CN114672481A - 一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，包括提取柱，其提取柱用于核酸提取方法下的吸附基质使用，具体步骤如下：S1混合均匀；S2.加入溶液；S3.溶液混合；S4.吸附溶液；S5.离心液；S6.洗出废液；S7.丢弃洗出液；S8.吸收溶液；S9.收集洗脱溶液。本发明新的高效植物纤维核酸吸附基质具有非常显著的核酸吸附性，提取的核酸量比商用试剂盒平均高出4.2倍，即其目标核酸的提取成功率以及下游检测的成功率至少提高4.2倍。

Description

一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法
技术领域
本发明涉及核酸检验领域，特别涉及一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)检测的高比例假阴性误判，已成为疫情防控的主要障碍之一，并造成不可估量的损失，这也说明目前的核酸提取技术不够可靠。优化核酸提取技术实际上是在保持合规纯度的前提下，尽可能增加样品中提取的核酸数量。核酸提取技术是分子分析(如核酸扩增、DNA片段连接、载体构建、高通量测序)的关键前提。虽然下游生物检测类型和技术蓬勃发展，但上游核酸提取技术投入不足。目前，由于COVID-19大流行，人们对核酸检测应对能力的提高，实际上是应付检测样本数量上能力的提高。提取效果的提高也必须予以同等关于，因为只有有效的核酸提取才能保证下游判断的准确性。
根据提取介质的不同，DNA提取技术可分为液相(传统)提取和固相提取。如今研究人员倾向于在传统方法非必要的情况下，使用商业化的固相萃取试剂盒。“离心柱”和“磁珠”法是目前商业化的主要固相DNA提取技术，其中“离心柱”法试剂盒应用最为广泛。核酸提取试剂盒只提供说明，并没有透露任何关于内部缓冲液和吸附剂的信息。虽然商业化的DNA提取试剂盒给科学研究带来了便利，但一些资深研究员认为，商业化的DNA提取试剂盒抑制了研究人员的创造力，阻碍了DNA提取技术的进步和创新。由于DNA提取试剂盒的便捷性，本应与下游实验获得同等关注的DNA提取技术的受关注度已被不合理降低。这可能是资深科学家提出以上反对意见的主要原因。因此，它强调了当今DNA提取持续创新的必要性。在享受DNA提取试剂盒的优势的同时，研究人员也应该正视其带来的相关问题并做出应对。由于DNA提取试剂盒的保密信息，创新与优化DNA提取的研究面临着一定的挑战，主要是由于信息不对称造成的。创新DNA提取的有效性应与商业试剂盒的效果进行比较。
虽然现有研究在DNA提取量上做到了一些推进，但其存在比较明显的局限性。首先，他们用于DNA吸附的过滤膜是商业产品，其核心信息(如成分)和制造方法是商业机密。用商业化的DNA提取试剂盒对其进行研究，虽可以获得比现有DNA提取商业试剂盒更好的DNA提取能力，但这无异于在不知道使用对象的情况下进行“双盲”实验，因此对于现有技术的需求趋势而言，无法达到提高准确率和使用效率，以及泛用性的技术效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，包括提取柱，其提取柱用于核酸提取方法下的吸附基质使用，具体步骤如下：
S1.取106--107个细胞，100-1000xg离心1-10min，弃上清，加入10-1000μL磷酸盐缓冲液，混合均匀；
S2.加入10-100μL蛋白酶k，再加入100-1000μL裂解液，将其与轻柔混合，得到均匀的裂解溶液；
S3.裂解溶液中加入100-1000μl无水乙醇，将其与S2裂解溶液轻轻混合，得到均匀的溶液，重要的是样品和乙醇充分混合，以得到均匀的溶液；
S4.将步骤S3中的溶液移到吸附管中，等待1-10min，让吸附膜吸收溶液；
S5.将吸附管放入离心管中，100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出液；
S6.加入100-1000μL10-100％乙醇，100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出废液；
S7.100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出液；
S8.将吸附管取出，并放入1.5ml或2ml离心管中；在吸附管中加入100-1000μL洗脱缓冲液；等待1-10min，让吸附膜吸收溶液；
S9.100-10000xg离心1-10min，收集洗脱溶液，洗脱溶液就是DNA提取液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S6中的流程循环2-3次。
作为本发明的一种优选技术方案，所用原料的溶液和材料包括：
裂解液，100-1000mM盐酸胍,10-100mM Tris,0.1-10％(v/v)Triton X-100,0.1-10％(v/v)Tween 20,pH4 to 10；
洗涤缓冲溶液，10-100％乙醇溶液；
洗脱缓冲溶液，10-1000mM Tris,0.1-10mM EDTA,pH 4to 10；
高效植物纤维吸附基质，是指由植物为原料制作的纤维基质，包括但不限于原木纤维基质、秸秆纤维基质、竹纤维基质和脱脂棉。
作为本发明的一种优选技术方案，所述提取柱包含有：内柱、外柱和固定环，其中内柱包括支撑部分，提取柱的制作包含如下步骤：
A.装载入内柱前的材料都使用7mm打孔进行打孔，将1-30层定性滤纸圆盘装入内柱的支撑部分，作支撑作用；
B.将1-30层高效植物纤维吸附基装载到支撑滤纸圆盘上；使用200μL移液枪头的末端将固定环推入内柱紧紧固定高效植物纤维吸附基质；
C.将组装好的内柱装载入外柱，将组装好的高效植物纤维吸附基质专用提取柱收集于密封于灭菌袋中，在高压灭菌锅中以121℃高温灭菌30min，然后置于烘箱中以60℃烘干30min，后置于超净工作台中紫外灭菌30min，待用。
作为本发明的一种优选技术方案，所述36.0～38.0％盐酸和氢氧化钠粉末在pH计的检测下调节裂解液和洗脱液的pH，在配制相关溶液前，先用pH值为4.00、7.00、10.00的pH校正缓冲液对pH计进行校正，温度为25℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1：本发明高效植物纤维核酸吸附基质具有非常显著的核酸吸附性，提取的核酸量比商用试剂盒平均高出4.2倍，即其目标核酸的提取成功率以及下游检测的成功率至少提高4.2倍。
2：本发明高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，所得的样品纯度同时符合OD260/OD280和OD260/OD230对核酸纯度的要求。因此发明方法应用范围广，可用于几乎所有下游实验和检测。
3：本发明新的高效植物纤维吸附基质具有明显经济性，与商业滤纸比较，其成本可以忽略(表1)。本方法的应用将大大降低核酸提取成本。
4：本发明新的高效植物纤维吸附基质是可降解环保材料对环境友好，这与不可降解不可回收的磁珠相比是一个很大的优势。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明核酸提取方法结果与市面上常用试剂盒对比图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1所示，本发明提供一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，包括提取柱，其提取柱用于核酸提取方法下的吸附基质使用，具体步骤如下：
S1.取106--107个细胞，100-1000xg离心1-10min，弃上清，加入10-1000μL磷酸盐缓冲液，混合均匀；
S2.加入10-100μL蛋白酶k，再加入100-1000μL裂解液。将其与轻柔混合，得到均匀的裂解溶液；
S3.裂解溶液中加入100-1000μl无水乙醇。将其与S2裂解溶液轻轻混合，得到均匀的溶液，重要的是样品和乙醇充分混合，以得到均匀的溶液；
S4.将步骤S3中的溶液移到吸附管中，等待1-10min，让吸附膜吸收溶液；
S5.将吸附管放入离心管中，100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出液；
S6.加入100-1000μL10-100％乙醇，100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出废液；
S7.100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出液；
S8.将吸附管取出，并放入1.5ml或2ml离心管中；在吸附管中加入100-1000μL洗脱缓冲液；等待1-10min，让吸附膜吸收溶液；
S9.100-10000xg离心1-10min，收集洗脱溶液，洗脱溶液就是DNA提取液。
步骤S6中的流程循环2-3次。
所用原料的溶液和材料包括：
裂解液，100-1000mM盐酸胍,10-100mM Tris,0.1-10％(v/v)Triton X-100,0.1-10％(v/v)Tween 20,pH4 to 10；
洗涤缓冲溶液，10-100％乙醇溶液；
洗脱缓冲溶液，10-1000mM Tris,0.1-10mM EDTA,pH 4to 10；
高效植物纤维吸附基质，是指由植物为原料制作的纤维基质，包括但不限于原木纤维基质、秸秆纤维基质、竹纤维基质和脱脂棉。
提取柱包含有：内柱、外柱和固定环，其中内柱包括支撑部分，提取柱的制作包含如下步骤：
A.装载入内柱前的材料都使用7mm打孔进行打孔，将1-30层定性滤纸圆盘装入内柱的支撑部分，作支撑作用；
B.将1-30层高效植物纤维吸附基装载到支撑滤纸圆盘上；使用200μL移液枪头的末端将固定环推入内柱紧紧固定高效植物纤维吸附基质；
C.将组装好的内柱装载入外柱，将组装好的高效植物纤维吸附基质专用提取柱收集于密封于灭菌袋中，在高压灭菌锅中以121℃高温灭菌30min，然后置于烘箱中以60℃烘干30min，后置于超净工作台中紫外灭菌30min，待用。
36.0～38.0％盐酸和氢氧化钠粉末在pH计的检测下调节裂解液和洗脱液的pH，在配制相关溶液前，先用pH值为4.00、7.00、10.00的pH校正缓冲液对pH计进行校正，温度为25℃。
具体的，本发明采用了对照实验，根据上述步骤方法为流程，进行新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取，所得核酸为实验组；选取目前使用最广的商业核酸提取试剂盒
Figure BDA0003608177840000061
(离心柱法)、
Figure BDA0003608177840000062
(离心柱法)、和
Figure BDA0003608177840000063
(磁珠法)，并使用各自试剂盒自带的内容物与说明书提取核酸，所得核酸作为对照。
用上述新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法获得的核酸，在超微量紫外分光光度计检测其浓度与纯度。在超微量紫外分光光度计的取样器上加入1-3μL样品，在紫外光照下测定提取核酸的浓度和纯度(图1)。用每种条件下使用的洗脱缓冲液作为对照。
所涉及各类现有技术原料以及本发明原料均如下表所示：
表1
Figure BDA0003608177840000064
Figure BDA0003608177840000071
由上表可知，在形成同样的检测效果情况下，本方法所能够涉及的产品不仅性价比较高，且可泛用性更强，均为检测领域内常用产品。
根据上述实验表明，本高效植物纤维核酸吸附基质具有非常显著的核酸吸附性，提取的核酸量比商用试剂盒平均高出4.2倍(图1)，即其目标核酸的提取成功率以及下游检测的成功率至少提高4.2倍。实验数据的结论可让人有理由相信，采用本发明所述新的高效植物纤维吸附基质的方法提取核酸，不仅增加数倍增加核酸获得量，而且其获得的核酸可被用于更广泛的下游实验，具有更强的实用性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，其特征在于，包括提取柱，其提取柱用于核酸提取方法下的吸附基质使用，具体步骤如下：
S1.取106--107个细胞，100-1000xg离心1-10min，弃上清，加入10-1000μL磷酸盐缓冲液，混合均匀；
S2.加入10-100μL蛋白酶k，再加入100-1000μL裂解液，将其与轻柔混合，得到均匀的裂解溶液；
S3.裂解溶液中加入100-1000μl无水乙醇，将其与S2裂解溶液轻轻混合，得到均匀的溶液，重要的是样品和乙醇充分混合，以得到均匀的溶液；
S4.将步骤S3中的溶液移到吸附管中，等待1-10min，让吸附膜吸收溶液；
S5.将吸附管放入离心管中，100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出液；
S6.加入100-1000μL10-100％乙醇，100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出废液；
S7.100-10000xg离心1-10min，丢弃洗出液；
S8.将吸附管取出，并放入1.5ml或2ml离心管中；在吸附管中加入100-1000μL洗脱缓冲液；等待1-10min，让吸附膜吸收溶液；
S9.100-10000xg离心1-10min，收集洗脱溶液，洗脱溶液就是DNA提取液。
2.根据权利要求1所述的一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，其特征在于，所述步骤S6中的流程循环2-3次。
3.根据权利要求1所述的一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，其特征在于，所用原料的溶液和材料包括：
裂解液，100-1000mM盐酸胍,10-100mM Tris,0.1-10％(v/v)Triton X-100,0.1-10％(v/v)Tween 20,pH4 to 10；
洗涤缓冲溶液，10-100％乙醇溶液；
洗脱缓冲溶液，10-1000mM Tris,0.1-10mM EDTA,pH 4to 10；
高效植物纤维吸附基质，是指由植物为原料制作的纤维基质，包括但不限于原木纤维基质、秸秆纤维基质、竹纤维基质和脱脂棉。
4.根据权利要求1所述的一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，其特征在于，所述提取柱包含有：内柱、外柱和固定环，其中内柱包括支撑部分，提取柱的制作包含如下步骤：
A.装载入内柱前的材料都使用7mm打孔进行打孔，将1-30层定性滤纸圆盘装入内柱的支撑部分，作支撑作用；
B.将1-30层高效植物纤维吸附基装载到支撑滤纸圆盘上；使用200μL移液枪头的末端将固定环推入内柱紧紧固定高效植物纤维吸附基质；
C.将组装好的内柱装载入外柱，将组装好的高效植物纤维吸附基质专用提取柱收集于密封于灭菌袋中，在高压灭菌锅中以121℃高温灭菌30min，然后置于烘箱中以60℃烘干30min，后置于超净工作台中紫外灭菌30min，待用。
5.根据权利要求3所述的一种新的高效植物纤维吸附基质的核酸提取方法，其特征在于，所述36.0～38.0％盐酸和氢氧化钠粉末在pH计的检测下调节裂解液和洗脱液的pH，在配制相关溶液前，先用pH值为4.00、7.00、10.00的pH校正缓冲液对pH计进行校正，温度为25℃。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050214926A1 (en) * 2004-02-20 2005-09-29 Ralf Zielenski Adsorption of nucleic acids to a solid phase
CN101250522A (zh) * 2008-04-14 2008-08-27 金政策 改进高盐法提取线粒体dna的方法及其应用
CN102031249A (zh) * 2010-09-14 2011-04-27 广西大学 一种简易纯化核酸的方法
CN102978105A (zh) * 2012-12-24 2013-03-20 天津启仁医药科技有限公司 一种mRNA快速提取试剂盒
CN107794260A (zh) * 2017-11-21 2018-03-13 苏州吉玛基因股份有限公司 一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法
CN108795924A (zh) * 2017-12-06 2018-11-13 宁夏农林科学院 一种快速、简单的植物基因组dna提取方法
CN112941067A (zh) * 2021-02-04 2021-06-11 天津诺道医学检验中心有限公司 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
WO2021164396A1 (zh) * 2020-02-18 2021-08-26 南京农业大学 一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050214926A1 (en) * 2004-02-20 2005-09-29 Ralf Zielenski Adsorption of nucleic acids to a solid phase
CN101250522A (zh) * 2008-04-14 2008-08-27 金政策 改进高盐法提取线粒体dna的方法及其应用
CN102031249A (zh) * 2010-09-14 2011-04-27 广西大学 一种简易纯化核酸的方法
CN102978105A (zh) * 2012-12-24 2013-03-20 天津启仁医药科技有限公司 一种mRNA快速提取试剂盒
CN107794260A (zh) * 2017-11-21 2018-03-13 苏州吉玛基因股份有限公司 一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法
CN108795924A (zh) * 2017-12-06 2018-11-13 宁夏农林科学院 一种快速、简单的植物基因组dna提取方法
WO2021164396A1 (zh) * 2020-02-18 2021-08-26 南京农业大学 一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法
CN112941067A (zh) * 2021-02-04 2021-06-11 天津诺道医学检验中心有限公司 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用

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