CN108795924A

CN108795924A - 一种快速、简单的植物基因组dna提取方法

Info

Publication number: CN108795924A
Application number: CN201711274541.3A
Authority: CN
Inventors: 陈晓军; 樊云芳; 王敬东; 李树华; 宋海丽
Original assignee: Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2018-11-13

Abstract

一种提取植物基因组DNA方法，它涉及一种简便、环保、快速提取植物基因组DNA的方法。它解决了目前植物基因组DNA提取方法需要离心机昂贵特殊设备、提取步骤繁锁、提取过程中刺激味大、提取时间长等问题。提取方法：一、将新鲜的植物组织打碎，加入改良DNA裂解液，混匀；二、用干净脱脂棉签，将其浸入步骤一中的DNA的粗提液3s，将浸润的棉签迅速在DNA清洗液中轻轻漂洗3次；三、然后将棉签在100μL ddH₂O或TE溶解彻底洗脱3‑5次，洗脱过的溶液即DNA溶液，可用于下游的分子生物学实验。本发明方法是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，它不受设备、材料量的限制，在DNA提取过程中省去了氯仿等刺激性化学试剂，短时间内完成DNA提取的工作，可广泛应满足基于PCR反应的基因型鉴定和基因克隆、测序等需要。

Description

一种快速、简单的植物基因组DNA提取方法

发明人：陈晓军樊云芳王敬东李树华宋海丽

技术领域

本发明涉及一种快速、简单、环保的植物基因组DNA的提取方法。

背景技术

DNA是分子生物学研究的主要对象之一，在植物分子生物学和遗传育种中，基因组DNA的质量好坏是影响其成败的关键因素。人们经常需要提取高质量的植物DNA，于构建基因文库、基因组sourthern分析、酶切、克隆和测序等分子生物学实验。根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等的不同，提取基因组DNA所应用的方法也不同。其中，随着作物分子辅助育种的广泛应用与推广，基因型鉴定是最主要的工作，基因组DNA的提取则是最繁重、最耗时的工作之一。目前提取基因组DNA提取方法有：(1)CTAB提取法，此方法多用于禾本科植物基因组DNA的提取。此方法是1987年Doyle最先应用，后来应用改进的CTAB法，用特定吸附作用的螯合树脂在特定条件下，吸附、纯化DNA；(2)PVP提取法，此方法主要应用于林木类植物DNA的提取。1997年Kim最先应用此方法提取果树和针叶类林木中高质量的DNA；(3)SDS提取法，此方法适用于多种植物DNA的提取。(4)尿素提取法，此方法适用于一般植物和真核微生物DNA的提取。Dudler 1990年最先应用此方法。这些方法均用到离心机、提取步骤繁杂、配置化学试剂种类众多、提取过程刺激味大、特别是缺乏高效的、快速、环保提取植物基因DNA的方法。本发明，大约用时60秒，即可完成植物叶片基因组DNA的提取，且完全可以满足基于PCR反应的基因型鉴定和基因克隆、测序等需要。

发明内容

本发明的目的是针对于目前植物DNA提取方法耗时长、步骤繁杂、需要昂贵设备仪器、刺激味大等问题而提供的一种提取植物DNA简单、快速、环保、高效的方法。

提取植物基因组DNA按以下步骤进行：

一、植物提取材料5mg，装入圆底EP管中，加一粒直径4mm的钢珠，将管子浸入液氮中冷却，待彻底冷却后，快速用振荡研磨仪(频率25，时间30秒钟)将植物组织打碎。

二、加入DNA裂解液300μL，上下颠倒直至管壁清洗干净，溶液变浑浊，室温下放置待用，即得到植物材料DNA的粗提液。

三、将干净脱脂棉签浸入步骤二中的DNA的粗提液3s，将浸润的棉签迅速在DNA清洗液中轻轻漂洗3次，然后再将其在100μL去离水(ddH2O)彻底洗脱3-5次，洗脱过的ddH2O即DNA溶液，可用于下游的分子生物学实验。

四、其中步骤二中的DNA裂解液由十二烷基硫酸钠钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)和去离子水组成，DNA裂解液中SDS质量百分比浓度为0.06％、EDTA的浓度为25mmol/L、NaCl的浓度为250mmol/L、Tris-base 200mmol/L，pH＝8.0；步骤三中的DNA清洗液由三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、吐温20(tween-20)和ddH2O组成，DNA清洗液中Tris-base的浓度为10mmol/L、tween-20质量百分比浓度为0.15％。

本发明方法步骤一中在没有液氮的情况下，可用小剪子将植物材料剪碎，使植物组织破碎的越细，DNA释放效果越好。步骤三中，脱脂棉签可以用玻璃纤维滤纸(whatmanGF/A)或棉纤维滤纸所代替。本发明方法是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料量的限制(大于5mg)，在超短时间和简单设备下完成植物基因组DNA提取，特别适合需早期或苗期进行基因型鉴定的材料。

附图说明

图1是具体实施方式一所提取的DNA的粗提液。

图2是具体实施方式一PCR凝胶电泳图，M为DNA marker DL2000。

图3是具体实施方式一DNA稀释后PCR凝胶电泳图，M为DNA marker DL2000。

图4是具体实施方式二所提取的DNA的粗提液。

图5是具体实施方式二PCR凝胶电泳图，M为DNA marker DL2000。

图6是具体实施方式三PCR凝胶电泳图，M为DNA marker DL2000。

图7是具体实施方式四测序图。

具体实施方式

具体实施方式一：

本实施方式提取植物基因组DNA按以下步骤进行：

一、取水稻叶片材料5mg，装入圆底EP管中，加一粒直径4mm的钢珠，浸入液氮中冷却，待彻底冷却后，快速用振荡研磨仪(频率25Hz，时间30s)将植物组织打碎。

二、加入DNA裂解液300μL，上下颠倒直至管壁清洗干净，溶液变浑浊，室温下放置待用，即得到植物材料DNA的粗提液，如图1。

三、将干净脱脂棉签浸入步骤二中的DNA的粗提液3s，将浸润的棉签迅速在DNA清洗液中轻轻漂洗3次，然后再将其在100μL去离水彻底洗脱3-5次，洗脱过的ddH2O即DNA溶液。其中步骤二中的DNA裂解液由十二烷基硫酸钠钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)和ddH2O组成，DNA裂解液中SDS质量百分比浓度为0.06％、EDTA的浓度为25mmol/L、NaCl的浓度为250mmol/L、Tris-base 200mmol/L，pH＝8.0；步骤三中的DNA清洗液由三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、吐温20(tween-20)和去离子水组成，DNA清洗液中Tris-base的浓度为10mmol/L、tween-20质量百分比浓度为0.15％。

四、按照以下PCR反应体系配置反应液20μL：2×Mixture，10μL；FPrimer，1μL；BPrimer，1μL：上述DNA溶液2μL；ddH2O，6μL。FPrimer序列：TGCTATGTACGTCGCCATCCA，BPrimer序列：AATGAGTAACCACGCTCCGTC。反应程序为：预变性95℃，5min；循环35个，95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；最后延伸72℃，10min。

五、PCR产物电泳条件：PCR产物上样量，10μL，电压120V，6CM/V；恒压电泳30min，结果见图2。

六、为了检测其灵敏度，对所提DNA溶液进行了梯度稀释。首先吸取2μLDNA溶液到8μL去离子水中，依次稀释。发现稀释至千万分之一时，仍然可以通过PCR进行目的条带的扩增，如图3PCR产物凝胶电泳图，从左到右依次是稀释的DNA为模板。

本实施方式方法操作简单，易于掌握，步骤少，可有效的提高植物DNA提取效率。

具体实施方式二：

本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中用小剪刀将叶片尽可能剪碎装入1.5mL尖底EP管中，然后加入500μL DNA裂解液，粗提液效果见图4。其它步骤及参数与实施方式一相同，PCR结果见图5。本实施方式可以保证在没有液氮的条件下，提取植物DNA。

具体实施方式三：

本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中改用滤纸头-牙签蘸取法。具体步骤为将宽度为5mm宽双面胶贴于Whatman(GF/A)滤纸上，撕去另一面，然后用牙签旋转裹住贴胶滤纸，每1cm断开，即可做成滤纸头-牙签。握住牙签的另一头进行相关后续操作。其它步骤及参数与实施方式一相同，PCR结果见图6。本实施方式可以用玻璃纤维、纤维滤纸代替棉签，其提取效果不影响PCR扩增。

具体实施方式四：

本实施方式与具体实施方式一相同，所得到扩增产物，进行了一代基因测序验证，具体结果见图7。本实施方式方法操作简单，易于掌握，步骤少，可有效满足克隆、基因测序等需要。

Claims

1.一种改良DNA裂解缓冲液，每1000ml所述DNA提取缓冲液中，含有十二烷基硫酸钠钠(SDS)0.6g。

2.根据权利要求1所述的DNA提取缓冲液，其特征在于，每1000ml所述DNA提取缓冲液中还含有Tris-HCl 200mmol、NaCl 250mmol、EDTA 25mmol。

3.一种改良DNA清洗液，每1000ml所述DNA清洗液中，含有吐温-20 15g。

4.根据权利3所述的DNA清洗液，其特征在于，每1000ml所述DNA清洗液中还含有Tris-HCl 200 mmol。

5.根据权利要求1所述的DNA提取缓冲液和权利要求3所述的DNA清洗液，其特征在于，所述Tris-HCl的pH为8.0。

6.根据权利要求1所述的DNA提取缓冲液和权利要求3所述的DNA清洗液在植物基因组DNA提取中的用途。

7.一种植物DNA提取方法，所述方法采用前述改良DNA提取缓冲液和清洗液来提取植物基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将新鲜的植物组织装入圆底EP管中，放中一粒钢珠将其打碎，加入改良DNA裂解液，混匀；(2)用干净脱脂棉签，将其浸入步骤(1)中的DNA的粗提液3s，将浸润的棉签迅速在DNA清洗液中轻轻漂洗3次；(3)然后将棉签在100μLTE或ddH2O溶解彻底洗脱3-5次，洗脱过的溶液即DNA溶液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物组织为植物的叶片。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述棉签可以用滤纸(Whatman GF/A)玻璃纤维或棉纤维等吸附材料之一所替代。