CN104342433A - 一种提取基因组dna的提取液、其应用及利用该提取液快速高效提取烟草基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法，具体为：使用以下提取液对DNA进行提取，提取液的各组分的浓度为0.1MTris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5，同时附加0.75％(w/v)PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)和0.36％(w/v)按1∶1重量混合的NaHSO₃/Na₂S₂O₃混合物。本发明所述的一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法与实验室目前所有的试剂盒相比，本发明所涉及的实验步骤少，操作简单，实验过程中不会用到氯仿等有毒试剂，更加安全。另一方面，材料损失少，试剂易得，提取成本远远低于试剂盒，且得率远远高于试剂盒，按每克鲜重叶片计，所获得的DNA在1200μg以上，最高达6078.30μg，所提取的基因组DNA可以满足高精度的实验，如AFLP等。

Description

一种提取基因组DNA的提取液、其应用及利用该提取液快速高效提取烟草基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及生物学研究的基础技术技术领域，特别涉及一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法。

背景技术

烟草作为分子生物学研究的常用模式植物，在基因工程各项研究中的作用越发重要。由于烟草叶片富含多糖、蛋白和酚类物质，且含有大量的生物碱(如：烟碱)及其它多种次生物质，这就给为DNA的提取带来了极大困难，如酚类物质可以氧化成醌类物质可引起DNA降解、变色；蛋白与DNA结合造成DNA纯度下降，并影响后续分析；残存的多糖能抑制连接酶、限制性酶及PCR聚合酶的生物酶活，运用目前常用的方法不是费用高昂，操作繁琐，就是获得DNA纯度不高，得率低，且多糖、蛋白质的除去不彻底，影响后续试验的进行。

目前所常植物DNA提取方法主要有CTAB法、高盐低pH法、SDS裂解法及果胶酶解法等，在市场上也出现了各种提取DNA的试剂盒。本实验室常用试剂盒提取烟草基因组DNA，现参照试剂盒提供的步骤操作进行，具体操作步骤如下：(1)取烟草新鲜叶片组织0.1g，加入液氮充分研磨，每个样品3个重复。(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验先加β-巯基乙醇，使终浓度达0.1％)，迅速颠倒混匀后，65℃温育20min，期间颠倒混匀3-4次。(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min.(4)取上清液转入一新的离心管中，加入700μL缓冲液GD2，充分混匀。(5)将混匀的液体转到吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。(6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液。(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。(8)重复步骤(7)。(9)将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中的漂洗液。(10)将吸附柱置于另一干净的离心管中，加入100μL TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到的溶液即为DNA溶液。

目前所运用的DNA提取方法大体表现为操作繁琐需要，需多种成分使细胞裂解破碎，内含物释放，再经过抽提，一般需用氯仿等有机溶剂除去蛋白质和多糖等杂质，乙醇沉淀等操作步骤，大体都表现为时间长，完成一次提取要3.5个小时左右，价格昂贵，每个样品的费用在1美元左右，且DNA得率较低，用于简单的检测还可以，若用于大批量的检测则需要再次提取，这样不但耽误了实验进程，还会增加更大的工作量。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种提取基因组DNA的提取液，由以下组分组成：

(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，还含有0.75％(w/v)PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)和0.36％(w/v)按等重量混合的NaHSO₃/Na₂S₂O₃混合物。

一种如上所述的提取基因组DNA的提取液的用途，所述提取液用于提取烟草基因组DNA。

一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法，具体的步骤如下：

(1)取烟草的幼嫩叶片组织0.1g于无菌离心管中，加液氮研磨至粉末状，每个样品3个重复；

(2)每管加入600μL预热DNA提取缓冲液(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，同时附加0.75％(w/v)PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)和0.36％(w/v)NaHSO₃/Na₂S₂O₃，摇匀后于65℃水浴45min，期间颠倒混匀3-4次；

(3)加入200μL 5M(pH＝5.8)KAC，摇匀后室温静置15min待反应充分后，13000rpm离心10min；

(4)将上清液转入另一新的无菌离心管，加入165μL预冷的异丙醇，-20℃放置30min，可见絮状沉淀；

(5)将上述离心管中溶液11000rpm离心8min，弃废液留沉淀；

(6)用500μL的70％乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，11000rpm离心3min，弃废液；

(7)除去剩余乙醇，当乙醇完全挥发完时向离心管中，加入100μL TER(含RNaseA的TE缓冲液)，于37℃放置5min，12000rpm离心2min，溶液即为提取的烟草基因组DNA。

本发明所述的一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法与实验室目前所有的试剂盒相比，本发明所涉及的实验步骤少，操作简单，实验过程中不会用到氯仿等有毒试剂，更加安全。另一方面，材料损失少，试剂易得，提取成本远远低于试剂盒，且得率远远高于试剂盒，按每克鲜重叶片计，所获得的DNA在1200μg以上，最高达6078.30μg，所提取的基因组DNA可以满足高精度的实验，如AFLP等。提取液中PVP是一类高分子合成树脂，具有络和酚类物质的作用，防止酚类物质氧化成褐色的醌类物质，介导DNA的降解。另外，PVP还能有效地去除多糖，消除多糖物质对后续实验如PCR、酶切反应的抑制作用。NaHSO₃/Na₂S₂O₃混合物具有抗氧化、使蛋白发生盐析、脱色及快速渗透剂的作用，可使蛋白盐析，裂解液快速裂解细胞释放内含物。烟草叶片富含酚类，蛋白质及多糖类物质，本发明在提取液中加入0.75％的PVP40和0.36％的NaHSO₃/Na₂S₂O₃混合物，使叶片组织细胞破碎更加快速彻底。当细胞破碎，释放出内含物时PVP-40有效的结合酚类物质。另外，5M的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂，且有助于PVP与多糖形成复合物，复合物经离心或过滤除去，得到浓度高、质量好、完整性好的DNA。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为本发明利用背景技术中所述试剂盒的方法提取基因组总DNA电泳图谱；其中：M：DL2000标准DNA分子量；1-3：林烟草；4-6：绒毛状烟草；7-9：具翼烟草；10-12：本赛姆氏烟；13-15：红花大金元；16-18：什邡晒烟；

图2为本发明方法提取基因组总DNA电泳图谱；其中：M：DL2000标准DNA分子量；1-3：林烟草；4-6：绒毛状烟草；7-9：具翼烟草；10-12：本赛姆氏烟；13-15：红花大金元；16-18：什邡晒烟；

图3为本发明两种方法提取基因组总DNA经EcoR I/Mse I双酶切电泳检测图谱；其中：M：DL1000标准DNA分子量；1-6：试剂盒提取；7-12：本发明方法；

图4为本发明两种不同方法提取DNA进行AFLP-PCR预扩增电泳检测图谱；其中：M：DL1000标准DNA分子量；1-6：试剂盒；7-12：本发明方法。

具体实施方式

实施例1：

DNA提取

(1)取不同烟草的幼嫩叶片组织0.1g于无菌离心管中，加液氮研磨至粉末状，每个样品3个重复。

(2)每管加入600μL预热DNA提取缓冲液(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，同时附加0.75％(w/v)PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)和0.36％(w/v)NaHSO₃/Na₂S₂O₃，摇匀后于65℃水浴45min，期间颠倒混匀3-4次；

(3)加入200μL 5M(pH＝5.8)KAC，摇匀后室温静置15min待反应充分后，13000rpm离心10min。

(4)将上清液转入另一新的无菌离心管，加入165μL预冷的异丙醇，-20℃放置30min，可见絮状沉淀。

(5)将上述离心管中溶液11000rpm离心8min，弃废液留沉淀。

(6)用500μL的70％乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，11000rpm离心3min，弃废液。

(7)除去剩余乙醇，当乙醇完全挥发完时向离心管中，加入100μL TER(含RNaseA的TE缓冲液)，于37℃放置5min，12000rpm离心2min，溶液即为提取的烟草基因组DNA。

利用上述方法分别提取林烟草、绒毛状烟草、具翼烟草、本赛姆氏烟、红花大金元和什邡晒烟的DNA。

同时利用说明书背景技术中试剂盒的方法也提取上述烟草材料叶片的DNA做对比。

对比实验：

一、DNA浓度及纯度测定

用美国产NANO DROP2000C分光光度计测定OD260、OD280、OD230。用1％琼脂糖凝胶检查纯度和分子量大小。

1.琼脂糖凝胶电泳检测试验结果如图1和图2所示：

1％琼脂糖凝胶电泳结果表明，两种方法提取的DNA条带单一，且一致性较好，但用试剂盒提取的DNA拖尾现象说明有DNA发生降解，且点样孔有少许残留，说明样品中含有残留的糖或者蛋白与DNA包裹，影响正常电泳，而本发明的法提取的DNA降解程度则较轻，且点样无杂质，表明样品中多糖、蛋白等杂质去除彻底。

2.紫外分光光度计检测

从表1、表2的结果可以看出，两种方法提取的不同烟草材料叶片DNA，OD260/OD280基本在1.7-1.9之间，没有超出2.0，说明提取的DNA中RNA含量较小且没有蛋白质、酚污染；OD260/OD230基本都在1.9-2.1之间，表明DNA纯度较高，没有小分子污染。

用本发明法提取烟草叶片DNA，结果表明本发明的法适合不同类型的烟草叶片基因组DNA的提取，且不同材料的DNA得率存在差异，平均每克(鲜重)叶片可获得1299.97-6078.30μg DNA(表2)，而试剂盒法所得的DNA得率为188.03-396.57μg(表1)，与试剂盒的平均得率差异达极显著。

表1 试剂盒提取不同烟草品种DNA的光密度比值及得率

表2 本发明方法提取不同烟草品种DNA的光密度比值及得率

二、酶切及AFLP-PCR

参照AFLP的实验原理及操作流程，选用EcoR I/Mse I 37℃双酶切基因组DNA，反应体系中各组分如下：10×NEB Buffer 5μL，DNA750ng，100×BSA 0.5μL，Mse I(10U/μL)1μL，EcoR I(10U/μL)1μL，用双蒸水补足至体积50μL，待酶切结束后，用1％琼脂糖凝胶检测酶切结果。结果如图3所示；酶切产物与复性后的接头E adapter、M adapter连接，反应体系如下：10×T4Ligase Buffer 5.0μL，Eadapter(50μM)4.0μL，M adapter(5μM)4.0μl，酶切产物8.5μL，T4Ligase 0.7μL，其余用双蒸水补足至50μL，16℃连接过夜，4℃保存。以预扩增引物E1/M3(E-A/M-C)进行预扩增，反应体系及PCR扩增程序如下：10×PCR reaction Buffer 2.0μL，连接产物3.0μL，Mse I预扩增引物(10μM)1.0μL，EcoR I预扩增引物(10μM)1.0μL，dNTPs 0.8μL，Taq酶0.2μL，其余用双蒸水补足至20μL。预扩增PCR程序：94℃预变性60s，94℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸2min，共延伸35个循环，72℃后延伸8min，12℃保温，反应结束取5μL用1％琼脂糖凝胶检测扩增结果。结果如图4所示。

检测结果：

两种方法提取的基因组DNA经EcoR I/Mse I双酶切处理，电泳结果显示均可酶解完全(图3)，酶切产物经接头连接，以E-A/M-C预扩增引物进行扩增，均得到了预期的结果，预扩增产物大小主要集中在100-500bp之间，一致性较好且扩增效率较高符合实验要求(图4)。

Claims (4)

1.一种提取基因组DNA的提取液，其特征在于提取液各组分及浓度为：

(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，以及0.75％(w/v)PVP和0.36％(w/v)按等重量混合的NaHS0₃/Na₂S₂O₃。

2.一种根据权利要求1所述的提取基因组DNA的提取液的用途，其特征在于所述提取液用于提取烟草基因组DNA。

3.一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法，其特征在于：使用权利要求1或2所述的提取液。

4.一种根据权利要求3所述的快速高效提取烟草基因组DNA的方法，其特征在于具体的步骤如下：

(1)取烟草的幼嫩叶片组织0.1g于无菌离心管中，加液氮研磨至粉末状，每个样品3个重复；

(2)每管加入600μL预热DNA提取缓冲液(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，同时附加0.75％(w/v)PVP和0.36％(w/v)NaHS0₃/Na₂S₂O₃，摇匀后于65℃水浴45min，期间颠倒混匀3-4次；

(3)加入200μL 5M(pH＝5.8)KAC，摇匀后室温静置15min待反应充分后，13000rpm离心10min；

(4)将上清液转入另一新的无菌离心管，加入165μL预冷的异丙醇，-20℃放置30min，可见絮状沉淀；

(5)将上述离心管中溶液11000rpm离心8min，弃废液留沉淀；

(6)用500μL的70％乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，11000rpm离心3min，弃废液；

(7)除去剩余乙醇，当乙醇完全挥发完时向离心管中，加入100μL TER(含RNaseA的TE缓冲液)，于37℃放置5min，12000rpm离心2min，溶液即为提取的烟草基因组DNA。