CN101812446B

CN101812446B - 一种快速提取水稻dna的方法

Info

Publication number: CN101812446B
Application number: CN2010101574077A
Authority: CN
Inventors: 曾大力; 钱前; 饶玉春; 张光恒; 刘坚; 胡江; 高振宇; 杨窑龙; 郭龙彪
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: Zhejiang hetianxia Seed Industry Co.,Ltd.
Priority date: 2010-04-27
Filing date: 2010-04-27
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2030-04-27
Also published as: CN101812446A

Abstract

本发明公开了一种快速提取水稻DNA的方法，包括以下步骤：1)取0.001g～0.01g水稻样品放入离心管内，然后向离心管内加入500μl试剂C和200μl氯仿，并加入1～2粒钢珠；试剂C的制作方法如下：先由试剂A、试剂B、蒸馏水按1∶2∶7的体积比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％体积比的β-巯基乙醇，得作为DNA提取液的试剂C；2)对步骤1)所得的离心管内的水稻样品进行破碎处理；3)将步骤2)所得的破碎后的样品进行离心处理；得含DNA的上清液。采用本发明的方法能从水稻组织中高效、快速、简便的提取模板DNA。

Description

一种快速提取水稻DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种快速提取水稻DNA的方法。

背景技术

基于PCR技术为基础的分子标记已广泛地运用于种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。尤其是，DNA分子标记辅助选择育种已成为分子技术在作物改良中的一个重要应用，即通过对与表型紧密连锁的DNA分子标记的筛选，以快速获取带目的表型的理想植株。随着生物技术的不断发展、水稻基因组测序的完成、功能基因鉴定的日益增多，分子标记辅助选择育种越来越多地应用于作物新品种改良。

为了应用PCR检测技术，人们需要从组织样品中提取DNA。然而，DNA提取是一项耗费人力、物力的繁琐工作，提取的DNA也仅在筛选、鉴定时使用了很少的一部分，剩余的大部分DNA将作为累赘而被废弃。尽管人们也一直致力于DNA抽提方法的探讨，但目前应用的主要方法仍然烦琐费时。因此，在大规模的基于PCR的基因型检测作业中，高效、快速、简便的模板DNA制备显得非常重要。

目前已公开的一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法(王兰、龙云铭、刘耀光，分子植物育种.2009，7(2)：425-428)，存在着如下缺陷：

1、操作较费时，仅破碎组织样品的时间就需要5min；

2、仅能以叶片为原料进行提取，且最少要求有4mg的叶片；因此原料的适应性较差；

3、所得的DNA溶液主要用于短期使用：用TE制备的DNA在4℃下可保存10d以上，在冷冻下可保存半年；不利于长期保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速提取水稻DNA的方法，采用该方法能从水稻组织中高效、快速、简便的提取模板DNA。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速提取水稻DNA的方法，包括以下步骤：

1)、取0.001g～0.01g水稻样品放入离心管内，然后向离心管内加入500μl试剂C和200μl氯仿，并加入1～2粒钢珠；

试剂C的制作方法如下：先由试剂A、试剂B、蒸馏水按1∶2∶7的体积比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％体积比的β-巯基乙醇，得作为DNA提取液的试剂C；

试剂A包括100～200mM sorbitol(山梨醇)、100～150mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)、20～30mM EDTA-Na₂(乙二胺四乙酸二钠)、400～600mM NaCl、15～25mM Na₂SO₃、质量浓度0.8％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和质量浓度2％的sarkosyl(N-十二烷基肌氨酸钠)，其余为蒸馏水；pH7.5；

试剂B包括90～110mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)、450～550mM KCl、15～20mMMgCl₂和质量浓度1％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，其余为蒸馏水；pH9.0；

2)、对步骤1)所得的离心管内的水稻样品进行破碎处理；

3)、将步骤2)所得的破碎后的样品进行离心处理；得含DNA的上清液。

作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的改进：将上述步骤3)所得的含DNA的上清液继续依次进行以下步骤：

4)、取步骤3)所得的上清液于另一个离心管内，加1～2体积倍的无水乙醇轻摇混匀，沉淀30～60min后，8,000～10,000rpm离心10～15min；弃上清液，得沉淀；

5)、将步骤4)所得的沉淀用体积浓度60～80％的乙醇洗涤，8,000～10,000rpm离心10～15min；

6)、弃步骤5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀为DNA。

作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进：取步骤3)所得的4～6μl上清液直接作为模板DNA，以试剂D作为PCR反应缓冲液，进行PCR检测；根据PCR检测结果选择所需的上清液进行步骤4)；

试剂D包括40～60mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)、200～300mM KCl、8～10mM MgCl₂、质量浓度0.5％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和体积浓度5～10％的BSA(牛血清白蛋白)，其余为去离子灭菌水；pH9.0。

作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进：步骤2)的破碎为：将步骤1)所得的离心管放入细胞破碎仪内，于28HZ的频率破碎1.5～2.5min；所述步骤3)的离心为：将步骤2)所得的破碎后的样品于8,000～10,000rpm离心4～6min。

作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进：步骤6)为：弃步骤5)所得的上清液，倒置离心管至晾干，附着于离心管壁上的沉淀为DNA。

作为本发明的快速提取水稻DNA的方法的进一步改进：步骤1)中钢珠的粒径为4～6mm。

在本发明中，试剂A、试剂B和试剂D均可利用HCl或NaOH对pH值进行调整。实际应用时，在使用前，先将试剂A、试剂B、蒸馏水按1∶2∶7的体积比混合成混合液，然后再加入占混合液0.1～0.3％体积比(优选的0.2％体积比)的β-巯基乙醇，得作为DNA提取液的试剂C。试剂A可以破坏水稻组织的细胞壁和细胞膜，试剂B则协调提供一个细胞裂解、DNA释出的pH环境和离子环境；在使用前才进行试剂C的配制是为了保证试剂A和试剂B长期存放的稳定性。试剂D则为PCR反应提供稳定的环境和必需的因子。

本发明的主要原理为：采用试剂A破坏水稻组织的细胞壁和细胞膜，有助于细胞中DNA的释出，进一步在机械破碎的作用下，使绝大部分的组织细胞破裂，DNA逸出。试剂B则协调提供一个细胞裂解、DNA释出的pH环境和离子环境，防止释出的DNA发生沉淀或氧化褐变。当DNA释出于由溶液A和溶液B配制的溶液C中时，通过氯仿的纯化和离心后，获得的上清液可直接用于PCR反应或通过乙醇沉淀析出DNA用于长期保存或使用。

本发明所得的DNA可于-20℃长期保存备用或加100～200μl超纯水溶解用于直接使用。

利用本发明能从水稻组织中高效、快速、简便地提取DNA，可以简化PCR检测技术中提取DNA的耗费人力、物力的繁琐工作。

与现有的植物DNA提取方法相比，本发明具有如下优点：

1)、快速、简便。本发明能够在2min内完成细胞破碎，且一次性可完成48份样品的破碎。10分钟就可完成96份样品的DNA提取，用于PCR扩增。

而传统的CTAB提取法，完成96份样品的DNA提取则在5小时以上。

2)、成本低。提取过程中减少了多种试剂的使用量，使用本发明从水稻中快速提取DNA仅应用于PCR反应时，无需使用乙醇或异丙醇沉淀。

3)、DNA产量高。0.001g的水稻样品用本试剂盒提取，可用作100次PCR扩增的DNA模板使用。而按照背景技术中告知的《用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法》，以0.004g的水稻样品为原料进行提取，所得也无法满足100次PCR扩增的DNA模板所需使用量。

4)、周期短。由于所需的水稻样品少，催芽、播种5～8天就可取少量叶片用于PCR检测。

5)、本发明不但可以叶片作为原料，还可以用别的组织(例如根、茎、老叶、嫩叶、叶鞘、穗等)作为原料；一般来说，根在催芽、播种的5～8天内即能取得。

6)、本发明可实现短期使用，也可实现长期保存；具有更大的通用性；具体为：利用本发明所得的DNA溶液可用于短期使用，进一步沉淀获得的DNA与传统方法获得的DNA是一样的，在冷冻条件下可以保存若干年。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是从水稻叶片中快速提取DNA经PCR扩增后实施的效果图；

RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217、RM3183引物序列来自GRAMENE网站(http://www.gramene.org/)的公开信息，并委托上海申能博彩公司合成用于PCR扩增；Marker为DL2000标准分子量图谱。

图2是经沉淀提取的DNA经光密度测定得出的含量对比图，1～5为5份样品的测定值。

图3是来自不同组织样品的模板DNA的PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

实施例1、一种快速提取水稻DNA的方法，依次进行以下步骤：

1)、取0.005g水稻叶片(日本晴经浸种、催芽后，播种7天后的幼嫩叶片)放入2ml的圆底离心管(江苏海门耀华玻璃仪器厂生产)，加入500μl试剂C和200μl氯仿，并加入1粒钢珠(为粒径5mm的碳素钢钢珠，购自上海自行车钢珠厂)；

试剂C的制作方法如下：先由试剂A、试剂B、蒸馏水按1∶2∶7的体积比混合成混合液，然后再加入占混合液0.2％体积比的β-巯基乙醇，得试剂C；该试剂C作为DNA提取液。

试剂A包括150mM sorbitol，125mM Tris，25mM EDTA-Na₂，500mM NaCl，20mMNa₂SO₃，质量浓度0.8％的CTAB，质量浓度2％的sarkosyl；其余为蒸馏水；pH7.5；

试剂B包括100mM Tris，500mM KCl，18mM MgCl₂，质量浓度1％的Triton X-100，其余为蒸馏水；pH9.0；

2)、将步骤1)所得的离心管放入细胞破碎仪(TissueLyserII，QIAGEN，德国)内，于28HZ的频率破碎2min；从而实现对水稻叶片进行破碎。

3)、将步骤2)所得的破碎后样品于10,000rpm离心5min；得上清液。

4)、以2μl的试剂D作为PCR反应缓冲液，取5μl上清液直接作为模板DNA，进行PCR检测。

试剂D包括50mM Tris，250mM KCl，9mM MgCl₂，质量浓度0.5％的Triton X-100，体积比10％的BSA(牛血清白蛋白)，其余为去离子灭菌水；pH9.0。该试剂D为10×PCR反应缓冲液，即试剂D占PCR反应体系的总体积的1/10。

用于PCR检测的PCR反应体系具体如下：

5μl上清液，2μl试剂D，1unit Taq酶，200mM dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP各50mM)，引物浓度0.2mM，加ddH₂O补至20μl。

所用引物分别为以下任意一种：

RM8213、RM17713、RM13、RM19234、RM217和RM3183；上述引物均可从gramene网站(http://www.gramene.org/)上获得。

PCR反应过程控制条件如下：

94℃ 6分钟

94℃ 50秒

55℃ 30秒

72℃ 40秒42cycle

72℃ 15分钟

15℃ 保存

所得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图1所示：不同的引物均能扩增出清晰的条带。从而证明：步骤3)所得的上清液的确含有足够含量DNA可用于PCR扩增，并且不同引物均能扩出良好的效果。

实施例2、一种快速提取水稻DNA的方法，在实施例1的基础上，根据PCR检测结果选择所需的上清液继续依次进行以下步骤：

4)、取400μl步骤3)所得的上清液于另一个离心管内，加600μl无水乙醇轻摇混匀，沉淀45min后，10,000rpm离心15min；弃上清液，得沉淀；

5)、将步骤4)所得的沉淀用500μl体积浓度70％的乙醇洗涤，10,000rpm离心15min；

6)、弃步骤5)所得的上清液，倒置离心管至晾干；所得DNA可长期保存。也可将其加100μl超纯水溶解获得含DNA的溶液。

上述6个步骤总计花费在2小时。

经测试：0.005克叶片克最终能获得25μg左右的核酸。5次重复实验所得的数据如图2所示。

实施例3、

分别选用水稻(日本晴)的老叶、茎、鞘、穗、根各0.005克作为原料替代实施例1中的幼嫩叶片，以RM8213作为引物，其余同实施例1；老叶、茎、鞘、穗、根均为90天所得；最终所得的结果如图3所示。

图3证明：不同组织所得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测的结果相一致。

对比实施例1：

选用同实施例1的水稻叶片0.005g水稻叶片，按照背景技术所告知的DNA快速制备方法进行提取，所得的上清液再按照上述实施例2的步骤4)～步骤6)进行操作，最终仅能获得10μg左右的核酸。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种快速提取水稻DNA的方法，其特征是包括以下步骤：

所述试剂A包括100～200mM山梨醇、100～150mM三羟甲基氨基甲烷、20～30mM乙二胺四乙酸二钠、400～600mM NaCl、15～25mM Na₂SO₃、质量浓度0.8％的十六烷基三甲基溴化铵和质量浓度2％的N-十二烷基肌氨酸钠，其余为蒸馏水；pH7.5；

所述试剂B包括90～110mM三羟甲基氨基甲烷、450～550mM KCl、15～20mM MgCl₂和质量浓度1％的聚乙二醇辛基苯基醚，其余为蒸馏水；pH9.0；

2)、对步骤1)所得的离心管内的水稻样品进行破碎处理；

2.根据权利要求1所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是将上述步骤3)所得的含DNA的上清液继续依次进行以下步骤：

6)、弃步骤5)所得的上清液，得沉淀；所述沉淀为DNA。

3.根据权利要求2所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是：取步骤3)所得的4～6μl上清液直接作为模板DNA，以试剂D作为PCR反应缓冲液，进行PCR检测；根据PCR检测结果选择所需的上清液进行步骤4)；

所述试剂D包括40～60mM三羟甲基氨基甲烷、200～300mM KCl、8～10mM MgCl₂、质量浓度0.5％的Triton X-100和体积浓度5～10％的BSA，其余为去离子灭菌水；pH9.0。

4.根据权利要求3所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是：

所述步骤2)的破碎为：将步骤1)所得的离心管放入细胞破碎仪内，于28HZ的频率破碎1.5～2.5min；

所述步骤3)的离心为：将步骤2)所得的破碎后的样品于8,000～10,000rpm离心4～6min。

5.根据权利要求4所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是：所述步骤6)为：弃步骤5)所得的上清液，倒置离心管至晾干，附着于离心管壁上的沉淀为DNA。

6.根据权利要求5所述的快速提取水稻DNA的方法，其特征是：所述步骤1)中钢珠的粒径为4～6mm。