CN110272896A - 一种花生基因组的提取方法 - Google Patents

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潘丽娟
陈明娜
陈娜
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杨珍
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

本发明公开了一种花生基因组的提取方法，属于生物大分子提取技术领域。本发明以改进CTAB法提取花生组织材料中的DNA，具有操作简便、快捷的优点，极大的缩短了试验时间，节约了大量的人力、物力，使繁琐的工作变得简单，成本低，提取率高；提取的材料范围广(根、叶和种子)，需要的样品量很少，可达到微量检测；具有很好的通用性，也可应用于其它植物材料的提取，同样取得了满意的结果。

Description

一种花生基因组的提取方法
技术领域
本发明属于生物大分子提取技术领域，具体涉及一种花生基因组的提取方法。
背景技术
基因组DNA的提取和纯化是植物分子生物学和遗传育种学的基础及关键环节。目前，常用来提取植物基因组DNA的方法有CTAB法、SDS法、酶法和高盐提取法等。CTAB法和SDS法都是在裂解植物细胞的基础上，多次利用有机溶剂进行抽提，使蛋白质等沉淀于有机试剂中，而核酸保留在水相，从而达到分离核酸的目的。
植物基因组DNA的提取方法很多，但不同的植物具有不同的特性，在实践中需不断加以改进才能得到理想的结果。
花生组织材料中的蛋白质、多糖、多酚物质以及其他次生代谢产物等给DNA的提取和纯化造成很大的阻碍。为了有效制备高纯度、高完整性的花生DNA，必须考虑尽量去除蛋白质、脂类、糖类、多酚类物质，并防止和抑制内源DNAase对DNA的降解。在几种常规提取花生DNA的方法中，相较于SDS法和高盐提取法，CTAB法更能有效去除植物中糖类和多酚类杂质。传统CTAB法获得的DNA的得率和纯度均较高，但也存在使用较多有毒有机试剂、操作过程繁琐等缺点。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适合实验室操作的方便快捷的花生基因组提取方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种花生基因组的提取方法，步骤如下：
(1)取新鲜花生组织，加入100μL CTAB提取缓冲液，研磨成匀浆；
(2)再加入100μL CTAB提取缓冲液，震荡混匀，65℃水浴15min，期间每隔5min取出摇匀一次；
(3)向(2)中加入100μL氯仿，震荡混匀，25℃，13000r/min转速离心10min；
(4)取上清液，加入100μL异丙醇，震荡混匀，25℃，13000r/min转速离心7min；
(5)弃上清液，向沉淀中加入150μL 70％酒精洗涤1次，弃上清液，室温下开盖放置使酒精挥发；
(6)最后加入水或TE，使沉淀溶解，保存备用。
在上述方案的基础上，步骤(2)中所述的CTAB提取缓冲液由以下试剂配置而成：Sorbitol(山梨醇)1.04g，0.5mol/L EDTA(pH 8.0，乙二胺四乙酸)1.76mL，1mol/L Tris-HCl(pH8.0)8.8mL，NaCl 1.87g，10％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)3.2mL，10％Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)4mL，先用10mL ddH2O溶解，再定容至40mL灭菌。
在上述方案的基础上，步骤(1)中新鲜花生组织量为l0mg。
在上述方案的基础上，步骤(6)所述的水或TE加入体积为65μL。
本发明技术方案的优点
本发明具有操作简便、快捷的优点，极大的缩短了试验时间，节约了大量的人力、物力，使繁琐的工作变得简单，成本低，提取率高；提取的材料范围广(根、叶和种子)，需要的样品量很少，可达到微量检测；具有很好的通用性，也可应用于其它植物材料的提取，同样取得了满意的结果。
花生富含脂类、蛋白、酚类等，有必要建立适合自身的高效、简便、经济且通用性好的花生基因组DNA提取方法。本发明在传统的CTAB法的基础上，通过对提取试剂、步骤等进行优化，旨在集成一种简单、快速而且可以直接从花生不同组织中提取高质量基因组DNA的新方法，以满足花生分子生物学研究的需要。山梨醇溶液可以调节渗透压，防止细胞核过早破裂。十二烷基肌氨酸钠是离子型表面活性剂，可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离。此外，提取过程中只使用氯仿抽提一次，操作流程简单，降低了实验的复杂程度，节省时间，适合大规模提取，另外，只用氯仿抽提而不用饱和酚或异戊醇，减少了有毒有机溶剂的使用，提高了实验的安全性。
本发明以改进CTAB法提取花生组织材料中的DNA，以期为进一步开展花生分子生物学研究奠定基础。
附图说明
图1实施例1中花生叶片基因组电泳图(M，Marker；1、2、3、4：提取的叶片基因组编号)；
图2实施例1中花生叶片基因组PCR结果(M，Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1、2、3：PCR产物编号)；
图3实施例2中花生子叶基因组电泳图(M，Marker；1、2、3、4：提取的子叶基因组编号)；
图4实施例2中花生子叶基因组PCR结果(M，Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1,2,3：PCR产物编号)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
取新鲜花生叶片组织l0mg，放置于1.5mL EP管中。加入少量液氮，使用塑料小研磨棒将组织迅速研碎，加入100μL CTAB提取缓冲液，使用塑料小研磨棒将组织迅速研磨成匀浆。再加入100μL CTAB提取缓冲液，震荡混匀；65℃水浴15min，期间每隔5min左右取出摇匀。每个1.5mL EP管中再加入100μL氯仿，震荡混匀。25℃，13000r/min转速离心10min。取上清液移入另一个l.5mL EP管中，加入100μL异丙醇，震荡混匀。25℃，13000r/min转速离心7min，弃上清液。沉淀再用150μL 70％酒精洗涤1次，弃上清液。在室温下开盖放置使酒精挥发，最后加入65μL水或TE，使沉淀溶解，保存备用。
采用琼脂糖凝胶电泳检测发现，提取的基因组片段完整，点样孔无蛋白或糖类杂质残留(图1)。
经紫外分光光度计检测，提取的DNA OD260/OD280介于1.8～2.0之间。以提取的DNA为模板，通过PCR技术扩增AhFAD2-2基因，基因长度1152bp。
引物序列为AhFAD2-2-F：5’-ATGGGAGCTGGCGGCCGA-3’和AhFAD2-2-R：5’-TCACAACTTATTGTTGTACCAGAATAC-3’。
PCR反应条件如下：94℃2min；94℃30s，68℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。琼脂糖电泳后发现，能够扩增获得条带清晰的目标基因条带，条带大小与目标基因相符(图2)。
实施例2
用刀片切一薄片新鲜花生子叶组织，约l0mg，放置于1.5mL EP管中。加入100μLCTAB提取缓冲液，使用塑料小研磨棒将组织迅速研磨成匀浆。再加入100μL CTAB提取缓冲液，震荡混匀；65℃水浴15min，期间每隔5min左右取出摇匀。每个1.5mL EP管中再加入100μL氯仿，震荡混匀。25℃，13000r/min转速离心10min。取上清液移入另一个l.5mL EP管中，加入100μL异丙醇，震荡混匀。25℃，13000r/min转速离心7min，弃上清液。沉淀再用150μL70％酒精洗涤1次，弃上清液。在室温下开盖放置使酒精挥发，最后加入65μL水或TE，使沉淀溶解，保存备用。
采用琼脂糖凝胶电泳检测发现，提取的基因组片段完整，点样孔无蛋白或糖类杂质残留(图3)。
经紫外分光光度计检测，提取的DNA OD260/OD280介于1.8～2.0之间。以提取的DNA为模板，通过PCR技术扩增AhFAD2-1基因，基因长度1140bp。
引物序列为AhFAD2-1-F：5’-ATGGGAGCTGGAGGGCGT-3’和AhFAD2-1-R：5’-TCAGAACTTGTTCTTGTACCAATAAA-3’。
PCR反应条件如下：94℃2min；94℃30s，68℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。琼脂糖电泳后发现，能够扩增获得条带清晰的目标基因条带，条带大小与目标基因相符(图4)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (4)

1.一种花生基因组的提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取新鲜花生组织，加入100μL CTAB提取缓冲液，研磨成匀浆；
(2)再加入100μL CTAB提取缓冲液，震荡混匀，65℃水浴15min，期间每隔5min取出摇匀一次；
(3)向(2)中加入100μL氯仿，震荡混匀，25℃，13000r/min转速离心10min；
(4)取上清液，加入100μL异丙醇，震荡混匀，25℃，13000r/min转速离心7min；
(5)弃上清液，向沉淀中加入150μL 70％酒精洗涤1次，弃上清液，室温下开盖放置使酒精挥发；
(6)最后加入水或TE，使沉淀溶解，保存备用。
2.根据权利要求1所述花生基因组的提取方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的CTAB提取缓冲液由以下试剂配置而成：Sorbitol 1.04g，0.5mol/LEDTA 1.76mL，1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)8.8mL，NaCl 1.87g，10％CTAB 3.2mL，10％Sarkosyl 4mL，先用10mL ddH2O溶解，再定容至40mL灭菌。
3.根据权利要求1或2所述花生基因组的提取方法，其特征在于，步骤(1)中新鲜花生组织量为l0mg。
4.根据权利要求3所述花生基因组的提取方法，其特征在于，步骤(6)所述的水或TE加入体积为65μL。
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