CN104120129A

CN104120129A - 牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用

Info

Publication number: CN104120129A
Application number: CN201410336602.4A
Authority: CN
Inventors: 谭训刚; 李美洁; 王倩; 尤锋; 焦爽
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2034-07-15
Also published as: CN104120129B

Abstract

本发明涉及牙鲆原始生殖细胞调控序列，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用。牙鲆Nanos3基因的3’UTR序列如SEQ ID No.1中所示。所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为在调控目的基因在原始生殖细胞中特异表达的应用。本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以用于牙鲆等海水鱼以及其它动物譬如斑马鱼PGCs的标记，以及PGCs中特异表达目的基因。

Description

牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用

技术领域

本发明涉及牙鲆原始生殖细胞调控序列，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用。

背景技术

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。针对养殖牙鲆种质退化、抗病力下降，严重制约其养殖产业发展的现象，近年来陆续在牙鲆中进行了多种育种方法的尝试。其中，性别控制育种、多倍体育种、分子标记辅助选择育种作为常用的育种方法，既耗时又需要较大的水体，也无法将外源优良性状基因导入。而且，通过保存亲本进行优良种质保存也需要大面积养殖水体。基于原始生殖细胞(PGCs)的操作技术，则可以分离获得PGCs，并通过PGCs的冷冻保存技术来有效地保存优良种质，如此减少优良性状牙鲆等鱼类种质资源保存需要的大量水体，也将促进人工分子设计育种将外源优良性状基因导入技术的开发。然而，有关于牙鲆PGCs相关研究尚未见到报道，PGCs特异基因及PGCs的标记也未获得。

发明内容

本发明在于提供一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列，牙鲆Nanos3基因的3’UTR序列如SEQ ID No.1中所示。

一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为在调控目的基因在原始生殖细胞中特异表达的应用。

所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为鱼类中调控目的基因在PGCs中特异表达的应用。

所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为斑马鱼或牙鲆中调控目的基因在PGCs中特异表达的应用。

本发明的优点：

本发明是首次在牙鲆中发现原始生殖细胞标志因子的调控序列，并证实其有原始生殖细胞特异性的调控作用，该序列在鱼类包括海水鱼类原始生殖细胞的标记、分离等应用中具有极大的价值，这为鱼类包括海水鱼类原始生殖细胞相关研究提供了基础技术保证。

本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以用于牙鲆等海水鱼以及其它动物譬如斑马鱼PGCs的标记以及PGCs中特异表达目的基因；在不影响原有细胞功能的条件下活体标记。

附图说明

图1为本发明实施例提供的Nanos3 3’UTR RACE电泳图谱。

图2本发明实施例提供的pSP64Poly(A)(Promega)组成示意图。

图3为本发明实施例提供的牙鲆Nanos3基因能够驱动GFP特异表达在斑马鱼PGCs中的示意图。其中，GFP-YPNanos3 3’UTR mRNA标记斑马鱼原始生殖细胞(PGCs)，侧面观，箭头所指位置是PGCs。hpf，受精后小时。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明的实验步骤。

实施例1

1.RNA提取及SMATer3’RACE文库的构建

牙鲆性腺的总RNA提取采用Trizol(Invitrogen)提取，具体步骤如下：取大约0.1mg牙鲆性腺，加入0.1mL Trizol，充分混匀，然后加入Trizol0.9mL，室温放置5min。加入氯仿0.2mL，剧烈振荡15s，室温放置3min。12000×g，4℃，离心15min，离心后将离心管小心取出。取上清到新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，12000×g，4℃，离心10min。去掉异丙醇，加入预冷的75％乙醇1mL洗涤沉淀，7500×g，4℃，离心5min。去掉乙醇，置于超净台中使乙醇挥发。加入水(无RNA酶)30μL，55-60℃水浴10min使RNA溶解，取出后置于冰上。加入1μL DNase(无RNA酶)，37℃水浴15min，消化DNA以去除DNA的残余。取出后置于冰上，1μL电泳检测质量及完整度，测吸光度检测浓度及质量。直接用于余下实验，或者液氮速冻，-80℃保存

SMATer3’RACE cDNA文库的合成利用SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)试剂盒进行，具体操作如下：合成所用的引物：3'-RACE CDS Primer A5'–AAGCAGTGGTATCA ACGCAGA GTA C(T)30VN–3'(12μM)。

取性腺总RNA3.75μL，1μL反转录引物3'-RACE CDS primer A70℃3min，冰上冷却2min，离心，加入2.0μL5X First-Strand Buffer，1.0μL DTT(20mM)，1.0μL dNTP Mix(10mM)，0.25μL RNase Inhibitor(40U/μL)，1.0μL SMARTScribe^TM Reverse Transcriptase(100U)，混匀后离心，42℃温育90min，然后70℃10min。离心后加20μL水(无RNA酶)稀释，-20℃保存备用。

2、Nanos3 3’UTR的获得。

PCR所用引物如下：(1)10X Universal Primer A Mix(UPM)长引物5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT–3'(0.4μM)，短引物5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'(2μM)；(2)Nested UniversalPrimer A(NUP)5'–AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGT–3'(10μM)；(3)RACE15’-CCGACCTGGTGTATGGATCC CACTGG-3’(10μM)；(4)RACE2 5’-CTGCGACAGTACGTGTGTCC CCTCTG-3’(10μM)。

按照巢式PCR进行两次反应。

第一次反应PCR管分配及所含混合物如下：

试剂(μL)管号	1-1	2-1	3-1
				10X Advantage2PCR Buffer	5.0	5.0	5.0
dNTP Mix(10mM)	1.0	1.0	1.0
				50X Advantage2Polymerase Mix	1.0	1.0	1.0
SMATer3’RACE文库	2.5	2.5	2.5
				引物UMP	5.0	5.0
引物RACE1	1.0		1.0
				水	34.5	35.5	39.5
总和	50.0	50.0	50.0

第一次PCR按照如下程序进行：94℃30s，72℃3min，反应5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，反应5个循环；然后94℃30s，68℃30s，72℃3min，反应25个循环；结束后取出1μL稀释50倍，并置于冰上。

第二次反应PCR管分配及所含混合物如下：

试剂(μL)管号	1-2	2-2	3-2
				10X Advantage2PCR Buffer	5.0	5.0	5.0
dNTP Mix(10mM)	1.0	1.0	1.0
				50X Advantage2Polymerase Mix	1.0	1.0	1.0
第一次反应对应管号的稀释物	5.0	5.0	5.0
				引物NUP	1.0	1.0
引物RACE2	1.0		1.0
				水	36.0	37.0	37.0
总和	50.0	50.0	50.0

第二次PCR按照如下程序进行：94℃30s，68℃30s，72℃3min反应25个循环。其中1-2，2-2，3-2对应的第一PCR管号分别为1-1，2-1，3-1。反应结束后取出10μL在1.0％的琼脂糖电泳检测，发现1-2的产物中含有2-2，3-2产物中没有的片段(参见图1)，然后将1-2剩下的产物(约40μL)通过胶回收的方法回收其独有的片段。

PCR产物的回收采用胶回收试剂盒(康为公司)进行，具体方法如下：制备大孔的琼脂糖凝胶，将回收用PCR反应液加入点样孔内，100V电压恒压电泳，使电泳条带分离效果达到最佳为止。在紫外灯下切下目的片段所在琼脂糖块放入1.5mL离心管中。按每100mg琼脂糖加300μL S1液的比例加入S1液，置50℃水浴10min，使琼脂糖块完全溶化。每2min颠倒混匀一次。将琼脂糖溶化后的溶液移入吸附柱，离心30s。倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入收集管。在吸附柱中加入500μL W1液，离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。在吸附柱中加入500μL W1液，静置1min后，离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。离心1min。将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入20uL EB液，37℃5min后，离心1min，取3μL回收溶液电泳检测回收结果。将DNA贮存于-20℃保存备用。

将PCR产物连接到pTransEasy-T3载体中(全式金公司)，并转化入Trans1-T1感受态细胞(全式金公司)中。

3、质粒的获得及测序。

铺平板(内含IPTG、X-gal和100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。挑取白色菌落于预先分装的3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的试管中，37℃培养过夜，碱裂解法提取质粒，具体如下：将1.5mL过夜培养的菌液，5000rpm离心5min，除去上清；加入200μL Buffer1(50mM Glucose,25mMTris-Hcl(pH8.0),10mM EDTA(pH8.0))，重悬菌体。加200μL Buffer2(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，轻轻混匀，冰上放置5min；200μL Buffer3(3M NaAc,pH5.2)，充分混匀，冰上放置5min；12000rpm离心5min，取上清至一新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀；冰上放置5min。12000rpm离心5min，除去上清，沉淀用300μL70％乙醇洗涤，7500rpm离心5min。除去上清，室温晾干后加40μL灭菌双蒸水溶解质粒。(7)除去上清，室温晾干后加40μL灭菌双蒸水溶解质粒。用EcoR I(宝生物)对质粒进行酶切，酶切的反应体系如下：1μL10×M Buffer，0.5μL EcoRI，3μL质粒DNA，6.5μL dd H₂O，37℃酶切2h。酶切后进行电泳检测，将阳性克隆菌株送到测序。将获得序列与已有的部分序列进行比较分析，从而获得如SEQ ID No.1所示的Nanos3 3’UTR序列。

SEQ ID No.1

AGCCAACAGGTGTCAGGTATATCGACAACAAGCCACTGCACAGAGGCCGCAGTTCTTTTTTATGTGTGATTTTTATTTTAATAGCACTAGTGTTGTTTTTTGCTTTTGTGTGGTTTTTGGTTTGGTTTTAATTTGCATGCTTTGGCACGTTTACACTGAGGCCTTCTGTGAAGCTGGCTGATCTTTCTGTGGGCCCTCTACTTCAAAAAGCGTCTGTTGGTGGATTTCGTGAGGTACTCTCTTTCGACAACGACTGCCAGATATGTTTGGGAGGAGAAAAGAAAAAATGTTTCTCAGGAAATTGTATGTTTGTTTTATTTATATTTTAAACGTGGCCATCCGATGTCCAGCCTCACTTTTCCTGTCCATGCATTGAAGGATTTCAACACAAATACCAAAGCTTTATCAGACCTACATTCATCATTGGTAATAATTTTACTACAGCATTTAAACATCATGTGACCATGTCAGTATTTTAAATTTTTAAAATATCAGTGACTTGTTCTAGTTCTAAGGTGTGTGAGTGAATTCCTGTTCCTGAGACATCCTGTTTTATTTTGAATATTCTATGTGTGGCTTTTCTAAAGGTAAAAAAAAAAAAAAAGCCGCTGTAACTCATCTGGCTTTGTGGGGGGGGGGATCTTTGTGTGAATATTCTTGTAGTTACACATGTCTAAAGTGAGTAAATCTGTGTTTGTATGCTTTGCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

(a)序列特征：

●长度：737

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：牙鲆

结构特点：上述所得SEQ ID No.1所示的Nanos3 3’UTR序列是从牙鲆性腺SMARTer RACE文库中通过RACE方法获得的。该序列特征是含有737个核苷酸，710-737为多聚腺苷酸尾巴，106-155核苷酸序列为多T序列，646-651GTGTG核苷酸序列为所有物种中高度保守序列。

实施例2

牙鲆Nanos3基因能够驱动GFP特异表达：

本实施例通过PCR扩增获得Nanos3 3’UTR(去掉710-737即多聚腺苷酸尾巴)，然后通过同源重组的方法插入GFP/pSP64-polyA载体中报告基因GFP及PolyA之间。

通过PCR扩增获得含有GFP、Nanos3 3’UTR(去掉多聚腺苷酸尾巴)以及poly A片段，纯化片段后体外合成RNA。

将合成的RNA注射到1-2细胞期斑马鱼胚胎中，荧光显微镜下观测(图3)，发现PGCs中有GFP的表达。

具体为：

1.GFP/pSP64-polyA的构建

PCR所用引物如下：GFP-pSP64-5:5’-AAGCTTGGGCTGCAG GTCGACATGAGTAAAGG AGAAGAA-3’；GFP-pSP64-3:5’-TGGGAGCTCGCCCGGGGATCCCTATTTGTATAGTTCATC-3’

利用内切酶对pSP64-polyA酶切线性化，酶切的反应体系如下：15μL10×T Buffer，5μL Sal I，5μL BamH I(宝生物)，20μL质粒DNA，55μL dd H₂O，37℃酶切2h。将pSP64polyA载体线性化，然后利用胶回收试剂盒(康为公司，如上)回收。

利用PCR扩增GFP,引物为GFP-pSP64-5和GFP-pSP64-3，Pfu(Promega)扩增程序为94℃30s，然后为94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35个循环。反应结束后取出10μL在1.0％的琼脂糖电泳检测，然后将剩下的产物(约40μL)通过胶回收的方法进行回收(康为公司，如上)。

将线性化的pSP64-polyA和GFP按照Clone EZ试剂盒(金斯瑞)比例混匀。

在22℃保持30min，之后在冰上保持5min，然后加入Trans1-T1感受态细胞中进行转化，铺平板(100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。

第二天进行质粒的获得及测序(如上)，将测序准确的GFP/pSP64-polyA载体保存。

2.GFP/pSP64-YPNanos3-polyA的构建

引物：GFPNanos3-5’:5’-GAACTATACAAATAGGGATCCAGCCAACAGGTGTCAGGT-3’；GFPNanos3-3’:5’-TGGGAGCTCGCCCGGGGATCCGGGCAAAGCATACAAACAC-3’。

利用内切酶对GFP/pSP64-polyA进行线性化，酶切的反应体系如下：5μL10×K Buffer，5μL BamH I(宝生物)，10μL质粒DNA，30μL dd H₂O，37℃酶切2h。然后利用胶回收试剂盒(康为公司，如上)回收。

利用PCR扩增Nanos3-3’UTR,引物为GFPNanos3-5’和GFPNanos3-3’，采用Pfu(Promega)酶，扩增程序：94℃30s，然后为94℃30s，55℃30s，72℃3min，35个循环。反应结束后取出10μL在1.0％的琼脂糖电泳，然后将剩下的产物(约40μL)通过胶回收的方法进行回收(康为公司，如上)。

将线性化的GFP/pSP64-polyA和Nanos3-3’UTR按照Clone EZ试剂盒(金斯瑞，如上)比例混匀。

提取质粒及测序(如上)，将测序准确的质粒命名为GFP/pSP64-YPNanos3–polyA并保存(参见图2)。

3.RNA的体外合成及纯化。

引物：GFP-nos3-3’UTR-F:5’-TTGTCGTTAGAACGCGGCTAC-3’,GFP-nos3-3’UTR-R:5’-TGTGGAATTGTGAGCGGATAA-3’。

利用引物(GFP-nos3-3’UTR-F和GFP-nos3-3’UTR-R)PCR扩增GFP-YPNanos3-polyA片段，采用Pfu(Promega)酶，扩增程序为94℃30s，然后为94℃30s，55℃30s，72℃3min，35个循环。反应结束后取出10μL在1.0％的琼脂糖电泳，然后将剩下的产物(约40μL)通过胶回收的方法进行回收(康为公司，如上)，测定浓度。

然后根据RNA合成试剂盒(mMESSAGEKit,Ambion)手册进行RNA合成，具体如下：按照如下比例加入试剂及PCR产物：

无RNA/DNA酶水补足20.0μL

混匀后，37℃反应2h，然后加入1μL TURBO DNase,混匀后37℃15min。反应结束后取出1μL在1.0％的琼脂糖电泳检测，然后在剩下的反应液中加入30μL水(无RNA/DNA酶)和30μL LiCl，混匀后–20℃冷却1h，以最高速4℃离心15min，小心去除上清液，然后用1mL70％乙醇清洗，以最高速4℃离心，小心去除上清液，干燥后用水(无RNA/DNA酶)溶解，并测定浓度。

4.显微注射

用0.2M的KCL稀释RNA到300ng/μL，然后注射到斑马鱼胚胎(1细胞)中，注射2nL，然后在28.5℃培养至适当时期，在荧光显微镜下观测并照相(参见图3)。绿色荧光蛋白(GFP)首先在整个胚胎中表达，而在受精后13小时(hpf)GFP逐渐特异表达在斑马鱼PGCs中，而在其它部位的表达逐渐消失；在19.5hpf和33hpf也可以看到GFP特异表达在PGCs中。

Claims

1.一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列，其特征在于：牙鲆Nanos3基因的3’UTR序列如SEQ ID No.1中所示。

2.一种权利要求1所述的牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，其特征在于：

所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为在调控目的基因在原始生殖细胞中特异表达的应用。

3.按权利要求2所述的牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，其特征在于：所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为鱼类中调控目的基因在PGCs中特异表达的应用。

4.按权利要求3所述的牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，其特征在于：所述SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列作为斑马鱼或牙鲆中调控目的基因在PGCs中特异表达的应用。