CN110157743A - 用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的注射剂及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于敲低大菱鲆14‑3‑3基因表达的注射剂及使用方法，属于分子生物学领域，所述注射剂的制备方法包括如下步骤：(1)基因主表达组织RNA提取，(2)dsRNA的制备：根据目的基因的CDS序列，设计特异性引物合成DNA产物片段。以步骤(1)提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR获得目的DNA片段，将DNA产物回收，以回收产物为模板，合成dsRNA，使用生理盐水稀释合成的dsRNA，其有效浓度为4ug/g，通过多点注射的方式，分2‑4次注射到鱼体背部肌肉中。本发明注射剂能够实现直接在鱼类个体水平上进行基因敲降，以便于研究大菱鲆14‑3‑3基因的功能。

Description

用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的注射剂及使用方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体地涉及到一种用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的dsRNA注射剂及使用方法。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、通过抑制mRNA翻译或使mRNA高效特异性降解从而介导转录后的基因沉默现象。由dsRNA介导的基因沉默过程通常需要经过三个步骤来实现。首先是dsRNA进入细胞后与酶蛋白Dicer结合并被Dicer切割成21-23nt长的小片段，这些小片段被称为siRNA；紧接着siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)；最后被激活的RISC在反义链的引导下与目标mRNA结合，通过抑制mRNA的翻译或使mRNA降解介导转录后的基因沉默。该现象首次在线虫中被发现，将dsRNA注入线虫后出现了基因表达沉默的现象。与传统的基因敲除手段相比，RNAi技术具有快速、高效、特异性强、操作简易等优点，近年来已经成为揭示不同物种中基因功能的工具，被广泛应用于植物、线虫、果蝇及哺乳动物，在生长发育、抗逆、信号转导等方面都发挥了重要的作用。在水产动物中的研究主要集中在模式动物斑马鱼中，研究方法主要是在胚胎中注射dsRNA进行干扰，研究基因在生长发育过程中所起到的作用，然而在幼鱼肌肉中注射进行干扰的研究方法未见报道。因此，在鱼类个体水平上研究基因在抗逆、信号转导等方面的功能需要新的研究方式。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的dsRNA注射剂及使用方法，所述dsRNA注射剂能够通过对鱼类肌肉注射来敲低大菱鲆14-3-3基因表达。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的dsRNA注射剂，所述注射剂的制备方法包括如下步骤：
(1)基因主表达组织RNA提取：提取大菱鲆鳃组织的RNA；
(2)dsRNA的制备：根据目的基因的CDS序列，设计特异性引物合成DNA产物片段，产物控制在300-800bp之间，上下游引物的5’端均需加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG；IR1F TAATACGACTCACTATAGGGG CACGAATCGCTTGCCACT，IR1RTAATACGACTCACTATAGGGAC GGAGAAGTTCAGAGCAAGG；
使用这对引物，以步骤(1)提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增获得目的DNA片段，将DNA产物回收，凝胶检测，并对其进行测序以确认合成片段的特异性，以回收产物为模板，合成dsRNA，Nanodrop 2000以及凝胶检测dsRNA质量与浓度；
本发明还提供上述注射剂的使用方法：合成的dsRNA保存在-80℃或者液氮中，使用前冰上融化再进行稀释操作，使用生理盐水稀释合成的dsRNA，根据鱼体重选择dsRNA注射剂量，其有效浓度为4ug/g，通过多点注射的方式，分2-4次注射到鱼体背部肌肉中，完成干扰过程。
本发明与现有技术相比的有益效果:
在基因功能研究方面，本发明提供的方法可以实现直接在鱼类个体水平上进行基因敲降，结合已有的细胞水平的基因敲降，可以更好地研究基因的功能。本发明针对的大菱鲆14-3-3可以作为接头或支架蛋白，在环境应激方面(如温度胁迫、盐度胁迫)发挥重要的作用，使用肌肉注射dsRNA对其进行有效干扰后，可以在个体水平更好地揭示该基因在环境胁迫方面发挥的功能，同时也可以为培育抗逆良种提供参考。
附图说明
图1大菱鲆14-3-3基因dsRNA凝胶电泳图：1、marker，2-4、dsRNA。
图2使用第一对引物(IR1F和IR1R)合成的dsRNA肌肉注射后产生的干扰效果。
图3用第二对引物(IR2F和IR2R)合成的dsRNA肌肉注射后产生的干扰效果。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明得保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的注射剂及使用方法，具体步骤如下：大菱鲆14-3-3基因dsRNA制备、肌肉注射干扰实验以及干扰效果的验证
1、14-3-3基因主表达组织RNA提取：采集鳃组织，使用Tiangen RNA快速提取试剂盒进行RNA提取，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，利用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA浓度，检测合格后保存于-80℃。
2、14-3-3基因的全长cDNA克隆：将鳃组织的RNA反转录成cDNA，通过TA克隆以及RACE的方法获得全长cDNA序列，并对序列进行生物信息学分析，如编码区的预测等。
3、dsRNA引物设计：以大菱鲆14-3-3基因全长cDNA序列为依据，在ORF内采用Primer5设计用于制备双链RNA的引物2对，干扰引物如表1所示：
表1干扰引物序列
其中TAATACGACTCACTATAGGG为T7启动子序列。
4、dsRNA合成：采用设计合成的dsRNA引物，以大菱鲆鳃组织总RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR获得目的DNA片段，将DNA产物回收，凝胶检测，并对其进行测序以确认合成片段的特异性，以回收产物为模板，使用HiScribeTMT7 High Yield RNA SynthesisKit合成dsRNA，Nanodrop 2000以及凝胶检测RNA质量与浓度。合成步骤如下：按照表2的配比方式配成20μl体系；
表2PCR反应体系
简单离心混匀后，37℃孵育2h。反应产物进行DNA酶处理，去除模板DNA，每20μl反应体系中加入30μl无核酸酶水溶液，然后加入2μlDNaseI(无RNase)，混合后并37℃孵育15分钟。孵育结束后利用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA浓度。
5、dsRNA纯化：按照RNA吸附柱的吸附效率，同时结合测量的RNA浓度，将孵育产物分批放入吸附柱，静置10min后，12000rpm离心2min，使用无酶水进行RNA的洗脱，对洗脱产物进行凝胶电泳检测产物RNA的质量，利用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA浓度，选择质量合格产物(260/280在1.8-2.0之间，凝胶电泳显示单一明亮条带)保存于-80℃备用。
6、肌肉注射干扰实验：干扰实验分为7组，其中6个干扰组由两种不同dsRNA三种不同浓度(2μg/g、4μg/g、6μg/g)组成，对照组注射等量的生理盐水。注射用鱼的大小为30±2g，注射方式为多点注射，分2-4次注射到鱼体背部肌肉中，完成干扰过程。在实验6h、12h、24h和48h分别取样干扰组和对照组鳃组织，液氮中保存。
7、干扰效果的验证：使用Tiangen RNA快速提取试剂盒对取样的鳃组织进行RNA提取，并使用Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)对14-3-3基因干扰效率进行检测，用大菱鲆18S基因做内参，定量引物和内参引物如表3所示：
表3定量引物和内参引物序列
实验结果采用2-ΔΔCt计算基因相对表达量，使用SPSS18.0软件对数据进行分析，使用Origin8.6软件对分析结果进行作图，结果如图2、图3所示。
8、实验结果
图1所示，为合成的双链RNA图，dsRNA条带清晰，特异性强。
图2所示，为使用第一对引物(IR1F和IR1R)合成的dsRNA肌肉注射后产生的干扰效果。
图3所示，为使用第二对引物(IR2F和IR2R)合成的dsRNA肌肉注射后产生的干扰效果。
结果显示，与对照组相比，第二对引物(IR2F和IR2R)合成的dsRNA没有产生很好的干扰效果，而第一对引物(IR1F和IR1R)合成的dsRNA在注射后产生了显著的干扰效果。另外三种不同浓度的注射都产生了显著的干扰效果，其中4μg/g注射12h后的干扰效果最为显著，随着时间的加长以及浓度的提高，干扰效果并没有提升，因此对大菱鲆14-3-3而言，使用IR1F和IR1R合成的dsRNA进行肌肉注射后具有高效的干扰效率，可以有效的实验目的基因的沉默。

Claims (2)

1.一种用于敲低大菱鲆14-3-3基因表达的dsRNA注射剂，所述注射剂的制备方法包括如下步骤：
(1)基因主表达组织RNA提取：提取大菱鲆鳃组织的RNA；
(2)dsRNA的制备：根据目的基因的CDS序列，设计特异性引物合成DNA产物片段，产物控制在300-800bp之间，上下游引物的5’端均需加入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG；IR1F TAATACGACTCACTATAGGGG CACGAATCGCTTGCCACT，IR1R TAATACGACTCACTATAGGGACGGAGAAGTTCAGAGCAAGG；
使用这对引物，以步骤(1)提取的RNA反转录合成的cDNA为模板，通过PCR获得目的DNA片段，将DNA产物回收，凝胶检测，并对其进行测序以确认合成片段的特异性，以回收产物为模板，合成dsRNA，使用Nanodrop 2000以及凝胶检测dsRNA质量与浓度。
2.根据权利要求1所述注射剂的使用方法：其特征在于所述方法具体为：合成的dsRNA保存在-80℃或者液氮中，使用前冰上融化再进行稀释操作，使用生理盐水稀释合成的dsRNA，根据鱼体重选择dsRNA注射剂量，其有效浓度为4ug/g，通过多点注射的方式，分2-4次注射到鱼体背部肌肉中，完成干扰过程。
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