CN113186187A

CN113186187A - 基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用

Info

Publication number: CN113186187A
Application number: CN202110386494.1A
Authority: CN
Inventors: 任涛; 张殿宸; 梁健鹏; 向斌; 林秋燕
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113186187B

Abstract

本发明公开了一种基于CRSIPR技术构建14‑3‑3ε基因敲除细胞株的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明提供一种敲除14‑3‑3ε基因的sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用CRISPR‑Cas9技术首次在鸡成纤维细胞系DF‑1细胞基因组上敲除14‑3‑3ε基因，使得14‑3‑3ε蛋白的表达完全丧失，获得14‑3‑3ε敲除的DF‑1细胞株，且敲除细胞株活性、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的DF‑1敲除的细胞模型；操作简便，周期短，成本低，改造后细胞株稳定，可用于研究14‑3‑3ε蛋白的生物学功能。

Description

基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用。

背景技术

14-3-3蛋白在大多数动植物中高度保守，哺乳动物细胞中有7种14-3-3蛋白亚型(β、γ、ε、σ、ζ、τ和η)。14-3-3家族的每个同工型可以形成同型或异型二聚体，作为分子伴侣蛋白主要结合磷酸化蛋白，并在受到刺激后调节其靶蛋白的细胞亚定位，从而调控如干扰素反应和细胞凋亡等多种细胞重要生理过程。研究显示，寨卡病毒NS3蛋白通过结合并隔离14-3-3ε与14-3-3η蛋白，以拮抗视黄酸诱导基因1(retinoicacidinduciblegene-1,RIG-1)和黑色素瘤分化相关分子(MDA-5)诱导的干扰素反应。抑制14-3-3ε蛋白的表达后，丙肝病毒和仙台病毒诱导的磷酸化干扰素调节因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF-3)减少，阻碍干扰素反应。丙肝病毒核心蛋白可以与14-3-3ε相互作用，调控Raf-1激酶活性并调节线粒体中BAX的释放，从而控制宿主细胞的信号转导和凋亡。使用14-3-3的抑制剂Difopein TFA或siRNA干扰14-3-3ε后能够抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)复制，过表达14-3-3ε导致HP-PRRSV复制增加。不难发现，14-3-3ε蛋白与多种病毒的感染致病过程密切相关，是今后研究病毒致病机制的一个重点。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出的特有免疫系统～CRISPR系统。利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的染色体上切除。近年来，科学家们从细菌中解析了这个系统的关键蛋白(Cas9)，并掌握了这个关键蛋白的操作技术。以该关键蛋白为核心的复合物能在一段RNA的指导下，定向寻找目标DNA序列，然后编辑DNA以扰乱基因或插入想要的序列。CRISPR方法正快速超越锌指核酸酶和其他编辑工具，能够快速的对生物DNA序列进行修剪、切断、替换或添加，且操作简单，成本低廉。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的第一个目的在于提供一种敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列。

本发明的第二个目的在于提供一种基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法。

本发明的第三个目的在于提供一种14-3-3ε基因敲除细胞株。

本发明的第四个目的在于提供上述14-3-3ε基因敲除细胞株的应用。

本发明的目的通过如下方法制备得到：

一种敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，其核苷酸序列为：5'-GGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'。

一种基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：

(1)根据上述敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸链，同时根据上述靶向敲除人P300基因的sgRNA序列获得其对应的DNA互补链，在其5'端加上AAAC、3'端加上C得到反向寡核苷酸链，将合成的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链变性、退火形成双链；

(2)将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；

(3)将步骤(2)制得的重组敲除表达载体使用脂质体转染法转染鸡成纤维细胞系DF-1细胞，培养，筛选稳转细胞，得到14-3-3ε基因敲除细胞株。

步骤(2)中所述的Cas9载体优选为PX459载体。

步骤(3)中所述的脂质体转染法所用的脂质体优选为Lipofectamine 2000。

步骤(4)中所述的DF-1细胞优选为处于对数生长期的细胞DF-1细胞。

步骤(4)中所述的筛选优选为嘌呤霉素筛选，所述的嘌呤霉素的浓度优选为0.5～1μg/mL；更优选为培养48h后，先用含0.5μg/mL嘌呤霉素的新鲜10％FBS的DMEM细胞培养液培养24h，然后更换为含1μg/mL嘌呤霉素的新鲜10％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养24h以实现嘌呤霉素筛选。

一种14-3-3ε基因敲除细胞株，通过上述方法制备得到。

上述14-3-3ε基因敲除细胞株在14-3-3ε蛋白自身生物学特性研究和/或与病毒相互作用研究中的应用。本发明可以为相关研究提供便利，发挥巨大作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的特异性靶向14-3-3ε基因的sgRNA，可通过CRISPR/Cas9技术构建14-3-3ε基因敲除的DF-1细胞系。经过抗性筛选得到稳定敲除14-3-3ε基因的细胞系，经过western blot实验方法验证敲除14-3-3ε基因。

(2)本发明构建方法构建的14-3-3ε基因敲除的可传代鸡成纤维细胞DF-1^Δ14-3-3ε稳定细胞株，敲除细胞株活性、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的DF-1敲除的细胞模型；操作简便，周期短，成本低，改造后细胞株稳定，为今后14-3-3ε生物学功能的研究提供了基因敲除模型。

附图说明

图1是PX459质粒图谱。

图2是Western Blot鉴定结果图。

图3是DNA测序结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

实施例1基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株

1.sgRNA设计与合成

根据ensembl公布的鸡源14-3-3ε(ENSGALG00000002661)基因下载相应核苷酸序列，在14-3-3ε第2个外显子区利用在线sgRNA设计工具(http://crispor.tefor.net)设计14-3-3ε的sgRNA(small guide RNA)，引物送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成的引物序列如下所示：

sgRNA-F：5'-caccgGGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'；

sgRNA-R：5'-aaacCTTTCTTCATTGATTCAACCc-3'。

2.重组真核表达质粒PX459-14-3-3ε的构建

退火：将公司合成的sgRNA序列离心后加入适量ddH₂O，使终浓度为100μmol/L，充分溶解后加入T4连接酶，使用PCR仪将sgRNA引物退火形成双链，反应体系如下：

PCR程序：37℃，30min；95℃，5min；

酶切：稀释载体PX459(质粒图谱如图1所示)至400ng/μL，利用BbsⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：

反应条件：37℃，7h

胶回收：1％琼脂糖凝胶电泳后使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit胶回收试剂盒进行凝胶纯化产物回收，具体步骤如下：

(1)对含有片段大小正确的目的基因的琼脂糖胶块在紫外灯下切取，将其放入1.5mL离心管中；

(2)每0.1g琼脂糖胶加入0.2mL Binding Buffer，于55～65℃条件下溶胶至完全溶化；

(3)将溶化后的琼脂糖胶移入提前套好下套管HiBind TM DNA柱子，10 000r/min室温离心60s，弃滤液；

(4)再向柱中加入0.3mL Binding Buffer，室温10 000g离心1min，弃滤液；

(5)向柱中加入0.7mL SPW Wash buffer，室温10 000g离心1min，弃滤液；

(6)重复步骤(5)，再洗一次；

(7)将柱子套回下套管中，13 000g室温空离2min；

(8)将柱子放入无菌1.5mL EP管上，向柱子膜中央滴入30～50μL洗脱液，13 000g室温离心2min，即得到纯化的DNA溶液，-20℃保存。

连接：使用T4 DNA连接酶将sgRNA与酶切回收后的PX459相连，反应体系如下：

反应条件：4℃，10h

转化：随后将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，在氨苄抗性的平板中倒置培养过夜，之后挑菌扩大培养并用菌液进行测序鉴定。转化过程：取连接好的产物10μL加入100μL DH5α细胞中，然后将混合物放置在冰上冰浴45min；将混合物在42℃的条件下水浴热冲击30s，然后再快速地将混合物插回冰上并冰浴2min；吸取LB液体培养基400μL到上述的质粒与感受态细胞的混合物中，将混合物放于温度条件为37℃的摇床上以频率150r/min振荡培养1h；将菌液使用已经灭菌好的涂布棒均匀涂布在预先配制好的氨苄固体LB培养基平板上，静置平板微干后，倒置平板于37℃培养箱培养过夜。挑取菌落进行摇菌扩大培养并用菌液进行测序鉴定。

3.质粒抽提

根据鉴定结果，对菌液进行质粒抽提，具体步骤如下：

(1)量取约12mL菌液于15mL离心管中，以10 000g室温离心60s；

(2)弃上清，向底物加入0.5mL预混RNaseA的Solution I，震荡重悬2～3min；

(3)向管中加入500μL Solution II，轻轻将离心管彻底上下颠倒7～10次至液体变清亮，室温静置孵育2min；

(4)向管中加入0.25mL预冷的Buffer N3，将离心管轻轻颠倒直至出现白色絮状物，室温条件下12 000g离心10～15min；

(5)取上清液至无菌1.5mL离心管中，加入与上清相同体积的ETR BindingBuffer，将混合液完全混匀；

(6)用下套2mL收集管的HiBind DNA Mini柱每次过滤0.7mL混合液，常温下10000g离心1min；

(7)重复步骤(6)直至所有液体均过柱成功；

(8)向柱中加入500μL ETR Wash Buffer，以10 000g室温离心60s，弃掉滤液并回收柱子；

(9)向柱中加入500μL HBC Buffer，以10 000g室温离心60s，弃掉滤液并回收柱子；

(10)向柱中加入700μL DNA Wash Buffer，以10 000g室温离心60s，弃掉滤液并回收柱子；

(11)重复步骤(10)；

(12)设置转速13 000g室温空离180s甩干柱子；

(13)把柱子放入新的无菌1.5mL EP中，柱子膜上加入0.1mL Elution Buffer，37℃静置2～5min；

(14)设置13 000g室温离心60s，以洗脱出柱上质粒，测定浓度后，保存于-20℃。

4.转染

使用Lipofectamine 2000介导的细胞转染方法将重组质粒PX459-14-3-3ε转染鸡成纤维细胞系DF-1细胞。具体操作如下：

1)DF-1细胞在75cm²细胞培养瓶中长至约50％左右，即可进行转染。

2)吸弃培养液，加入2mL PBS洗三次。

3)配制

A液：将PX459-14-3-3ε(1000ng/μL)5μL加入100μL Opti-MEN中，充分混匀。

B液：将15μL Lipo2000加入到100μL Opti-MEM中，充分混匀，室温静置5min。

4)将B液加入A液中，轻弹数次，室温静置20min。

5)吸弃培养皿中的Opti-MEM，将上述混合液慢慢滴加，均匀分散到培养皿中，加入3mL Opti-MEN，轻摇混匀，放入细胞培养箱中培养，每隔一小时轻晃摇匀一次。

6)培养4h后，吸弃培养皿中的Opti-MEM。

7)从边缘缓缓加入3mL预热后含10％FBS的DMEM细胞培养液，放入细胞培养箱中继续培养。

5.嘌呤药筛

确定嘌呤霉素筛选浓度：以6孔板常规培养未转染质粒的DF-1细胞，分别加入0.5、1、1.5和2μg/mL嘌呤霉素的含10％FBS的DF-1细胞培养液，培养48h，确定将所有未转染的DF-1细胞杀死的最低浓度为1μg/mL：

稳定细胞株的单克隆筛选：将转染后的细胞培养48h后，更换含0.5μg/mL嘌呤霉素的新鲜10％FBS的DMEM细胞培养液培养24h，然后更换为含1μg/mL嘌呤霉素的新鲜10％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养24h。并在显微镜下观察，经嘌呤霉素筛选后的细胞数量。嘌呤霉素筛选完成后换不加嘌呤霉素的培养液培养12h。

利用有限稀释法进行96孔板单细胞筛选。加入EDTA-Trypsin消化上述75cm²细胞培养瓶中细胞，消化完全后加10％FBS的DMEM细胞培养液后离心，弃上清后再加10％FBS的DMEM细胞培养液重悬。然后对细胞进行梯度稀释，最终得到细胞密度为5cell/mL的单细胞悬液，充分混匀后将上述细胞悬液接种于96孔板，每孔200μL，共接种3个96孔板。余下细胞培养至80％后冻存。96孔板中细胞接种24h后，在显微镜下观察，挑选只有单细胞的小孔，并进行编号。待96孔板长满后，移至24孔板中继续培养，培养过程中每隔一段时间更换培养液。

6.Western Blot鉴定

将细胞用冷的PBS洗2次，加入裂解液，于冰上裂解30min，用细胞刮将细胞刮下后放入1.5mL离心管中，10 000g，4℃离心10min，小心吸取上清至新的1.5mL离心管中，测定蛋白质总浓度，剩余蛋白加入蛋白loading buffer后沸水煮10min，所得样品用于WB检测。

(1)聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE的配制

按照表中所列组分及试剂加入量依次配置12％分离胶和5％浓缩胶；

表1 SDS-PAGE分离胶和浓缩配制成份

先灌注下层分离胶，静置室温待其聚合凝固，灌注上层浓缩胶，迅速插入加样梳，跑胶前去除梳子；

(2)加样：在第一孔加入蛋白Marker 5μL；第二孔加入正常DF-1细胞蛋白样品；第三孔加入DF-1^Δ14-3-3ε细胞蛋白样品。

(3)电泳：电泳使用Bio-Rad垂直电泳仪，浓缩胶使用恒定电压80V，分离胶电泳使用恒定电压保持120V，电泳至溴酚蓝指示剂达到分离胶底部后即可停止；

(4)转膜：电泳结束后去浓缩胶部分，将剩下整块分离胶浸泡于转移缓冲液。裁剪与胶块大小一致的1张硝酸纤维膜(NC膜)和6张3mm滤纸，放在膜转移缓冲液中浸泡5min充分湿润，从负极到正极按照3层滤纸--凝胶--硝酸纤维素膜--3层滤纸顺序依次叠放整齐置于湿转转膜仪的板上，排尽空气。以200mA恒定电流，转膜120min，之后取出NC膜；

(5)洗涤：将NC膜用TBST振荡洗涤3次，再用TBS振荡洗涤1次，每次10min；

(6)封闭：置向提前配好的封闭液中放入洗涤好的NC膜，室温封闭1h；用TBST振荡洗涤3次，再用TBS振荡洗涤1次，每次10min；

(7)一抗孵育：按照说明书稀释14-3-3ε抗体，置于室温孵育30min后，放置于4℃孵育过夜；

(8)二抗孵育：次日将NC膜用TBST振荡洗涤3次，再用TBS振荡洗涤1次，每次10min。将洗好的NC膜置于按照说明书稀释好的二抗中，避光室温振荡45min，用TBST振荡洗涤3次，再用TBS振荡洗次，每次10min；

(9)图片扫描，保存。结果如图2所示。检测结果显示14-3-3ε蛋白的表达已被完全敲除。

7.DF-1^Δ14-3-3ε细胞DNA测序

抽提DF-1^Δ14-3-3ε细胞DNA，使用PCR扩增包含14-3-3ε基因第二个外显子的DNA片段后测序。PCR引物序列如下：

F(5’-3’)：5'-AAGCAGTTCATTTTTCTTCTGG-3'

R(5’-3’)：5'-TAGGTAAAGCTGCACAGGCTGACTA-3'

测序结果如图3所示。

8.细胞株的细胞活性检

14-3-3ε基因敲除细胞株DF-1^Δ14-3-3ε与DF-1正常细胞株通过CCK8实验检测，发现二者在细胞活性上没有显著的差异。在连续传代后，检测细胞的14-3-3ε蛋白的表达以及对该段基因组测序，发现构建的细胞株十分稳定。不难想象，该敲除细胞株具有较大的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-F

<400> 1

caccgggttg aatcaatgaa gaaag 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-R

<400> 2

aaacctttct tcattgattc aaccc 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F（5’-3’）

<400> 3

aagcagttca tttttcttct gg 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R（5’-3’）

<400> 4

taggtaaagc tgcacaggct gacta 25

Claims

1.一种敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，其特征在于：其核苷酸序列为：5'-GGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'。

2.一种基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)根据权利要求1所述的敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸链，同时根据所述的敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列获得其对应的DNA互补链，在其5'端加上AAAC、3'端加上C得到反向寡核苷酸链，将合成的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链变性、退火形成双链；

3.根据权利要求2所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的Cas9载体为PX459载体。

4.根据权利要求2所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的脂质体转染法所用的脂质体为Lipofectamine 2000。

5.根据权利要求2所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的DF-1细胞为处于对数生长期的细胞DF-1细胞。

6.根据权利要求2所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的筛选为嘌呤霉素筛选。

7.根据权利要求6所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：

所述的嘌呤霉素的浓度为0.5～1μg/mL。

8.根据权利要求2所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：

所述的筛选的操作为培养48h后，先用含0.5μg/mL嘌呤霉素的新鲜10％FBS的DMEM细胞培养液培养24h，然后更换为含1μg/mL嘌呤霉素的新鲜10％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养24h以实现嘌呤霉素筛选。

9.一种14-3-3ε基因敲除细胞株，其特征在于：通过权利要求2-8任一项所述的方法制备得到。

10.权利要求9所述的14-3-3ε基因敲除细胞株在14-3-3ε蛋白自身生物学特性研究和/或与病毒相互作用研究中的应用。