CN109085365A

CN109085365A - 一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂

Info

Publication number: CN109085365A
Application number: CN201810978797.0A
Authority: CN
Inventors: 肖红; 肖一红; 曹胜亮; 丛芳源; 刘思当; 丁国飞; 刘家琪
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2038-08-27
Also published as: CN109085365B; CN111500576B; CN111500576A

Abstract

本发明公开了一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(HP‑PRRSV)感染的阻断剂，本发明发现了一个新的HP‑PRRSV细胞靶蛋白‑‑‑14‑3‑3ε蛋白，并找到了该受体的抑制靶点。在这些抑制靶点处对14‑3‑3ε基因进行干扰，或者利用14‑3‑3ε蛋白的抑制剂difopein均可显著降低HP‑PRRSV感染，这些抑制靶点及difopein可开发成防治PRRSV感染的药物，从而为HP‑PRRS研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

Description

一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂。

背景技术

猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称为蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种急性传染病。该病主要特征为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难，对养猪业造成巨大的经济损失。

2006年又出现了高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(HP-PRRSV)，与普通PRRSV相比，HP-PRRSV的NSP2蛋白缺失了大约30个氨基酸引起突变，造成毒力增强，能引起更高的发病率和死亡率，因此农业部于2008年将其归为A类传染病。

目前，现有的疫苗免疫效果不理想，HP-PRRSV与PRRSV的普通株交叉免疫保护力低，给HP-PRRSV的预防和治疗带来了极大的困难。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首次发现了14-3-3ε蛋白能够参与HP-PRRSV的生命周期过程中。基于此，

本发明的第一方面，提供14-3-3ε蛋白作为HP-PRRSV的靶蛋白在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

具体的，14-3-3ε蛋白是作为影响HP-PRRSV感染的靶蛋白。

本发明的第二方面，提供14-3-3ε蛋白的抑制剂在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

优选的，所述14-3-3ε蛋白的抑制剂为difopein。

本发明的第三方面，提供编码14-3-3ε蛋白的基因作为靶标在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

优选的，所述编码14-3-3ε蛋白的基因的序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：ATGGATGATCGAGAGGATCTGGTGTACCAGGCGAAGCTGGCCGAGCAG²⁹ GCTGAGCGATACGACGAAATGGTGGAGTCAATGAAGAAAGTAGCAGGGATGGATGTGGAGCTGACAGTTGAAGAACGAAACCTCCTATCGGTTGCATATAAGAATGTGATTGGAGCTAGAAGAGCCTCCT¹⁵⁹ GGAGAATAATCAGCAGCATTGAACAGAAAGAAGAAAACAAGGGAGGAGAAGACAAGCTAAAAATGATTCGGGAATATCGGCAAATGGTTGAGACTGAGCTAAAGTTAATCTGTTGTGACATTCTGGATGTACTGGACAAACACCTCATTCCAGCAGCTAACACTGGCGAGTCCAAGGTTTTCTATTATAAAATGAAAGGGGACTACCACAGGTATCTGGCAGAATTTGCCACAGGAAATGACAGGAAGGAGGCTGCGGAGAACAGCCTAGTGGCTTATAAAGCTGCTAGTGATATTGCAATGACAGAACTTCCACCAACACATCCTATTCGCTTAGGTCTTGCTCTCAATTTTTCCGTATTCTACTACGAAATTCTTAATTCCCCTGACCGTGCCTGCAGGTTGGCAAAAGCAGCTTTCGATGATGCAATTGCAGAACTGGATACGCTGAGTGAAGAAAGCTATAAGGACTCTACACTTATCAT⁶⁴³ GCAGTTGTTACGTGATAATC TGACACTATGGACTTCAGACATGCAGGGTGACGGTGAAGAGCAGAATAAAGAAGCGCTGCAGGACGTGGAAGACGAAAATCAGTGA。(SEQ ID NO.1)

本发明的第四方面，提供一种siRNA，所述siRNA为如下(1)-(3)中的任一：

(1)siRNA，其正义链如SEQ ID NO.2所示，反义链如SEQ ID NO.3所示；

(2)siRNA，其正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示；

(3)siRNA，其正义链如SEQ ID NO.6所示，反义链如SEQ ID NO.7所示。

本发明的第五方面，提供上述siRNA在降低编码14-3-3ε蛋白基因的转录和/或降低14-3-3ε蛋白的表达中的应用。

本发明的第六方面，提供上述siRNA在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

本发明的第七方面，提供一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂，所述阻断剂中含有上述14-3-3ε蛋白的抑制剂和/或siRNA。

本发明的第八方面，提供上述阻断剂在制备防治HP-PRRSV感染的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明发现了一个新的HP-PRRSV细胞靶蛋白---14-3-3ε蛋白，并找到了该受体的抑制靶点，14-3-3ε蛋白能够参与HP-PRRSV的感染，因此，干扰14-3-3ε基因或蛋白表达，或者利用14-3-3ε蛋白的抑制剂difopein均可显著的降低HP-PRRSV感染细胞有显著的抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物，从而为PRRS研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

附图说明

图1：Marc-145细胞上14-3-3β和14-3-3εsiRNA沉默效果的real-time PCR(A)、混合后siRNA沉默效果的real-time PCR(B)和Western blot(C)检测结果。

图2：14-3-3ε沉默后HP-PRRSV感染后不同时间对HP-PRRSV感染的real-time PCR(A)和Western blot(B)检测结果。

图3：14-3-3过表达细胞系的构建Wester blot验证及14-3-3ε和14-3-3β过表达细胞系对HP-PRRSV复制影响的Real-time PCR检测结果(B、C)。

图4：PAM细胞上Real-time PCR检测14-3-3εsiRNA沉默效果(A)及其对HP-PRRSV感染影响(B)。

图5：Difopein对Marc-145细胞和PAM毒性(A、D)及对HP-PRRSV感染的影响real-timePCR(B、C)、Western blot(E)和病毒滴度TCID50(F)结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，HP-PRRSV与PRRSV的普通株交叉免疫保护力低，给HP-PRRSV的预防和治疗带来了极大的困难。因此需要寻找新的防控该病的途径。以蛋白质组学为技术手段，寻找参与病毒感染过程的细胞蛋白，以这些细胞蛋白为靶标的药物或抑制剂的研究成为目前研究的热点。

在所有的真核细胞中，14-3-3蛋白都有表达且该蛋白是一个可溶性蛋白，包括7种亚型，分别为β、γ、ε、ε、σ、ζ、δ。本申请发明人首次发现14-3-3ε蛋白可以作为影响HP-PRRSV复制的靶蛋白，细胞蛋白14-3-3ε的抑制剂及其siRNA可对阻断HP-PRRSV的感染。

上述病毒受体(靶蛋白)及受体抑制剂针对高致病性毒株(HP-PRRSV)(代表毒株为TA-12，GenBank的登录号为HQ416720)。该抑制剂主要抑制HP-PRRSV感染细胞。经过试验验证出14-3-3εsiRNA及其抑制剂difoepin能够稳定地作为HP-PRRSV感染细胞的阻断剂，这在之前的研究中一直未见应用。

其病毒靶细胞蛋白14-3-3ε蛋白具体分离及鉴定过程为：

根据NCBI公布的14-3-3ε(GenBank登录号：XM008009806.1)和14-3-3β(GenBank登录号：XM_017028039.2)基因序列设计引物扩增14-3-3ε基因片段并送生工生物(上海)工程技术服务有限公司测序(序列见附件)。根据14-3-3ε、β基因测序列，利用设计了14-3-3ε第29、159、643位siRNA基因沉默位点序列。14-3-3β在第21、138位siRNA基因沉默位点序列及阴性对照序列(见表1；位点是正义序列的起始位点)。荧光定量的结果显示14-3-3ε第29、159、643位siRNA敲低效率分别为75％、90％及91％；14-3-3β在第21、138位siRNA敲低效率分别为82％和87％(见图1A)。将合成siRNA分别混合后转染Marc-145中的14-3-3ε、β基因沉默后能显著性的降低这两种亚型mRNA和蛋白的表达(见图1B、1C)。为了进一步验证哪一个亚型的14-3-3蛋白在HP-PRRSV感染过程中起着重要作用，分别将14-3-3ε、β基因沉默后接种HP-PRRSV，在不同时间点收集样品，用real-time PCR检测病毒拷贝数，结果发现，沉默14-3-3ε基因后能显著的降低HP-PRRSV感染。在感染后12h、24h、36h时，对照组病毒拷贝数分别是沉默组的37.14、42.25、12.22倍(见图2A)，14-3-3β基因沉默对病毒感染没有影响。Western blot验证也发现14-3-3ε基因沉默后显著降低了HP-PRRSV的感染，而14-3-3β基因沉默和对照siRNA对PRRSV感染没有影响(见图2B)。同时进行了互补研究，将Marc-145细胞中过表达14-3-3ε和β基因，在感染HP-PRRSV不同时间收取样品进行Real-time PCR和Western blot验证。结果表明14-3-3ε和β成功获得过表达(见图3A)，与慢病毒空载体感染的Marc-145细胞相比，HP-PRRSV在14-3-3ε过表达细胞系上的复制能力显著增强(见图3B)，而14-3-3β过表达的细胞系上HP-PRRSV复制与慢病毒空载体对照组相比没有差异(见图3C)。

为了进一步验证14-3-3ε在HP-PRRSV感染过程中的作用，将14-3-3ε的siRNA转染到猪肺巨噬细胞(PAM)，结果发现也能显著性的沉默14-3-3ε基因(见图4A)，降低HP-PRRSV的感染(见图4B)

Difopein是14-3-3的竞争性抑制剂，用CCK-8法测定了difopein对Marc-145细胞和PAM的毒性作用，结果表明该抑制剂对Marc-145细胞和PAM均有较小的毒性(见图5A、D)。将difopein加入接毒后的Marc-145细胞和PAM上，对HP-PRRSV感染的影响，Real-time PCR检测结果表明0.08μg/ml difopein可以使HP-PRRSV在Marc-145细胞上拷贝数降低10倍(见图5B)，在PAM上降低7.7倍(见图5C)。Western blot结果也表明0.08μg/ml的difopein能明显的抑制HP-PRRSV在Marc-145细胞和PAM的感染(见图5E)。研究还发现0.08μg/ml的difopein对能使HP-PRRSV的TCID50降低1个lg值(见图5F)。

通过以上研究发现了一个新的HP-PRRSV细胞靶蛋白，并找到了该受体的抑制靶点。对14-3-3ε基因这些位点进行干扰，或者利用14-3-3ε蛋白的抑制剂difopein均可对HP-PRRSV感染细胞有显著的抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物，从而为PRRS研究和防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

RNA干扰是由双链RNA引起的基因沉默现象，广泛应用于研究基因的功能、药物靶点筛选、疾病治疗等方面。siRNA设计是实现RNA干扰的有效途径，siRNA设计的优劣将直接影响RNA干扰的效果。现有siRNA设计方法中主要是基于序列特征，没有考虑靶结构对siRNA干扰效率的影响，导致设计出的siRNA序列的干扰效率较低；而且预测候选siRNA的干扰效率的准确度不高，导致候选的siRNA数量过多，给生物实验带来了很大的困难；再加之siRNA普遍存在脱靶效应，因此，siRNA的设计难度较大。本发明基于14-3-3ε基因的序列特征，并综合考虑14-3-3ε蛋白的结构特征；在预测siRNA干扰效率时，既考虑siRNA自身特征，也考虑mRNA全局特征和靶点附近的局部特征，进而设计了14-3-3ε第29、159、643位siRNA基因沉默位点序列，具体如下：

Epsilon-29：

正义序列：GCUGAGCGAUACGACGAAATT；(SEQ ID NO.2)

反义序列：UUUCGUCGUAUCGCUCAGCTT。(SEQ ID NO.3)

Epsilon-159:

正义序列：GGAGAAUAAUCAGCAGCAUTT；(SEQ ID NO.4)

反义序列：AUGCUGCUGAUUAUUCUCCTT。(SEQ ID NO.5)

Epsilon-643:

正义序列：GCAGUUGUUACGUGAUAAUTT；(SEQ ID NO.6)

反义序列：AUUAUCACGUAACAACUGCTT。(SEQ ID NO.7)

上述设计得到的siRNA的干扰效果优异，均具有显著的抑制HP-PRRSV感染的效果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：参与PRRSV感染14-3-3亚型的鉴定

我们前期将PRRSV非结构蛋白nsp2基因连接到真核表达载体，在293T细胞中表达，经GFP-Trap琼脂糖珠收集与nsp2可能相互作用的细胞蛋白，通过质谱分析和Western blot验证发现细胞蛋白14-3-3与nsp2具有相互作用(Xiao et al,J Proteome Res.2016,15(5):1388-1401)。为了进一步研究14-3-3的哪种亚型参与PRRSV感染，根据质谱结果选择14-3-3β、ε两种亚型，设计了针对这2种亚型的siRNA，降低其表达后，分析对HP-PRRSV感染的影响。

根据NCBI公布的14-3-3β、ε基因序列(GenBank登录号：XM008009806.1、XM_017028039.2)设计引物扩增14-3-3β和14-3-3ε基因片段并送生工生物(上海)工程技术服务有限公司测序。根据14-3-3β、ε基因测序结果，14-3-3ε第29、159、643位siRNA基因沉默位点序列、14-3-3β在第21、138位siRNA基因沉默位点序列及阴性对照序列(见表1)。序列设计后送上海吉玛制药技术有限公司进行合成，合成序列用DEPC水稀释成1μM分装到无RNA酶的1.5mL离心管中，保存于-20℃。

选择状态良好的Marc-145细胞以1.5×10⁵个/mL密度铺于6孔板，等细胞密度为70％左右进行转染siRNA。根据RNAiMAX Reagent说明书，每孔以25μM的量分别进行转染siRNA，混匀，于37℃，5％CO₂培养箱培养24h。弃旧细胞培养基，用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，同时提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。

荧光定量的结果显示14-3-3ε第29、159、643位siRNA敲低效率分别为75％、90％及91％；14-3-3β在第21、138位siRNA敲低效率分别为82％和87％(见图1A)。将合成siRNA分别混合后转染Marc-145中的14-3-3ε、β基因沉默后能显著性的降低这两种亚型蛋白和mRNA的表达(见图1B、1C)。为了进一步验证哪一个亚型的14-3-3蛋白在HP-PRRSV感染过程中起着重要作用，分别将14-3-3ε、β基因沉默后接种HP-PRRSV，在不同时间点收集样品，用real-time PCR检测PRRSV的拷贝数，结果发现，沉默14-3-3ε基因后能显著的降低HP-PRRSV感染。在感染后12h、24h、36h时，对照组病毒拷贝数分别是沉默组的37.14、42.25、12.22倍(见图2A)，14-3-3β基因沉默对病毒感染没有影响。Western blot验证也发现14-3-3ε基因沉默后显著降低了HP-PRRSV的感染，而14-3-3β基因沉默和对照siRNA对PRRSV感染没有影响(见图2B)。

表1：

注：表1中，N.C表示阴性对照序列。本发明中使用了Marc-145细胞系和PAM，Marc-145细胞系是PRRSV的易感细胞系，来自于猴肾上皮细胞，PAM是原代猪肺巨噬细胞，这两个细胞系用于检测GAPDH的引物序列不同，分别列了出来。14-3-3ε和14-3-3β的基因序列找的是猪和猴共同保守的序列，为相同的引物序列。

实施例2：14-3-3蛋白过表达细胞系的构建及其对PRRSV感染的影响

(1)14-3-3慢病毒构建

根据GenBank中登录的14-3-3基因序列，设计扩增不同亚型14-3-3的引物，具体如下：

14-3-3β-leti：正向引物5’-CGGGATCCATGACAATGGATAAAAGTGAG-3’；反向引物5’-CCCGAATTCTTAGTTCTCTCCCTCCCCAG-3’。

14-3-3ε-leti：正向引物5’-CGGGATCCATGGATGATCGAGAGGATCTG-3’；反向引物5’-CCCGAATTCTCACTGATTTTCGTCTTCCAC-3’。

分别带有BamH I，EcoR I限制性酶切位点。以从Marc145细胞的RNA为模板，克隆出目的片段，将经限制性酶酶切以后的目的片段和慢病毒空载体pwpxld在16℃下过夜连接。转化进T1感受态，挑取单个菌落进行PCR、酶切验证和序列测定验证。大量提取验证正确的质粒保存于-80℃备用。

(2)稳定表达14-3-3亚型蛋白细胞系的筛选

将构建好的质粒和辅助质粒按比例混合：pWPXLd-14-3-3：psPAX2：pMD2.G(VSV-G)＝3:2:1，转染至单层293T细胞上进行病毒包装，48h后收集细胞上清。上清中含有重组毒，将该重组毒接种到单层Marc145细胞上，感染48小时后在培养基中加入嘌呤霉素使浓度变为10μg/ml，然后每2天更换含有嘌呤霉素选择性培养基。嘌呤霉素选择后10天出现嘌呤霉素抗性细胞克隆。将生长性质良好的细胞进行亚克隆，待细胞生长稳定后。将全细胞蛋白(每泳道10μg)加入到12％梯度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中。将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上，并用单克隆抗14-3-3抗体或单克隆抗GAPDH抗体进行检测。经Clarity^TM Western ECL Substrate检测后，发现成功构建了过表达14-3-3不同亚型蛋白的细胞系Marc-145^14-3-3β和Marc-145^14-3-3ε(见图3A)。将这些细胞系扩大培养，液氮保存备用。

(3)Marc145-过表达14-3-3亚型细胞系对PRRSV感染的影响

为了检测病毒蛋白，将0.1MOI的HP-PRRSV接种在Marc-145^14-3-3β、Marc-145^14-3-3ε和Marc-145^14-3-3γ和Marc-145上，在感染后的第0h，6h，12h，24h，36h，48h收取细胞，提取总RNA，并使用real-time PCR用引物对扩增HP-PRRSV的N基因，研究病毒感染情况。结果表明，与慢病毒空载体感染的Marc-145细胞相比，HP-PRRSV在14-3-3ε过表达细胞系上的复制能力显著增强(见图3B)，而14-3-3β过表达的细胞系上HP-PRRSV复制与慢病毒空载体对照组相比没有差异(见图3C)。

实施例3：在PAM上敲低14-3-3ε及其对HP-PRRSV感染的影响

为了进一步验证该结果，取原代猪肺巨噬细胞(PAM)进行验证。将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用高压灭菌后的PBS(加入1/25体积PBS的1640培养基和5×双抗)洗涤外表面，将pH7.2的PBS 30.0ml-50ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1-2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，1500r/min离心5-10min，收集沉淀。用含有5×双抗的PBS洗涤两次，每次要轻轻混匀后离心。后加入适量含10％胎牛血清的1×RPMI1640(含有2×双抗)营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37℃，5％CO₂培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非粘附细胞继续用含10％胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。在PAM细胞上转染混合的siRNA(即Epsilon-29、Epsilon-159和Epsilon-643的混合)沉默14-3-3ε(图4A)，用real-time PCR进行检测对HP-PRRSV感染的影响，结果发现在感染后6h、12h、24h时对照组的HP-PRRSV的拷贝数分别是其10.4、4.24、22.6倍(图4B)。

实施例4：14-3-3抑制剂difopein对HP-PRRSV感染的阻断实验

Difopein是R18的二聚体形式，R18是第一个报道的14-3-3蛋白抑制剂，由20个氨基酸残基组成。R18可以与14-3-3中心(WLDLE)为主要氨基酸组成的保守的两亲槽结合，可以阻断14-3-3与其配体的结合，而影响其功能的发挥。

首先用CCK-8法验证了difopein对Marc-145和PAM的毒性，结果发现Marc-145细胞在0-1.25μg/ml，PAM在0-0.08μg/ml之间属于安全应用范围(见图5中A、D)。

在单层Marc-145和PAM细胞上，将0.1MOI的高致病性PRRSV感做1h，换成含有0、0.02、0.08μg/ml的difopein维持液，24h后收取细胞，提取蛋白和RNA进行Western blot和Real-time PCR分析。Real-time PCR检测结果表明0.08μg/ml difopein可以使HP-PRRSV在Marc-145细胞上拷贝数降低10倍(见图5B)，在PAM上降低7.7倍(见图5C)。Western blot结果也表明0.08μg/ml的difopein能明显的抑制HP-PRRSV在Marc-145细胞和PAM的感染(见图5E)。研究还发现0.08μg/ml的difopein对能使HP-PRRSV的TCID50降低1个lg值(见图5F)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂

<130> 2018

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 14-3-3 ε基因

<400> 1

atggatgatc gagaggatct ggtgtaccag gcgaagctgg ccgagcaggc tgagcgatac 60

gacgaaatgg tggagtcaat gaagaaagta gcagggatgg atgtggagct gacagttgaa 120

gaacgaaacc tcctatcggt tgcatataag aatgtgattg gagctagaag agcctcctgg 180

agaataatca gcagcattga acagaaagaa gaaaacaagg gaggagaaga caagctaaaa 240

atgattcggg aatatcggca aatggttgag actgagctaa agttaatctg ttgtgacatt 300

ctggatgtac tggacaaaca cctcattcca gcagctaaca ctggcgagtc caaggttttc 360

tattataaaa tgaaagggga ctaccacagg tatctggcag aatttgccac aggaaatgac 420

aggaaggagg ctgcggagaa cagcctagtg gcttataaag ctgctagtga tattgcaatg 480

acagaacttc caccaacaca tcctattcgc ttaggtcttg ctctcaattt ttccgtattc 540

tactacgaaa ttcttaattc ccctgaccgt gcctgcaggt tggcaaaagc agctttcgat 600

gatgcaattg cagaactgga tacgctgagt gaagaaagct ataaggactc tacacttatc 660

atgcagttgt tacgtgataa tctgacacta tggacttcag acatgcaggg tgacggtgaa 720

gagcagaata aagaagcgct gcaggacgtg gaagacgaaa atcagtga 768

<210> 2

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Epsilon-29

<400> 2

gcugagcgau acgacgaaat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Epsilon-29

<400> 3

uuucgucgua ucgcucagct t 21

<210> 4

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Epsilon-159

<400> 4

ggagaauaau cagcagcaut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Epsilon-159

<400> 5

augcugcuga uuauucucct t 21

<210> 6

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Epsilon-643

<400> 6

gcaguuguua cgugauaaut t 21

<210> 7

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Epsilon-643

<400> 7

auuaucacgu aacaacugct t 21

<210> 8

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Beta-21

<400> 8

gcugguacag aaagccaaat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Beta-21

<400> 9

uuuggcuuuc uguaccagct t 21

<210> 10

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Beta-138

<400> 10

cucuguugcc uacaagaaut t 21

<210> 11

<211> 21

<212> SiRNA

<213> Beta-138

<400> 11

auucuuguag gcaacagagt t 21

<210> 12

<211> 21

<212> SiRNA

<213> N.C

<400> 12

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 13

<211> 21

<212> SiRNA

<213> N.C

<400> 13

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 14-3-3 β

<400> 14

tgagaagaag cagcagatg 19

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 14-3-3 β

<400> 15

ttccgatgtc cacagagt 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 14-3-3 ε

<400> 16

cgacgaaatg gtggagtc 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 14-3-3 ε

<400> 17

tgctggaatg aggtgttt 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> PRRSV N gene

<400> 18

agatcatcgc ccaacaaaac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> PRRSV N gene

<400> 19

gacacaattg ccgctcacta 20

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> GAPDH (swine)

<400> 20

actcactctt ccacttttga tgct 24

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH (swine)

<400> 21

tgttgctgta gccaaattca 20

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> GAPDH (monkey)

<400> 22

acccactctt ccaccttcga cgct 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH (monkey)

<400> 23

tgttgctgta gccaaattcg 20

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 14-3-3β-leti

<400> 24

cgggatccat gacaatggat aaaagtgag 29

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 14-3-3β-leti

<400> 25

cccgaattct tagttctctc cctccccag 29

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 14-3-3ε-leti

<400> 26

cgggatccat ggatgatcga gaggatctg 29

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 14-3-3ε-leti

<400> 27

cccgaattct cactgatttt cgtcttccac 30

Claims

1.14-3-3ε蛋白作为HP-PRRSV的靶蛋白在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

2.14-3-3ε蛋白的抑制剂在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述14-3-3ε蛋白的抑制剂为difopein。

4.编码14-3-3ε蛋白的基因作为靶标在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述编码14-3-3ε蛋白的基因的序列如SEQID NO.1所示。

6.一种siRNA，其特征在于，所述siRNA为如下(1)-(3)中的任一：

(1)siRNA，其正义链如SEQ ID NO.2所示，反义链如SEQ ID NO.3所示；

(2)siRNA，其正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示；

(3)siRNA，其正义链如SEQ ID NO.6所示，反义链如SEQ ID NO.7所示。

7.权利要求6所述的siRNA在降低编码14-3-3ε蛋白基因的转录和/或降低14-3-3ε蛋白的表达中的应用。

8.权利要求6所述的siRNA在制备抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

9.一种抑制高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂，其特征在于，所述阻断剂中含有权利要求2或权利要求3所述的14-3-3ε蛋白的抑制剂和/或权利要求6所述的siRNA。

10.权利要求9所述的阻断剂在制备防治HP-PRRSV感染的药物中的应用。