CN114404439A - 抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)感染的阻断剂，属于兽用生物制品技术领域。所述不同类型PRRSV感染的阻断剂是以内质网应激激活剂为二硫苏糖醇、衣霉素中的一种或二者的混合为活性成分。本发明在PRRSV感染诱导内质网应激的基础上，发现了内质网应激的激活剂二硫苏糖醇(DTT)、衣霉素(TU)及二者的联合应用能显著性的抑制高致病性PRRSV(HP‑PRRSV)、NADC30‑like与经典PRRSV(LP‑PRRSV)感染的阻断剂，可显著降低PRRSV感染，可开发成防治不同类型PRRSV感染的药物，从而为PRRS防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。

Description

抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称为蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一种急性传染病。该病主要临床特征为母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸困难，给养猪业造成巨大的经济损失。由于PRRSV具有高度的变异性，多种类型PRRSV在临床上流行，主要以HP-PRRSV、NADC30-like与LP-PRRSV为流行优势毒株，现有疫苗免疫效果不理想，并且尚无有效治疗药物，这些已成为该病防控中的难题。
内质网是新合成的膜蛋白与分泌蛋白折叠及糖基化修饰，在正常的生理条件下，内质网中产生的错误折叠蛋白主要通过内质网相关蛋白降解(ERAD)进行清除，从而维持内质网的稳态。而当处于缺氧、病毒感染等应激条件下，内质网中的非折叠蛋白及错误折叠蛋白将显著增加，当超过内质网自身的正常处理能力时，将引起内质网应激。
有研究表明PRRSV感染后能引起内质网应激反应。但内质网应激反应激活对不同类型PRRSV感染的影响不同，不同内质网的激活剂或抑制剂对PRRSV感染的影响也不同。目前还很少见有基于内质网应激反应的调控剂来开发治疗和预防PRRSV感染的药物的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂。本发明发现，内质网应激的激活剂二硫苏糖醇(DTT)、衣霉素(TU，Tunicamycin)能够抑制PRRSV感染；两者联合应用在抑制PRRSV感染上具有协同效果，能显著性的抑制高致病性PRRSV(HP-PRRSV)、NADC30-like与经典PRRSV(LP-PRRSV)感染，可开发成防治不同类型PRRSV感染的药物，由此提出了本发明。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供内质网应激激活剂在制备抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂中的应用。
优选的，所述内质网应激激活剂为二硫苏糖醇(DTT)、衣霉素(TU，Tunicamycin)中的一种或二者的混合。
更优选的，所述内质网应激激活剂由二硫苏糖醇和衣霉素混合而成。
优选的，猪繁殖与呼吸综合症病毒的种类为HP-PRRSV型、LP-PRRSV型和NADC30-like型。
本发明的第二方面，提供一种抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的组合物，所述组合物包括：二硫苏糖醇和衣霉素。
优选的，所述组合物中含有600μM的二硫苏糖醇和(0.05-0.1)μg/ml的衣霉素。
优选的，所述不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒包括：HP-PRRSV型、LP-PRRSV型和NADC30-like型。
本发明的第三方面，提供上述组合物在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药物中的应用。
本发明的第四方面，提供一种预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药物，所述药物以上述组合物为有效成分。
所述药物中除含有上述有效成分外，还可以包含一种或多种药学上可接受的载体。例如：羟丙甲纤维素、甲基纤维素、硬脂酸、壳聚糖、丝素蛋白、脂质体等。
药物的剂型可以以注射制剂的形式存在，如水性悬浮液、油性悬浮液、乳浊液或者溶液制剂；也可以以口服制剂的形式存在，如粉剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等。
本发明的有益效果：
本发明在PRRSV感染诱导内质网应激的基础上，发现了内质网应激的激活剂二硫苏糖醇(DTT)、衣霉素(TU，Tunicamycin)及二者的联合应用能显著性的抑制高致病性PRRSV(HP-PRRSV)、NADC30-like与经典PRRSV(LP-PRRSV)感染的抑制剂，可显著降低PRRSV感染，可开发成防治不同类型PRRSV感染的药物，从而为PRRS防治提供了一个全新的思路，扩大了研究范围，对于实际生产有着极为重要的意义。
附图说明
图1：DTT在Marc-145上对TA-12感染的影响；
DTT对Marc-145细胞毒性(A)及对TA-12感染的影响Western blot(B、C)结果。
图2：TU在Marc-145上对TA-12感染的影响；
TU对Marc-145细胞毒性(A)及对TA-12感染的影响Western blot(B、C)结果。
图3：DTT和TU联合应用在Marc-145上对TA-12感染的影响；
不同药物处理方式对TA-12感染后的Westernblot(A、C)和real-time PCR(B、D)检测结果。
图4：DTT和TU联合应用在Marc-145上对TA-01和CH-1R感染的影响；
不同药物处理方式对TA-01与CH-1R感染后的Western blot(A、B)检测结果；不同药物处理方式对TA-01感染后的real-time PCR(C、D)检测结果；不同药物处理方式对CH-1R感染后的real-time PCR(E、F)检测结果。
图5：DTT和TU联合应用在PAMs上对TA-12、TA-01和CH-1R感染的影响
DTT对PAM细胞毒性(A)及TU对PAM细胞毒性(B)，在PAM细胞上同药物处理方式对TA-12、TA-01与CH-1R的real-time PCR(C、D、E、G、H、I)和Western blot(F、J)检测结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
本发明中所用的PRRSV毒株，HP-PRRSV型以TA-12株为代表，LP-PRRSV型以CH-1R株为代表，NADC30-like型以TA-01株为代表。公众自申请日起20年内可从申请人处获得上述毒株以用于重复本发明。
本发明中所使用的维持液为含有2％胎牛血清培养基。
本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
实施例1：内质网应激激活剂DTT对HP-PRRSV(以TA-12株为代表)感染的抑制实验
首先用CCK-8法验证了不同浓度DTT(1μM、5μM、10μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、2mM、3mM)对Marc-145的毒性，结果发现DTT在0-600μM之间属于安全应用范围(见图1A)。
在单层Marc-145细胞上，分别加入0、200、400、600μM的DTT预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12，换成含有2％胎牛血清培养基，TA-12感染24h后用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞提取蛋白进行Western blot验证，以检测不同浓度DTT对TA-12感染作用，Western blot结果表明600μM的DTT能明显的抑制TA-12在Marc-145细胞的感染(见图1B)，其中：N代表PRRSV的N蛋白，以此评价病毒的感染情况；GRP78蛋白是内质网应激反应的一个标志蛋白，以此来检测TU和DTT对内质网应激反应的作用。上述结果说明：DTT可以用于预防HP-PRRSV的感染。
在单层Marc-145细胞上，以0.1MOI接种HP-PRRSV毒株TA-12，6h后换成含有600μMDTT的维持液，分别在12h，24h，36h后收取细胞样品，进行Western blot验证，以检测DTT对PRRSV的治疗作用，Western blot结果表明600μM的DTT对TA-12在Marc-145细胞的感染有明显抑制作用(见图1C)。该结果说明：DTT可以用于治疗HP-PRRSV的感染
实施例2：内质网应激激活剂TU对TA-12感染的抑制实验
首先用CCK-8法验证了不同浓度TU(0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL)对Marc-145细胞的毒性，结果发现TU处理在0-0.8μg/ml之间属于安全应用范围(见图2A)。
在单层Marc-145细胞上，加入0、0.2、0.4、0.8、1μg/mL的TU预处理4h后，以0.1MOI感染TA-12，换成含有2％胎牛血清培养基，TA-12感染24h后，用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，以检测不同浓度TU对TA-12的作用，Western blot结果表明0.2μg/mL的TU能明显的预防TA-12在Marc-145细胞的感染(见图2B)。结果说明TU可以用于预防HP-PRRSV的感染。
在单层Marc-145细胞上，以0.1MOI接种HP-PRRSV毒株TA-12，分别在12h，16h，20h后换成含有0.1μg/mL TU的维持液，在24h后收取细胞样品，进行Western blot验证，以检测TU对TA-12的治疗作用，Western blot结果表明0.1μg/mL的TU对TA-12在Marc-145细胞的感染有明显抑制TA-12感染作用(见图2C)。该结果说明TU可以用于治疗HP-PRRSV的感染。
实施例3：DTT与TU的联合应用对TA-12感染的抑制实验
1、实验方法
实验设如下处理：
DMSO+TA-12：在单层Marc-145细胞上，加入二甲基亚砜(DMSO)预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12，在TA-12感染后24h后用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，同时提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
DTT+TA-12：在单层Marc-145细胞上，加入600μM的DTT预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12，在TA-12感染后24h后用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，同时提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
TU+TA-12：在单层Marc-145细胞上，加入0.1μg/mL的TU预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12，在TA-12感染后24h后用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，同时提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
(TU+DTT)+TA-12：在单层Marc-145细胞上，同时加入600μM的DTT与0.1μg/mL的TU合用预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12，在TA-12感染后24h后用预冷的PBS清洗细胞，用移液枪把全部细胞吹打下来，转移到新的离心管中，2000rpm离心3min，弃上清，留沉淀。用细胞裂解液裂解细胞收取蛋白进行Western blot验证，同时提取细胞RNA并进行反转录进行荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
TA-12+DMSO：在单层Marc-145细胞上，以0.1MOI接种HP-PRRSV毒株TA-12，4h后换成含DMSO的维持液，24h后收集细胞进行Western blot验证和荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
TA-12+DTT：在单层Marc-145细胞上，以0.1MOI接种HP-PRRSV毒株TA-12，4h后换成含600μM DTT的维持液，24h后收集细胞进行Western blot验证和荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
TA-12+TU：在单层Marc-145细胞上，以0.1MOI接种HP-PRRSV毒株TA-12，4h后换成含0.05μg/mL TU的维持液，24h后收集细胞进行Western blot验证和荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
TA-12+(TU+DTT)：在单层Marc-145细胞上，以0.1MOI接种HP-PRRSV毒株TA-12，4h后换成含600μM DTT和0.05μg/mL TU的维持液，24h后收集细胞进行Western blot验证和荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
(TU+DTT)+TA-12+(TU+DTT)：在单层Marc-145细胞上，同时加入600μM的DTT与0.1μg/mL的TU合用预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12，4h后换成含600μM DTT和0.05μg/mL TU的维持液，24h后收集细胞进行Western blot验证和荧光定量PCR验证(荧光定量PCR所用的引物见表1)。
2、实验结果
实验结果见图3，由图3A和图3B可以看出：利用DTT和TU对Marc-145细胞进行预处理，能够抑制TA-12感染Marc-145细胞；而将DTT与TU合用与单一使用相比，能更显著性的降低TA-2在Marc-145细胞的感染。该结果说明DTT和TU联合应用可更显著性的抑制TA-12的感染，可以用于预防HP-PRRSV的感染。
由图3C和图3D可以看出：DTT与TU合用比DTT和TU单独使用更能显著性的抑制TA-12在Marc-145细胞的感染，降低病毒基因的拷贝数。该结果说明DTT和TU联合应用可以用于治疗HP-PRRSV的感染，比DTT或TU单独效果明显。
表1：荧光定量所用引物
Figure BDA0003501018280000061
注：表1中，本发明中使用了Marc-145细胞系和PAM，Marc-145细胞系是PRRSV的易感细胞系，来自于猴肾上皮细胞，PAM是原代猪肺巨噬细胞，这两个细胞系用于检测GAPDH的引物序列是不同的，所以分别列了出来。
实施例4：DTT与TU的联合应用对不同类型PRRSV感染的抑制实验
用600μM的DTT以及0.1μg/mL的TU对单层Marc-145细胞进行不同的处理，分别接种CH-1R和NADC30-like(以TA-01株为代表)两种不同类型的PRRSV，24h后收集细胞检测病毒的感染情况以检测DTT与TU对不同类型PRRSV感染的预防和治疗作用，具体实验步骤与实施例3中预防和治疗实验一致。其中：
DMSO+TA-01表示用DMSO预处理4h后接毒；DTT+TA-01表示用DTT预处理4h后接毒；TU+TA-01表示用TU预处理4h后接毒；(TU+DTT)+TA-01表示用TU和DTT联合预处理4h后接毒；TA-01+DMSO表示接毒4h后换成含有DMSO的维持液；TA-01+DTT表示接毒4h后换成含有DTT的维持液；TA-01+TU表示接毒4h后换成含有TU的维持液；TA-01+(TU+DTT)表示接毒4h后换成含有TU和DTT的维持液；(TU+DTT)+TA-01+(TU+DTT)用TU和DTT预处理4h后接毒，4h后换成含有TU和DTT的维持液。
DMSO+CH-1R表示用DMSO预处理4h后接毒；DTT+CH-1R表示用DTT预处理4h后接毒；TU+CH-1R表示用TU预处理4h后接毒；(TU+DTT)+CH-1R表示用TU和DTT联合预处理4h后接毒；CH-1R+DMSO表示接毒4h后换成含有DMSO的维持液；CH-1R+DTT表示接毒4h后换成含有DTT的维持液；CH-1R+TU表示接毒4h后换成含有TU的维持液；CH-1R+(TU+DTT)表示接毒4h后换成含有TU和DTT的维持液；(TU+DTT)+CH-1R+(TU+DTT)用TU和DTT预处理4h后接毒，4h后换成含有TU和DTT的维持液。
我们发现DTT和TU均能明显抑制CH-1R在Marc-145细胞上的感染(见图4A、B)。Real-time PCR检测结果(引物见表1)也表明DTT和TU单个的预防作用可以使CH-1R在Marc-145细胞上拷贝数降低10倍以上。并且DTT与TU合用的作用可以使CH-1R在Marc-145细胞上拷贝数降低100倍以上(见图4E、F)。同时发现DTT和TU也能明显抑制TA-01在Marc-145细胞上的感染(见图4A、B)。Real-time PCR检测结果也表明DTT和TU单个使用的作用可以使TA-01在Marc-145细胞上拷贝数降低10倍以上。并且DTT与TU合用的作用可以使TA-01在Marc-145细胞上拷贝数降低100倍以上(见图4C、D)。该结果说明DTT和TU联合应用可以用于预防和治疗CH-1R和NADC30-like型PRRSV的感染，比DTT或TU单独效果更显著。
实施例5：内质网应激激活剂DTT与TU合用在PAM上对不同类型PRRSV感染的抑制实验
首先用CCK-8法测定了DTT与TU对PAM细胞的毒性作用，结果表明600μM的DTT与0.05μg/mL的TU对PAM细胞有较小的毒性(见图5A、B)。
在PAM细胞上，评价DTT和TU联合应用对HP-PRRSV/NADC30-like/LP-PRRSV 3种不同类型PRRSV的预防和治疗效果，具体实验步骤与实施例3中抑制剂预防和治疗实验一致。具体为在PAM细胞上，用含有600μM DTT和0.05μg/mL TU的培养基预处理4h后，以0.1MOI接种TA-12/CH-1R/TA-01三种不同类型的PRRSV，24h后收集细胞检测病毒的感染情况以检测在PAM上DTT与TU合用对不同类型PRRSV感染的预防作用。Real-time PCR结果(荧光定量PCR所用的引物见表1)表明DTT和TU的联合应用对三种不同类型的PRRSV的均有预防作用，并且DTT和TU的联合应用比单个使用效果要好很多。(见图5C、D、E)。Western blot结果也显示DTT和TU的联合应用具有更好的预防PRRSV感染的作用(见图5F)。该结果说明，在PRRSV体内自然感染细胞PAM上DTT和TU联合应用可以用于HP-PRRSV/NADC30-like/LP-PRRSV 3种不同类型PRRSV的预防，比DTT或TU单独效果显著。
在PAM细胞以0.1MOI接种TA-12/CH-1R/TA-01三种不同类型的PRRSV，4h后换含有600μM DTT和0.05μg/mL TU的维持液，24h后收集细胞检测病毒的感染情况以检测在PAM上DTT与TU合用对不同类型PRRSV感染的治疗作用。Real-time PCR结果表明DTT和TU的联合应用对三种不同类型的PRRSV的具有更好的治疗作用(见图5G、H、I)。Western blot结果也显示DTT和TU的联合应用能明显的抑制PRRSV在PAM细胞的感染(见图5J)。该结果说明，在PRRSV体内自然感染细胞PAM上，DTT和TU联合应用可以用于HP-PRRSV/NADC30-like/LP-PRRSV 3种不同类型PRRSV的治疗，比DTT或TU单独治疗的效果更为显著。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂
<130> 2022
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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tgttgctgta gccaaattcg 20

Claims (9)

1.内质网应激激活剂在制备抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述内质网应激激活剂为二硫苏糖醇、衣霉素中的一种或二者的混合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述内质网应激激活剂由二硫苏糖醇和衣霉素混合而成。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，猪繁殖与呼吸综合症病毒的种类为HP-PRRSV型、LP-PRRSV型和NADC30-like型。
5.一种抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的组合物，其特征在于，所述组合物包括：二硫苏糖醇和衣霉素。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物中含有600μM的二硫苏糖醇和(0.05-0.1)μg/ml的衣霉素。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其特征在于，所述不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒包括：HP-PRRSV型、LP-PRRSV型和NADC30-like型。
8.权利要求5或6所述的组合物在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药物中的应用。
9.一种预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药物，其特征在于，所述药物以权利要求5或6所述的组合物为有效成分。
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