CN112336717A - 尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，属于医药领域。本发明通过qRT‑PCR、Western Blot、测定细胞上清中子代病毒TCID50及IFA等方法研究了尹奎色亭在Marc‑145和PAM细胞水平上对PRRSV的抗病毒作用，结果表明，尹奎色亭显著的抑制了PRRSV在其易感细胞Marc‑145和宿主靶细胞PAM中的增殖，且其抗病毒作用随浓度增加而上升。本发明证明了尹奎色亭制剂具有很好的抗病毒效果，有望成为一种新型的防治猪繁殖与呼吸综合征的药物。

Description

尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)引起的对全球养猪业危害极大的一种重要的猪传染病。PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年龄段猪特别是仔猪的呼吸道症状，特征性病变为严重的间质性肺炎，死亡率极高。
PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：
(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病：PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages,PAMs),PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，引起免疫抑制；
(2)抗原变异性：PRRSV是RNA病毒，PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；
(3)抗体依赖性增强(ADE)特性：PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而在病毒的感染过程中有促进作用；
(4)病毒持续性感染：PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症；
(5)继发感染：PRRSV感染后，猪体免疫系统受到抑制导致免疫力低下，容易发生猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌等病原菌的继发感染；
(6)混合感染：目前临床上容易发生混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、主流行性腹泻病毒等与PRRSV的混合感染使PRRSV防控难上加难。
目前市场上现有的针对PRRSV不同毒株的疫苗不能够长期给猪提供百分之百的全面保护，因此，急需开发新的抗PRRSV感染的药物，以有效防治猪繁殖与呼吸道综合征。
尹奎色亭(Equisetin)最早发现于陆生真菌，具有抗菌、抗艾滋病、以及抗癌等诸多活性，其结构如式Ⅰ所示。凭借特异的化学结构和显著的生物活性，尹奎色亭及其类似物引起了化学及医药研究者的广泛关注，目前尹奎色亭主要被用作抗菌剂，抑制革兰氏阳性细菌，也有研究表明其能够用于防治代谢综合征和烟草赤星病。现有技术中尚未有尹奎色亭用于防治猪繁殖与呼吸道综合征的报道。
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发明内容
本发明的目的是提供尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明证明了尹奎色亭能显著抑制PRRSV在Marc-145细胞和PAM细胞中复制与增殖，可用于制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
优选的，所述尹奎色亭及其药学上可接受的盐的浓度为1-30μM。
优选的，所述的药物中还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述的辅料为磷酸盐缓冲液(PBS)或二甲基亚砜(DMSO)。
优选的，所述的药物剂型为注射剂或口服制剂。
优选的，所述的注射剂为冻干粉针剂。
优选的，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。
本发明公开了以下技术效果：
1、本发明采用的尹奎色亭生产工艺成熟，可以为制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制备提供充足的原料。
2、尹奎色亭抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果明显，本发明通过体外试验发现，尹奎色亭能显著抑制PRRSV在其易感细胞Marc-145细胞和宿主靶细胞PAM细胞中的复制与增殖。
3、本发明使用方便，药品为粉末制剂，2-8℃密封保存即可保存，易于运输，且即溶即用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为qPCR检测不同浓度尹奎色亭处理后PRRSV ORF7 mRNA表达结果图；
图2为Western Blot检测不同浓度尹奎色亭处理对PRRSV感染Marc-145细胞的结果图；
图3为不同浓度尹奎色亭处理后Marc-145细胞培养上清中子代PRRSV的TCID50的测定结果图；
图4为Western Blot检测不同浓度尹奎色亭处理对PRRSV感染PAM细胞的影响结果图；
图5为不同浓度尹奎色亭处理后PAM细胞培养上清中子代PRRSV的TCID50的测定结果图；
图6为IFA检测不同浓度尹奎色亭处理对PAM细胞中PRRSV N蛋白表达的影响结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中所使用的材料，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
实施例1
1、尹奎色亭配制
将尹奎色亭溶解于DMSO，配制为10mM，使用时再用细胞培养基DMEM倍比稀释，用0.2μm的滤膜过滤除菌，分装后用锡箔纸包裹，贮存于-80℃备用。
2、尹奎色亭处理PRRSV感染的Marc-145细胞
Marc-145细胞以1×105个细胞/ml的密度培养于含DMEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2的湿润培养箱中培养至70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1ml PBS/孔洗涤3次。每孔分别加入2ml含前文所述稀释好的不同浓度(0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM)尹奎色亭的DMEM培养基，置于37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。病毒感染后48h，分别收集细胞上清和细胞。
实施例2
1、qPCR检测不同浓度尹奎色亭处理后PRRSV ORF7 mRNA表达
胰酶消化实施例1中病毒感染的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4℃，500g离心10min，弃去上清。每管加入1ml TRIzol(购自Invitrogen公司)，参照说明书抽提总RNA。用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒(购自TAKARA公司)将RNA反转录成cDNA。
最后应用SYBR GREEN试剂盒(购自Roche公司)和上述反转录的cDNA模板及设计好的PRRSV ORF7基因的上下游引物，在Applied Biosystems仪器的StepOnePlus Real-TimePCR System上进行实时荧光定量PCR检测。PRRSV ORF7基因的上下游引物如下所示(SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2)：
F：AGATCATCGCCCAACAAAAC
R：GACACAATTGCCGCTCACTA
反应条件为：95℃10min进行变性；95℃15sec，60℃1min，反应40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec进行溶解曲线分析。
结果(图1)表明，尹奎色亭以浓度梯度依赖性方式抑制PRRSV ORF7mRNA表达，即抑制PRRSV的增殖。
实施例3
1、Western blot检测不同浓度尹奎色亭处理对PRRSV感染Marc-145细胞的影响
胰酶消化实施例1所述的病毒感染后的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4℃，500g离心10min，弃去上清。沉淀用200μL NP40裂解液冰上裂解30min；12000g离心10min，除去细胞碎片，取上清，5μL裂解样品中加入45μL PBS，Pierce BCA protein Assay Kit测定总蛋白浓度，进行Western Blot检测。每个泳道40μg总蛋白，在Bio-Lab电泳仪上以150V电压进行SDS-PAGE；转膜后，将膜小心取出，封闭液4℃封闭过夜；弃封闭液，用洗脱液洗膜，每次5min共洗4次；加入一抗：anti-N蛋白抗体，anti-α-tubulin抗体室温孵育2h；弃一抗，用PBS’T洗膜，5min×4次；加入二抗：HRP-Goat anti-Mouse IgG，室温孵育1h；弃二抗，用PBS’T洗膜，5min×4次；PBS洗膜，5min×4次；最后进行ECL发光显色。
如图2的检测结果表明，尹奎色亭呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV N蛋白表达，即抑制PRRSV的增殖。
实施例4
1、不同浓度尹奎色亭处理后Marc-145细胞培养上清中子代病毒PRRSV的TCID50的测定
将实施例1中收集的病毒感染后细胞培养上清，用无血清DMEM细胞培养基作10倍梯度稀释为10-1至10-8，接种在Marc-145细胞汇合度为70％～80％的96孔细胞培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.1ml，37℃孵育1h后每孔再加入175μL含3％FBS的DMEM维持液，37℃、5％CO2培养箱中培养3-7d，每天观察细胞病变(CPE)。
PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞聚堆呈火山堆状，细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。
检测结果如图3所示，尹奎色亭呈现浓度梯度依赖性的降低Marc-145细胞培养上清中PRRSV的病毒滴度，即抑制PRRSV的增殖。
实施例5
1、尹奎色亭处理PRRSV感染的PAM细胞
PAM以1×106个细胞/ml的密度培养于含RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃孵育1h，吸弃病毒液，分别加入含有不同浓度尹奎色亭(0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM)和3％FBS的RPMI-1640维持液培养基，于37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养，同时用不含尹奎色亭的含有3％FBS的RPMI-1640培养基作为对照，24hpi后收集细胞及上清。
实施例6
1、Western Blot检测不同浓度尹奎色亭处理对PRRSV感染PAM细胞的影响
Western Blot检测样品来自实施例5所收集的细胞样品。
Western Blot检测方法同实施例3中所描述的方法。
Western Blot检测结果如图4所示，与未经尹奎色亭处理的对照组相比，尹奎色亭以浓度依赖性方式抑制PRRSV N蛋白表达。
实施例7
1、不同浓度尹奎色亭处理后PAM细胞培养上清中子代PRRSV的TCID50的测定
TCID50测定上清样品来自实施例5所收集的细胞培养上清。
TCID50测定方法同实施例4中所描述的方法。
TCID50测定结果如图5所示，尹奎色亭浓度梯度依赖性降低PAM细胞培养上清中子代病毒滴度。
实施例8
1、IFA检测不同浓度尹奎色亭处理对PAM细胞中PRRSV N蛋白表达的影响
(1)铺板：将PAM细胞以1×106个细胞/ml的密度加到24孔细胞培养板上，每孔500μL，培养约24h直到达到80％汇合度。
(2)接毒：PRRSV接毒量为0.1MOI，37℃孵育1h，弃掉病毒液，1×PBS洗3次，加入含不同浓度尹奎色亭的3％FBS+RPMI-1640维持液后继续培养。
(3)固定：培养12h、24h后，将毒液弃掉，加入400μL/孔的75％乙醇(需事先放在-20℃预冷)，4℃固定30min。
(4)洗板：弃掉固定液，400μL/孔PBS洗5min/次×4次，在生物安全柜中将24孔板吹干。
(5)孵育一抗：每孔加入150μL用PBS稀释好的抗PRRSV N蛋白的单抗6D10(1:300稀释)，37℃孵育1h。
(6)洗板：400μL/孔PBS洗5min/次×4次。
(7)孵育二抗：每孔加入150μL用PBS稀释好的FITC标记的羊抗鼠IgG荧光二抗(1:300稀释)，37℃避光孵育1h。
(8)洗板：400μL/孔PBS洗5min/次×4次。
(9)观察荧光：加入一定量PBS后直接镜检。
从图6可以看出，随着尹奎色亭浓度的增加，标记了FITC的N蛋白表达(绿色荧光)在减少，且呈剂量依赖性。从而更加确认尹奎色亭在PRRSV感染PAM细胞过程中可以发挥抗病毒作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 尹奎色亭在制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatcatcgc ccaacaaaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacacaattg ccgctcacta 20

Claims (7)

1.尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，其特征在于，所述尹奎色亭及其药学上可接受的盐的浓度为1-30μM。
3.根据权利要求1所述的尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，其特征在于，所述的药物中还包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求3所述的尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，其特征在于，所述的辅料为磷酸盐缓冲液或二甲基亚砜。
5.根据权利要求1所述的尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，其特征在于，所述的药物剂型为注射剂或口服制剂。
6.根据权利要求5所述的尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，其特征在于，所述的注射剂为冻干粉针剂。
7.根据权利要求5所述的尹奎色亭及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用，其特征在于，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。
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