CN105853406A - 原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了来源于葡萄籽提取物的原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途。药理试验表明，原花青素有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在细胞的增殖，可作为药效成分配以辅助剂制成注射液或口服液防治猪繁殖与呼吸综合征。

Description

原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途
技术领域
本发明属于兽医药物领域，具体涉及原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物的用途。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种在世界范围内严重危害养猪业的传染病，俗称“猪蓝耳病”，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV)。PRRSV可以感染任何年龄的猪，主要引起怀孕母猪流产、早产、产死胎、弱胎及木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状。PRRS于1987年在美国首次被报道，随后在全球其他国家迅速传播。我国在1996年由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到美洲型PRRSV(CH-1a株)。2006-2007年席卷我国各地的高致病性PRRS，给养猪业带来巨大的损失。世界动物卫生组织将PRRS列为B类疾病，《中华人民共和国动物防疫法》将经典的PRRS列为二类动物疫病、高致病性PRRS列为一类动物疫病。
目前对于PRRS尚无特效药物，其预防除了应加强管理，如严格检疫，自繁自养，严格的卫生消毒措施等等之外，疫苗免疫是预防该病的主要措施，主要以常规疫苗对猪群进行免疫，包括灭活苗和弱毒苗。但PRRSV易发生变异、多毒株同时感染等情况，使得疫苗免疫并不能完全控制PRRSV的传播。因此，开发新的有效药物对防治PRRS至关重要，抗PRRS的药物研究成为目前国际兽医领域的重要研究课题。我国的中医药应用历史悠久，丰富的中药及天然药物资源成为发现防治PRRS药物的宝库。吴金梅等2011年在《中国兽医杂志》第6期18-20页报道了柴胡解毒注射液体外具有抗PRRSV活性。贺晶晶等2013年在《云南农业大学学报》第4期494-499页发现了青黛、花椒、卫矛和沉香4种中药提取物体外具有显著抗PRRSV的作用。冼琼珍等在《黑龙江畜牧兽医》杂志(上)133-136页中使用MTT法确定板蓝根、黄芪、青蒿和芦根等4种中药水提物体外具有显著的抗PRRSV的作用。但这些研究是中药提取物或复方的初步药效筛选，没有明确其药效成分，作用机制也不清楚，因而无法达到作为药物所必须的“安全、有效、稳定、可控”四个基本要求。因此，通过从中药及天然产物中寻找抗PRRSV活性单体或活性成分组，进而开发防治猪繁殖与呼吸综合征的新药研究工作具有重要价值。
原花青素(Proanthocyanidin，PC)是由不同数量的儿茶素(catechin)或表儿茶素(epicatechin)结合而成的聚多酚类物质，因在酸性介质中加热可产生相应的花色素而得名。根据缩合数量及连接的位置不同而构成不同类型的聚合物，如二聚体、三聚体、四聚体……十聚体等，其中二到四聚体称为低聚体原花青素(Oligomeric Proanthocyanidins，OPC)，五以上聚合体称为高聚体。原花青素广泛存在于多种植物的核、皮或种籽等部位，从葡萄籽中提取的原花青素的纯度和低聚体含量较高。原花青素最主要的生物活性是抗氧化活性，是迄今为止人类所发现的最强、最有效的自由基清除剂之一。近年来，国内外对原花青素的抗氧化、保护心血管、防治癌症、抗炎、抗糖尿病、抗胃溃疡、保护肝脏、抗辐射、提高学习记忆、促进毛发生长等药理作用开展了大量研究。
猪繁殖与呼吸综合征是目前危害养猪业最严重的感染性疾病之一。有关原花青素的抗PRRSV作用研究及其在防治猪繁殖与呼吸综合征上的应用未见报道，也未见相关的专利公开。
发明内容
本发明的目的在于提供原花青素在制备抗PRRSV药物上的应用；本发明的另一目的是提供原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
公开了原花青素在制备抗PRRSV药物上的应用，所述的原花青素是从葡萄籽提取物中获得的聚多酚类化合物构成的活性成分组。
公开了原花青素在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。所述猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV感染引起的。
优选地，所述原花青素是从葡萄籽中提取分离。
所述原花青素使用剂量范围为10μg/mL～40μg/mL。
该药物的剂型可以为注射制剂或口服制剂。
本发明首先从葡萄籽中分离获得高纯度的原花青素，采用Folin-Ciocaheau法测定原花青素的含量在90％以上。通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光显微分析等方法研究原花青素在Marc-145细胞上对PRRSV的抗病毒效果，并通过病毒感染前加药、病毒感染后加药及与病毒同时加入等过程研究阐述其抗病毒机制。结果显示，本发明所述的原花青素有很好抗PRRSV病毒效果，可望成为新型的防治繁殖与呼吸综合征的药物。
本发明的原花青素可以通过以下方法制备得到：(1)葡萄籽用粉碎机粉碎后过筛(20目)，经石油醚脱脂，晾干。(2)用60％体积分数的乙醇溶液50℃水浴搅拌提取，离心取上清液，反复提取3次，最后洗涤残渣2次，将3次上清液和洗涤液合并，减压蒸馏得到原花青素提液，真空干燥后制得粗提物。(3)称取一定量的AB-8树脂，湿法装柱，按常规对柱中树脂进行处理。将葡萄籽原花青素粗提液调到pH＝4，上柱吸附，吸附平衡后先用去离子水冲洗去除未吸附的原花青素及小分子杂质，再用体积分数为50％的乙醇水溶液按1.0BV/h的流速进行解吸，收集洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，即为原花青素。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明首次证明公开了原花青素的抗PRRSV病毒的作用。本发明通过多种方法研究证实了原花青素在细胞水平对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果。原花青素抗PRRSV病毒的药效成分及作用机制明确，质量可控，安全无毒，在猪繁殖与呼吸综合征防治方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中不同浓度原花青素(PC)在细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA增殖的抑制作用；
图2是实施例2中Western Blot分析不同浓度原花青素(PC)在细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白合成的抑制作用；
图3是实施例3中原花青素(PC)在细胞中作用不同时间对猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA增殖的抑制作用；
图4是实施例4中免疫荧光法分析不同浓度原花青素(PC)在细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白合成的抑制作用；
图5是实施例5中不同浓度原花青素(PC)对猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附细胞的抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：原花青素(PC)在细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA增殖的抑制作用
待MARC-145细胞在6孔细胞培养板生长至单层后，弃去培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗2遍，加入用含有2％胎牛血清的DMEM细胞维持液稀释好的含100TCID50的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，600μL/孔，37℃孵育2h，弃去病毒上清，PBS清洗2遍，分别加入40，20，10μg/mL的从葡萄籽提取物中分离获得的原花青素(PC)，2mL/孔。试验同时设正常对照组(不加受试药物，不加PRRSV)与PRRSV对照组(不加受试药物)，每个受试浓度设三个平行。细胞继续37℃培养，至感染后48h终止培养。观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。用总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)推荐的操作方法，将收集到的细胞上清液进行总RNA抽提。提取RNA后立即进行反转录，以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，Real Time PCR检测PRRSV的NSP9基因的拷贝数；以正常对照组做参照，评价NSP9mRNA的变化情况。
PRRSVNSP9基因上下游引物序列：
NSP9-F：5’-CTAAGAGAGGTGGCCTGTCG-3’
NSP9-R：5’-GAGACTCGGCATACAGCACA-3’
GAPDH基因上下游引物序列：
GAPDH-F：5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3’
GAPDH-R：5’-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3’
试验结果如图1所示，PRRSV代表病毒感染对照组，PC代表原花青素处理组。图中，与病毒感染对照组比较，“*”表示差异显著(P＜0.05)；“**”表示差异极显著(P＜0.01)。试验结果如图1所示，本发明的药物原花青素在10～40μg/ml的浓度范围内，对MARC-145细胞内猪繁殖与呼吸综合征病毒的RNA增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
实施例2：Western Blot分析不同浓度原花青素(PC)在细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白合成的抑制作用
MARC-145细胞感染PRRSV、加入药物的步骤与实施例1中相同，细胞培养至感染后48h终止培养，弃去上清液，用PBS洗2遍。将细胞培养板放置在冰上，加入RIPA裂解液150μL/孔，经吹打后将液体吸出至离心管中，12000转/分钟离心5分钟，将上清吸出至另一干净的管中备用。用BCA法测定各样品蛋白浓度后，采用Western Blot检测PRRSV的N蛋白和内参蛋白GAPDH的条带。试验结果如图2所示，本发明的药物原花青素在10～40μg/ml的浓度范围内，对MARC-145细胞内猪繁殖与呼吸综合征病毒的蛋白合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
实施例3：原花青素(PC)在细胞中作用不同时间对猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA增殖的抑制作用
除加入PC的浓度为40μg/ml之外，其余步骤与实施例1相同。试验结果如图3所示，本发明的药物原花青素在40μg/ml的浓度下对PRRSV的NSP9mRNA增殖有持续的抑制作用，且效果显著。
实施例4：免疫荧光法分析不同浓度原花青素(PC)在细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白合成的抑制作用
MARC-145细胞感染PRRSV及加入药物的步骤与实施例1相同。加入不同浓度的原花青素后细胞培养至48h后终止培养。弃去上清液，PBS洗3遍，每孔加入质量浓度为4％的低聚甲醛500μl固定10min；PBS清洗3次，加入质量浓度为0.25％Triton X-100透膜化，室温下15min；加入质量浓度为5％BSA封闭杂蛋白，室温封闭2h；PBS清洗3次，加入鼠源N单抗(1∶400稀释)，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，避光加入二抗(Alexa488标记抗小鼠IgG，1∶1000)，37℃避光孵育1h，PBS洗净；荧光显微镜下观察，绿色荧光代表PRRSV的N蛋白。试验结果如图4所示，本发明的药物原花青素在10～40μg/ml的浓度范围内，对MARC-145细胞内猪繁殖与呼吸综合征病毒的N蛋白合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
实施例5：不同浓度原花青素(PC)对猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附细胞的抑制作用
用含有100TCID50PRRSV的DMEM细胞维持液稀释PC至40，20，10，0μg/ml。待MARC-145细胞在6孔细胞培养板生长至单层后弃去培养基，PBS清洗2遍，将稀释好的PRRSV与PC的混合液分别加入，1mL/孔，并设正常对照组，每个受试浓度设三个平行。将细胞板放置4℃，1h后弃去上清液，PBS洗2遍，加入新的细胞维持液，37℃继续培养。感染后48h终止培养，观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。抽提总RNA、反转录为cDNA及荧光定量PCR检测样品的步骤与实施例1相同。试验结果如图5所示，本发明的药物原花青素在10～40μg/ml的浓度范围内，对猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附MARC-145细胞具有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

Claims (2)

1.本发明提出来源于葡萄籽提取物的原花青素在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的用途，其特征在于，以原花青素作为有效成分配以辅助剂制成注射液或口服液在防治猪繁殖与呼吸综合征上的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的猪呼吸道感染性疾病。
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