CN102698289A

CN102698289A - Pabp抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102698289A
Application number: CN2012101658226A
Authority: CN
Inventors: 姜平; 王晓晔; 李玉峰; 王先炜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。所述的PABP抑制剂为表达PABP shRNA的重组质粒,优选以pSUPER为出发载体，含有表达PABP shRNA的DNA模板序列。本发明成功构建并筛选了以pSUPER为载体，可以表达靶向PABP的小发卡RNA的重组质粒。将这种质粒转染到Marc-145细胞后接种PRRSV，发现干扰PABP表达之后，PRRSV的mRNA水平比对照组有所下降，免疫荧光结果显示N蛋白表达也比对照组有所减弱。可见通过抑制PABP表达，能够减弱PRRSV N蛋白的表达，从而实现对PRRSV的抑制。

Description

PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）N蛋白是由ORF7编码的一个主要结构蛋白，是病毒核衣壳的唯一蛋白成分。N蛋白具有的核定位序列，不仅使N蛋白可以自由穿越核膜进入细胞核，而且能明显影响病毒毒力的强弱。PRRSV N蛋白在病毒感染过程中扮演了双重角色：在细胞质中是结构蛋白而在细胞核中则如同非结构蛋白一般。研究显示，冠状病毒、风疹病毒以及与PRRSV同属尼多病毒目的马动脉炎病毒（EAV）等病毒的核衣壳蛋白都能与宿主细胞内的蛋白发生相互作用，影响一系列蛋白的表达进而调节病毒的复制，暗示了PRRSV N蛋白也会存在这种类似的现象。

酵母双杂交筛选常常用来探索未知蛋白质相互作用，我们使用酵母双杂交筛选来寻找与PRRSV N蛋白相互作用的宿主细胞蛋白。

RNA干扰介导的基因沉默技术可以部分地抑制特定内源基因的表达。RNA干扰技术在预防兽医学上广泛应用于靶向病原核酸的某一特定区域，从而抑制病原的复制。RNA干扰技术也常用来降低宿主细胞某种特定蛋白的表达，从而建立研究此蛋白与病毒复制关系的细胞模型。

发明内容

本发明的目的是提供PABP抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种干扰PABP表达的miRNA。

本发明的又一目的是提供该miRNA的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

PABP蛋白抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用，其中所述的PABP蛋白GeneBank登录号为:XM_001927747.1。

所述的PABP蛋白抑制剂为表达PABP shRNA的重组质粒。

所述的表达PABP shRNA的重组质粒以pSUPER为出发载体，含有表达PABP shRNA的DNA模板序列。

所述的表达PABP shRNA的DNA模板序列系由SEQ ID No.9所示的寡核苷酸正义链和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸反义链序列组成。

一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒表达的重组表达质粒，其特征在于以pSUPER为出发载体，含有可表达PABP shRNA的DNA模板序列。

所述的可表达PABP shRNA的DNA模板序列系由SEQ ID No.9所示的寡核苷酸正义链和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸反义链序列组成。

有益效果：

本发明根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）N蛋白在病毒复制过程中的多功能作用和多重角色，以及根据病毒衣壳蛋白往往能够与宿主细胞的蛋白成分发生相互作用，作出PRRSV N蛋白也有类似作用的假设。利用酵母双杂交技术，在成功构建猪肺泡巨噬细胞cDNA文库及含有PRRSV ORF7全长基因诱饵质粒的基础上，成功筛选出包括PABP在内的一系列能够与N蛋白发生相互作用的宿主蛋白质，并通过免疫学方法和激光共聚焦显微观察技术对PABP与PRRSVN蛋白相互作用的结果进行了验证。

本发明成功构建并筛选了以pSUPER为载体，可以表达靶向PABP的小发卡RNA的重组质粒。将这种质粒转染到Marc-145细胞后接种PRRSV，与转染不能够靶向干扰PABP表达的重组质粒的对照组相比较，发现干扰PABP表达之后，PRRSV的mRNA水平比对照组有所下降，免疫荧光结果显示N蛋白表达也比对照组有所减弱。可见通过抑制PABP表达，能够减弱PRRSV N蛋白的表达，从而实现对PRRSV的抑制。

基于上述研究成果，可见包括本发明干扰PABP表达的重组质粒在内的PABP抑制剂在作为一种新型的抗PRRSV感染的药物方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1dscDNA的合成与鉴定

M1:1kb DNA Maker，M2:DL-2000 DNA Maker，1:ds cDNA的琼脂糖凝胶电泳。

图2文库插入片段的PCR鉴定

M：DL-2000 DNA Maker，1-10：随机挑选的16个cDNA文库克隆PCR产物。

图3酵母双杂交筛选得到的阳性克隆在QDO/X/A平板上证实

1-5：用接种环分别将5个初筛选中得到的蓝色菌落在QDO/X/A平板上涂布和划线，“+”表示阳性对照，阳性对照酵母内含有的质粒分别是pGADT7-T和pGBKT7-p53，T和p53是已知的可以相互作用的蛋白。

图4酵母双杂交筛选得到阳性克隆插入片段的酶切鉴定

M:DL-2000 DNA Maker，1-5:分别提取QDO/X/A平板上对应的5个蓝色菌落中质粒，质粒经过大肠杆菌DH5α扩增，分别用NdeI和XhoI双酶切后的琼脂糖凝聚电泳结果。

图5酵母双杂交共转化验证结果

在QDO/X/A平板上生长出蓝色酵母的组分别是转化了：pGADT7-T和pGBKT7-p53（阳性对照）；pGBKT7-ORF7与pGADT7-PABP(iPABP，HMGN2,PIAS-1)；pGADT7-HMGN2与pGBKT7；单独转化pGADT7-HMGN2。pGADT7-PABP(iPABP，PIAS-1)与pGBKT7共转化后均不能生长蓝色菌落；pGADT7-PABP(iPABP，PIAS-1)单独转化酵母均不能生长蓝色菌落。

图6免疫共沉淀验证PABP与N蛋白在Marc-145细胞相互作用

从左向右：1-2，细胞裂解物western结果；3-4，细胞裂解物用抗PABP的抗体（Abcam）沉淀后western结果；5-6,细胞裂解物用抗N蛋白的抗体（2H7）沉淀后western结果。上图用抗PABP的抗体检测PABP，下图用抗N蛋白的抗体检测N。

图7激光共聚焦验证PABP与N蛋白在Marc-145细胞共同定位

第一行的三幅图为接毒Marc-145细胞两种蛋白的分布，第二行的三幅图为不接毒细胞对照。PABP中的红色荧光指示PABP在细胞内的定位，N中的绿色荧光指示N蛋白在细胞内的定位，merge指的是红色荧光和绿色荧光两张图片重叠后的效果。

图8激光共聚焦验证PABP与N蛋白在PAM细胞共同定位

图9PABP结构模式图

图10重组质粒pGEX-6p-1-PABP NT和pGEX-6p-1-PABP CT的酶切鉴定结果。

M:100bp DNA Maker，1:pGEX-6p-1-PABP NT;2:pGEX-6p-1-PABP CT.内切酶分别是EcoRI和XhoI。

图11大肠杆菌表达的融合蛋白GST-PABP NT和GST-PABP CT跑SDS-PAGE凝胶电泳用考马斯亮蓝染色结果。

图12GST-pulldown验证PABP与N蛋白相互作用的区域在PABP的C端。

从左向右，1-3泳道分别是：融合蛋白GST,GST-PABPNT,GST-PABP CT与N蛋白及Glutothione Sepharose孵育后的上清，4-6泳道分别是GS T,GST-PABP NT,GST-PABP CT与N蛋白相互作用的结合情况。Western用的抗体是抗N蛋白的抗体（2H7）。

图13靶向PABP的重组质粒pSUPER-PABP1#,pSUPER-PABP2#,pSUPER-PABP3#的酶切鉴定结果

M:100bp DNA marker，1,2,4:pSUPER-PABP1#,pSUPER-PABP2#,pSUPER-PABP3#，3:pSUPER空载体，所用的内切酶是：EcoRI和KpnI。

图14筛选靶向PABP的重组质粒的western鉴定结果。

1-3：分别转染了pSUPER-PABP1#,2#,3#的细胞裂解物；4：转染对照质粒pSUPER-PCV2的细胞裂解物；5：不转染质粒的细胞裂解物对照。上图用抗PABP的抗体检测PABP，下图用抗GAPDH的抗体检测GAPDH，内参照GAPDH的量相同指示每个泳道加的相同质量的蛋白。

图15荧光定量PCR检测转染不干扰PABP的质粒和干扰PABP的Marc-145细胞内PABPmRNA的相对水平。

图16荧光定量检测转染不干扰PABP的质粒和干扰PABP的Marc145细胞在接种PRRSV 12h后，细胞内PRRSV ORF7mRNA的相对水平。

图17间接免疫荧光显示转染不干扰PABP的质粒和干扰PABP的Marc-145细胞在接种PRRSV16h后，细胞内PRRSV N蛋白的表达量差异。蓝色荧光指示的是细胞核，由DAPI发出；绿色荧光指示的是N蛋白，在上图和下图蓝色荧光基本一致的前提下，上图的绿色荧光略微弱于下图的绿色荧光，说明上图的细胞中N蛋白的表达量比下图低。

生物材料信息保藏证明

PRRSV毒株SY0608，分类命名猪繁殖与呼吸综合征病毒，于2011年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4932。

具体实施方式：

实施例1猪肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建

1.1猪肺泡巨噬细胞cDNA的获得

采用Trizol提取猪肺泡巨噬细胞的RNA，应用SMART技术将提取的RNA反转录成cDNA，取RNA1.0μl，CDⅢ primer 1.0μl，无RNA酶水2.0μl，72℃2min，冰浴2min，14,000g离心10秒，加5×First-Strand Bμffer 2.0μl，100nmDTT 1.0μl，10mM dNTP 1.0μl，SMART MMLV Reverse Transcriptase 1.0μl，42℃孵育10min，加1.0μl SMARTⅢ modified oligo，42℃1h，75℃10min终止反转录，加1.0μl RNase H(2个单位)，37℃孵育20min.

1.2用LD-PCR技术扩增双链DNA

设置两管各100μl的PCR反应体系，分别加入1.1中反转录的cDNA 2.0μl，双蒸水70.0μl，10×Advantage 2 PCR Buffer 10.0μl，50×dNTP Mix 2.0μl，5′端PCR引物（SEQ ID No.1)2.0μl， 3′端PCR引物(SEQ ID No.2)2.0μl,10×Melting solution 10.0μl，50×Advantage 2 PCR Polymerase Mix 2.0μl。在PCR仪上进行反应，循环参数为95℃预变性30s，30个循环，每个循环95℃变性10s，68℃延伸6min(每增加一个循环延伸时间比上一个循环增加5s),最后68℃延伸5min。取7μl PCR产物在1.2%（g/ml）的琼脂糖凝胶上进行电泳，结果见图1。

1.3PCR产物的纯化

准备两根CHROMA SPIN TE-400 column(BD公司)，700g离心5min，使纯化柱中的基质呈半干状态。把两份各93μl的PCR产物分别加到两根纯化柱的基质中央，700g离心5min，收集的两份纯化产物合并到一起，向其中加1/10倍体积的3M乙酸钠和2.5倍体积的冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀1h，室温14000rpm离心20min，移去上清并干燥10min，用20μl无菌双蒸水溶解DNA，得到纯化后的文库DNA。

1.4酵母感受态的制备

从酵母培养基YPDA中挑取一个直径2-3mm的Y187酵母菌落（购自clontech公司），接种到5ml液体酵母培养基YPDA broth中，30℃，250rpm，振荡培养8-12h，取菌液5μl至50mlYPDA broth中，30℃，250rpm振荡培养16-20h，取菌液测OD600，若OD600的值达到0.15-0.3，把酵母700g离心，弃上清，加入100ml新鲜的YPDA broth培养3-5h，测OD600，若OD600的值达到0.4-0.5，把酵母700g离心，弃上清，加入新鲜配制的600μl 1.1×TE/LiAc。

1.5酵母转化

在一个预冷的15ml无菌离心管中依次加入下列物质：纯化后的文库cDNA 200.0μl，线性化pGADT7（购自clontech公司）6.0μl，Yeastmaker Carrier DNA 20.0μl，1.4中制备的酵母感受态600.0μl，轻轻混匀后继续加入PEG/LiAc 2.5ml，轻轻混匀，30℃孵育30min，每隔10min轻轻晃动离心管混匀其中的物质，然后加入DMSO 160.0μl，轻轻混匀后置于42℃水浴锅中孵育20min，每隔5min轻轻晃动混匀。700g离心，弃上清，加入3ml YPD Plμs Medium重悬酵母，至30℃摇床220rpm震荡培养90min，700g离心，弃上清，用15ml 0.9%(w/v)NaCl重悬酵母。取100μl重悬液进行1∶10和1∶100稀释，分别取出100μl稀释液涂布100mm SD/-Leμ平板，倒置平板于30℃恒温培养箱，孵育3~5天，计数平板上的克隆，计算文库质粒pGADT7-cDNA转化Y187总克隆数，计算公式：

滴度(Titer)=平板上的克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

总克隆数(CFus)=滴度(cfu/ml)×总体积

为保障文库的库容量，总克隆数应大于1百万。

将剩余的重悬液涂布在150mm SD/-Leμ平板，每平板150μl，约需涂布100块150mm SD/-Leμ平板，倒置平板于30℃恒温培养箱，孵育3~5d至克隆出现。

1.6插入片段的PCR鉴定

随机挑取10个酵母菌落，通过PCR反应检测文库质粒pGADT7平均插入片段的大小。

PCR反应体系(在Mictube中进行)：

在Thermal Cycler PCR仪上按下列程序进行PCR反应:

94℃预变性1min；98℃变性10s，68℃退火延伸3min，共30个循环。PCR结束后取5μl PCR产物，加适量的10×Loading Buffer于1％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。结果见图2。

1.7酵母菌株Y187[pGADT7-cDNA]文库的收集

将所有150mm SD/-Leu平板放于4℃冰箱4-5h；

每块平板加冻存液(25％甘油YPDA)5ml；

用无菌的玻璃涂布棒将平板上的酵母克隆刮下，并将所有平板上的酵母文库菌液转移至一个无菌的1L锥形瓶中；

混匀后，用细胞计数板计数酵母细胞个数/ml；若酵母细胞个数/ml小于2×10⁷，通过离心及重悬调整细胞浓度；

取部分酵母文库菌液分装至2.0ml冻存管中，每管1ml，所有的酵母文库菌液于-80℃保存；

每次使用酵母文库Y187[pGADT7-cDNA]时，都要做文库滴度测定，确保文库滴度大于1×10⁷cfu/ml。

实施例2诱饵质粒pGBKT7-ORF7的构建

2.1PCR引物的设计合成

根据PRRSV毒株SY0608的序列设计扩增N蛋白基因特异性引物，引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列如下：上游引物：SEQ ID No.3，下游引物：SEQ ID No.4。

2.2PCR扩增目的基因

用Trizol提取PRRSV毒株SY0608(CGMCCNo.4932)的RNA，应用RT-PCR技术扩增得到ORF7基因片段，反转录的体系为RNA3.0μ，5×bμffer2.0μl，oligo dT 0.5μl，50mM dNTP0.25μl，补无RNase水至10μl，70℃孵育10min，马上置冰浴2min，加M-MLV 0.25μl，37℃孵育17h，70℃30min终止反转录反应。以此cDNA为模板，应用PCR技术扩增得到ORF7基因片段，PCR反应体系为：cDNA2.0μl，上、下游引物各1.0μl,无Mg²⁺缓冲液2.5μl,2.5mMdNTPs 2.0μl，25mM Mg²⁺1.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积25.0μl。在PCR仪上进行反应，循环参数为94℃预变性5min,94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共进行34个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物进行1%(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。

2.3PCR产物的克隆

2.3.1PCR产物回收与纯化

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖胶块，参照DNA快速回收纯化试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)说明书回收目的片段。

2.3.2PCR产物酶切与纯化

酶切反应总体积为20.0μl。10×buffer 2.0μl，PCR回收片段10.0μl，EcoRI和SalI各0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl。37℃作用3h,然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。

2.3.3pGBKT7-BD vector（购自clontech公司）酶切与纯化

酶切反应总体积为20μl。10×buffer 2.0μl，pGBKT7-BD vector质粒10.0μl，EcoRI和SalI各0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl。37℃作用3h,然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。

2.3.4ORF7与pGBKT7-BD vector连接得重组质粒pGBKT7-ORF7

连接反应体积为10μl。10×buffer 1.0μl，酶切回收的ORF7 6.0μl,酶切回收的pGBKT7-BD vector 2.0μl，T4连接酶0.5μl，补水至10μl。

2.3.5重组质粒pGBKT7-ORF7转化大肠杆菌DH5a及质粒的提取

将重组质粒pGBKT7-ORF7转化DH5a，挑取单菌落，用Biomega质粒小提试剂盒提取质粒。

2.3.6重组质粒pGBKT7-ORF7酶切鉴定和测序

酶切反应体系同2.3.3中介绍，构建好的诱饵质粒pGBKT7-ORF7测序工作由上海英骏生物技术有限公司进行。

2.4诱饵质粒pGBKT7-ORF7有效性检测

2.4.1Y2HGold酵母菌株（购自clontech公司）感受态的制备

制备Y2HGold酵母菌株感受态与制备Y187酵母菌株感受态的方法相同，见实施例1.4。

2.4.2诱饵质粒pGBKT7-ORF7转化Y2H酵母菌株感受态得Y2HGold[pGBKT7-ORF7]方法参考实施例1.5。

2.4.3诱饵质粒pGBKT7-ORF7自激活性检测

诱饵质粒pGBKT7-ORF7转化Y2HGold酵母菌株感受态后，取100μl 1∶10和1∶100稀释液各涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A平板，并倒置平板于30℃恒温培养箱中，孵育3~5天，观察结果。不具有自激活性的诱饵质粒表型如下所示：

表1.无自激活性诱饵质粒的表型

转化诱饵质粒pGBKT7-ORF7的酵母菌落符合上表所列表型，说明诱饵质粒pGBKT7-ORF7不具有自激活性。

2.4.4诱饵质粒pGBKT7-ORF7毒性检测

使用Clontech公司的YeastmakerTM Yeast Transformation System 2试剂盒分别将pGBKT7-BD和pGBKT7-ORF7诱饵质粒转化Y2HGold酵母菌株感受态，各取100μl 1∶10和1∶100转化物稀释液涂布于SD/-Trp琼脂平板，倒置平板于30℃恒温培养箱中，孵育3~5天。各挑取一个2~3mm大小、生长状态良好的克隆于含500μl冻存液(25％甘油YPDA肉汤培养基)的无菌冻存管中，涡旋混匀，-75℃保存；用封口膜封闭平板其可在4℃冰箱中保存一个月。含有pGBKT7-ORF7诱饵质粒和含有pGBKT7空质粒的Y2H酵母克隆大小一致，说明诱饵质粒pGBKT7-ORF7的融合蛋白对酵母没有毒性。

实施例3酵母双杂交筛选与N蛋白互作的蛋白

用Clonetech公司的Matchmaker^TM Gold Yeast Two-Hybrid System，通过酵母交配(Y2HGold菌株和Y187菌株在一定条件下可交配形成2倍体)的方式进行文库蛋白的筛选，筛选cDNA文库的具体操作步骤如下：

3.1挑取一个新鲜2-3mm大小、生长状态良好的Y2HGold[pGBKT7-ORF7]克隆于含 50mlSD/-Trp肉汤培养基的无菌锥形瓶中，置于30℃恒温摇床，250-270rpm培养16-20h至OD₆₀₀达到0.8。室温下1000g离心5min，去除上清，用4-5ml SD/-Trp肉汤培养基重悬酵母细胞至终浓度大于1×10⁸/ml，全部转移至一个2L无菌锥形瓶中。

3.2文库菌株Y187[pGADT7-cDNA]与诱饵菌株Y2HGold[pGBKT7-ORF7]交配：

A取一支冻存的猪血管内皮细胞cDNA文库菌株Y187[pGADT7-cDNA](1ml)放入25℃温水中，使其复苏。移取10μl，用YPDA肉汤培养基分别按1∶100，1∶10000稀释，分别取10μl 100倍稀释液和50μl 10000倍稀释液涂布SD/-Leu平板(Φ100mm)，倒置平板于30℃恒温培养箱，孵育3-5d，计数克隆个数测定cDNA文库滴度(Titer)，计算式如下：

Titer(cfu/ml)=平板上的克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

B剩余的文库菌株全部加入含诱饵菌株的2L无菌锥形瓶，加入45ml 2×YPDA肉汤培养基，置于30℃恒温摇床，30-50rpm培养20hr。

C培养20hr后，取一滴培养物于40×倒置显微镜下观察，若视野中有三叶草型二倍体酵母菌出现，接下步；若无，则继续培养4hr。

3.3室温下1000g离心10min，去除上清；用50ml 0.5×YPDA肉汤培养基涮洗2L锥形瓶2次，且用涮洗液重悬酵母细胞。

3.4室温下1000g离心10min，去除上清，加入10ml 0.5×YPDA肉汤培养基重悬酵母细胞，并测量酵母细胞重悬液总体积(10ml培养基体积+酵母细胞体积)。

3.5取100μl酵母细胞液分别按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000稀释，取100μl 10倍、100倍、1000倍及10000倍稀释液分别涂布于SD/-Trp、SD/-Leu及DDO平板(Φ100mm)，置于30℃恒温培养箱，培养3-5d。

3.6将剩余的酵母细胞液全部涂布于DDO/X/A平板(Φ150mm)，每平板200μl，倒置平板于30℃恒温培养箱，培养3-5d，至蓝色克隆出现，进行文库的初步筛选。

3.7计数在DDO平板(Φ100mm)上的克隆数，计算两菌株交配形成二倍体的总克隆数，计算公式如下：

Titer(cfu/ml)=平板上的克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

总克隆数(CFUs)=Titer(cfu/ml)×总体积(ml)

实验要求，酵母交配形成二倍体的总克隆数不得少于1million。

3.8计数在SD/-Trp、SD/-Leu及DDO平板(Φ100mm)上的克隆数，计算交配率(Mating Efficiency)，公式如下：

Titer(cfu/ml)=平板上的克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

含诱饵质粒的菌株滴度(cfu/ml)

=SD/-Trp平板上的克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

含文库质粒的菌株滴度(cfu/ml)

=SD/-Leu平板上克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

二倍体菌株滴度(cfu/ml)

=DDO平板平板上的克隆数×稀释系数/涂板量(ml)

Mating Efficiency(％)=2倍体菌株滴度(cfu/ml)/限制因子×100

注：限制因子为含诱饵质粒的菌株滴度(cfu/ml)和含文库质粒的菌株滴度(cfu/ml)中较小的一个滴度(cfu/ml)。

实验要求，交配率(Mating Efficiency)不能小于2％。

3.9用接种环将在150mm DDO/X/A平板上的蓝色克隆涂划在100mm QDO/X/A平板上，进行高严谨度筛选，剔除假阳性克隆，倒置平板于30℃恒温培养箱，培养3-5d，平板上生长的蓝色克隆即为初步的阳性克隆。经过初步筛选共得到5个蓝色克隆，将这5个蓝色克隆接种在QDO/X/A平板上，倒置平板于30℃恒温培养箱中，培养3-5d，平板上仍会会出现蓝色克隆，初步确定这5个蓝色克隆均为阳性克隆，结果见图3。用无菌接种环挑取QDO/X平板上的单个蓝色克隆，在QDO/X平板上划线，置于30℃恒温培养箱中，培养3-5d；重复2-3次，至QDO/X平板上只有蓝色克隆出现。所有QDO/X/A平板上的蓝色克隆同样处理。

3.11提取阳性文库质粒并酶切鉴定

利用clontech公司提供的Easy Yeast Plasmid Isolation Kit提取所有QDO/X/A平板上的蓝色克隆的质粒，并分别转化E.coli DH5α进行质粒扩增,进一步提取DH5α中阳性质粒，用NdeI和XhoⅠ双酶切鉴定，阳性质粒中均有外源基因插入，外源基因大小均在1500bp-2000bp之间。结果见图4。

3.12阳性文库质粒基因测序

阳性文库质粒基因测序工作由上海英骏生物科技有限公司完成。通过基因序列分析pGADT7上连接的基因，有2个与PABP1(polyA binding protein)同源，另外3个分别与iPABP(induceble polyA binding protein)，PIAS(Protein inhibitor of activated STAT protein 1)，HMGN2(high-mobility group nucleosomal binding domain2)同源。

3.13共转化验证

将筛选得到的4种阳性文库质粒分别与诱饵质粒pGBKT7-ORF7一起转化酵母菌，涂布筛选培养基，仍然长出蓝色菌落且与pGBKT7空载体共转或单独转化酵母不能长出蓝色菌落的判为阳性。有一条不符均判为假阳性。试验结果显示含有猪肺泡巨噬细胞基因PABP，iPABP，PIAS1及HMGN2的pGADT7质粒与诱饵质粒pGBKT7-ORF7共转入酵母后都能长出蓝色菌落（结果见图5），但是当pGADT7-HMGN2与pGBKT7空载体共转后也可以长出蓝色菌落，说明HMGN2是假阳性（结果见图5）。因此，酵母双杂交试验的结果是与PRRSV N蛋白能够相互作用的蛋白是PABP(GeneBank:XM_001927747.1)，iPABP(GeneBank:NM_001083724.1)，PIAS1(GeneBank:NM_001075396.1)。

实施例4验证PABP-N蛋白互相作用

4.1免疫共沉淀方法证实PABP与N蛋白在哺乳动物细胞中相互作用

4.1.1Marc-145细胞接种PPRSV

在25cm²的细胞瓶中培养Marc-145细胞（购自上海复祥生物科技有限公司，

Number:CRL-12231，下同），接种0.1MOI PRRSV病毒株SY0608(CGMCCNo.4932)，同时设立不接毒的Marc-145细胞作为阴性对照。

4.1.2裂解细胞并收集细胞内蛋白

细胞接毒48h后，向每瓶加细胞裂解液1%NP-40 1ml，4℃缓慢震荡裂解10min，用EP管收集细胞裂解物，12，000rpm，4℃，5min离心除去细胞碎片，收集细胞蛋白。

4.1.3免疫沉淀

将收集的细胞蛋白按每管400μl分装到不同的EP管，向每400μl细胞蛋白中加入4μl抗PABP的抗体（Abcam：ab21060）或10μl抗N蛋白的抗体（实验室保藏，猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析，马苏，李玉峰，段舒怡，姜平，畜牧与兽医，2007，4：1-4。)，4℃缓慢震荡孵育过夜，然后向每管中加入40μl Protein G agarose，4℃缓慢震荡孵育3h，1000×g,4℃离心5min，小心吸弃上清，用4℃的细胞裂解夜洗涤3遍，最后用40μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液溶解树脂上的结合蛋白，100℃煮沸5min，12,000rpm离心，取上清进行SDS-PAGE电泳。

4.1.4western-blot

用抗N蛋白的抗体（2H7）或抗PABP的抗体（购自Abcam）进行western-blot，试验结果显示接毒细胞用抗PABP的抗体沉淀的复合物中能检测到N蛋白，同样沉淀N蛋白可以检测到PABP。结果见图6。表明在哺乳动物细胞中PABP能够与PRRSV N蛋白相互作用。

4.2激光共聚焦检测证实N蛋白与PABP在Marc-145细胞和PAM细胞内都有共同的定位

4.2.1Marc-145细胞接种PPRSV

将无菌盖玻片放置在6孔板中，接种Marc-145细胞，待细胞接近长满单层时接种PRRSV病毒株SY0608(CGMCCNo.4932)，同时设立不接种病毒的细胞作为阴性对照。

4.2.2间接免疫荧光

接毒36h后，吸弃细胞上清，每孔加1ml 4%多聚甲醛，室温30min固定细胞，每孔加0.2%Triton-X100 500μl，室温5min，每孔加1ml 1%BSA，室温30min封闭，用1%BSA按1∶200稀释抗N蛋白的单抗（2H7）和1∶500稀释抗PABP抗体（Abcam），按每孔650μl加入稀释后的抗N蛋白的单抗和抗PABP的抗体，室温孵育1h，PBS洗涤5遍，用1%BSA按1∶500稀释标记Alexa488的羊抗鼠荧光二抗和标记Alexa555的羊抗兔荧光二抗，室温孵育45min，PBS洗涤5遍。

4.2.3将细胞爬片置于ZEISS LSM 700倒置激光共聚焦显微镜下观察。试验结果显示在接毒的Marc-145细胞内PABP与N蛋白具有明显的共同定位，结果见图7。在PAM细胞上也有相同的结果，结果见图8。

4.3用GST-pulldown方法发现与N蛋白相互作用的PABP结构域

4.3.1习惯上对PABP的结构划分为N端和C端两个结构域。图9是PABP结构模式图。有研究发现Rubella病毒的Capsid蛋白及流感病毒的NS1蛋白与PABP结合的部位正是PABP的C端。因此本研究将PABP分为1aa-368aa和369aa-636aa两个截断体，并分别连接到pGEX-6p-1质粒，构建pGEX-6p-1-PABP NT和pGEX-6p-1-PABP CT。

4.3.2引物设计与合成

根据PABP基因序列设计分别扩增N端和C端基因的特异性引物，上下游引物分别携带EcoR I和Xho I酶切位点，引物由上海Invitrogen公司合成。

PABP N端特异性引物序列：

上游引物:5′-ATAGAATTCATGAACCCCAGCGCCCC-3′（SEQ ID No.5）；

下游引物:5′-CTGCTCGAGTCAAAAGCTACA-3′（SEQ ID No.6）；

PABP C端特异性引物序列：

上游引物:5′-GCGGAATTCATGCAGCGCAAAGAAGA-3′（SEQ ID No.7）；

下游引物:5′-CTGCTCGAGTCAAAACAGTTGGA-3′（SEQ ID No.8）；

4.3.3PCR扩增和DNA纯化

采用Trizol提取Marc-145细胞的RNA，应用RT-PCR技术扩增得到PABP基因片段，反转录的体系为RNA3.0μl，5×bμffer2.0μl，oligo dT 0.5μl，50mM dNTP 0.25μl，补无RNase水至10μl，70℃孵育10min，马上置冰浴2min，加M-MLV 0.25μl，37℃孵育113h，70℃30min终止反转录反应。

以此cDNA为模板，应用PCR技术扩增得到PABP NT和PABP CT基因片段，PCR反应体系为：cDNA2.0μl，上、下游引物各1.0μl,无Mg²⁺缓冲液2.5μl，2.5mM dNTPs 2.0μl，25mMMg²⁺1.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积25.0μl。在PCR仪上进行反应，循环参数为94℃预变性5min,94℃变性45s，56℃退火30s，72℃分别延伸90s和60s，共进行34个循环；然后72℃延伸10min。PCR产物进行1%(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。PCR产物用胶回收试剂盒切胶回收纯化。

4.3.4重组质粒pGEX-6p-1-PABP NT和pGEX-6p-1-PABP CT的构建

将pGEX-6p-1质粒（购自Amersham）用EcoR I和Xho I限制性双酶切后，用胶回收试剂盒回收。将PCR扩增得到的PABP NT和PABP CT用胶回收试剂盒回收后，分别用EcoR I和Xho I限制性双酶切，再用胶回收试剂盒回收。

用T4连接酶（TaKaRa）分别连接pGEX-6p-1和PABP NT以及pGEX-6p-1和PABP CT，转化大肠杆菌5α感受态，用加有氨苄青霉素的LB平板筛选，挑取平板上的单菌落，提取质粒，经EcoR I和Xho I限制性双酶切鉴定和基因测序分析，成功构建pGEX-6p-1-PABP NT和pGEX-6p-1-PABP CT。结果见图10。

4.3.5用大肠杆菌分别表达融合蛋白GST-PABP NT、GST-PABP CT和GST

将构建好的pGEX-6p-1-PABP NT和pGEX-6p-1-PABP CT分别转化大肠杆菌BL21感受态，挑取单菌落，接种LB液体培养基，测量细菌浓度在OD600大约等于0.8时，加入终浓度为1μg/ml的IPTG，诱导4h，超声裂解细菌，收取细菌蛋白，跑12%SDS-PAGE凝胶。在目的蛋白位置有颜色较深的条带出现，说明重组质粒pGEX-6p-1-PABP NT和pGEX-6p-1-PABP CT能够表达相应的蛋白GST-PABP NT和GST-PABP CT。同时将空载体pGEX-6p-1转化大肠杆菌BL21感受态，方法同上，表达载体蛋白GST作为阴性对照。

4.3.5GST-pulldown

取3个1.5ml EP管，分别加入100μl大肠杆菌表达的GST，GST-PABP NT和GST-PABP CT蛋白，分别向其中加入40μl Glutothione Sepharose^TM4B（GE Healthcare），4℃孵育3h，各用PBS洗涤3次，分别向其中加入接种PRRSV的Marc145细胞裂解物100μl,4℃孵育过夜，用PBS洗涤3次，最后用40μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液溶解树脂上的结合蛋白，100℃煮沸5min，12,000rpm离心，取上清进行SDS-PAGE电泳。结果见图11。

4.1.4western-blot

用抗N蛋白的抗体（2H7）进行western-blot，试验结果显示PABP CT可以与PRRSV N蛋白结合，而PABP N端和单独的GST蛋白则不能。结果见图12。

实施例5用RNA干扰的方法敲除Marc-145中的PABP，观察对PRRSV复制的影响

5.1靶向PABP小发卡RNA（shRNA）的构建

5.1.1siRNA靶位点的选择

根据PABP基因序列及siRNA设计的一般原则，利用Ambion公司的在线设计工具 http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA-design.html寻找siRNA靶序列，最后采用NCBIGenBank提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异地抑制猪体和其他病毒基因片段的可能。

5.1.2小发卡RNA（shRNA）设计

根据pSUPER载体的要求，设计合成了3对分别含有相应siRNA靶序列的寡核苷酸，所设计的寡核苷酸5’端19个核苷酸为siRNA的正义链，中间加入9个核苷酸TTCAAGAGA间隔以形成发卡结构，19个核苷酸siRNA的反义链，3’端加有转录终止信号TTTTT。并且正义链寡核苷酸5’端带有BglⅡ（GATC）酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸5’端带有Xho Ⅰ(TCGA)酶切位点粘性末端。寡核苷酸合成均由上海英骏有限公司合成。寡核苷酸序列分别为：

shPABP1#

正义链：

5′-GATCCCCGGTGGTTTGTGATGAAAATTTCAAGAGAATTTTCATCACAAACCACCTTTTTGGAAA-3′（SEQ ID No.9）；

反义链：

5′-TCGATTTCCAAAAAGGTGGTTTGTGATGAAAATTCTCTTGAAATTTTCATCACAAACCACCGGG-3′（SEQ ID No.10）；

shPABP2#

正义链：

5′-GATCCCCCTAAGACCAAGTCCTCGCTTTCAAGAGAAGCGAGGACTTGGTCTTAGTTTT TGGAAA-3′（SEQ ID No.11）

反义链：

5′-TCGATTTCCAAAAACTAAGACCAAGTCCTCGCTTCTCTTGAAAGCGAGGACTTGGTCTTAGGGG-3′（SEQ ID No.12）

shPABP3#

正义链：

5′-GATCCCCATGTTGGGTGAACGGCTCTTTCAAGAGAAGAGCCGTTCACCCAACATTTTTTGGAAA-3′（SEQ ID No.13）

反义链：

5′-TCGATTTCCAAAAAATGTTGGGTGAACGGCTCTTCTCTTGAAAGAGCCGTTCACCCAACATGGG-3′（SEQ ID No.14）

5.1.3重组质粒的构建

5.1.3.1退火

用退火缓冲液溶解DNA单链片段，将要退火的两条片段等摩尔数混合，94℃水浴10min,然后自然冷却到室温，即为双链DNA。

5.1.3.2载体片段的准备

pSUPER质粒（购自Promega公司）小量提取后用BglⅡ，XhoⅠ双酶切。用胶回收试剂盒回收，并测定核酸含量。

5.1.3.3连接和转化

连接反应体系10ul，其中pSUPER 0.5ul，退火产物5μl，T4 DNA ligase 175U，10×T4 DNAligase Buffer 1μl，加ddH20至10μl。将连接产物转化入E.coli DH5α。

5.1.3.4重组质粒的提取和酶切鉴定

挑取经氨苄青霉素筛选的单菌落，用Qiagen质粒小提试剂盒提取质粒。取小量提取的重组质粒各3μl,分别用EcoRI/KpnI双酶切，酶切反应体系为：质粒3.0μl，EcoRI 5U，KpnI 5U，10×M Buffer 2μl，加无菌双蒸水至20μl，37℃水浴3h，酶切产物各取10μl经琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图13。

5.1.3.5核酸测序鉴定

酶切鉴定正确的重组质粒进行DNA测序分析，测序结果表明插入的表达不同的shRNA的寡核苷酸序列正确，未发现有突变、缺失等异常存在，并已准确克隆如入pSUPER中。经酶切和测序鉴定是阳性的质粒依次命名为pSUPER-shPABP1#、pSUPER-shPABP2#pSUPER-shPABP3#。用靶向PCV2 Cap蛋白的shRNA pSUPER-shPCV2(GenBank比对与PABP序列无同源性)（Adenovirus-mediated shRNA interference against porcine circovirus type 2replication both in vitro and in vivo.Zhixin Feng,Ping Jiang,Xianwei Wang,Yufeng Li,Wenming Jiang.Antiviral Research,2008,77:186-94）作为阴性对照。

5.2靶向PABP的shRNA的筛选

5.2.1shRNA表达质粒转染Marc-145细胞

用Qiagen质粒提取试剂盒纯化3个靶向PABP的shRNA表达质粒和阴性对照pSUPER-shPCV2，测定核酸含量。转染前24h将Marc-145细胞铺24孔板，当细胞长至约30%-50%时，按Promega公司的TransFast^TM Transfection Reagent说明转染Marc-145细胞。每孔转染0.8μg pSUPER重组质粒和0.2μg pEGFP，每μg质粒加3μl转染试剂，24孔板1μg/孔为转染条件。同时设立不转染质粒细胞对照。

5.2.2Western-blot检测shRNA表达质粒对细胞PABP表达的影响

转染后48h，吸弃细胞上清，向每个细胞孔中加入100μl细胞裂解液，4℃裂解10min，用EP管收集细胞裂解物，12000rpm离心5min，弃掉细胞碎片等沉淀，测蛋白浓度。加入上样缓冲液，95℃5min，跑12%SDS-PAGE胶检测。用兔抗PABP多抗（购自Abcam公司）和抗GAPDH蛋白单抗（购自Abmart公司）分别进行western-blot分析，发现3个候选的靶向PABP的shRNA表达质粒中，pSUPER-shPABP1#对PABP的表达有明显的抑制效果。结果见图14。因此选择pSUPER-shPABP1#作为干扰细胞靶向PABP的工具。

5.3观察PABP表达下降对PRRSV复制的影响

5.3.1shRNA表达质粒转染Marc-145细胞

用Qiagen质粒提取试剂盒纯化pSUPER-shPABP1#和pSUPER-shPCV2，测定核酸浓度。转染前24h将Marc-145细胞铺24孔板，当细胞长至约30%-50%时，按Promega公司的TransFast^TM Transfection Reagent说明转染Marc-145细胞。每组质粒的转染设3个重复孔，每孔转染0.8μg pSUPER重组质粒和0.2ug pEGFP，每μg质粒加3μl转染试剂，24孔板1μg/孔为转染条件。同时设立不转染任何质粒的细胞对照。

5.3.2接毒

转染后24h接种病毒，先吸弃细胞上清，并用Hank’s液洗，每个孔接种400TCID₅₀ PRRSV SY0608，37℃孵育1h，用Hank’s液洗掉未吸附的病毒，加含2%牛血清DMEM营养液，37℃ 培养12h。

5.3.3Realtime PCR检测转染靶向PABP的shRNA后病毒复制的变化

5.3.3.1Realtime PCR引物的设计与合成

利用Primer Express3.0软件，针对PABP，PRRSV ORF7及猪肌动蛋白(β-actin)的基因序列，设计合成特异性引物，针对PABP基因的引物序列为：

P1:5’-GCCCAACCCTGTAATCAATCC-3’（SEQ ID No.15）；

P2:5’-CCGCCATGAAGTAACCTGAAG-3’（SEQ ID No.16）；

针对PRRSV ORF7基因的引物序列为：

P3:5’-CCAGAATTCCATGCTGAGGGTGATGC-3’（SEQ ID No.17）；

P4:5’-CGAGGATCCAATATGCCAAATAACAACGG-3’（SEQ ID No.18）；

针对细胞中β-actin基因的引物序列为：

P5:5’-CTCCATCATGAAGTGCGACGT-3’（SEQ ID No.19）；

P6:5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3’（SEQ ID No.20）；

引物均由上海英骏生物科技公司合成。

5.3.3.2用Realtime PCR检测

转染后12h，吸弃所述试验中3个重复孔（转染每种质粒都是3个重复孔）的细胞上清，每个细胞孔加500μl Trizol裂解细胞，提取RNA，用Oligo dT₁₈作为反转录的引物将RNA反转成cDNA。反转录体系为：RNA 2ug，5M-MLV Buffer 4μl，dNTP 250nmol/L,M-MLV 100U，Oligo dT18(50pmol/L)1μl。

Realtime PCR的反应体系为：cDNA 1.0μl，SYBR Green Realtime Master Mix 10.0μl，上、下游引物各0.75μl，补无菌双蒸水至20μl，每个样品做一个重复，分别以P1，P2；P3，P4；P5，P6；为引物检测PABP，N，β-actin的mRNA水平。

反应在ABI7300荧光定量PCR仪（ABI公司）上进行，反应条件为：预变性95℃2min；95℃15s，60℃1min；共进行40个循环。同时设定不加cDNA的阴性对照。

5.3.3.3相对定量方法及数据分析

根据2^-△△Ct的方法，检测样品中PRRSV ORF7和PABP基因的相对水平。首先分别用同一样品的目的基因Ct值减去内参基因Ct值，获得校准值△Ct1、△Ct2、△Ct3，然后将校准后的△Ct值两两相减获得△△Ct值，公式如下:

△△Ct=△(Ct_target-1-Ct_β-actin-1)-△(Ct_target-2-Ct_β-actin-2)

2^-△△ct计算结果的意义为样品1中的目的基因水平为样品2中目的基因的多少倍或几分之几。应用该方法进行定量时，首先将同一种处理的样品目的基因Ct值和内参基因Ct分别求平均数，然后相减获得△Ct平均，然后再依据上面公式计算不同处理之间目的基因水平差异。

实时PCR数据通过ABI PRISM7300_SDSsoftware(Applied Biosystems)软件进行分析，根据软件计算Ct值。根据上面介绍的相对定量方法分析，转染了干扰质粒pSUPER-shPABP1#比转染了对照质粒pSUPER-shPCV2的Marc-145细胞PABP的mRNA水平下降了约20%（结果见图15），在接种PRRSV病毒后，相应的ORF7的mRNA水平下降了约50%（结果见图16）。说明当Marc-145细胞PABP表达量下降时，病毒PRRSV在细胞上的复制也受到了抑制。

5.3.4间接免疫荧光检测转染靶向PABP的shRNA后病毒复制的变化

用Qiagen质粒提取试剂盒纯化pSUPER-shPABP1#和pSUPER-shPCV2，测定核酸浓度。转染前24h将Marc-145细胞铺24孔板，当细胞长至约30%-50%时，按Promega公司的TransFast^TM Transfection Reagent说明转染Marc-145细胞。每孔设3个重复，每μg质粒加3μl转染试剂，24孔板1μg/孔为转染条件。

转染24h后接毒，接毒方法和剂量与5.3.2同。

接毒后16h，吸弃细胞上清，每孔加500μl 4%多聚甲醛,室温30min固定细胞，每孔加0.2%Triton-X100 500μl，室温5min，每孔加500μl1%BSA，室温30min封闭，用1%BSA按1∶200稀释抗N蛋白的单抗（2H7），按每孔500μl加入稀释后的抗N蛋白的单抗，室温孵育1h，PBS洗涤5遍，用1%BSA按1∶500稀释标记Alexa488的羊抗鼠荧光二抗，室温孵育45min，PBS洗涤5遍，用DAPI染色5min，PBS洗涤5遍。用ZEISS倒置荧光显微镜观察，发现转染了干扰质粒pSUPER-shPABP1#的Marc-145细胞上的绿色荧光明显弱于转染了对照质粒pSUPER-shPCV2，说明转染干扰质粒pSUPER-shPABP1#使细胞PABP表达量下降后，也抑制了PRRSV在Marc145细胞上的复制。结果见图17。

Claims

1.PABP蛋白抑制剂在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用，其中所述的PABP蛋白GeneBank登录号为:XM_001927747.1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的PABP蛋白抑制剂为表达PABP shRNA的重组质粒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的表达PABP shRNA的重组质粒以pSUPER为出发载体，含有表达PABP shRNA的DNA模板序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的表达PABP shRNA的DNA模板序列系由SEQ ID No.9所示的寡核苷酸正义链和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸反义链序列组成。

5.一种抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒表达的重组表达质粒，其特征在于以pSUPER为出发载体，含有可表达PABP shRNA的DNA模板序列。

6.根据权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于所述的可表达PABP shRNA的DNA模板序列系由SEQ ID No.9所示的寡核苷酸正义链和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸反义链序列组成。