CN107164527B - 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种多能干细胞体外定向分化调节因子筛选方法以及多能干细胞体外定向分化报告基因细胞株,本公开所提供的技术方案能够在全基因组范围内对所有可能参与多能干细胞体外定向分化调控的编码基因、蛋白以及能调控多能干细胞体外定向分化的化合物进行简便、快速的大规模筛查。
Description
技术领域
本公开涉及细胞生物学领域,具体地,涉及一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法。
背景技术
多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)在体外特定生长因子诱导下可定向分化得到多种功能体细胞,如肝脏细胞、心肌细胞、神经元细胞、胰岛细胞),是生物功能分析、药物筛选、毒理检测、体内移植等研究和临床治疗的潜在重要细胞来源。
建立多种体外定向分化体系需要基于对体内发育生物学的理解,以及,对体内各器官或细胞发育过程进行体外模拟。而由于发育生物学的复杂性,体外定向分化体系无法完全模拟体内发育环境,所得的多种功能体细胞大都存在细胞成熟性不够、细胞群体处于杂合状态、不同多能干细胞株系的定向分化效率差异大的缺陷,多能干细胞分化得到的功能体细胞在基础科研和转化医学方面的应用受到较大限制。为解决上述问题,进一步改善体外分化体系,提高所得功能体细胞的质量,需要深入分析寻找参与调控体外定向分化的生物因子,进而对体外分化体系进行针对性的改进。
目前多种方法被用于改进体外定向分化体系,包括:1)通过比较体内发育和体外分化各阶段细胞的RNA、蛋白表达谱及关键信号通路变化,发现体外分化与体内发育的差别,进而通过调整生长因子的使用对体外分化体系进行优化;该方法的缺陷在于,针对特定的调控因子或信号通路,无法在全基因组的范围内对所有可能参与定向分化调控的编码基因或蛋白进行大规模筛查;2)通过建立终末分化细胞的功能检测方法平台,大规模筛选化合物,寻找和添加合适的化合物对体外分化体系进行优化。该方法的缺陷在于,大规模化合物筛选的检测平台主要是ELISA或qPCR,这两种检测方式需要比较复杂的操作步骤,在扩大筛选化合物体系时需要较大的工作量和时间。
因此,有必要提供一种在全基因组范围内,简便、快速的筛选参与调控体外定向分化的生物因子的技术方案以及大规模筛选调节多能干细胞体外定向分化的化合物的技术方案。
发明内容
本公开的目的是解决制约多能干细胞体外定向分化技术发展的问题,建立一种能够在全基因组范围内对所有可能参与定向分化调控的编码基因或蛋白进行简便、快速的大规模筛查的技术,以及对可能调控多能干细胞体外定向分化的化合物进行大规模筛查的技术。
为了实现上述目的,本公开的第一个方面提供一种多能干细胞体外定向分化调节因子筛选方法,所述方法包括以下步骤:
(1)构建针对细胞特异性标志物的编码基因的同源重组载体,所述同源重组载体包含能与所述细胞特异性标志物共表达的报告基因;
(2)将所述同源重组载体转染多能干细胞,获得稳定整合了所述同源重组载体的报告基因株系;
(3)将靶向全基因组的CRISPR文库包装慢病毒获得CRISPR慢病毒文库,用所述CRISPR慢病毒文库感染所述报告基因株系,使每个细胞至多只有一个病毒颗粒感染获得感染后细胞,诱导所述感染后细胞进行定向分化培养获得定向分化细胞,根据报告基因的表达水平对所述定向分化细胞进行分化程度划分,对不同分化程度的细胞进行靶向序列测序,筛选获得与多能干细胞分化程度相关的细胞特异性标志物的编码基因种类;
或者,
对步骤(2)所述的报告基因株系进行体外定向分化培养,在定向分化培养基中加入待筛选化合物,分化培养结束后,根据报告基因表达水平筛选调节多能干细胞体外定向分化的化合物。
可选的,所述细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因、成熟心肌细胞标志物编码基因、成熟运动神经元标志物编码基因或成熟胰岛β细胞标志物编码基因。
可选的,所述报告基因为荧光报告基因、抗性基因或化学发光蛋白,其中,所述报告基因为荧光报告基因、抗性基因或化学发光蛋白,其中,所述荧光报告基因为Venus、mCherry、GFP、YFP或CFP;所述抗性基因为嘌呤霉素编码基因或新霉素编码基因;所述化学发光蛋白为荧光素酶报告基因。可选的,所述同源重组载体中还包括在同源重组后将细胞特异性标志物的编码基因与报告基因进行连接的连接肽,所述连接肽为2A蛋白连接肽或内部核糖体进入位点。
可选的,所述同源重组载体的插入位点为细胞特异性标志物的编码基因终止密码子前。
可选的,所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因ALB。
本公开的第二个方面能提供一种多能干细胞体外定向分化报告基因细胞株,其中,所述细胞株是通过如下方式制备获得的:
(a)构建针对细胞特异性标志物的编码基因的同源重组载体,所述同源重组载体包含能与所述细胞特异性标志物共表达的报告基因;所述细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因、成熟心肌细胞标志物编码基因、成熟运动神经元标志物编码基因或成熟胰岛β细胞标志物编码基;
所述报告基因为荧光报告基因、抗性基因或化学发光蛋白,其中,所述荧光报告基因为Venus、mCherry、GFP、YFP或CFP;所述抗性基因为嘌呤霉素编码基因或新霉素编码基因;所述化学发光蛋白为荧光素酶报告基因;
(b)将所述同源重组载体转染多能干细胞,获得稳定整合了所述同源重组载体的报告基因株系。
可选的,所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因ALB。
通过上述技术方案,能够在全基因组范围内对所有可能参与多能干细胞体外定向分化调控的编码基因、蛋白以及能调控多能干细胞体外定向分化的化合物进行简便、快速的大规模筛查。本公开所提供的技术方案无偏见,可以针对全基因组,不基于前期实验结果;操作性强,涉及的实验操作包括分子克隆,病毒包装、干细胞培养和分化、流式分选、深度测序和生物信息分析等均为成熟的实验体系;耗费少,不需要多次、多样本的RNA或蛋白表达谱测序。该方案可直接用于高效和极大规模的细胞分化影响因子筛选,进一步改进体外定向分化平台,提高所得功能体细胞的质量。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本公开,但并不构成对本公开的限制。在附图中:
图1显示大规模遗传筛选出部分在高Venus表达群体(Venus+)中CRISPR gRNA富集的基因(相比流式分选前肝脏细胞群体,HLCs)。
其中,横坐标为不同细胞群体,纵坐标为相对应基因的CRISPR gRNA在不同细胞群体中的数目。gRNA在Venus+群体中的富集提示靶向相应基因能提高Venus表达强度。
图2显示大规模化合物筛选结果。
96孔板中每个孔细胞被不同化合物进行处理,以DMSO作为对照组。其中,A显示荧光图片;B和C分别显示化合物处理后细胞荧光强度和荧光百分比统计图(以DMSO对照组为1)。箭头所指为筛选出的化合物CI-994。
图3显示不同基因敲除后肝脏细胞成熟标记物白蛋白(ALB,albumin)的分泌量。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开,并不用于限制本公开。
本公开的第一个方面提供一种多能干细胞体外定向分化调节因子筛选方法,所述方法包括以下步骤:
(1)构建针对细胞特异性标志物的编码基因的同源重组载体,所述同源重组载体包含能与所述细胞特异性标志物共表达的报告基因;
(2)将所述同源重组载体转染多能干细胞,获得稳定整合了所述同源重组载体的报告基因株系;
(3)将靶向全基因组的CRISPR文库包装慢病毒获得CRISPR慢病毒文库,用所述CRISPR慢病毒文库感染所述报告基因株系,使每个细胞至多只有一个病毒颗粒感染获得感染后细胞,诱导所述感染后细胞进行定向分化培养获得定向分化细胞,根据报告基因的表达水平对所述定向分化细胞进行分化程度划分,对不同分化程度的细胞进行靶向序列测序,筛选获得与多能干细胞分化程度相关的靶基因种类;
或者,
对步骤(2)所述的报告基因株系进行体外定向分化培养,在定向分化培养基中加入待筛选化合物,分化培养结束后,根据报告基因表达水平筛选调节多能干细胞体外定向分化的化合物。
其中,所述多能干细胞为具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞,在本公开中,所述多能干细胞可以为任何具有向干细胞方向分化能力的干细胞,其来源可以为从动物体直接分离的多能干细胞,也可以为通过诱导方法所获得的诱导多能干细胞。
在本公开所提供的方法中,根据需要筛选的定向分化调节因子种类选取细胞特异性标志物并构建针对细胞特异性标志物的编码基因的同源重组载体,例如,如果需要筛选的多能干细胞定向分化调节因子为参与由多能干细胞定向分化为成熟肝脏细胞过程的调节因子,那么所选取的细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物的编码基因,例如可以为ALB基因。
可选的,根据需要筛选的定向分化调节因子种类,所述细胞特异性标志物的编码基因,可以为成熟肝脏细胞标志物编码基因、成熟心肌细胞标志物编码基因、成熟运动神经元标志物编码基因、成熟胰岛β细胞标志物编码基因等细胞特异性标志物基因。
针对细胞特异性标志物的编码基因设计同源重组载体,所述同源重组载体的两端包括用于将重组载体插入靶位点的5′和3′的同源臂序列。可选的,所述同源重组载体的插入位点为细胞特异性标志物的编码基因终止密码子前,从而使得报告基因可以与细胞特异性标志物的编码基因共表达。
所述同源重组载体中还包括在同源重组整合后将细胞特异性标志物的编码基因与报告基因进行连接的连接肽,所述连接肽可选为2A蛋白连接肽或内部核糖体进入位点(IRES),连接肽的作用为保证细胞特异性标志物的编码基因与报告基因在细胞内实现共表达,二者的表达量呈正相关,从而可以通过报告基因的表达水平反映细胞特异性标志物的编码基因的表达水平。
可选的,所述报告基因为荧光报告基因、抗性基因或化学发光蛋白,其中,所述荧光报告基因可以为Venus、mCherry、GFP、YFP或CFP;所述抗性基因可以为嘌呤霉素编码基因或新霉素编码基因;所述化学发光蛋白可以为荧光素酶报告基因。
可选的,所述同源重组载体中还可以含有用于筛选稳定真核了所述同源重组载体的选择标记基因,所述选择标记基因的种类可以根据本领域常规的选择系统确定。
在本公开的一种具体的实施方式中,当利用本公开所提供的方法筛选参与由多能干细胞定向分化为成熟肝脏细胞过程的定向分化调节因子时,所述同源重组载体的核苷酸序列可以为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
在本公开所提供的方法中,将同源重组载体转染进入多能干细胞的方法没有特别的限制,可以为慢病毒转染法或电转染法,优选采用电转染的方式将同源重组载体导入多能干细胞。本公开对多能干细胞的培养、转染以及阳性克隆的筛选条件没有特别的限制,可以按照本领域常规的方法进行。
在步骤(3)中,通过使每个细胞至多只有一个病毒颗粒感染获得感染后细胞,可以使得每个细胞最多只有一个基因被敲除。本公开对于诱导所述感染后细胞使其定向分化的方法没有特别的限制,可以根据筛选目的,选取本领域所公知的定向分化培养基和培养条件,从而获得定向分化细胞。所述定向分化细胞可能为已经成熟的体细胞,也可能是处于定向分化过程中的未成熟的体细胞。
值得注意的是,本公开中,针对全基因组的CRISPR文库可以根据筛选目的不同而被任何其他CRISPR文库替代,包括针对特定基因群体的文库(如针对激酶、膜受体等)、针对特定RNA群体的文库(如lincRNA、miRNA等)、针对非编码基因组区域的文库(如转录调控区等)等,都应视作没有脱离本公开的范围。
进一步的,在步骤(3)中,是利用CRISPR技术进行靶基因的敲除,本领域技术人员可以理解的是,利用本领域其他已知的技术进行基因操作也可以在一定程度上实现靶基因的敲除(例如利用Cre-LoxP重组酶系统),而这样的技术方案也应视为没有脱离本公开的技术构思。
本公开中,可以根据报告基因的种类选取相应的检测其表达水平的方法,例如,当所述报告基因为荧光报告基因时,可以使用流式细胞仪根据荧光强度对细胞进行分类。当所述报告基因为抗性基因时,可以通过抗性筛选的方法对细胞进行分类。当报告基因为化学发光蛋白时,可以通过使用荧光素酶底物的方式对细胞进行分类。
在本公开中,对于进行细胞分化程度划分的方式没有特别的限制,可以将细胞的分化程度划分为高分化细胞、低分化细胞以及未分化细胞,也可以根据实际需要选择适当的划分方式。
以荧光报告基因Venus为例,通过流式分选将高Venus基因表达和低或无Venus表达的细胞群体分别分选出来作为不同的细胞群体。抽取细胞群体的基因组DNA进行PCR扩增CRISPR序列后进行深度测序。运用生物统计学的方法,分析在分选后高Venus基因表达群体中富集的CRISPR gRNA序列,筛查在高Venus表达群体中的细胞中被靶向敲除的基因,提示这些基因编码的蛋白因子参与调节多能干细胞向某种体细胞的体外定向分化过程。本领域技术人员可以理解的是,这里所述的高Venus基因表达是指Venus强度top 5%,低Venus基因表达是指Venus强度bottom 5%。
在本公开中,为了筛选促进多能干细胞体外定向分化的化合物,可以对所述报告基因株系进行体外定向分化培养,在定向分化培养基中加入待筛选化合物,分化培养结束后,根据报告基因表达水平筛选促进多能干细胞体外定向分化的化合物。可以根据报告基因的种类选取相应检测其表达水平的方法。以荧光报告基因Venus为例,在分化结束时通过高内涵分析细胞的荧光基因表达程度和荧光基因表达细胞百分比筛查能提高荧光基因表达的化合物分子,提示该化合物分子促进多能干细胞体外定向分化为肝脏细胞的分化效率和细胞成熟度。
本公开的第二个方面能提供一种多能干细胞体外定向分化报告基因细胞株,其中,所述细胞株是通过如下方式制备获得的:
(a)构建针对细胞特异性标志物的编码基因的同源重组载体,所述同源重组载体包含能与所述细胞特异性标志物的编码基因共表达的报告基因;所述成熟细胞标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因、成熟心肌细胞标志物编码基因、成熟运动神经元标志物编码基因或成熟胰岛β细胞标志物编码基;
所述报告基因为荧光报告基因、抗性基因或化学发光蛋白,其中,所述荧光报告基因为Venus、mCherry、GFP、YFP或CFP;所述抗性基因为嘌呤霉素编码基因或新霉素编码基因;所述化学发光蛋白为荧光素酶报告基因;
(b)将所述同源重组载体转染多能干细胞,获得稳定整合了所述同源重组载体的报告基因株系。
可选的,所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因ALB。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中,如无特别说明,所用的各试剂均可通过商购获得,如无特别说明,所用的方法为本领域的常规方法。
实施例1
1)构建成熟肝脏细胞的报告基因株系。
构建如SEQ ID NO.1所示的同源重组载体,将所述同源重组载体通过电转染的方式转染1016诱导人多能干细胞(购自美国哈佛大学干细胞库),筛选稳定表达所述同源重组载体的多能干细胞,获得报告基因株系。
2)利用报告基因株系,结合CRISPR介导的全基因组大规模遗传筛选,筛查参与多能干细胞体外定向分化为肝脏细胞的调节因子。将靶向全基因组2万个左右基因的CRISPR文库(购自Addgene)包装慢病毒并进行慢病毒滴度测定。在报告基因株系中进行CRISPR慢病毒文库感染,使每个细胞至多只有一个病毒颗粒感染,即每个细胞最多只有一个基因被敲除。诱导hPSC体外分化为肝脏细胞,通过流式分选将高Venus表达、低Venus表达、无Venus表达的细胞群体分别分选出来。抽取四个细胞群体的基因组DNA(感染的hPSCs(占所有hPSC细胞量的5%),流式分选前肝脏细胞群体(占所有分选前肝脏细胞量的5%),分选后高Venus表达群体(占所有分选肝脏细胞量的5%),分选后低或无Venus表达群体(占所有分选肝脏细胞量的5%))。对CRISPR序列进行PCR扩增,并对扩增产物进行深度测序。运用生物统计学的方法,分别以hPSC、分选前肝脏细胞群体、分选后低或无Venus表达细胞群体为对照,分析在分选后高Venus表达群体中富集的CRISPR gRNA序列,筛查在高Venus表达群体的细胞中被靶向的基因,提示基因ATG7、RPS6KA2、HDAC3、TIMP3和RAB3GAP1编码的蛋白因子参与调节多能干细胞体外向肝脏细胞的定向分化。
图1显示部分在高Venus表达群体中gRNA富集的基因(相比流式分选前肝脏细胞群体)。其中,横坐标为不同细胞群体,纵坐标为相对应基因的CRISPR gRNA在不同细胞群体中的数目。gRNA在Venus+群体中的富集提示靶向相应基因能提高Venus表达强度。
其中,诱导hPSCs体外分化为肝脏细胞的步骤如下:
(a)将多能干细胞在含有激活素A或P13K抑制剂的第一诱导培养基中培养3-4天获得内胚层细胞,其中第一诱导培养基具体组成为以RPMI-1640为基础培养基(购自invitrogen,货号11875093),添加1%的B27补充物(购自invitrogen,货号12587010)、100ng/mL激活素A(购自PeproTech,货号AF-120-14E和5uM P13K抑制剂(LY-294002,购自Selleck,货号S1105);
(b)将所述内胚层细胞在含有骨形态发生蛋白4或成纤维生长因子2的第二诱导培养基中培养5天获得肝脏祖细胞,其中第二诱导培养基具体组成为以RPMI-1640为基础培养基(购自invitrogen,货号11875093),添加1%的B27补充物(购自invitrogen,货号12587010)、20ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4,购自PeproTech,货号120-05)、5ng/mL成纤维生长因子2(FGF2,购自PeproTech,货号AF-100-18B)和0.5%二甲基亚砜(DMSO);
(c)将所述肝脏祖细胞在含有肝细胞生长于因子的第三诱导培养基中培养5天获得不成熟肝脏细胞,其中第三诱导培养基具体组成为以RPMI-1640为基础培养基(购自invitrogen,货号11875093),添加1%的B27补充物(购自invitrogen,货号12587010)、20ng/mL肝细胞生长于因子(HGF,购自PeproTech,货号100-39)和0.5%二甲基亚砜(DMSO);
(d)将所述不成熟肝脏细胞在含有5-10μmol/L的组蛋白去乙酰化酶抑制剂以及制瘤素M、肝细胞生长因子和地塞米松的第四诱导培养基中培养10-15天获得肝脏细胞,其中第四诱导培养基具体组成为以肝脏培养基为基础培养基(购自Lonza,货号CC-3198),添加20ng/mL肝细胞生长因子(HGF,购自PeproTech,货号100-39)、20ng/mL制瘤素M(OncostatinM,购自PeproTech,货号300-10)、100nM地塞米松(Dexamethasone,购自Sigma,货号D4902)、和0.5%二甲基亚砜(DMSO)。
3)利用报告基因株系,进行大规模化合物分子筛选。
利用1)中的荧光基因报告株系,进行定向分化得到功能体细胞后进行化合物分子库筛选,寻找能提高荧光基因表达(即功能体细胞成熟标志物表达)的化合物分子。在肝脏细胞体外定向分化中,多能干细胞首先分化得到不成熟肝脏细胞,随后将不成熟肝脏细胞均匀分盘到96孔中,在肝脏细胞成熟分化培养基中同时加入不同的化合物分子,化合物名称及添加量如表1所示,(购自国家新药筛选中心)进行化合物筛选,在分化结束时分析细胞的荧光基因表达程度和荧光基因表达细胞百分比筛查能提高荧光基因表达的化合物分子,提示该化合物分子促进多能干细胞体外定向分化为肝脏细胞的分化效率和细胞成熟度,如图2示,在培养体系中添加化合物CI-994可以提高荧光基因的表达,提示该化合物参与了多能干细胞体外定向分化为肝脏细胞的过程,并且发挥了促进分化的作用。
表1
测试例1
选取实施例1中筛选获得的基因ATG7、RPS6KA2和HDAC3,构建各基因的CRISPR慢病毒颗粒并分别转染多能干细胞,对多能干细胞进行体外定向分化培养,使其向肝脏细胞分化。分化结束后,分别检测细胞中ALB蛋白的表达情况。结果表明,在敲除ATG7、RPS6KA2和HDAC3基因后,抑制了多能干细胞向成熟肝脏细胞的分化,与实施例1中得出的结果相适应(如表2所示),说明利用本公开所提供的细胞株和方法,可以实现多能干细胞体外定向分化调节因子的筛选。表2和图3显示为利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测不同组别肝脏细胞成熟标记物白蛋白(albumin)分泌量,并用细胞总的RNA量进行细胞量的标准化,结果显示与相对应的对照组相比的倍数变化。证实了利用实施例1的方案所筛选出的基因ATG7、RPS6KA2和HDAC3在被敲除后可以促进多能干细胞体外定向分化为肝脏细胞。
表2
敲除基因种类 | albumin蛋白分泌量(改变倍数) |
ATG7 | 7.8 |
RPS6KA2 | 11.0 |
HDAC3 | 1.93 |
对照组(未敲除基因) | 1 |
测试例2
选取实施例1中筛选获得的化合物CI-994,对多能干细胞进行体外定向分化培养,使其向肝脏细胞分化。多能干细胞首先分化得到不成熟肝脏细胞,随后将不成熟肝脏细胞均匀分盘到96孔中,在肝脏细胞成熟分化培养基中同时加入化合物CI-994,分化结束后,分别检测细胞中ALB蛋白的表达情况。结果表明,利用化合物CI-994可以促进多能干细胞向成熟肝脏细胞的分化,与实施例1中得出的结果吻合(如表3所示),说明利用本公开所提供的细胞株和方法,可以实现多能干细胞体外定向分化调节因子的筛选。
表3显示利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测不同组别肝脏细胞成熟标记物白蛋白(albumin)分泌量,并用细胞总的RNA量进行细胞量的标准化,结果显示为与相对应的对照组相比的倍数变化。
表3
化合物种类 | albumin蛋白分泌量(改变倍数) |
CI-994 | 1.79 |
对照组(DMSO) | 1 |
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州观梓健康科技有限公司
<120> 一种筛选参与多能干细胞体外定向分化调节因子的方法
<130> 6570HZGZ
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5389
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> This sequence is synthesized in lab.
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aanctctgac acatgcagnn 60
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 120
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 180
tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 240
ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 300
ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 360
ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattggagat 420
cggtacttcg cgaatgcgtc gagatattgg gtcgcggccg cactttgttt ttatctcctg 480
ctctattgtg ccatactgtt aaatgtttat aatgcctgtt ctgtttccaa atttgtgatg 540
cttatgaata ttaataggaa tatttgtaag gcctgaaata ttttgatcat gaaatcaaaa 600
cattaattta tttaaacatt tacttgaaat gtggtggttt gtgatttagt tgattttata 660
ggctagtggg agaatttaca ttcaaatgtc taaatcactt aaaattgccc tttatggcct 720
gacagtaact tttttttatt catttgggga caactatgtc cgtgagcttc cgtccagaga 780
ttatagtagt aaattgtaat taaaggatat gatgcacgtg aaatcacttt gcaatcatca 840
atagcttcat aaatgttaat tttgtatcct aatagtaatg ctaatatttt cctaacatct 900
gtcatgtctt tgtgttcagg gtaaaaaact tgttgctgca agtcaagctg ccttaggctt 960
aggcggcgga gagggcagag gaagccttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg 1020
cccaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 1080
ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 1140
ctacggcaag ctgaccctga agctcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 1200
caccctcgtg accaccctcg gctacggcct gcagtgcttc gcccgctacc ccgaccacat 1260
gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 1320
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cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 1440
gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcaccgccg acaagcagaa 1500
gaacggcatc aaggccaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggcg gcgtgcagct 1560
cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 1620
ccactacctg agctaccagt ccaagctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 1680
ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctcaatta 1740
attaacccta gaaagataat catattgtga cgtacgttaa agataatcat gcgtaaaatt 1800
gacgcatgtg ttttatcggt ctgtatatcg aggtttattt attaatttga atagatatta 1860
agttttatta tatttacact tacatactaa taataaattc aacaaacaat ttatttatgt 1920
ttatttattt attaaaaaaa aacaaaaact caaaatttct tctataaagt aacaaaactt 1980
ttaaagcttt ttttggtacc ttttgctagc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 2040
ttatcctagg taattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg 2100
cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca 2160
ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc 2220
ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac 2280
gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca 2340
atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg 2400
ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg 2460
ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc 2520
tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc tgttgacaat 2580
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tctgccacca tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc 2700
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gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc 2820
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acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag 2940
ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg 3000
cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag 3060
ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc 3120
gccttcctgg aaacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc 3180
gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc 3240
ggtgccgtcg acgagggcag aggaagcctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 3300
ggccctggat ccatgcccac gctactgcgg gtttatatag acggtcccca cgggatgggg 3360
aaaaccacca ccacgcaact gctggtggcc ctgggttcgc gcgacgatat cgtctacgta 3420
cccgagccga tgacttactg gcgggtgctg ggggcttccg agacaatcgc gaacatctac 3480
accacacaac accgccttga ccagggtgag atatcggccg gggacgcggc ggtggtaatg 3540
acaagcgccc agataacaat gggcatgcct tatgccgtga ccgacgccgt tctggctcct 3600
catatcgggg gggaggctgg gagctcacat gccccgcccc cggccctcac cctcatcttc 3660
gaccgccatc ccatcgccgc cctcctgtgc tacccggccg cgcgatacct tatgggcagc 3720
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aacatcgtgt tgggggccct tccggaggac agacacatcg accgcctggc caaacgccag 3840
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atggcgcgcc attgggtatc ggatgccggg accgacgagt gcagaggcg 5389
Claims (1)
1.一种多能干细胞体外定向分化调节因子筛选方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)构建针对细胞特异性标志物的编码基因的同源重组载体,所述同源重组载体包含能与所述细胞特异性标志物共表达的报告基因;所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示,所述细胞特异性标志物的编码基因为成熟肝脏细胞标志物编码基因ALB;
(2)将所述同源重组载体转染多能干细胞,获得稳定整合了所述同源重组载体的报告基因株系;所述多能干细胞为1016诱导人多能干细胞;
(3)将靶向全基因组的CRISPR文库包装慢病毒获得CRISPR慢病毒文库,用所述CRISPR慢病毒文库感染所述报告基因株系,使每个细胞至多只有一个病毒颗粒感染获得感染后细胞,诱导所述感染后细胞进行定向分化培养获得定向分化细胞,根据报告基因的表达水平对所述定向分化细胞进行分化程度划分,对不同分化程度的细胞进行靶向序列测序,筛选获得与多能干细胞分化程度相关的靶基因种类。
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