CN116837032A - 一种表达egfr细胞外结构域a289v错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法 - Google Patents

一种表达egfr细胞外结构域a289v错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，涉及细胞生物学技术领域，该方法包括EGFR A289V突变的获取、载体质粒双酶切、基因特异性扩增、同源重组酶连、钙转法包装慢病毒和目的细胞慢病毒感染与筛选六个步骤。能够得到能稳定表达EGFRA289V突变的胶质瘤细胞系，保证无菌环境，避免了标本转移带来的污染问题，所采用的细胞系较为稳定，能够减少实验的干扰因素，实验的操作简便，花费低。

Description

一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系 的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，更具体地说，它涉及一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法。
背景技术
胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是恶性程度最高的胶质瘤，由于GBM侵袭生长迅速，手术难以完全切除，且易复发，其治疗一直是医学上的难点。近些年来，关于GBM驱动基因的多项研究表明，GBM与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)密切相关。大多数GBM存在EGFR基因状态的改变，其中EGFR基因突变以胞外结构域(Extracellular Domain,ECD)突变最为常见。EGFR VIII缺失突变为胞外区突变的主要突变形式，而胞外区错义突变中以EGFR A289V突变频率最高。后续研究发现EGFR A289V为主的EGFR ECD错义突变同样可以成为引起恶性胶质瘤发生、发展的驱动因素。所以近些年来，EGFR胞外区突变成为GBM研究的新方向。
在各项针对GBM胞外结构域突变的基础研究中总免不了使用相关的胶质瘤细胞系。但是目前针对GBM中EGFR胞外区错义突变的基础研究极为稀少，且使用的胶质瘤细胞系大多为人源肿瘤组织提取培养的原代细胞。主要方法是将手术中获取的新鲜胶质瘤标本，用含抗生素的无血清培养基冲洗过后，将其处理成0.5-1.0mm3的小块组织种植于培养瓶进行培养，或者使用0.25％胰蛋白酶消化过滤成细胞悬液再进行培养传代。之后将所得的原代细胞进行NGS测序，选出所需要的原代细胞进行后续的研究。其优势为：直接从患者的肿瘤组织中提取，更加直观地从现实层面反应出所研究的EGFR突变对临床诊疗造成的影响。但缺陷也很明显：(1)标本材料需要尽可能的新鲜，还要无菌操作，但是手术标本获取再转运至实验室的过程中容易造成污染。(2)由于放化疗会抑制胶质瘤的生长，降低原代培养成功率，因此最好是选取未经过治疗的首诊患者，但这类组织获取较为困难。(3)这类原代细胞还需要经过NGS检测以挑选产生符合实验要求的突变才可进行使用。多项限制条件使得此方法需要大量的临床标本数据，同时反复的测序所花费的时间及成本较为高昂。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，能够得到能稳定表达EGFR A289V突变的胶质瘤细胞系，保证无菌环境，避免了标本转移带来的污染问题，所采用的细胞系较为稳定，能够减少实验的干扰因素，实验的操作简便，花费低。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，所述方法包括以下六个步骤：
S1.EGFR A289V突变的获取；
S2.载体质粒双酶切；
S3.基因特异性扩增；
S4.同源重组酶连；
S5.钙转法包装慢病毒；
S6.目的细胞慢病毒感染与筛选。
本发明进一步设置为：所述S1中EGFR A289V突变的获取具体操作如下：从NCBI官网获取EGFR基因全长信息，以EGFR野生型为模板，其胞外结构域第289个氨基酸突变为EGFRA289V突变。
本发明进一步设置为：所述S2中载体质粒双酶切具体操作如下：选用骨架为CD510B-1-pCDH-CMV-EF1-Puro的慢病毒质粒pCDH-VHL-HA作为载体质粒，用限制性核酸内切酶XbaI、NotI对其进行双酶切，制备线性化载体；其反应体系在冰上配制，反应体系中包含5uL Cutsmart、1uL XbaI、1uL NotI、2.5ug载体质粒，用双蒸水补齐至50ul,在37℃下过夜酶切,酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行胶回收得到线性化载体。
本发明进一步设置为：所述S3中基因特异性扩增具体操作如下：
①设计EGFR A289V突变质粒的特异性扩增引物，引物序列为：
EGFR-F(5'-3'):ATAGAAGATTCTAGAATGCGACCCTCCGGGAC；
EGFR-R(5'-3'):ATCCTTCGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTGCTCCAATAAATTC；
②PCR反应体系：其中包含25uL Pfu mix(2×)、5uL正向引物、5uL反向引物、50ngEGFR A289V突变质粒，再用双蒸水补齐至50ul；
③PCR反应程序：调试PCR仪，使其温度在94℃维持5min，实现预变性；随后继续在94℃下维持5s实现变性；再退火至68℃下维持2.5min；在72℃下延伸5min；在72℃下再延伸5min；循环30次；
④反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并胶回收得到纯化的PCR扩增产物。
本发明进一步设置为：所述S4中同源重组酶连具体操作如下：
①同源重组反应体系：所述反应体系中包含150ng线性化载体、200ng纯化的PCR扩增产物、4uL 5x Ligation-Free cloning Master Mix，再用双蒸水补齐至20ul；
②将反应体系放置于冰上孵育30min，取实验室保存的STBL3感受态细胞于冰上融化；将反应体系与感受态细胞混合后在冰上放置40min，在42℃热激90s,随即继续冰上孵育10min，加入500ul无抗性的液体LB培养基，37℃、220rpm摇菌活化2小时，活化后的菌液2000rpm离心5min，弃去大部分上清液，留约50ul上清液混合吹匀，使用涂布棒将菌液均匀铺满含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养皿中，涂布棒浸于75％酒精中，使用前于酒精灯上灼烧晾凉后再涂布平板，平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养后观察单克隆菌落生长状况，用灭菌的10ul枪头挑取平板中的单克隆菌落，接种在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，培养基的总体积为5ml，其中氨苄青霉素：LB培养基＝1:1000，摇床设置37℃、220rpm，过夜摇菌；
③菌落PCR验证上述单克隆菌落后，将菌落PCR结果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果为阳性的菌液移至200ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中再次摇菌12h，利用无内毒素大抽质粒试剂盒抽提质粒，得到重组慢病毒载体质粒。
本发明进一步设置为：所述S5中钙转法包装慢病毒具体操作如下：
在包装前一天取对数生长期的293T细胞接种于10cm培养皿中，待细胞密度达70％-80％时进行钙转；先将360ul双蒸水、40ul 2.5M Cacl2、6ug重组慢病毒载体质粒、6ug辅助质粒混合，再将其加入400ul2xHBS中静置10min；随后将混合液缓慢滴入293T细胞培养基中，轻晃混匀后镜下可见培养基中出现黑色钙沉积，后置于37℃培养箱中培养，24小时后更换新鲜DMEM培养基，并于荧光显微镜下可观察出现了绿色荧光，分别于48小时及72小时收集含病毒的培养基；将收集到的病毒液4500rpm，离心10min，并利用0.45um的滤膜进行过滤得包装好的病毒。
本发明进一步设置为：所述S6中目的细胞慢病毒感染与筛选具体操作如下：
取S5中得到的包装好的病毒液缓慢加入预先传代好的U87、U251细胞的培养基中，等待感染24小时后，在镜下可观察到PCDH-GFP质粒组发出绿色荧光；感染目的细胞48小时后，进行传代，并在培养基中加入嘌呤霉素5ug/ml以筛选稳定表达的细胞，将细胞继续培养得到表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系。
本发明进一步设置为：所述辅助质粒包括PAX2和VSVG。
综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明构建出一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系，将表达EGFR A289V错义突变的重组质粒利用钙转法导入U87、U251这类常用的胶质瘤细胞系中，经过筛选得到能稳定表达EGFR A289V突变的胶质瘤细胞系。相较于培养原代细胞全程在实验室进行无菌操作，避免了标本转移带来的污染问题，其次所用的胶质瘤细胞为常用成品基础实验细胞系，较为稳定，且各项特性可经文献查阅，减少实验的干扰因素。建系所使用的同源重组酶连法与钙转法花费低，操作简便，且这两种细胞系可以作为进行EGFR A289V突变研究的成品细胞系，同时其重组质粒以及构建方法还可以进一步感染其他细胞系，用以在其他方面探索这种突变。该细胞系对于临床上GBMEGFR胞外区突变的患者的诊疗具有一定的意义。
附图说明
图1A是本发明实施例中：CD510B-1-pCDH-CMV-EF1-Puro慢病毒质粒骨架；图1B是本发明实施例中：pCDH-VHL-HA载体质粒酶切后电泳图，M为10kb DNA Marker；1、2泳道为pCDH-VHL-HA质粒双酶切结果(两组为重复组)；Control为未添加核酸内切酶的pCDH-VHL-HA质粒；
图2是本发明实施例中EGFR基因PCR扩增产物及EGFR相关基因重组质粒菌落PCR结果的琼脂糖凝胶电泳图。图2A:1泳道为EGFR WT的PCR扩增结果条带；2泳道为EGFR A289V的PCR扩增结果条带。图2B：3泳道为EGFR L858R的PCR扩增结果条带。图2C：1泳道为EGFR WT的菌落PCR结果条带；2泳道为EGFR A289V的菌落PCR结果条带；3泳道为EGFR L858R的菌落PCR结果条带。M均为5kb DNA Marker；
图3是本发明实施例中pCDH-GFP病毒颗粒感染U87、U251细胞绿色荧光观察结果(100X)。图3A：钙转法显示pCDH-GFP在293T细胞中的表达；图3B：pCDH-GFP病毒颗粒感染U87细胞的结果；图3C：pCDH-GFP病毒颗粒感染U251细胞的结果；
图4是本发明实施例中Flag-Tag在U87、U251细胞系中表达的蛋白电泳图；
图5是本发明实施例中EGFR DNA产物与所需序列比对图。A：EGFR A289V B：EGFRL858R。
具体实施方式
以下结合附图1-5对本发明作进一步详细说明。
实施例：一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，如图1-5所示，该方法包括以下六个步骤：
S1.EGFR A289V突变的获取；
S2.载体质粒双酶切；
S3.基因特异性扩增；
S4.同源重组酶连；
S5.钙转法包装慢病毒；
S6.目的细胞慢病毒感染与筛选。
S1中EGFR A289V突变的获取具体操作如下：从NCBI官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取EGFR基因全长信息，以EGFR野生型(即EGFR WT)为模板，选其胞外结构域第289个氨基酸突变即EGFR A289V突变作为实验组，选取其胞内结构域突变EGFR L858R为阳性对照，将EGFR WT作为一般对照组，分别对一般对照组、实验组、阳性对照组按照如下步骤做相同处理。
S2中载体质粒双酶切具体操作如下：选用骨架为CD510B-1-pCDH-CMV-EF1-Puro的慢病毒质粒pCDH-VHL-HA作为载体质粒，用限制性核酸内切酶XbaI(识别序列：5’-TCTAGA-3’)、NotI(识别序列：5’-GCGGCCGC-3’)对其进行双酶切，制备线性化载体；其反应体系在冰上配制，反应体系中包含5uL Cutsmart、1uL XbaI、1uL NotI、2.5ug载体质粒，用双蒸水补齐至50ul,在37℃下过夜酶切,酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行胶回收得到线性化载体，凝胶电泳分离每孔上样10uL，120V，电泳50min。
胶回收步骤如下(同胶回收试剂盒上所示操作步骤，胶回收试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司#DC301-01)：
a.将凝胶置于EP管中称重，去除空管重量后，100mg凝胶等同于100ul体积bufferGDP。凝胶与等体积buffer GDP混合后55℃金属浴加热值凝胶完全溶解，期间可颠倒EP管加速混匀。
b.短暂离心收集管壁上的液滴，将溶胶混合液分次转移至吸附柱中，每次少于700ul，以免超过吸附柱体积以至溢出。
c.12000rpm，1min离心后弃废液，再次加入300ul buffer GDP，静置1min后再次离心1min。
d.上述离心弃废液后，沿吸附柱四周加入700ul buffer GW(已加入所需量的无水乙醇)，盖紧颠倒混匀2次，有助于完全洗净吸附柱上的盐分，再次离心并重复buffer GW洗涤一次。
e.空管离心一次后取出吸附柱置于干净的EP管中，加入20ul Elution buffer(洗脱+缓冲)或双蒸水，静置5min后离心收集所需液体，可重复一次以增加回收效率。所得溶液测浓度后保存于-20℃。
载体质粒双酶切的目的是去除实验室之前插入的VHL-HA中间片段并线性化质粒，经过酶切后的片段为35bp和7384bp，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切结果，如图1A、1B所示，其中泳道1、2代表pCDH-VHL-HA慢病毒载体的双酶切结果(两组为重复组)；Control为未进行酶切的pCDH-VHL-HA质粒，结果显示酶切有效，酶切后纯化目的条带。
S3中基因特异性扩增具体操作如下：
①设计EGFR A289V突变质粒的特异性扩增引物，引物序列为：
EGFR-F(5'-3'):ATAGAAGATTCTAGAATGCGACCCTCCGGGAC；
EGFR-R(5'-3'):ATCCTTCGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTGCTCCAATAAATTC；
②PCR反应体系：其中包含25uL Pfu mix(2×)、5uL正向引物、5uL反向引物、50ngEGFR A289V突变质粒，再用双蒸水补齐至50ul；
③PCR反应程序：调试PCR仪，使其温度在94℃维持5min，实现预变性；随后继续在94℃下维持5s实现变性；再退火至68℃下维持2.5min；在72℃下延伸5min；在72℃下再延伸5min；循环30次；
④反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定PCR产物并胶回收得到纯化的PCR扩增产物。
1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物结果如图2A、2B所示，PCR结果提示条带位置正确，经过纯化后将所收集的DNA产物送往上海生工生物工程公司测序，应用Snap-Gene软件将测序结果与EGFR目的基因进行比对，结果序列完全符合预期。
S4中同源重组酶连具体操作如下：
①同源重组反应体系：所述反应体系中包含150ng线性化载体、200ng纯化的PCR扩增产物、4uL 5x Ligation-Free cloning Master Mix，再用双蒸水补齐至20ul；
②将反应体系放置于冰上孵育30min，取实验室保存的STBL3感受态细胞于冰上融化；将反应体系与感受态细胞混合后在冰上放置40min，在42℃热激90s,随即继续冰上孵育10min，加入500ul无抗性的液体LB培养基，37℃、220rpm摇菌活化2小时，活化后的菌液2000rpm离心5min，弃去大部分上清液，留约50ul上清液混合吹匀，使用涂布棒将菌液均匀铺满含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养皿中，涂布棒浸于75％酒精中，使用前于酒精灯上灼烧晾凉后再涂布平板，平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养后观察单克隆菌落生长状况，用灭菌的10ul枪头挑取平板中的单克隆菌落，接种在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，培养基的总体积为5ml，其中氨苄青霉素：LB培养基＝1:1000，摇床设置37℃、220rpm，过夜摇菌；
③菌落PCR验证单克隆菌落，其引物为：
Primer-F(5'-3')：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；
Primer-R(5'-3')：GTTCACGGTGCCCTCC。
表1菌落PCR反应体系
PCR反应程序：预变性：94℃，5min；变性：94℃，20s；退火：55℃，20s；延伸：72℃，30s；再延伸：72℃，5min；共进行30个循环数。
④将菌落PCR结果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果为阳性的菌液移至200ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中再次摇菌12h，利用无内毒素大抽质粒试剂盒抽提质粒，得到重组慢病毒载体质粒。
质粒抽提步骤如下：
a.按照大抽质粒试剂盒说明书抽提质粒，大抽质粒试剂为北京天根生化科技公司#DP117，使用前注意各溶液成分是否已正确添加，P1须加入RNaseA(核酸内切酶)，PW须加入无水乙醇。
b.将菌液倒入50ml离心管，8000rpm，3min，弃上清，多次离心将菌液沉淀至管中，可用吸水纸尽量吸除上清。
c.加入8mlP1，反复吹打或涡旋震荡菌体沉淀以充分悬浮。
d.加入8mlP2，立即温和上下翻转6-8次。使菌体充分裂解，静置5min。
e.加入8mlP4，立即温和上下翻转6-8次。此时溶液出现白色絮状沉淀，静置10min后离心8000rpm，20min。
f.将上层溶液倒入过滤器CS1中，收集滤液于干净的50ml离心管中。向滤液中加入0.3倍体积异丙醇，上下混匀后转移至吸附柱P6中(P6使用前需柱平衡：向吸附柱中加入2.5ml平衡液BL，离心后弃废液)8000rpm，2min，弃废液，多次重复过柱。
g.洗涤时先加入10mlPW洗涤2次，后加入3ml无水乙醇洗涤一次。再空离一次。弃废液后开盖静置5min，以蒸发乙醇。
h.将CP6置于干净的50ml离心管中，悬空滴加1ml ddH2O，室温静置5min后离心(可重复一次以增加浓度)，将收集的含质粒的液体检测浓度后分装保存于-20℃。
i.将质粒送往公司测序验证，测序所得序列与基因库中的序列比对分析，序列比对正确，即重组慢病毒载体质粒构建成功。
结果如图2C所示，将显示阳性的菌液进行培养抽提质粒，后将所得的质粒送往公司进行测序，测序结果显示所得质粒在预计的位置准确插入所需的EGFR的全长基因及相关突变序列，质粒构建完成。
S5中钙转法包装慢病毒具体操作如下：
在包装前一天取对数生长期的293T细胞接种于10cm培养皿中，待细胞密度达70％-80％时进行钙转；先将360ul双蒸水、40ul 2.5M Cacl2、6ug重组慢病毒载体质粒、6ug辅助质粒混合(辅助质粒包含PAX2和VSVG)，再将其加入400ul 2xHBS中静置10min；随后将混合液缓慢滴入293T细胞培养基中，轻晃混匀后镜下可见培养基中出现黑色钙沉积，后置于37℃培养箱中培养，24小时后更换新鲜DMEM培养基，并于荧光显微镜下可观察出现了绿色荧光，分别于48小时及72小时收集含病毒的培养基；将收集到的病毒液4500rpm，离心10min，并利用0.45um的滤膜进行过滤得包装好的病毒。
钙转法获得的PCDH-GFP病毒颗粒感染U87、U251细胞48小时后，通过荧光显微镜可观察到绿色荧光蛋白在细胞内的表达，观察结果显示同批进行感染的pCDH-puro、pCDH-EGFR-WT、pCDH-EGFR-A289V、pCDH-EGFR-L858R病毒颗粒顺利感染U87、U251细胞，结果如图3所示。
S6中目的细胞慢病毒感染与筛选具体操作如下：
取S5中得到的包装好的病毒液缓慢加入预先传代好的U87、U251细胞的培养基中，等待感染24小时后，在镜下可观察到PCDH-GFP质粒组发出绿色荧光；感染目的细胞48小时后，进行传代，并在培养基中加入嘌呤霉素5ug/ml以筛选稳定表达的细胞，将细胞继续培养得到表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系。
使用pCDH-puro空载质粒作为阴性对照，将pCDH-EGFR-WT、pCDH-EGFR-A289V、pCDH-EGFR-L858R重组质粒转染进U87、U251细胞。将经过嘌呤霉素筛选后的细胞提蛋白进行WB。结果如图4所示。Flag-Tag是在构建重组质粒时，人为添加在EGFR基因末端，正常细胞中并不存在Flag-Tag的表达。WB结果显示稳转的细胞中成功表达Flag-Tag蛋白，同时U87、U251细胞中EGFR-WT、EGFR-A289V、EGFR-L858R三组的EGFR蛋白表现出与Flag-Tag蛋白相同的表达水平。由此可证，我们成功构建出稳定表达EGFR WT、EGFR A289V、EGFR L858R蛋白的胶质瘤细胞。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述方法包括以下六个步骤：
S1.EGFRA289V突变的获取；
S2.载体质粒双酶切；
S3.基因特异性扩增；
S4.同源重组酶连；
S5.钙转法包装慢病毒；
S6.目的细胞慢病毒感染与筛选。
2.根据权利要求1所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：
所述S1中EGFRA289V突变的获取具体操作如下：从NCBI官网获取EGFR基因全长信息，以EGFR野生型为模板，其胞外结构域第289个氨基酸突变为EGFRA289V突变。
3.根据权利要求1所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：
所述S2中载体质粒双酶切具体操作如下：选用骨架为CD510B-1-pCDH-CMV-EF1-Puro的慢病毒质粒pCDH-VHL-HA作为载体质粒，用限制性核酸内切酶XbaI、NotI对其进行双酶切，制备线性化载体；其反应体系在冰上配制，反应体系中包含5uLCutsmart、1uLXbaI、1uLNotI、2.5ug载体质粒，用双蒸水补齐至50ul,在37℃下过夜酶切,酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行胶回收得到线性化载体。
4.根据权利要求3所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：
所述S3中基因特异性扩增具体操作如下：
①设计EGFRA289V突变质粒的特异性扩增引物，引物序列为：
EGFR-F(5'-3'):ATAGAAGATTCTAGAATGCGACCCTCCGGGAC；
EGFR-R(5'-3'):ATCCTTCGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAAT CTGCTCCAATAAATTC；
②PCR反应体系：其中包含25uLPfumix(2×)、5uL正向引物、5uL反向引物、50ngEGFRA289V突变质粒，再用双蒸水补齐至50ul；
③PCR反应程序：调试PCR仪，使其温度在94℃维持5min，实现预变性；随后继续在94℃下维持5s实现变性；再退火至68℃下维持2.5min；在72℃下延伸5min；在72℃下再延伸5min；循环30次；
④反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并胶回收得到纯化的PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：
所述S4中同源重组酶连具体操作如下：
①同源重组反应体系：所述反应体系中包含150ng线性化载体、200ng纯化的PCR扩增产物、4uL5xLigation-FreecloningMaster Mix，再用双蒸水补齐至20ul；
②将反应体系放置于冰上孵育30min，取实验室保存的STBL3感受态细胞于冰上融化；将反应体系与感受态细胞混合后在冰上放置40min，在42℃热激90s,随即继续冰上孵育10min，加入500ul无抗性的液体LB培养基，37℃、220rpm摇菌活化2小时，活化后的菌液2000rpm离心5min，弃去大部分上清液，留约50ul上清液混合吹匀，使用涂布棒将菌液均匀铺满含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养皿中，涂布棒浸于75％酒精中，使用前于酒精灯上灼烧晾凉后再涂布平板，平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养后观察单克隆菌落生长状况，用灭菌的10ul枪头挑取平板中的单克隆菌落，接种在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，培养基的总体积为5ml，其中氨苄青霉素：LB培养基＝1:1000，摇床设置37℃、220rpm，过夜摇菌；
③菌落PCR验证上述单克隆菌落后，将菌落PCR结果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果为阳性的菌液移至200ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中再次摇菌12h，利用无内毒素大抽质粒试剂盒抽提质粒，得到重组慢病毒载体质粒。
6.根据权利要求5所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：
所述S5中钙转法包装慢病毒具体操作如下：
在包装前一天取对数生长期的293T细胞接种于10cm培养皿中，待细胞密度达70％-80％时进行钙转；先将360ul双蒸水、40ul2.5MCacl2、6ug重组慢病毒载体质粒、6ug辅助质粒混合，再将其加入400ul2xHBS中静置10min；随后将混合液缓慢滴入293T细胞培养基中，轻晃混匀后镜下可见培养基中出现黑色钙沉积，后置于37℃培养箱中培养，24小时后更换新鲜DMEM培养基，并于荧光显微镜下可观察出现了绿色荧光，分别于48小时及72小时收集含病毒的培养基；将收集到的病毒液4500rpm，离心10min，并利用0.45um的滤膜进行过滤得包装好的病毒。
7.根据权利要求6所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：
所述S6中目的细胞慢病毒感染与筛选具体操作如下：取S5中得到的包装好的病毒液缓慢加入预先传代好的U87、U251细胞的培养基中，等待感染24小时后，在镜下可观察到PCDH-GFP质粒组发出绿色荧光；感染目的细胞48小时后，进行传代，并在培养基中加入嘌呤霉素5ug/ml以筛选稳定表达的细胞，将细胞继续培养得到表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系。
8.根据权利要求6所述的一种表达EGFR细胞外结构域A289V错义突变的胶质瘤细胞系的构建方法，其特征是：所述辅助质粒包括PAX2和VSVG。
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