CN117645975B - 一种用于高通量筛选trpv1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents
一种用于高通量筛选trpv1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞生物学和药物筛选技术领域，尤其涉及一种用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用。本发明提供的细胞系稳定表达GCaMP8m序列和TRPV1受体序列，所述GCaMP8m序列存在于细胞质中，所述TRPV1受体序列存在于细胞膜上，所述GCaMP8m序列和TRPV1受体序列的摩尔比为1：1。该细胞系能够有效排除其他钙离子通道对实验的干扰，准确而客观地反映TRPV1的通道活性，克服了现有技术无法准确反映TRPV1通道活性的缺点，利用该细胞系能够进行TRPV1受体抑制剂的高通量筛选。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学和药物筛选技术领域，尤其涉及一种用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloidsubfamily 1，TRPV1）是瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道家族中的一员，广泛分布于全身各个系统，包括中枢神经、外周神经、呼吸、消化、心脑血管和皮肤等系统。TRPV1是一种非选择性的阳离子通道，激活时能够引起Ca2+、Mg2+、K+和Na+等阳离子内流。TRPV1分子由六个跨膜核心片段（S1-S6）构成，在S5和S6跨膜片段之间有一个成孔环。这个环包括胞质N和C末端，使其成为对Ca2+具有高通透性的非选择性四聚体阳离子通道，其特性类似于电压门控K+通道。N端尾部具有6个锚蛋白重复结构域（ARD），而C端能够与钙调蛋白（CaM）和ATP结合，还有一个TRP结构域。TRPV1对Ca2+显示出的相对选择特异性、通透性比其他阳离子高5-10倍左右。TRPV1受体通道定位在细胞膜上，当与配体结合被激活后，胞内Ca2+浓度升高，进而引起相应的生理和病理变化，如咳嗽、疼痛、炎症、瘙痒、血压调节和脂肪代谢等。并且在痛觉传导通路中，TRPV1受体发挥着关键作用，其功能异常与多种疼痛性疾病有关。鉴于TRPV1在疾病防治中的潜在应用价值，开发快速、灵敏且高通量的TRPV1受体抑制剂筛选模型，对于治疗疼痛及相关疾病具有重要意义。
目前筛选TRPV1受体抑制剂的技术方法主要有三类：（1）药物处理后提取细胞内的总RNA，通过反转录得到cDNA，再利用q-PCR技术检测TRPV1基因的mRNA表达水平；（2）药物处理后提取细胞内的总蛋白质，通过western blot技术检测TRPV1蛋白的表达水平；（3）TRPV1受体的FLIPR（Fluorescent Imaging Plate Reader）实时荧光检测，利用高灵敏度的荧光探针Fluo-4，对细胞内Ca2+水平进行实时的检测和监测。前两种方法仅能反映TRPV1的mRNA或蛋白质表达水平，无法真实反映TRPV1的通道活性。FLIPR检测技术仅限于TRPV1高表达细胞，无法排除其他钙离子通道的干扰，并且需要高端大型仪器，试剂材料昂贵，操作复杂且周期长。此外，在正常体温下，TRPV1并不活跃，其可以被多种理化因素激活，如辣椒素、质子（pH＜6.0）、热刺激（温度＞43℃）等。辣椒素通过香草醛基和跨膜结构域的S4-S5连接体上的T551和E571之间形成氢键，从而稳定TRPV1的开放状态。此外，它还可以被多种神经炎症介质和内源性炎症介质如缓激肽、P物质、前列腺素和降钙素基因相关肽等直接或间接激活。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系及其构建方法和应用。本发明构建的细胞系能够有效排除其他钙离子通道对实验的干扰，准确而客观地反映TRPV1的通道活性，克服了现有技术的缺点，利用该细胞系能够进行TRPV1受体抑制剂的高通量筛选。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供一种用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，所述细胞系稳定表达GCaMP8m序列和TRPV1受体序列，所述GCaMP8m序列存在于细胞质中，所述TRPV1受体序列存在于细胞膜上，所述GCaMP8m序列和TRPV1受体序列的摩尔比为1：1。
GCaMP由绿色荧光蛋白（GFP）、钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13组成。当Ca2+与CaM结合时，CaM发生构象变化，其轻链区可以与M13结合，在特定波长的光照下，GFP发色团的质子化作用增强，导致吸光度增加，从而激发强烈的荧光。利用荧光信号强度可检测出细胞或组织中Ca2+的浓度变化。本发明提供的上述细胞模型中含有GCaMP8m序列和TRPV1受体序列，当胞外Ca2+经TRPV1受体进入细胞时，GCaMP8m感应到Ca2+而产生绿色荧光，通过对荧光强度进行检测，即可客观地判断TRPV1的通道活性。由于细胞系中TRPV1受体高表达，其数量远多于其他钙离子通道，所以其他钙离子通道对TRPV1受体活性检测结果的影响很小。因此，使用该细胞模型，可以对TRPV1受体抑制剂进行高通量筛选。目前，尚未发现利用GCaMP钙离子指示剂检测TRPV1通道活性的技术。
本发明第二方面还提供上述用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系的构建方法，具体包括以下步骤：
S1、利用EcoRI和NotI内切酶对GCaMP8m-P2A基因片段和pLVX-IRES-puro载体进行双酶切，将所得酶切产物纯化回收后通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A慢病毒载体；所述GCaMP8m-P2A基因片段的序列如SEQ ID NO .1所示；
S2、利用NotI和BamHI内切酶对所述GCaMP8m-P2A慢病毒载体和带有NotI酶切位点及BamHI酶切位点的TRPV1片段进行双酶切，将所得酶切产物纯化回收后通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体；所述带有NotI酶切位点及BamHI酶切位点的TRPV1片段的序列如SEQ ID NO .2所示；
S3、将所述GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体与psPAX2和pMD2.G包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装、扩增，得到GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒；
S4、用所述GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染细胞，然后进行细胞筛选，获得GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系，即为用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系。
该构建方法创造性地将GCaMP8m与P2A基因片段相融合，构成序列如SEQ ID NO .1所示的GCaMP8m-P2A基因片段，并使该GCaMP8m-P2A基因片段前端带有酶切位点EcoRI（GAATTC），后端带有酶切位点NotI（GCGGCCGCG）。利用该GCaMP8m-P2A基因片段，本发明通过基因工程技术将钙离子指示剂GCaMP8m序列、P2A序列、TRPV1受体序列稳定表达于适宜的细胞系中，使得该细胞系具有稳定表达GCaMP8m-P2A-TRPV1的特性，P2A序列可自行将GCaMP8m与TRPV1蛋白质切割并释放，使GCaMP8m定位在细胞质中，TRPV1定位在细胞膜上，确保GCaMP8m序列和TRPV1受体序列均能高表达，使胞外Ca2+能够经TRPV1受体进入细胞并通过GCaMP8m而产生绿色荧光，从而准确、客观地反映TRPV1的通道活性。
优选地，所述带有NotI酶切位点及BamHI酶切位点的TRPV1片段可通过以下方法获得：以人cDNA为模板通过PCR技术克隆TRPV1编码区序列（NCBI Reference Sequence: NM_080706.3.），引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。经PCR克隆得到产物（序列如SEQ ID NO .2所示）前端带有酶切位点NotI（GCGGCCGCG），后端带有酶切位点BamHI（GGATCC）。
优选地，S1中的酶切体系为：
酶切反应条件为：在37℃反应1~2h。
S1中将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A慢病毒载体的反应体系为：
连接反应条件为：在4~22°C反应6~12h。
S2中的酶切体系为：
酶切反应条件为：在37℃反应1~2h。
S2中将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体的条件为：
连接反应条件为：在4~22°C反应6~12h。
可选地，S1、S2中的纯化回收可采用以下方法：
①载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测；
②在紫外灯下小心切下目的条带，尽量将不含DNA片段的空白凝胶切掉；
③按0.1g对应100 μL加入胶块重量的PN，50°C水浴5-10 min至胶完全溶解，中间颠倒数次；
④将溶胶液移入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心60 s。倒掉收集管中废液；
⑤加入600 μL PW（含无水乙醇），12000 rpm离心30 s，倒掉收集管中液体；
⑥重复步骤⑤一次；
⑦吸附柱于12000 rpm离心2 min，室温放置数分钟，彻底晾干；
⑧将吸附柱加入一个干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30 μL ElutionBuffer，室温静置2 min后，12000 rpm离心2 min。保存离心管中DNA溶液，即为纯化后的酶切产物。
S4中所述细胞包括HeLa、HEK293、HaCaT或SH-SY5Y细胞。根据细胞筛选模型的部位选择相同部位的细胞系即可，例如，筛选肾脏细胞TRPV1受体抑制剂则用GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染肾源细胞系，如人肾源HEK293细胞系，筛选皮肤细胞受体抑制剂则用GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染皮肤细胞系，如人皮肤角质形成细胞HaCaT细胞系，筛选宫颈细胞受体抑制剂则用GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染宫颈细胞或宫颈癌细胞，如HeLa细胞。
可选地，S4可采用以下操作：在培养皿中接种细胞，培养至70%-80%汇合度，利用所述GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染细胞，12~48 h后更换含嘌呤霉素（Puromycin）的新鲜培养基，然后通过含嘌呤霉素的培养基进行细胞筛选，将形克隆的细胞挑出，用无钙离子的培养基继续培养，即可获得GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系。其中Puromycin浓度根据细胞系的类别进行常规选择即可。
优选地，该细胞模型的构建方法还可以包括对所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系进行TRPV1受体表达水平的检测，以确保TRPV1受体的高表达。
本发明第三方面提供了上述细胞系在高通量筛选TRPV1受体活性抑制剂中的应用，具体操作包括：
将待筛选化合物、辣椒素与所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系共孵育，作为实验组，将辣椒素与所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系共孵育，作为阳性对照组，将所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系作为阴性对照组，根据各组的荧光强度判断所述待筛选物质对TRPV受体活性的抑制作用；如果实验组的荧光强度低于阳性对照组，则所述待筛选化合物对TRPV受体活性有抑制作用。
该操作方法具备低成本、易操作和周期短等优势，易于实施。其中辣椒素能够特异性激活TRPV1，使用辣椒素做阳性对照能够进一步减少其他钙离子通道对TRPV1受体活性检测结果的影响，提高检测结果的准确性。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的细胞系在细胞膜上稳定高表达TRPV1蛋白，能够有效排除其他钙离子通道对筛选结果的干扰；
（2）本发明提供的细胞系通过GCaMP8m荧光信号直接反映TRPV1通道活性，检测结果更准确可靠；
（3）通过本发明提供的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系的构建方法所得到的稳定表达GCaMP8m-P2A-TRPV1的细胞系可多次传代，通过培养于96孔板即可实现TRPV1活性的高通量筛选；
（4）利用本发明提供的细胞系，通过倒置荧光显微镜即可检测待测物对TRPV1通道活性的影响，易操作、成本低且实验周期短。
附图说明
图1为本发明实施例3中荧光显微镜下不同处理组的荧光；
图2为本发明实施例3中不同处理组的荧光强度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都落入本发明的保护范围之内。
TRPV1是一种非选择性的阳离子通道，对Ca2+显示出的相对选择特异性、通透性比其他阳离子高5-10倍左右。TRPV1受体通道定位在细胞膜上，当与配体结合被激活后，胞内Ca2+浓度升高，进而引起相应的生理和病理变化，如咳嗽、疼痛、炎症、瘙痒、血压调节和脂肪代谢等，且其功能异常与多种疼痛性疾病有关，在疾病防治中的潜在应用价值。因此，开发快速、灵敏且高通量的TRPV1受体抑制剂筛选模型，对于治疗疼痛及相关疾病具有重要意义。目前筛选TRPV1受体抑制剂的技术方法存在无法真实反映TRPV1的通道活性，无法排除其他钙离子通道的干扰的缺点。
本发明通过创造性地将GCaMP8m与P2A基因片段相融合，再与TRPV1受体序列连接，使GCaMP8m序列、P2A序列和TRPV1受体序列稳定表达于适宜的细胞系中，P2A序列可自行将GCaMP8m与TRPV1蛋白质切割并释放，使GCaMP8m定位在细胞质中，TRPV1定位在细胞膜上，当胞外Ca2+经TRPV1受体进入细胞时，GCaMP8m感应到Ca2+而产生绿色荧光，通过对荧光强度进行检测，即可客观地判断TRPV1的通道活性。由于细胞系中TRPV1受体高表达，其数量远多于其他钙离子通道，所以其他钙离子通道对TRPV1受体活性检测结果的影响很小。
以下通过具体实施例对本发明的方案进行说明。
如无特殊说明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；以下实施例中所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了一种用于筛选TRPV1受体抑制剂的高通量细胞模型的构建方法，具体包括以下操作步骤：
（1）合成GCaMP8m-P2A基因序列（如SEQ ID NO .1所示），其前端带有酶切位点EcoRI（GAATTC），后端带有酶切位点NotI（GCGGCCGCG）。
（2）以人cDNA为模板通过PCR技术克隆TRPV1编码区序列（NCBI ReferenceSequence: NM_080706.3.），引物如下：F：CTAGCGGCCGCGATGAAGAAATGGAGCAGC（如SEQ ID NO.3所示）；R：CGCGGATCCTCACTTCTCCCCGGAAGC（如SEQ ID NO .4所示），得到如SEQ ID NO .2所示的TRPV1片段。产物前端带有酶切位点NotI（GCGGCCGCG），后端带有酶切位点BamHI（GGATCC）。
（3）利用EcoRI和NotI内切酶将GCaMP8m-P2A和pLVX-IRES-puro载体（购买于Clontech公司）进行双酶切（37°C酶切2 h），用DNA片段回收试剂盒（购买于天根生化科技有限公司）对酶切产物纯化回收后，通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物在16℃连接过夜（12h），形成GCaMP8m-P2A慢病毒载体。
其中对GCaMP8m-P2A进行双酶切的体系为：
对pLVX-IRES-puro进行双酶切的体系为：
对酶切产物纯化回收的方法为：
①将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测；
②在紫外灯下小心切下目的条带，尽量将不含DNA片段的空白凝胶切掉；
③按0.1g对应100 μL加入胶块重量的PN，50°C水浴5-10 min至胶完全溶解，中间颠倒数次；
④将溶胶液移入吸附柱中，室温放置2 min，12000 rpm离心60 s。倒掉收集管中废液；
⑤加入600 μL PW（含无水乙醇），12000 rpm离心30 s，倒掉收集管中液体；
⑥重复步骤⑤一次；
⑦吸附柱于12000 rpm离心2 min，室温放置数分钟，彻底晾干；
⑧将吸附柱加入一个干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30 μL ElutionBuffer，室温静置2 min后，12000 rpm离心2 min。保存离心管中DNA溶液。
通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物连接的体系为：
（4）利用NotI和BamHI内切酶将GCaMP8m-P2A慢病毒载体和步骤（2）得到的TRPV1片段进行双酶切（37°C酶切2 h），将所得酶切产物纯化回收后通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物在16℃连接过夜（12h），形成GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体。
其中对GCaMP8m-P2A慢病毒载体进行双酶切的体系为：
对TRPV1片段进行双酶切的体系为：
对酶切产物纯化回收的方法同步骤（3）；
通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物连接的体系为：
（5）将GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体与psPAX2和pMD2.G包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装、扩增，得到GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒。
（6）在装有固体培养基的60 mm培养皿中接种适宜细胞系（如HeLa、HEK293、HaCaT或SH-SY5Y细胞等），培养至70%-80%汇合度，利用GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染细胞，24 h后更换含Puromycin（浓度根据细胞系而定）的新鲜培养基。
（7）通过含Puromycin的培养基进行细胞筛选，当阳性克隆形成后，将阳性克隆挑至96孔板中继续培养，即可获得GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系。
（8）对稳定表达细胞系进行western blot蛋白水平检测，确保TRPV1受体的高表达。
将稳定表达GCaMP8m-P2A-TRPV1的细胞系培养于96孔板，即可用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂。
实施例2
本实施例提供了一种用于筛选宫颈细胞TRPV1受体抑制剂的高通量细胞模型的构建方法，具体包括以下操作步骤：
（1）按实施例1中的步骤（1）~（5）获得GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒。
（2）在装有固体培养基的60 mm培养皿中接种人宫颈癌Hela细胞系，培养至70%-80%汇合度，利用GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染细胞，24 h后更换含0.8 µg/mL Puromycin的新鲜培养基。
（3）通过含0.8 µg/mL Puromycin的培养基进行细胞筛选，2周后将阳性克隆挑至96孔板中，以含0.8 µg/mL Puromycin的无钙离子培养基继续培养，即可获得GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的HeLa细胞系。
（4）提取稳定表达GCaMP8m-P2A-TRPV1的HeLa细胞系的总蛋白进行Western blot检测，确保TRPV1受体的高表达。
实施例3
本实施例提供了实施例2制得的稳定表达GCaMP8m-P2A-TRPV1的HeLa细胞系在高通量筛选宫颈细胞TRPV1受体活性抑制剂中的应用。
用含0.8 µg/mL Puromycin的无钙离子液体培养基将稳定表达GCaMP8m-P2A-TRPV1的HeLa细胞培养于96孔板，各孔含有104个GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的HeLa细胞且各孔培养基体积相同，将各孔分为实验组、阳性对照组和阴性对照组。实验组的孔中加入4-叔丁基环己醇（待筛选化合物）和辣椒素的DMSO溶液共孵育30 sec，其中4-叔丁基环己醇的终浓度为50 μM，辣椒素的终浓度为10 μM，二者加入的总体积为200 μL；阳性对照组的孔中加入200 μL辣椒素的DMSO溶液共孵育30 sec，辣椒素的终浓度为10 μM；阴性对照组的孔中加入200 μL DMSO共孵育30 sec。
经荧光显微镜观察，阳性对照组显现出明亮的绿色荧光（如图1所示），而实验组和阴性对照组的荧光则明显较弱。通过ImageJ软件计算各处理组之间的荧光强度（如图2所示），结果显示4-叔丁基环己醇显著抑制辣椒素对TRPV1的激活。以上结果表明实施例2制得的细胞系能够用于高通量筛选宫颈细胞TRPV1受体活性抑制剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，所述细胞系稳定表达GCaMP8m序列和TRPV1受体序列，所述GCaMP8m序列存在于细胞质中，所述TRPV1受体序列存在于细胞膜上，所述GCaMP8m序列和TRPV1受体序列的摩尔比为1：1；所述细胞系的构建方法具体包括以下步骤：
S1、利用EcoRI和NotI内切酶对GCaMP8m-P2A基因片段和pLVX-IRES-puro载体进行双酶切，将所得酶切产物纯化回收后通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A慢病毒载体；所述GCaMP8m-P2A基因片段的序列如SEQ ID NO .1所示；
S2、利用NotI和BamHI内切酶对所述GCaMP8m-P2A慢病毒载体和带有NotI酶切位点及BamHI酶切位点的TRPV1片段进行双酶切，将所得酶切产物纯化回收后通过T4 DNA连接酶将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体；所述带有NotI酶切位点和BamHI酶切位点的TRPV1片段的序列如SEQ ID NO .2所示；
S3、将所述GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体与psPAX2和pMD2.G包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒包装、扩增，得到GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒；
S4、用所述GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染细胞，然后进行细胞筛选，获得GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系，即为用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系。
2.根据权利要求1所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，所述带有NotI酶切位点及BamHI酶切位点的TRPV1片段通过以下方法获得：以人cDNA为模板通过PCR技术克隆TRPV1编码区序列，引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
3.根据权利要求1所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，S1中的酶切体系为：
酶切反应条件为：在37℃反应1~2h。
4.根据权利要求1所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，S1中将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A慢病毒载体的反应体系为：
连接反应条件为：在4~22°C反应6~12h。
5.根据权利要求1所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，S2中的酶切体系为：
酶切反应条件为：在37℃反应1~2h。
6.根据权利要求1所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，S2中将纯化后的酶切产物连接形成GCaMP8m-P2A-TRPV1过表达载体的条件为：
连接反应条件为：在4~22°C反应6~12h。
7.根据权利要求1~5任一项所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，S4中所述细胞包括HeLa、HEK293、HaCaT或SH-SY5Y细胞；和/或
S4的具体操作为：在培养皿中接种细胞，培养至70%-80%汇合度，利用所述GCaMP8m-P2A-TRPV1病毒侵染细胞，12~48 h后更换含嘌呤霉素的新鲜培养基，然后通过含嘌呤霉素的培养基进行细胞筛选，将形克隆的细胞挑出，用无钙离子的培养基继续培养，即可获得GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系。
8.根据权利要求1~5任一项所述的用于高通量筛选TRPV1受体抑制剂的细胞系，其特征在于，所述构建方法还包括对所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系进行TRPV1受体表达水平的检测。
9.权利要求1所述的细胞系在高通量筛选TRPV1受体活性抑制剂中的应用，具体操作包括：
将待筛选化合物、辣椒素与所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系共孵育，作为实验组，将辣椒素与所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系共孵育，作为阳性对照组，将所述GCaMP8m-P2A-TRPV1稳定表达的细胞系作为阴性对照组，根据各组的荧光强度判断所述待筛选物质对TRPV受体活性的抑制作用；如果实验组的荧光强度低于阳性对照组，则所述待筛选化合物对TRPV受体活性有抑制作用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |