CN108949697A - 一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法 - Google Patents

一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法 Download PDF

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李会政
李文奇
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汤叶美
周江韬
刘红亮
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Abstract

本发明属于细胞研究技术领域，具体涉及一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法。本发明稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，包含以下步骤：(1)设计并合成引物；(2)根据绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro序列，用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti‑puro载体质粒，将酶切产物连接，获得目的载体pLenti‑puro‑GFP；(3)无内毒素提取验证载体pLenti‑puro‑GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切载体pLenti‑puro‑GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳电泳检测基因序列大小，同时将载体pLenti‑puro‑GFP质粒送去测序检测GFP‑LC3的序列情况；(4)用载体pLenti‑puro‑GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收取病毒上清，将病毒上清转染喉癌细胞Hep‑2，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在高内涵下观察，直至获得稳定株。

Description

一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法
技术领域
本发明属于细胞研究技术领域，具体涉及一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法。
背景技术
绿色荧光蛋白(GFP)最初是从水母中发现的一种蛋白质，当水母发光蛋白结合Ca2+后发出蓝色荧光，该蓝光进一步激发GFP产生绿色荧光。GFP激发后发出的荧光持续时间较长，且不需要任何其他辅助因子的作用，GFP的cDNA成功克隆及在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功表达后，人们认识到它的巨大应用前景。
喉癌是头颈癌常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高复发率的特点，其发病率在各国各地的差异很大。至今为止喉癌的治疗仍以手术为主，但手术不仅影响了患者的生理功能，同时也给患者带来了很大的精神困扰，所以对其研究至关重要。构建稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株，对于喉癌发生发展机制的研究、高通量和高内涵分子靶向药物筛选、以及动物模型中监测肿瘤生长转移等具有重要的推动作用，为喉癌生物标志物筛选及治疗靶点的挖掘提供细胞学基础。
目前尚无商品化的表达荧光蛋白的喉癌稳定细胞株，在很大程度上限制了针对喉癌的靶向药物筛选和分子机制研究。因此筛选稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株对喉癌及相关领域的基础及临床转化研究具有重要的意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种慢病毒质粒为骨架的绿色荧光蛋白表达载体，并通过病毒包装、感染喉癌细胞Hep-2及筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，包含以下步骤：
(1)根据绿色荧光蛋白基因的序列信息，设计并合成引物，以pEGFP-C1载体质粒为模板，PCR扩增获得绿色荧光蛋白的基因序列；
(2)根据绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti-puro序列，用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti-puro载体质粒，将酶切产物连接，获得目的载体pLenti-puro-GFP；
(3)无内毒素提取验证载体pLenti-puro-GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切载体pLenti-puro-GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳电泳检测基因序列大小，同时将载体pLenti-puro-GFP质粒送去测序检测GFP-LC3的序列情况；
(4)用载体pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收取病毒上清，将病毒上清转染喉癌细胞Hep-2，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在高内涵下观察，直至获得稳定株。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(1)所述的绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ.ID.NO.1；pLenti-puro序列的基因序列如SEQ.ID.NO.2；载体pLenti-puro-GFP的基因部分测序结果的序列如SEQ.ID.NO.3
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(1)所述的引物为SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(1)中PCR扩增的反应条件为：95℃，3-5min；95℃,30Sec；57℃,30Sec；72℃1min；25-30个循环。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(2)中用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列后回收的产物与和pLenti-puro载体质粒按照5：1的摩尔比用连接酶solution I在4摄氏度过夜连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，获得目的载体pLenti-puro-GFP。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(3)中无内毒素提取验证载体pLenti-puro-GFP质粒的具体方法为：
(31)取测序验证正确的pLenti-puro-GFP菌液20微升，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的15mL LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；
(32)无内毒素质粒小提试剂盒提取培养菌液中的pLenti-puro-GFP质粒，测定浓度。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述步骤(4)中筛选细胞的具体方法为：
(41)将60皿中90％的293T细胞按体积比为1:3的比例传代到60mm培养皿中，待细胞密度在60-70％时进行转染；
(42)用lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体转染293T细胞，转染6h后换成20％血清的培养基，转染48h后，收取病毒上清；
(43)将60皿中90％的喉癌细胞Hep-2按体积比为1:3的比例传代到60mm皿中，待细胞融合度达到60％时用pLenti-puro-GFP病毒上清感染细胞，感染24h后换成含有嘌呤霉素的培养基，在高内涵下观察，直至筛选出稳定表达的细胞株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明的绿色荧光绿色蛋白质粒以慢病毒作为骨架，有利于获得稳定表达绿色荧光细胞的建立。
2、本发明的pLenti-puro载体使用CMV启动子，该启动子在哺乳动物细胞中广泛表达，可应用与不同种类哺乳动物细胞。
3、本发明的慢病毒绿色荧光蛋白载体含有嘌呤霉素抗性基因，可用嘌呤霉素筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞，且筛选周期短。
4、本发明构建的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株，可利用倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、高内涵筛选系统进行观察和检测，满足不同通量需求、兼容手动和自动化分析。
附图说明
图1为pLenti-puro载体结构图谱；
图2为pLenti-puro-GFP目的载体酶切电泳鉴定结果图；
图3为绿色荧光蛋白目的基因PCR产物电泳鉴定结果图；
图4为pLenti-puro载体质粒；
图5为绿色荧光蛋白目的基因酶切图谱；
图6为pLenti-puro-GFP目的载体电泳鉴定结果图；
图7为pLenti-puro-GFP目的载体测序结果部分峰图；
图8为高内涵筛选的荧光图。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种慢病毒质粒为骨架的绿色荧光蛋白表达载体，并通过病毒包装、感染喉癌细胞Hep-2及筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的方法。下面结合具体的实验过程和实验结果做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建，包括以下步骤：
首先提供质粒和主要试剂的来源或制备方法：
pLenti-puro载体和pEGFP-C1载体质粒为本实验保存。
DH5α感受态细胞购于北京全式金生物技术公司，Lipofectamine 3000转染试剂购自Thermo Fisher Scientific公司，限制性内切酶购自NEB公司，PCR酶购于北京全式金生物技术公司，连接酶solution I购自Takara公司。
LB液体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g，加1L ddH2O搅拌至完全溶解，高压灭菌。
LB固体培养基配方(1L)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g。加1L ddH2O搅拌至完全溶解，高压灭菌。
氨苄青霉素(100mg/mL):1g溶于10mL1L ddH2O，0.22μm滤器过滤除菌。
1、构建载体pLenti-puro-GFP
1)设计并合成以下引物SEQ.ID.NO.4：F：5’-CGCGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’；SEQ.ID.NO.5R：5’-CCGCTCGAGTTACACTGACAATTTCATCCCGAACGTC-3’，引物中下划线部分分别为BamHI和Xhol的酶切位点，以pEGFP-C1质粒为模板，使用该引物进行PCR反应获得含有目的基因绿色荧光蛋白的基因序列，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，PCR反应条件为：95℃，3-5min；95℃,30Sec,57℃,30Sec,72℃1min，25-30个循环；72℃，3min，核酸电泳，结果显示与目的片段大小相符，电泳结果如图3所示，胶回收绿色荧光蛋白产物；
2)使用BamHI和Xhol切割2ug的绿色荧光蛋白和1ug的pLenti-puro质粒，核酸电泳，结果如图4和5所示，胶回收酶切产物；
3)酶切后回收的绿色荧光蛋白与pLenti-puro质粒片段按照5：1的摩尔比用连接酶solutionI 4度过夜连接，获得连接产物；
4)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取；
5)提取的质粒进行电泳鉴定，结果见图6；电泳检测阳性的质粒进行DNA测序，验证序列方向和部分峰图，结果见SEQ.ID.NO.3和图7。
2、无内毒素小量提取pLenti-puro-GFP质粒
1)取测序验证正确的pLenti-puro-GFP菌液20微升，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的15mL LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；
2)无内毒素质粒小提试剂盒提取培养的菌液中的pLenti-puro-GFP质粒，测定浓度；
3、绿色荧光蛋白稳定株的筛选
1)将密度为90％的293T细胞按1:3比例传代到60mm培养皿中，转染时细胞密度在60-70％；
2)用lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体转染293T细胞，6h换成20％血清的培养基，转染48h后，收取病毒上清；
3)将密度为90％喉癌细胞Hep-2按1:3比例传代到60mm皿中，待细胞融合度达到60％时用病毒上清感染细胞，感染24h后换成含有嘌呤霉素的的培养基，在倒置荧光显微镜下观察，直至筛选出稳定表达的细胞株，结果如图8。
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
<120> 一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> 发光水母(Physalia physalis)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagataa 798
<210> 2
<211> 7067
<212> DNA
<213> 人工合成序列(human synthesis)
<400> 2
aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60
tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120
tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180
gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg 240
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 300
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 360
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 420
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcgata 1800
agcttgggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 1860
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 1920
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 1980
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 2040
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 2100
agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 2160
gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 2220
gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 2280
gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctcccta tcagtgatag 2340
agatctccct atcagtgata gagatcgtcg actagtggat ccagtgtggt ggaattctgc 2400
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgcggttcg aaggtaagcc 2460
tatccctaac cctctcctcg gtctcgattc tacgcgtacc ggtcatcatc accatcacca 2520
ttgagtttaa acctgctgat cagcctcgac tgtgccttct agtcgaccct gtggaatgtg 2580
tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 2640
catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 2700
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 2760
ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 2820
atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 2880
ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag cttaccatga ccgagtacaa gcccacggtg 2940
cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc 3000
gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag 3060
ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac 3120
gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc 3180
gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag 3240
atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc 3300
ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg 3360
gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc 3420
cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgagtgccc gaaggaccgc 3480
gcgacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaggta cctttaagac caatgactta 3540
caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat 3600
tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca 3660
gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 3720
cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 3780
atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct 3840
tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt 3900
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 3960
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 4020
ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 4080
gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 4140
tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agggacgtac 4200
ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 4260
gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 4320
ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 4380
tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 4440
cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 4500
cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 4560
tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 4620
gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 4680
cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 4740
attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 4800
tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt taggtggcac 4860
ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat 4920
gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag 4980
tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc 5040
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc 5100
acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc 5160
cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc 5220
ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt 5280
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt 5340
atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat 5400
cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct 5460
tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat 5520
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc 5580
ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg 5640
ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc 5700
tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta 5760
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc 5820
ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga 5880
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 5940
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 6000
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 6060
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 6120
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 6180
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 6240
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 6300
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 6360
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 6420
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 6480
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 6540
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 6600
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 6660
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 6720
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 6780
agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 6840
gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 6900
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 6960
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg 7020
cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagctt 7067
<210> 3
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工合成序列(human synthesis)
<400> 3
ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg 60
cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat 120
cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga 180
tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg 240
tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg 300
gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc 360
gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat 420
caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa 480
ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg 540
cttcagtgac aacgtcgagc 560
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成序列(human synthesis)
<400> 4
cgcggatccg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctg 39
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列(human synthesis)
<400> 5
ccgctcgagt tacactgaca atttcatccc gaacgtc 37

Claims (7)

1.一种稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)根据绿色荧光蛋白基因的序列信息，设计并合成引物，以pEGFP-C1载体质粒为模板，PCR扩增获得绿色荧光蛋白的基因序列；
(2)用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列和pLenti-puro载体，将酶切产物连接，获得pLenti-puro-GFP质粒；
(3)无内毒素提取pLenti-puro-GFP质粒，用BamHI和XhoI酶切pLenti-puro-GFP质粒，琼脂糖凝胶电泳检测序列大小，同时将pLenti-puro-GFP质粒送测序检测序列准确性；
(4)用pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，收集病毒上清，将病毒上清感染Hep-2细胞，感染24h后加入含有嘌呤霉素的培养基，筛选细胞，并在倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。
2.根据权利要求1所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株构建方法，其特征是步骤(1)所述的绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ.ID.NO.1；pLenti-puro载体基因序列如SEQ.ID.NO.2；载体pLenti-puro-GFP的基因部分测序结果序列如SEQ.ID.NO.3。
3.根据权利要求1所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(1)所述的引物为SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。
4.根据权利要求1所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(1)中PCR扩增的反应条件为：95℃，3-5min；95℃,30Sec；57℃,30Sec；72℃1min；25-30个循环。
5.根据权利要求书所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(2)中用BamHI和XhoI酶切绿色荧光蛋白的基因序列后回收的产物与和pLenti-puro载体质粒按照5：1的摩尔比用连接酶solution I在4℃过夜连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，获得目的载体pLenti-puro-GFP质粒。
6.根据权利要求书所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(3)中无内毒素提取验证载体pLenti-puro-GFP质粒的具体方法为：
(31)取测序验证正确的pLenti-puro-GFP菌液20微升，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的15mL LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；
(32)无内毒素质粒小提试剂盒提取培养的菌液中的pLenti-puro-GFP质粒，测定浓度。
7.根据权利要求书所述的稳定表达绿色荧光蛋白的喉癌细胞株的构建方法，其特征是步骤(4)中筛选细胞的具体方法为：
(41)将1个60mm细胞培养皿中汇合度90％的293T细胞传代到3个60mm细胞培养皿中，待细胞汇合度达到60-70％时进行转染；
(42)用lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-puro-GFP质粒及慢病毒包装载体共转染293T细胞，转染6小时后换成20％血清的培养基，转染48h后，收集pLenti-puro-GFP病毒上清；
(43)将60mm细胞培养皿中汇合度90％的喉癌细胞Hep-2传代到3个60mm细胞培养皿中，待细胞汇合度达到60％时用pLenti-puro-GFP病毒上清感染细胞，感染24h后换成含有嘌呤霉素的细胞培养液，在倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，直至筛选出稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。
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