CN109680006A - 一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法 - Google Patents

一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法 Download PDF

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赵帅
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Abstract

本发明公开了一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法。在pLenti‑CMV‑Gag‑Mcherry‑Puro载体的Not I和BamH I多克隆位点处插入cytochrome C基因，用构建好的pLenti‑CMV‑cytochrome C‑Emcherry‑Puro重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，培养、出毒、收取病毒上清、过滤得重组慢病毒液。将包装好的重组慢病毒感染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选及鉴定，得稳定表达cytochrome C蛋白细胞株。本发明利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达cytochrome C蛋白的细胞株，该细胞株为研究cytochrome C蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

Description

一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法
技术领域
本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法。
背景技术
cytochrome C是由核基因编码，位于线粒体内外膜之间，是进化上最保守的蛋白质之一，在外界凋亡刺激因素的作用下，线粒体膜通透性改变，释放cytochrome C等进入细胞浆，在dATP存在时能够与凋亡相关因子-1(Apaf-1)相结合，从而形成多聚体，并促使pro-caspase-9与其结合形成凋亡复合体，激活Caspase-9，进而通过级联反应激活下游的Caspase-3，导致细胞凋亡。可见，cytochrome C从线粒体释放到细胞浆是触发细胞凋亡信号通路的关键步骤，而细胞凋亡的紊乱又是肿瘤发生和发展的关键过程，因此，通过导入cytochrome C诱导细胞凋亡可能是肿瘤治疗的途径之一，但是外源性cytochrome C能否诱导细胞凋亡有待验证。
研究表明，从健康的非凋亡的细胞中纯化的细胞色素C在无细胞体系中可以引起Caspase的活化促进细胞凋亡，细胞色素缺陷型的小鼠在胚胎期就会死亡，经cytochrome C显微注射后的细胞可出现特异性的凋亡特征，cytochrome C激活的无细胞体系可诱导哺乳动物细胞发生凋亡等。紫外线诱导草地贪夜蛾Sf-9细胞凋亡时，同样出现了cytochrome C自线粒体释放至细胞质中及Caspase的活化等现象，可见，cytochrome C参与了哺乳动物及昆虫细胞的凋亡，且外源性cytochrome C能诱导细胞凋亡。基于细胞凋亡是肿瘤遗传学和肿瘤治疗生物学之间的纽带，通过基因和蛋白控制细胞凋亡可能是潜在的药物靶点。因此，cytochrome C蛋白在肿瘤治疗中将具有极大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达cytochrome C蛋白的细胞株，该细胞株为研究cytochrome C蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。
为实现上述目的，本发明提供一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：
(1)cytochrome C基因的扩增；
(2)将cytochrome C基因与载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro；
(3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；
(4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达cytochrome C蛋白细胞株。
上述构建方法中，所述的步骤1)，以cytochrome C-F和cytochrome C-R为特异性引物，添加酶切位点Not I和BamH I，以质粒pEmcherry-N1-cytochrome C为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物cytochrome C-F的序列详见序列表SEQ ID 1，cytochrome C-R的序列详见序列表SEQ ID 2。
上述构建方法中，PCR扩增体系为：
PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
上述构建方法中，步骤(3)中，所述的病毒包装质粒是psPAX2和pVSV-G。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明以重组慢病毒为载体，将其感染293T人胚肾细胞，筛选获得能稳定表达cytochrome C蛋白的细胞株，所述cytochrome C蛋白融合表达mcherry标签，方便cytochrome C蛋白表达的检测。
2.本发明建立了能稳定表达cytochrome C蛋白的293T细胞株，该细胞株为进一步深入研究cytochrome C蛋白的生物学特性及为研发抗肿瘤药物奠定了坚实基础。
3.本发明构建一种带有标签的过表达cytochrome C蛋白的细胞株，为cytochromeC蛋白生物学特性及功能的研究提供一个良好的工具。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，具体如下：
实施例
(一)cytochrome C基因扩增
1、cytochrome C基因PCR扩增根据NCBI中cytochrome C基因序列(Gene ID:54205)，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)设计cytochrome C基因的特异性引物cytochrome C-F和cytochrome C-R，添加酶切位点NotI和BamH I，引入的酶切位点NotI序列(限制性内切酶NotI酶切识别位点序列)详见序列表SEQ ID 5，引入的酶切位点BamH I序列(限制性内切酶BamH I酶切识别位点序列)详见序列表SEQ ID 6，所述的特异性引物cytochrome C-F的序列(扩增人(Homosapiens)细胞色素C(Cytochrome C)基因的特异性引物1序列)详见序列表SEQ ID 1，cytochrome C-R的序列(扩增人(Homosapiens)细胞色素C(Cytochrome C)基因的特异性引物2序列)详见序列表SEQ ID 2。
以pEmcherry-N1-cytochrome C质粒为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：
PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
2、DNA琼脂糖凝胶电泳
配置1％的琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解；将洗净、干燥的制胶板水平放置在工作台上；混匀，灌胶，插入梳子，避免产生气泡；待凝胶凝固后，小心拔去梳子；将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液；将PCR产物上样，经100V电泳40min。
3、PCR产物凝胶回收
按照康为世纪公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收。
(二)构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro
1、pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro载体酶切
将pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro载体用NotI和BamH I酶切，酶切体系于37℃水浴过夜，电泳，将正确的目的条带进行凝胶回收。酶切体系如下：(ddH2O:11ul；NotI:1.5ul；BamH I:1.5ul；DNA:1ul(1ug/ul)；Enzyme Buffer:5ul；总体系：20ul，温度37℃，反应时间：30min)
2、cytochrome C基因与pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro载体连接
将(一)中凝胶回收后的cytochrome C基因与酶切后的载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro，在16℃反应24h，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro。
3、质粒转化感受态大肠杆菌E.coli DH 5α
取E.coli DH 5α感受态细胞于冰上放置10min溶解；取5ul构建好的重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro加入50ul感受态细胞，混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热休克大肠杆菌45s，移入冰中，静置2min；加入500ul已37℃预热无抗生素的SOC培养液，于37℃恒温箱摇床培养1h(300rpm)。取120ul感受态细胞涂于含Ampicillin(100μg/mL)的LB琼脂平板上，于37℃的培养箱中培养，12h后检查培养皿中是否出现菌落。挑选琼脂平板上的单菌落接种到8mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃摇床培养12h(1500rpm)。
4、pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro重组菌株的质粒提取
对测序正确的重组菌株进行质粒小提与大提，得到pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro重组慢病毒表达质粒。用NanoDrop测定OD 260及OD 280，计算质粒纯度及浓度。
(三)重组慢病毒CMV-mcherry-LVP的获得
1、重组慢病毒的包装
将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro和病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞(转染pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro空病毒载体作为对照)。转染前24h，用胰蛋白酶消化处于对数生长期的293T细胞，调整细胞密度为5×105细胞，用10mL含10％FBS的DMEM培养基重新接种于10cm细胞培养皿，置于5％CO2培养箱内培养(37℃)，待细胞密度达90％时转染质粒。
转染前2h将细胞培养液更换为无血清的DMEM培养基。取无菌离心管(2mL)，向其中加入pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro载体8μg，以及病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G各8μg，与1.5mL的无血清DMEM培养基混合均匀。取48ul Lipofectamine 2000试剂在另一管中与1mLDMEM混合。将上述两种溶液进行混合，室温下静置20min，形成转染复合物。将混合液转移至293T细胞的培养液中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。24h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基10mL，于5％CO2培养箱内(37℃)继续培养。24h后更换含10％FBS的DMEM培养基继续培养。
2、重组慢病毒的收集及浓缩
转染48h后，收集培养液到无菌离心管中(50mL)，于4℃离心，4500×g，10min。取上清，4℃超速离心，72000×g，3h，去除上清，加入500ul完全培养液，用1000ul枪头缓慢充分重悬后，将病毒浓缩液分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存，获得重组慢病毒CMV-mcherry-LVP。
3、重组慢病毒的滴度测定
胰酶消化293T细胞，接种于96孔板中(3×104个/孔)，24h后在EP管中做10倍梯度稀释：准备8个2.0mLEP管，每管加入297μl含10％FBS的L-15培养液，向第一个管中加入33μl病毒原液，混匀后，吸取30μl加入第二个管混匀。依此类推，做8个稀释度。每个稀释度设置3个重复孔，每孔加入稀释好的病毒液100μl并做好标记。第四天用倒置荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内荧光细胞数，计算3个重复孔内细胞的平均数。
(四)稳定转染细胞株的筛选
1、稳定转染细胞株筛选
胰酶消化293T细胞，接种于24孔细胞培养板中，3×104个/孔。每孔500μl。24h后感染病毒，病毒液滴度3×107TU/mL，病毒量15μl。每孔加10μl聚凝胺(1mg/mL)，感染24小时后换培养基：弃去旧培养基，每孔加入1mL新鲜的培养基。在感染细胞72小时后，通过加入并维持2ug/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞；每隔2-3天换一次新鲜培养基(聚凝胺终浓度2ug/mL)；倒置荧光显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常生长细胞群传代，逐步放大培养；从而在嘌呤霉素的维持下筛选阳性细胞株。
3、阳性细胞株的检测
用荧光显微镜对阳性细胞进行免疫荧光鉴定。最后获得稳定转染cytochrome C基因的293T细胞株。
重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro的测序序列(携带人(Homo sapiens)细胞色素C(Cytochrome C)基因的重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro序列)详见序列表SEQ ID 3，测序序列的目的基因片段的序列(人(Homosapiens)细胞色素C(Cytochrome C)基因序)详见序列表SEQ ID4。
序列表
<110> 贵州大学
<120> 一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
ataagaatgc ggccgcgcca ccatgggtga tgttgagaaa ggcaag 46
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
cgggatcctt actcattagt agcttttttg aga 33
<210> 3
<211> 1007
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
ttttcatcat tttcatgtgt cgtgagcatg cgatgactga tcatgaccct cgaggtcgac 60
ggtatcgata agctcgcttc acgagattcc agcaggtcga gggacctaat aacttcgtat 120
agcatacatt atacgaagtt atattaaggg ttccaagctt aagcggccgc gccaccatgg 180
gtgatgttga gaaaggcaag aagattttta ttatgaagtg ttcccagtgc cacaccgttg 240
aaaagggagg caagcacaag actgggccaa atctccatgg tctctttggg cggaagacag 300
gtcaggcccc tggatactct tacacagccg ccaataagaa caaaggcatc atctggggag 360
aggatacact gatggagtat ttggagaatc ccaagaagta catccctgga acaaaaatga 420
tctttgtcgg cattaagaag aaggaagaaa gggcagactt aatagcttat ctcaaaaaag 480
ctactaatga gtaaggatcc atatatttcg accatagcca attcaatatg gcgtatatgg 540
actcatgcca attcaatatg gtggatctgg acctgtgcca attcaatatg gcgtatatgg 600
actcgtgcca attcaatatg gtggatctgg accccagcca attcaatatg gcggacttgg 660
gcaccatgcc aatttcaata tggcggacct ggcacggagg caactgcgga gtgagtctac 720
tccacaagga agcgctcgct agaaagatta aattaaaaca caaagtcaac cgaacaaagt 780
ctgactttta tctatcgcga gcacatgtcc catgaaatga gtgcatcgtc tcgaagtgac 840
gttgtgctac aagacaatta tcgcttatag ttaaagctaa agaagagaaa tataccaagt 900
gggattacag tcaccagcac aggatatcgc aaattaagta tgtgtcgctg tgattgttga 960
aagctggata cacagtctag ctctagtctg aagtctgaaa gatcaaa 1007
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
gccaccatgg gtgatgttga gaaaggcaag aagattttta ttatgaagtg ttcccagtgc 60
cacaccgttg aaaagggagg caagcacaag actgggccaa atctccatgg tctctttggg 120
cggaagacag gtcaggcccc tggatactct tacacagccg ccaataagaa caaaggcatc 180
atctggggag aggatacact gatggagtat ttggagaatc ccaagaagta catccctgga 240
acaaaaatga tctttgtcgg cattaagaag aaggaagaaa gggcagactt aatagcttat 300
ctcaaaaaag ctactaatga gtaa 324
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
gcggccgc 8
<210> 6
<211> 6
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
ggatcc 6
说明书核苷酸和氨基酸序列表
1

Claims (4)

1.一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)cytochrome C基因的扩增；
(2)将cytochrome C基因与载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro；
(3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-cytochrome C-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；
(4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达cytochrome C蛋白细胞株。
2.根据权利要求1所述一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：所述的步骤1)，以cytochrome C-F和cytochrome C-R为特异性引物，添加酶切位点NotI和BamH I，以质粒pEmcherry-N1-cytochrome C为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物cytochrome C-F的序列见序列表SEQ ID 1，cytochrome C-R的序列见序列表SEQ ID 2。
3.根据权利要求1所述一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，其特征在于，PCR扩增体系为：PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
4.根据权利要求1所述一种稳定表达cytochrome C蛋白细胞株的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的病毒包装质粒是psPAX2和pVSV-G。
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