CN106520779A - 一种通过密码子优化鸡il‑2基因提高鸡的il‑2蛋白表达效率的方法 - Google Patents

一种通过密码子优化鸡il‑2基因提高鸡的il‑2蛋白表达效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通过密码子优化鸡IL‑2基因提高鸡的IL‑2蛋白表达效率的方法，将鸡的IL‑2基因根据鸡的密码子的偏嗜性进行优化，得到的优化后的基因optiCKIL‑2；将优化基因optiCKIL‑2连接至真核表达载体pCAGGS构建重组质粒pCAGGoptiCKIL‑2。所述通过密码子优化鸡IL‑2基因提高鸡的IL‑2蛋白表达效率的方法，根据鸡的密码子偏嗜性进行优化后，提高鸡IL‑2的蛋白表达效率，为鸡IL‑2构建DNA疫苗或作为佐剂奠定基础。

Description

一种通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率 的方法
技术领域
本发明涉及鸡白介素2技术领域，具体地，涉及一种通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法。
背景技术
IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(T cellgrowth factor，TCRF)。IL-2是在促有丝分裂素或特异抗原刺激下，由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的在机体免疫调节作用的一种细胞因子。IL-2的主要生物学功能包括活化T细胞，促进细胞因子产生；促进NK细胞的增殖，并维持其长期生长；促使B胞增殖和产生免疫球蛋白，刺激并提高巨噬细胞的吞噬能力；促进Th0和CTL的增殖等。IL-2是调控机体免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。
Schauenstein等在1982年首次发现鸡脾淋巴细胞能分泌具有类似哺乳动物IL-2活性的细胞因子，Sundick等在1997年成功获得了鸡的IL-2基因，但在随后的研究中发现，与哺乳动物的IL-2相比，鸡的IL-2具有很强的种属特异性和差异性，因此许多在哺乳动物IL-2研究中应用成熟的技术方法都无法应用于鸡IL-2的研究。自从DNA疫苗被世界各地科研人员广泛关注以来，已经有研制成功的DNA疫苗进入临床试验阶段，因此通过将鸡的IL-2基因作为抗原目的基因构建DNA疫苗来高效表达鸡的IL-2蛋白是研究鸡IL-2的一种可行方法。目前DNA疫苗应用的关键问题是如何增强其免疫效果，提高诱导机体免疫应答效率。将鸡的IL-2作为佐剂以及免疫增强剂在构建新型基因工程疫苗方面呈现出一定的应用前景。
在抗原蛋白基因的角度来讲，提高DNA疫苗免疫原性的最首要的方法是密码子优化。有研究表明，DNA疫苗质粒携带的外源目的基因蛋白的高效表达与宿主细胞信号肽以及目的基因密码子和宿主密码子偏好性是否匹配等密切相关。不同物种在表达蛋白时对密码子的偏嗜性不同，不同动物细胞在表达外源基因过程中使用氨基酸密码子的频率与病毒蛋白之间存在一定的差异，将目的基因对宿主物种进行密码子优化，尽量多采用宿主偏爱的密码子，提高外源基因在宿主细胞内的密码子适用指数(CAI)和最优密码子使用频率(FOP)，尽量避免使用稀有密码子可以显著提高外源基因的表达水平。因为基因的鸟嘌呤G和胞嘧啶C的含量的理想区间为30％-70％，所以优化基因碱基中GC的含有率，可增强外源基因的稳定性和提高表达水平。大量的研究表明，将DNA疫苗的目的基因按照被免疫目标物种的密码子使用偏好进行优化后，可以显著提高目的基因在该宿主细胞内的蛋白表达水平。与未优化的原基因相比，密码子优化后的基因的蛋白表达量可以提高约5-20倍。
发明内容
本发明提供了一种通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，根据鸡的密码子偏嗜性进行优化后，提高鸡IL-2的蛋白表达效率，为鸡IL-2构建DNA疫苗或作为佐剂奠定基础。
本发明的技术方案如下：一种通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，将鸡的IL-2基因根据鸡的密码子的偏嗜性进行优化，得到的优化后的基因optiCKIL-2；将优化基因optiCKIL-2连接至真核表达载体pCAGGS构建重组质粒pCAGGoptiCKIL-2。
所述基因optiCKIL-2序列如optiCKIL-2seq所示。
与IL-2基因相比，所述基因optiCKIL-2基因密码子适用指数(CAI)为0.99，最优密码子使用频率为95％，基因中GC含量为57％，优化前后两个基因的氨基酸同源性为100％。
所述真核表达载体为限制性内切酶EcoRI和NheI同时酶切质粒pCAGGS得到的载体片段。
一种构建鸡白介素2高效表达质粒的方法，包括如下步骤:
S1)克隆IL-2基因，利用密码子优化软件OPTIMWIZ，根据鸡的密码子偏嗜性优化CKIL-2基因得到优化后基因optiCKIL-2，其序列如optiCKIL-2seq所示
S2)将基因optiCKIL-2克隆至载体pUC57-Amp，构建质粒pUCoptiCKIL-2；
S3)用限制性内切酶EcoRI和NheI处理质粒pUCoptiCKIL-2，切下含有基因optiCKIL-2的目的条带，回收目的片段；同时用限制性内切酶EcoRI和NheI双酶切处理真核表达质粒pCAGGS；
S4)连接S3)回收的目的片段optiCKIL-2与酶切处理后的质粒pCAGGS，构建重组pCAGGoptiCKIL-2。
一种鸡白介素2高效表达质粒，其特征在于，由真核表达质粒pCAGGS和鸡的IL-2基因根据鸡的密码子的偏嗜性进行优化，得到的优化后的基因optiCKIL-2；所述基因optiCKIL-2序列如optiCKIL-2seq所示。
本发明的有益效果为：所述通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，根据鸡的密码子偏嗜性进行优化后，提高鸡IL-2的蛋白表达效率，为鸡IL-2构建DNA疫苗或作为佐剂奠定基础。
附图说明：
图1为CKIL-2基因的优化前后的密码子使用频率CAI对比结果。
图2为CKIL-2基因的优化前后最优密码子使用频率(FOP)对比结果。
图3为CKIL-2基因的优化前后GC含量对比结果。
图4为质粒pUCCKIL-2酶切分析，其中M：DL5000；1：pUCCKIL-2/EcoRI；2：pUCCKIL-2/NheI；3：pUCCKIL-2；4：pUCCKIL-2/EcoRI/NheI。
图5为质粒pUCoptiCKIL-2酶切分析，其中M：DL5000；1：pUCoptiCKIL-2；2、3、4：pUCoptiCKIL-2/EcoRI/NheI。
图6质粒pCAGGCKIL-2酶切分析，其中M：DL5000；1：pCAGGCKIL-2；2：pCAGGCKIL-2/EcoRI/NheI 3：pCAGGCKIL-2/NheI；4：pCAGGCKIL-2/EcoRI。
图7质粒pCAGGoptiCKIL-2酶切分析，其中M:DL5000；1:pCAGGoptiCKIL-2/EoRI；2:pCAGGoptiCKIL-2/NheI；3：pCAGGoptiCKIL-2/EcoRI/NheI；4:pCAGGoptiCKIL-2/EcoRI/NheI；5:pCAGGoptiCKIL-2。
图8质粒在293T细胞中蛋白表达产物Western-blot结果，其中1.转染质粒pCAGGCKIL-2的293T细胞；2.未转染质粒的293T细胞；3.蛋白Marker；4.转染质粒pCAGGoptiCKIL-2的293T细胞。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的，技术方案及技术效果更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。应理解，此处所描述的具体实施例及相关附图，仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
1.1质粒和菌株
真核表达质粒pCAGGS和工程菌DH5α均由华南农业大学人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。
1.2方法
1.2.1基因的获取及密码子优化
根据NCBI(National Center for Biotechnology)序列数据库公布的鸡的IL-2基因组序列(AY510091.1)，合成鸡的IL-2基因称为CKIL-2。利用密码子优化软件OPTIMWIZ，根据鸡的密码子偏嗜性优化CKIL-2基因得到优化后基因optiCKIL-2。参照图1，图2，和图3，密码子优化后optiCKIL-2基因密码子适用指数(CAI)从原来的0.78变为现在的0.99，最优密码子使用频率从原来的40％变为后来的95％，基因中GC含量由原来优化前的37％变为优化后的57％，优化前后两个基因的氨基酸同源性为100％，序列对比如下表1，下划线表示优化的序列。
表1优化前后CKIL-2与optiCKIL-2核苷酸对比表
optiCKIL-2seq 1 ATGATGTGCAAGGTGCTGATCTTCGGCTGCATCTCCGTGGCCATGCTGATGACCACCGCT
CKIL-2seq 1 ATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGTAGCAATGCTAATGACTACAGCT
optiCKIL-2seq 61 TACGGCGCCAGCCTGTCCAGCGAGAAGTGGAAGACCCTGCAGACCCTGATCAAGGACCTG
CKIL-2seq 61 TATGGAGCATCTCTATCATCAGAAAAATGGAAAACTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTA
optiCKIL-2seq 121 GAGATTCTGGAGAACATCAAGAACAAGATCCACCTGGAGCTGTATACCCCCACCGAGACC
CKIL-2seq 121 GAAATATTGGAAAATATCAAGAATAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACC
optiCKIL-2seq 181 CAGGAGTGCACACAGCAGACCCTGCAGTGCTACCTGGGCGAGGTGGTGACCCTGAAGAAG
CKIL-2seq 181 CAGGAGTGCACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGAAA
optiCKIL-2seq 241 GAGACAGAGGACGACACCGAGATCAAGGAGGAGTTCGTGACCGCCATCCAGAACATCGAG
CKIL-2seql 241 GAAACTGAAGATGACACTGAAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATTCAAAATATCGAA
optiCKIL-2seq 301 AAGAACCTGAAGAGCCTGACCGGCCTGAACCACACCGGCAGCGAATGCAAGATCTGCGAG
CKIL-2seq 301 AAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAAATCACACCGGAAGTGAATGCAAGATCTGTGAA
optiCKIL-2seq 361 GCCAACAACAAGAAGAAGTTCCCCGACTTCCTGCACGAGCTGACCAACTTCGTGAGGTAC
CKIL-2seql 361 GCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATTTTCTCCATGAACTGACCAACTTTGTGAGATAT
optiCKIL-2seq421 CTGCAGAAGTGA
CKIL-2seq 421 CTGCAAAAATAA
1.2.2表达质粒的构建和鉴定
将CKIL-2基因和优化后基因optiCKIL-2分别克隆至载体pUC57-Amp，构建质粒质粒pUCCKIL-2和pUCoptiCKIL-2。
目的片段回收分别用限制性内切酶EcoRI和NheI处理质粒pUCCKIL-2和pUCoptiCKIL-2。酶切反应体系如下表2：
表2：酶切反应体系
将酶切产物进行琼脂凝胶电泳，如图4和图5所示，双酶切获得了500bp左右的条带。
切下含有基因CKIL-2和optiCKIL-2的目的条带凝胶后，按照天根通用型DNA纯化回收试剂盒说明书进行胶回收，并进行测序，测序结果与CKIL-2和optiCKIL-2一致，无位点突变。
同时用限制性内切酶EcoRI和NheI双酶切处理真核表达质粒pCAGGS。
2.回收产物的连接和转化分别将回收的基因CKIL-2和optiCKIL-2片段与处理后的质粒pCAGGS连接，构建重组质粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2。连接体系如下表3：
表3连接体系
将上述混合物混匀，16℃连接过夜。将获得的连接产物10μL加到100mL感受态细胞DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热冲击1.5min后，迅速冰浴2～3min。加500μL不含抗菌素的LB液体培养基，置于摇床中，37℃，150r/min摇动1h。取上述菌液涂布于含氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)的LB固体选择培养基平板上，待菌液完全吸收后放入温箱，37℃倒置培养12h～16h。
3.阳性菌落的筛选和鉴定。从每个培养基平板中随即挑取8个单菌落接种于1000μL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，用天根质粒小提试剂盒抽提质粒，通过琼脂糖凝胶电泳确定出3个疑似阳性克隆质粒，进行双酶切鉴定及测序鉴定。如图6和图7所上市，重组质粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2双酶切得到了500bp左右的条带，测序结果序列一致，无突变位点，说明重组质粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2构建成功。
1.2.3表达质粒在293T细胞中的表达
质粒DNA的制备将获得的阳性克隆转化DH5α大肠杆菌，扩大培养。使用去内毒素质粒抽提试剂盒(MN公司产品)抽提质粒，步骤如下：将100mL菌液，以10000r/min离心10min，弃菌液上清；加8mL的RES-EF于上述离心管中，充分重悬菌体；向上述离心管中加8mL的LYS-EF，上下颠倒5次，室温放置2min；加8mL的NEU-EF于上述混合液中，上下颠倒10-15次，然后冰上放置5min；润洗柱子，从柱子边缘加15mL的EQU-EF，待柱中的液体过滤完后，将上述混合液加入柱中；待柱中液体过滤完后，从柱子边缘加5mL的FIL-EF；待柱中液体过滤完后，弃滤膜，加35mL的ENDO-EF到柱中；待柱中液体过滤完后，加15mL的WASH-EF于柱中；将柱子放在15mL离心管上，加5mL的ELU-EF，待柱中液体全部过滤到管中；向上述管中加3.5mL(0.7倍体积)的异丙醇；12000r/min，离心30min；弃上清液，加入2mL 70％乙醇，12000r/min，离心5min；弃上清液，尽量吸干离心管底部液体，开盖放置5min；向管中加200μL H2O-EF，用枪头吹打底部白色沉淀，使其充分溶解；用分光光度仪测提取质粒的浓度。
细胞转染转染前24h，将293T细胞均匀铺于6孔细胞培养板，细胞汇合度达到70％左右进行转染；转染时用500μL Opti-MEM稀释4μg质粒，吹打混匀；向质粒稀释液中加入10μL的Lipofectamine2000，并轻轻震荡混匀；室温下孵育20min；将6孔细胞板中的培养液吸出并使用Opti-MEM或PBS洗2-3次，并加400μL Opti-MEM培养液；将静置了20min的混合液加入到6孔板中，轻轻晃动细胞板使均匀分布；将细胞板置于CO2浓度为5％的37℃培养箱中培养24-48h，检测表达情况。
Western blot检测目的蛋白的表达将在6孔板表达的外源蛋白的293T细胞，用PBS清洗3次后，每孔加入100uL蛋白酶抑制剂PMSF和裂解液RIPA的混合液，反复吹打，并收集至1.5mL离心管中；5000r/min 4℃离心5min，取上清与5×SDS混合，沸水中煮10min，-20℃保存备用。
在进行SDS-PAGE凝胶电泳时，将样品加入孔中。先恒压80V电泳，当样品进入下层胶后改为恒压120V电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止。电泳完毕后，根据目的蛋白大小切胶，测量胶片大小，将切好的胶置于转胶缓冲液中室温平衡5min；裁剪硝酸纤维素膜和滤纸，并置于转膜缓冲液中平衡15min，同时浸泡滤纸；用湿电转膜仪进行转膜。
完成转膜后，取下硝酸纤维素膜，用TBST漂洗3次，每次5min，漂洗后将硝酸纤维素膜放入BSA封闭液中，室温封闭2h，或者4℃冰箱过夜；再取出硝酸纤维素膜用TBST漂洗3次，每次5min；放入一抗稀释液中室温低速孵育2h；回收一抗，用TBST将硝酸纤维素膜漂洗3次，每次5min；然后将硝酸纤维素膜放入二抗的稀释液中，避光室温孵育1h，孵育后用TBST将硝酸纤维素膜漂洗3次，每次10min。用扫膜仪进行扫膜，分析处理图片后保存。
参照图8，Western blot结果显示，未转染质粒及转染空白质粒pCAGGS的293T细胞均无特异性条带，而转染质粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2的293T细胞均产生约19KDa大小的特异性条带，说明质粒pCAGGCKIL-2和pCAGGoptiCKIL-2均能在体外表达鸡IL-2特异性蛋白，且重组质粒pCAGGoptiCKIL-2表达蛋白的效率明显高于质粒pCAGGCKIL-2。说明，将鸡的IL-2基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化后，可以提高鸡IL-2的蛋白表达效率，为鸡IL-2构建DNA疫苗或作为佐剂奠定基础。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (6)

1.一种通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，其特征在于，将鸡的IL-2基因根据鸡的密码子的偏嗜性进行优化，得到的优化后的基因optiCKIL-2；将优化基因optiCKIL-2连接至真核表达载体pCAGGS构建重组质粒pCAGGoptiCKIL-2。
2.如权利要求1所述的通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述基因optiCKIL-2序列如optiCKIL-2seq所示。
3.如权利要求2所述的通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，其特征在于，与IL-2基因相比，所述基因optiCKIL-2基因密码子适用指数（CAI）从原来的0.78变为现在的0.99，最优密码子使用频率从原来的40%变为后来的95%，基因中GC含量由原来优化前的37%变为优化后的57%。
4.如权利要求1-3任一项所述的通过密码子优化鸡IL-2基因提高鸡的IL-2蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述真核表达载体为限制性内切酶EcoRI和NheI同时酶切质粒pCAGGS得到的载体片段。
5.一种构建鸡白介素2高效表达质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤:
S1)克隆IL-2基因，利用密码子优化软件OPTIMWIZ，根据鸡的密码子偏嗜性优化CKIL-2基因得到优化后基因optiCKIL-2，其序列如optiCKIL-2seq所示
S2）将基因optiCKIL-2克隆至载体pUC57-Amp，构建质粒pUCoptiCKIL-2；
S3）用限制性内切酶EcoRI和NheI处理质粒pUCoptiCKIL-2，切下含有基因optiCKIL-2的目的条带，回收目的片段；同时用限制性内切酶EcoRI和NheI双酶切处理真核表达质粒pCAGGS；
S4）连接S3）回收的目的片段optiCKIL-2与酶切处理后的质粒pCAGGS，构建重组pCAGGoptiCKIL-2。
6.一种鸡白介素2高效表达质粒，其特征在于，由真核表达质粒pCAGGS和鸡的IL-2基因根据鸡的密码子的偏嗜性进行优化，得到的优化后的基因optiCKIL-2；所述基因optiCKIL-2序列如optiCKIL-2seq所示。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663523A (zh) * 2017-09-30 2018-02-06 华南农业大学 一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法与应用
CN108681658A (zh) * 2018-05-22 2018-10-19 贵州医科大学 一种优化外源基因在大肠杆菌中翻译速度的算法
CN113264993A (zh) * 2021-04-08 2021-08-17 华南农业大学 一种家禽用rig i免疫增强剂及其制备方法
CN113308477A (zh) * 2021-04-08 2021-08-27 华南农业大学 一种鸭il-2基因真核表达重组质粒及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104245719A (zh) * 2011-12-12 2014-12-24 宾夕法尼亚大学托管会 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法
CN106039303A (zh) * 2016-06-20 2016-10-26 华南农业大学 一种h5亚型禽流感dna疫苗及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104245719A (zh) * 2011-12-12 2014-12-24 宾夕法尼亚大学托管会 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法
CN106039303A (zh) * 2016-06-20 2016-10-26 华南农业大学 一种h5亚型禽流感dna疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
中国科学技术协会编: "《中国科学技术专家传略农学编综合卷二》", 31 December 1999, 中国农业出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107663523A (zh) * 2017-09-30 2018-02-06 华南农业大学 一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法与应用
CN108681658A (zh) * 2018-05-22 2018-10-19 贵州医科大学 一种优化外源基因在大肠杆菌中翻译速度的算法
CN113264993A (zh) * 2021-04-08 2021-08-17 华南农业大学 一种家禽用rig i免疫增强剂及其制备方法
CN113308477A (zh) * 2021-04-08 2021-08-27 华南农业大学 一种鸭il-2基因真核表达重组质粒及其制备方法

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