CN113308477A - 一种鸭il-2基因真核表达重组质粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种优化的鸭IL‑2基因真核表达重组质粒及其制备方法。本发明首先根据鸭密码子偏嗜性将鸭IL‑2基因进行优化，所得优化的鸭IL‑2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，再将优化的鸭IL‑2基因连接到真核表达载体pCAGGK，得到了鸭IL‑2基因真核表达重组质粒。本发明获得的真核表达重组质粒在细胞内能成功表达鸭IL‑2蛋白，真核表达重组质粒可作为免疫增强剂和免疫佐剂使用，增强鸭类体内细胞和体液免疫反应，具有很好的应用前景。

Description

一种鸭IL-2基因真核表达重组质粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域。更具体地，涉及一种优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒及其制备方法。
背景技术
IL-2在多种免疫细胞中起作用，对Th1细胞有重要分化作用，能增强自然杀伤细胞(NKcell)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能，并且诱导其它细胞因子的产生，如T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞，具有广泛的上调作用。因此，可构建IL-2和其他保护性抗原基因通过共表达提高DNA类制品的免疫效果.
IL-2还能显著地增强IFN-γ和TNF的生成、增强NK细胞的功能、刺激B细胞增殖和诱导B细胞分泌免疫球蛋白。另外IL-2产生的CTL在体内具有显著的抗肿瘤作用，可以诱导和促进淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL细胞)，而NK细胞、CTL细胞、LAK细胞和TIL细胞等在机体的免疫监视及肿瘤免疫方面作用至关重要。IL-2是与T淋巴细胞从细胞周期G1期到S期生长有关的主要细胞因子，其主要的生物活性是诱导CD4+T细胞的产生，并使致敏的CD4+T细胞活性增强，维持其持续克隆增长和在体外的长期生长，从而增强机体的免疫功能。
医学和兽医学的研究证明，IL-2的免疫增强作用主要有以下几方面：活化T细胞；促进B细胞的分化和分泌抗体；活化NK、CTL和LAK细胞；促进其它细胞因子的释放，如IFN-α、IFN-β等；增强淋巴细胞和内皮细胞表面粘附分子的表达；促进淋巴细胞及其它活化细胞的粘附及移动能力；增加抗原提呈细胞表面MHC I和II类分子的量，增强抗原提呈作用。
IL-2已被广泛地应用于免疫佐剂和免疫增强剂的研究。Li J等将鸡IL-2作为佐剂和传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)多聚蛋白基因(VP2、VP4、VP3)DNA疫苗联合免疫SPF鸡然后攻毒，结果表明鸡IL-2质粒能明显增强DNA疫苗对病毒攻击的保护。
发明内容
本发明提供一种根据鸭密码子偏嗜性优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒及其制备方法。具体是构建一种优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒，该质粒可以在细胞内成功表达鸭IL-2蛋白，其可作为免疫增强剂和免疫佐剂使用，增强鸭类体内细胞和体液免疫反应。
本发明的第一个目的是提供一种优化的鸭IL-2基因。
本发明的第二个目的是提供一种含有优化鸭IL-2基因的真核表达重组质粒。
本发明的第三个目的是提供一种构建鸭IL-2基因的真核表达重组质粒的方法。
本发明的第四个目的是提供所述优化的鸭IL-2基因和含有优化鸭IL-2基因的真核表达重组质粒在作为或制备免疫增强剂和免疫佐剂方面的应用。
一种优化的鸭IL-2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
一种真核表达重组质粒，是嵌入了所述优化的鸭IL-2基因的真核表达载体，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述真核表达载体为pCAGGK。
该真核表达载体含有卡那霉素抗性基因(Kana+)、CMV增强子(CMV-Enhancer)和鸡beta-actin启动子(beta-chicken actin promoter)。其中，使用卡那霉素(kanamycin)抗性基因作为标记基因，方便筛选阳性菌落；选择CMV-Enhancer作为增强子，其可以启动哺乳动物细胞中下游基因的表达；选择beta-chicken actin promoter作为启动子，其可以启动禽类细胞中下游基因的表达。
一种构建鸭IL-2基因的真核表达重组质粒的方法，将所述优化的鸭IL-2基因嵌入真核表达载体，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述方法包括以下步骤：
S1.将鸭IL-2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，根据鸭的密码子偏嗜性进行优化，优化的鸭IL-2基因(optiDkIL-2)核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
S2.利用限制性内切酶处理S1所述优化的鸭IL-2基因，同时用相同的限制性内切酶处理真核表达载体；
S3.分别回收经S2酶切后的目的基因片段和载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到阳性质粒。
优选地，所述真核表达载体为pCAGGK。
优选地，所述限制性内切酶为EcoRI和XhoI。
优选地，步骤S2所述酶切的反应体系为：5μL 10×buffer、3μL阳性质粒、1μL内切酶EcoRI、1μL内切酶XhoI、ddH2O 40μL，补足50μL体系。
优选地，步骤S3所述连接的反应体系和反应条件为：1μL T4 DNA连接酶buffer、1μL T4 DNA连接酶(5U/μL)、2μL空载体DNA片段(50ng/μL)、6μL optiDkIL-2基因片段；将上述试剂混合均匀后，16℃连接仪连接过夜。
优选地，步骤S3所述转化的方法是：以1:6体积比将连接过夜的连接产物移入感受态细胞JM109中，充分混匀，冰浴40min，42℃热击2min，冰浴4min。
优选地，步骤S3所述筛选方法是：卡那霉素(终浓度为100μg/mL)筛选。
所述构建方法获得的含有优化的鸭IL-2基因的真核表达重组质粒。也在本发明的保护范围之内。
所述优化的鸭IL-2基因在作为或制备免疫增强剂和免疫佐剂方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
所述真核表达重组质粒在作为或制备免疫增强剂和免疫佐剂方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
本发明具有如下有益效果：
本发明根据鸭密码子偏嗜性优化鸭IL-2基因，并将其连接到真核表达载体pCAGGK，得到了鸭IL-2基因真核表达重组质粒。本发明获得的真核表达重组质粒在细胞内能成功表达鸭IL-2蛋白，表达效率得到显著提升；因此，该重真核表达重组质粒可作为免疫增强剂和免疫佐剂使用，增强鸭类体内细胞和体液免疫反应。
附图说明
图1为优化前后鸭IL-2基因核苷酸对比；Original为未优化的鸭IL-2基因序列(DkIL-2)；Optimized为优化后的鸭DkIL-2基因序列(optiDkIL-2)；下划线标注的为优化后基因与未优化基因的差异碱基位点。
图2为根据鸭的密码子偏嗜性将鸭IL-2基因的ORF进行优化后的数据分析显示图；A：优化后鸭IL-2基因的密码子适用指数(CAI)从0.72提高到0.99；B：最优密码子使用频率(FOP)从34％提高到96％；C：GC含量从39.73％提高到58.19％；优化前后该基因的核苷酸同源性为80％，氨基酸同源性为100％。
图3为优化的鸭IL-2基因重组质粒pUC-optiDkIL-2酶切验证结果。该图中，M：DS15000；1、2、3、4：pUC-optiDkIL-2/EcoRI和XhoI双酶切产物；5：pUC-optiDkIL-2基因目的片段；6：pUC-optiDkIL-2/EcoRI单酶切产物；7：pUC-optiDkIL-2/XhoI单酶切产物。
图4为真核表达载体pCAGGK基因图谱。
图5为优化的鸭IL-2基因重组质粒pCAGGK-optiDkIL-2-HIS酶切鉴定。该图中，M：DS15000；1：pCAGGK-optiDkIL-2-HIS/EcoRI单酶切产物；2：pCAGGK-optiDkIL-2-HIS/XhoI单酶切产物；3，4：pCAGGK-optiDkIL-2-HIS/EcoRI和XhoI双酶切产物；5：pCAGGK-optiDkIL-2-HIS基因目的片段。
图6为优化重组质粒pCAGGK-optiDkIL-2-HIS在293T细胞中蛋白表达产物Westernblot结果。该图中，M：蛋白Marker；1：转染质粒pCAGGK转染表达结果；2：转染质粒pCAGGK-optiDkIL-2-HIS转染表达结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1鸭IL-2基因的获取和优化
根据NCBI(National Center for Biotechnology)序列数据库公布的鸭IL-2基因序列，即为未优化的鸭IL-2基因(DkIL-2)序列，如SEQ ID NO.3所示。
根据鸭的密码子偏嗜性优化鸭IL-2基因序列，优化后的鸭IL-2基因(optiDkIL-2)序列如SEQ ID NO.4所示。并合成优化的鸭IL-2基因(optiDkIL-2)，该基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
根据鸭的密码子偏嗜性优化鸭IL-2基因序列，结果显示：鸭IL-2基因的密码子适用指数(CAI)从0.72升到0.99(如图2A)；最优密码子使用频率(FOP)从34％升高到96％(如图2B)；GC含量从39.73％提高到58.19％(如图2C)。未优化基因和优化后基因的核苷酸同源性为80％，氨基酸同源性为100％。
优化前后的鸭IL-2基因的核酸序列如图1所示。
实施例2构建优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒
1、构建优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒的方法如下：
(1)由公司合成优化的鸭IL-2基因(optiDkIL-2)；
(2)将上述优化的optiDkIL-2基因连接到载体pUC-57，得到的重组质粒命名为pUC-optiDkIL-2；
(3)酶切鉴定重组质粒pUC-optiDkIL-2(如图3)，并测序鉴定该质粒含有的optiDkIL-2基因序列是否有误。
(4)酶切：分别用限制性内切酶EcoRI、XhoI双酶切重组质粒pUC-optiDkIL-2，然后使用琼脂凝胶电泳对酶切产物进行鉴定，从琼脂糖凝胶中切下含有目的基因的胶块后，通过天根DNA纯化回收试剂盒进行胶回收，得到酶切后的目的基因optiDkIL-2。同样的方法双酶切真核表达载体pCAGGK，将酶切产物进行胶回收，得到酶切后的载体。该载体pCAGGK是在载体pCAGGS基础上改造而来，具体是由华南农业大学禽病研究室构建，质粒基因图谱见图4。
上述酶切的反应体系为：5μL 10×buffer、3μL阳性质粒、1μL内切酶EcoRI、1μL内切酶XhoI、ddH2O 40μL，补足50μL体系。
(5)连接：利用T4连接酶将酶切回收的目的基因optiDkIL-2和相同酶切处理后的真核表达载体pCAGGK连接，得到重组质粒pCAGGK-optiDkIL-2。
连接的反应体系和反应条件为：1μL T4 DNA连接酶buffer、1μL T4 DNA连接酶(5U/μL)、2μL空载体DNA片段(50ng/μL)、6μL optiDkIL-2基因片段；依次将上述试剂混匀后，16℃连接仪连接过夜。
(6)转化、筛选
将上面得到的连接产物加到60μL感受态细胞JM109中，混合均匀，冰浴40min。42℃热击2min后，迅速冰浴4min。加适量不含抗菌素的LB液体培养基，置于摇床中，37℃150-200r/min摇动50min。离心后弃掉部分上清液，剩下菌液沉淀混匀涂布于含卡那霉素(终浓度为100μg/mL)的LB固体选择培养基平板上，待培养基完全吸收后放入37℃温箱，倒置培养12h～16h。从固体培养基平板中任意挑取16个单菌落接种于1000μL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养4～6h后，用天根质粒小提试剂盒抽提质粒，使用琼脂糖凝胶电泳鉴定出3个阳性质粒，同时进行酶切鉴定及测序鉴定。
阳性质粒PCR鉴定所用的引物如表1所示。
表1 PCR鉴定引物：
Figure BDA0003012523570000051
Figure BDA0003012523570000061
鉴定结果如图5所示。成功构获得优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒pCAGGK-optiDkIL-2。
(7)质粒DNA的大量提取制备：
将获得的阳性质粒转化至JM109大肠杆菌，扩大培养。参考德国MN(MACHEREY-NAGEL)公司产品去内毒素质粒大量抽提试剂盒步骤抽提质粒，同时用分光光度仪测提取质粒的浓度。
实施例3优化后鸭IL-2基因真核表达重组质粒的表达和检测
1、293T细胞转染：
将测序正确的pCAGGK-optiDkIL-2-HIS重组质粒转染293T细胞，转染前12h，将细胞瓶中的293T细胞铺在多聚赖氨酸处理过的6孔板中，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞12h，细胞生长到90％以上时转染质粒。
(1)具体步骤如下：
1.5mL离心管中加入400μL opti-MEMI，再加入10μL Lipofectamine 2000混匀，然后将400μLopti-MEM加入另一个1.5mL离心管中，再加入4μg待转染质粒，混匀；将含有Lipofectamine 2000的opti-MEMI加入到含有质粒的opti-MEMI中，充分混匀，在室温下静置20min。内用PBS洗2～3次待转染然293T细胞，将静置20min的转染混合液入到6孔板中，并加1200ul opti-MEM培养液；最后将6孔板置于37℃浓度为5％的CO2培养箱中培养48h，用于下一步检测表达情况。
2、Western blot检测目的蛋白的表达：
具体步骤如下：
弃掉六孔板中的培养基，内用PBS洗三遍，最后加PBS用枪头刮净细胞置于1.5ml离心管，离心后弃掉上清，加入适量裂解液裂解混合均匀，置于摇床冰盒低速摇30min，离心后取上清加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10～15min，-20℃保存备用。
待至SDS-PAGE凝胶电泳时，恒压电泳直至样品进入下层胶底部终止电泳，将含有样品的适宜胶块切下，置于转胶缓冲液中浸润6min，同样的方法处理裁剪的合适硝酸纤维素膜和滤纸，用湿电转膜仪进行转膜。
待转膜完毕，用TBST洗3次硝酸纤维素膜，每次7min，然后将其置于入封闭液中，室温封闭2h或者4℃冰箱过夜；用TBST洗3次硝酸纤维素膜，每次7min，然后将硝酸纤维素膜置于一抗稀释液中室温孵育2h；待孵育完成回收一抗，用TBST洗3次硝酸纤维素膜，每次7min，将其避光置于二抗稀释液中室温孵育45min，待孵育完成回收二抗，TBST洗3次硝酸纤维素膜，每次7min。用扫膜仪进行扫膜，分析处理图片后保存。
3、结果：
结果如图6所示，Western blot实验表明转染质粒pCAGGK-optiDkIL-2-HIS组和pCAGGK组，前者可以表达出约17kDa的特异性条带。说明重组质粒pCAGGK-optiDkIL-2-HIS组能在体外特异性表达鸭IL-2蛋白。
综上可知，本发明根据鸭密码子偏嗜性对鸭IL-2基因进行优化，将其连接到真核表达载体pCAGGK，得到了优化的鸭IL-2基因真核表达重组质粒pCAGGK-optiDkIL-2。该重组质粒可以在细胞内成功表达鸭IL-2蛋白，其可以作为免疫增强剂和免疫佐剂使用，增强鸭类体内细胞和体液免疫反应。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种鸭IL-2基因真核表达重组质粒及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atagaattca tgggccacca tgt 23
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatctcgagt cagtggtggt ggtggtggtg ggtcatctgc ttacttcagc atgct 55
<210> 3
<211> 423
<212> DNA
<213> Anas platyrhynchos
<400> 3
atgtgcaaag tactcatctt cagctgcctt tcagtactaa tgcttatgac tacagcttat 60
ggagcacctc tatcagagaa agacaacact cttaaaactt taataaaaga tttagaaaac 120
ctgggaacaa gcatgaatgg gattgatctt gagctctaca caccaaatga cacaaaggag 180
tgcagctggc aaactctgca atgttacttg aaagaaatag tcaccttgga ggaagaaatt 240
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gccaacaact tccctgaatt tcgccaagag ctgaccaact tcctgagatc tatgctaaaa 420
taa 423
<210> 4
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtgcaagg tgctgatctt cagctgcctg agcgtgctga tgctgatgac cacagcttac 60
ggggcccccc tgagcgagaa ggacaacacc ctgaagaccc tgatcaagga cctggagaac 120
ctggggacca gcatgaacgg catcgacctg gagctgtaca cccccaacga caccaaggag 180
tgcagctggc agaccctgca gtgctacctg aaggagatcg tgaccctgga ggaagagatc 240
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ctgcagaagc tgatggacct gatcccccca ggcaccggct gcaacatctg cgaggccaac 360
gccaacaact tccccgagtt caggcaggag ctgaccaact tcctgaggag catgctgaag 420
taa 423

Claims (10)

1.一种优化的鸭IL-2基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种真核表达重组质粒，其特征在于，是嵌入了权利要求1所述优化的鸭IL-2基因的真核表达载体。
3.根据权利要求2所述真核表达重组质粒，其特征在于，所述真核表达载体为pCAGGK。
4.一种鸭IL-2基因的真核表达重组质粒的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述优化的鸭IL-2基因嵌入真核表达载体。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
S1.获得优化的鸭IL-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
S2.利用限制性内切酶处理S1所述优化的鸭IL-2基因，同时用相同的限制性内切酶处理真核表达载体；
S3.分别回收经S2酶切后的目的基因片段和载体片段，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到阳性质粒。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述真核表达载体为pCAGGK。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述限制性内切酶为EcoRI和XhoI。
8.权利要求4所述构建方法获得的含有优化的鸭IL-2基因的真核表达重组质粒。
9.权利要求1所述优化的鸭IL-2基因在作为或制备免疫增强剂和免疫佐剂方面的应用。
10.权利要求2或权利要求8所述真核表达重组质粒在作为或制备免疫增强剂和免疫佐剂方面的应用。
CN202110379859.8A 2021-04-08 2021-04-08 一种鸭il-2基因真核表达重组质粒及其制备方法 Pending CN113308477A (zh)

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