CN107663523A - 一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法与应用。具体是将优化的鸡α干扰素基因与真核表达载体连接构建得到所述重组质粒；所述优化的鸡α干扰素基因序列（序列如SEQ ID NO.4所示）。本发明构建得到的优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒可以在细胞内成功表达鸡α干扰素蛋白，可以增强禽类体内细胞和体液免疫反应；作为免疫增强剂使用，安全性和稳定性更高，且运输方便、使用简便、成本低，毒副反应更低，具有很好的推广应用前景。

Description

一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法 与应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域。更具体地，涉及一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法和作为免疫增强剂的应用。

背景技术

近年来我国养禽业发展迅速，规模不断扩大。但是，禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎等病毒类疾病的流行制约了养禽业发展的重要因素。目前我国仍然采用疫苗免疫、化学药物及抗生素治疗等方法来防制禽类疾病。但由于病原的血清型复杂、变异速度快，常常导致疫苗的免疫效果不佳，同时抗生素和化学药物的使用又因为病原的耐药性与药物残留问题而限制了其使用的范围。因此迫切需要广谱抗病毒生物制剂来治疗和加强免疫效果。

干扰素(Interferon，IFN)是一类重要的细胞因子，由生物体细胞受到病毒或其他诱生剂的作用而产生的分泌性蛋白，具有抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物学活性。在临床应用上，干扰素有着抗生素无法替代的作用，研究表明禽干扰素具有抗病毒较强、抗病毒谱广等优点，细胞接触干扰素在短时间内就能产生抗病毒作用，可适用于不同品种的鸡，对生产性能影响小。但是目前市面上禽类重组干扰素的制品较少，制作成本相对较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中禽类免疫增强剂的缺陷和不足，提供一种安全性和稳定性更高、运输方便、使用简便、生产成本低、周期短、相对直接注射细胞因子具有更低的毒副反应的免疫增强剂。具体是一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒，该质粒可以在细胞内成功表达鸡α干扰素的蛋白，增强禽类体内细胞和体液免疫反应。

本发明的目的是提供一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法。

本发明另一目的是提供所述优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒在作为免疫增强剂方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒的制备方法，将优化的鸡α干扰素基因与真核表达载体连接构建得到所述重组质粒。

其中，所述鸡α干扰素基因是优化的鸡α干扰素基因序列（ChIFN-α-opti），其序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述真核表达载体为限制性内切酶EcoRI和NheI，同时切割真核表达载体pCAGGK得到的线性载体。

所述真核表达载体质粒pCAGGK（质粒基因图谱见图4）是在载体pCAGGS基础上改造而来，具体是由本课题组（华南农业大学禽病研究室）构建并保存。

另外，具体优选地，所述优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

S1. 将鸡α干扰素基因（序列如SEQ ID NO.3所示）根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的鸡α干扰素基因（ChIFN-α-opti）序列如SEQ ID NO.4所示；

S2.利用限制性内切酶处理S1所述优化的鸡α干扰素基因，同时利用相同的限制性内切酶处理真核表达载体pCAGGK；

S3.将S2酶切后的目的基因片段和载体片段回收，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到阳性质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti。

更进一步地，得到阳性质粒后，还进行酶切鉴定、测序鉴定、保存鉴定，获得优化的鸡α干扰素基因真核表达质粒。

优选地，步骤S2所述限制性内切酶为限制性内切酶EcoRI和NheI。

优选地，步骤S3所述连接的方法是：利用T4连接酶16℃连接过夜。

优选地，步骤S3所述转化是转化感受态细胞DH5α。

优选地，步骤S3所述转化的方法是按照1:10体积比将获得的连接产物加到感受态细胞DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热冲击1.5min后，迅速冰浴2～3min。

步骤S3所述筛选是利用卡那霉素（终浓度为100μg/mL）进行筛选。

另外，由上述方法制备获得的优化的鸡α干扰素基因（其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示），及其作为免疫增强剂的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明将优化的鸡α干扰素基因连接至真核表达载体pCAGGK构建了鸡α干扰素基因真核表达重组质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti。本发明构建的重组质粒可以在细胞内成功表达鸡α干扰素的蛋白，增强禽类体内细胞和体液免疫反应。

同时，使用本发明构建的细胞因子类基因质粒作为免疫增强剂，相较于目前使用的其他类型制剂，安全性和稳定性更高；运输方便，使用简便，生产成本低，生产周期短；相对直接注射细胞因子具有更低的毒副反应。

附图说明

图1为鸡α干扰素基因优化前后的核苷酸对比；图中，Original为未优化的鸡α干扰素基因序列；Optimized为优化后的鸡α干扰素基因序列；下划线标注的为优化后基因与未优化基因的差异碱基位点。

图2为优化的鸡α干扰素重组质粒基因扩增鉴定电泳图；其中M：DS2000Marker；1：优化的鸡α干扰素目的基因片段。

图3为优化的鸡α干扰素重组质粒酶切鉴定结果；其中M：DS5000Marker；1、2：优化的鸡α干扰素基因片段双酶切产物。

图4为未优化的鸡α干扰素重组质粒pCAGGK-ChIFN-α与真核表达载体pCAGGK酶切鉴定结果；其中M：DS15000Marker；1：真核表达载体pCAGGK双酶切产物；2：pCAGGK-ChIFN-α双酶切产物。

图5为优化的鸡α干扰素重组质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti酶切鉴定结果；其中M：DS5000Marker；1、2：pCAGGK-ChIFN-α-opti双酶切产物；3、4：pCAGGK-ChIFN-α-opti单酶切产物。

图6为真核表达载体pCAGGK基因图谱。

图7为优化的鸡α干扰素重组质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti在293T细胞中蛋白表达产物Western-blot结果；其中M：蛋白Marker；1：pCAGGK-ChIFN-α-opti转染表达结果；2：pCAGGK-ChIFN-α转染表达结果；3：pCAGGK转染表达结果；4：空白对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 鸡α干扰素基因的获取和优化

1、根据NCBI（National Center for Biotechnology）序列数据库公布的鸡α干扰素基因序列，即为未优化的鸡α干扰素基因（ChIFN-α）序列，如SEQ ID NO.3所示。并合成未优化的鸡α干扰素基因（ChIFN-α），由江苏苏州金唯智生物科技有限公司完成。

2、根据鸡的密码子偏嗜性对鸡α干扰素基因序列进行优化，优化后的鸡α干扰素基因（ChIFN-α-opti）序列如SEQ ID NO.4所示。并合成优化的鸡α干扰素基因（ChIFN-α-opti），由江苏苏州金唯智生物科技有限公司完成。

优化前后的鸡α干扰素基因的核苷酸对比如图1所示。

实施例2 构建鸡α干扰素基因真核表达重组质粒

1、未优化和优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒的方法相同，具体方法步骤如下：

（1）如实施例1，首先合成并鉴定未优化和优化的鸡α干扰素基因；

（2）酶切目的基因与真核表达载体pCAGGK

用限制性内切酶EcoRI和SacI处理未优化的鸡α干扰素基因片段，用限制性内切酶EcoRI和NheI处理优化的鸡α干扰素基因片段，并分别将酶切产物进行琼脂凝胶电泳，切下含有目的条带的凝胶后，按照天根通用型DNA纯化回收试剂盒说明书进行胶回收。

同时分别双酶切处理真核表达质粒pCAGGK。该质粒pCAGGK是在载体pCAGGS基础上改造而来，具体是由华南农业大学禽病研究室构建，质粒基因图谱见图6。

（3）连接：将回收的未优化和优化的目的基因片段分别与相同酶切处理后的真核表达载体pCAGGK连接，具体是：利用T4连接酶（10μL连接体系）将未优化和优化的目的基因片段分别与双酶切处理后的质粒pCAGGK连接，16℃连接过夜；分别构建得到重组质粒pCAGGK-ChIFN-α及pCAGGK-ChIFN-α-opti。

（4）转化、筛选

将获得的连接产物10μL加到100μL感受态细胞DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热冲击1.5min后，迅速冰浴2～3min。加500μL不含抗菌素的LB液体培养基，置于摇床中，37℃，150r/min摇动1h。取上述菌液涂布于含卡那霉素（终浓度为100μg/mL）的LB固体选择培养基平板上，待菌液完全吸收后放入温箱，37℃倒置培养12h～16h。从每个培养基平板中随即挑取8个单菌落接种于1000μL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，用天根质粒小提试剂盒抽提质粒，通过琼脂糖凝胶电泳确定出3个疑似阳性克隆质粒，进行双酶切鉴定及测序鉴定。

阳性质粒PCR鉴定所用的引物如表1所示

表1 PCR鉴定引物

鉴定结果分别如图2-5所示。成功构建得到未优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒pCAGGK-ChIFN-α和优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti。

（5）质粒DNA的大量提取制备：

将获得的阳性克隆转化DH5α大肠杆菌，扩大培养。参考德国MN(MACHEREY-NAGEL)公司产品去内毒素质粒大量抽提试剂盒步骤抽提质粒。用分光光度仪测提取质粒的浓度。

2、优化结果分析

ChIFN-α基因的密码子适用指数（CAI）从0.86提高到0.98，最优密码子使用频率（FOP）从68%提高到96%，GC含量从61.34%提高到61.62%。

实施例3 鸡α干扰素基因真核表达重组质粒的表达和检测

1、试验方法

（1）293T细胞转染：

转染前24h，将293T细胞均匀铺于6孔细胞培养板，细胞汇合度达到80%左右进行转染；转染时用500μL opti-DMEM稀释4μg质粒，吹打混匀；向质粒稀释液中加入10μL的Lipofectamine2000，并轻轻震荡混匀；室温下孵育20min；将6孔细胞板中的培养液吸出并使用opti-DMEM或PBS洗2-3次，并加400μL opti-MEM培养液；将静置了20min的混合液加入到6孔板中，轻轻晃动细胞板使均匀分布；将细胞板置于CO₂ 浓度为5%的37℃培养箱中培养24-48h，检测表达情况。

（2）Western blot检测目的蛋白的表达：

将在6孔板表达的外源蛋白的293T细胞，用PBS清洗3次后，每孔加入100μL蛋白酶抑制剂PMSF和裂解液RIPA的混合液，反复吹打，并收集至1.5mL离心管中；5000r/min 4℃离心5min，取上清与5×SDS混合，沸水中煮10min，-20℃保存备用。

在进行SDS-PAGE凝胶电泳时，将样品加入孔中。先恒压80V电泳，当样品进入下层胶后改为恒压120V电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止。电泳完毕后，根据目的蛋白大小切胶，测量胶片大小，将切好的胶置于转胶缓冲液中室温平衡5min；裁剪硝酸纤维素膜和滤纸，并置于转膜缓冲液中平衡15min，同时浸泡滤纸；用湿电转膜仪进行转膜。

完成转膜后，取下硝酸纤维素膜，用TBST漂洗3次，每次5min，漂洗后将硝酸纤维素膜放入BSA封闭液中，室温封闭2h，或者4℃冰箱过夜；再取出硝酸纤维素膜用TBST漂洗3次，每次5min；放入一抗稀释液中室温低速孵育2h；回收一抗，用TBST将硝酸纤维素膜漂洗3次，每次5min；然后将硝酸纤维素膜放入二抗的稀释液中，避光室温孵育1h，孵育后用TBST将硝酸纤维素膜漂洗3次，每次10min。用扫膜仪进行扫膜，分析处理图片后保存。

2、结果如图7所示，Western blot试验表明转染质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti组和pCAGGK-ChIFN-α组均有约22kD大小的特异性条带，且重组质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti组的蛋白条带比质粒pCAGGK-ChIFN-α的表达量大。说明重组质粒pCAGGK-ChIFN-α和pCAGGK-ChIFN-α-opti均能在体外表达ChIFN-α特异性蛋白，且后者表达ChIFN-α蛋白的效率高于前者。

综上实验结果显示，本发明成功将优化的鸡α干扰素基因分别连接至真核表达载体pCAGGK构建了优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti，该重组质粒都可以在293T细胞成功表达鸡α干扰素ChIFN-α的蛋白，有助于增强禽体内细胞和体液免疫反应。同时使用该质粒作为免疫增强剂相较于目前使用的其他类型制剂，安全性和稳定性更高；运输方便，使用简便，生产成本低，生产周期短；相对直接注射细胞因子具有更低的毒副反应。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 1

tcctacagct cctgggcaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 2

tattagccag aagtcagatg 20

<210> 3

<211> 582

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 3

atggctgtgc ctgcaagccc acagcaccca cgggggtacg gcatcctgct gctcacgctc 60

cttctgaaag ctctcgccac caccgcctcc gcctgcaacc accttcgccc ccaggatgcc 120

accttctctc acgacagcct ccagctcctc cgggacatgg ctcccacact accccagctg 180

tgcccacagc acaacgcgtc ttgctccttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240

cggcaagccg acaaaaccac ccacgacatc cttcagcacc tcttcaaaat cctcagcagc 300

cccagcactc cagcccactg gaacgacagc caacgccaaa gcctcctcaa ccggatccac 360

cgctacaccc agcacctcga gcaatgcttg gacagcagcg acacgcgctc ccggacgcga 420

tggcctcgca accttcacct caccatcaaa aaacacttca gctgcctcca caccttcctc 480

caagacaacg attacagcgc ctgcgcctgg gaacacgtcc gcctgcaagc tcgtgcctgg 540

ttcctgcaca tccacaacct gaccggcaac accagaacct ga 582

<210> 4

<211> 582

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 4

atggctgtgc cagccagccc acagcacccc agaggctacg gcatcctgct gctgacactg 60

ctgctgaagg ccctggccac aacagccagc gcctgcaacc acctgagacc ccaagacgcc 120

acctttagcc acgacagcct gcagctgctg agggatatgg ctcccaccct gccccagctg 180

tgcccacagc acaacgccag ctgcagcttc aacgacacca tcctggacac cagcaacacc 240

aggcaggctg acaagaccac ccacgacatc ctgcagcacc tgttcaagat cctgagcagc 300

cccagcacac cagcccactg gaacgatagc cagaggcaga gcctgctcaa caggatccac 360

aggtacaccc agcacctgga gcagtgcctg gacagcagcg acaccaggag caggaccaga 420

tggcccagga acctgcacct gaccatcaag aagcacttca gctgcctgca caccttcctc 480

caggacaacg actactccgc ctgcgcttgg gagcacgtga gactgcaggc tagggcctgg 540

ttcctgcaca tccacaacct cacaggcaac acgcgcactt ag 582

Claims (7)

1.一种优化的鸡α干扰素基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒的制备方法，其特征在于，将优化的鸡α干扰素基因与真核表达载体连接构建得到所述重组质粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为限制性内切酶EcoRI和NheI，同时切割真核表达载体pCAGGK得到的线性载体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 将鸡α干扰素基因根据鸡的密码子偏嗜性进行优化，优化的鸡α干扰素基因序列如SEQ ID NO.4所示；

S2.利用限制性内切酶处理S1所述优化的鸡α干扰素基因，同时利用相同的限制性内切酶处理真核表达载体pCAGGK；

S3.将S2酶切后的目的基因片段和载体片段回收，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到阳性质粒pCAGGK-ChIFN-α-opti。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，得到阳性质粒后，还进一步进行酶切鉴定、测序鉴定、保存鉴定，获得优化的鸡α干扰素基因真核表达质粒。

6.根据权利要求2-5任一所述方法制备获得的优化的鸡α干扰素基因真核表达质粒。

7.权利要求6所述优化的鸡α干扰素基因真核表达质粒在作为或制备免疫增强剂方面的应用。