CN103555860B - 一种鲤春病毒标准样品及其制备方法 - Google Patents

一种鲤春病毒标准样品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其通过选用鲤春病毒株SVCV-DL进行标准品的制备，经过毒株的鉴定、标准样品的制备，即通过病毒的增殖后收获病毒培养物，再经过冻干工艺，选用由海藻糖、脯氨酸、脱脂奶粉和去离子水制备的冻干保护剂，选用特定的冻干工艺制备鲤春病毒标准样品。最后通过均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等项工作获得本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。

Description

一种鲤春病毒标准样品及其制备方法
技术领域
本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法技术领域，具体涉及鲤春病毒标准样品及其制备方法。
背景技术
我国是世界上最大的水产品生产和输出国，目前，我国水产品总量已占全球渔业总产量的40%，连续15年居世界首位，养殖水产品产量占世界养殖总产量的70%。水产品在保障国家粮食安全、促进农民增收和农村经济稳步发展中发挥了重要作用。我国水海产品出口面临的壁垒主要为绿色壁垒，如日本的“肯定列表制度”、欧盟的《欧盟食品及饲料安全管理法规》及有关法令、美国的《最严谨的水产养殖规范》（BAP）等，欧盟启动了对我国进口人工养殖海产品的审查；韩国政府也禁止我国34家水产养殖企业向韩国出口鱼类等水产品，严重制约了我国水产品的出口增长。
鲤春病毒病(又称鲤鱼传染性腹水症)是由鲤春病病毒（SVC）感染而引起鲤鱼科的一种急性、出血性传染性病，是对水产养殖业危害较大的一种传染性疫病。也是我国动物防疫法规定的一类动物疫病，OIE将其列为需要向OIE申报的疫病。该病原广泛存在，传播速度快，潜伏期短，死亡率高，可导致整个鱼塘毁灭性打击，且该病毒传播快且比较难控制疫情，是水生动物检疫中严格检验控制的病毒。鲤春病毒血症的流行地域广，流行于欧洲、中东和俄罗斯，主要有奥地利、匈牙利、保加利亚、法国、德国、英国、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克、俄罗斯等，近几年逐步蔓延到美洲和亚洲。该病是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象，可引起各国的贸易摩擦和巨大的经济损失。1998年英国从北京进口一批观赏鱼中检出含有鲤春病病毒，并以此要求中国对所有出口观赏鱼饲养场进行两年以上的净化及SVC监测，直至保证没有SVC，方可向英国出口。随后，中国观赏鱼出口的传统市场法国、意大利、西班牙、比利时、日本和新加坡等也相继提出了类似要求。后经英国有关专家证实，北京并未发现任何SVC感染情况。但是，我国却为此损失创汇1亿多元，而且全国的观赏鱼产业从此一落千丈。2002年美国北卡罗来纳州发生该病导致15万尾锦鲤的损失，同年6月美国威斯康星州的野生鲤鱼也大量发病。2003、2005、2007年英国在本地均检出SVCV。中国养殖鲤鱼占淡水鱼21%，养殖历史悠久，但未见该病暴发的正式报道，该病一旦发病，将给我国养殖渔业以沉重的打击。
由于养殖生态环境恶化，疾病预防意识差，滥用药物普遍，水生动物种苗质量不高，防疫体系不健全等原因导致水生动物发病。系统内送检鱼的样品通常眼观来看都比较健康，而鲤春病毒通常只有在适宜的温度下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出临床症状的鱼中检出病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，鱼类疫病多数要上细胞进行先增殖，而普通的水生动物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制及研究带来了极大的挑战。
发明内容
为解决上述技术问题，帮助实验室建立好的质量保证，辽宁出入境检验检疫局从2006年就开始从事水生动物疫病及标准样品的研究工作，成立了研制标准样品工作小组，由辽宁出入境检验检疫局制备测试样品，使用的鲤春病毒株SVCV-DL来源于日常搜集样品。进行了原材料的选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等项工作。
本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。
本发明的一方面在于：公开一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其包括以下操作步骤：
a.病毒的增殖
选长满单层的EPC细胞，倒掉培养液，接种SVC病毒液；于15℃吸附2小时；补加M199维持液，继续培养至细胞病变达到80%以上，收获病毒培养物，于-20℃保存备用；
b.冻干工艺
冻干保护剂为：按以下组分和重量体积比配制而成：海藻糖：去离子水为5%，脯氨酸：去离子水为5%，脱脂奶粉：去离子水为10%；
冻干工艺为：取步骤a中病毒培养物与冻干保护剂按等体积比均匀混合，于-30℃中预冻24h后，移至冻干机中，保持真空度在30～40mtorr间，真空干燥24h，即为鲤春病毒标准样品。
对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤a所述收获病毒培养物为：待EPC细胞感染SVC病毒后脱落，出现细胞病变后反复冻融细胞培养物三次，于4℃，10000r/min离心10min制备获得。
对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤b所述冻干保护剂经过108℃,15min灭菌。
对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤a所述收毒的病毒滴度通过Karber法测定，TCID50值为10-6.7525/0.1ml。
本发明的另一方面在于，保护一种利用上述技术方案中所述方法制备的鲤春病毒标准样品。
附图说明
本发明附图4幅，
图1：SVCV目的片段外套引物扩增PCR电泳图；M：DL2000 Marker；1：F1/R2扩增产物；大小约为714bp；
图2：SVCV目的片段内套引物扩增PCR电泳图；M：DL2000 Marker；1：F1/R4扩增产物；2：阴性；
图3：鲤春病毒糖蛋白核酸序列对比图；
图4：Neighbor Joining方法作系统发育树；图中所示本鲤春病毒株SVCV-DL（图中以lcll22631为简称）与S30病毒株亲缘关系最近,为一个分支。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明中使用的EPC细胞系（全称鲤上皮乳头状瘤细胞系）由ATCC购买；M199培养基为Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。感受态细胞E.coli JM109、PCR试剂盒、分子量标准DL-2000、DNA快速纯化回收试剂盒、DNA片段的连接转化试剂盒等均为TaKaRa公司产品；氨苄青霉素（Amp）为上海生工生物工程有限公司产品；其余试剂均为分析纯产品。
实施例1 鲤春病毒标准样品的制备
一.病毒的鉴定
将辽宁出入境检验检疫局日常收集的鱼病病料组织（毒株来源于样品），根据OIE和《GB/T15805.5-2008 鱼类检疫方法 第5部分：鲤春病毒(SVCV)》方法进行前处理，并进行RT-PCR检测。
RNA的提取
①Trizol法提取病毒RNA：
②取3个1.5mL灭菌EP管，病毒样品2个，阴性对照1个，并对每个管进行编号。
③每管加入600μL裂解液，样品200μL；再加入200μL氯仿，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
④再取相同个数的EP管，加入-20℃预冷的异丙醇500μL，对每个管进行编号。取离心后上清至少500μL，颠倒混匀。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
⑤轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体。加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心10min。
⑥轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体。4000r/min离心10s。
⑦用微量加样器尽吸干液体，室温干燥3min。
⑧加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。
RT反应：
①解二级结构：在PCR管中，加入如下体系：
RNA模板  10μL
R1       3μL
DEPC水   2μL
总体积15μL。70℃加热5min后，立即冰浴。
②合成cDNA：在上述管中，加入如下体系：
总体积25μL。40℃加热60min。
PCR反应：在上述管中加入如下体系：
总体积100μL。所述F1和R1序列信息是否已经在《GB/T 15805.5-2008鱼类检疫方法第5部分：鲤春病毒(SVCV)》中公开。
反应条件：
反应结束后，RT-PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察是否出现了与预期大小一致的目的片段。SVCV目的片段PCR电泳图结果如图1，有目的条带，图2为外套引物扩增PCR，大小约为714bp，右图为内套引物扩增产物，大小约为606bp。
（二）目标基因的纯化鉴定
1.采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒（货号DV805A），并按其操作说明回收目标分子DNA片段。
2.目的片段的连接转化
连接体系：纯化的目的片段4μL，2×Rapid ligation buffer 5μL，PGEM-T载体0.5μL，T4 DNA Ligase 0.5μL，用无菌水补充至10μL，室温连接1h。
3.转化
将连接产物加入到制备好的感受态细胞中，轻轻用移液器混匀，冰浴20min，42℃热应激1min，冰浴2min，加入800μL SOC培养基，150g摇菌1.5h，1 000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μL，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h-16h。
4.阳性克隆的筛选
挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件同上。
5.质粒回收
应用Omega公司质粒回收试剂盒方法。
6.测序
将菌液PCR鉴定均为阳性的重组质粒送宝生物（大连）有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示（并将其对应的病毒株命名为鲤春病毒株SVCV-DL）。
7.序列分析
NCBI在线nucleotide blast分析，序列与鲤春病毒糖蛋白核酸序列相似性最高，达99%。核酸比对序列如图3，NCBI在线通过Neighbor Joining方法作系统发育树,如图4,本研究获得的分离株鲤春病毒株SVCV-DL与S30病毒株亲缘关系最近,为一个分支。
实施例2.标准样品的制备
一.细胞的复苏与病毒的增殖
1.EPC细胞的复苏
①从液氮中取出冻存管，迅速投入37～38℃水浴中，使其迅速溶化。后1000r/min离心5min。
②吸去上清，加入M199培养液1mL，吹打混匀。移入25cm2培养瓶中，继续加入培养液至终体积6mL。
③标记细胞名称，日期。
④镜检。
⑤放入20℃低温培养箱培养。
2.病毒的增殖
①选长满单层的EPC细胞4瓶，倒掉培养液。细胞传代后24h接种实施例1中获得的组织病料由本研究室保存，其中1瓶作为不接鲤春病毒株SVCV-DL的对照组，3瓶接毒组。
②在EP管中，将鲤春病毒株SVCV-DL病毒液用含2%胎牛血清的M199维持液稀释成3个稀释度，1:10；1:100和1:1000。
③接毒组依次加入稀释好的三个不同稀释度（1:10；1:100和1:1000）的1mL鲤春病毒株SVCV-DL病毒悬液。
④至于15℃低温培养箱中，吸附2小时。
⑤补加M199维持液5mL。
⑥继续培养，直至细胞病变达到80%以上。
⑦待细胞脱落，反复冻融细胞培养物三次，于4℃，10000r/min离心10min得细胞培养物上清液，于-20℃保存备用。
3.Karber法测定病毒滴度
①选取1长满单层EPC细胞的96孔微量培养板。
②在EP管中将EPC细胞扩增出的鲤春病毒株SVCV-DL病毒培养液做连续10倍稀释，从10-1～10-10。
③将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一个稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μL。
④设立正常细胞对照，两纵排。加入100μL无血清培养液。
⑤再向所有孔中每孔中加入100μL无血清培养液。
⑥逐日观察并记录结果，一般为7天。
⑦按照Karber法计算TCID50的值。
TCID50=10-6.7525/0.1ml
4.冻干保护剂的选择及冻干工艺
选用不同的冻干工艺：不同的菌株和不同的保护剂，采用的工艺不同，其中包括冷冻速度、共熔点的设置、干燥时间和温度的设定等，并认真总结经验，努力摸索实验的相关性，筛选出实验条件和较适宜的反应物料配比，从而为本课题的研究工作奠定了坚实基础。
本发明选择经过高压灭菌（高压条件：108℃,15min）的冻干保护剂，取步骤3中病毒培养物与冻干保护剂按照1：1体积比均匀混合，吸取2mL混合液加入到西林瓶中，放置于-30℃冰箱中预冻24h，保证样品彻底冷冻，预冻结束后，快速将样品放置在冻干机（SIM公司FD5508型）的样品托盘中，保持真空度在30～40mtorr间，真空干燥24h，制备成冻干粉末样品，即为鲤春病毒标准样品。
冻干保护剂为：按照重量体积比，海藻糖：去离子水=5%，脯氨酸：去离子水=5%，脱脂奶粉：去离子水=10%配制，108℃，高压灭菌15min即可。
5.标准样品的活性鉴定
鉴定方法同上，镜检结果观察到，EPC细胞可以产生明显的细胞病变。
6.标准样品的定性鉴定
鉴定方法为取上述制备的鲤春病毒标准样品，经RT-PCR试验，证明含有该病毒核酸片段，同时测序结果如SEQ ID NO.1也表明，所获得的序列为鲤春病毒株SVCV-DL序列。
实施例3 标准样品均匀性和稳定性检验
标准样品的均匀性是标准样品的基本性质，其目的是一方面通过均匀性检验说明特性值在各个部位之间是否均匀，另一方面要了解特性值在不同部位之间不均匀的程度，进而判断不均匀性程度是否可以接受，标准样品是否可以使用。不论在制备标准样品过程是是否经过均匀性初验，凡成批制备并分装成最小包装单元的标准样品，必须进行均匀性检验。由大包装分装成最小包装单元时，也需进行均匀性检验。这是制备标准样品过程中不可缺少的程序，也是确保标准样品定值准确的最基本条件。
制备的鲤春病毒标准样品根据OIE和《GB/T 15805.5-2008 鱼类检疫方法 第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)》中RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检测，结果如下，标准样品在真空、-20℃下贮存，稳定有效期为一年。
1 均匀性
鲤春病毒标准样品的均匀性测定结果见表1，其均匀性评价结果见表2。从表2可知，两个样品组之间不存在显著差异，可以认为样品是均匀的。
表1 鲤春病毒标准样品均匀性测定结果
样品号 RT-PCR产物(ng/μL) RT-PCR产物(ng/μL)
1 246 240
2 248 255
3 249 251
4 245 251
5 248 245
6 252 242
7 246 244
8 246 245
9 244 243
10 247 244
11 250 247
12 248 249
13 243 245
14 249 246
15 247 246
表2 鲤春病毒标准样品均匀性评价结果
方差来源 平方和 自由度 均方MS F比
组间（瓶间） 7.500 1 7.500 0.727
组内 288.800 28 10.314
总和 296.300 29
表3 鲤春病毒标准样品均匀性评价结果
2 稳定性
同样采用两种类型的稳定性试验：一种是在-20℃下的稳定性试验，随机取每个样品（样品A和B），每个月检测2份；另一种是在较高的温度20℃下的稳定性试验，样品取12份，每周检测3份测试结果见下表4、表5。
表4 稳定性检验实验（-20℃）
F=0.211,F表0.05=3.18，F＜FCr[0.05,5,5]，无显著性差异。
表5 稳定性检验实验（20℃）结果
F=1.107,F表0.05=3.18，F＜FCr[0.05,5,5]，无显著性差异。
3 定值方法
制备的鲤春病毒标准样品随机选15个用GB/T15805.5-2008中“鲤春病毒RT-PCR检测方法”所示进行定值试验，结果完全一致，均为鲤春病毒核酸阳性。
本鲤春病毒标准样品经新疆检验检疫局、珠海检验检疫局、山西检验检疫局、大连疾病预防控制中心等协作试验定值结果统计见表6。
表6 协作试验定值结果表
序号 定值方法 测试结果（定性）
1 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
2 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
3 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
4 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
5 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
6 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
7 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
8 GB/T15805.2-2008 鲤春病毒核酸阳性
证明应用GB/T15805.5-2008规定的方法对本标准样品的定值实验结果均为鲤春病毒核酸阳性。

Claims (4)

1.一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
a.病毒的增殖
选长满单层的EPC细胞，倒掉培养液，接种鲤春病毒的病毒液；于15℃吸附2小时；补加M199维持液，继续培养至细胞病变达到80％以上，收获病毒培养物，于-20℃保存备用；
b.冻干工艺
冻干保护剂由以下组分按重量体积比配制而成，海藻糖：去离子水为5％，脯氨酸：去离子水为5％，脱脂奶粉：去离子水为10％；
冻干工艺为：取步骤a中病毒培养物与步骤b中的冻干保护剂按等体积比均匀混合，于-30℃中预冻24h后，移至冻干机中，保持真空度在30～40mtorr间，真空干燥24h，即为鲤春病毒标准样品。
2.根据权利要求1所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于步骤a所述收获病毒培养物为：待EPC细胞感染SVC病毒后脱落，出现细胞病变后反复冻融细胞培养物三次，于4℃，10000r/min离心10min制备获得。
3.根据权利要求1所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于步骤b所述冻干保护剂经过108℃,15min灭菌。
4.根据权利要求1所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其特征在于步骤a收获病毒培养物的TCID50值为10-6.7525/0.1ml。
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