CN111484984B

CN111484984B - 一种鸭圆环病毒毒株及其灭活疫苗制备方法

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Publication number: CN111484984B
Application number: CN201910081110.8A
Authority: CN
Inventors: 黄瑜; 傅光华; 施少华; 李兆龙; 傅秋玲; 万春和; 程龙飞; 陈红梅; 刘荣昌; 林建生
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2039-01-28
Also published as: CN111484984A

Abstract

本发明提供了一种鸭圆环病毒毒株及其灭活疫苗制备方法，属于病毒疫苗株技术领域。鸭圆环病毒毒株FJ1815的保藏编号为CGMCC No.16283。基于鸭圆环病毒毒株FJ1815制备的鸭圆环病毒灭活疫苗是国内外首个用于防控鸭圆环病毒病的疫苗，使用所述灭活疫苗免疫鸭21天后，可诱导鸭产生高水平的针对鸭圆环病毒的特异性抗体，能有效抵抗鸭圆环病毒感染。所述灭活疫苗免疫原性好，免疫保护率高达到100％。该疫苗的推广应用有利于预防和控制鸭圆环病毒在鸭群中的感染和流行，具有广阔的应用前景。

Description

一种鸭圆环病毒毒株及其灭活疫苗制备方法

技术领域

本发明属于病毒疫苗株技术领域，具体涉及一种鸭圆环病毒毒株及其灭活疫苗制备方法。

背景技术

鸭圆环病毒(duck circovirus，DuCV)为无囊膜、二十面体对称的动物病毒颗粒，其基因组为单股负链环状DNA，为最小的致病性动物病毒，为圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属(circovirus)的成员。该病毒是近年来发现的严重影响鸭生长性能及机体免疫应答能力的重要病原，2003年首次在德国报道以来，世界各地如美国、德国、韩国及我国等多个国家和地区相继出现感染的报道。我国由本申请人于2008年首次在饲养的鸭群中检测到了鸭圆环病毒。目前已知该病毒在鸭群中广泛存在，不同品种及生长阶段的鸭均可感染。鸭感染圆环病毒后多表现为生长迟缓、被毛杂乱，组织病理学观察可见鸭免疫系统受到损伤，临床上还发现鸭圆环病毒检测为阳性的病例，多存在其他病原混合感染的现象。

鸭圆环病毒基因组全长为1988～1996nt之间，含6个200nt以上的ORF，分别为ORFV1、ORFV2、ORFV3、ORFC1、ORFC2、ORFC3。ORF V1编码氨基酸推导序列为292aa的rep蛋白，该蛋白与病毒的复制有关，在ORF V1的下游有1个TATA盒，可能在rep蛋白表达的控制和调节过程中发挥作用；ORF C1编码257aa的cap蛋白，为病毒的核衣壳蛋白，其氨基端为精氨酸富集的强碱性氨基酸区域，这与其它圆环病毒类似，在该基因的下游发现1个多聚腺苷信号。在编码区外还存在2个与病毒复制、增殖相关的基因间区：一个位于ORF V1和ORF C1的3′端之间的区域(927～1159nt)，它包含4个正向重复序列，该序列可能与病毒的包装效率有关；另一个基因间区位于ORF V1和ORF C1的5′端之间的区域(1935～48nt)，由2个反向的重复序列构成了一个发夹结构，在茎环结构的下游有2个6碱基重复序列ACTCCG，该重复序列是rep蛋白的连结位点，与病毒的复制相关。

研究表明，鸭群中流行的鸭圆环病毒呈现生态多样性。应用建立的基因分型方法对鸭圆环病毒进行分子进化分析表明，鸭群中流行的圆环病毒存在两个大的进化谱系(DuCV1和DuCV2)，且两个进化谱系又可进一步分为五个基因型(DuCV1a、DuCV1b和DuCV2a、DuCV2b、DuCV2c)。

到目前为止，还未见鸭圆环病毒能在SPF鸡胚、鸭胚等各种禽源成纤维细胞及其他传代细胞成功获得稳定培养的报道。即国内外还没有学者能通过上述培养体系获得该病毒的体外培养毒株。因此，这严重影响了该病治病机理研究及相关疫苗研发的进程，极大阻碍了该病的有效防控。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭圆环病毒毒株FJ1815，所述毒株FJ1815可实现体外稳定增殖培养且具有较好免疫原性。

本发明的目的还在于提供一种鸭圆环病毒灭活疫苗及其制备方法和应用，基于上述毒株FJ1815制备的灭活疫苗具有安全性良好，诱导高水平抗体产生的特点，解决了当前该病无法预防的现状。

本发明提供的一种鸭圆环病毒毒株FJ1815，duck circovirus，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的保藏编号为CGMCC No.16283。

本发明提供了一种鸭圆环病毒毒株FJ1815的培养方法，包括以下步骤：

A.从鸭新鲜血中分离培养外周血淋巴细胞；

B.将所述的鸭圆环病毒毒株FJ1815接种至步骤A中分离培养的外周血淋巴细胞中进行扩大培养，待80％的淋巴细胞出现细胞病变后将细胞回收，经冻融和离心，取上层液为鸭圆环病毒毒株FJ1815病毒液。

优选的，所述扩大培养时，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的接种量为感染复数1。

优选的，所述离心的转速为6000r/min；所述离心的时间为30min；所述离心的温度为4℃。

本发明提供的一种鸭圆环病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述所述培养方法制备的鸭圆环病毒毒株FJ1815病毒液灭活，得到灭活病毒液；

2)将所述灭活病毒液和佐剂混合、乳化，得到鸭圆环病毒灭活疫苗。

优选的，所述步骤2)中灭活用灭活剂为福尔马林溶液；所述福尔马林溶液的体积浓度为0.1％。

优选的，所述步骤2)中灭活的温度为37℃；所述灭活的时间为24h。

优选的，所述步骤2)中所述灭活病毒液和佐剂混合的方法是将灭活病毒液和吐温-20混匀制成水相，将白油、司班-80和硬脂酸铝制成的油相；将所述水相和油相按体积比1:1.5的比例混合。

优选的，所述步骤2)中灭活病毒液和吐温-20混的体积比为96:4；所述白油、司班-80的体积和硬脂酸铝的质量比为92ml：6ml：2g。

本发明提供的所述的制备方法制备得到的鸭圆环病毒灭活疫苗。

本发明提供的一种鸭圆环病毒毒株FJ1815，duck circovirus，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的保藏编号为CGMCC No.16283。本发明提供的鸭圆环病毒毒株FJ1815是通过体外细胞培养的方法从鸭圆环病毒阳性样品中分离获得并建立了稳定的培养方法。利用该系统分离获得一株鸭圆环病毒FJ1815株，并应用该毒株制备灭活疫苗，用于鸭圆环病毒引起的疾病的预防。实验证明：分离的毒株FJ1815株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫番鸭后能产生较高的抗体水平。

本发明还提供了所述的制备方法制备得到的鸭圆环病毒灭活疫苗，以保藏编号为CGMCC No.16283的病毒株作为抗原制备的灭活疫苗，有效解决了当前该病无法预防的现状，减少了因该病导致的生长不良鸭的数量，显著降低了鸭圆环病毒对鸭免疫系统的损伤程度及免疫应答能力的抑制效果，提高了鸭群的生长效率及种蛋鸭的产蛋性能，极大提高了的鸭养殖生产的经济收益。该疫苗生产工艺简便快捷，适于规模化批量生产；该疫苗生物安全性高，疫苗的使用对鸭和周边环境不会产生任何不良影响；该疫苗具有良好的免疫效果，接种后可有效保证鸭维持良好的生长性能，疫苗稳定高，保质期可达12个月。

生物材料保藏信息

鸭圆环病毒毒株(duck circovirus)，本发明所述的鸭圆环病毒毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年8月20日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.16283，毒株编号为FJ1815。

附图说明

图1为组织样品中鸭圆环病毒琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；

图2为外周血淋巴细胞感染鸭圆环病毒形成的细胞病变，其中图2-A为空白对照细胞的病变情况，图2-B为感染鸭圆环病毒FJ1815株细胞的病变情况；

图3为番鸭感染鸭圆环病毒的临床情况，其中图3-A为空白对照组番鸭感染鸭圆环病毒的临床情况，图3-B为免疫组番鸭感染鸭圆环病毒的临床情况，图3-C为攻毒对照组番鸭感染鸭圆环病毒的临床情况；

图4为番鸭感染鸭圆环病毒体重变化情况。

具体实施方式

本发明提供的一种鸭圆环病毒毒株FJ1815，duck circovirus，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的保藏编号为CGMCC No.16283。所述鸭圆环病毒毒株FJ1815从中国福建某鸭场表现生长迟缓、羽毛凌乱的鸭群中，首次应用体外细胞培养系统外周血淋巴细胞分离获得。经3轮蚀斑纯化得到一株免疫原性良好的疫苗株，应用鸭圆环病毒特异性引物对获得的毒株进行PCR鉴定、基因组序列测定、电镜负染观察等实验，最终确定鉴定该病毒为鸭圆环病毒(duck circovirus)。通过分离实验表明：鸭圆环病毒毒株DuCV-FJ1815在鸭外周血单核细胞培养物(外周血淋巴细胞)中能有效增殖并形成明显的细胞病变，但所述病毒株不能在鸭胚、鸡胚、鹅胚、不同禽胚成纤维细胞及Vero、BHK-21、293T及MDCK等不同传代细胞系中稳定增殖。通过动物实验表明，本发明所分离的鸭圆环病毒感染鸭可导致生长迟缓及免疫系统损伤，宿主的免疫应答活性受到影响。

本发明还提供了一种适合鸭圆环病毒毒株FJ1815体外增殖培养的方法，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的培养方法，包括以下步骤：

A.从鸭新鲜血中分离培养外周血淋巴细胞；

B.将所述的鸭圆环病毒毒株FJ1815接种至步骤A中外周血淋巴细胞中进行扩大培养，待80％的淋巴细胞出现细胞病变后将细胞回收，冻融和离心，得到鸭圆环病毒毒株FJ1815病毒液。

在本发明中，从鸭新鲜血中分离培养外周血淋巴细胞的方法优选包括以下步骤：将无菌采集的鸭新鲜血与PBS缓冲液按体积比1：1混合后，铺在淋巴细胞分离液上层，通过水平离心后，将白色的细胞层与PBS的缓冲液混合，离心10min后去掉上清，细胞沉淀用细胞培养液重悬，转入培养瓶进行培养，得到外周血淋巴细胞。所述白色的细胞层与PBS的缓冲液的体积比优选为1～2：15～20，更优选为1：15。所述水平离心的转速优选为1,500r/m，所述水平离心的时间优选为10min。所述细胞培养液为RPMI1640培养基。

在本发明中，接种的鸭圆环病毒毒株FJ1815优选为毒株种子液；所述毒株种子液的制备方法优选为将鸭圆环病毒毒株FJ1815种毒与PBS缓冲液按体积比为1：3的比例制备成混悬液，取上清接种至上述培养好的外周血淋巴细胞，待80％的淋巴细胞出现细胞病变后将细胞回收，反复冻融，收集的细胞液为毒株种子液。所述鸭圆环病毒毒株FJ1815种毒的浓度优选为≥10⁴PFU/0.1ml。

在本发明中，所述扩大培养时，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的接种量优选为感染复数1。所述离心的转速优选为6000r/min；所述离心的时间优选为30min；所述离心的温度优选为4℃。

1)将所述培养方法制备的鸭圆环病毒毒株FJ1815病毒液灭活，得到灭活病毒液；

在本发明中，所述灭活用灭活剂优选为福尔马林溶液；所述福尔马林溶液的体积浓度优选为0.1％。所述灭活的温度优选为37℃；所述灭活的时间优选为24h。所述灭活病毒液的浓度优选为10⁶PFU/mL。

在本发明中，所述灭活病毒液和佐剂混合的方法是将灭活病毒液和吐温-20混匀制成水相，将白油、司班-80和硬脂酸铝制成的油相；将所述水相和油相按体积比1:1.5的比例混合。所述灭活病毒液和吐温-20混的体积比优选为96:4；所述白油和司班-80的体积与硬脂酸铝的质量比优选为92ml：6ml：2g。

本发明提供的所述的制备方法制备得到的鸭圆环病毒灭活疫苗。所述疫苗经检验表明，应用分离获得的鸭圆环病毒FJ1815株制备的灭活疫苗性状稳定，保质期可大12个月以上、安全性良好，鸭免疫后不出现任何不良反应，且可诱导产生高水平的抗体，获得抵抗鸭圆环病毒感染的能力。

基于所述灭活疫苗的生物性能，本发明优选将所述灭活疫苗在防治鸭圆环病毒感染中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一种鸭圆环病毒毒株及其灭活疫苗制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

鸭圆环病毒DuCV-FJ1815毒株的分离和鉴定

1实验材料

实验所用的临床样品来源于福建某鸭场表现生长迟缓、被毛杂乱的110d番鸭，采集时间为2018年4月。鸭外周血淋巴细胞来源于90日龄健康番鸭，用含RPMI1640培养基饲养。

2引物的设计

参照GenBank基因数据库中已有的鸭圆环病毒序列，使用Primer5.0设计一对特异性鉴定引物，其核苷酸序列如下：上游引物P15'-cggcgcttgtactccgtactc-3'(SEQ IDNo.1)，下游引物P25'-cccgcgtggtttgtatacttg-3'(SEQ ID No.2)，上述引物委托福州尚亚生物有限公司合成。

3临床样品的采集与处理

无菌采集具有典型症状的法氏囊及脾脏等器官，剪碎后按1:5[W(g)/V(ml)]比例加入含双抗(100U/mL青霉素，100g/mL链霉素)的灭菌PBS缓冲液进行研磨，制成悬液，反复冻融3次，8000g离心10min。获得的上清液用0.45μm过滤器进行除菌，分装冻存于-80℃备用。

4组织样品中鸭圆环病毒PCR检测

应用商品化病毒DNA提取试剂盒提取样品中的DNA，以获得的DNA为模板，按照PCRAmplification kit(Thermo公司)配制PCR反应体系进行病毒检测。检测体系为25μl反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μl；dNTP mixture(2.5m mol/L每种原料)2μL；引物P1和P2(均10pmol/μL)各0.5μL；DNA模板2μL；Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL；dH₂O补加至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；随后进行94℃45s；57℃45s；72℃1min循环，共循环35次，扩增循环结束后72℃7min。反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(图1)。由图1可见，成功从样品中扩增到大小约620bp左右的条带，与预期扩增片段大小相符。

将上述扩增产物克隆到pMD 18-T载体上送至福州铂尚生物技术有限公司进行测序。测序结果经BLAST比对分析表明，扩增片段与GenBank中鸭圆环病毒序列同源性最高，序列相似性在93.6％～99.8％之间。由此可见，该样品中鸭圆环病毒核酸阳性。

5外周血淋巴细胞的制备

无菌采集10ml鸭全血，与等体积的PBS溶液混匀，将得到的混合液铺到含Ficoll溶液的离心管中，每只离心管各10ml稀释血液。将上述液体置于高速离心机中进行2,000rpm离心20min。用吸管将白色的细胞吸取在另一干净的50ml离心管中，加入15mL PBS溶液，在1500rpm离心10min后去掉上清，再加入培养基进行清洗。最后加入5ml培养基重悬细胞，进行铺板培养。

6病毒的分离培养

将制备好的圆环病毒疑似感染样品悬液上清接种培养好的鸭外周血淋巴细胞，于37℃条件下感染。60min后去除样品上清，加入RPMI1640培养基，于37℃温箱培养观察。如接种细胞在第5d未出现细胞病变，将细胞冻融3次后，收集细胞和培养液继续传代培养。在外周血淋巴细胞上连续传代5代后，出现明显的细胞病变(图2)，由图2可见，细胞接种鸭圆环病毒样品后表现为皱缩、脱落以及细胞核固缩，感染3d后可引起75％的细胞死亡。参照步骤4对第5代后不同代次的细胞培养物进行PCR检测，均能扩增出明显的鸭圆环病毒特异性目的片段，分别收集不同代次的细胞培养物冻存于-80℃备用。

鸭圆环病毒蚀斑纯化

采集新鲜的鸭全血，分离外周血淋巴细胞，按1.2×10⁶个/孔将获得的外周血淋巴细胞分装于六孔细胞板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。将步骤6中收获的鸭圆环病毒细胞培养物作10倍梯度稀释至10^-8，取10^-4～10^-8稀释的病毒，每个稀释度做2个重复，同时设置接种PBS的阴性对照组，置于37℃，5％CO₂的温箱吸附40～60min后，去除DuCV细胞培养物，加入含0.1％低熔点琼脂糖的培养基，每孔加入2.5mL，于室温冷却凝固后，将六孔板倒置放入37℃，5％CO₂的温箱培养观察，并记录细胞病变情况。

细胞培养2d后开始出现病毒蚀斑，培养3d后呈现明显的蚀斑。选择病毒蚀斑个数较少(10个左右)的细胞孔，标记蚀斑的位置。随后在显微镜观察的同时，用无菌移液器枪头将所标记的蚀斑位置对应的琼脂糖吸取至含适量RPMI1640培养基的离心管中，反复冻融3次后，将该病毒液通过外周血淋巴细胞培养增殖两代，获得的病毒再进行蚀斑纯化2次，即获得蚀斑纯化的鸭圆环病毒株，命名为DuCV-FJ1815毒株。

7病毒培养稳定性

参照步骤6的方法对获得的蚀斑纯化克隆毒株进行培养，连续传代10代后，通过实时荧光定量PCR测定第5～10代的细胞培养物中的病毒量。测定引物分别为：上游引物5'-ggcgaagagcggcaacta-3'(SEQ ID No.3)，下游引物5'-ccgacgatagcgaacttgc-3'(SEQ IDNo.4)。通过SYBR Green实时荧光定量PCR检测发现，病毒量在1×10^8.2～1×10⁹拷贝/μL，可见病毒在外周血淋巴细胞能稳定、有效增殖，收获各代次细胞培养物作为种子液，冻存-80℃备用。

综合以上鉴定和分析，DuCV-FJ1815毒株为鸭圆环病毒，能在鸭外周血淋巴细胞上进行稳定而有效的增殖。该毒株已于2018年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏编号为CGMCC No.16283。

实施例2

鸭圆环病毒FJ1815株灭活疫苗的制备

1病毒的增量培养

无菌采集鸭全血，提取外周血淋巴细胞，用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI1640培养基进行铺板培养。待细胞丰度达到80％时，弃去培养基，按感染复数为1将鸭圆环病毒的种子液接种外周血淋巴细胞，用含2％胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO₂培养，当细胞病变达到75％时，反复冻融3次后，10000g离心10min，去除细胞碎片，收取上清得到鸭圆环病毒液，对病毒液中的病毒含量进行测定后保存于-80℃备用。

2病毒的灭活

在病毒含量合格的病毒液中(≥10⁶PFU/mL)按0.1％(V/V)比例加入甲醛，摇匀后置于37℃灭活24h，对灭活的病毒液进行无菌性检验后保存于4℃备用。

将灭活的病毒液按上述步骤1的方法接种外周血淋巴细胞，同时设置阴性对照，于37℃、5％CO₂培养5d。如此盲传3代，对每代的培养物提取DNA，参照实施例1中步骤4进行PCR检测细胞培养物中是否存在鸭圆环病毒核酸。如果均为阴性，表明病毒液灭活彻底。

3灭活疫苗的制备

油相的制备油相包含优质白油、司班-80及硬脂酸铝(依次按92ml:6ml:2g的比例混合)，先将白油加热至60～70℃后，缓慢加入司班-80，混匀后再加入硬脂酸铝，并实时搅拌均匀，冷却后即为油相；

水相的制备水相包含灭活的病毒抗原液和吐温-20(V:V＝96:4)，将吐温-20缓慢的加入灭活的病毒抗原液中，并实时搅拌均匀，即为水相；

混合与乳化按V:V＝1:1.5的比例将水相缓慢加入到油相中，并实时搅拌，充分混匀后，将混合液转移到胶体磨中，以10000rpm的转速进行乳化3min，所获乳状悬液即为鸭圆环病毒油乳剂灭活疫苗。

通过上述方法制备的疫苗经检验表明，应用分离获得的鸭圆环病毒FJ1815株制备的灭活疫苗性状稳定，保质期可大12个月以上、安全性良好，鸭免疫后不出现任何不良反应，且可诱导产生高水平的抗体，获得抵抗鸭圆环病毒感染的能力。

实施例3

疫苗的效力检验

1灭活疫苗的免疫原性试验

(1)疫苗安全性检验

按照步骤4和商品化鸭圆环病毒抗体检测试剂盒的方法对3周龄左右的番鸭进行抗原抗体阴性筛选，选取40只抗原抗体阴的番鸭随机分成4组，每组10只，进行鸭圆环病毒FJ1815株灭活疫苗的安全性检验评价试验。第一组每只1头份(0.5ml乳化疫苗)，第二组每组2头份，第三组每只3头份，第四组每天注射细胞维持液0.5ml。免疫后观察7天，每天观察番鸭精神状态及临床表现，并记录采食情况、体重变化。

鸭圆环病毒FJ1815株灭活疫苗免疫番鸭后，正常免疫状态(1头份)及高剂量免疫状态(2头份及3头份)的各免疫组番鸭精神状态良好，采食正常，无明显的局部和全身反应，体重变化与对照组差异不明显(表1)，说明该疫苗对免疫番鸭安全性良好。

表1灭活疫苗免疫后番鸭体重变化情况

(2)抗体效价

为评估鸭圆环病毒FJ1815株灭活疫苗的免疫效果，将1日龄番鸭分为4组，每组15只，分别进行如下处理：

第一组：取鸭圆环病毒灭活疫苗原液倍比稀释液，对15只1d番鸭进行单次免疫，每只0.5mL皮下注射(0.5头份)，14d及28d采集血清检测中和抗体效价。

第二组：取鸭圆环病毒灭活疫苗原液，对15只1d番鸭进行单次免疫，每只0.5mL皮下注射(1头份)，14d及28d采集血清检测中和抗体效价。

第三组：取鸭圆环病毒灭活疫苗原液，对15只1d番鸭进行单次免疫，每只1mL皮下注射(2头份)，14d及28d采集血清检测中和抗体效价。

第四组：取灭菌生理盐水，对15只1d番鸭进行单次免疫，每只0.5mL皮下注射，14d及28d采集血清检测中和抗体效价。

血清中和抗体效价检测方法如下：

经颈静脉途径采集15只番鸭1ml静脉血，置于37℃放置1h后，3000rpm离心5min收集血清用于抗体检测。

将获得的鸭血清于56℃灭活30min，用灭菌生理盐水进行倍比稀释，在向每个稀释度中加入等体积的含200TCID₅₀/0.2mL病毒液，混匀后置于37℃孵育1h。

将上述病毒血清混合液接种外周血淋巴细胞，每个稀释度接种3个孔，37℃孵育2h后，弃病毒血清混合液，加入含2％胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO₂培养。同时设置血清及病毒阳性接种孔。观察培养5天，记录细胞病变情况。按照Reed-Muench法计算中和效价。

结果如表2所示，用实施例2制备的疫苗0.5头份免疫番鸭14d，番鸭对鸭圆环病毒FJ1815株(病毒滴度200TCID₅₀/0.2mL)的平均中和抗体效价>1:16；28d后番鸭血清中的平均中和抗体效价>1:32；用实施例2制备的疫苗1头份免疫番鸭14d，番鸭对鸭圆环病毒FJ1815株(病毒滴度200TCID₅₀/0.2mL)的平均中和抗体效价>1:24；28d后番鸭血清中的平均中和抗体效价>1:48；用实施例2制备的疫苗2头份免疫番鸭14d，番鸭对鸭圆环病毒FJ1815株(病毒滴度200TCID₅₀/0.2mL)的平均中和抗体效价>1:24；28d后番鸭血清中的平均中和抗体效价>1:48；对照组鸭血清中和抗体效价均<1:2。以上结果表明，分离的毒株FJ1815株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫番鸭后能产生较高的抗体水平。不同剂量免疫效果表明，1头份与0.5头份免疫剂量之间的单次免疫效果在免疫14d和28d均差异明显，与2头份的免疫效果差异不明显。

表2鸭圆环病毒FJ1815株灭活疫苗免疫抗体效价结果。

2攻毒保护实验

为评估鸭圆环病毒FJ1815株灭活疫苗的免疫效果，将1日龄番鸭分为2组，每组15只，分别进行如下处理：

第一组：免疫组，取实施例2制备的鸭圆环病毒灭活疫苗原液对15只1d番鸭进行单次免疫，每只0.5mL皮下注射(1头份)。免疫14d后，用鸭圆环病毒腿部肌肉接种番鸭，每只接种病毒量为2×10⁵拷贝/mL，观察35d，记录鸭临床表现及体重变化情况。

第二组：攻毒对照组，取灭菌生理盐水注射15只番鸭，每只0.5mL皮下注射。14d后用鸭圆环病毒腿部肌肉接种番鸭，每只接种病毒量为2X10⁵Copies/mL，观察35d，记录鸭临床表现及体重变化情况。

第三组：空白对照组，取灭菌生理盐水注射15只番鸭，每只0.5mL皮下注射。14d后用灭菌生理盐水腿部肌肉接种番鸭，每只接种病毒量为0.5mL，观察35d，记录鸭临床表现及体重变化情况。

攻毒保护试验结果表明空白对照组合免疫组番鸭生长良好，羽毛光亮，而攻毒对照组番鸭体型消瘦，被毛杂乱(图3)。免疫组和空白对照组番鸭在整个试验过程中的体重增长变化情况类似，组间差异不明显，而攻毒组织在攻毒后14d开始出现体重增长迟缓(图4)，到攻毒后21d时，免疫组和空白对照组是各自组攻毒前鸭平均体重的8.7倍左右，而攻毒对照组的体重为该组攻毒前的6.25倍；至攻毒后35d时，免疫组和空白对照组鸭的平均体重均增加到攻毒前体重的15倍以上，而较免疫组攻毒对照组的体重为该组攻毒前的12.4倍；体重增加差异明显，差异可达25％左右。通过该实验可知，鸭圆环病毒灭活疫苗可为番鸭提供有效的免疫保护作用，保护番鸭减少因感染鸭圆环病毒而引起的生长迟缓带来的损失，为企业和养殖户带来非常可观的经济效益。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鸭圆环病毒毒株及其灭活疫苗制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggcgcttgt actccgtact c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccgcgtggt ttgtatactt g 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgaagagc ggcaacta 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgacgatag cgaacttgc 19

Claims

1.一种鸭圆环病毒毒株FJ1815，duckcircovirus，其特征在于，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的保藏编号为CGMCC No.16283。

2.一种鸭圆环病毒毒株FJ1815的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.从鸭新鲜血中分离培养外周血淋巴细胞；

B.将权利要求1所述的鸭圆环病毒毒株FJ1815接种至步骤A中外周血淋巴细胞中进行扩大培养，待80％的淋巴细胞出现细胞病变后将细胞回收，冻融和离心，取上层液得到鸭圆环病毒毒株FJ1815病毒液。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述扩大培养时，所述鸭圆环病毒毒株FJ1815的接种量为1个感染复数。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为6000r/min；所述离心的时间为30min；所述离心的温度为4°C。

5.一种鸭圆环病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求2所述培养方法制备的鸭圆环病毒毒株FJ1815病毒液灭活，得到灭活病毒液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中灭活用灭活剂为福尔马林溶液；所述福尔马林溶液的体积浓度为0.1％。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中灭活的温度为37℃；所述灭活的时间为24h。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中灭活病毒液和佐剂混合的方法是将灭活病毒液和吐温-20混匀制成水相，将白油、司班-80和硬脂酸铝制成的油相；

将所述水相和油相按体积比1:1.5的比例混合。

9.根据权利要求5或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中灭活病毒液和吐温-20混匀的体积比为96:4；所述白油和司班-80的体积与硬脂酸铝的质量比为92ml：6ml：2g。

10.权利要求5～9任意一项所述的制备方法制备得到的鸭圆环病毒灭活疫苗。