CN113248574A - 一种高效表达a型塞内卡病毒结构蛋白的方法 - Google Patents

一种高效表达a型塞内卡病毒结构蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种高效表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法。本发明首先对编码A型塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因进行原核表达密码子优化，并借助小泛素样融合蛋白，获得了在大肠杆菌中同时可溶性表达三种结构蛋白的单个质粒；其次，在大肠杆菌中转入分子伴侣质粒和上述A型塞内卡病毒结构蛋白质粒，进一步提高了A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达，并解决了目标蛋白表达量不均一的问题，获得的目标蛋白约占菌体总蛋白25％以上；由表达获得的三种结构蛋白配制获得的塞内卡病毒病亚单位疫苗，能够激发猪体产生较高水平的中和性抗体，对国内A型塞内卡流行毒具有良好的保护作用。

Description

一种高效表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高效表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法。
背景技术
A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)也称塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus，SVV)，属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属，其基因组为单链正股RNA，基因组长度约为7.2kb。SVA唯一的开放阅读框(ORF)用于编码多聚前体蛋白，具有小RNA病毒典型的L-4-3-4结构，包含L前体蛋白及结构蛋白的P1区和非结构蛋白的P2区和P3区，P1区蛋白在病毒2A、3C蛋白酶和宿主蛋白酶水解下可产生3种结构蛋白和7种非结构蛋白。VP0、VP1和VP3作为病毒衣壳的表面结构蛋白具有良好的免疫原性。
SVA最初被认为是细胞培养过程的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。2007年SVA被发现是引起加拿大发生的猪原发性水疱病(PIVD)的致病病原，SVA感染猪后引起鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床症状，与口蹄疫症状无法区分，困扰口蹄疫防控，严重危害养猪业发展。尽快研发疫苗成为防控该病大范围流行最迫切、有效的方法。
塞内卡灭活疫苗是塞内卡田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，具有良好的免疫保护效果。但是，传统的灭活疫苗在生产制备过程中存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题，亟需研制更加安全、有效的新型塞内卡病毒疫苗。
塞内卡病毒结构蛋白负责组装病毒衣壳，决定抗原特异性，是病毒重要的抗原成份。与小RNA病毒科的其它病毒相似，塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1在体外混合后，一部分会自行装配形成空衣壳(病毒样颗粒)，其形态、结构与真实病毒粒子相同或相似，保有病毒粒子空间构象，但不含病毒核酸，无法进行复制，也不具有感染性。塞内卡病毒空衣壳含有病毒的特异性抗原表位，能模拟天然病毒被宿主抗原提呈细胞的识别过程，有效刺激机体产生很强的免疫应答，是更加安全有效的疫苗候选者。但是，相较于其他小RNA病毒科病毒(口蹄疫病毒)的病毒空衣壳，提高塞内卡病毒空衣壳的产率和纯度相对比较困难，即使采用制备其他小RNA病毒科病毒(口蹄疫病毒)空衣壳的相同体系，仍然无法提高塞内卡病毒空衣壳的产率和纯度。
目前通过基因工程技术，利用大肠杆菌表达系统制备塞内卡病毒空衣壳已有文献报道。大肠杆菌表达系统具有成本低、细胞生长快、可规模放大等特点，但其表达产物易形成包涵体，导致生物活性较差，而获得的目的蛋白的纯度较低。因此提高SVA结构蛋白的表达纯化量十分必要。有研究表明，在大肠杆菌表达系统中，通过将不同融合标签结合使用，可以提高目的蛋白的表达量和病毒样颗粒的组装效率，例如专利(CN108642021B)公开了在A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3中引入SUMO，分别构建了VP0、VP1、VP3的表达质粒，并在SUMO VP1基因的N端再次融合GST得VP1重组载体，并与VP0和VP3的表达质粒共同转染的表达菌表达。但是分别构建多个表达质粒、借助多种融合蛋白、通过多种抗性筛选工程菌株步骤较为复杂。也有研究表明分子伴侣能够提高目的蛋白的可溶性表达，例如文献(A型口蹄疫结构蛋白VP1可溶性表达及O型口蹄疫结构蛋白的融合表达[D]，崔颖磊)公开了使用分子伴侣促进A型口蹄疫结构蛋白VP1可溶性表达的策略，但是分子伴侣促进目的蛋白可溶性表达的结果也存在一定的随机性，相反可能会抑制其他酶或蛋白的可溶性表达；而且在蛋白纯化过程中分子伴侣污染现象严重。
发明内容
针对上述问题，本发明首先以编码A型塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因序列为基础进行原核表达密码子优化，并借助小泛素样融合蛋白(SUMO)，筛选出单个质粒在大肠杆菌中同时可溶性表达这三种结构蛋白；再次，在大肠杆菌中转入表达分子伴侣和表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒，构建目标蛋白与分子伴侣蛋白的共表达体系，进一步提高了A型塞内卡病毒结构蛋白的表达量和可溶性比例，同时改善了上述结构蛋白表达量不均一的问题；获得的目标蛋白约占菌体总蛋白25％以上；由这三种结构蛋白配制获得的塞内卡病毒病亚单位疫苗，能够激发猪体产生较高水平的中和性抗体，对国内A型塞内卡流行毒具有良好的保护作用。
本发明首先以编码A型塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因序列为基础进行原核表达密码子优化，并借助小泛素样融合蛋白(SUMO)，通过单种抗生素筛选出单个质粒在大肠杆菌中同时可溶性表达这三种结构蛋白，大大提高了目标蛋白制备效率；接下来，在大肠杆菌中转入分子伴侣和表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒，构建目标蛋白与分子伴侣蛋白的共表达体系，进一步提高了A型塞内卡病毒结构蛋白的表达量和可溶性比例，同时改善了上述结构蛋白表达量不均一的问题；并且改善了分子伴侣的污染问题，获得了高纯度的目的蛋白；由这三种塞内卡病毒结构蛋白配制的塞内卡病毒病疫苗，能够激发猪体产生较高水平的中和性抗体，对国内A型塞内卡流行毒具有良好的保护作用。
具体发明内容为：
第一方面，本发明提供了一种分子伴侣在促进A型塞内卡病毒结构蛋白表达中的应用，所述分子伴侣包括DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Triggerfactor蛋白中的一种或几种的组合。
优选地，所述分子伴侣由groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白组成。
优选地，所述A型塞内卡病毒结构蛋白包括A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1。
优选地，所述A型赛内卡病毒为SVA/CH-FJ-2017。
优选地，所述结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本发明提供了一种含有分子伴侣的重组载体在促进A型塞内卡病毒结构蛋白表达中的应用，所述分子伴侣包括DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Trigger factor蛋白中的一种或几种的组合。
优选地，所述分子伴侣由groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白组成。
优选地，所述A型塞内卡病毒结构蛋白包括A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1。
优选地，所述A型赛内卡病毒为SVA/CH-FJ-2017。
优选地，所述结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第三方面，本发明提供了一种含有分子伴侣的重组微生物在促进A型塞内卡病毒结构蛋白表达中的应用，其特征在于，所述分子伴侣包括DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Trigger factor蛋白中的一种或几种的组合。
优选地，所述重组微生物为重组大肠杆菌。
优选地，所述分子伴侣由groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白组成。
优选地，所述A型塞内卡病毒结构蛋白包括A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1。
优选地，所述A型赛内卡病毒为SVA/CH-FJ-2017。
优选地，所述结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第四方面，本发明提供了一种用于可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白的基因工程菌，所述基因工程菌包含表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒和表达分子伴侣的质粒，所述分子伴侣包括DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Trigger factor蛋白中的一种或几种的组合。
优选地，所述分子伴侣由groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白组成。
优选地，所所述A型塞内卡病毒结构蛋白包括A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1。
优选地，所述A型赛内卡病毒为SVA/CH-FJ-2017。
优选地，所述结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第五方面，本发明提供了一种上述第四方面所述基因工程菌的制备方法，所述方法包括：将表达分子伴侣蛋白的质粒与表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒转化宿主，获得可同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白和分子伴侣蛋白的基因工程菌。
优选地，所述方法为：先将表达分子伴侣蛋白的质粒转化宿主，后用表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒转化表达分子伴侣蛋白的宿主，获得可同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白和分子伴侣蛋白的基因工程菌。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)设计编码融合标签蛋白基因序列THS，其中T为翻译起始区核苷酸序列，H为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，S为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(SUMO)的核苷酸序列；
(2)将步骤(1)所述的融合标签蛋白基因序列THS分别与编码A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因串联，形成三段融合目标蛋白基因序列THS-VP0、THS-VP3和THS-VP1；
(3)通过分子克隆技术将步骤(2)所述三段融合目标蛋白基因序列同时克隆入原核表达载体中，获得重组表达质粒；
(4)构建表达分子伴侣的质粒，将表达分子伴侣的质粒和步骤(3)所述的重组表达质粒转化大肠杆菌，获得基因工程菌。
优选地，所述重组表达质粒为pET-SVA-VP031。
优选地，所述THS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
第六方面，本发明提供了一种可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将权利要求3或4所述的基因工程菌，或将根据权利要求5或6所述方法构建获得基因工程菌进行发酵培养，诱导表达带有融合标签蛋白的塞内卡病毒结构蛋白；
b.破碎基因工程菌菌体后，回收上清液，亲和色谱层析分离纯化获得带有融合标签蛋白的塞内卡病毒结构蛋白；
c.酶切去除步骤b所述结构蛋白中的融合标签蛋白，再用亲和色谱层析分离纯化获得塞内卡病毒结构蛋白。
第七方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的方法制备获得的A型塞内卡病毒结构蛋白。
第八方面，本发明提供了一种上述第七方面所述的A型塞内卡病毒结构蛋白在制备塞内卡病毒病疫苗中的应用。
第九方面，本发明提供了一种用于预防塞内卡病毒感染的疫苗，所述疫苗包括述第七方面所述的A型塞内卡病毒结构蛋白。
优选地，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
本发明的有益效果是：
(1)本发明以编码A型塞内卡病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因序列为基础进行原核表达密码子优化，并借助小泛素样融合蛋白(SUMO)，筛选出单个质粒在大肠杆菌中同时可溶性表达这三种结构蛋白，提高了A型塞内卡病毒三种结构蛋白的表达效率；
(2)本发明发现分子伴侣(DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Trigger factor蛋白中的一种或几种的组合)能够进一步提高A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性比例；同时分子伴侣(groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白的组合)不仅能够显著促进A型塞内卡病毒三种结构蛋白的可溶性表达，而且解决了现有技术中A型塞内卡病毒三种结构蛋白表达量不均一的问题，实现了A型塞内卡病毒三种结构蛋白高效均一表达；
(3)本发明发现在所述大肠杆菌中同时表达分子伴侣和上述可溶性标签蛋白与结构蛋白VP0、VP3和VP1后，能够进一步提高目的蛋白的表达效率，使用亲和色谱层析分离纯化后，能够进一步提高目的蛋白的产量，提高病毒样颗粒的组装效率；并且改善了分子伴侣的污染问题，获得了高纯度的目的蛋白；
(4)构建方法简单，避免了成本较高的分子筛色谱层析纯化，不需要使用超速离心等复杂工艺，两步亲和纯化的回收率接近50％，使得以工业化规模制备纯化塞内卡病毒结构蛋白易于实现；
(5)以制备的A型塞内卡病毒结构蛋白组合物构建亚单位疫苗，能够激发猪体产生较高水平的中和性抗体，具有较好的免疫保护作用。
附图说明
图1分子伴侣表达质粒pA-KJEGro图谱；
图2分子伴侣表达质粒pTF图谱；
图3分子伴侣表达质粒pGTF图谱；
图4分子伴侣表达质粒pGro图谱；
图5分子伴侣表达质粒pKJGro图谱；
图6本发明所得的融合小泛素样修饰蛋白(SUMO)标签的塞内卡病毒结构蛋白表达效率SDS-PAGE鉴定结果；其中，M为分子量Marker；1和2分别为SVA/FJ(仅含有重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；3和4分别为SVA/FJ(仅含有重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；5和6分别为SVA/G-Tig(同时含有分子伴侣质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；7和8分别为SVA/G-Tig(同时含有分子伴侣质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；9和10分别为SVA/Tig(同时含有分子伴侣质粒pTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；11和12分别为SVA/Tig(同时含有分子伴侣质粒pTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；13和14分别为SVA/G-KJE(同时含有分子伴侣质粒pA-KJEGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；15和16分别为SVA/G-KJE(同时含有分子伴侣质粒pA-KJEGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；17和18分别为SVA/KJE(同时含有分子伴侣质粒pKJGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；19和20分别为SVA/KJE(同时含有分子伴侣质粒pKJGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；21和22分别为SVA/G(同时含有分子伴侣质粒pGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；23和24分别为SVA/G(同时含有分子伴侣质粒pGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清，上样量5μL；
图7本发明所得纯化的融合小泛素样修饰蛋白(SUMO)标签的塞内卡病毒结构蛋白的纯化SDS-PAGE鉴定结果；其中，M为分子量Marker；1为SVA/FJ(仅含有重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；2为SVA/G-Tig(同时含有分子伴侣质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；3为SVA/Tig(同时含有分子伴侣质粒pTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；4为SVA/G-KJE(同时含有分子伴侣质粒pA-KJEGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；5为SVA/KJE(同时含有分子伴侣质粒pKJGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；6为SVA/G(同时含有分子伴侣质粒pGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果，上样量5μL；
图8同时含有质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031所得的融合小泛素样修饰蛋白(SUMO)标签的塞内卡病毒结构蛋白，SDS-PAGE鉴定结果；其中M为分子量Marker；1为诱导前全菌裂解后的沉淀；2为诱导前全菌裂解后的上清；3为诱导后全菌裂解后的沉淀；4为诱导后全菌裂解后的上清，上样量5μL；
图9同时含有质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031所得的的亲和色谱纯化的带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白，经SUMO酶酶切后SDS-PAGE鉴定结果；其中，M为分子量Marker；1为亲和色谱纯化后的带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白；2为SUMO酶酶切后，不带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白，上样量10μL；
图10同时含有质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031所得的不带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白，经亲和色谱纯化后SDS-PAGE鉴定结果；其中，M为分子量Marker；1和2均为纯化的A型塞内卡病毒三种结构蛋白，上样量5μL；
图11同时含有质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031所得的塞内卡病毒结构蛋白自组装后透射电镜观察结果；
图12A型塞内卡病毒结构蛋白亚单位疫苗免疫动物中和抗体应答结果，其中Negative control为免疫PBS的动物血清；VLPs vaccine为本发明所述A型塞内卡病毒结构蛋白亚单位疫苗免疫的动物血清。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性SVA病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
A型塞内卡病毒SVA/CH-FJ-2017来自国家塞内卡病毒参考实验室。
质粒pA-KJEGro(共表达分子伴侣蛋白DnaK、DnaJ、groES、groEL、GrpE)、质粒pTF(表达分子伴侣蛋白Trigger factor)、质粒pGTF(共表达分子伴侣蛋白groEL、groES、Trigger factor)、质粒pGro(共表达分子伴侣蛋白groEL、groES)、质粒pKJGro(共表达分子伴侣蛋白DnaK、DnaJ、groEL、groES)由本实验室自行构建；其中所述质粒pA-KJEGro、pTF、pGTF、pGro、pKJGro的构建方法如下：
(1)由北京六合华大基因科技有限公司分别合成分子伴侣基因片段过渡质粒：pMV-dnaK-dnaJ、pMV-groESL、pMV-tig、pMV-grpE；分别对上述过渡质粒pMV-dnaK-dnaJ、pMV-groESL、pMV-tig、pMV-grpE进行酶切，DNA纯化回收目的片段；
(2)分子伴侣质粒的构建：
分子伴侣表达质粒pKJGro：将载体质粒pACYC184进行酶切，利用NEB公司的DNA重组试剂盒
Figure BDA0003061893550000081
HiFi DNA Assembly Master，将回收的质粒pMV-dnaK-dnaJ和pMV-groESL的DNA片段与载体片段进行同源重组DNA无缝连接，构建获得分子伴侣表达质粒pKJGro；
分子伴侣表达质粒pA-KJEGro：将构建的分子伴侣表达质粒pKJGro进行酶切，利用NEB公司的DNA重组试剂盒
Figure BDA0003061893550000082
HiFi DNA Assembly Master，将回收的质粒pMV-grpE的DNA片段与载体片段进行同源重组DNA无缝连接，构建获得分子伴侣表达质粒pA-KJEGro；
分子伴侣表达质粒pTF：将载体质粒pACYC184进行酶切，利用NEB公司的DNA重组试剂盒
Figure BDA0003061893550000083
HiFi DNA Assembly Master，将回收的质粒pMV-tig的DNA片段与载体片段进行同源重组DNA无缝连接，构建获得分子伴侣表达质粒pTF；
分子伴侣表达质粒pGTF：将载体质粒pACYC184进行酶切，利用NEB公司的DNA重组试剂盒
Figure BDA0003061893550000084
HiFi DNA Assembly Master，将回收的质粒pMV-groESL和pMV-tig的DNA片段与载体片段进行同源重组DNA无缝连接，构建获得分子伴侣表达质粒pGTF；
分子伴侣表达质粒pGro：将载体质粒pACYC184进行酶切，利用NEB公司的DNA重组试剂盒
Figure BDA0003061893550000085
HiFi DNA Assembly Master，将回收的质粒pMV-groESL的DNA片段与载体片段进行同源重组DNA无缝连接，构建获得分子伴侣表达质粒pGro；
(3)将上述分子伴侣质粒转化至E.coli DH5α，涂布于含特定抗生素的Luria-Bertanil(LB)固态培养基，37℃培养，挑选阳性克隆，送往生物公司测序鉴定重组质粒，其中分子伴侣表达质粒pA-KJEGro图谱如图1所示，分子伴侣表达质粒pTF图谱如图2所示，分子伴侣表达质粒pGTF图谱如图3所示，分子伴侣表达质粒pGro图谱如图4所示，分子伴侣表达质粒pKJGro图谱如图5所示。
本发明中相关术语的说明及解释：
术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698，优选BL21(DE3)。
术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。
本发明以A型塞内卡病毒SVA/CH-FJ-2017为例，将A型塞内卡病毒结构蛋白VP3，VP1，VP0(为VP4和VP2的基因融合)进行串联共表达，所述串联共表达是指把多个基因插入到同一个载体中共表达。串联共表达顺序包括但不限于VP3-VP1-VP0，可以为VP3，VP1，VP0之间的各种组合以及VP1，VP2，VP3，VP4之间的各种可能组合，例如可以是VP1-VP3-VP0的串联顺序，VP3-VP0-VP1的串联顺序，VP1-VP0-VP3的串联顺序，VP3-VP1-VP2-VP4的串联顺序，VP4-VP2-VP3-VP1的串联顺序等，优选VP0-VP3-VP1的串联顺序。其中所述结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的由A型塞内卡病毒株SVA/CH-FJ-2017结构蛋白VP0、VP3和VP1组合的亚单位疫苗。
本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。
本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
实施例1 A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达
1.A型塞内卡病毒结构蛋白重组表达载体的构建
(1)设计由下述原件串联组成的编码融合标签蛋白的基因序列THS，其中T为翻译起始区核苷酸序列，H为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，S为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(SUMO)的核苷酸序列；所述THS的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
(2)将上述THS基因序列分别与编码A型塞内卡病毒株SVA/CH-FJ-2017结构蛋白基因VP0、VP3、VP1按顺序串联，形成三段融合基因序列THS-VP0、THS-VP3和THS-VP1。
(3)由华大基因生物科技有限公司合成三段优化后的融合基因片段，并通过分子克隆技术将上述片段按VP0、VP3、VP1的顺序克隆入同一个pET30a载体，鉴定序列正确后获得重组表达质粒pET-SVA-VP031。
(4)用上述pET-SVA-VP031质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，获得pET-SVA-VP031质粒转化体，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至4mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，220转/分振荡培养12小时，从中取1mL菌液于-80℃保存，为重组表达质粒pET-SVA-VP031。
(5)分别构建获得表达不同分子伴侣的表达质粒pA-KJEGro、pTF、pGTF、pKJGro和pGro，并转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，然后在含有氯霉素(20μg/ml)的平板上培养，筛选获得表达不同分子伴侣的质粒转化体；将伴侣蛋白质粒转化体在含有20μg/ml氯霉素的液体培养基中培养，再用通常方法将其制备成感受态细胞；用重组表达质粒pET-SVA-VP031转化制备的感受态细胞，并于含有氯霉素(20μg/ml)和表达质粒选择性生长抗生素的平板上培养，筛选转化体；再将筛选获得的转化体涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至4mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，220转/分振荡培养12小时，从中取1mL菌液于-80℃保存。
2.A型塞内卡病毒结构蛋白的原核表达
取pET-SVA-VP031质粒转化体以及同时含有不同分子伴侣表达质粒和pET-SVA-VP031质粒转化体，分别接入含对应抗生素抗性的50mL的LB液体培养基，220rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1L的LB液体培养基中，37℃培养，等OD600值达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导蛋白表达。
本实施例所得的融合小泛素样修饰蛋白(SUMO)标签的塞内卡病毒结构蛋白表达效率SDS-PAGE鉴定结果如图6所示，其中，M为分子量Marker；1和2分别为SVA/FJ(仅含有重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；3和4分别为SVA/FJ(仅含有重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；5和6分别为SVA/G-Tig(同时含有分子伴侣质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；7和8分别为SVA/G-Tig(同时含有分子伴侣质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；9和10分别为SVA/Tig(同时含有分子伴侣质粒pTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；11和12分别为SVA/Tig(同时含有分子伴侣质粒pTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；13和14分别为SVA/G-KJE(同时含有分子伴侣质粒pA-KJEGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；15和16分别为SVA/G-KJE(同时含有分子伴侣质粒pA-KJEGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；17和18分别为SVA/KJE(同时含有分子伴侣质粒pKJGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；19和20分别为SVA/KJE(同时含有分子伴侣质粒pKJGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清；21和22分别为SVA/G(同时含有分子伴侣质粒pGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导前裂解全菌的沉淀和上清；23和24分别为SVA/G(同时含有分子伴侣质粒pGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的沉淀和上清，上样量5μL；实验结果显示，以上带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白在大肠杆菌中可溶共表达；其中相较于SVA/FJ组，SVA/KJE组、SVA/G-KJE组、SVA/G组和SVA/G-Tig组上清中目的蛋白可溶表达显著；而SVA/G-Tig组上清中目的蛋白可溶表达更显著，即分子伴侣质粒pGTF的转入显著提高了A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达，以上结果说明，共表达分子伴侣蛋白能够促进A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达。
3.A型塞内卡病毒结构蛋白的纯化
取上述诱导表达后的菌体，按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris，20mM咪唑，400mM NaCl，pH7.5)的比例重悬菌体，使用均质机以700bar压力破碎菌体2次。20,000g离心1h，取上清，通过12％SDS-PAGE电泳检测，上清用0.45μm孔径滤膜过滤后，用镍亲和柱(HisTrap FF，GE Healthcare Life Sciences)进行纯化。
缓冲液：20mM Tris，0.4M NaCl，pH8.0；
洗脱液：20mM Tris，0.4M NaCl，500mM咪唑，pH8.0。
样品为1.4L经过0.45μm孔径滤膜过滤后的经均质机破碎后的大肠杆菌菌体上清。
洗脱程序为：样品流穿后，淋洗液洗脱杂蛋白，洗脱液洗脱带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白(VP0，VP3，VP1)产物。
本发明所得纯化的融合小泛素样修饰蛋白(SUMO)标签的塞内卡病毒结构蛋白SDS-PAGE鉴定结果如图7所示，其中，M为分子量Marker；1为SVA/FJ(仅含有重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；2为SVA/G-Tig(同时含有分子伴侣质粒pGTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；3为SVA/Tig(同时含有分子伴侣质粒pTF和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；4为SVA/G-KJE(同时含有分子伴侣质粒pA-KJEGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；5为SVA/KJE(同时含有分子伴侣质粒pKJGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果；6为SVA/G(同时含有分子伴侣质粒pGro和重组表达质粒pET-SVA-VP031)诱导后裂解全菌的上清纯化结果，上样量5μL；实验结果显示，以上带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白在大肠杆菌中可溶共表达；其中相较于SVA/FJ组，SVA/KJE组、SVA/G-KJE组、SVA/G组和SVA/G-Tig组上清中目的蛋白可溶表达显著；而SVA/G-Tig组上清中目的蛋白可溶表达更显著，即分子伴侣质粒pGTF的转入显著提高了A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达；说明共表达分子伴侣蛋白groEL、groES、Triggerfactor能够显著促进A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达，并且杂蛋白含量较少，获得的三种结构蛋白的浓度比例较为均一，更有利于提高三种结构蛋白的的组装效率。
实施例2 A型塞内卡病毒结构蛋白的制备
1.A型塞内卡病毒结构蛋白的可溶性表达
(1)取出表达分子伴侣的质粒pGTF转化体和重组表达质粒pET-SVA-VP031的转化体，接入卡那霉素抗性的50mL的LB液体培养基，250rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1L的LB液体培养基中，37℃培养，等OD600值达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导蛋白表达。
本实施例所得的融合小泛素样修饰蛋白(SUMO)标签的塞内卡病毒结构蛋白SDS-PAGE鉴定结果如图8所示，其中M为分子量Marker；1为诱导前全菌裂解后的沉淀；2为诱导前全菌裂解后的上清；3为诱导后全菌裂解后的沉淀；4为诱导后全菌裂解后的上清，上样量5μL；实验结果显示，带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白在大肠杆菌中可溶共表达，且目的蛋白约占菌体可溶总蛋白的30％左右。
(2)校正发酵罐(德国赛多利斯CT5-2发酵罐)pH电极，配制4L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30min，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。
(3)第二天将400mL种子液接入发酵罐中，温度37℃，pH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。流加补料，将50％葡萄糖按30mL/小时的速度流加培养。通过调节转速，控制发酵罐内溶氧在30％-40％。培养至菌浓度达到OD600大约15左右时，将培养温度降至16℃加入终浓度0.5mM的IPTG诱导培养12小时。终菌液浓度OD600大约为45左右时下罐，离心收集菌体大约300g。
2.带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白的亲和色谱纯化
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris，20mM咪唑，400mM NaCl，pH7.5)的比例重悬菌体，使用均质机以700bar压力破碎菌体2次。30,000g离心1h，取上清，通过12％SDS-PAGE电泳检测，上清用0.45μm孔径滤膜过滤后，用镍亲和柱(HisTrap FF，GE Healthcare LifeSciences)进行纯化。
缓冲液：20mM Tris，0.4M NaCl，pH8.0；
洗脱液：20mM Tris，0.4M NaCl，500mM咪唑，pH8.0。
样品为1.4L经过0.45μm孔径滤膜过滤后的经均质机破碎后的大肠杆菌菌体上清。
洗脱程序为：样品流穿后，淋洗液洗脱杂蛋白，洗脱液洗脱带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白(VP0，VP3，VP1)产物。
取经本实施例方法纯化的SVA/G-Tig组样品20μL，加入5μL的5×Loading Buffer混匀，于100℃金属浴10min后取5μL于12％SDS-PAGE中电泳。随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，所得的亲和色谱纯化的带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白，经SUMO酶酶切后SDS-PAGE鉴定结果如图9所示，其中，M为分子量Marker；1为亲和色谱纯化后的带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白；2为SUMO酶酶切后，不带SUMO标签的塞内卡病毒结构蛋白，上样量10μL；SDS-PAGE鉴定结果显示，纯化获得了预期大小的融合目标蛋白；对该SDS-PAGE鉴定结果进行灰度扫描分析，SUMO VP0、SUMO VP3和SUMO VP1三者浓度比例较为均一。
3.去除SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白的亲和色谱纯化
取步骤2中四种带SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白的洗脱样品，在4℃用SUMO酶酶切12小时，将酶切后的含有A型塞内卡病毒结构蛋白的溶液流穿镍柱(HisTrap FF，GEHealthcare Life Sciences)，收集流穿液。SUMO标签结合于镍柱，不含SUMO标签的A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3在流穿液中。
取纯化的A型塞内卡病毒结构蛋白样品20μL，加入5μL的5×Loading Buffer混匀，于100℃金属浴10min后分别取5μL于12％SDS-PAGE电泳。随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图10，其中M为分子量Marker；1和2均为纯化的A型塞内卡病毒三种结构蛋白，上样量5μL。结果显示，纯化获得了预期大小的不含融合标签目标蛋白；对该SDS-PAGE鉴定结果进行灰度扫描分析，VP0、VP3和VP1三者浓度比例较为均一，纯度>90％。经BCA法测定，纯化后去除SUMO标签的目标蛋白浓度约1.12mg/mL。
4.A型塞内卡病毒结构蛋白自组装的形态学检测
收集步骤4中含有A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3的流穿液于组装缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.6)中，4℃过夜后透射电镜观察A型塞内卡病毒结构蛋白的自组装，仪器为FEI透射电镜。A型塞内卡病毒结构蛋白组合物经亲水化处理后，1％UF染色20秒，固定于超薄炭铜网，进行电镜观察。结果如图11所示，通过透射电镜可观察到大量半径约为20nm左右的颗粒，大小均匀，呈现为空心形态，和自然的A型塞内卡病毒粒子相似，病毒三种结构蛋白成功自组装，并且VP3和VP1结构蛋白的氨基酸点突变，并不影响A型塞内卡病毒结构蛋白的自组装。制备的A型塞内卡病毒结构蛋白组合物命名为Re/SVA/CH-FJ-2017。
实施例3 A型塞内卡亚单位疫苗免疫动物中和抗体应答检测
将实施例2中获得的口蹄疫病毒结构蛋白组合物Re/SVA/CH-FJ-2017配制疫苗后进行猪体免疫，免疫后于0、7、14、21、28天分别采血，分离血清进行中和抗体滴度检测。试验结果如图12所示，其中Negative control为免疫PBS的动物血清；VLPs vaccine为本发明所述A型塞内卡病毒结构蛋白亚单位疫苗免疫的动物血清。结果表明，以本发明所述A型塞内卡病毒株结构蛋白基因VP0、VP3、VP1构建的A型塞内卡病毒结构蛋白组合物Re/SVA/CH-FJ-2017在动物免疫后均能产生较高水平的中和抗体，提高了A型口蹄疫基因工程疫苗的体内稳定性和保护效力。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种高效表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 355
<212> PRT
<213> A型赛内卡病毒(Seneca virus A)
<400> 1
Gly Asn Val Gln Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe Asp Ser Arg Gly Asn
1 5 10 15
Asn Gly Asn Met Thr Phe Asn Tyr Tyr Ala Asn Thr Tyr Gln Asn Ser
20 25 30
Val Asp Phe Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ala Gly Pro Gly Asn
35 40 45
Ser Arg Gly Gly Leu Ala Gly Leu Leu Thr Asn Phe Ser Gly Ile Leu
50 55 60
Asn Pro Leu Gly Tyr Leu Lys Asp His Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn
65 70 75 80
Ser Ala Asp Arg Val Ile Thr Gln Thr Ala Gly Asn Thr Ala Ile Asn
85 90 95
Thr Gln Ser Ser Leu Gly Val Leu Cys Ala Tyr Val Glu Asp Pro Thr
100 105 110
Lys Ser Asp Pro Pro Ser Ser Ser Thr Asp Gln Pro Thr Thr Thr Phe
115 120 125
Thr Ala Ile Asp Arg Trp Tyr Thr Gly Arg Leu Asn Ser Trp Thr Lys
130 135 140
Ala Val Lys Thr Phe Ser Phe Gln Ala Val Pro Leu Pro Gly Ala Phe
145 150 155 160
Leu Ser Arg Gln Gly Gly Leu Asn Gly Gly Ala Phe Thr Ala Thr Leu
165 170 175
His Arg His Phe Leu Met Lys Cys Gly Trp Gln Val Gln Val Gln Cys
180 185 190
Asn Leu Thr Gln Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Met Val Pro
195 200 205
Glu Thr Thr Leu Asp Val Lys Pro Asp Gly Lys Ala Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Glu Leu Asn Glu Glu Gln Trp Val Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Gly Lys Asn Met Pro Phe Gln Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro
245 250 255
Asn Trp Thr Trp Gly Pro Asn Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val
260 265 270
Phe Pro His Gln Ile Leu Asn Ala Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile
275 280 285
Ser Val Pro Tyr Ile Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln
290 295 300
Asn Ser Trp Thr Leu Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Gly Ala Thr Thr Asp Pro Glu Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr
325 330 335
Ser Pro Tyr Phe Asn Gly Leu Arg Asn Arg Phe Thr Thr Gly Thr Asp
340 345 350
Glu Glu Gln
355
<210> 2
<211> 1065
<212> DNA
<213> A型赛内卡病毒(Seneca virus A)
<400> 2
ggtaatgtcc agacaacctc aaagaacgat tttgattccc gcggcaataa tggtaacatg 60
accttcaatt actacgcaaa cacttaccag aattcagtag acttctcgac ctcctcgtcg 120
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<210> 3
<211> 594
<212> PRT
<213> A型赛内卡病毒(Seneca virus A)
<400> 3
Gly Asn Val Gln Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe Asp Ser Arg Gly Asn
1 5 10 15
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50 55 60
Asn Pro Leu Gly Tyr Leu Lys Asp His Asn Thr Glu Glu Met Glu Asn
65 70 75 80
Ser Ala Asp Arg Val Ile Thr Gln Thr Ala Gly Asn Thr Ala Ile Asn
85 90 95
Thr Gln Ser Ser Leu Gly Val Leu Cys Ala Tyr Val Glu Asp Pro Thr
100 105 110
Lys Ser Asp Pro Pro Ser Ser Ser Thr Asp Gln Pro Thr Thr Thr Phe
115 120 125
Thr Ala Ile Asp Arg Trp Tyr Thr Gly Arg Leu Asn Ser Trp Thr Lys
130 135 140
Ala Val Lys Thr Phe Ser Phe Gln Ala Val Pro Leu Pro Gly Ala Phe
145 150 155 160
Leu Ser Arg Gln Gly Gly Leu Asn Gly Gly Ala Phe Thr Ala Thr Leu
165 170 175
His Arg His Phe Leu Met Lys Cys Gly Trp Gln Val Gln Val Gln Cys
180 185 190
Asn Leu Thr Gln Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Met Val Pro
195 200 205
Glu Thr Thr Leu Asp Val Lys Pro Asp Gly Lys Ala Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Glu Leu Asn Glu Glu Gln Trp Val Glu Met Ser Asp Asp Tyr Arg Thr
225 230 235 240
Gly Lys Asn Met Pro Phe Gln Ser Leu Gly Thr Tyr Tyr Arg Pro Pro
245 250 255
Asn Trp Thr Trp Gly Pro Asn Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Val Thr Val
260 265 270
Phe Pro His Gln Ile Leu Asn Ala Arg Thr Ser Thr Ser Val Asp Ile
275 280 285
Ser Val Pro Tyr Ile Gly Glu Thr Pro Thr Gln Ser Ser Glu Thr Gln
290 295 300
Asn Ser Trp Thr Leu Leu Val Met Val Leu Val Pro Leu Asp Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Gly Ala Thr Thr Asp Pro Glu Ile Thr Phe Ser Val Arg Pro Thr
325 330 335
Ser Pro Tyr Phe Asn Gly Leu Arg Asn Arg Phe Thr Thr Gly Thr Asp
340 345 350
Glu Glu Gln Gly Pro Ile Pro Thr Ala Pro Arg Glu Asn Ser Leu Met
355 360 365
Phe Leu Ser Thr Ile Pro Asp Asp Thr Val Pro Ala Tyr Gly Asn Val
370 375 380
Arg Thr Pro Pro Val Asn Tyr Leu Pro Gly Glu Ile Thr Asp Leu Leu
385 390 395 400
Gln Leu Ala Arg Ile Pro Thr Leu Met Ala Phe Gly Arg Val Ser Glu
405 410 415
Pro Glu Pro Ala Ser Asp Ala Tyr Val Pro Tyr Val Ala Val Pro Ala
420 425 430
Gln Phe Asp Asp Lys Pro Leu Ile Ser Phe Pro Ile Thr Leu Ser Asp
435 440 445
Pro Val Tyr Gln Asn Thr Leu Val Gly Ala Ile Ser Ser Asn Phe Ala
450 455 460
Asn Tyr Arg Gly Cys Ile Gln Ile Thr Leu Thr Phe Cys Gly Pro Met
465 470 475 480
Val Ala Arg Gly Lys Phe Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Asn Gly Ala
485 490 495
Gln Pro Gln Thr Leu Ser Glu Ala Met Gln Cys Thr Tyr Ser Ile Trp
500 505 510
Asp Ile Gly Leu Asn Ser Ser Trp Thr Phe Val Ile Pro Tyr Ile Ser
515 520 525
Pro Ser Asp Tyr Arg Glu Thr Arg Ala Ile Thr Asn Ser Val Tyr Ser
530 535 540
Ala Asp Gly Trp Phe Ser Leu His Lys Leu Thr Lys Ile Thr Leu Pro
545 550 555 560
Pro Asp Cys Pro Gln Ser Pro Cys Ile Leu Phe Phe Ala Ser Ala Gly
565 570 575
Glu Asp Tyr Thr Leu Arg Leu Pro Val Asp Cys Asn Pro Ser Tyr Val
580 585 590
Phe His
<210> 4
<211> 717
<212> DNA
<213> A型赛内卡病毒(Seneca virus A)
<400> 4
gggcccattc ccacagcacc cagagaaaat tcgcttatgt ttctctcaac catccctgac 60
gacactgttc ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct ccctggtgaa 120
ataaccgacc tcttacaact ggcccgtata cccactctca tggcgtttgg gcgggtgtct 180
gaacccgagc ctgcctcaga cgcatatgtg ccttacgttg ccgttcctgc ccagttcgac 240
gacaagcctc tcatctcctt cccgatcacc ctttcagatc ctgtctacca gaacaccctg 300
gtgggcgcca tcagttcgaa cttcgccaac taccgggggt gtatccaaat cactctgaca 360
ttttgtggac ccatggtggc aagagggaaa ttcctgctct cgtattctcc cccaaatgga 420
gcacaaccac agaccctttc tgaagctatg cagtgcacat actctatttg ggatataggc 480
ttgaactcta gttggacctt tgtcatcccc tatatctcgc ccagtgatta ccgtgaaact 540
cgggctatta ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcttgca caagctgacc 600
aaaattactc taccacctga ctgcccacag agtccctgta ttctcttttt cgcctctgct 660
ggtgaggatt acaccctccg cctccctgtt gattgtaatc cttcctacgt gttccac 717
<210> 5
<211> 264
<212> PRT
<213> A型赛内卡病毒(Seneca virus A)
<400> 5
Ser Thr Asp Asn Ala Glu Thr Gly Val Ile Glu Ala Gly Asn Thr Asp
1 5 10 15
Thr Asp Phe Ser Gly Glu Leu Ala Ala Pro Gly Ser Asn His Thr Asn
20 25 30
Val Lys Phe Leu Phe Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn Val Ile Lys Val
35 40 45
Leu Glu Lys Asp Ala Val Phe Pro Arg Pro Phe Pro Thr Ala Thr Gly
50 55 60
Ala Gln Gln Asp Asp Gly Tyr Phe Cys Leu Leu Thr Pro Arg Pro Thr
65 70 75 80
Val Ala Ser Arg Pro Ala Thr Arg Phe Gly Leu Tyr Val Asn Pro Ser
85 90 95
Asp Asn Gly Val Leu Ala Asn Thr Ser Leu Asp Phe Asn Phe Tyr Ser
100 105 110
Leu Ala Cys Phe Thr Tyr Phe Arg Ser Asp Leu Glu Val Thr Val Val
115 120 125
Ser Leu Glu Pro Asp Leu Glu Phe Ala Val Gly Trp Phe Pro Ser Gly
130 135 140
Ser Glu Tyr Gln Ala Ser Ser Phe Val Tyr Asp Gln Leu His Val Pro
145 150 155 160
Tyr His Phe Thr Gly Arg Thr Pro Arg Ala Phe Thr Ser Lys Gly Gly
165 170 175
Lys Val Ser Phe Val Leu Pro Trp Asn Ser Val Ser Ser Val Leu Pro
180 185 190
Val Arg Trp Gly Gly Ala Ser Lys Leu Ser Ser Ala Thr Arg Gly Leu
195 200 205
Pro Ala His Ala Asp Trp Gly Thr Ile Tyr Ala Phe Ile Pro Arg Pro
210 215 220
Asn Glu Lys Lys Gly Thr Ala Val Lys His Val Ala Val Tyr Val Arg
225 230 235 240
Tyr Lys Asn Ala Arg Ala Trp Cys Pro Ser Met Leu Pro Phe Arg Ser
245 250 255
Tyr Lys Gln Lys Met Leu Met Gln
260
<210> 6
<211> 792
<212> DNA
<213> A型赛内卡病毒(Seneca virus A)
<400> 6
tccaccgaca acgccgagac tggggttatt gaggcaggta acactgacac cgatttctct 60
ggtgaactgg cggctcctgg ctctaaccat actaatgtca aattcctgtt tgaccgatct 120
cggctactga atgtaattaa ggtactggag aaggacgccg tcttcccccg tcctttcccc 180
acagcaacag gtgcacagca ggacgatggt tacttttgtc ttctaacacc ccgcccaaca 240
gtcgcttccc gacccgccac tcgtttcggc ctgtacgtca acccgtctga caatggcgtt 300
ctcgctaaca cttcactgga tttcaatttt tacagtttgg cctgtttcac ttactttaga 360
tcagaccttg aagtcacggt ggtctcactg gagccagatc tggaattcgc cgtggggtgg 420
ttcccctctg gcagtgagta ccaggcttct agctttgtct acgaccaact gcatgtaccc 480
taccacttta ctgggcgcac tccccgcgct ttcaccagca agggtggaaa ggtatccttc 540
gtgctccctt ggaactctgt ctcttccgtg cttcccgtgc gctggggggg cgcctccaag 600
ctttcttctg ccacgcgggg tctgccggct catgctgact gggggaccat ttacgccttt 660
atcccccgtc ctaacgagaa gaaaggcacc gctgtaaagc acgtggcggt gtacgttcgg 720
tacaagaacg cgcgtgcctg gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta caagcagaag 780
atgctgatgc aa 792
<210> 7
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatgg gcagcagcca tcatcatcat 60
catcacggca gcggcctggt gccgcgcggc agcgctagca tgtcggactc agaagtcaat 120
caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg agactcacat caatttaaag 180
gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg 240
ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg actccttaag attcttgtac 300
gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat 360
attattgagg ctcacagaga acagattggt ggt 393

Claims (10)

1.分子伴侣，或含有分子伴侣的重组载体，或含有分子伴侣的重组微生物在促进A型塞内卡病毒结构蛋白表达中的应用，其特征在于，所述分子伴侣包括DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Trigger factor蛋白中的任一种或几种的组合。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述分子伴侣由groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白组成。
3.一种用于可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒和表达分子伴侣的质粒，所述分子伴侣包括DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、Trigger factor蛋白中的任一种或几种的组合。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述分子伴侣由groEL蛋白、groES蛋白、Trigger factor蛋白组成。
5.如权利要求3或4所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将表达分子伴侣蛋白的质粒与表达A型塞内卡病毒结构蛋白的质粒转化宿主，获得可同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白和分子伴侣蛋白的基因工程菌。
6.如权利要求5所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计编码融合标签蛋白基因序列THS，其中T为翻译起始区核苷酸序列，H为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，S为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(SUMO)的核苷酸序列；
(2)将步骤(1)所述的融合标签蛋白基因序列THS分别与编码A型塞内卡病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因串联，形成三段融合目标蛋白基因序列THS-VP0、THS-VP3和THS-VP1；
(3)通过分子克隆技术将步骤(2)所述THS-VP0、THS-VP3和THS-VP1同时克隆入原核表达载体中，获得重组表达质粒pET-SVA-VP031；
(4)构建表达分子伴侣的质粒，将表达分子伴侣的质粒和步骤(3)所述的重组表达质粒pET-SVA-VP031转化大肠杆菌，获得基因工程菌。
7.一种可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
a.将权利要求3或4所述的基因工程菌，或将根据权利要求5或6所述方法构建获得基因工程菌进行发酵培养，诱导表达带有融合标签蛋白的塞内卡病毒结构蛋白；
b.破碎基因工程菌菌体后，回收上清液，亲和色谱层析分离纯化获得带有融合标签蛋白的塞内卡病毒结构蛋白；
c.酶切去除步骤b所述结构蛋白中的融合标签蛋白，再用亲和色谱层析分离纯化获得塞内卡病毒结构蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法制备获得的A型塞内卡病毒结构蛋白。
9.如权利要求8所述的A型塞内卡病毒结构蛋白在制备塞内卡病毒病疫苗中的应用。
10.一种用于预防塞内卡病毒感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求8所述的A型塞内卡病毒结构蛋白。
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