CN116555141A - 一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗中的应用。所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。本发明所构建的枯草芽孢杆菌表达系统安全无毒，能够高效分泌猪塞内卡病毒重组蛋白。本发明使用的猪塞内卡重组蛋白是通过转入pHT43‑His‑rVP2高效表达载体的枯草芽孢杆菌表达获得，所述pHT43‑His‑rVP2高效表达载体通过同源重组技术获得，不仅实现了猪塞内卡病毒重组蛋白的高水平表达，而且能够高效分泌到细胞外，极大地简化了重组蛋白的制备流程，有利于重组蛋白抗原的大规模生产。

Description

一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物疫苗制品技术领域，具体涉及一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备疫苗中的应用。
背景技术
猪塞内卡病毒(Seneca virus，SVA)是近几年新发现的一种动物疫病病毒，该病毒能够引起不同年龄阶段的猪产生水疱性病变、腹泻、跛行，甚至可引起新生仔猪大量死亡。猪塞内卡病毒SVA导致的病症在临床症状上与猪口蹄疫、猪水疱病极为相似，而预防猪塞内卡病毒感染对控制猪水疱性疾病具有重要意义，疫苗是预防猪塞内卡病毒感染的最有效措施。
VP2蛋白是SVA的结构蛋白之一，具有较强的免疫原性，是制备猪塞内卡病毒亚单位疫苗理想的候选靶标。目前使用的大肠杆菌表达系统进行VP2蛋白表达时主要以包涵体形式的蛋白出现，可溶性表达产量低。包涵体形式的蛋白作为疫苗抗原来使用效果不佳，而且需要多道工艺对蛋白进行纯化，在生产过程中大肠杆菌会产生大量内毒素，处理方法复杂，不能满足实际生产的需求。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种分布广泛、需氧并产芽孢的革兰氏阳性杆菌，遗传背景清晰，无致病性，已被美国食品药品监督管理局(FDA)评为生物安全菌株(GRAS)。改造后的枯草芽孢杆菌WB800N已经解决野生型菌株Bacillus subtilis168在生长过程中降解表达产物的问题，成为猪塞内卡病毒VP2蛋白的理想表达宿主。
基于上述考虑，本发明人通过构建表达猪塞内卡病毒VP2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，解决VP2蛋白以包涵体形式出现的问题。猪塞内卡病毒VP2蛋白高效地分泌到胞外，极大地简化蛋白纯化流程、缩短生产周期，但我们又发现VP2蛋白表达量不能满足大规模生产的需要。在此基础上，本发明人通过改造VP2蛋白，筛选获得高水平表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌，并且增强重组蛋白的免疫原性。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用于表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗中的应用。
本发明首先提供一种重组枯草芽孢杆菌工程菌，所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌中包含有重组表达猪塞内卡病毒VP2蛋白的表达载体；
所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其一种具体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；
在保留VP2蛋白的免疫原性的基础上，为了提高VP2蛋白的表达效率，本发明还提供一种重组多肽，所述的重组多肽是将VP2蛋白截短体通过Linker连接组成，其中重组蛋白的一种氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述的表达载体，作为一个实施例的具体记载，为pHT43-His-rVP2高效表达载体。
本发明还提供一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其包含猪塞内卡病毒重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
作为优选，所述猪塞内卡病毒重组蛋白为应用本发明所述的重组枯草芽孢杆菌表达得到。
本发明所构建的枯草芽孢杆菌表达系统安全无毒，能够高效分泌猪塞内卡病毒重组蛋白。本发明使用的猪塞内卡重组蛋白是通过转入pHT43-His-rVP2高效表达载体的枯草芽孢杆菌表达获得，所述pHT43-His-rVP2高效表达载体通过同源重组技术获得，不仅实现了猪塞内卡病毒重组蛋白的高水平表达，而且能够高效分泌到细胞外，极大地简化了重组蛋白的制备流程，有利于重组蛋白抗原的大规模生产。在此基础上，本发明提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，具有良好的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激免疫兔体内产生特异性IgG抗体及保护性中和抗体，具有较高应用价值和经济价值。本发明提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗还具有制备方法简单高效、生产周期短、生产成本低等优势。
附图说明
图1：实施例1中重组质粒pHT43-His-VP2的PCR鉴定结果图，其中M为DNAmaker，泳道1为pHT43-His-VP2质粒，泳道2为空白质粒。
图2：实施例1中枯草芽孢杆菌表达的VP2蛋白原液的SDS-PAGE鉴定结果图，其中M为蛋白maker，泳道1为纯化后VP2蛋白，泳道2为纯化前VP2蛋白。
图3：本发明实施例2中重组质粒pHT43-His-rVP2的PCR鉴定结果图，其中M为DNAmaker，泳道1为pHT43-His-rVP2质粒，泳道2为空白质粒。
图4为本发明中枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白进行2倍稀释后的SDS-PAGE鉴定结果，其中M为蛋白maker，泳道1为纯化前重组蛋白，泳道2为纯化后重组蛋白。
图5为本发明实施例3中猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗和VP2亚单位免疫新西兰大白兔的特异性抗体检测结果。
图6为本发明实施例3中猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗和VP2亚单位疫苗免疫新西兰大白兔的中和抗体检测结果。
具体实施方式
本发明属于生物疫苗制品技术领域，具体涉及一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌制备方法及其应用。本发明提供一种重组枯草芽孢杆菌，其包含猪塞内卡病毒重组蛋白的编码基因。本发明使用Linker连接两个VP2蛋白截短体，通过同源重组技术构建高效表达载体，实现了重组蛋白的高水平表达。本发明还提供一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其包含采用重组枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白，本发明提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗具有良好的免疫原性。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：猪塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白原始编码基因重组枯草芽孢杆菌的构建
根据Gene bank中的SVA VP2基因序列设计一对引物并在上下游引物5’端各加上BamH I、Sma I酶切位点，以SVA RNA为模板扩增VP2基因，利用BamH I和Sma I酶切回收的PCR产物和pUC57克隆载体，再用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组克隆质粒pUC57-VP2。利用BamH I和Sma I酶切回收pUC57-VP2和pHT43-His载体，再用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组质粒pHT43-His-VP2。将重组质粒转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选挑出阳性克隆菌落进行扩大培养、保菌、测序鉴定。将鉴定正确的阳性重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，在含氯霉素的LB琼脂平板上挑取单克隆菌株进行培养，通过PCR鉴定，挑选阳性克隆菌株接种于含氯霉素的液体LB培养基中，振荡培养至OD600值为0.8时加入IPTG诱导表达，最后离心菌液，去菌体沉淀，保留含VP2蛋白的上清液，并对VP2蛋白的浓度和纯度进行鉴定。
液体LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，加水溶解，调节pH至7.2～7.4，121℃30min高压灭菌。
LB琼脂板：每100mL液体LB培养基里加入1.5g琼脂粉，121℃30min高压灭菌后无菌铺板。
具体实施步骤如下：
1.扩增SVA VP2基因
根据Gene bank已发表的SVA基因序列(No.MZ031967.1)设计一对特异引物，并在上、下游引物的5’端加BamH I、Sma I酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：
SVA-VP2-F：
5’-CGCGGATCCGCGCCCCGAAACCACCCTTGATGTC-3’(下划线处为BamH I识别位点)
SVA-VP2-R：5’-TCCCCCGGGAATGGGCCCCTGTTCCTCGTC-3’(下划线处为Sma I识别位点)
以SVA RNA为模板，用合成的上下游引物进行PCR扩增，反应体系为20μL：2×PCR bμffer 10μL，SVA-VP2-F 1μL，SVA-VP2-R 1μL，M-MLV 0.8μL，模板2μL，dd H2O 5.2μL
反应条件为：55℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性10s，67℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环；72℃延伸10min。
2.重组质粒pHT43-His-VP2的构建与鉴定
将PCR扩增阳性产物连入pUC57大肠杆菌克隆质粒，构建克隆载体pUC57-VP2。使用BamH I和Sma I双酶切pUC57-VP2和pHT43-His载体，用T4 DNA连接酶将两者的酶切产物进行连接，构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆菌株，摇菌扩增后提取质粒通过PCR初步鉴定，挑选阳性质粒送去测序，结果正确的质粒命名为pHT43-His-VP2，PCR鉴定结果如图1所示。
3.重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43-VP2的筛选和鉴定
将保存的甘油菌复苏后扩增，提取重组质粒pHT43-His-VP2。采用电转化的方式将其导入枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞中。具体步骤为：取60μL感受态细胞中加入5μL DNA质粒，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，按照条件(2kv、25μF、200Ω)电转1次，结束后迅速向电转杯中加入1mL的电转复苏液，轻柔混匀，37℃200r/min复苏3个小时，将复苏完的菌液涂布含有氯霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养。挑取单克隆菌株培养，经PCR方法初步鉴定出2株单克隆菌株，通过测序确定其中1株为阳性克隆株，命名为WB800N/pHT43-VP2株。
4.VP2蛋白的诱导表达
取10μL甘油菌接种于10mL含氯霉素的液体LB培养基，37℃220r/min过夜培养。第2天按1％的比例接种到含氯霉素的新液体LB培养基，在37℃220r/min条件下振荡培养至OD600值为0.8时，加入1.0mmol/L IPTG后在22℃220r/min条件下诱导16h，同时设置空白质粒对照。6000r/min离心15min收集上清液，经10％ SDS-PAGE凝胶电泳鉴定上清液中VP2蛋白的纯度并采用Bradford法测定蛋白浓度，实验结果(图2)显示在分子量约40ku处出现一条较为明显的目的蛋白条带，蛋白表达量占整个菌体蛋白量的8％～10％。
实施例2：构建携带重组蛋白编码基因高效表达载体和重组枯草芽孢杆菌
1.获取重组蛋白编码基因的核苷酸序列
根据抗原表位分析筛选获得两个VP2蛋白截短体，通过Linker(EAAAK)2连接，得到的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。根据枯草芽孢杆菌表达系统的特点，对重组蛋白编码基因对应的核苷酸序列进行密码子优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列由生工生物工程股份有限公司合成，以连入克隆质粒pUC57的形式取得，命名为pUC57-rVP2。
2.重组质粒pHT43-His-rVP2的构建
(1)重组蛋白目的基因的扩增：通过PCR扩增，使目的基因片段5’和3’最末端分别带上与线性化载体两末端一致的序列(15～20bp)。
引物如下：
SVA-rVP2-F：
5’-CAAAAACATCAGCCGTAGGATCCGATGTAAAGCCAGATGGAAA AGC-3’(下划线处为BamHI识别位点)
SVA-rVP2-R：
5’-CATCACCATCATCCCCGGGCATCATCACCATCACCATGCCCGCAC GTCAACTAGC-3’(下划线处为Sma I识别位点)
PCR反应体系为20μL：2×PCR bμffer 10μL，SVA-rVP2-F 1μL，SVA-rVP2-R 1μL，M-MLV 1.0μL，模板2.2μL，ddH2O 5.2μL
反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，69℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。
按照上述引物对pUC57-rVP2质粒进行PCR扩增，胶回收琼脂糖凝胶电泳分离的目的基因片段。
(2)获得线性化载体。通过使用BamH I和Sma I对pHT43-His表达载体进行酶切，胶回收琼脂糖凝胶电泳分离的片段。
(3)重组连接。通过PCR扩增获得5’和3’末端分别带上与线性化载体两端一致序列的插入片段，之后使用Universal One Step Cloning Kit试剂盒进行重组反应，按照线性化载体与插入片段摩尔比为1:3的比例混合，在重组酶催化作用下50℃反应15min，获得重组产物。
(4)转化。将重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氯霉素的LB平板筛选阳性克隆菌株，摇菌扩增后提取质粒通过PCR初步鉴定，挑选阳性质粒送去测序，结果正确的质粒命名为pHT43-His-rVP2，PCR鉴定结果如图3所示。
3.重组枯草芽孢杆菌WB800N/pHT43-rVP2的构建
按照实施例1的操作步骤将pHT43-His-rVP2重组质粒电转入枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，涂板培养，挑取单克隆菌株至LB液体培养基培养，经PCR鉴定并送去测序，将测序正确的阳性转化子命名为WB800N/pHT43-rVP2。
4.重组蛋白的诱导表达
按照实施例1的操作步骤将WB800N/pHT43-rVP2甘油菌复苏、扩培至OD600值为0.8时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG在22℃220r/min条件下诱导16h，同时设置空白对照组。将收集到的菌液6000r/min离心15min，取上清液经10％ SDS-PAGE凝胶电泳鉴定重组蛋白的表达量，结果显示(图4)，重组蛋白分子量大小约24ku，表达量占整个菌体蛋白量的18％～23％。与VP2蛋白的表达量相比，重组蛋白的表达量提高约1.3倍。
实施例3：利用实施例1和实施例2表达蛋白制备猪塞内卡病毒亚单位疫苗
1.VP2蛋白和重组蛋白的纯化
将实施例1表达VP2蛋白的枯草芽孢杆菌菌液和实施例2中表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌菌液离心，保留上清液。上清液分别先用0.45μm滤器去除杂质，装入平衡好的Ni柱中，让样品缓慢流出，控制流速为0.5mL/min，收集流出液。然后依次用洗杂液、0.2M～0.5M咪唑洗脱液洗脱蛋白，收集各峰段的流出液，经10％ SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白纯化效果(图2、图4)，结果显示VP2蛋白和重组蛋白经镍柱亲和层析法纯化后蛋白纯度高，蛋白浓度分别为2.3mg/ml、4.4mg/ml。
2.猪塞内卡病毒VP2亚单位疫苗和重组蛋白疫苗的制备
将纯化后的VP2蛋白与重组蛋白过滤除菌后分别与矿物油佐剂按照1:2.5比例乳化制备疫苗，获得猪塞内卡病毒亚单位疫苗和猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，使每毫升疫苗中的蛋白含量为650μg，置于4℃保存。
3.猪塞内卡病毒VP2亚单位疫苗与重组蛋白疫苗的免疫效果评价
将30只2.5～3.0Kg新西兰大耳白随机分成A、B、C三组，每组10只。A组颈部皮下接种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，B组颈部皮下接种猪塞内卡病毒VP2亚单位疫苗，每只1.0ml，间隔21日，A、B两组加强免疫1次，每只1.0ml，C组为不接种疫苗对照组。分别于二次免疫后14、28、42日采血，分离血清，用间接Elisa方法检测特异性抗体，结果显示(图5)，二免14天两组免疫兔均产生特异性IgG抗体，二免28天抗体水平均达到最高，而且A组抗体水平明显高于B组抗体水平。
利用细胞中和试验(微量法)检测血清中和抗体水平，结果显示(图6)，二免28天A、B两组免疫兔血清中和抗体效价最高，二免42天，中和抗体效价仍保持在较高水平，以上结果表明，相比于全长VP2蛋白与，重组蛋白能更有效诱导机体产生高水平的特异性抗体及中和抗体。

Claims (10)

1.一种重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌中包含有重组表达猪塞内卡病毒VP2蛋白的表达载体。
2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
3.如权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
4.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
5.如权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
6.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
7.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的表达载体为pHT43-His-rVP2高效表达载体。
8.一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其抗原包含有氨基酸序列为SEQ ID NO：3的猪塞内卡病毒VP2蛋白。
9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白是通过权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌表达制备的。
10.一种猪塞内卡病毒抗原蛋白，其特征在于，所述的抗原蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO：3。
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