CN104245719A - 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法 - Google Patents

包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104245719A
CN104245719A CN201280069473.6A CN201280069473A CN104245719A CN 104245719 A CN104245719 A CN 104245719A CN 201280069473 A CN201280069473 A CN 201280069473A CN 104245719 A CN104245719 A CN 104245719A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
seq
subunit
homology
function fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201280069473.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104245719B (zh
Inventor
D·B·韦纳
M·P·莫罗
严健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Pennsylvania Penn filed Critical University of Pennsylvania Penn
Publication of CN104245719A publication Critical patent/CN104245719A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104245719B publication Critical patent/CN104245719B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001136—Cytokines
    • A61K39/00114—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了核酸分子和组合物，其包含：编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列，和/或编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列。本发明还公开了还包含编码免疫原的核酸序列的核酸分子和组合物。本发明公开了调节免疫应答的方法以及诱导针对免疫原的免疫应答的方法。本发明还公开了治疗性和预防性疫苗接种方法。

Description

包含改进的IL-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及编码人IL-12的改进基因构建体以及包含所述构建体的核酸分子。本发明还涉及包含编码人Il-12的核苷酸序列的改进表达载体、疫苗和免疫治疗剂，以及涉及它们的使用方法。
发明背景
免疫治疗是指调节人的免疫应答从而赋予所需的疗效。免疫治疗剂是指施用给个体时调节个体的免疫系统，足以最终减轻与不良免疫应答相关的症状，或通过增强所需的免疫应答而最终缓解症状的那些组合物。在一些情况下，免疫治疗是疫苗接种方案的一部分，其中向个体施用疫苗，该疫苗将个体暴露于免疫原，进而使该个体产生针对该免疫原的免疫应答，在此类情况下，免疫治疗剂增强免疫应答和/或选择性增强免疫应答的一部分(例如细胞应答或体液应答)，这是治疗或预防特定病症、感染或疾病所需的。
在设计疫苗时，已认识到，在接种疫苗的个体的细胞中产生靶抗原的疫苗可有效诱导免疫系统的细胞免疫应答。具体地讲，减毒活疫苗、采用无毒力载体的重组疫苗以及DNA疫苗各自能在接种疫苗的个体的细胞中产生抗原，从而导致诱导免疫系统的细胞免疫应答。另一方面，只包含蛋白的杀死或灭活疫苗和亚单位疫苗不能诱导良好的细胞免疫应答，虽然它们能诱导有效的体液应答。
细胞免疫应答通常是提供抵御病原体感染的保护力和提供治疗病原体感染、癌症或自身免疫疾病的有效免疫介导疗法所必需的。因此，在接种疫苗的个体的细胞中产生靶抗原的疫苗诸如减毒活疫苗、采用无毒力载体的重组疫苗和DNA疫苗通常是优选的。
需要可在人体中诱导强T细胞和B细胞免疫的疫苗方法。在一系列其他问题之中，最近对减毒、疫苗制造复杂性、血清学干扰(如在HIV STEP试验中所观察到的)的关注进一步强调了这一问题。在非人灵长类模型中以及在人类临床试验中，作为疫苗平台的简单质粒DNA未能诱导支持商业开发工作的令人满意的免疫原性水平。在面对面的直接比较中，一些基于裸质粒的疫苗未能诱导与其病毒载体对应物(包括常用的腺病毒血清型5(Ad5)平台)所诱导的相当的细胞或体液应答。
作为独立疫苗接种方法的DNA疫苗技术的开发及其在当前初免平台中的实用性将受益于开发增强其免疫效力的策略。已报道，对密码子和RNA编码序列的操纵以及先导序列的改变可增强质粒编码的免疫原的表达。此外，形成共有免疫原正尝试着满足广泛免疫覆盖率以部分考虑病毒多样性的需求。
另外，已采用了其他策略，这些策略关注于通过改进制剂和装置驱动的技术来改善DNA质粒的物理递送。已报道，在恒河猴中，通过电穿孔(EP)递送的DNA疫苗在用质粒DNA免疫后增强了抗原特异性干扰素-γ(IFNγ)的产生。
共同递送质粒编码的分子佐剂以增强疫苗诱导的应答是该项专门研究的另一个重要领域。在非人灵长类动物中得到最好表征的分子佐剂之一是IL-12，这是一种TH1极化细胞因子，它通过提供初始CD8+T细胞的有效激活和抗原特异性扩增所需的“第三信号”而驱动CTL应答。IL-12是包含两个亚单位p35和p40的异源二聚体。已表明其为最令人印象深刻的免疫增强细胞因子，尤其是在作为DNA疫苗进行工程改造时用于驱动CD8T细胞。在猕猴中，已表明IL-12是扩展靶向多种抗原的DNA疫苗的细胞免疫效力的高度有效的佐剂。在恒河猴以及在人类中，这种DNA疫苗佐剂均可明显改善由DNA疫苗诱导的免疫应答。
以引用方式并入本文的美国专利5,723,127公开了作为疫苗佐剂的IL-12。以引用方式并入本文的PCT申请PCT/US1997/019502和相应的美国专利申请08/956,865公开了包含IL-12编码序列的DNA疫苗和DNA构建体。
仍需要改进的疫苗和免疫治疗剂。需要产生增强的免疫应答的组合物和方法。同样，虽然某些免疫治疗剂可用于调节患者中的免疫应答，但是仍需要改进的免疫治疗组合物和方法。仍需要编码IL-12并可用作DNA疫苗策略的一部分的改进构建体。仍需要编码IL-12并可用作免疫治疗剂的改进构建体。仍需要编码IL-12并可用于实现高水平IL-12表达的改进构建体。
发明概要
本发明提供组合物，其包含编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列，以及编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列。编码IL-12p35亚单位的核酸序列可与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白。编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列可以是与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白。编码IL-12p40亚单位的核酸序列可与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白。编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列可以是与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白。组合物还可以包含编码免疫原的核酸序列。
本发明还提供调节免疫应答的方法。该方法包括向个体施用组合物的步骤，该组合物包含编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列以及编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列。
本发明还提供诱导针对免疫原的免疫应答的方法。该方法包括向个体施用组合物的步骤，该组合物包含一定量的编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列以及编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列与编码免疫原的核酸序列的组合。诱导针对免疫原的免疫应答的方法可以是诱导治疗性免疫应答的方法或诱导预防性免疫应答的方法的一部分。
附图简述
图1A和1B显示了坐标图，该图对用2μg HuIL12-opt或HuIL12-nonopt(图1A)或4μg HuIL12-opt和HuIL12-nonopt(图1B)转染的细胞中的人IL-12的表达水平进行比较。
图2显示了在恒河猴中增强的PSA和PSMA特异性细胞免疫应答。
图3显示了在恒河猴中增强的HBV核心和表面抗原特异性细胞免疫应答。
具体实施方式
在本发明的一个方面，期望的是，改进的IL-12构建体能改善转录和翻译，包括具有以下一者或多者：低GC含量的先导序列以增强转录；mRNA稳定性和密码子优化；在某种程度上消除可能的顺式作用序列基序(即，内部TATA盒)。
在本发明的一些方面，期望将改进的IL-12构建体结合到疫苗方案中，作为疫苗组合物的一部分或作为与疫苗以协调方式递送的单独组合物，以便生成针对疫苗免疫原的广泛免疫。在本发明的一些方面，期望提供改进的IL-12构建体，作为可用于调节个体中的免疫应答的免疫治疗剂。在本发明的一些方面，期望提供改进的IL-12构建体以便提供表达载体，该表达载体可用于获得高水平的IL-12表达。
本文提供了更高效力的IL-12基因佐剂。这些新的佐剂较以前的IL-12分子具有若干优点。本发明提供了有利于分子分泌并提高核糖体含量的增强的先导序列，从而扩大这些佐剂的影响并增强表达。对RNA序列的明显改变进一步移除了与初始IL-12序列的同源性，从而防止所递送的佐剂与宿主系统之间的干扰，以及降低宿主IL-12序列和基因递送分子之间可能的有害相互作用。此外，新构建体的更高效力降低了剂量需要，从而改善与此类佐剂相关的制造和递送问题。最后，因为这些分子具有更高的生物活性，因此它们可在体内改善疫苗的性能。总之，它们是疫苗以及免疫疗法应用的重要的新工具。
1.定义。
本文所用的术语只是为了描述特定的实施方案，并非旨在进行限制。如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非上下文另有明确指出。
关于本文中数字范围的引述，明确地包括相同精度的介于其间的每个居间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9以外还包括数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确地包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
a.佐剂
如本文所用的“佐剂”可意指被添加到DNA质粒疫苗或其他疫苗中以增强由所述DNA质粒或疫苗编码的一种或多种抗原的抗原性的分子(包括编码具有免疫调节活性的蛋白的核酸分子)，以及编码下文所述的佐剂蛋白的核酸序列。
b.抗体
″抗体″可意指类别IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab′)2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗体显示足够的对所需表位或从其衍生的序列的结合特异性。
c.编码序列
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”可意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可以包含可操作地连接到调节元件的起始和终止信号，包括能够指导个体或哺乳动物细胞(向该个体或哺乳动物施用所述核酸)中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
d.互补序列
如本文所用的“互补序列”或“互补的”意指可进行核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对的核酸。
e.恒定电流
如本文所用的“恒定电流”意指由组织或限定所述组织的细胞在被递送至所述组织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。电脉冲通过本文所述的电穿孔装置递送。该电流在电脉冲的寿命过程中在所述组织中保持恒定的安培数，因为本文中提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时反馈。反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织(或细胞)的电阻，并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，升高电压)，这样相同组织中的电流在整个电脉冲过程(在微秒级上)以及脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。
f.电流反馈或反馈
如本文所用的“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可意指所提供的电穿孔装置的主动反应，这包括测量电极之间的组织中的电流，并且相应地改变通过EP装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平。该恒定水平可由使用者在脉冲序列或电治疗开始之前预先设置。反馈可通过电穿孔装置的电穿孔组件例如控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测电极之间的组织中的电流并将该监测到的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，以及连续进行能量输出调整以将监测到的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为其为模拟闭环反馈。
g.分散电流(Decentralized Current)
如本文所用的“分散电流”可意指来源于本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列的电流模式，其中所述模式最小化或优选地消除电穿孔相关热应激在被电穿孔的组织的任何区域上发生。
h.电穿孔
如在本文中可互换使用的“电穿孔”、“电透化”或“电动增强”(“EP”)可指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导极微通道(孔)；其存在使生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水能够从细胞膜的一侧通向另一侧。
i.反馈机制
如本文所用的“反馈机制”可以指通过软件或硬件(或固件)进行的过程，该过程(在能量脉冲递送之前、期间和/或之后)接收所需组织的阻抗并将其与预设值(优选电流)进行比较，然后调整递送的能量脉冲以达到预设值。反馈机制可通过模拟闭环电路来实现。
j.片段
如本文所用的“片段”可意指编码多肽的一个部分或一种核酸，其能够基本上类似于共有抗原的非片段在哺乳动物中引起免疫应答。所述片段可以是选自以下的DNA片段：SEQ ID NO：1的片段，与SEQID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白功能片段的核酸序列片段；SEQ ID NO：3的片段，以及与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白功能片段的核酸序列片段。
SEQ ID NO：1的DNA片段即与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白功能片段的核酸序列片段可编码SEQ ID NO：2的50个或更多个氨基酸长、55个或更多个、60个或更多个、65个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、85个或更多个、90个或更多个、95个或更多个、100个或更多个、105个或更多个、110个或更多个、115个或更多个、120个或更多个、125个或更多个、130个或更多个、135个或更多个、140个或更多个、145个或更多个、150个或更多个、155个或更多个、160个或更多个、165个或更多个、170个或更多个、175个或更多个、180个或更多个、185个或更多个、190个或更多个、195个或更多个、200个或更多个、205个或更多个、210个或更多个长或215个或更多个长或与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白。SEQ ID NO：1的DNA片段即与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码蛋白(少于SEQ ID NO：2的53个、少于58个、少于63个、少于68个、少于73个、少于78个、少于83个、少于88个、少于93个、少于98个、少于103个、少于108个、少于113个、少于118个、少于123个、少于128个、少于133个、少于138个、少于143个、少于148个、少于153个、少于158个、少于163个、少于168个、少于173个、少于178个、少于183个、少于188个、少于193个、少于198个、少于203个、少于208个、少于213个或少于218个氨基酸长)或为与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白的功能片段的核酸序列片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段编码与SEQ IDNO：2至少98％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段编码与SEQ ID NO：2至少99％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段编码SEQ ID NO：2的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1至少99％同源的核酸序列的片段编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1至少99％同源的核酸序列的片段编码与SEQID NO：2至少99％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1至少99％同源的核酸序列的片段编码SEQ ID NO：2的功能片段。在一些实施方案中，所述片段为编码SEQ ID NO：2的功能片段的SEQ ID NO：1的片段。
SEQ ID NO：3的DNA片段即与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白功能片段的核酸序列片段可编码SEQ ID NO：4的50个或更多个氨基酸长、55个或更多个、60个或更多个、65个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、85个或更多个、90个或更多个、95个或更多个、100个或更多个、105个或更多个、110个或更多个、115个或更多个、120个或更多个、125个或更多个、130个或更多个、135个或更多个、140个或更多个、145个或更多个、150个或更多个、155个或更多个、160个或更多个、165个或更多个、170个或更多个、175个或更多个、180个或更多个、185个或更多个、190个或更多个、195个或更多个、200个或更多个、205个或更多个、210个或更多个、215个或更多个、220个或更多个、225个或更多个、230个或更多个、235个或更多个、240个或更多个、245个或更多个、250个或更多个、255个或更多个、260个或更多个、265个或更多个、270个或更多个、275个或更多个、280个或更多个、285个或更多个、290个或更多个、295个或更多个、300个或更多个、305个或更多个、310个或更多个、315个或更多个、320个或更多个或325个或更多个氨基酸或与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白。SEQ ID NO：3的DNA片段和与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列片段可编码少于SEQ ID NO：4的53个、少于58个、少于63个、少于68个、少于73个、少于78个、少于83个、少于88个、少于93个、少于98个、少于103个、少于108个、少于113个、少于118个、少于123个、少于128个、少于133个、少于138个、少于143个、少于148个、少于153个、少于158个、少于163个、少于168个、少于173个、少于178个、少于183个、少于188个、少于193个、少于198个、少于203个、少于208个、少于213个、少于218个、少于223个、少于228个、少于233个、少于238个、少于243个、少于248个、少于253个、少于258个、少于263个、少于268个、少于273个、少于278个、少于283个、少于288个、少于293个、少于298个、少于303个、少于308个、少于313个、少于318个或少于328个氨基酸的功能片段或与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的片段编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的片段编码与SEQ ID NO：4至少99％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的片段编码SEQ ID NO：4的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ IDNO：3至少99％同源的核酸序列的片段编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：3至少99％同源的核酸序列的片段编码与SEQ ID NO：4至少99％同源的蛋白的功能片段。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：3至少99％同源的核酸序列的片段编码SEQ ID NO：4的功能片段。在一些实施方案中，所述片段为编码SEQ ID NO：4的功能片段的SEQ ID NO：3的片段。
DNA片段可不含IL-12信号肽的编码序列。DNA片段可包含免疫球蛋白信号肽的编码序列，诸如IgE或IgG信号肽序列。因此，例如，编码IL-12p35亚单位的DNA片段不编码SEQ ID NO：2的第1-22位氨基酸，并且在一些此类实施方案中，可包含编码免疫球蛋白信号肽的序列，诸如IgE信号肽序列(SEQ ID NO：5)或IgG信号肽序列。
“片段”还可以指能够基本上类似于全长多肽发挥功能的多肽片段。IL-12p35的片段可以是SEQ ID NO：2的片段或与SEQ ID NO：2的片段至少98％同源的多肽片段。IL-12p35的片段可以是与SEQ IDNO：2的片段至少99％同源的多肽片段。IL-12p35的片段可以是如上所述的片段。IL-12p40的片段可以是SEQ ID NO：4的片段或与SEQID NO：4的片段至少98％同源的多肽片段。IL-12p40的片段可以是与SEQ ID NO：4的片段至少99％同源的多肽片段。IL-12p40的片段可以是如上所述的片段。
“功能片段”意指可基本上类似于全长p35或p40发挥功能的短于完整p35和/或短于完整p40序列的IL-12亚单位的片段。此类基本上相似的功能包括以与全长p35或p40基本上相同的方式与其他蛋白、亚单位或受体的相互作用，并在以允许形成异源二聚体的方式递送时导致与IL-12p35/p40异源二聚体基本上相同的作用。
k.基因构建体
如本文所用的术语“基因构建体”是指DNA或RNA分子，该DNA或RNA分子包含编码一个或两个IL-12亚单位或靶蛋白或另一种(非IL-12)免疫调节蛋白的核苷酸序列。该编码序列包含可操作地连接到调节元件的起始和终止信号，包括能够指导个体细胞(向该个体施用所述核酸分子)中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号。
l.过度增殖性
如本文所用，术语“过度增殖性疾病”意指以细胞过度增殖为特征的那些疾病和障碍，并且术语“过度增殖相关蛋白”意指与过度增殖性疾病相关的蛋白。
m.同一
如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下使用的“同一”或“同一性”可意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可如下计算百分比：最佳地对齐两个序列，在指定的区域上比较两个序列，测定两个序列中在其上存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数，然后将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同的长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域只包括单个序列的情况下，将单个序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA与RNA时，胸腺嘧啶(T)与尿嘧啶(U)可被认为是等同的。可通过人工或使用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0来计算同一性。
n.阻抗
如本文所用的“阻抗”在论述反馈机制时可以使用，并可根据欧姆定律转变成电流值，从而使得能够与预设电流进行比较。
o.免疫应答
如本文所用的“免疫应答”可意指宿主免疫系统例如哺乳动物的免疫系统响应一种或多种RSV共有抗原的引入(通过所提供的DNA质粒疫苗)的激活。免疫应答可以为细胞或体液应答或两者的形式。
p.细胞内病原体
如本文所用的“细胞内病原体”意指病毒或病原性生物体，其复制或生命周期的至少一部分存在于宿主细胞内并在其中产生或导致产生病原体蛋白。
q.核酸
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也确定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本上同一的核酸及其互补序列。单链提供了可与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可包含双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可利用化学合成法或通过重组方法获得。
r.可操作地连接
如本文所用的“可操作地连接”在指代可操作地连接到启动子的基因时是指两个组件的连接，使得基因的表达处于与其在空间上连接的启动子的控制之下。启动子可被置于处于其控制下的基因的5′(上游)或3′(下游)。启动子与基因之间的距离可以与启动子所源自的基因中启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中所已知，该距离的变化可被容许而不丧失启动子功能。当指代可操作地连接到蛋白的信号肽时，该术语是指具有作为蛋白的一部分而结合在内的信号肽的蛋白，结合的方式使得其可作为信号肽发挥作用。当指代编码可操作地连接到编码序列(编码蛋白)的信号肽的编码序列时，该术语是指这些的编码序列，其排列方式使得编码序列的翻译产生具有作为蛋白的一部分而结合在内的信号肽的蛋白，结合的方式使得其可作为信号肽发挥作用。
s.启动子
如本文所用的“启动子”可意指能够在细胞中赋予核酸的表达、激活或增强所述表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强所述核酸的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或抑制子元件，所述元件可位于远离转录起始位点多达数千个碱基对。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。相对于表达发生所处的细胞、组织或器官，或相对于表达发生所处的发育阶段，或响应于外部刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，启动子可组成型地或差异地调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。
t.严格杂交条件
如本文所用的“严格杂交条件”可意指第一核酸序列(例如探针)将与第二核酸序列(例如靶)例如在核酸的复杂混合物中杂交所处的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中是不同的。严格条件可被选择为比限定离子强度pH下特定序列的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm可以是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)50％的与靶互补的探针与靶序列平衡杂交时所处的温度(当靶序列过量存在时，在Tm下，50％的探针被平衡地占据)。严格条件可以是这样的条件，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，例如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其他盐)并且温度为至少约30℃(对于短探针，例如约10-50个核苷酸)和至少约60℃(对于长探针，例如大于约50个核苷酸)。严格条件还可通过加入去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括下列条件：在42℃下于50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS中温育，或在65℃下于5x SSC、1％SDS中温育，和在65℃下于0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。
u.基本上互补的
如本文所用的“基本上互补的”可意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域范围内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
v.基本上同一的
如本文所用的“基本上同一的”可意指第一序列与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域范围内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补，则第一序列与第二序列基本上同一。
w.靶蛋白
如本文所用的术语“靶蛋白”意指作为疫苗的一部分或由DNA疫苗的基因构建体编码的肽和蛋白，该肽和蛋白在免疫应答中起靶蛋白的作用。术语“靶蛋白”和“免疫原”可互换使用，并指可以引起免疫应答的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白，它与病原体的蛋白或不利细胞类型(例如癌细胞)的蛋白或需要引起免疫应答的自身免疫疾病中所涉及的细胞的蛋白共有至少一个表位。针对靶蛋白的免疫应答将保护个体抵御和/或治疗该个体的与该靶蛋白相关的特定感染或疾病。
x.变体
如本文相对于核酸所用的“变体”可意指：(i)参照核酸序列的部分或片段；(ii)参照核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参照核酸或其互补序列基本上同一的核酸；或(iv)在严格条件下与参照核酸、其互补序列或与其基本上同一的序列杂交的核酸。
相对于肽或多肽的“变体”在氨基酸序列上的差异在于氨基酸的插入、缺失或保守置换但保持至少一种生物活性。变体还可以意指其氨基酸序列与参考蛋白的氨基酸序列基本上同一的蛋白，其保持至少一种生物活性。氨基酸的保守置换，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域被认为通常涉及微小的变化。这些微小的变化可部分地通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知的是，具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被置换并且仍然保留蛋白功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被置换。氨基酸的亲水性还可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白的置换。在肽的背景下对氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这一有用的指标已报道与抗原性和免疫原性相关。美国专利4,554,101，以引用的方式整体并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的置换可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解。可利用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸置换依赖于氨基酸的相似性，尤其是那些氨基酸的侧链的相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭示。
y.载体
本文所用的“载体”可意指包含复制起始位点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合进宿主基因组的载体。
2.IL-12
本文提供了编码人IL-12p35(α亚单位)和p40(β亚单位)的合成构建体。人IL-12p35亚单位(SEQ ID NO：2)为219个氨基酸的蛋白，其包含在第1-22位氨基酸的信号肽和在第23-219位的成熟蛋白序列。人IL-12p40亚单位(SEQ ID NO：4)为328个氨基酸的蛋白，其包含在第1-22位氨基酸的信号肽和在第23-328位的成熟蛋白序列。人IL-12p40亚单位的第40-90位氨基酸称为免疫球蛋白结构域；人IL-12p40亚单位的第125-217位氨基酸称为细胞因子白介素-12p40C端结构域。
在一些实施方案中，IL-12p35亚单位由在一个质粒上包含编码序列的构建体编码，而IL-12p40亚单位由在不同质粒上包含编码序列的构建体编码。在一些实施方案中，包含IL-12p35亚单位编码序列的构建体和包含IL-12p40亚单位编码序列的构建体在相同的质粒上但各构建体具有其自身的启动子。在一些实施方案中，包含IL-12p35亚单位编码序列的构建体和包含IL-12p40亚单位编码序列的构建体在相同的质粒上并处于单个启动子的控制下且由IRES序列分开。在一些实施方案中，包含IL-12p35亚单位编码序列的构建体和包含IL-12p40亚单位编码序列的构建体在相同的质粒上并处于单个启动子的控制下且由蛋白水解裂解位点的编码序列分开。在一些实施方案中，包含IL-12p35亚单位编码序列的构建体和包含IL-12p40亚单位编码序列的构建体在相同的质粒上并处于单个启动子的控制下并且所述亚单位由使得它们可作为单链蛋白而具有活性的接头分开。
HuIL12-opt序列是编码人IL-12亚单位的优化序列。该序列具有与宿主基因组较低的同源性，以改变RNA结构并避免隐秘的调控序列。所述序列提供改善的mRNA稳定性和表达。
作为编码人IL-12p35亚单位的编码序列的HuIL12-opt序列在SEQ ID NO：1中公开。作为因而编码的219个氨基酸的IL-12p35亚单位氨基酸序列的HuIL12-opt序列以SEQ ID NO.2公开。第1-22位氨基酸对应于信号肽。第23-219位氨基酸对应于成熟蛋白区域。
作为编码人IL-12p40亚单位的编码序列的HuIL12-opt序列以SEQ ID NO：3公开。作为因而编码的328个氨基酸的IL-12p40亚单位氨基酸序列的HuIL12-opt序列以SEQ ID NO.4公开。第1-22位氨基酸对应于IL-12信号肽而第23-328位氨基酸构成成熟蛋白。猕猴IL-12的类似序列为RhIL12-opt序列，其为编码猕猴IL-12亚单位的优化序列。
在一些实施方案中，IL-12p35或p40亚单位或两者的IL-12信号肽可被不同的信号肽诸如另一种免疫球蛋白信号肽例如IgG或IgE(SEQ ID NO：5)替代。编码IL-12p35或p40亚单位或两者的IL-12信号肽的编码序列可被不同的信号肽诸如另一种免疫球蛋白信号肽例如IgG或IgE(其为编码SEQ ID NO：5的编码序列)替代。在一些实施方案中，IL-12p35信号肽可被不同的信号肽诸如另一种免疫球蛋白信号肽例如IgG或IgE(SEQ ID NO：5)替代。SEQ ID NO.2的功能片段可不含IL-12p35信号肽序列。在一些实施方案中，编码IL-12p35信号肽的编码序列可被不同信号肽的编码序列诸如另一种免疫球蛋白信号肽的编码序列例如IgG或IgE信号肽的编码序列(即编码SEQID NO：5的编码序列)替代。为SEQ ID NO：1的片段的核酸序列可不含IL-12p35信号肽的编码序列。SEQ ID NO.4的功能片段可不含IL-12p40信号肽序列。在一些实施方案中，编码IL-12p40信号肽的编码序列可被不同信号肽的编码序列诸如另一种免疫球蛋白信号肽的编码序列例如IgG或IgE信号肽的编码序列(即编码SEQ ID NO：5的编码序列)替代。为SEQ ID NO：3的片段的核酸序列可不含IL-12p40信号肽的编码序列。分别计算在不编码IL-12p35信号肽或IL-12p40信号肽的编码序列中与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的同源性时，该计算基于排除以下部分的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的比较：编码IL-12p35信号肽的SEQ ID NO：1的部分，或编码IL-12p40信号肽的SEQ ID NO：3的部分。
3.质粒
本文提供了能够以有效地调节哺乳动物中的免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表达IL-12构建体的载体。各载体可包含编码所述一个或多个亚单位的异源核酸。载体可以是质粒。质粒可用于通过编码Il-12的核酸对细胞进行转染，将转化后的宿主细胞进行培养，并维持在其中发生IL-12的表达的条件下。
质粒可以包含编码一种或多种抗原的核酸。质粒还可以包含起始密码子，其可以位于编码序列的上游，以及终止密码子，其可以为与编码序列的下游。起始和终止密码子可与编码序列在一个框内。
质粒还可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。此类启动子的实例在美国专利申请公布US20040175727中有所描述，将其内容以引用方式整体并入本文。
质粒还可包含多聚腺苷酸化信号，其可位于编码序列的下游。多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒的多聚腺苷酸化信号(Invitrogen，SanDiego，CA)。
质粒还可以包含位于编码序列的上游的增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子例如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的一种。在美国专利5,593,972、5,962,428和WO94/016737(每一者的内容均以引用方式整体并入本文)中描述了多核苷酸功能增强。
质粒还可包含哺乳动物复制起点以便在细胞中使质粒保持于染色体外并且产生多个质粒的拷贝。质粒可以是得自Invitrogen(SanDiego，CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，其可以包含EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝游离型复制而不整合。质粒的主链可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。
质粒还可以包含可非常适合在施用质粒的细胞中的基因表达的调控序列。编码序列可包含可允许在宿主细胞中更高效地转录编码序列的密码子。
编码序列还可以包含Ig先导序列。先导序列可以在编码序列的5’。由该序列编码的共有抗原可包含N端Ig先导序列，随后为共有抗原蛋白。N端Ig先导序列可以是IgE或IgG。
质粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)中产生蛋白。质粒还可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株系中产生蛋白。质粒还可以具有MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白。
4.疫苗
根据本发明的一些实施方案，将编码IL-12或其功能片段的核酸序列与编码免疫原的核酸序列相结合递送到个体将增强针对该免疫原的免疫应答。当编码免疫原和IL-12的核酸分子被个体的细胞吸收时，免疫原和IL-12在细胞中表达并因而将蛋白递送到个体。本发明的多个方面提供在单个核酸分子上递送免疫原和IL-12的编码序列的方法，在不同核酸分子上递送免疫原和IL-12的编码序列的方法，以及作为重组疫苗的一部分和作为减毒活疫苗的一部分递送蛋白的编码序列的方法。
根据本发明的一些方面，提供对个体进行预防性和/或治疗性免疫以抵御病原体或异常、疾病相关细胞的组合物和方法。该疫苗可以是任何类型的疫苗，诸如减毒活疫苗、重组疫苗或者核酸或DNA疫苗。通过递送编码免疫原和IL-12或其功能片段的核酸分子，可调节由疫苗诱导的免疫应答。IL-12构建体尤其可用于与编码免疫原的核酸分子组合递送的情况，诸如作为重组载体或减毒活病原体或细胞的质粒或基因组的一部分。IL-12构建体可预防性用于疫苗以便在未感染或无疾病的个体中诱导保护性免疫应答。IL-12构建体尤其可用于为在人体中诱导保护性免疫应答而递送的情况。IL-12构建体可治疗性用于疫苗以便在感染或患病个体中诱导免疫应答。IL-12构建体尤其可用于为在人体中诱导治疗性免疫应答而递送的情况。在一些实施方案中，包含IL-12构建体的核酸分子在无细胞的组合物中递送。在一些实施方案中，包含IL-12构建体的核酸分子在无癌细胞的组合物中递送。在一些实施方案中，包含IL-12构建体的核酸分子在无任何其他细胞因子的情况下施用。
本文提供能够在哺乳动物中生成针对以下方面的免疫应答的疫苗：病原体、在疾病相关细胞上表达的免疫原以及需要引起针对其的免疫应答的其他免疫原。疫苗可包含如上所述的各质粒。疫苗可包含多种质粒或其组合。可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫应答。
基因构建体可以包含编码可操作地连接到基因表达所需的调节元件的靶蛋白或免疫调节蛋白的核苷酸序列。根据本发明，提供了基因构建体的组合，其包括：含有编码靶蛋白的可表达形式的核苷酸序列的一个构建体，以及含有编码免疫调节蛋白的可表达形式的核苷酸序列的一个构建体。将含有基因构建体的组合的DNA或RNA分子递送进活细胞可导致该DNA或RNA的表达，并产生靶蛋白以及一种或多种免疫调节蛋白。结果是增强了针对该靶蛋白的免疫应答。
可采用本发明来使个体对病原体例如病毒、原核生物和致病性真核生物(诸如单细胞致病生物和多细胞寄生虫)免疫。本发明特别可用于使个体对感染细胞和无衣壳的那些病原体(例如病毒和原核生物，诸如淋球菌、李斯特菌属和志贺菌属)免疫。此外，本发明还可用于使个体对原生动物病原体免疫，所述原生动物病原体在其生命周期中的某一阶段为胞内病原体。表1提供了可制备其根据本发明的疫苗的一些病毒科和属的列表。疫苗中可采用含有编码肽的DNA序列的DNA构建体，所述肽含有至少一个与例如表中所列的那些病原体抗原所展示的表位相同的或基本上相似的表位。此外，本发明还可用于使个体对其他病原体免疫，包括如表2所列的那些原核病原体和真核原生动物病原体以及多细胞寄生虫。
表1-病毒
小RNA病毒科
属：
鼻病毒属：(医学)引起约-50％的普通感冒病例。
肠病毒(Etheroviruses)：(医学)包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和人肠道病毒，诸如甲肝病毒。
口疮病毒(Apthoviruses)：(兽医)这些是口蹄疫病毒。
靶抗原：VP1、VP2、VP3、VP4、VPG
杯状病毒科
属：
诺瓦克群病毒属：(医学)这些病毒是流行性胃肠炎的重要病原体。
披膜病毒科
属：
α病毒属：(医学和兽医)实例包括Sindbis病毒、罗斯河病毒(RossRiver virus)以及东方和西方马脑炎病毒。
呼肠孤病毒属：(医学)风疹病毒。
黄病毒科
实例包括：(医学)登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和虱传脑炎病毒。西尼罗病毒(Genbank NC001563、AF533540、AF404757、AF404756、AF404755、AF404754、AF404753、AF481864、M12294、AF317203、AF196835、AF260969、AF260968、AF260967、AF206518和AF202541)
代表性靶抗原：E NS5C
丙肝病毒：(医学)这些病毒不属于任何科，但据信是披膜病毒或黄病毒。大部分类似于披膜病毒科。
冠状病毒科：(医学和兽医)
传染性支气管炎病毒(禽类)
猪可传播性胃肠炎病毒(猪)
猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)
猫传染性腹膜炎病毒(猫)
猫小肠冠状病毒(猫)
狗冠状病毒(狗)
SARS相关冠状病毒
人呼吸道冠状病毒引起约40％的普通感冒病例。EX.224E，OC43。注意-冠状病毒可引起非甲型、非乙型和非丙型肝炎。
靶抗原：E1-也称为M蛋白或基质蛋白，E2-也称为S蛋白或刺突蛋白，E3-也称为BE或血凝素-elterose糖蛋白(并不存在于所有冠状病毒中)N-核衣壳
棒状病毒科
属：
水疤病毒(Vesiculovirus)、狂犬病病毒：(医学和兽医)狂犬病
靶抗原：G蛋白、N蛋白
线状病毒科：(医学)
出血热病毒，例如马堡病毒和埃博拉病毒
副粘病毒科：
属：
副粘病毒属：(医学和兽医)腮腺炎病毒、新城疫病毒(鸡中的重要致病原)
麻疹病毒属：(医学和兽医)麻疹病毒、狗瘟热
肺病毒：(医学或兽医)呼吸道合胞病毒
正粘液病毒科(医学)流感病毒
布尼亚病毒(Bunyavirus)科
属：
布尼亚病毒属：(医学)加利福尼亚脑炎、La Crosse
白岭热病毒属：(医学)里夫特山谷热病
汉坦病毒属：Puremala是一种hemahagin热病毒
内罗毕病毒属(兽医)内罗毕绵羊病
还有许多未分类的布尼亚病毒属
砂粒病毒科(医学)LCM、拉沙热病毒
呼肠孤病毒科
属：
呼肠孤病毒属：潜在的人病原体
轮状病毒：儿童急性胃肠道炎
环状病毒属：(医学和兽医)科罗拉多虱传热病毒、
菜邦博病毒(Lebombo)(人)马脑炎病毒、蓝舌病毒
逆转录病毒科
亚科：
致癌病毒亚科(Oncorivirinal)：(兽医)(医学)猫白血病病毒、HTLVI和HTL VII
慢病毒亚科：(医学和兽医)HIV、猫免疫缺陷病毒、马传染性病毒、贫血病毒
泡沫病毒亚科(Spumavirinal)乳多空病毒(Papovavirus)科
亚科：
多瘤病毒亚科：(医学)BKU和JCU病毒
亚科：
乳头瘤病毒亚科：(医学)与癌症或乳头瘤的恶性进展有关的许多种病毒
腺病毒(医学)EXAD7、ARD.、O.B.-引起呼吸道疾病-某些腺病毒(诸如275)引起肠炎
细小病毒科(兽医)
猫细小病毒：引起猫肠炎
猫传染性粒细胞缺乏病毒(Feline panleucopeniavirus)
狗细小病毒
猪细小病毒
疱疹病毒科
亚科：
α疱疹病毒亚科
属：
单纯疱疹病毒属(医学)
HSVI(Genbank X14112，NC001806)、
HSVII(NC001798)
水痘病毒属：(医学和兽医)
假性狂犬病
水痘带状疤疹
亚科
β疱疹病毒亚科
属：
巨细胞病毒属(医学)
HCMV
鼠巨细胞病毒属(Muromegalovirus)
亚科
γ疱疹病毒亚科
属：
淋巴隐病毒属(医学)
EBV-(伯基特淋巴瘤)
痘病毒科
亚科：
带状痘病毒亚科(医学-兽医)
属：
天花(痘疮)
痘疹(牛痘)
副痘病毒属-兽医
禽痘病毒(Auipoxvirus)-兽医
山羊痘病毒属(Capripoxvirus)
兔痘病毒属(Leporipoxvirus)
猪痘病毒属(Suipoxviru’s)
亚科：
昆虫痘病毒亚科(Entemopoxviridue)
嗜肝DNA病毒科
乙型肝炎病毒
未分类的丁型肝炎病毒
表2
细菌病原体
病原性革兰阳性球菌包括：肺炎球菌属、葡萄球菌属和链球菌属。
病原性革兰阴性球菌包括：脑膜炎球菌属和淋球菌属。
病原性革兰阴性肠道杆菌包括：肠杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属和艾肯菌属、类鼻疽、沙门菌属、志贺菌属、嗜血杆菌属、软性下疮、布鲁菌属、土拉菌属、耶尔森菌属(巴斯德菌属)、念珠状链杆菌(streptobacillus mortiliformis)和螺菌属、单核细胞增生李斯特菌、猪红斑丹毒丝菌、白喉(diphtheria)、霍乱、炭疽(anthrax)、杜诺万菌(性病性肉芽肿)和巴尔通氏体病(bartonellosis)。
病原性厌氧菌包括：破伤风(tetanus)、肉毒杆菌(botulism)、其他梭菌属、结核(tuberculosis)、麻风(leprosy)和其他分枝杆菌属。
病原性螺旋体病包括：梅毒、密螺旋体病、热带肉芽肿(yaws)、品他病(pinta)和地方流行性梅毒和钩端螺旋体病。
由较高级病原菌和病原性真菌引起的其他感染包括：放线菌病、诺卡菌病、隐球菌病、酵母病、组织胞浆菌病和球孢子菌病、念珠菌病、曲霉病、和毛霉菌病、孢子丝菌病、副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、霉样真菌病(petriellidiosis)、球拟酵母菌病、足分枝菌病和着色真菌病(chromomycosis)以及皮肤真菌病。
立克次体感染包括立克次体属微生物(rickettsial)和立克次体病。
支原体和衣原体感染的实例包括：支原体肺炎、性病性淋巴肉芽肿、鹦鹉热和围产期衣原体感染。
病原性真核细胞
病原性原虫和蠕虫以及由此的感染包括：阿米巴病、疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形体病、卡氏肺囊虫病、巴贝虫病、贾第鞭毛虫病、旋毛虫病、丝虫病、血吸虫病、线虫病、蛭(trematodes)、吸虫病和绦虫(cestode)(带虫(tapeworm))感染。
为制备基因疫苗以提供对病原体的保护力，必须在基因构建体中作为靶的编码序列而包含编码免疫原性蛋白的遗传物质，以引发对其的保护性免疫应答。因为DNA和RNA均较小，而制备相对容易，因此本发明提供了可采用多种病原体抗原进行疫苗接种的另外优点。用于基因疫苗的基因构建体可包含编码多种病原体抗原的遗传物质。例如，一个构建体中可包含数种病毒基因，从而提供多种靶。
表1和表2包括一些致病因子和生物体的列表，可以制备它们的基因疫苗以保护个体免遭其感染。
在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与在均以引用方式并入本文的以下专利文献中所示的一种或多种DNA疫苗构建体的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US07/74769和相应的美国专利申请号12/375,518中所公开的(人免疫缺陷病毒)HIV疫苗、(丙型肝炎病毒)HCV疫苗、人乳头瘤病毒(HPV)疫苗、流感疫苗或hTERT靶向癌症疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US08/83281和相应的美国专利申请号12/269,824或PCT申请PCT/US11/22642和相应的美国专利申请号12/694,238中所公开的流感疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US08/081627和相应的美国专利申请13/127,008中所公开的HCV疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US10/21869和相应的美国专利申请号12/691,588或美国临时专利申请号61/442,162中所公开的HPV疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US09/045420和相应的美国专利申请号12/473634中所公开的天花疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US09/039656和相应的美国专利申请号12/936,186中所公开的基孔肯雅病疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与PCT申请PCT/US10/55187中所公开的口蹄疫病毒(FMDV)疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与美国临时专利申请号61/386,973中所公开的疟疾疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与美国临时专利申请号61/413,176或美国临时专利申请号61/417,817中所公开的前列腺癌疫苗的组合。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与美国临时专利申请号61/438,089中所公开的人巨细胞病毒(CMV)疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含优化的IL-12与以下专利中所公开的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)疫苗：2011年12月12日提交的名称为“PROTEINS COMPRISING MRSA PBP2AANDFRAGMENTS THEREOF，NUCLEIC ACIDS ENCODING THE SAME，AND COMPOSITIONS AND THEIR USE TO PREVENT AND TREATMRSA INFECTIONS”的美国临时专利申请号61/569,727和指定的代理人案卷号133172.04000(X5709)及其相应的PCT申请，其要求与此提交的专利申请同日提交的美国临时专利申请号61/569,727的优先权，它们均以引用方式整体并入本文。本文所公开的所有专利和专利申请均以引用方式整体并入本文。
本发明另一方面提供了向抵御过度增殖性疾病特征性的过度增殖性细胞赋予保护性免疫应答的方法，以及治疗患过度增殖性疾病个体的方法。过度增殖性疾病的实例包括所有形式的癌症和银屑病。
已经发现，将包含编码免疫原性“过度增殖细胞”相关蛋白的核苷酸序列的基因构建体引入个体细胞能导致在个体的疫苗接种细胞内产生这些蛋白。为了对过度增殖性疾病免疫，可向个体施用包含编码过度增殖性疾病相关蛋白的核苷酸序列的基因构建体。
为使过度增殖相关蛋白成为有效的免疫原性靶标，其必须是只在过度增殖细胞内产生，或在过度增殖细胞内产生的水平高于正常细胞的蛋白。靶抗原包括此类蛋白、其片段和肽，它们包含存在于此类蛋白上的至少一个表位。在一些情况下，过度增殖相关蛋白是编码蛋白的基团的突变产物。除了以下方面外，突变基因编码的蛋白与正常蛋白几乎相同：其氨基酸序列略有不同因而产生正常蛋白上没有的不同表位。此类靶蛋白包括由诸如myb、myc、fyn的原癌基因和转座基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的那些蛋白。除了作为靶抗原的原癌基因产物外，用于抗癌治疗和保护性方案的靶蛋白还包含B细胞淋巴瘤所产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，它们也可用作自身免疫疾病的靶抗原。可采用其他肿瘤相关蛋白作为靶蛋白，诸如以较高的水平存在于肿瘤细胞中的蛋白，包括单克隆抗体17-IA所识别的蛋白和叶酸结合蛋白或PSA。
虽然可采用本发明使个体对若干癌症形式中的一种或多种免疫，但是本发明尤其可用于预防性免疫接种易患某种特定癌症或曾患癌症因而易复发的个体。遗传学和技术以及流行病学的发展已能测定和评估个体发生癌症的几率和风险。可利用基因筛检和/或家族健康史来预测某特定个体患若干癌症中任何一种的可能性。
类似地，那些曾患癌症和已接受治疗移除癌症或处于缓解中的个体尤其易复发。作为治疗方案的一部分，可对此类个体针对已明确诊断的癌症进行免疫接种以抵御复发。因此，一旦得知个体曾患有某种类型的癌症并有复发危险时，即可对他们进行免疫接种，以便使其免疫系统作好准备以抵御该癌症的任何将来出现。
本发明提供治疗患过度增殖性疾病个体的方法。在此类方法中，引入的基因构建体用作免疫治疗剂，从而指导和促进个体的免疫系统抵御产生靶蛋白的过度增殖细胞。在治疗或者预防癌中，不含细胞的实施方案是尤其有用的。
本发明通过赋予对抗自身免疫相关靶(包括细胞受体和产生针对“自身抗原”的抗体的细胞)的广泛保护性免疫应答而提供治疗患自身免疫疾病和障碍的个体的方法。
T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、斯耶格伦综合征、肉样瘤病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。上述各种疾病的特征在于结合内源性抗原并引起自身免疫疾病相关的炎性级联反应的T细胞受体。针对T细胞可变区的疫苗接种将引起包括CTL的免疫应答从而消除那些T细胞。
在RA中，已表征了在该疾病中涉及的T细胞受体(TCR)的几个特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3、Vβ-14、20Vβ-17和Vα-17。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种将引起免疫应答，该免疫应答靶向RA中涉及的T细胞。参见：Howell，M.D.等人，1991Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：10921-10925；Piliard，X.等人，1991Science 253：325-329；Williams，W.V.等人，1992J Clin.Invest.90：326-333；这些文献的每一者以引用方式并入本文。在MS中，已表征了在该疾病中涉及的TCR的几个特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种将引起免疫应答，该免疫应答靶向MS中涉及的T细胞。参见：Wucherpfennig，K.W.等人，1990Science 248：1016-1019；Oksenberg，J.R.等人，1990Nature 345：344-346；这些文献的每一者以引用方式并入本文。
在硬皮病中，已表征了在该疾病中涉及的TCR的几个特异性可变区。这些TCR包括：Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14和Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种将引起免疫应答，该免疫应答靶向硬皮病中涉及的T细胞。
为治疗T细胞介导的自身免疫疾病患者，尤其是TCR可变区尚未表征的那些疾病，可以进行滑膜活检。可采集存在T细胞的样品，并用标准技术鉴定那些TCR的可变区。可利用这些信息制备基因疫苗。
B细胞介导的自身免疫疾病包括狼疮(SLE)、格雷夫斯病、重症肌无力、自身免疫溶血性贫血、自身免疫血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆道硬化症和恶性贫血。这些疾病各自的特征在于结合到内源性抗原并引发与自身免疫疾病相关的炎性级联反应的抗体。针对抗体的可变区的疫苗接种将引发包括CTL的免疫应答以消除产生这种抗体的B细胞。
为治疗B细胞介导的自身免疫疾病患者，必须鉴定自身免疫活动中涉及的抗体的可变区。可进行活检，并可采集在炎症部位存在的抗体样品。可用标准技术鉴定那些抗体的可变区。可利用这些信息制备基因疫苗。
就SLE而言，据信一种抗原为DNA。因此，可以筛检待免疫接种以抵御SLE的患者血清中的抗DNA抗体，并可制备包含DNA构建体的疫苗，所述DNA构建体编码存在于所述血清中的此类抗DNA抗体的可变区。
TCR和抗体可变区之中的共同结构特征是熟知的。通常可按照以下熟知的方法发现编码特定TCR或抗体的DNA序列，例如以引用方式并入本文的以下文献中所述的方法：Kabat等人1987Sequence ofProteins of Immunological Interest U.S.Department of Health andHuman Services，Bethesda Md.。此外，克隆抗体的功能性可变区的一般方法可见于以引用方式并入本文的文献：Chaudhary，V.K.等人，1990Proc.Natl.Acad Sci.USA 87：1066。
除了使用可表达形式的免疫调节蛋白编码序列来改进基因疫苗外，本发明还涉及改进的减毒活疫苗以及使用重组载体以递送编码抗原的外源基因的改进疫苗。减毒活疫苗和那些使用重组载体以递送外源基因的疫苗的实例见述于美国专利：4,722,848、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734和5,482,713，它们均以引用方式并入本文。本发明提供基因构建体，其包含IL-12构建体或其功能片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接到调节序列，该调节序列可在疫苗中起到实现表达的作用。将基因构建体并入减毒活疫苗和重组疫苗中以产生根据本发明的改进疫苗。
疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包含表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其他已知的转染促进剂。
转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L-谷氨酸(LGS)或脂质。转染促进剂为多聚L-谷氨酸，并且更优选地，多聚L-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡例如角鲨烯和角鲨烯，并且也可将透明质酸与基因构建体一同施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包含转染促进剂例如脂质、脂质体，包括作为DNA-脂质体混合物的卵磷脂脂质体或其他本领域已知的脂质体(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括多聚L谷氨酸(LGS)或脂质。疫苗中转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种另外的佐剂。佐剂可以是从相同的质粒或从替代质粒表达的其他基因，或作为蛋白与疫苗中的上述质粒组合地递送。所述一种或多种佐剂可以是蛋白和/或编码选自以下蛋白的核酸分子：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-15(包括这样的IL-15，其信号序列或编码信号序列的编码序列缺失，且任选地包含不同的信号肽(例如来自IgE的信号肽)或编码不同信号肽(例如来自IgE的信号肽)的编码序列)、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段或其组合。在一些实施方案中，另外的佐剂可以是一种或多种蛋白和/或编码选自IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES的蛋白的核酸分子。IL-15构建体和序列的实例在PCT申请PCT/US04/18962和相应的美国专利申请10/560,650、以及在PCT申请PCT/US07/00886和相应的美国专利申请12/160,766、以及在PCT申请PCT/US10/048827中有所公开。IL-28构建体和序列的实例在PCT申请PCT/US09/039648和相应的美国专利申请12/936,192中有所公开。RANTES以及其他构建体和序列在PCT申请PCT/US1999/004332和相应的美国专利申请09/622452中有所公开。RANTES构建体和序列的其他实例在PCT申请PCT/US11/024098中有所公开。RANTES以及其他构建体和序列的实例在PCT申请PCT/US1999/004332和相应的美国专利申请09/622452中有所公开。RANTES构建体和序列的其他实例在PCT申请PCT/US11/024098中有所公开。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例在PCT申请PCT/US2005/042231和相应的美国专利申请11/719,646中有所公开。OX40和其他免疫调节剂的实例在美国专利申请10/560,653中有所公开。DR5和其他免疫调节剂的实例在美国专利申请09/622452中有所公开。
疫苗还可以包含1994年4月1日提交的美国专利021,579(其以引用方式整体并入本文)中描述的基因疫苗促进剂。
疫苗可按如下的量包含共有抗原和质粒；约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选约0.1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克、约1微克至约10毫克、约0.1微克至约10毫克、约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的共有抗原或其质粒。
可根据待使用的施用模式来配制疫苗。注射用疫苗药物组合物可以是无菌、无热原以及无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸缓冲盐水。疫苗还可以包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定化可使得制剂在室温或环境温度下长期稳定，例如将LGS或聚阳离子或聚阴离子加入疫苗制剂。
5.递送疫苗的方法
本文提供了用于递送包含IL-12构建体的疫苗以针对疫苗免疫原有效产生免疫应答的方法。可提供递送疫苗或接种的方法以诱导治疗性和预防性免疫应答。接种过程可在哺乳动物中产生抗免疫原免疫应答。可向个体递送疫苗以调节哺乳动物的免疫系统的活动以及增强免疫应答。疫苗的递送可以是转染在一个或多个核酸分子上编码免疫原和IL-12构建体的序列。该编码序列在细胞中表达并递送到细胞表面，在其上免疫系统加以识别并诱导细胞、体液或细胞和体液应答。疫苗的递送可用于通过向哺乳动物施用如上所述的疫苗来诱导或引发哺乳动物中针对免疫原的免疫应答。包含IL-12构建体导致更有效的免疫应答。
在将疫苗和质粒递送进哺乳动物细胞后，转染的细胞将表达和分泌由通过疫苗注射的质粒所编码的免疫原和IL-12。这些免疫原将被免疫系统识别为外来物并将产生针对它们的抗体。这些抗体将被免疫系统维持并能对后续感染产生有效的应答。存在由IL-12构建体编码的IL-12导致更强的免疫应答。
可向哺乳动物施用疫苗以引起哺乳动物的免疫应答。哺乳动物可以为人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、骆马、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
a.联合治疗
可将IL-12构建体与其他蛋白和/或编码以下一者或多者的基因组合施用：α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-15(包括信号序列缺失的并任选地包含来自IgE的信号肽的IL-15)、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-28、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段或其组合。
可通过不同的途径施用疫苗，包括经口、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过颊面施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或其组合。对于兽医学用途，可按正常兽医学实践将组合物作为适当地可接受的制剂施用。兽医可容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。可利用常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其他物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“水动力学法”或超声施用疫苗。
可通过若干熟知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组疫苗。共有抗原可通过DNA注射结合体内电穿孔来递送。
b.电穿孔
可使用电穿孔装置来实现通过疫苗质粒的电穿孔而施用疫苗，所述电穿孔装置可被构造成将有效引起可逆的孔在细胞膜中形成的能量脉冲递送至哺乳动物的所需组织，并且优选的是，能量脉冲是与由使用者预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置包括电穿孔组件、电极组合件或柄部组合件。电穿孔组件可以包括并纳入电穿孔装置的各种元件(包括控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通讯端口、存储器组件、电源和电源开关)的一种或多种。电穿孔可使用体内电穿孔装置例如CELLECTRA EP系统(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell，PA)或Elgen电穿孔仪(Genetronics，San Diego，CA)来实现以有利于质粒对细胞的转染。
电穿孔组件可用作电穿孔装置的一个元件，而其他元件是与电穿孔组件相连的单独元件(或组件)。电穿孔组件可以用作电穿孔装置的不止一个元件，这些元件可以与电穿孔组件分开的电穿孔装置的另外其他元件相连。作为一个机电或机械装置的部件存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为所述元件可用作一个装置或用作彼此连通的单独元件。电穿孔组件能够递送能量脉冲并包括反馈机制，该能量脉冲在所需的组织中产生恒定电流。电极组合件可包括具有空间排布的多个电极的电极阵列，其中电极组合件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并通过电极将该能量脉冲递送至所需的组织。所述多个电极中的至少一个在能量脉冲的递送中是中性的，并测量所需组织中的阻抗，且将该阻抗传至电穿孔组件。反馈机制可以接收测得的阻抗，并可调节电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以按分散的形式递送能量脉冲。所述多个电极可以通过电极的控制按程序化的序列以分散形式递送能量脉冲，并且所述程序化的序列由使用者输入到电穿孔组件。程序化的序列可包括按序列递送的多个脉冲，其中所述多个脉冲的每个脉冲由至少两个活性电极递送，其中一个是测量阻抗的中性电极，并且其中所述多个脉冲的后续脉冲由不同于至少两个活性电极(其中一个是测量阻抗的中性电极)的电极递送。
反馈机制由硬件或软件执行。反馈机制由模拟闭环电路执行。该反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选地为实时反馈或瞬时反馈(即，通过测定响应时间的可用技术测定时基本上为瞬时的)。中性电极可测量所需组织中的阻抗并将该阻抗传至反馈机制，并且反馈机制响应该阻抗且调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值。在能量脉冲的递送过程中，反馈机制连续且瞬时地维持恒定电流。
可促进本发明的DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利7,245,963、Smith等人提交的美国专利公布2005/0052630中所述的那些，这些专利的内容均以引用方式整体并入本文。可用于促进DNA疫苗递送的其他电穿孔装置和电穿孔方法包括在2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请11/874072中所提供的那些，所述美国专利申请根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时专利申请60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982的权益，将这些专利申请均以引用方式整体并入本文。
Draghia-Akli等人的美国专利7,245,963描述了模块化电极系统及其在促进将生物分子引入体内或植物的选定组织的细胞中的用途。该模块化电极系统可包括多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器向所述多个针电极的导电性连接的电连接器；和电源。操作员可握住安装在承载结构上的所述多个针电极并将它们牢牢插入体内或植物的选定组织。然后生物分子经由皮下针递送至选定的组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器并将恒定电流电脉冲施加到所述多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进生物分子引入所述多个电极之间的细胞。美国专利7,245,963的全部内容以引用方式并入本文。
Smith等人提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效促进将生物分子引入体内或植物的选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由软件或固件规定其操作的电动装置(“EKD装置”)。EKD装置基于使用者控制和脉冲参数的输入在电极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲模式，并允许存储和获得电流波形数据。该电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可移除的导向盘。将美国专利公布2005/0052630的全部内容以引用方式并入本文。
美国专利7,245,963和美国专利公布2005/0052630中所述的电极阵列和方法不仅可适用于深层穿入诸如肌肉的组织，而且还可适用于深层穿入其他组织或器官。由于电极阵列的构造，注射针(用于递送所选生物分子)也被完全插入靶器官，并在由电极所预描绘的区域垂直于所述靶组织进行注射。美国专利7,245,963和美国专利公布2005/005263中所述的电极优选为20mm长和21号。
此外，在一些实施方案中设想了包括电穿孔装置及其用途，在这些实施方案中存在以下专利中所述的那些电穿孔装置：1993年12月28日公布的美国专利5,273,525、2000年8月29日公布的美国专利6,110,161、2001年7月17日公布的6,261,281和2005年10月25日公布的6,958,060以及2005年9月6日公布的美国专利6,939,862。此外，本文设想了涵盖2004年2月24日公布的美国专利6,697,669(涉及使用多种装置中的任一种递送DNA)以及2008年2月5日公布的美国专利7,328,064中所提供的适于DNA注射方法的主题的专利。将上述专利以引用方式整体并入本文。
c.制备DNA质粒的方法
本文提供了用于制备构成本文所述的DNA构建体和疫苗的DNA质粒的方法。在最终亚克隆进哺乳动物表达质粒的步骤后，可使用本领域已知的方法将DNA质粒用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。
可使用已知的装置和技术的组合来配制或制备与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选地使用在2007年5月23日提交的许可、共同未决的美国临时专利申请美国60/939,792中所述的优化质粒制备技术来制造质粒。在一些实例中，可以大于或等于10mg/mL的浓度配制这些研究中使用的DNA质粒。除了美国专利60/939792中所述的装置和方案(包括2007年7月3日发布的许可美国专利7,238,522中所述的装置和方案)外，制造技术还包括或结合对于本领域普通技术人员而言通常已知的各种装置和方案。将上述申请和专利(分别为美国专利60/939,792和美国专利7,238,522)整体并入本文。
6.免疫调节组合物和方法
在一些实施方案中，在不添加编码免疫原的核酸序列的情况下递送编码IL-12亚单位的核酸序列。在此类方法中，将编码IL-12亚单位的核酸序列用作免疫治疗剂，其在表达以产生功能性IL-12时，为个体赋予所需的免疫调节作用。除了不包括编码免疫原的核酸序列外，均如上所述提供并递送编码IL-12亚单位的核酸序列。在此类方法中，可将编码IL-12亚单位的核酸序列单独地或与其他免疫调节蛋白(诸如在标题为“联合治疗”章节中所述的那些)相结合用作免疫治疗剂。
实施例
在以下实施例中进一步对本发明进行阐述。应当理解，这些实施例虽然表示本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。根据上文中的论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和变动以使之适合于各种用法和条件。因此，根据上述说明，除了本文中显示和描述的变动外的本发明的各种变动对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类变动也旨在落在所附权利要求的范围内。
实施例1
比较phuIL12-opt与phuIL12-nonopt的表达水平。
对phuIL12-opt与phuIL12-nonopt的表达水平进行了比较，表明重要的密码子/RNA优化策略可增强设计的合成IL-12的表达水平/佐剂效应。
使用FuGene6转染试剂(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)根据制造商的说明将293T细胞(7.5×105个)在6孔板中分别用2或4μghuIL12-opt或huIL12-nonopt转染。将DNA和FuGene6转染试剂以1μg DNA∶3μl FuGene6试剂的DNA∶FuGene6比率按顺序加入无血清的培养基。无血清培养基的体积通过制备等于200μl的整个混合物总体积所需的量而确定。将混合物加入细胞的各孔中并在37℃下在5％C02环境中温育48小时。在温育结束时，采集上清液样品进行ELISA测定。
将高蛋白结合板(Nunc，Rochester，NY)用100μl/孔的得自人IL-12ELISA试剂盒(Mabtech，Mariemont，OH)的单克隆抗体MT86/221包被并在4℃下温育过夜。在温育后，将板用PBST(含0.1％Tween 20的DPBS)洗涤两次，并用补充了0.05％Tween 20和0.1％BSA的200μl/孔的DPBS溶液封闭1小时。随后将板用PBST洗涤。使用制造商的说明，由hIL-12p70(Mabtech，Mariemont，OH)制备了阳性标准品。将阳性标准品和上清液以1∶50、1∶150、1∶450、1∶1350和1∶4050的稀释度按100μl/孔的体积加入平行孔。使用上述封闭液将样品和阳性标准品稀释。然后将板在4℃下温育过夜。之后，将板用PBST洗涤，并用100μl/孔的mAB MT618-生物素(Mabtech，Mariemont，OH)温育1小时。在温育后，将板再次洗涤，并用100μl/孔的以1∶1000在封闭缓冲液中稀释的链霉亲和素-HRP温育1小时。然后将板用PBST再次洗涤，并用TMB和2N H2SO4显色。使用分光光度计在450nm处读取板。
如图1A和1B所示，huIL12-opt质粒与huIL12-nonopt相比表现出更高的IL-12表达水平。明显的是，密码子/RNA优化策略改善了IL-12的表达。
实施例2
通过pMacIL12-opt接种引起的增强PSA和PSMA特异性细胞免疫应答。
将恒河猴用1mg PSA和PSMA与0.04mg pMacIL-12-opt的组合经肌内免疫，然后用得自Inovio Pharmaceuticals的Cellectra装置电穿孔。各免疫两周后，采集恒河猴血样，并分离PBMC以进行PSA和PSMA特异性IFN-γELISpot测定。接受pMacIL12-opt的动物组与未接受pMacIL12-opt的动物组相比显示出峰值应答的约3倍增加(图2)。
实施例3
通过pMacIL12-opt接种引起的增强HBV核心和表面抗原特异性细胞免疫应答。
将恒河猴用1mg核心和表面抗原与0.04mg pMacIL-12-opt的组合经肌内免疫，然后用得自Inovio Pharmaceuticals的Cellectra装置电穿孔。各免疫两周后，采集恒河猴血样，并分离PBMC以进行核心和表面抗原特异性IFN-γELISpot测定。接受pMacIL12-opt的动物组与未接受pMacIL12-opt的动物组相比显示出细胞应答的幅度和广度的增加(图3)。

Claims (66)

1.一种组合物，所述组合物包含a)编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列，以及b)编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列，其中
编码IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列与SEQ IDNO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白，或编码与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的功能片段以及编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白；并且
编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列与SEQ IDNO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白，或编码与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的功能片段以及编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白。
2.根据权利要求1所述的组合物，包含：
编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白；并且
编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白。
3.根据权利要求2所述的组合物，包含：
编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少99％同源的蛋白；并且
编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少99％同源的蛋白。
4.根据权利要求3所述的组合物，包含：
编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码SEQ ID NO：2；并且
编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码SEQ ID NO：4。
5.根据权利要求2所述的组合物，包含：
编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码与SEQ ID NO：2至少99％同源的蛋白；并且
编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：3至少99％同源并编码与SEQ ID NO：4至少99％同源的蛋白。
6.根据权利要求2所述的组合物，包含：
编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码SEQ ID NO：2；并且
编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列与SEQ ID NO：3至少99％同源并编码SEQ ID NO：4。
7.根据权利要求2所述的组合物，包含：
编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列为SEQ ID NO：1，并且
编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列为SEQ ID NO：3。
8.根据权利要求2所述的组合物，所述组合物被配制成使用电穿孔递送给个体。
9.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列位于与编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列不同的核酸分子上。
11.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列位于质粒上，并且编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于不同的质粒上。
12.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的核酸分子上。
13.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的质粒上。
14.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的核酸分子上并可操作地连接到不同的启动子。
15.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列位于相同的质粒上并可操作地连接到不同的启动子。
16.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，还包含编码免疫原的核酸序列。
17.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，还包含编码来自病原体的免疫原的核酸序列，所述病原体选自：HIV、HPV、HCV、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、疟疾、人巨细胞病毒、人呼吸道合胞病毒和MRSA。
18.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，其中将编码IL-12p35亚单位的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位的所述核酸序列掺入病毒颗粒中。
19.根据权利要求2-8任一项所述的组合物，还包含编码选自IL-15和IL-28的一种或多种蛋白的核酸序列。
20.根据权利要求1所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列。
21.根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少99％同源的蛋白的核酸序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少99％同源的蛋白的核酸序列。
22.根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码SEQ ID NO：2的功能片段的核酸序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码SEQ ID NO：4的功能片段的核酸序列。
23.根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码SEQ ID NO：2的功能片段的核酸序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少99％同源并编码SEQ ID NO：4的功能片段的核酸序列。
24.根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO：2的功能片段的SEQ ID NO：1的片段，和/或b)编码SEQ ID NO：4的功能片段的SEQ ID NO：3的片段。
25.根据权利要求20所述的组合物，包含a)不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列的SEQ ID NO：1的片段，和/或b)不含IL-12p40亚单位信号肽的编码序列的SEQ ID NO：3的片段。
26.根据权利要求25所述的组合物，包含a)不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列并连接有编码信号肽的核酸序列的SEQ IDNO：1的片段，和/或b)不含IL-12p40亚单位信号肽的编码序列并连接有编码信号肽的核酸序列的SEQ ID NO：3的片段。
27.根据权利要求20所述的组合物，包含a)不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列并连接着编码SEQ ID NO：5的核酸序列的SEQ ID NO：1的片段，和/或b)不含IL-12p40亚单位信号肽的编码序列并连接着编码SEQ ID NO：5的核酸序列的SEQ ID NO：3的片段。
28.根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO：2的第23-219位氨基酸的SEQ ID NO：1的片段，和/或b)编码SEQ IDNO：4的第23-328位氨基酸的SEQ ID NO：3的片段。
29.根据权利要求28所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO：2的第23-219位氨基酸的SEQ ID NO：1的片段，其连接着编码信号肽的核酸序列，和/或b)编码SEQ ID NO：4的第23-328位氨基酸的SEQID NO：3的片段，其连接着编码信号肽的核酸序列。
30.根据权利要求28所述的组合物，包含a)编码SEQ ID NO：2的第23-219位氨基酸的SEQ ID NO：1的片段，其连接着编码SEQ IDNO：5的核酸序列，和/或b)编码SEQ ID NO：4的第23-328位氨基酸的SEQ ID NO：3的片段，其连接着编码SEQ ID NO：5的核酸序列。
31.根据权利要求20所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，其不含IL-12p35亚单位信号肽的编码序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，其不含IL-12p40亚单位信号肽的编码序列。
32.根据权利要求31所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码信号肽的编码序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码信号肽的编码序列。
33.根据权利要求31所述的组合物，包含a)编码IL-12p35的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码SEQ ID NO：5的编码序列，和/或b)编码IL-12p40的功能片段的核酸序列，所述核酸序列是与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列，其可操作地连接到编码SEQ ID NO：5的编码序列。
34.根据权利要求1所述的组合物，其中编码所述IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列位于与编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列不同的核酸分子上。
35.根据权利要求1所述的组合物，其中编码所述IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列位于与编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列不同的质粒上。
36.根据权利要求1所述的组合物，其中编码所述IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列是与编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列相同的核酸分子。
37.根据权利要求1所述的组合物，其中编码所述IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列是与编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列相同的质粒。
38.根据权利要求1所述的组合物，其中编码所述IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列位于相同的质粒上并可操作地连接到不同的启动子。
39.根据权利要求1所述的组合物，还包含编码免疫原的核酸序列。
40.根据权利要求1所述的组合物，还包含编码来自病原体的免疫原的核酸序列，所述病原体选自：HIV、HPV、HCV、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、疟疾、人巨细胞病毒、人呼吸道合胞病毒和MRSA。
41.根据权利要求1所述的组合物，其中将编码所述IL-12p35亚单位或其功能片段的所述核酸序列和编码IL-12p40亚单位或其功能片段的所述核酸序列掺入病毒颗粒中。
42.根据权利要求1所述的组合物，还包含编码选自IL-15和IL-28的一种或多种蛋白的核酸序列。
43.一种诱导针对免疫原的免疫应答的方法，包括以有效诱导个体中的免疫应答的量向所述个体施用权利要求1的组合物与编码免疫原的核酸序列的组合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中权利要求1所述的组合物还包含编码免疫原的核酸序列。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中免疫应答为治疗性的。
46.根据权利要求43或44所述的方法，其中免疫应答为预防性的。
47.一种核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位或其功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的核酸序列与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白，并且其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列是作为与SEQ IDNO：1至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位或其功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的核酸序列与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白，并且其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列是作为与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ IDNO：4的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列。
48.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少98％同源的蛋白的核酸序列；和/或与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少98％同源的蛋白的核酸序列。
49.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码与SEQ ID NO：2至少99％同源的蛋白的核酸序列；和/或与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码与SEQ ID NO：4至少99％同源的蛋白的核酸序列。
50.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：与SEQ ID NO：1至少98％同源并编码SEQ ID NO：2的核酸序列；和/或与SEQ ID NO：3至少98％同源并编码SEQ ID NO：4的核酸序列。
51.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码与SEQ ID NO：2至少99％同源的蛋白的核酸序列；和/或与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码与SEQ ID NO：2至少99％同源的蛋白的核酸序列。
52.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码SEQ ID NO：2的核酸序列；和/或与SEQ ID NO：1至少99％同源并编码SEQ ID NO：2的核酸序列。
53.根据权利要求47所述的核酸分子，包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3。
54.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ IDNO：3至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少98％同源的蛋白的核酸序列。
55.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少99％同源的蛋白的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ IDNO：3至少98％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少99％同源的蛋白的核酸序列。
56.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：1至少98％同源的核酸序列的片段并编码SEQ ID NO：2的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：3至少98％同源的核酸序列的片段并编码SEQ ID NO：4的核酸序列。
57.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：1至少99％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：2的功能片段至少99％同源的蛋白的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ IDNO：3至少99％同源的核酸序列的片段并编码与SEQ ID NO：4的功能片段至少99％同源的蛋白的核酸序列。
58.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：1至少99％同源的核酸序列的片段并编码SEQ ID NO：2的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为与SEQ ID NO：3至少99％同源的核酸序列的片段并编码SEQ ID NO：4的核酸序列。
59.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为SEQ ID NO：1的片段并编码SEQ ID NO：2的功能片段的核酸序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列是作为SEQ ID NO：3的片段并编码SEQ ID NO：4的功能片段的核酸序列。
60.根据权利要求47所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列不含编码SEQ ID NO：2的第1-22位氨基酸的编码序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列不含编码SEQ ID NO：4的第1-22位氨基酸的编码序列。
61.根据权利要求61所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列还包含编码信号肽的编码序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列还包含编码信号肽的编码序列。
62.根据权利要求61所述的核酸分子，包含：编码IL-12p35亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p35亚单位的功能片段的所述核酸序列还包含编码SEQ ID NO：5的编码序列；和/或编码IL-12p40亚单位的功能片段的核酸序列，其中编码IL-12p40亚单位的功能片段的所述核酸序列还包含编码SEQ ID NO：5的编码序列。
63.根据权利要求47-62任一项所述的核酸分子，所述核酸分子被配制成使用电穿孔递送给个体。
64.根据权利要求47-62任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子为质粒。
65.根据权利要求47-62任一项所述的核酸分子，还包含编码免疫原的核酸序列。
66.根据权利要求47-62任一项所述的核酸分子，还包含编码来自病原体的免疫原的核酸序列，所述病原体选自：HIV、HPV、HCV、流感、天花、基孔肯雅病、口蹄疫病毒、疟疾、人巨细胞病毒、人呼吸道合胞病毒和MRSA。
67.根据权利要求47-62任一项所述的核酸分子，其中将所述核酸分子掺入病毒颗粒。
CN201280069473.6A 2011-12-12 2012-12-11 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法 Active CN104245719B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161569600P 2011-12-12 2011-12-12
US61/569,600 2011-12-12
PCT/US2012/069017 WO2013090296A1 (en) 2011-12-12 2012-12-11 Compositions, comprising improved il-12 genetic constructs and vaccines, immunotherapeutics and methods of using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104245719A true CN104245719A (zh) 2014-12-24
CN104245719B CN104245719B (zh) 2016-09-14

Family

ID=48613120

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280069473.6A Active CN104245719B (zh) 2011-12-12 2012-12-11 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法

Country Status (13)

Country Link
US (4) US9272024B2 (zh)
EP (2) EP2791157A4 (zh)
JP (4) JP6333730B2 (zh)
KR (4) KR20220132652A (zh)
CN (1) CN104245719B (zh)
AU (1) AU2012352457B2 (zh)
BR (1) BR112014014078A8 (zh)
CA (1) CA2858893A1 (zh)
EA (1) EA026926B1 (zh)
HK (1) HK1205130A1 (zh)
MX (2) MX354986B (zh)
WO (1) WO2013090296A1 (zh)
ZA (1) ZA201404199B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520779A (zh) * 2016-11-09 2017-03-22 华南农业大学 一种通过密码子优化鸡il‑2基因提高鸡的il‑2蛋白表达效率的方法
CN110777115A (zh) * 2019-11-21 2020-02-11 北京启辰生生物科技有限公司 用于增强抗原递呈细胞致敏t细胞能力的组合物及应用

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2791157A4 (en) 2011-12-12 2015-10-14 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS WITH IMPROVED GENETIC IL-12 CONSTRUCTS AND VACCINES, IMMUNOTHERAPY THEREOF AND METHOD OF USE THEREOF
AU2014235120B2 (en) * 2013-03-15 2017-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines having an antigen and interleukin-23 as an adjuvant
MX2017009044A (es) * 2015-01-09 2018-01-11 Oncosec Medical Inc Metodo para el tratamiento de malignidades.
RU2749113C2 (ru) 2015-04-22 2021-06-04 Куревак Аг Содержащая рнк композиция для лечения опухолевых заболеваний
JP7246930B2 (ja) 2016-05-18 2023-03-28 モデルナティエックス インコーポレイテッド インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用
US20190336552A1 (en) 2016-05-30 2019-11-07 Astellas Pharma Inc. Genetically engineered vaccinia viruses
US10888594B2 (en) 2016-05-30 2021-01-12 National University Corporation Tottori University Genetically engineered vaccinia viruses
AU2018270111B2 (en) 2017-05-18 2022-07-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof
TWI824020B (zh) 2018-09-26 2023-12-01 日商安斯泰來製藥股份有限公司 藉由腫瘤溶解性牛痘病毒與免疫檢查點抑制劑併用之癌症療法以及用於其之醫藥組合物及組合醫藥
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
KR102524247B1 (ko) * 2018-12-21 2023-04-21 가톨릭대학교 산학협력단 p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도
CN115066255A (zh) 2019-09-18 2022-09-16 星际治疗有限公司 合成的dna载体和使用方法
CN115916233A (zh) 2019-10-03 2023-04-04 Xencor股份有限公司 靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白
US20230287075A1 (en) * 2021-12-13 2023-09-14 Deka Biosciences, Inc. Dual cytokine fusion proteins comprising multi-subunit cytokines
WO2023114967A1 (en) * 2021-12-17 2023-06-22 William Marsh Rice University Encapsulated cells expressing il-12 and uses thereof
WO2023229013A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 北京天一方生物科技▲発▼展有限公司 ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999047678A2 (en) * 1998-03-19 1999-09-23 Valentis, Inc. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
US6096869A (en) * 1995-03-22 2000-08-01 Cambridge University Technical Services, Ltd. Treatment of papillomavirus-associated lesions
US20030181405A1 (en) * 1999-03-12 2003-09-25 Nordstrom Jeffrey L. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
CN1798502A (zh) * 2003-05-30 2006-07-05 南佛罗里达大学 治疗恶性肿瘤的方法
WO2007084364A2 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Improved il-12 for expression in mammalian cells
WO2008089144A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Improved dna vaccination protocols
WO2010126766A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inducible interleukin-12

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5077044A (en) 1980-05-19 1991-12-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting shigella live vaccines
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US5223424A (en) 1985-09-06 1993-06-29 Prutech Research And Development Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence
US5310668A (en) 1986-06-20 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine
US5242829A (en) 1986-09-23 1993-09-07 Therion Biologics Corporation Recombinant pseudorabies virus
US5294441A (en) 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
IL86583A0 (en) 1987-06-04 1988-11-15 Molecular Eng Ass Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof
US5387744A (en) 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi
US5112749A (en) 1987-10-02 1992-05-12 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
WO1990010693A1 (en) 1989-03-08 1990-09-20 Health Research, Inc. Recombinant poxvirus host selection system
US5225336A (en) 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
DE69027313T2 (de) 1989-03-31 1997-01-23 Univ Washington Impfstoffe enthaltende avirulente phop-type mikroorganismen
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
US5294548A (en) 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
US5462734A (en) 1990-11-02 1995-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Bovine herpesvirus vaccine and method of using same
US5240703A (en) 1991-03-01 1993-08-31 Syntro Corporation Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
DE69434469T2 (de) 1993-01-26 2006-06-14 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von genetischem material
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
EP0931156A2 (en) * 1996-10-18 1999-07-28 Valentis Inc. Gene expression and delivery systems and uses
US6110161A (en) 1997-04-03 2000-08-29 Electrofect As Method for introducing pharmaceutical drugs and nucleic acids into skeletal muscle
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
DE69826124T3 (de) 1997-06-30 2007-10-11 Institut Gustave Roussy Verabreichung der nukleinsäure in den quergestreiften muskel
EP1100579B1 (en) 1998-07-13 2015-09-02 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
JP3543326B2 (ja) 2001-08-30 2004-07-14 ソニー株式会社 情報処理装置および方法、情報処理システム、情報配信装置、記録媒体、並びにプログラム
US7245963B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Advisys, Inc. Electrode assembly for constant-current electroporation and use
US8209006B2 (en) 2002-03-07 2012-06-26 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Constant current electroporation device and methods of use
US7328064B2 (en) 2002-07-04 2008-02-05 Inovio As Electroporation device and injection apparatus
US20040175727A1 (en) 2002-11-04 2004-09-09 Advisys, Inc. Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
WO2004108260A2 (en) 2003-05-30 2004-12-16 Advisys, Inc. Devices and methods for biomaterial production
EP2791157A4 (en) 2011-12-12 2015-10-14 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS WITH IMPROVED GENETIC IL-12 CONSTRUCTS AND VACCINES, IMMUNOTHERAPY THEREOF AND METHOD OF USE THEREOF
GB2504774A (en) 2012-08-10 2014-02-12 Munster Simms Eng Ltd Diaphragm pump with integral motor housing and rear pump housing
TWI548337B (zh) 2015-10-16 2016-09-01 技嘉科技股份有限公司 散熱模組、顯示卡組件及電子裝置

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096869A (en) * 1995-03-22 2000-08-01 Cambridge University Technical Services, Ltd. Treatment of papillomavirus-associated lesions
WO1999047678A2 (en) * 1998-03-19 1999-09-23 Valentis, Inc. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
US20030181405A1 (en) * 1999-03-12 2003-09-25 Nordstrom Jeffrey L. Interferon alpha plasmids and delivery systems, and methods of making and using the same
CN1798502A (zh) * 2003-05-30 2006-07-05 南佛罗里达大学 治疗恶性肿瘤的方法
WO2007084364A2 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Improved il-12 for expression in mammalian cells
WO2008089144A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Improved dna vaccination protocols
WO2010126766A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inducible interleukin-12

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520779A (zh) * 2016-11-09 2017-03-22 华南农业大学 一种通过密码子优化鸡il‑2基因提高鸡的il‑2蛋白表达效率的方法
CN110777115A (zh) * 2019-11-21 2020-02-11 北京启辰生生物科技有限公司 用于增强抗原递呈细胞致敏t细胞能力的组合物及应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP6333730B2 (ja) 2018-05-30
CN104245719B (zh) 2016-09-14
AU2012352457A1 (en) 2014-07-03
JP6803354B2 (ja) 2020-12-23
US20160235840A1 (en) 2016-08-18
KR102445129B1 (ko) 2022-09-20
US9272024B2 (en) 2016-03-01
HK1205130A1 (zh) 2015-12-11
EA201491171A1 (ru) 2014-09-30
US20220193230A1 (en) 2022-06-23
JP2015501840A (ja) 2015-01-19
JP2018134100A (ja) 2018-08-30
EP3336096A1 (en) 2018-06-20
KR20200042960A (ko) 2020-04-24
BR112014014078A8 (pt) 2021-09-28
US20150004188A1 (en) 2015-01-01
MX2014006987A (es) 2014-11-10
BR112014014078A2 (pt) 2018-10-09
KR20220132652A (ko) 2022-09-30
EP2791157A4 (en) 2015-10-14
WO2013090296A1 (en) 2013-06-20
AU2012352457B2 (en) 2016-04-21
JP7129106B2 (ja) 2022-09-01
MX2020001385A (es) 2020-03-20
MX354986B (es) 2018-03-28
EA026926B1 (ru) 2017-05-31
KR102277469B1 (ko) 2021-07-15
EP2791157A1 (en) 2014-10-22
KR20210089272A (ko) 2021-07-15
KR20140110934A (ko) 2014-09-17
ZA201404199B (en) 2015-08-26
US20180333485A1 (en) 2018-11-22
US9981036B2 (en) 2018-05-29
CA2858893A1 (en) 2013-06-20
US11241496B2 (en) 2022-02-08
JP2021042245A (ja) 2021-03-18
JP2022160704A (ja) 2022-10-19
KR102101819B1 (ko) 2020-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104245719B (zh) 包含改进的il-12基因构建体的组合物和疫苗、免疫治疗剂及其使用方法
CN104619719A (zh) 人呼吸道合胞病毒共有抗原、由其制备的核酸构建体和疫苗及其使用方法
US10646563B2 (en) Vaccines and immunotherapeutics using IL-28 and compositions and methods of using
KR20080094044A (ko) 코돈 최적화된 ｉｌ―15를 사용하는 백신 및 면역치료제, 및 그의 사용 방법
CN102781952B (zh) 编码rantes的核酸分子、包含其的组合物以及其使用方法
AU2014235120B2 (en) Vaccines having an antigen and interleukin-23 as an adjuvant
CN104254616B (zh) 包含mrsa pbp2a及其片段的蛋白、编码它们的核酸、以及组合物及它们预防和治疗mrsa感染的用途
CN104254616A (zh) 包含mrsa pbp2a及其片段的蛋白、编码它们的核酸、以及组合物及它们预防和治疗mrsa感染的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1205130

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1205130

Country of ref document: HK