CN110777115A

CN110777115A - 用于增强抗原递呈细胞致敏t细胞能力的组合物及应用

Info

Publication number: CN110777115A
Application number: CN201911148184.5A
Authority: CN
Inventors: 孙圣楠; 林鑫; 谢桦函
Original assignee: Beijing Kai Sheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yixing Chengong New Drug Development Co ltd
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110777115B

Abstract

本发明公开用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用。本发明的组合物包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体。其中，第一白介素复合物为IL‑15/IL‑15Rα复合物，第二白介素复合物为IL‑12复合物。本发明的组合物能够协同增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力。

Description

用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用。

背景技术

在机体免疫应答过程中，抗原递呈细胞(APC)扮演重要的角色，研究表明，这类细胞能够辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并对抗原产生应答，根据APC细胞表面膜分子表达情况和功能的差异，分为专职和非专职APC 两类，其中树突状细胞(DC)是目前所知体内功能最强的专职APC，其最大的特点是能够刺激初始T细胞的增值，因此APC在免疫系统占有独特地位，是免疫应答启动者。

CN101360827A公开了一种IL-15Rαsushi结构域作为通过IL-15Rβ/γ的 IL-15作用的选择性和有效的增强剂以及超激动剂(IL15Rαsushi-IL15)融合蛋白，用于刺激IL-15Rβ/γ信号通路、从而诱导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的化合物，该融合蛋白包含直接或间接共价连接到至少一个含有IL-15Rα胞外区的sushi结构域的多肽上的至少一个IL-15Rβ/γ结合体。

CN110050062A公开了一种表达IL12的溶瘤弹状病毒，其基因组包含组合地编码白细胞介素-12(IL12)蛋白或其功能部分的一种或多种核酸序列。还公开了一种使用所述溶瘤重组Maraba病毒来治疗患者中的癌症的方法。

因此，以抗原递呈细胞相关疫苗在肿瘤的预防和治疗中方面展现了较好的应用前景。如Sipuleucel-T直接将前列腺癌酸性磷酸酶抗原转染DC激发机体产生特异性的抗肿瘤反应。IMPACT研究显示，尽管客观有效率评价显示治疗效果有限(<5％)，Sipuleucel-T组的中位生存时间(25.8个月)要高于对照组(21.7个月)4.1个月。2010年4月，美国FDA批准Sipuleucel-T用于治疗无症状或症状轻微的转移性去势治疗无效的难治性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)。在胶质瘤中，负载自体肿瘤裂解物的DC疫苗DC-VAX尚在进行III期临床试验中。有电穿孔法将自体肾脏肿瘤的RNA 和CD40LmRNA电转到DC的肿瘤疫苗，与靶向药物舒尼替尼联用的报道，目前也在临床试验中。近期的研究发现，DC疫苗能显著延长患者生存期，不过单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。目前的临床实验表明，DC治疗性疫苗的应答率很少超过15％，总体应答率偏低。

发明内容

本发明提供一种组合物，用于解决现有技术中的至少部分技术问题。本发明通过高通量筛选实验发现两种白介素复合物的组合可以发挥协同作用，增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力，诱导产生更多的有抗肿瘤活性的CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，该组合物包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体；其中：

所述第一白介素复合物为IL-15/IL-15Rα复合物，和

所述第二白介素复合物为IL-12复合物。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第一白介素复合物的前体为编码 IL-15的基因和编码IL-15Rα的基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第一白介素复合物的前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两者基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第二白介素复合物的前体为编码 IL-12p40的基因和编码IL-12p35的基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第二白介素复合物的前体为同时编码IL-12p40和IL-12p35两者的基因。

在某些具体实施方案中，所述能够形成第二白介素复合物的前体为编码 IL-12p40和IL-12p35的融合蛋白的基因。

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞包含抗原或能够产生所述抗原的前体，和第一方面所述的组合物。

在某些具体实施方案中，所述抗原递呈细胞通过使第一方面所述的组合物引入负载所述抗原的抗原递呈细胞而得到；或者其通过使第一方面所述的组合物和抗原引入所述抗原递呈细胞而得到。

本发明的第三方面，提供一种用于致敏T细胞的方法，包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

本发明的第四方面，提供一种用于促进辅助T细胞产生细胞因子的方法，所述方法包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与辅助T细胞接触的步骤。

本发明的第五方面，提供一种用于促进杀伤T细胞产生细胞因子的方法，所述方法包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与杀伤T细胞接触的步骤。

本发明通过利用IL15、IL15Rα的复合物和IL12 p70调节T细胞活化和增殖的能力，两者协同作用促使DC细胞诱导产生的特异的细胞毒性T细胞持续扩增，产生更多的有抗肿瘤活性的淋巴细胞，提高治疗肿瘤，例如DC 疫苗在治疗肿瘤的效果。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及AKR1B10抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图1的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+和TNF- α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及AKR1B10抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+和TNF- α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

图3为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原 mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图3的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+和TNF- α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图4为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原 mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图4的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+和TNF- α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明的“复合物”指的是白细胞介素与其他蛋白之间或者白细胞介素的不同功能性片段之间通过非共价键或共价键结合形成的聚集体。此处，非共价键结合的作用力的实例包括范德华力、疏水作用、氢键结合力和电荷吸引力等。非共价健结合的实例包括但不限于配体受体之间的结合。这种情况形成的复合物一般是可以再次分开，从而形成单独的白介素与单独的其他蛋白，或两个或更多个单独的白介素功能性片段。共价健结合的实例包括二硫键或肽键。在通过肽键使两个蛋白或两个不同多肽片段结合的情况下，可以理解为复合物为一种融合蛋白。融合蛋白的两个蛋白或不同多肽片段之间通常通过柔性连接子连接，从而有利于两个蛋白或不同多肽片段之间的结合形成复合物。

本发明的“前体”是指能够形成复合物的任何物质。本发明的前体包括能够形成复合物的以单独、分离形式存在的各组成成分。例如，单独、分离形式存在的白介素或与其结合的另外的蛋白。本发明的前体还包括能够形成白介素或与其结合的另外的蛋白的物质，例如，能够编码产生白介素的核酸或能够编码产生白介素第一个功能性片段的核酸(为方便说明在本文中其可称作第一核酸)，和能够编码产生与白介素结合的另外的蛋白的核酸或能够编码产生白介素第二个功能性片段的核酸(为方便说明其可称作第二核酸)。此处，第一核酸和第二核酸分别包括DNA和mRNA。在某些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接形成一个核酸分子，从而使第一核酸和第二核酸分别成为该核酸分子的一部分。在某些实施方案中，连接形成的核酸分子可以同时产生两种不同的蛋白或两种不同的多肽片段。在某些实施方案中，连接形成的核酸分子可以产生融合蛋白。在某些实施方案中，第一核酸与第二核酸分别为单独的分子。

[组合物]

本发明的第一方面，提供一种用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，本文有时也简称为“本发明的组合物”。本发明的组合物包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体；其中：所述第一白介素复合物为IL- 15/IL-15Rα复合物，和所述第二白介素复合物为IL-12复合物。

本发明中，能够形成第一白介素复合物的IL-15(interleukin-15,IL-15)是指天然存在或野生型白细胞介素-15，包括不同的剪接变体和天然生成的变体。IL-15可以是任何物种的IL-15。例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。

本发明的IL-15是一种与IL-2结构类似的细胞因子，具有共同的受体亚基和信号转导通路，两种细胞因子均可刺激T细胞增殖、诱导细胞毒性T细胞 (CTL)产生，促进B细胞增殖和免疫球蛋白合成，诱导NK细胞产生。IL-15广泛表达在各种细胞和组织中，如单核细胞，巨噬细胞，DC细胞，纤维细胞等。本发明发现虽然第一白介素复合物中不存在IL-15受体中的β和γ亚基，但是其也能激活下游的JAK1，JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、LCK和SYK的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。第一白介素复合物能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，能够维持在缺乏抗原刺激下记忆性T细胞的存活。有研究证明，在啮齿类动物的淋巴细胞中，IL-15通过诱导BCL2L1/BCL-x(L)而抑制凋亡。同样地，本发明发现在人体内第一白介素复合物也能通过诱导BCL2和/或Bcl-xL抑制T淋巴细胞的凋亡。

本发明中，IL-15的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.1所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。

本发明中，IL-15受体α(IL-15Rα)是IL-15受体的α、β和γ三条链中的α链，是形成高特异性、高亲和力IL-15Rαβγ的必要亚单位。本发明中，IL-15受体α的氨基酸序列不特别限定，只要能够具备结合IL-15的功能即可，其实例包括SEQ ID No.3所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15受体α由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成。

优选地，本发明中能够形成第一白介素复合物的前体为编码IL-15的基因和编码IL-15Rα的基因。更优选地，该前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两个分离的单独蛋白的基因。

在示例性实施方案中，本发明的组合物包含核酸，且该核酸同时编码两种蛋白，从而有利于得到的表达产物高效地形成复合物。在该情况下，同一核酸分子包含两个基因，且两个基因之间连接例如核糖体进入位点(IRES)。可选地，还可以通过使相临的两个基因之间连接编码自剪切多肽序列的核酸序列来实现。作为示例性实例，本发明的核酸可为同时编码IL-15和IL-15Rα的核酸。此类核酸的实例包括但不限于SEQ ID No.2所示的核酸，该核酸可同时编码产生单独的IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白，产生的蛋白通过共价键直接连接形成融合蛋白。

本发明中，IL-12复合物具有IL-12类似的功能，能使活化的T细胞增殖并增加其细胞毒活性，诱导NK细胞和T细胞产生γ-干扰素(IFN-γ)，调节Th1/Th2 细胞发育，促使其向Th1细胞分化。本发明中，IL-12复合物还能诱生CTL免疫应答的细胞因子，启动细胞介导的免疫反应。IL-12复合物不但能活化先天性免疫细胞，促使APC功能，特别是促使树突状细胞(DC)成熟，提高抗原提呈的效率，还可作为第三信号直接活化初始T细胞，使其转化为效应性T细胞。另外，IL-12复合物还协同IL-18促进记忆性T细胞的活化作用，使其能迅速消除被感染的细胞，同时促进其它细胞因子的分泌，抑制病毒复制，调节其它细胞免疫功能。

在某些实施方案中，本发明的IL-12复合物是由p35和p40两个蛋白通过非共价键结合形成的异二聚体。在此情况下，IL-12复合物的前体可以是p35和 p40两个蛋白，也可以是编码IL-12p40的基因和编码IL-12p35的基因。优选地，前体为编码IL-12p40和IL-12p35融合蛋白的基因。更优选地，本发明的融合蛋白中缺少IL-12p35的信号肽。

在某些实施方案中，IL-12复合物为融合蛋白70，其氨基酸序列不特别限定，例如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，或与其同源性为95％以上，优选 97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。在此情况下，IL-12复合物的前体可以编码融合蛋白的核酸，其序列例如可以如SEQ ID No.5所示。

[抗原递呈细胞]

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，其为人为改造的细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，通过从外周血单核细胞(PBMC)中分离出来的单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在具体实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子其实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或能够产生抗原的前体，和第一方面所述的组合物。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由APC捕获并且可以被呈递到抗原呈递细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原包括AKR1B10和GPC3。

优选地，本发明的抗原递呈细胞通过使第一方面所述的组合物引入负载所述抗原的抗原递呈细胞而得到；或者其通过第一方面所述的组合物和抗原引入所述抗原递呈细胞而得到。

[用于致敏T细胞的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于致敏T细胞能力的方法，其包括将第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

另外，本发明提供一种用于促进辅助T细胞和杀伤T细胞产生细胞因子的方法，其包括使第二方面所述的抗原递呈细胞分别与辅助T细胞、杀伤 T细胞接触的步骤。在具体实施方案中，所述步骤通过使抗原递呈细胞与CD4 T细胞和CD8 T细胞接触并产生TNF-α和IFN-γ实现。

制备例1

本制备例用于制备编码抗原以及作为不同白介素复合物前体的DNA和 mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码IL12 p70以及IL15/IL15Rα mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原AKR1B10和GPC3的编码序列。AKR1B10和GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用 CN107583042A中公开的抗原。

表-1 DNA序列表

名称	序列号
		IL-15\IL-15Rα	SEQ ID No.2
IL-12	SEQ ID No.5

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例1

本实施例用于研究本发明组合物对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％ CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL 的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基 (mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM- CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml) 和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8- 18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.用组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA 与不同的蛋白IL15/IL15Rα、IL12的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵ DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码AKR1B10抗原的mRNA(AKR1B10对照组)

3)编码AKR1B10抗原的mRNA与IL-12p70的mRNA(IL12组)

4)编码AKR1B10抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

5)编码AKR1B10抗原的mRNA与IL-12p70和IL15/IL15Rα的 mRNA(实验组)

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96 孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述五个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA 的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml, 按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI 完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、 CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

6.1使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及AKR1B10抗原 mRNA转染DC细胞后，CD4 T和CD8 T细胞免疫应答结果

结果如图1和图2所示，使用本发明提供的组合物能够显著提高CD4 T 细胞亚群中IFN-γ阳性细胞比例，尤其是与单独使用IL-12和IL15/IL15Rα相比，本发明组合物具有协同的免疫增强效果。

与只转染了AKR1B10抗原的组比，使用了本发明组合物的实验组中， IFN-γ阳性的CD8 T细胞比例为2.39％，提高了8.56倍。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞以及TNF-α阳性细胞分别提高了64％和80％。在CD4 T细胞亚群中，实验组的IFN-γ阳性细胞比例为17.2％，是AKR1B10对照的15.28倍， IFN-γ比例显著提高。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例为3.22％，是AKR1B10 对照的7倍。TNF-α阳性细胞为4.06％，是AKR1B10对照的184.5％。

6.2使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA 转染DC细胞后，CD4 T和CD8 T细胞免疫应答结果。

实施例2

本实施使用GPC3抗原进行与实施例相似的实验。本实施例中，使用的 mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL-12p70的mRNA(IL12组)

4)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

5)编码GPC3抗原的mRNA与IL-12p70和IL15/IL15Rα的mRNA(实验组)

结果见表2以及图3和图4。

使用本发明提供的组合物与单独使用IL-12和IL15/IL15Rα相比，本发明组合物具有协同的免疫增强效果。在CD8 T细胞亚群中，实验组的IFN-γ阳性细胞比例为3.82％，是GPC3对照的56.18倍，IFN-γ比例显著提高。 IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例为1％，是GPC3对照的22.22倍。TNF-α阳性细胞为1.79％，是GPC3对照的37.68倍。与只转染了GPC3抗原的组比，使用了本发明组合物的实验组中，IFN-α阳性的CD4 T细胞比例为4.87％，提高了4.43倍。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞以及TNF-α阳性细胞分别提高了248％和152％。

表-2免疫应答结果

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 北京启辰生生物科技有限公司

<120> 用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物及应用

<141> 2019-11-21

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

<210> 2

<211> 1951

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttgag cggccgccgc ccgccccacg acccgcagcg cccgaccgaa aggagcgcac 540

gaccccatca tccaattccg cccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 600

aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 660

tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 720

tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 780

cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 840

acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 900

cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 960

tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 1020

ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc 1080

gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc acaacgtcga 1140

cgccaccatg gctcctagga gagccagagg gtgtaggaca ctgggactgc cagctctgct 1200

gctgctgctg ctgctgagac ctccagctac aaggggaatc acctgccctc ctcctatgag 1260

cgtggagcac gccgacattt gggtgaagag ctacagcctg tacagccggg agcgctacat 1320

ttgcaacagc ggcttcaaga ggaaggccgg aacaagctct ctcaccgagt gcgtgctgaa 1380

caaggccacc aacgtggccc attggacaac ccctagcctg aagtgcatca gggacccagc 1440

actggtgcac cagagaccag ctcctcctag cacagtgacc acagccggag tgacacctca 1500

gccagaaagc ctgagcccta gcggaaaaga accagccgcc tctagcccca gcagcaataa 1560

taccgccgcc acaacagccg ctattgtgcc aggaagccag ctgatgccta gcaagagccc 1620

tagcaccggc acaacagaga tcagcagcca cgagagcagc cacggaacac ctagccagac 1680

cacagccaag aattgggagc tgaccgccag cgccagccac cagcctccag gagtgtaccc 1740

tcagggacac agcgatacca ccgtggccat ctctaccagc acagtgctgc tgtgcggact 1800

gtcagctgtg tccctgctgg cttgctacct gaagagcaga cagacccctc ctctggccag 1860

cgtggaaatg gaggctatgg aggccctgcc agtgacttgg ggaacctcta gcagagacga 1920

ggacctggag aattgcagcc accacctgta g 1951

<210> 3

<211> 267

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr

20 25 30

Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser

35 40 45

Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala

65 70 75 80

Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp

85 90 95

Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr

100 105 110

Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu

115 120 125

Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala

130 135 140

Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr

145 150 155 160

Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser

165 170 175

Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln

180 185 190

Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile

195 200 205

Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu

210 215 220

Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu

225 230 235 240

Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg

245 250 255

Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu

260 265

<210> 4

<211> 603

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg

20 25 30

Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val

35 40 45

Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr

85 90 95

Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn

180 185 190

Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser

195 200 205

Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys

210 215 220

Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala

225 230 235 240

Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Ser Gly

245 250 255

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

260 265 270

Pro Gly Pro Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu

275 280 285

Val Phe Leu Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp

290 295 300

Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met

305 310 315 320

Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr

325 330 335

Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile

340 345 350

Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly

355 360 365

Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp

370 375 380

Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn

385 390 395 400

Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr

405 410 415

Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys

420 425 430

Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala

435 440 445

Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr

450 455 460

Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser

465 470 475 480

Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu

485 490 495

Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro

500 505 510

Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu

515 520 525

Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe

530 535 540

Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys

545 550 555 560

Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg

565 570 575

Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser

580 585 590

Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

595 600

<210> 5

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120

ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180

gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240

gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300

gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360

ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420

aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480

atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540

atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600

atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660

gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720

gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttccg gatccggagc caccaacttc 780

agcctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg gccccatgtg tcaccagcag 840

ttggtcatct cttggttttc cctggttttt ctggcatctc ccctcgtggc catatgggaa 900

ctgaagaaag atgtttatgt cgtagaattg gattggtatc cggatgcccc tggagaaatg 960

gtggtcctca cctgtgacac ccctgaagaa gatggtatca cctggacctt ggaccagagc 1020

agtgaggtct taggctctgg caaaaccctg accatccaag tcaaagagtt tggagatgct 1080

ggccagtaca cctgtcacaa aggaggcgag gttctaagcc attcgctcct gctgcttcac 1140

aaaaaggaag atggaatttg gtccactgat attttaaagg accagaaaga acccaaaaat 1200

aagacctttc taagatgcga ggccaagaat tattctggac gtttcacctg ctggtggctg 1260

acgacaatca gtactgattt gacattcagt gtcaaaagca gcagaggctc ttctgacccc 1320

caaggggtga cgtgcggagc tgctacactc tctgcagaga gagtcagagg ggacaacaag 1380

gagtatgagt actcagtgga gtgccaggag gacagtgcct gcccagctgc tgaggagagt 1440

ctgcccattg aggtcatggt ggatgccgtt cacaagctca agtatgaaaa ctacaccagc 1500

agcttcttca tcagggacat catcaaacct gacccaccca agaacttgca gctgaagcca 1560

ttaaagaatt ctcggcaggt ggaggtcagc tgggagtacc ctgacacctg gagtactcca 1620

cattcctact tctccctgac attctgcgtt caggtccagg gcaagagcaa gagagaaaag 1680

aaagatagag tcttcacgga caagacctca gccacggtca tctgccgcaa aaatgccagc 1740

attagcgtgc gggcccagga ccgctactat agctcatctt ggagcgaatg ggcatctgtg 1800

ccctgcagtt ag 1812

Claims

1.一种用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，其特征在于，包含第一白介素复合物或者能够形成第一白介素复合物的前体，和第二白介素复合物或者能够形成第二白介素复合物的前体；其中：

所述第一白介素复合物为IL-15/IL-15Rα复合物，和

所述第二白介素复合物为IL-12复合物。

2.根据权利要求1所述的用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，其特征在于，所述能够形成第一白介素复合物的前体为编码IL-15的基因和编码IL-15Rα的基因。

3.根据权利要求1所述的用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，其特征在于，所述能够形成第一白介素复合物的前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两者的基因。

4.根据权利要求1所述的用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，其特征在于，所述能够形成第二白介素复合物的前体为编码IL-12p40的基因和编码IL-12p35的基因。

5.根据权利要求1所述的用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，其特征在于，所述能够形成第二白介素复合物的前体为同时编码IL-12p40和IL-12p35两者的基因。

6.根据权利要求1所述的用于增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力的组合物，其特征在于，所述能够形成第二白介素复合物的前体为编码IL-12p40和IL-12p35的融合蛋白的基因。

7.一种工程化抗原递呈细胞，其特征在于，所述工程化抗原递呈细胞包含抗原或能够产生所述抗原的前体，和根据权利要求1-5任一项所述的组合物。

8.根据权利要求6所述的工程化抗原递呈细胞，其特征在于，其通过使根据权利要求1-5任一项所述的组合物引入负载有抗原的抗原递呈细胞而得到；或者通过使根据权利要求1-5任一项所述的组合物和抗原或编码所述抗原的核酸引入抗原递呈细胞而得到。

9.一种用于致敏T细胞的方法，其特征在于，包括使根据权利要求6或7所述的工程化抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

10.一种用于促进辅助T细胞产生细胞因子的方法，其特征在于，包括使根据权利要求6或7所述的工程化抗原递呈细胞与辅助T细胞接触的步骤；或

使根据权利要求6或7所述的工程化抗原递呈细胞与杀伤T细胞接触的步骤。