CN110694061A - 用于增强t淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用。本发明的组合物包含下述(a)至(d)成分：(a)白细胞介素‑15、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(b)白细胞介素‑15受体α、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(c)白细胞介素‑12、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和(d)PD1‑CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段，或者其编码核酸。本发明的组合物、免疫细胞以及改善T淋巴细胞的性质的方法均能够激起更强的免疫应答，诱导出更高比例的肿瘤特异的CD4以及CD8T细胞，从而有望解决单一肿瘤治疗手段难以解决的肿瘤免疫抑制和临床效果不理想的缺陷。

Description

用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用。

背景技术

机体的免疫反应首先是由抗原递呈细胞(APC)捕获抗原，经过加工和处理后将抗原信息递呈给淋巴细胞，继而引发一系列的特异性免疫应答。树突状细胞(DC)被认为是目前功能最强的APC，其最大的特点是能够刺激初始型T细胞(Naive T cells)的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节。在机体抗肿瘤免疫中，由T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。

研究发现，肿瘤患者存在DC数量减少及功能缺陷的特点，肿瘤组织及其周围浸润DC的数量、功能与肿瘤的发生、发展、转移、预后有着密切的关系。DC密集浸润的肿瘤分化程度高，预后较好。而DC轻度浸润的肿瘤常伴有分化程度低和恶性进展。肿瘤细胞具有较高水平的Fas(细胞表面的蛋白受体分子)表达，能诱导FasL(Fas天然配体)表达的淋巴细胞凋亡，并能分泌TGF-β、IL-10等免疫抑制性细胞因子，导致抗原提呈能力下降，从而逃避免疫攻击。

近年来，已经清楚了免疫系统确实识别肿瘤抗原，但是尽管存在肿瘤抗原，T细胞却保持静止状态。基于此现象，有这样的假说：患者体内的抗原呈递细胞，不能正确识别肿瘤抗原，将之呈递给T淋巴细胞，引起肿瘤特异的免疫应答。近年来，如何增加抗原呈递细胞的数量，提高抗原呈递细胞，特别是DC细胞摄取、转运、呈递抗原、刺激T细胞的能力，是目前肿瘤免疫研究中的一个重点。

基于对免疫系统细胞的增殖、分化和功能发现，其受到一系列细胞因子的调节，在这一系列细胞因子中，具有结构同源性的白细胞介素-12(IL-12)和白细胞介素-15(IL-15)发挥着重要作用。在临床前模型中，IL-15已被证明能增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫能力。一项一期临床试验，评估了IL-15在转移性黑色素瘤和肾细胞癌(肾癌)患者中的安全性、剂量和抗肿瘤疗效，并已开始在National Institutes of Health(NIH)登记患者。目前有两种类型的白介素-15超级激动剂可用。一种方法是将IL-15和IL-15Rα-Fc(R&D Systems)结合在体外产生复合物，称为IL-15SA。另一种叫做ALT-803的IL-15超激动剂复合物(由altorbioscience提供)。目前，除了加强免疫治疗和疫苗接种外，IL-15SA还正在评估其抗病毒和抗癌活性。ALT-803是一种IL-15超激动剂复合物，包括一个融合到IL-15受体α/igg1 fc融合蛋白的IL-15突变体(IL-15N72D)。2017年美国食品和药物管理局(FDA)对ALT-803进行了快速跟踪，当时，正在准备膀胱癌的第三阶段试验。另外，基于IL-12在抗肿瘤免疫及抗感染免疫中的重要作用，人们对其临床应用寄予厚望，特别是IL-12可协同IL-2促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的产生表明，IL-12与IL-2联用可望构成一种更有效的肿瘤免疫治疗方法。

近年来，有大量的使用负载了抗原的DC疫苗治疗肿瘤的报道，从目前报道的数据来看，DC疫苗似乎代表了一种用于改善的肿瘤免疫治疗的新的非常有潜力的方法。目前市场上PD-1/PD-L1阻断剂有Nivolumab，治疗肝癌策略主要包括手术、放疗、全身化疗、靶向治疗和微创介入治疗在内的综合治疗，但仍难以突破肝癌治疗后高转移率和高复发率的瓶颈。有研究表明，IL-12与sPD-1联合治疗有效下调免疫抑制性细胞因子IL-10，增强抗肿瘤免疫。PD-1/PD-L1阻断剂在早期临床研究证实了已经证实单药治疗是安全可控，部分患者出现早期持续的应答。市场上PD-1/PD-L1阻断剂副作用多，部分患者因无法耐受药物毒性而终止治疗。最近，已经有数个靶向PD-1受体及其配体PD-L1以及CTLA-4的免疫检验点抑制剂药物获批上市。这些免疫检验点抑制剂在多种肿瘤如黑色素瘤，肾癌，结直肠癌，非小细胞肺癌和肝癌等患者中都有比较好的临床疗效。

然而，目前的多个临床研究数据表明，使用免疫检验点抑制剂如PD-1/PD-L1抗体以及CTLA-4抗体临床应答率较低，如在肝癌患者中，使用PD-1抗体，仅仅15％左右的患者能够获得临床受益；在多个使用CTLA-4抗体治疗黑色素瘤的临床实验中，单独或者联合使用CTLA-4单抗ipilimumab，有效率在5-22％之前。在更近的研究中，已经有在临床模型中评价了与PD-1途径免疫检验点抑制剂组合的抗肿瘤效果。目前的肿瘤研究越来越发现，单一的治疗手段往往难以解决肿瘤的免疫抑制。

类似地，已经有报道使用感染了编码人IL-12的重组腺病毒(AFIL12)的自体DC细胞回输治疗实体瘤。一共有17名转移性胰腺癌、结直肠癌和原发性肝癌患者接受了不同剂量的细胞回输治疗。在接受了完整治疗的11个患者中，尽管经过治疗后，患者的肿瘤浸润淋巴细胞比治疗前显著增加，然而影像学评估显示，仅仅有一位患者(转移性胰腺癌)出现部分应答(PR)，2位转移性肝细胞癌患者病情稳定(SD)，其余8为患者均表现为肿瘤进展(PD)。说明单独使用IL12，不能起到理想的效果[Mazzolini G D,Alfaro C,Sangro B,etal.1134.Intratumoral Injection of Dendritic Cells Engineered to SecreteInterleukin-12by Recombinant Adenovirus in Patients with MetastaticGastrointestinal Carcinomas[J].Journal of Clinical Oncology Official Journalof the American Society of Clinical Oncology,2005,23(5):999-1010.]。

目前的临床实验表明，DC治疗性疫苗的应答率很少超过15％，总体应答率偏低，单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，且不能得到令人满意的临床效果。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种组合物，与DC疫苗联合使用，能够增强DC疫苗致敏T细胞的能力，提高DC疫苗治疗肿瘤的效果。经过大量物质的筛选本发明发现，本发明的各成分的组合能够激起更强的免疫应答，诱导出更高比例的肿瘤特异的CD4以及CD8 T细胞。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物，其包含下述(a)至(d)成分：

(a)白细胞介素-15、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(b)白细胞介素-15受体α、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(c)白细胞介素-12、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和

(d)PD1-CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段，或者其编码核酸。

在某些具体实施方案中，所述用于增强T淋巴细胞免疫性组合物的成分(a)和成分(b)的摩尔比为(0.8-1.2):1。

在某些具体实施方案中，所述用于增强T淋巴细胞免疫性组合物的成分(a)和(b)分别为单独的蛋白，且成分(a)和(b)由同一核酸分子表达产生。

在某些具体实施方案中，所述用于增强T淋巴细胞免疫性组合物的成分(a):(b):(c):(d)摩尔比为1:1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)。

本发明的第二方面，提供一种免疫细胞，其包含第一方面所述的组合物。

在某些具体实施方案中，所述免疫细胞为树突细胞。

在某些具体实施方案中，所述免疫细胞进一步包含抗原或其编码核酸。

本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含根据上述的组合物或免疫细胞，和可选的药物学可接受载体。

本发明的第四方面，提供一种改善T淋巴细胞的性质的方法，包括使根据所述的组合物或所述的免疫细胞与所述T淋巴细胞接触从而改善其性质的步骤。

在某些具体实施方案中，所述改善包括选自下述行为中的至少之一：

(1)维持在缺乏抗原刺激下记忆性T淋巴细胞的存活；

(2)抑制T淋巴细胞的凋亡；

(3)促进T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌。

本发明的提供的组合物中，各成分之间协同作用，能够激起更强的免疫应答，诱导出更高比例的肿瘤特异的CD4以及CD8 T细胞。本发明有望解决单一的治疗手段往往难以解决肿瘤的免疫抑制和临床效果不理想的缺陷。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。在图1的各组柱中，从左到右依次为CD8IFN-γ+、CD8 IFN-γ+,TNF-α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD4IFN-γ+、CD4 IFN-γ+,TNF-α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，术语“突变体”是指与天然存在蛋白或野生型蛋白相比具有突变但基本同源且仍保留原有活性的蛋白。其中，突变可以是例如一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代或它们的组合。此类突变可以天生产生的突变，也可以是人工引入的突变。在突变为氨基酸取代的情况下，优选为保守性氨基酸取代，即一个残基被具有类似性质的另一个取代。典型的取代是在脂肪族氨基酸组中、在含有脂族羟基侧链的氨基酸组中、在含有酸性基团的氨基酸组中、在含有酰胺衍生物的氨基酸组中，在含有碱性基团的氨基酸组中或在含有芳族基团的氨基酸之间的取代。

本发明中，“基本同源”是指与对象序列之间的相同程度为60％以上，优选为80％以上，更优选90％以上。例如，95％以上，97％以上，最优选99％以上。

本发明中，“保留原有活性”是指与其天然存在蛋白或野生型蛋白的活性相比，其活性处于基本相同或甚至提高的水平。突变体的活性为天然存在或野生型蛋白活性的90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上，或高于天然存在或野生型蛋白的活性时可以理解为保留原有活性。

本发明中，术语“功能片段”是指由源自天然存在蛋白或野生型蛋白的一部分连续氨基酸组成且仍保留原有活性的蛋白。

本发明中，术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(即DNA)和核糖核酸(即RNA)。在RNA的情况下，优选对核酸分子进行多种优化，从而防止RNA的不稳定性和多种途径的降解。例如，在天然存在的mRNA的5’端，设计修饰的鸟苷核苷酸，称之为5’帽子结构，并且3’端设计一段长约200～300个碱基的腺苷核苷酸(即多聚A尾巴)结构，5’和3’端的UTR序列，比如人的beta-球蛋白的UTR序列。

[组合物]

本发明的第一方面，提供一种用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物，本文有时也简称为“本发明的组合物”。本发明的组合物包含下述(a)至(d)成分：(a)白细胞介素-15、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(b)白细胞介素-15受体α、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(c)白细胞介素-12、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和(d)PD1-CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段，或者其编码核酸。

本发明中，白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)是指天然存在或野生型白细胞介素-15，包括不同的剪接变体和天然生成的变体。IL-15可以是任何物种的IL-15。例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。

本发明的白细胞介素-15是一种与IL-2结构类似的细胞因子，广泛表达在各种细胞和组织中，如单核细胞、巨噬细胞、DC细胞和纤维细胞等。本发明的IL-15能够与IL-15受体α结合，激活下游的JAK1，JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、LCK和SYK的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。另外，IL-15能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，能够维持在缺乏抗原刺激下记忆性T细胞的存活。有研究证明，在啮齿类动物的淋巴细胞中，IL-15通过诱导BCL2L1/BCL-x(L)而抑制凋亡。本发明发现，在人体内Il-15通过诱导BCL2和/或Bcl-xL抑制T淋巴细胞的凋亡。

本发明中，白细胞介素-15的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.1所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的白细胞介素-15、其突变体或其功能片段为由包含SEQ ID No.2所示的序列的核酸编码。

本发明中，白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)是IL-15受体(IL-15R)的α、β和γ三条链中的α链，是形成高特异性、高亲和力IL-15Rαβγ的必要亚单位。本发明中，白细胞介素-15受体α的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.3所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的白细胞介素-15受体α、其突变体或其功能片段为由包含SEQ ID No.2所示的序列的核酸编码。

在具体实施方案中，本发明组合物的成分(a)和(b)，即，白细胞介素-15和白细胞介素-15受体α分别为单独的蛋白，且白细胞介素-15和白细胞介素-15受体α由同一种核酸分子表达产生，本发明组合物中的成分(a)和(b)的摩尔比优选为(0.8-1.2):1，更优选为(0.9-1.2):1。

本发明中，白细胞介素(interleukin,IL)12由抗原提呈细胞和B细胞产生，是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。IL-12能诱导IFN-γ产生，在体内免疫应答中(特别是在细菌或寄生虫感染中)它也是IFN-γ产生所必需。首先，IL12能够能促进CD4+Th0细胞分化为Th1细胞，协同亚剂量IL-2，可诱导LAK细胞活性。其次，IL12能够诱导CTL和NK细胞的细胞毒活性并促进其分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等细胞因子。再次，IL12能够促进NK细胞和IL-2rα、TNF受体及CD56分子的表达，增强对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应。

本发明中，白细胞介素-12的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.4所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的白细胞介素-12、其突变体或其功能片段为由包含SEQ ID No.5所示的序列的核酸编码。

PD-1在活化的T细胞、B细胞以及在参与调解免疫激活与耐受平衡的单核细胞上表达，其主要作用是在针对感染的炎性应答中限制炎性周围的T细胞活性和限制自身免疫性，该调节的基础是PD-1分子的配体PD-L1和PD-L2相应多种促炎性因子被上调，并且可以结合炎症组织中活化T细胞上的PD-1分子，抑制T细胞功能，从而限制免疫应答。另外，在多种不同的肿瘤中，PD-L1表达通常上调，其通过与肿瘤浸润的淋巴细胞上面的PD-1结合而抑制局部的抗肿瘤T细胞应答，从而导致免疫逃逸的发生。研究发现在宫颈癌和肝癌中，有近半数以上的肿瘤浸润CD8阳性T细胞表达PD-1分子，其与肿瘤细胞表面表达的PD-L1分子结合后，可以导致T细胞的耗竭以及凋亡。

相关研究报道了使用PD-1配体PD-L1和PD-L2的siRNA转染到树突细胞(DC)里面抑制PD-L1和PD-L2的表达[Van d W AB,Fredrix H,Robbert V D V,et al.siRNA silencingof PD-1ligands on dendritic cell vaccines boosts the expansion of minorhistocompatibility antigen-specific CD8+T cells in NOD/SCID/IL2Rg(null)mice[J].Cancer Immunology,Immunotherapy,2015,64(5):645-654.]，并用次要的组织相容性抗原(MiHA)负载树突细胞制备成树突细胞疫苗。这些负载有MiHA的PD-L1/L2沉默的DC表现出了高效的激活以及扩增MiHA特异性T细胞功能，而且能够显著的增强MiHA特异性的CD8+T细胞的功能，与未对PD-L1/L2沉默的、负载MiHA的DC相比，在一周的体外刺激过程中，其扩增出来的MiHA特异性的CD8+T细胞增加了14.4倍，体外刺激两周后，其扩增出来的T细胞增加了20倍。

类似地，以靶向PD-L1/L2的siRNA-脂-纳米颗粒复合物沉默DC细胞的PD-L表达，再给DC负载抗原mRNA或者多肽制备成的树突细胞疫苗，能够有效的增加来自异体干细胞移植肿瘤患者的辅助性T细胞(Th1和Th2细胞)以及抗原特异性CD8+T细胞应答[Roeven M W H,Thordardottir S,Kohela A,et al.The Aryl Hydrocarbon Receptor AntagonistStemRegenin1 Improves In Vitro Generation of Highly Functional Natural KillerCells from CD34\r,+\r,Hematopoietic Stem and Progenitor Cells[J].Stem Cellsand Development,2015,24(24):2886-2898.]。

本发明的CD80属免疫球蛋白超家族(immunogloblin superfamily，IgSF)，以寡聚体形式标度多数的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，如树突状细胞(dendritic cell，DC)、活化的T细胞、B细胞以及巨噬细胞等。CD80是表达APC上的重要协同刺激分子。CD28是在大多数成熟T细胞和胸腺细胞表面组成性表达的一种细胞表面糖蛋白，CTLA-4受体只在活化后2-3天的T细胞中可以检测到，而在静息期T细胞中不表达。CD28和CTLA-4分子的主要配体是表达与抗原呈递细胞(APC)表面的CD80和CD86分子。目前对于存在至少两种受体(CD28和CTLA-4)以及两种配体(CD80和CD86)的生物学原理尚不清楚。不过目前的研究表明，CD80通过与T细胞表面的CTLA-4结合，抑制T细胞的活化，而本发明通过深入研究发现，CD80在与本发明的重要刺激分子协同作用下，可以解除T细胞活化的抑制且结果较显著，有效的诱导初始T细胞活化、增殖及效应功能的产生具有重要的始动调节作用。

本发明中，PD1-CD80融合蛋白的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.6所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的PD1-CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段为由包含SEQ IDNo.7所示的序列的核酸编码。

优选地，本发明的组合物上述的成分(a):(b):(c):(d)的摩尔比优选为1:1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)，更优选为1:1:(0.9-1.2):(0.9-1.2)。

[免疫细胞]

本发明的第二方面，提供免疫细胞，其包括第一方面所述的成分和摩尔配伍，这里的免疫细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给淋巴细胞的一类免疫细胞，并能辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞，其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞，优选地，本发明的免疫细胞为树突细胞。

优选地，本发明的免疫细胞还包含抗原或其编码核酸。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由抗原递呈细胞(APC)捕获，并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。本发明中优选肝癌相关抗原，更优选的抗原为GPC3抗原。

[药物组合物]

本发明的第三方面，提供药物组合物，其包括第一方面所述的组合物或第二方面所述的免疫细胞和可选的药物学可接受载体。还提供一种第一方面所述的组合物或第二方面所述的免疫细胞在制备药物组合物中的应用。其中药物学可接受载体，其在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂。

合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：(1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。

本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

与提供单独组分或部分组分相比，例如只提供IL15/IL15Rα、IL12、以及PD1-CD80蛋白以及其编码核酸中的一种或至少两种以上的药物的组合相比，本发明的药物组合物能够激起更强的免疫应答，诱导出更高比例的肿瘤特异的CD4以及CD8 T细胞，具体结果见图1和图2所示。

[改善T淋巴细胞的性质的方法]

本发明的本发明的第四方面，提供一种改善T淋巴细胞的性质的方法，包括使第一方面所述的组合物或第二方面所述的免疫细胞与所述T淋巴细胞接触从而改善其性质的步骤。

优选地，改善包括选自下述行为中的至少之一：

(1)维持在缺乏抗原刺激下记忆性T淋巴细胞的存活；(2)抑制T淋巴细胞的凋亡；(3)促进T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌。

实施例1

本实施例为制备编码抗原以及免疫检验点抑制剂的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

为本实施例分别构建用于编码IL12、IL15、IL15Rα以及PD1-Fc-CD80mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后，是一段多聚腺苷片段来制备构建体，具体序列如表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码序列，本发明GPC3的编码序列由SEQ ID No.8所示的序列组成，氨基酸序列由SEQ ID No.9所示的序列组成。GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用CN107583042A中公开的抗原。

表-1核酸序列表

名称	核酸序列号
		IL-15\IL-15Rα	SEQ ID No.2
IL-12	SEQ ID No.5
		PD1-CD80	SEQ ID No.7
GPC3	SEQ ID No.8

2.体外转录

将制备得到的相应DNA质粒，首先使用speI内切酶将质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例2

本实施例用于研究免疫调节剂组合物对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-a(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.免疫抑制剂组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的融合蛋白(IL15/IL15Rα、IL12以及PD1-Fc-CD80)mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照

2)只加编码GPC3抗原的mRNA

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL12的mRNA

4)编码GPC3抗原的mRNA与PD1-Fc-CD80的mRNA

5)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA

6)编码GPC3抗原的mRNA与IL12、IL15/IL15Rα的mRNA

7)编码GPC3抗原的mRNA与IL12、PD1-Fc-CD80的mRNA

8)编码GPC3抗原的mRNA与PD1-Fc-CD80、IL15/IL15Rα的mRNA

9)编码GPC3抗原的mRNA与PD1-Fc-CD80+IL15/IL15Rα+IL12的mRNA

3.将复苏过夜的外周血单核细胞(PBMC)以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述九个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM Monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-a和IFN-r抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-a+和IFN-r+细胞的比例。

结果如图1和图2所示，使用本发明所述的组合物可以引起T淋巴细胞抗肿瘤特异的免疫反应，其T淋巴细胞具有更强的抗肿瘤特异的免疫反应。与单独使用一种调节剂的药物相比，本发明具有协同的免疫增强效果。

另外，本实验所使用的外周血来源为肝细胞癌患者，肿瘤抗原GPC3在该肝细胞癌患者的肿瘤样品中有高水平的表达，该抗原作为肝细胞癌治疗的靶点，已经广泛用于DC疫苗以及CAR-T细胞疗法的一个靶点。已经有充分的数据表明，使用GPC3抗原负载DC细胞，在体外可以诱导出比较强的抗GPC3抗原的特异性免疫应答。实验结果如图所示，仅仅使用编码GPC3抗原的mRNA负载的DC细胞，仅能引起部分CD4 T细胞应答，而无CD8T细胞应答。在使用了编码IL12、IL15/IL15Rα或者PD1-Fc-CD80 mRNA后，不管是CD4 T细胞应答还是CD8 T细胞应答，相比不使用这些mRNA的组相比，均有显著的提高。而使用本发明组合(IL12+IL15/IL15Rα+PD1-Fc-CD80)的组中，不管与只使用GPC3抗原mRNA的组(GPC3对照组)，还是与使用了本发明组合物的部分组分的组相比，其CD4以及CD8 T细胞的应答均有显著的提高。其中，IFN-r阳性的CD8 T细胞比例为11.63％，比GPC3对照组的0.068％提高了170倍，跟其他的组比，IFN-r阳性的CD8 T细胞是效果最好的组(IL12+IL15/IL15Rα组，IFN-r阳性的CD8 T细胞比例为3.82％)的3倍。同样的，TNF-a阳性T细胞分别提高了14.5倍和3.1倍。在CD4 T细胞中，IFN-r阳性细胞的比例分别提高了11.9倍和1.9倍，TNF-a阳性细胞分别提高了5.1以及1.4倍。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 启辰生生物科技（珠海）有限公司

<120> 用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用

<141> 2019-11-21

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

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Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

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<212> PRT

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<212> DNA

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<210> 7

<211> 1869

<212> DNA

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cgugaugcag gguuguaugg ccggcguggu ggagaucgac aaguauuggc gggaguacau 960

ccugagccug gaggagcugg ugaacggcau guaccggauc uacgacaugg agaacgugcu 1020

gcugggccug uucuccacca uccacgacag cauccaguac gugcagaaga acgccggcaa 1080

gcugacaacc accaucggaa agcucugcgc ccacucucag cagaggcagu acagaagcgc 1140

cuacuacccc gaggaccugu ucaucgacaa gaaggugcug aagguggccc acguggaaca 1200

cgaagagaca cugagcagcc ggaggagaga gcugauccag aagcugaagu ccuucaucuc 1260

cuucuacagc gcccugccag gcuacauuug cagccacagc ccaguggccg agaacgacac 1320

ccucuguugg aacggccagg agcuggugga gagauacucu cagaaggccg ccaggaacgg 1380

caugaagaac caguucaacc ugcacgagcu gaagaugaag ggcccagagc cagugguguc 1440

ccagaucauc gacaagcuga agcacaucaa ccagcugcug cggaccauga gcaugccuaa 1500

gggcagggug cuggacaaga accuggacga ggagggcuuc gagucaggag auugcggcga 1560

cgacgaagac gaguguauug gcggaagcgg cgacggcaug aucaagguca agaaccagcu 1620

gcgguuccug gccgaacugg ccuacgaucu ggacguggac gacgcuccag gcaauucuca 1680

gcaggccaca ccuaaggaca acgagaucag caccuuccac aaccugggca acgugcacuc 1740

uccucugaag cugcugacca gcauggccau uagcgucguc ugcuucuucu uccuggugca 1800

ucugaucccc aucgcugugg guggugcccu ggcggggcug guccucaucg uccucaucgc 1860

cuaccucguc ggcaggaaga ggagucacgc aggcuaccag acuaucuagg aauucuuaau 1920

uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaa 1985

<210> 9

<211> 618

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Gln Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp

50 55 60

Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met

65 70 75 80

Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr

115 120 125

Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser

165 170 175

Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp

180 185 190

Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu

195 200 205

Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys

210 215 220

Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile

225 230 235 240

Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly

245 250 255

Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met

260 265 270

Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys

275 280 285

Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu

290 295 300

Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu

305 310 315 320

Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr

325 330 335

Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys

340 345 350

Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp

355 360 365

Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu

370 375 380

Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser

385 390 395 400

Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser

405 410 415

Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val

420 425 430

Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe

435 440 445

Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln

450 455 460

Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser

465 470 475 480

Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe

485 490 495

Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu

515 520 525

Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln

530 535 540

Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn

545 550 555 560

Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val

565 570 575

Cys Phe Phe Phe Leu Val His Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala

580 585 590

Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg

595 600 605

Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

610 615

Claims (10)

1.一种用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物，其特征在于，包含下述(a)至(d)成分：

(a)白细胞介素-15、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(b)白细胞介素-15受体α、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(c)白细胞介素-12、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和

(d)PD1-CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段，或者其编码核酸。

2.根据权利要求1所述的用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物，其特征在于，所述成分(a)和所述分成(b)的摩尔比为(0.8-1.2):1。

3.根据权利要求1所述的用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物，其特征在于，所述成分(a)和所述成分(b)分别为单独的蛋白，且所述成分(a)和所述成分(b)由同一核酸分子表达产生。

4.根据权利要求1所述的用于增强T淋巴细胞免疫性的组合物，其特征在于，成分(a):(b):(c):(d)的摩尔比为1:1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)。

5.一种免疫细胞，其包含根据权利要求1-4任一项所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为树突细胞。

7.根据权利要求5所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞进一步包含抗原或其编码核酸。

8.一种药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-4任一项所述的组合物或根据权利要求5-7任一项所述的免疫细胞，和可选的药物学可接受载体。

9.一种改善T淋巴细胞的性质的方法，其特征在于，包括使根据权利要求1-4任一项所述的组合物或根据权利要求5-7任一项所述的免疫细胞与所述T淋巴细胞接触从而改善其性质的步骤。

10.根据权利要求9所述的改善T淋巴细胞的性质的方法，其特征在于，所述改善包括选自下述行为中的至少之一：

(1)维持在缺乏抗原刺激下记忆性T淋巴细胞的存活；

(2)抑制T淋巴细胞的凋亡；

(3)促进T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌。

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