CN108728488A - 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用 - Google Patents

溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108728488A
CN108728488A CN201710258891.4A CN201710258891A CN108728488A CN 108728488 A CN108728488 A CN 108728488A CN 201710258891 A CN201710258891 A CN 201710258891A CN 108728488 A CN108728488 A CN 108728488A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
cell
oncolytic virus
oncolytic
construct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201710258891.4A
Other languages
English (en)
Inventor
黄雪芬
陈思毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Life Order Ltd
Original Assignee
Life Order Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Life Order Ltd filed Critical Life Order Ltd
Priority to CN201710258891.4A priority Critical patent/CN108728488A/zh
Publication of CN108728488A publication Critical patent/CN108728488A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用。溶瘤病毒构建体包含：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于抑制免疫检查点；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。根据本发明实施例的构建体编码抑制免疫检查点的融合蛋白和免疫刺激分子，能够抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起个体肿瘤特异性的免疫反应，进而实现全身性的，有效的杀伤肿瘤细胞。

Description

溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒、重组细胞、药物组合物，更进一步地，本发明涉及溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒、重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、抑制哺乳动物恶性细胞增殖。
背景技术
溶瘤病毒是指一类具有在肿瘤细胞中选择性复制与包装能力，实现选择性杀伤肿瘤细胞的病毒。目前，多数研究通过改造一些自然界存在的致病力较弱的毒种，使其特异的在肿瘤细胞中表达包装继而实现溶瘤作用。溶瘤病毒实现选择性杀伤肿瘤细胞的原理主要有两种：第一，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞；第二，选择利用肿瘤特异性的启动子调控病毒关键基因的表达使溶瘤病毒在肿瘤细胞内大量复制并表达毒性蛋白摧毁肿瘤细胞，并/或同时分泌细胞因子刺激自身免疫系统攻击肿瘤细胞。相应的溶瘤病毒无法或减低在正常机体细胞内复制而不具有或减弱杀伤作用，因此溶瘤病毒具有高的抗肿瘤效应和低的副作用。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了进展。目前腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)、新城疫病毒等相继被改造成溶瘤病毒。2006年，溶瘤腺病毒产品(oncorine)在中国已经用于临床治疗，主要用于治疗鼻咽癌等。Oncorine的原理，将人5型腺病毒E1B-55kD区删除，使该病毒可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用。但是，临床数据显示这种基于p53基因突变的溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。美国生物治疗公司Jennerex的JX-594是一种经过修改的牛痘病毒。在2013年完成的二期临床试验中，发现原发性肝癌患者在注射了高剂量的病毒后，其生命延长时间的中间值可达到14.1个月，而接受低剂量注射的患者只有6.7个月的生命延长期。生物技术公司BioVex研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEX GM-CSF已于2015年10月通过了FDA的批准成为世界首个上市的溶瘤病毒产品。OncoVex可选择性地杀灭肿瘤细胞同时表达分泌GM-CSF启动机体产生系统的免疫反应杀伤剩余局部肿瘤细胞及其转移肿瘤。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示50名患者中有26％对治疗有反应，有8名患者完全恢复健康。该公司于2011年被Amgen公司收购，用于推进三期临床试验。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的治疗数据，临床证明它能成功地让晚期患者的肿瘤缩小，并在超过400名试验患者的III期研究中，Amgen的该药物要比同类其他药物表现得更加出色。
综合以上的研究成果可以发现，溶瘤病毒确实是治疗肿瘤的利器，但溶瘤病毒依然需要科研工作者进一步地开发和改进，来增强局部及全身性抗肿瘤作用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒能够在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，同时它还能激发免疫反应，吸引及激活更多免疫细胞来继续杀伤局部残余癌细胞及全身转移扩散的癌细胞。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种溶瘤病毒构建体。根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒构建体包含：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于特异性抑制免疫检查点分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。根据本发明实施例的构建体编码抑制免疫检查点的融合蛋白和免疫刺激分子，能够抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起个体肿瘤特异性的免疫反应，进而实现全身性的，有效的杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的实施例，上述溶瘤病毒构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-L1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD1融合蛋白或CD80融合蛋白。分泌型PD1融合蛋白或CD80融合蛋白可与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，而抑制PD-L1介导的免疫抑制机制，进而肿瘤细胞的免疫逃逸机制被封闭，免疫细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的实施例，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD-L2融合蛋白。分泌型PD-L2融合蛋白可与免疫细胞表面的PD-1结合，而抑制PD-1介导的免疫抑制机制，进而肿瘤细胞的免疫逃逸机制被封闭，免疫细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的实施例，所述分泌型PD1融合蛋白包括PD1信号肽段、PD1胞外区段和IgG Fc段。信号肽是合成融合蛋白的N末端的一段短肽，其作用是介导融合蛋白分泌出细胞。程序性死亡因子-1(PD-1)也可被叫做程序性细胞死亡因子1(PDCD1)或CD279，是一种免疫球蛋白超家族的单通I型跨膜糖蛋白。它是CD28/CTLA-4家族中的一种免疫受体，具有lgV型胞外区，其胞外区与CTLA-4，CD28和ICOS有21％～33％序列一致。PD-1的胞浆部包含两个酪氨酸残基，一个是基于近膜免疫受体酪氨酸的抑制功能区(ITIM)，另一个是基于免疫受体酪氨酸的转换功能区(ITSM)。ITIM广泛存在于免疫抑制受体中，并且近膜酪氨酸残基对于PD-1的抑制功能可能起着关键作用。PD-1表达在激活的T细胞，B细胞和巨噬细胞的表面，PD-1与CTLA-4相比，PD-1更加广泛地负向调控免疫反应。PD-1与PD-L1或PD-L2结合，进而启动蛋白酪氨酸磷酸化来负向调控抗原受体的信号转导。PD-1参与到淋巴细胞的克隆选择和外周耐受的生理过程，从而可预防自体免疫疾病。作为一个T-细胞效应机制的负向调控器，PD-1与表达在肿瘤细胞上的PD-L1相互作用，导致抗肿瘤免疫的抑制。可溶性PD1胞外IgV区片段能够与表达在肿瘤细胞表面的PD-L1结合，因此竞争性抑制了表达在T细胞的PD1与表达在肿瘤细胞上的PD-L1的相互作用。与免疫球蛋白Fc构建的治疗性融合蛋白对于通过二聚作用改进生物活性，以及通过增加分子大小和减少降解，来增加在血浆的半衰期。例如改进型Fc融合蛋白包括etanercept，belatacept和romiplostim，这三种蛋白分别由Fc区融合肿瘤坏死因子受体2，CTLA-4的胞外区和TPO-模拟肽组成。
根据本发明的实施例，所述CD80融合蛋白包括CD80信号肽段、CD80胞外区段和IgGFc段。一些研究表明，CD80与PD-L1结合，其结合亲和力与CD80与CD28的结合亲和力大致相当，这表明CD80能够与PD-L1结合并且通过空间位阻效应阻止PD-1-PD-L1的相互作用。在人类以及小鼠肿瘤细胞上的研究也表明，由胞外CD80lgV和lgC区融合IgG Fc段的可溶性CD80-Fc融合蛋白可抑制PD-1与PD-L1+肿瘤细胞结合，并激活PD-1+CD4+和CD8+T细胞。
根据本发明的实施例，所述分泌型PD-L2融合蛋白包括PD-L2信号肽段、PD-L2胞外区段和IgG Fc段。PD-L2和PD-L1均能结合PD1。可溶性PD-L2-Fc融合蛋白能够与PD1结合并激活T细胞来杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的实施例，所述免疫刺激分子包括选自人类GM-CSF、IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，IL-24，TNF，IFNα，IFNβ，IFNγ，MIP-I，MIP-Iβ，MCP-I，RANTES的至少之一。上述免疫刺激分子能够引起人类全身性的免疫反应，进而对肿瘤细胞的免疫杀伤更加有效。
根据本发明的实施例，所述构建体的载体为牛痘病毒载体，所述牛痘病毒为WR株牛痘病毒，所述牛痘病毒中的胸苷激酶基因和生长因子基因失活。牛痘病毒以活疫苗的形式被用于预防天花，并且最近被用作治疗肿瘤的疫苗。牛痘病毒已被改造成携带各种抗原，细胞因子和免疫刺激分子包括癌胚抗原、gp100、MART-1、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子，B7-1，IL3-1β，IL-2，和IL-12，作为肿瘤疫苗，激活抗肿瘤免疫反应。失活胸苷激酶基因(TK基因)或者生长因子基因(VGF基因)相比野生型病毒，能够显著降低病毒的毒性。携带有TK-基因的病毒需要在分裂细胞的核苷酸库中汲取TTP来合成DNA。这会导致在分裂细胞中有优势的病毒复制，来选择性杀伤肿瘤细胞。VGF是一种分泌蛋白，在病毒感染早期产生，并且作为一个有丝分裂原，来促进周围的细胞接受牛痘病毒感染。去除这个生长因子引起静息正常细胞中病毒复制的下降。一起去除TK和VGE基因能更进一步增加肿瘤的特异性选择杀伤。缺少TK基因，病毒复制需要从分裂细胞中汲取TTP。而刺激周围细胞分裂的现象在缺少VGF的情况下不会发生。因此，病毒复制只能选择性在不断分裂的肿瘤细胞中发生。
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子以及第二核酸分子设置于所述胸苷激酶基因的第240碱基之后，第308碱基之前。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；第二启动子，所述第二启动子与所述第一核酸分子可操作地连接。第一核酸分子和第二核酸分子在第一启动子和第二启动子的调控下，能够分别独立地启动表达，彼此之间没有干扰，表达调控效率更高。
根据本发明的实施例，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自pSel、p7.5的至少之一。被牛痘特异性聚合酶控制的p7.5启动子是传统的早期和晚期启动子，而被广泛应用到重组基因的表达。pSel是合成型牛痘病毒启动子，其是基于序列的改造，这种序列的改造增加了P7.5早/晚期启动子的活性。这两个启动子被广泛用作外来基因的表达以此在牛痘病毒免疫的宿主体内产生一个保护性的免疫反应。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种溶瘤病毒构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列。
TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCATCACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTGCCACCTGCTCTTGTCCACGGTGAGCTTGCTGTAGAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCATCTCCTCCCGGGATGGGGGCAGGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTCCTTGCCATTCAGCCAGTCCTGGTGCAGGACGGTGAGGACGCTGACCACACGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCCCCCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGTGGGCTGTGGGCACTTCTGCCCTTCTCTCTGTCACCCTGAGCTCTGCCCGCAGGCTCTCTTTGATCTGCGCCTTGGGGGCCAGGGAGATGGCCCCACAGAGGTAGGTGCCGCTGTCATTGCGCCGGGCCCTGACCACGCTCATGTGGAAGTCACGCCCGTTGGGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGGCAGTCCTGGCCGGGCTGGCTGCGGTCCTCGGGGAAGGCGGCCAGCTTGTCCGTCTGGTTGCTGGGGCTCATGCGGTACCAGTTTAGCACGAAGCTCTCCGATGTGTTGGAGAAGCTGCAGGTGAAGGTGGCGTTGTCCCCTTCGGTCACCACGAGCAGGGCTGGGGAGAAGGTGGGGGGGTTCCAGGGCCTGTCTGGGGAGTCTAAGAACCATCCTGGCCGCCAGCCCAGTTGTAGCACCGCCCAGACGACTGGCCAGGGCGCCTGTGGGATCTGCATGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCGACTTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTTCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGATCATAACGATCTCTATAATCTCGCGCAACCTATTTTCCCCTCGAACACTTTTTAAGCCGTAGATAAACAGGCTGGGACACTTCACCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA(SEQ ID NO：1)。
TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTGCCACCTGCTCTTGTCCACGGTGAGCTTGCTGTAGAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCATCTCCTCCCGGGATGGGGGCAGGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTCCTTGCCATTCAGCCAGTCCTGGTGCAGGACGGTGAGGACGCTGACCACACGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATCAGTTGGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCCCCCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGCGGCCGCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGTATTCCAGTTGAAGGTCTGATTCACTCTTAAATGTCCATACTTGATGAGACACATGAAGCTGTGGTTGGTTGTCATATTGAAATCCAGTTTGCTGCTAACAGCATAGAGCTCAGTTTCAGGATCTTGGGAAACTGTTGTGTTGATGGCATTTAATTCTTCTCCATTTTCCAACCAGGAGAGGTGAGGCTCTGGAAAACCTCCAGAGGTTGAGCAAATTATCCTTCTAATATTAGAAGTTGGAATTTCAAAGTCAGATATACTAGGTGTAGGGAAGTCAGCTTTGACTGATAACGTCACTTCAGCCAGGTGTTCCCGCTTGAAAGCGTCTTTTTCATACTTCAGAACAACACACTCGTATGTGCCCTCGTCAGATGGGCGCAGAGCCAGGATCACAATGGAGAGGTTATTAGTGATATCAAAGATGGTCCGGTTCTTGTACTCGGGCCATATATTCATGTCCCCAGACATCATAGTCAGCACCATTTTCTTCTCCTTTTGCCAGTAGATGCGAGTTTGTGCCAGCTCTTCAACAGAAACATTGTGACCACAGGACAGCGTTGCCACTTCTTTCACTTCCTTGGTCACGTGGATAACACCTGAACAGAAGTGAGAAAGACCAGCCAGCACCAAGAGCTGAAAGAAATTGAGGTATGGACACTTGGATGGTGATGTTCCCTGCCTCCGTGTGTGGCCCATTCTAGAATCTAGATGCATTCGCGAGGTACCGTCGACTTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTTCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGATCATAACGATCTCTATAATCTCGCGCAACCTATTTTCCCCTCGAACACTTTTTAAGCCGTAGATAAACAGGCTGGGACACTTCACCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA(SEQ ID NO：2)。
TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTGCCACCTGCTCTTGTCCACGGTGAGCTTGCTGTAGAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCATCTCCTCCCGGGATGGGGGCAGGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTCCTTGCCATTCAGCCAGTCCTGGTGCAGGACGGTGAGGACGCTGACCACACGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATCAGTTGGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCCCCCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGCGGCCGCGTGAGTGTTTATTTTCCTGTAGGAAGCTTTGACTTTCAGAGTCAGGTACTTGTAGTCCCAGGCGACCCCATAGATGATTATGCATTGGTACTGTCCTTCGTCCCTCACTTGGACTTGAGGTATGTGGAACGAGGCCTTCCCTAGGGGCAGCTGCTCCTCCAGCAAAGTGGCTCTTTCACGGTGTGGGGATGTATCATTTTCCACCTTTTGCAAACTGGCTGTTATTGCTCCAAGGTTCACATGACTTCCAGTGTCAAAGTTGCATTCCAGGGTCACATTGCTGCCATGCTCTATTATGTACAGTTCCTTAGGGACTGTCACTGTGAATAAAGCTGCTATCTGGTGAAGCTGCAATTCCAGGCTCAACATTAGCAGGAGGAAGATCATTCTAGAATCTAGATGCATTCGCGAGGTACCGTCGACTTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTTCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGATCATAACGATCTCTATAATCTCGCGCAACCTATTTTCCCCTCGAACACTTTTTAAGCCGTAGATAAACAGGCTGGGACACTTCACCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA(SEQ ID NO：3)。
其中，SEQ ID NO:1是sPD1-Fc-pSel-p7.5-GMCSF的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是sCD80-Fc-pSel-p7.5-GMCSF的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是sPDL2-Fc--pSel-p7.5-GMCSF的核苷酸序列。
根据本发明实施例的溶瘤病毒构建体携带上述三种核苷酸序列，构建体编码的融合蛋白(sPD1-Fc、sCD80-Fc、sPDL2-Fc)和免疫刺激分子(GMCSF)，能够特异性抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起全身性的免疫反应，进而实现对肿瘤细胞有效和特异性的杀伤。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种溶瘤病毒构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带SEQ ID NO：4～6示的核苷酸序列。
ATGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGGCCCCATGTTTTCAGGTAAAAGTACAGAATTAATTAGACGAGTTAGACGTTATCAAATAGCTCAATATAAATGCGTGACTATAAAATATTCTAACGATAATAGATACGGAACGGGACTATGGACGCATGATAAGAATAATTTTGAAGCATTGGAAGCAACTAAACTATGTGATCTCTTGGAATCAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCTTTTTATCTGCGCGGTTAACCGCCTTTTTATCCATCAGGTGATCTGTTTTTATTGTGGAGTCTAGAACTAGTAGGCGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTACGCCTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCATCACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTGCCACCTGCTCTTGTCCACGGTGAGCTTGCTGTAGAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCATCTCCTCCCGGGATGGGGGCAGGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTCCTTGCCATTCAGCCAGTCCTGGTGCAGGACGGTGAGGACGCTGACCACACGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCCCCCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGTGGGCTGTGGGCACTTCTGCCCTTCTCTCTGTCACCCTGAGCTCTGCCCGCAGGCTCTCTTTGATCTGCGCCTTGGGGGCCAGGGAGATGGCCCCACAGAGGTAGGTGCCGCTGTCATTGCGCCGGGCCCTGACCACGCTCATGTGGAAGTCACGCCCGTTGGGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGGCAGTCCTGGCCGGGCTGGCTGCGGTCCTCGGGGAAGGCGGCCAGCTTGTCCGTCTGGTTGCTGGGGCTCATGCGGTACCAGTTTAGCACGAAGCTCTCCGATGTGTTGGAGAAGCTGCAGGTGAAGGTGGCGTTGTCCCCTTCGGTCACCACGAGCAGGGCTGGGGAGAAGGTGGGGGGGTTCCAGGGCCTGTCTGGGGAGTCTAAGAACCATCCTGGCCGCCAGCCCAGTTGTAGCACCGCCCAGACGACTGGCCAGGGCGCCTGTGGGATCTGCATGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCGACTTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTTCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGATCATAACGATCTCTATAATCTCGCGCAACCTATTTTCCCCTCGAACACTTTTTAAGCCGTAGATAAACAGGCTGGGACACTTCACCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGACTCGAGGATATCTCTTTTCAACGCCTGGCACTGCCGGGCGTTGTTCTTTTTAACTTCAGGCGGGTTACAATAGTTTCCAGTAAGTATTCTGGAGGCTGCATCCATGACACAGGCAAACCTGCGGATCCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCAGTTATAGTAGCCGCACTCGATGGGACATTTCAACGTAAACCGTTTAATAATATTTTGAATCTTATTCCATTATCTGAAATGGTGGTAAAACTAACTGCTGTGTGTATGAAATGCTTTAAGGAGGCTTCCTTTTCTAAACGATTGGGTGAGGAAACCGAGATAGAAATAATAGGAGGTAATGATATGTATCAATCGGTGTGTAGAAAGTGTTACATCGACTCATAA(SEQ ID NO：4)。
ATGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGGCCCCATGTTTTCAGGTAAAAGTACAGAATTAATTAGACGAGTTAGACGTTATCAAATAGCTCAATATAAATGCGTGACTATAAAATATTCTAACGATAATAGATACGGAACGGGACTATGGACGCATGATAAGAATAATTTTGAAGCATTGGAAGCAACTAAACTATGTGATCTCTTGGAATCAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCTTTTTATCTGCGCGGTTAACCGCCTTTTTATCCATCAGGTGATCTGTTTTTATTGTGGAGTCTAGAACTAGTAGGCGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTACGCCTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTGCCACCTGCTCTTGTCCACGGTGAGCTTGCTGTAGAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCATCTCCTCCCGGGATGGGGGCAGGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTCCTTGCCATTCAGCCAGTCCTGGTGCAGGACGGTGAGGACGCTGACCACACGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATCAGTTGGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCCCCCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGCGGCCGCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGTATTCCAGTTGAAGGTCTGATTCACTCTTAAATGTCCATACTTGATGAGACACATGAAGCTGTGGTTGGTTGTCATATTGAAATCCAGTTTGCTGCTAACAGCATAGAGCTCAGTTTCAGGATCTTGGGAAACTGTTGTGTTGATGGCATTTAATTCTTCTCCATTTTCCAACCAGGAGAGGTGAGGCTCTGGAAAACCTCCAGAGGTTGAGCAAATTATCCTTCTAATATTAGAAGTTGGAATTTCAAAGTCAGATATACTAGGTGTAGGGAAGTCAGCTTTGACTGATAACGTCACTTCAGCCAGGTGTTCCCGCTTGAAAGCGTCTTTTTCATACTTCAGAACAACACACTCGTATGTGCCCTCGTCAGATGGGCGCAGAGCCAGGATCACAATGGAGAGGTTATTAGTGATATCAAAGATGGTCCGGTTCTTGTACTCGGGCCATATATTCATGTCCCCAGACATCATAGTCAGCACCATTTTCTTCTCCTTTTGCCAGTAGATGCGAGTTTGTGCCAGCTCTTCAACAGAAACATTGTGACCACAGGACAGCGTTGCCACTTCTTTCACTTCCTTGGTCACGTGGATAACACCTGAACAGAAGTGAGAAAGACCAGCCAGCACCAAGAGCTGAAAGAAATTGAGGTATGGACACTTGGATGGTGATGTTCCCTGCCTCCGTGTGTGGCCCATTCTAGAATCTAGATGCATTCGCGAGGTACCGTCGACTTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTTCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGATCATAACGATCTCTATAATCTCGCGCAACCTATTTTCCCCTCGAACACTTTTTAAGCCGTAGATAAACAGGCTGGGACACTTCACCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGACTCGAGGATATCTCTTTTCAACGCCTGGCACTGCCGGGCGTTGTTCTTTTTAACTTCAGGCGGGTTACAATAGTTTCCAGTAAGTATTCTGGAGGCTGCATCCATGACACAGGCAAACCTGCGGATCCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCAGTTATAGTAGCCGCACTCGATGGGACATTTCAACGTAAACCGTTTAATAATATTTTGAATCTTATTCCATTATCTGAAATGGTGGTAAAACTAACTGCTGTGTGTATGAAATGCTTTAAGGAGGCTTCCTTTTCTAAACGATTGGGTGAGGAAACCGAGATAGAAATAATAGGAGGTAATGATATGTATCAATCGGTGTGTAGAAAGTGTTACATCGACTCATAA(SEQ IDNO：5)。
ATGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGGCCCCATGTTTTCAGGTAAAAGTACAGAATTAATTAGACGAGTTAGACGTTATCAAATAGCTCAATATAAATGCGTGACTATAAAATATTCTAACGATAATAGATACGGAACGGGACTATGGACGCATGATAAGAATAATTTTGAAGCATTGGAAGCAACTAAACTATGTGATCTCTTGGAATCAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCTTTTTATCTGCGCGGTTAACCGCCTTTTTATCCATCAGGTGATCTGTTTTTATTGTGGAGTCTAGAACTAGTAGGCGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTACGCCTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCATGCAGCACGGAGCATGAGAAGACGTTCCCCTGCTGCCACCTGCTCTTGTCCACGGTGAGCTTGCTGTAGAGGAAGAAGGAGCCGTCGGAGTCCAGCACGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCTCCCACTCCACGGCGATGTCGCTGGGATAGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAGGCTGACCTGGTTCTTGGTCATCTCCTCCCGGGATGGGGGCAGGGTGTACACCTGTGGTTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGATGGTTTTCTCGATGGGGGCTGGGAGGGCTTTGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTCCTTGCCATTCAGCCAGTCCTGGTGCAGGACGGTGAGGACGCTGACCACACGGTACGTGCTGTTGTACTGCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCAGGGTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATCAGTTGGTCCTTGGGTTTTGGGGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCCCCCAGGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGCGGCCGCGTGAGTGTTTATTTTCCTGTAGGAAGCTTTGACTTTCAGAGTCAGGTACTTGTAGTCCCAGGCGACCCCATAGATGATTATGCATTGGTACTGTCCTTCGTCCCTCACTTGGACTTGAGGTATGTGGAACGAGGCCTTCCCTAGGGGCAGCTGCTCCTCCAGCAAAGTGGCTCTTTCACGGTGTGGGGATGTATCATTTTCCACCTTTTGCAAACTGGCTGTTATTGCTCCAAGGTTCACATGACTTCCAGTGTCAAAGTTGCATTCCAGGGTCACATTGCTGCCATGCTCTATTATGTACAGTTCCTTAGGGACTGTCACTGTGAATAAAGCTGCTATCTGGTGAAGCTGCAATTCCAGGCTCAACATTAGCAGGAGGAAGATCATTCTAGAATCTAGATGCATTCGCGAGGTACCGTCGACTTCGAGCTTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAAGCTTTCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGATCATAACGATCTCTATAATCTCGCGCAACCTATTTTCCCCTCGAACACTTTTTAAGCCGTAGATAAACAGGCTGGGACACTTCACCTCGAGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGACTCGAGGATATCTCTTTTCAACGCCTGGCACTGCCGGGCGTTGTTCTTTTTAACTTCAGGCGGGTTACAATAGTTTCCAGTAAGTATTCTGGAGGCTGCATCCATGACACAGGCAAACCTGCGGATCCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCAGTTATAGTAGCCGCACTCGATGGGACATTTCAACGTAAACCGTTTAATAATATTTTGAATCTTATTCCATTATCTGAAATGGTGGTAAAACTAACTGCTGTGTGTATGAAATGCTTTAAGGAGGCTTCCTTTTCTAAACGATTGGGTGAGGAAACCGAGATAGAAATAATAGGAGGTAATGATATGTATCAATCGGTGTGTAGAAAGTGTTACATCGACTCATAA(SEQ ID NO：6)。
其中，SEQ ID NO:4是vTK-L-sPD1-Fc-pSel-p7.5-GMCSF-vTK-R的核苷酸序列；SEQID NO:5是vTK-L-sCD80-Fc-pSel-p7.5-GMCSF-vTK-R的核苷酸序列；SEQ ID NO:6是vTK-L-sPDL2-Fc-pSel-p7.5-GMCSF-vTK-R的核苷酸序列。根据本发明实施例的溶瘤病毒构建体携带上述三种核苷酸序列，构建体编码的融合蛋白(sPD1-Fc、sCD80-Fc、sPDL2-Fc)和免疫刺激分子(GMCSF)，能够特异性抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起全身性的免疫反应，进而实现对肿瘤细胞有效和特异性的杀伤，且安全性高。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种溶瘤病毒。根据本发明的实施例，所述溶瘤病毒携带前面所述的溶瘤病毒构建体。本发明实施例的溶瘤病毒，能够特异性抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起全身性的免疫反应，进而实现对肿瘤细胞有效和特异性的杀伤。
根据本发明的实施例，上述溶瘤病毒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述病毒为细胞内成熟病毒、细胞内包装病毒、细胞相关包装病毒或细胞外包装病毒，优选地，所述病毒为细胞外包装病毒或细胞内成熟病毒，更优选地，所述病毒为细胞外包装病毒。细胞内成熟病毒形成有一个脂双层外壳，并且大多数位于被感染细胞内直到细胞破裂。细胞相关包装病毒和细胞外包装病毒有一个额外的脂双层，并且能从宿主细胞中出芽而不裂解宿主细胞。细胞外包装病毒对靶细胞如肿瘤细胞有更高的感染效率，能够更容易生产和纯化以用于治疗。
根据本发明的实施例，所述病毒为牛痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、纽卡斯尔病病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、Sinbis病毒或流感病毒，优选地，所述病毒为牛痘病毒。牛痘病毒是痘病毒家族的一个成员，具有双链DNA，包装成砖块颗粒状，其大小为300×240×120nm。牛痘病毒颗粒包括许多病毒编码酶，例如DNA-依赖性RNA聚合酶、转录因子、加帽和甲基化酶以及多聚(A)聚合酶。这些酶使得病毒能够在宿主细胞中，在所产生的病毒因子(存在于被感染细胞的细胞质内)的调控下，独立合成可翻译mRNAs。在世界范围内的天花根除计划中，牛痘病毒作为一种有效的疫苗而被广泛关注，牛痘病毒由于其可作为预防天花疫苗的功能，其在人类各种病毒的研究中是历时最长和最广泛的。牛痘病毒生理和病理特征均得到了细致研究，并且有大量的可获得的有关牛痘病毒的基础、前临床和临床数据可供参考。牛痘病毒具有一些独特的特征，其继续发展为生物治疗剂尤其是癌症治疗剂极具吸引力。牛痘病毒宿主范围广，在几乎所有人类和许多其它种类的细胞中能够感染和复制。因此，它在许多动物模型中被广泛应用及研究，以此来协助规划有意义的临床前实验和转化为临床试验。牛痘病毒感染和继发基因表达以高效的速率发生，并且能够获得许多病毒启动子来控制基因表达的时间和水平。因为整个复制循环发生在细胞质，所以牛痘病毒基因不会整合到宿主细胞染色体核酸中。牛痘病毒的优点是可用抗病毒药物限制该病毒的毒性和扩散，例如应用牛痘免疫球蛋白。更进一步地，使用现有的标准DNA操作技术，能够将牛痘病毒与大的和/或许多转录基因高效重组在一起，最大可达25Kb，进而插入牛痘病毒基因组。牛痘病毒能够以相对高的滴度简单地产生，并且牛痘病毒颗粒稳定，可以以溶液或干粉的状态冻存更长时间而不会显著丢失活性。最后，牛痘病毒作为一种免疫原性病毒，能够激发强有力地免疫反应，为牛痘病毒作为肿瘤疫苗提供了基础。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的溶瘤病毒构建体导入受体细胞，或通过将前面所述的溶瘤病毒转染受体细胞获得的。本发明实施例的重组细胞可为溶瘤病毒的快速复制和成熟提供必要条件，进而利用根据本发明实施例的重组细胞，能够特异性抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起全身性的免疫反应，进而实现对肿瘤细胞有效和特异性的杀伤。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述受体细胞包括选自免疫细胞或肿瘤细胞的至少之一。免疫细胞或肿瘤细胞作为受体细胞而获得的重组细胞，能够更加安全地特异性抑制免疫检查点分子所介导的免疫抑制机制和引起全身性的免疫反应，进而实现对肿瘤细胞有效和特异性的杀伤，安全性更高。
在本发明第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的溶瘤病毒以及药学上可接受的载体。发明人发现，本发明的药物组合物可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。
在本发明的第七方面，本发明提出了前面所述的溶瘤病毒构建体、前面所述的溶瘤病毒或前面所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、抑制哺乳动物恶性细胞增殖。利用根据本发明实施例的溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒或重组细胞所制备的药物，能够有效抑制哺乳动物恶性细胞增殖，对于肿瘤的预防和治疗疗效显著。
附图说明
图1是根据本发明实施例的带有一系列人类融合蛋白编码基因的重组牛痘病毒穿梭载体的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的带有一系列鼠融合蛋白编码基因的重组牛痘病毒穿梭载体的结构示意图；
图3是根据本发明实施例的重组牛痘病毒VV-imPDL1/mGMCSF原位瘤内注射有效控制免疫完整小鼠中原位肿瘤生长的结果图；
图4是根据本发明实施例的免疫完整小鼠的原位瘤内注射重组牛痘病毒VV-imPDL1/mGMCSF有效激活系统性抗肿瘤活性的结果图；
图5是根据本发明实施例的在免疫缺陷小鼠模型，重组牛痘病毒VV-imPDL1/mGMCSF原位瘤内注射减弱控制原位肿瘤生长的能力结果图；以及
图6是根据本发明实施例的在免疫缺陷小鼠模型，原位瘤内注射重组牛痘病毒VV-imPDL1/mGMCSF不能激活系统性抗肿瘤活性的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1材料和方法
细胞系非洲绿猴肾成纤维细胞(CV-1)来自美国种质保藏中心。CV-1细胞培养在添加有抗生素-抗真菌溶液(100U/mL青霉素G，250ng/mL两性霉素B，100units/mL链霉素)和10％胎牛血清(FBS；Invitrogen Corporation)的DMEM培养基中。培养环境为37℃、5％CO2。人类143TK-细胞(ATCC)培养在基础培养基中，其中基础培养基为添加有0.015mg/ml的5-溴-2’-脱氧尿苷(BUdR)，10％胎牛血清和Earle的BSS。
人黑色素瘤细胞A375，人胰腺癌细胞Panc1，人大脑肿瘤细胞U87，人肺癌细胞H226，人头颈癌细胞ATCC TCP-1012取自ATCC。正常细胞系，包括人正常细胞PDF(人初级真皮成纤维细胞)，MRC5(正常人肺成纤维细胞)，IMR-90(ATCC CCL-186，正常人肺成纤维细胞)和BJ(ATCC CRL-2522，正常人皮肤成纤维细胞)来自ATCC。小鼠结肠腺癌细胞系MC38，小鼠前列腺癌细胞系TRAMP-C2和小鼠恶性黑色素瘤细胞系B16-OVA来自C57BL/6小鼠。小鼠结肠腺癌细胞系CT26细胞(ATCC)来自Balb/c小鼠。Py230细胞系(ATCC)是小鼠乳腺肿瘤细胞系，它来自C57BL/6小鼠。
细胞培养中的病毒复制和滴定CV-1(1×105)细胞被种在12或24-孔板里。培养24h后，用少量病毒感染细胞。细胞在37℃孵育1小时，每10分钟短暂搅拌，以加速病毒感染细胞。1小时后，移除感染液，更换新鲜培养基。分别在24h、48h、72h或96h收集细胞。感染细胞的病毒颗粒通过快速冻融循环释放出来，并通过CV-1单层细胞空斑法两次测定病毒在培养基中的滴度(pfu/mL)。对剩余的CV-1细胞进行同样的操作。该剩余的CV-1细胞在病毒感染之前以茂密的单层细胞状态培养在含有5％FBS的DMEM中6天。
细胞病变(CPE)的测定肿瘤细胞以每孔1×104个细胞的密度种在96-孔板中，每孔中加有100μL的培养基，并在37℃的条件下培养过夜。病毒以指定滴度感染肿瘤细胞，感染后的头2个小时在含有2.5％FBS的培养基中培养，之后更换完全培养基。所有样品均测试三次。肿瘤细胞的活力通过MTS formazan活力检测试剂盒(Promega，Madison，WI)检测。在读板(Molecular Devices VERSAmax，Sunnyvale，CA(Molecular Devices))上在490nm下测定孔的光密度。对于每个病毒稀释液处理的肿瘤细胞的平均活力是通过相对百分比(相对于单独用培养基处理的对照孔，对照孔细胞的活力设为100％成活率)来计算的±SEM。每个检测均检测三次。
动物研究雌性C57BL/6小鼠和免疫缺陷NSG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)购买自Jackson实验室，并养育在南加州大学动物设施和贝勒医学院的特定无病原环境中。所有的动物研究都得到了南加州大学动物保护与应用委员会和贝勒医学院的批准。
免疫完全小鼠皮下植入自体肿瘤细胞(植入位置为右侧或左侧肋腹)(植入数量为0.5～1×106个细胞/鼠)。例如将B16-OVA，TRAMP-C2和MC38细胞植入C57/B6小鼠，将CT26细胞植入BALB/c小鼠。确定的异种移植模型包括肿瘤细胞皮下植入免疫缺陷NSG小鼠。所有小鼠年龄均在8～10周，并且性别匹配。当肿瘤生长到5-10mm(直径)，小鼠被随机分成几组并接受肿瘤内注射不同的重组溶瘤病毒。每三或四天通过卡尺测量肿瘤的大小，肿瘤的大小通过下列公式计算：(长径)×(短径)2.
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)试验肿瘤细胞悬浮液通过CFSE(Life Technologies，USA)进行荧光标记。标记的靶细胞与从卵清蛋白-特异性TCR转基因小鼠分离的CD8+T细胞以不同的比例共培养5h。在细胞毒性试验终点，CD8+T细胞被标记上抗-小鼠CD3-APC(clone17A2，Biolegend，San Diego，CA)。通过SytoxBlue(Life Technologies，USA)染色来区分活细胞、死细胞。分析10，000实际存活细胞。靶细胞的裂解比率是通过流式分析靶细胞(CFSE+)和分析SytoxBlue+and SytoxBlue-细胞获得的。
统计分析本申请的数据统计分析是在USC的罗瑞斯全身肿瘤中心的统计中心的协助下完成的。所有的数据均以平均值和标准偏差(s.e.)的方式表示。方差分析用来衡量不同组差异水平。不同组的差异比较是利用SigmaStat 2.03软件(SPSS，Inc.)进行Student–Newman–Keuls分析或者进行Chi-square分析实现的。P值小于0.05被认为具有显著性差异。
实施例2共表达人PD1抑制剂和GM-CSF的重组牛痘溶瘤病毒(VV-iPD1/GMCSF)的构建
编码人类融合蛋白(iPD1)(包含人类PD1信号肽序列、PD1胞外区和人IgG Fc片段)的核苷酸序列与限制性酶切位点(Not1and SalI)相连。合成后被克隆进牛痘病毒穿梭载体(pSEL-DsRed)(RFP：red fluorescent protein红色荧光蛋白)，从而构建了pVV-iPD1穿梭载体(如图1所示)。人类GM-CSF基因连接限制性酶切位点(XhoI and EcoRV)合成后，被克隆进pVV-iPD1穿梭载体来构建穿梭载体pVV-iPD1/GMCSF。在获得的穿梭载体pVV-iPD1/GMCSF中，the iPD1融合基因在pSEL启动子的控制下，GM-CSF基因在p7.5启动子的调控下。人类GM-CSF基因也可以被克隆进pSEL-DsRed载体来构建穿梭载体pVV-GMCSF(如图1所示)。
病毒生长因子缺失的Western Reserve(WR)牛痘病毒(VV)(vSC20)(Dr BernieMoss，NIH)被用来构建重组双-缺失(VGF-TK-)的牛痘病毒，同时表达PD1-Fc(iPD1)融合基因和GM-CSM，具体构建方法参考文献“Systemic cancer therapy with a tumor-selectivevaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factorgenes.Cancer Res.2001；61:8751–8757，2001)”所记载的。简单地说，vSC20，a vgf基因-缺失的WR株VV作为母本病毒用于同源重组。为了获得重组双缺失(VGF-TK-)VV-iPD1/GMCSF，发明人在多重滴度下(0.1-0.5)用vSC20感染CV-1细胞，然后用穿梭质粒DNA pVV-iPD1/GMCSF转染CV-1细胞。重组病毒在BUdR的存在下在143Tk-细胞中被挑选出来，并通过对重组病毒的DNA进行PCR和序列分析来判定iPD1和GMCSF基因成功插入重组牛痘病毒中。这些重组溶瘤牛痘病毒(VV-iPD1/GMCSF)和对照溶瘤牛瘤病毒(VV-iPD1，VV-GMCSF，andVV-RFP)(其基因如图1所示)被生产出来和滴定以备进一步地研究。通过蛋白免疫印迹和ELISA来检测VV-iPD1/GMCSF-感染的肿瘤细胞中iPD1融合蛋白和GMCSF蛋白的表达。
实施例3构建共表达小鼠PD1抑制剂和GM-CSF的重组牛痘溶瘤病毒VV-imPD1/mGMCSF
人类GM-CSF在小鼠中无功能。人类PD1-Fc融合蛋白也不会高效地与小鼠PD-L1结合。为了检测GM-CSF和PD1-Fc(iPD1)融合蛋白所介导的抗-肿瘤免疫反应，发明人构建了一系列重组TK-VGF-牛痘病毒来表达相应的小鼠蛋白。小鼠融合蛋白基因包括小鼠PD1信号肽基因、小鼠PD1胞外区基因以及小鼠IgG2a Fc片段基因。小鼠融合蛋白基因与限制性酶切位点相连。合成后克隆进牛痘病毒穿梭载体pSEL-DsRed来构建pVV-imPDL1/mGMCSF(结果如图2所示)。小鼠pVV-imPD1或pVV-mGMCSF穿梭载体也被构建出来。接下来，表达mPD1-Fc(imPD1)融合蛋白基因和小鼠GM-CSM的重组双缺失VGF-TK-)牛痘病毒VV-iPD1/GMCSF(M)被构建出来。表达小鼠mPD1-Fc(imPD1)融合基因VV-imPD1，或小鼠mGM-CSM，VV-mGMCSF重组双缺失(VGF-TK-)牛痘病毒也被构建出来(其基因结构如图2所示)。这些重组溶瘤病毒和对照溶瘤病毒被产出和测滴度，以备后续研究。通过蛋白免疫印迹和ELISA来检测VV-imPD1/mGMCSF-感染的肿瘤细胞中imPD1融合蛋白和mGMCSF蛋白的表达。
实施例4溶瘤牛痘病毒VV-iPD1/GMCSF具有有效地直接溶解肿瘤的活性
发明人首次使用MTS细胞增殖检测试剂盒(Promega，Madison，WI)检测了重组溶瘤(VV-iPD1/GMCSF)在细胞培养过程中是否能够保持溶解肿瘤的杀伤活性。具体操作方法参照试剂盒的说明书。人类黑色素瘤细胞A375、人类胰腺癌细胞Panc1、人类大脑肿瘤细胞U87、和人类肺癌细胞H226种在组织培养皿中，并用VV-iPD1/GMCSF，VV-iPD1，VV-GMCSF，VV-RFP或mock(PBS)-分别进行感染。发明人发现，重组TK-VGF-牛痘病毒VV-iPD1/GMCSF与VV-iPD1，VV-GMCSF或VV-RFP在杀伤各种肿瘤细胞中具有相当的效果。相比于杀伤人类肿瘤细胞，VV-iPD1/GMCSF，VV-iPD1，VV-GMCSF和VV-RFP病毒在杀伤正常人类细胞上没有那么强的效果，包括PDF细胞(人类原代皮肤成纤维细胞)，MRC5(正常人肺成纤维细胞)，IMR-90(正常人肺成纤维细胞)和BJ(正常人皮肤成纤维细胞)。这个结果显示：iPD1融合蛋白基因和GMCSF基因的插入不会损坏重组溶瘤牛痘病毒VV-iPD1/GMCSF的溶瘤活性。
实施例5通过肿瘤原位注射，溶瘤牛痘病毒VV-imPD1/mGMCSF比VV-mGMCSF和VV-imPD1可更加有效地摧毁局部肿瘤
肿瘤生长在宿主内，创造着肿瘤的微环境，其中肿瘤细胞与许多其它类型的细胞共生，包括成纤维细胞和可能表达免疫检查点PD-L1的免疫细胞。发明人使用小鼠双缺失重组VV在免疫完全小鼠中来检测它们的抗肿瘤潜能。C57BL/6小鼠的Py230肿瘤细胞在相同遗传背景的小鼠体内(C57BL/6小鼠)能够生长成肿瘤。在免疫完全小鼠体内，为了检测局部瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF是否能够抑制肿瘤的生长，C57BL/6小鼠皮下注入5x105Py230肿瘤细胞，然后被分成几组(5-8个小鼠/组)。当肿瘤大小达到约～100mm3时，小鼠在指定时间内接受瘤内注射VV-iPD1/GMCSF(M)或VV-imPD1，VV-mGMCSF，VV-RFP(1x106pfu/小鼠)，或PBS两次。每3～4天监测肿瘤的大小一下。结果如图3所示。图3显示了重组溶瘤病毒VV-imPD1/mGMCSF能够摧毁Py230肿瘤。重组溶瘤病毒VV-imPD1和VV-mGMCSF能够抑制肿瘤的生长，但不能摧毁这些肿瘤。实验结果显示，重组溶瘤病毒VV-imPD1/mGMCSF在免疫完全小鼠体内具有更加强大的抗肿瘤活性。
实施例6溶瘤牛痘病毒VV-imPD1/mGMCS比VV-mGMCSF和VV-imPD1具有更强大的激发系统性抗肿瘤反应的能力
发明人检测了局部瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF能够诱导系统性抗肿瘤反应。在右肋处具有约～100mm3大小的Py230肿瘤的免疫完全C57BL/6小鼠被局部瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF or VV-imPD1，VV-mGMCSF，VV-RFP(1x106pfu per mouse)，在指定时间内注射两次。一周后，瘤内注射小鼠在左肋处通过皮下注射注入Py230肿瘤细胞(5x 105/小鼠)。左肋和右肋处的肿瘤大小每隔3～4天进行监测。结果如图4所示。图4结果显示瘤内注射重组溶瘤病毒VV-imPD1/mGMCSF能够抵抗远距离(左肋)的肿瘤的生长，然而瘤内注射重组溶瘤牛痘病毒VV-imPD1和VV-mGMCSF仅仅微弱地抑制这些远距离的收到威胁的肿瘤的生长。这个结果证明了重组溶瘤牛痘病毒VV-imPD1/mGMCSF在诱导系统性抗肿瘤活性上更加有力。
实施例7瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF所激发的系统性抗肿瘤活性是由免疫反应所介导的
发明人通过实验检测了宿主体内的抗肿瘤免疫反应是否包含在重组溶瘤牛痘病毒VV-imPD1/mGMCSF所引起的全身肿瘤杀伤反应。发明人使用免疫缺陷小鼠NSG或NOD scidγ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠进行了检测。NSG小鼠缺少成熟T和B淋巴细胞，和自然杀伤(NK)细胞，在多重细胞因子信号通路中也有缺陷。一组免疫缺陷小鼠NSG小鼠和一组野生型C57BL/6小鼠(5-8个小鼠/组)(购自Jackson Laboratory)被皮下注入5x105Py230肿瘤细胞。当肿瘤大小达到约～100mm3时，小鼠接受瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF(5x106pfu/小鼠)2次(分别在肿瘤接种后的第7和第9天)。肿瘤大小每3天监测一次。结果如图5所示。图5显示在免疫缺陷小鼠NSG中，重组溶瘤病毒VV-imPD1/mGMCSF仅仅能部分抑制Py230肿瘤的生长，抑制肿瘤生长作用弱于在免疫功能完全C57BL/6小鼠中。为进一步检测局部瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF能够诱导系统性抗肿瘤反应，在右肋处具有约～100mm3大小的Py230肿瘤的免疫缺陷小鼠NSG被局部瘤内注射VV-imPD1/mGMCSF(5x106pfu per mouse)，在指定时间内注射两次。一周后，瘤内注射小鼠组在左肋处通过皮下注射注入Py230肿瘤细胞(5x 105/小鼠)。结果如图6所示。图6结果显示在免疫缺陷小鼠，瘤内注射重组溶瘤病毒VV-imPD1/mGMCSF不能抵抗远距离(左肋)的肿瘤的生长。这个结果显示：瘤内注射的重组溶瘤牛痘病毒VV-imPD1/mGMCSF所引起的全身肿瘤杀伤作用由免疫反应所介导。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 生命序公司
<120> 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用
<130> PIDC1167813
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1893
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sPD1-Fc-pSel- p7.5- GMCSF的核苷酸序列
<400> 1
tcatttaccc ggagacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcgtg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctgtagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttt tgtcgtgggc tgtgggcact tctgcccttc tctctgtcac 720
cctgagctct gcccgcaggc tctctttgat ctgcgccttg ggggccaggg agatggcccc 780
acagaggtag gtgccgctgt cattgcgccg ggccctgacc acgctcatgt ggaagtcacg 840
cccgttgggc agttgtgtga cacggaagcg gcagtcctgg ccgggctggc tgcggtcctc 900
ggggaaggcg gccagcttgt ccgtctggtt gctggggctc atgcggtacc agtttagcac 960
gaagctctcc gatgtgttgg agaagctgca ggtgaaggtg gcgttgtccc cttcggtcac 1020
cacgagcagg gctggggaga aggtgggggg gttccagggc ctgtctgggg agtctaagaa 1080
ccatcctggc cgccagccca gttgtagcac cgcccagacg actggccagg gcgcctgtgg 1140
gatctgcatg gtggcgaccg gtggatcccg ggcccgcggt accgtcgact tcgagcttat 1200
ttatattcca aaaaaaaaaa ataaaatttc aatttttaag ctttcactaa ttccaaaccc 1260
acccgctttt tatagtaagt ttttcaccca taaataataa atacaataat taatttctcg 1320
taaaagtaga aaatatattc taatttattg cacggtaagg aagtagatca taacgatctc 1380
tataatctcg cgcaacctat tttcccctcg aacacttttt aagccgtaga taaacaggct 1440
gggacacttc acctcgagat gtggctgcag agcctgctgc tcttgggcac tgtggcctgc 1500
agcatctctg cacccgcccg ctcgcccagc cccagcacgc agccctggga gcatgtgaat 1560
gccatccagg aggcccggcg tctcctgaac ctgagtagag acactgctgc tgagatgaat 1620
gaaacagtag aagtcatctc agaaatgttt gacctccagg agccgacctg cctacagacc 1680
cgcctggagc tgtacaagca gggcctgcgg ggcagcctca ccaagctcaa gggccccttg 1740
accatgatgg ccagccacta caagcagcac tgccctccaa ccccggaaac ttcctgtgca 1800
acccagatta tcacctttga aagtttcaaa gagaacctga aggactttct gcttgtcatc 1860
ccctttgact gctgggagcc agtccaggag tga 1893
<210> 2
<211> 2159
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sCD80-Fc-pSel- p7.5- GMCSF的核苷酸序列
<400> 2
tcatttaccc ggagacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
cagcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctgtagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tcagttggtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttt tgtctgcggc cgcgttatca ggaaaatgct cttgcttggt 720
tgtattccag ttgaaggtct gattcactct taaatgtcca tacttgatga gacacatgaa 780
gctgtggttg gttgtcatat tgaaatccag tttgctgcta acagcataga gctcagtttc 840
aggatcttgg gaaactgttg tgttgatggc atttaattct tctccatttt ccaaccagga 900
gaggtgaggc tctggaaaac ctccagaggt tgagcaaatt atccttctaa tattagaagt 960
tggaatttca aagtcagata tactaggtgt agggaagtca gctttgactg ataacgtcac 1020
ttcagccagg tgttcccgct tgaaagcgtc tttttcatac ttcagaacaa cacactcgta 1080
tgtgccctcg tcagatgggc gcagagccag gatcacaatg gagaggttat tagtgatatc 1140
aaagatggtc cggttcttgt actcgggcca tatattcatg tccccagaca tcatagtcag 1200
caccattttc ttctcctttt gccagtagat gcgagtttgt gccagctctt caacagaaac 1260
attgtgacca caggacagcg ttgccacttc tttcacttcc ttggtcacgt ggataacacc 1320
tgaacagaag tgagaaagac cagccagcac caagagctga aagaaattga ggtatggaca 1380
cttggatggt gatgttccct gcctccgtgt gtggcccatt ctagaatcta gatgcattcg 1440
cgaggtaccg tcgacttcga gcttatttat attccaaaaa aaaaaaataa aatttcaatt 1500
tttaagcttt cactaattcc aaacccaccc gctttttata gtaagttttt cacccataaa 1560
taataaatac aataattaat ttctcgtaaa agtagaaaat atattctaat ttattgcacg 1620
gtaaggaagt agatcataac gatctctata atctcgcgca acctattttc ccctcgaaca 1680
ctttttaagc cgtagataaa caggctggga cacttcacct cgagatgtgg ctgcagagcc 1740
tgctgctctt gggcactgtg gcctgcagca tctctgcacc cgcccgctcg cccagcccca 1800
gcacgcagcc ctgggagcat gtgaatgcca tccaggaggc ccggcgtctc ctgaacctga 1860
gtagagacac tgctgctgag atgaatgaaa cagtagaagt catctcagaa atgtttgacc 1920
tccaggagcc gacctgccta cagacccgcc tggagctgta caagcagggc ctgcggggca 1980
gcctcaccaa gctcaagggc cccttgacca tgatggccag ccactacaag cagcactgcc 2040
ctccaacccc ggaaacttcc tgtgcaaccc agattatcac ctttgaaagt ttcaaagaga 2100
acctgaagga ctttctgctt gtcatcccct ttgactgctg ggagccagtc caggagtga 2159
<210> 3
<211> 1820
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> sPDL2-Fc--pSel- p7.5- GMCSF的核苷酸序列
<400> 3
tcatttaccc ggagacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
cagcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctgtagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tcagttggtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttt tgtctgcggc cgcgtgagtg tttattttcc tgtaggaagc 720
tttgactttc agagtcaggt acttgtagtc ccaggcgacc ccatagatga ttatgcattg 780
gtactgtcct tcgtccctca cttggacttg aggtatgtgg aacgaggcct tccctagggg 840
cagctgctcc tccagcaaag tggctctttc acggtgtggg gatgtatcat tttccacctt 900
ttgcaaactg gctgttattg ctccaaggtt cacatgactt ccagtgtcaa agttgcattc 960
cagggtcaca ttgctgccat gctctattat gtacagttcc ttagggactg tcactgtgaa 1020
taaagctgct atctggtgaa gctgcaattc caggctcaac attagcagga ggaagatcat 1080
tctagaatct agatgcattc gcgaggtacc gtcgacttcg agcttattta tattccaaaa 1140
aaaaaaaata aaatttcaat ttttaagctt tcactaattc caaacccacc cgctttttat 1200
agtaagtttt tcacccataa ataataaata caataattaa tttctcgtaa aagtagaaaa 1260
tatattctaa tttattgcac ggtaaggaag tagatcataa cgatctctat aatctcgcgc 1320
aacctatttt cccctcgaac actttttaag ccgtagataa acaggctggg acacttcacc 1380
tcgagatgtg gctgcagagc ctgctgctct tgggcactgt ggcctgcagc atctctgcac 1440
ccgcccgctc gcccagcccc agcacgcagc cctgggagca tgtgaatgcc atccaggagg 1500
cccggcgtct cctgaacctg agtagagaca ctgctgctga gatgaatgaa acagtagaag 1560
tcatctcaga aatgtttgac ctccaggagc cgacctgcct acagacccgc ctggagctgt 1620
acaagcaggg cctgcggggc agcctcacca agctcaaggg ccccttgacc atgatggcca 1680
gccactacaa gcagcactgc cctccaaccc cggaaacttc ctgtgcaacc cagattatca 1740
cctttgaaag tttcaaagag aacctgaagg actttctgct tgtcatcccc tttgactgct 1800
gggagccagt ccaggagtga 1820
<210> 4
<211> 3112
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> vTK-L-sPD1-Fc-pSel- p7.5- GMCSF- vTK-R的核苷酸序列
<400> 4
atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatctcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggc 240
gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctctt tttatctgcg cggttaaccg 300
cctttttatc catcaggtga tctgttttta ttgtggagtc tagaactagt aggcgtagtg 360
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 420
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 480
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 540
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta cgccttaaga tacattgatg 600
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 660
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 720
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa 780
acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atctagagtc gcggccgctc atttacccgg 840
agacagggag aggctcttct gcgtgtagtg gttgtgcaga gcctcgtgca tcacggagca 900
tgagaagacg ttcccctgct gccacctgct cttgtccacg gtgagcttgc tgtagaggaa 960
gaaggagccg tcggagtcca gcacgggagg cgtggtcttg tagttgttct ccggctgccc 1020
attgctctcc cactccacgg cgatgtcgct gggatagaag cctttgacca ggcaggtcag 1080
gctgacctgg ttcttggtca tctcctcccg ggatgggggc agggtgtaca cctgtggttc 1140
tcggggctgc cctttggctt tggagatggt tttctcgatg ggggctggga gggctttgtt 1200
ggagaccttg cacttgtact ccttgccatt cagccagtcc tggtgcagga cggtgaggac 1260
gctgaccaca cggtacgtgc tgttgtactg ctcctcccgc ggctttgtct tggcattatg 1320
cacctccacg ccgtccacgt accagttgaa cttgacctca gggtcttcgt ggctcacgtc 1380
caccaccacg catgtgacct caggggtccg ggagatcatg agggtgtcct tgggttttgg 1440
ggggaagagg aagactgacg gtccccccag gagttcaggt gctgggcacg gtgggcatgt 1500
gtgagttttg tcgtgggctg tgggcacttc tgcccttctc tctgtcaccc tgagctctgc 1560
ccgcaggctc tctttgatct gcgccttggg ggccagggag atggccccac agaggtaggt 1620
gccgctgtca ttgcgccggg ccctgaccac gctcatgtgg aagtcacgcc cgttgggcag 1680
ttgtgtgaca cggaagcggc agtcctggcc gggctggctg cggtcctcgg ggaaggcggc 1740
cagcttgtcc gtctggttgc tggggctcat gcggtaccag tttagcacga agctctccga 1800
tgtgttggag aagctgcagg tgaaggtggc gttgtcccct tcggtcacca cgagcagggc 1860
tggggagaag gtgggggggt tccagggcct gtctggggag tctaagaacc atcctggccg 1920
ccagcccagt tgtagcaccg cccagacgac tggccagggc gcctgtggga tctgcatggt 1980
ggcgaccggt ggatcccggg cccgcggtac cgtcgacttc gagcttattt atattccaaa 2040
aaaaaaaaat aaaatttcaa tttttaagct ttcactaatt ccaaacccac ccgcttttta 2100
tagtaagttt ttcacccata aataataaat acaataatta atttctcgta aaagtagaaa 2160
atatattcta atttattgca cggtaaggaa gtagatcata acgatctcta taatctcgcg 2220
caacctattt tcccctcgaa cactttttaa gccgtagata aacaggctgg gacacttcac 2280
ctcgagatgt ggctgcagag cctgctgctc ttgggcactg tggcctgcag catctctgca 2340
cccgcccgct cgcccagccc cagcacgcag ccctgggagc atgtgaatgc catccaggag 2400
gcccggcgtc tcctgaacct gagtagagac actgctgctg agatgaatga aacagtagaa 2460
gtcatctcag aaatgtttga cctccaggag ccgacctgcc tacagacccg cctggagctg 2520
tacaagcagg gcctgcgggg cagcctcacc aagctcaagg gccccttgac catgatggcc 2580
agccactaca agcagcactg ccctccaacc ccggaaactt cctgtgcaac ccagattatc 2640
acctttgaaa gtttcaaaga gaacctgaag gactttctgc ttgtcatccc ctttgactgc 2700
tgggagccag tccaggagtg actcgaggat atctcttttc aacgcctggc actgccgggc 2760
gttgttcttt ttaacttcag gcgggttaca atagtttcca gtaagtattc tggaggctgc 2820
atccatgaca caggcaaacc tgcggatccc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt 2880
gcgcgcagtt atagtagccg cactcgatgg gacatttcaa cgtaaaccgt ttaataatat 2940
tttgaatctt attccattat ctgaaatggt ggtaaaacta actgctgtgt gtatgaaatg 3000
ctttaaggag gcttcctttt ctaaacgatt gggtgaggaa accgagatag aaataatagg 3060
aggtaatgat atgtatcaat cggtgtgtag aaagtgttac atcgactcat aa 3112
<210> 5
<211> 3378
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> vTK-L-sCD80-Fc-pSel- p7.5- GMCSF- vTK-R的核苷酸序列
<400> 5
atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatctcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggc 240
gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctctt tttatctgcg cggttaaccg 300
cctttttatc catcaggtga tctgttttta ttgtggagtc tagaactagt aggcgtagtg 360
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 420
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 480
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 540
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta cgccttaaga tacattgatg 600
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 660
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 720
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa 780
acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atctagagtc gcggccgctc atttacccgg 840
agacagggag aggctcttct gcgtgtagtg gttgtgcaga gcctcatgca gcacggagca 900
tgagaagacg ttcccctgct gccacctgct cttgtccacg gtgagcttgc tgtagaggaa 960
gaaggagccg tcggagtcca gcacgggagg cgtggtcttg tagttgttct ccggctgccc 1020
attgctctcc cactccacgg cgatgtcgct gggatagaag cctttgacca ggcaggtcag 1080
gctgacctgg ttcttggtca tctcctcccg ggatgggggc agggtgtaca cctgtggttc 1140
tcggggctgc cctttggctt tggagatggt tttctcgatg ggggctggga gggctttgtt 1200
ggagaccttg cacttgtact ccttgccatt cagccagtcc tggtgcagga cggtgaggac 1260
gctgaccaca cggtacgtgc tgttgtactg ctcctcccgc ggctttgtct tggcattatg 1320
cacctccacg ccgtccacgt accagttgaa cttgacctca gggtcttcgt ggctcacgtc 1380
caccaccacg catgtgacct caggggtccg ggagatcatc agttggtcct tgggttttgg 1440
ggggaagagg aagactgacg gtccccccag gagttcaggt gctgggcacg gtgggcatgt 1500
gtgagttttg tctgcggccg cgttatcagg aaaatgctct tgcttggttg tattccagtt 1560
gaaggtctga ttcactctta aatgtccata cttgatgaga cacatgaagc tgtggttggt 1620
tgtcatattg aaatccagtt tgctgctaac agcatagagc tcagtttcag gatcttggga 1680
aactgttgtg ttgatggcat ttaattcttc tccattttcc aaccaggaga ggtgaggctc 1740
tggaaaacct ccagaggttg agcaaattat ccttctaata ttagaagttg gaatttcaaa 1800
gtcagatata ctaggtgtag ggaagtcagc tttgactgat aacgtcactt cagccaggtg 1860
ttcccgcttg aaagcgtctt tttcatactt cagaacaaca cactcgtatg tgccctcgtc 1920
agatgggcgc agagccagga tcacaatgga gaggttatta gtgatatcaa agatggtccg 1980
gttcttgtac tcgggccata tattcatgtc cccagacatc atagtcagca ccattttctt 2040
ctccttttgc cagtagatgc gagtttgtgc cagctcttca acagaaacat tgtgaccaca 2100
ggacagcgtt gccacttctt tcacttcctt ggtcacgtgg ataacacctg aacagaagtg 2160
agaaagacca gccagcacca agagctgaaa gaaattgagg tatggacact tggatggtga 2220
tgttccctgc ctccgtgtgt ggcccattct agaatctaga tgcattcgcg aggtaccgtc 2280
gacttcgagc ttatttatat tccaaaaaaa aaaaataaaa tttcaatttt taagctttca 2340
ctaattccaa acccacccgc tttttatagt aagtttttca cccataaata ataaatacaa 2400
taattaattt ctcgtaaaag tagaaaatat attctaattt attgcacggt aaggaagtag 2460
atcataacga tctctataat ctcgcgcaac ctattttccc ctcgaacact ttttaagccg 2520
tagataaaca ggctgggaca cttcacctcg agatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg 2580
gcactgtggc ctgcagcatc tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct 2640
gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg 2700
ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc caggagccga 2760
cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcaccaagc 2820
tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg 2880
aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact 2940
ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgactc gaggatatct 3000
cttttcaacg cctggcactg ccgggcgttg ttctttttaa cttcaggcgg gttacaatag 3060
tttccagtaa gtattctgga ggctgcatcc atgacacagg caaacctgcg gatcccagct 3120
tttgttccct ttagtgaggg ttaattgcgc gcagttatag tagccgcact cgatgggaca 3180
tttcaacgta aaccgtttaa taatattttg aatcttattc cattatctga aatggtggta 3240
aaactaactg ctgtgtgtat gaaatgcttt aaggaggctt ccttttctaa acgattgggt 3300
gaggaaaccg agatagaaat aataggaggt aatgatatgt atcaatcggt gtgtagaaag 3360
tgttacatcg actcataa 3378
<210> 6
<211> 3039
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> vTK-L-sPDL2-Fc-pSel- p7.5- GMCSF- vTK-R的核苷酸序列
<400> 6
atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatctcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggc 240
gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctctt tttatctgcg cggttaaccg 300
cctttttatc catcaggtga tctgttttta ttgtggagtc tagaactagt aggcgtagtg 360
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 420
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 480
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 540
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta cgccttaaga tacattgatg 600
agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 660
atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 720
gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa 780
acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atctagagtc gcggccgctc atttacccgg 840
agacagggag aggctcttct gcgtgtagtg gttgtgcaga gcctcatgca gcacggagca 900
tgagaagacg ttcccctgct gccacctgct cttgtccacg gtgagcttgc tgtagaggaa 960
gaaggagccg tcggagtcca gcacgggagg cgtggtcttg tagttgttct ccggctgccc 1020
attgctctcc cactccacgg cgatgtcgct gggatagaag cctttgacca ggcaggtcag 1080
gctgacctgg ttcttggtca tctcctcccg ggatgggggc agggtgtaca cctgtggttc 1140
tcggggctgc cctttggctt tggagatggt tttctcgatg ggggctggga gggctttgtt 1200
ggagaccttg cacttgtact ccttgccatt cagccagtcc tggtgcagga cggtgaggac 1260
gctgaccaca cggtacgtgc tgttgtactg ctcctcccgc ggctttgtct tggcattatg 1320
cacctccacg ccgtccacgt accagttgaa cttgacctca gggtcttcgt ggctcacgtc 1380
caccaccacg catgtgacct caggggtccg ggagatcatc agttggtcct tgggttttgg 1440
ggggaagagg aagactgacg gtccccccag gagttcaggt gctgggcacg gtgggcatgt 1500
gtgagttttg tctgcggccg cgtgagtgtt tattttcctg taggaagctt tgactttcag 1560
agtcaggtac ttgtagtccc aggcgacccc atagatgatt atgcattggt actgtccttc 1620
gtccctcact tggacttgag gtatgtggaa cgaggccttc cctaggggca gctgctcctc 1680
cagcaaagtg gctctttcac ggtgtgggga tgtatcattt tccacctttt gcaaactggc 1740
tgttattgct ccaaggttca catgacttcc agtgtcaaag ttgcattcca gggtcacatt 1800
gctgccatgc tctattatgt acagttcctt agggactgtc actgtgaata aagctgctat 1860
ctggtgaagc tgcaattcca ggctcaacat tagcaggagg aagatcattc tagaatctag 1920
atgcattcgc gaggtaccgt cgacttcgag cttatttata ttccaaaaaa aaaaaataaa 1980
atttcaattt ttaagctttc actaattcca aacccacccg ctttttatag taagtttttc 2040
acccataaat aataaataca ataattaatt tctcgtaaaa gtagaaaata tattctaatt 2100
tattgcacgg taaggaagta gatcataacg atctctataa tctcgcgcaa cctattttcc 2160
cctcgaacac tttttaagcc gtagataaac aggctgggac acttcacctc gagatgtggc 2220
tgcagagcct gctgctcttg ggcactgtgg cctgcagcat ctctgcaccc gcccgctcgc 2280
ccagccccag cacgcagccc tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc cggcgtctcc 2340
tgaacctgag tagagacact gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc atctcagaaa 2400
tgtttgacct ccaggagccg acctgcctac agacccgcct ggagctgtac aagcagggcc 2460
tgcggggcag cctcaccaag ctcaagggcc ccttgaccat gatggccagc cactacaagc 2520
agcactgccc tccaaccccg gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc tttgaaagtt 2580
tcaaagagaa cctgaaggac tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg gagccagtcc 2640
aggagtgact cgaggatatc tcttttcaac gcctggcact gccgggcgtt gttcttttta 2700
acttcaggcg ggttacaata gtttccagta agtattctgg aggctgcatc catgacacag 2760
gcaaacctgc ggatcccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcagttata 2820
gtagccgcac tcgatgggac atttcaacgt aaaccgttta ataatatttt gaatcttatt 2880
ccattatctg aaatggtggt aaaactaact gctgtgtgta tgaaatgctt taaggaggct 2940
tccttttcta aacgattggg tgaggaaacc gagatagaaa taataggagg taatgatatg 3000
tatcaatcgg tgtgtagaaa gtgttacatc gactcataa 3039

Claims (20)

1.一种溶瘤病毒构建体，其特征在于，包含：
第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型融合蛋白分子，所述分泌型融合蛋白分子用于特异性抑制免疫检查点分子；以及
第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-L1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD1融合蛋白或CD80融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型融合蛋白用于特异性抑制PD-1，所述分泌型融合蛋白分子为分泌型PD-L2融合蛋白。
4.根据权利要求2所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型PD1融合蛋白包括PD1信号肽段、PD1胞外区段和IgG Fc段。
5.根据权利要求2所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述CD80融合蛋白包括CD80信号肽段、CD80胞外区段和IgG Fc段。
6.根据权利要求3所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述分泌型PD-L2融合蛋白包括PD-L2信号肽段、PD-L2胞外区段和IgG Fc段。
7.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述免疫刺激分子包括选自人类GM-CSF、IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，IL-24，TNF，IFNα，IFNβ，IFNγ，MIP-I，MIP-Iβ，MCP-I，RANTES的至少之一。
8.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述构建体为牛痘病毒，所述牛痘病毒为WR株牛痘病毒，所述牛痘病毒中的胸苷激酶基因和生长因子基因失活。
9.根据权利要求8所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述第一核酸分子以及第二核酸分子设置于所述胸苷激酶基因的第240碱基之后，第308碱基之前。
10.根据权利要求1所述的溶瘤病毒构建体，其特征在于，所述构建体进
一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
11.根据权利要求10所述的溶瘤病毒构建体，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自pSel、p7.5的至少之一。
12.一种溶瘤病毒构建体，其特征在于，携带SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列。
13.一种溶瘤病毒构建体，其特征在于，携带SEQ ID NO：4～6示的核苷酸序列。
14.一种溶瘤病毒，其特征在于，携带权利要求1～13任一项所述的溶瘤病毒构建体。
15.根据权利要求14所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述病毒为细胞内成熟病毒、细胞内包装病毒、细胞相关包装病毒或细胞外包装病毒，优选地，所述病毒为细胞外包装病毒或细胞内成熟病毒，更优选地，所述病毒为细胞外包装病毒。
16.根据权利要求14所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述病毒为牛痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、纽卡斯尔病病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、Sinbis病毒或流感病毒，优选，所述病毒为牛痘病毒。
17.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求1～13任一项所述的溶瘤病毒构建体导入受体细胞，或通过将权利要求14～16任一项所述的溶瘤病毒转染受体细胞获得的。
18.根据权利要求17所述的重组细胞，其特征在于，所述受体细胞包括选自免疫细胞或肿瘤细胞的至少之一。
19.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求14～16任一项所述的溶瘤病毒以及药学上可接受的载体。
20.权利要求1～13任一项所述的溶瘤病毒构建体、权利要求14～16任一项所述的溶瘤病毒或权利要求17～18任一项所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、抑制哺乳动物恶性细胞增殖。
CN201710258891.4A 2017-04-19 2017-04-19 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用 Withdrawn CN108728488A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710258891.4A CN108728488A (zh) 2017-04-19 2017-04-19 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710258891.4A CN108728488A (zh) 2017-04-19 2017-04-19 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108728488A true CN108728488A (zh) 2018-11-02

Family

ID=63924256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710258891.4A Withdrawn CN108728488A (zh) 2017-04-19 2017-04-19 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108728488A (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957549A (zh) * 2018-12-03 2019-07-02 胜武（北京）生物科技有限公司 一种双功能溶瘤病毒及其应用
CN110694061A (zh) * 2019-11-21 2020-01-17 启辰生生物科技(珠海)有限公司 用于增强t淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用
CN110743006A (zh) * 2019-11-22 2020-02-04 北京启辰生生物科技有限公司 用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用
CN110804594A (zh) * 2019-11-21 2020-02-18 启辰生生物科技(珠海)有限公司 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化cd3+免疫细胞中的应用
WO2020173123A1 (zh) * 2019-02-26 2020-09-03 南京大学 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用
CN111826395A (zh) * 2019-04-18 2020-10-27 艾生命序公司 重组溶瘤病毒表达抗免疫检查点融合抗体及免疫刺激分子
CN112972506A (zh) * 2021-02-23 2021-06-18 浙江大学医学院附属第一医院 溶瘤病毒vg161或与吉西他滨以及白蛋白紫杉醇联合在制备治疗胰腺癌药物中的用途
CN113244411A (zh) * 2021-06-25 2021-08-13 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种基因修饰的溶瘤病毒诱导ctl细胞方法及其在肿瘤治疗的用途
CN113699123A (zh) * 2021-10-28 2021-11-26 旦旦生物科技(上海)有限公司 靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用
WO2021245111A1 (en) * 2020-06-03 2021-12-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Recombinant rhabdovirus encoding for a cd80 extracellular domain fc-fusion protein
US20220064672A1 (en) * 2020-08-27 2022-03-03 University Of Southern California Engineered oncolytic viruses expressing pd-l1 inhibitors and uses thereof

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109957549A (zh) * 2018-12-03 2019-07-02 胜武（北京）生物科技有限公司 一种双功能溶瘤病毒及其应用
WO2020173123A1 (zh) * 2019-02-26 2020-09-03 南京大学 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用
CN111826395A (zh) * 2019-04-18 2020-10-27 艾生命序公司 重组溶瘤病毒表达抗免疫检查点融合抗体及免疫刺激分子
CN110694061A (zh) * 2019-11-21 2020-01-17 启辰生生物科技(珠海)有限公司 用于增强t淋巴细胞免疫性的组合物、免疫细胞及应用
CN110804594A (zh) * 2019-11-21 2020-02-18 启辰生生物科技(珠海)有限公司 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化cd3+免疫细胞中的应用
CN110743006A (zh) * 2019-11-22 2020-02-04 北京启辰生生物科技有限公司 用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用
WO2021245111A1 (en) * 2020-06-03 2021-12-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Recombinant rhabdovirus encoding for a cd80 extracellular domain fc-fusion protein
US20220064672A1 (en) * 2020-08-27 2022-03-03 University Of Southern California Engineered oncolytic viruses expressing pd-l1 inhibitors and uses thereof
CN112972506A (zh) * 2021-02-23 2021-06-18 浙江大学医学院附属第一医院 溶瘤病毒vg161或与吉西他滨以及白蛋白紫杉醇联合在制备治疗胰腺癌药物中的用途
CN113244411A (zh) * 2021-06-25 2021-08-13 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种基因修饰的溶瘤病毒诱导ctl细胞方法及其在肿瘤治疗的用途
CN113244411B (zh) * 2021-06-25 2021-09-17 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 一种基因修饰的溶瘤病毒诱导ctl细胞方法及其在肿瘤治疗的用途
CN113699123A (zh) * 2021-10-28 2021-11-26 旦旦生物科技(上海)有限公司 靶向超敏广谱溶瘤病毒制备及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108728488A (zh) 溶瘤病毒构建体、溶瘤病毒及其应用
JP2020524174A (ja) Ｉｌ−２スーパーアゴニスト、アゴニスト、およびそれらの融合体の使用および方法
CN109862912A (zh) 携带双特异性T细胞衔接器（BiTE）的腺病毒
CN109312309A (zh) 工程化的病毒
CN109562126A (zh) 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
CN108018299A (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN108697745A (zh) 编码抗tcr复合体抗体或片段的b组腺病毒
CN107427565A (zh) 使用重组李斯特菌菌株的组合疗法
CN108070607A (zh) 靶向CD19-41BB-tEGFR的嵌合抗原受体及其用途
CN108004259A (zh) 靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途
CN109306016A (zh) 共表达细胞因子il-7的nkg2d-car-t细胞及其用途
JP2023071953A (ja) 単離された組換え体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとｎｋ細胞を含む治療薬、その使用およびそれを適用したキット
CN109777784A (zh) 一种增强向肿瘤部位迁移的嵌合抗原受体载体构建方法与应用
CN109320615A (zh) 靶向新型bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN108330133A (zh) 靶向cd19嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法及其用途
JP7420751B2 (ja) Ｉ型インターフェロン及びｃｄ４０－配位子を用いる腫瘍溶解性ウイルス又は抗原提示細胞媒介性癌治療
CN105950630A (zh) 同时表达十二聚体trail及hsv-tk自杀基因的载体及利用其的抗癌干细胞治疗剂
CN109836496A (zh) 一种靶向cd317的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN105218682B (zh) 经il-12/cd62l融合蛋白改造的肿瘤治疗剂及其制法和用途
CN104887717A (zh) 一种免疫增强试剂
CN110526970A (zh) 靶向cd133的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2014129412A1 (ja) 免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌
CN108285489A (zh) 靶向BCMA-BBz-tEGFR的嵌合抗原受体及其用途
CN110526987A (zh) 靶向cd133的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109957546A (zh) 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20181102

WW01 Invention patent application withdrawn after publication