CN110743006A

CN110743006A - 用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用

Info

Publication number: CN110743006A
Application number: CN201911156870.7A
Authority: CN
Inventors: 孙圣楠; 吴斐然; 文高柳
Original assignee: Beijing Kai Sheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kai Sheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-11-22
Also published as: CN110743006B

Abstract

本发明公开用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用。本发明的组合物包含(1)IL‑15/IL‑15Rα复合物、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(2)TGF‑β调节肽、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和(3)CD80复合物、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸。本发明的组合物的各成分之间能够协同作用解除免疫细胞衰竭。

Description

用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用。

背景技术

肿瘤具有免疫逃逸的特点，虽然一些肿瘤细胞在生长过程中存在细胞凋亡被外周抗原递呈细胞所获取，但同时会伴随免疫抑制因子的释放。肿瘤疫苗具有低毒性、持久和特异性强的特点成为国内外研究的热点。其中，DNA疫苗以独特的肿瘤抗原提供方式以及树突状细胞(DC)在抗原递呈中的重要作用，成为肿瘤疫苗重要的工具。

例如，2017年4月14日，一项针对11例胶质母细胞瘤患者的Ⅰ期临床研究发现，患者接受在研DC疫苗和替莫唑胺的联合治疗后，其生存期超过了五年，而这种结果相当罕见的，相关试验结果发表在《Clinical Cancer Research》期刊上。

再例如，Daniela Verthelyi等人通过研究发现，在DNA质粒中加入CpG片段或寡聚核苷酸与疫苗同时应用，能增加IL-1β、IL-10、IL-18表达，增加肿瘤成熟DC和NK细胞浸润，诱导特异性T细胞反应，增强免疫应答[Verthelyi D.Adjuvant Properties of CpGOligonucleotides in Primates[J].Methods in molecular medicine,2006,127:139-158.]。

目前有大量的使用负载了抗原的DC疫苗治疗肿瘤的报道，从报道的数据来看，DC疫苗似乎代表了一种用于改善的肿瘤免疫治疗的新的非常有潜力的方法。然而，单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。目前的临床实验表明，DC治疗性疫苗的应答率很少超过15％，总体应答率偏低。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种组合物，其与DC疫苗联合使用，能够增强DC疫苗致敏T细胞的能力，提高DC疫苗治疗肿瘤的效果。经过大量筛选实验，本发明发现IIL-15/IL-15Rα复合物、TGF-β调节肽和sCD80之间能够发挥协同作用，大大增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力，诱导产生更多的有抗肿瘤活性的CD4 T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，该组合物包含(1)IL-15/IL-15Rα复合物、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(2)TGF-β调节肽、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和(3)sCD80、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸。

在某些具体实施方案中，所述TGF-β调节肽具有SEQ ID No.3所示的基因编码的氨基酸序列。sCD80具有SEQ ID No.4所示的基因编码的氨基酸序列。

在某些具体实施方案中，所述IL-15/IL-15Rα复合物的编码核酸为编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸，其中，编码IL-15的核酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列，编码IL-15Rα的核酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列。

在某些具体实施方案中，所述IL-15和IL-15Rα复合物的编码核酸为同时编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。

在某些具体实施方案中，所述TGF-β调节肽的编码核酸序列包括SEQ ID No.3所示的序列。

在某些具体实施方案中，所述TGF-β调节肽为RGFBR3在金属蛋白酶作用下进行裂解后产生的可溶性功能片段sTGFBR3。

在某些具体实施方案中，sCD80的编码核酸序列包括SEQ ID No.4所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞包含抗原或能够产生所述抗原的前体，和第一方面所述的组合物。

本发明的第三方面，提供一种用于协同解除免疫细胞衰竭的方法，其包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

在某些具体实施方案中，所述用于协同解除免疫细胞衰竭的方法包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体，所述构建体包括编码相应抗原的核酸、编码sCD80的抗原、编码TGF-β调节肽的核酸和编码IL-15/IL-15Rα复合物的核酸；

(2)进行体外转录以获得用于协同解除免疫细胞衰竭组合物的核糖核酸分子；

(3)进行体外诱导培养以获得用于表达步骤(2)核糖核酸分子的抗原递呈细胞和

(4)通过转染使步骤(2)的核糖核酸分子导入步骤(3)的抗原递呈细胞并进行表达的步骤。

本发明通过利用IL15/IL15Rα调节T细胞活化和增殖的能力，协同TGF-β调节肽和sCD80多通路协同作用促使DC细胞诱导产生的特异的细胞毒性T细胞持续扩增，产生更多的有抗肿瘤活性的淋巴细胞，提高治疗肿瘤，例如DC疫苗在治疗肿瘤的效果。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图1的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+,TNF-α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+,TNF-α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[组合物]

本发明的第一方面，提供一种用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，本文有时也简称为“本发明的组合物”。本发明的组合物包含(1)IL-15/IL-15Rα复合物、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(2)TGF-β调节肽、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和(3)CD80复合物、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸。

本发明中，白介素-15(interleukin-15,IL-15)是指天然存在或野生型白细胞介素-15，包括不同的剪接变体和天然生成的变体。IL-15可以是任何物种的IL-15。例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。

本发明的IL-15是一种与IL-2结构类似的细胞因子，具有共同的受体亚基和信号转导通路，两种细胞因子均可刺激T细胞增殖、诱导细胞毒性T细胞(CTL)产生，促进B细胞增殖和免疫球蛋白合成，诱导NK细胞产生。其广泛表达在各种细胞和组织中，如单核细胞、巨噬细胞、DC细胞和纤维细胞等。

已知体内IL-15的受体有三个亚基α、β和γ，IL-15与三个亚基组成的受体结合激活下游信号通路。本发明发现在没有β和γ亚基的情况下，IL-15与IL-15α的复合物能够激活下游的JAK1和JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、LCK和SYK的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。本发明的IL-15/IL-15α复合物能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，能够维持在缺乏抗原刺激下记忆性T细胞的存活。

本发明中，优选地，IL-15/IL-15Rα复合物的编码核酸为编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。还优选地，IL-15和IL-15Rα复合物的编码核酸为同时编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。本发明中，IL-15和IL-15Rα的编码序列不特别限定，IL-15的编码序列实例包括SEQID No.1所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。IL-15Rα的编码序列实例包括SEQ ID No.2所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15的编码序列为SEQ ID No.1所示的序列，编码IL-15Rα的核酸序列为SEQ ID No.2所示的序列。

本发明中，核酸可以是同时编码多种蛋白的核酸，也可以是分别编码不同蛋白的核酸的组合，且每种核酸仅编码一种蛋白。优选地，本发明的核酸为同时编码两种以上蛋白的核酸，得到的表达产物有利于高效、简单地形成复合物。本文中，“同时编码”是指同一个核酸分子可以编码两种以上的蛋白。此时两种以上的蛋白可以融合形式存在，但更优选地，同一核酸分子编码产生两种以上单独存在的蛋白。在同一核酸分子同时产生两种以上的蛋白的情况下，可通过使相临的两个基因之间连接例如核糖体进入位点(IRES)来实现。可选地，还可以通过使相临的两个基因之间连接编码自剪切多肽序列的核酸序列来实现。作为示例性实例，本发明的核酸可为同时编码IL-15和IL-15Rα的核酸。此类核酸的实例包括但不限于SEQ ID No.5所示的核酸。

本发明中，TGF-β调节肽源自TGF-β信号传递途径的共同受体。优选地，本发明的TGF-β调节肽为TGFBR3在金属蛋白酶作用下进行裂解后产生的可溶性功能片段。此片的“功能”是指具有参与介导SMAD依赖的和SMAD非依赖的下游信号途径的功能。优选地，TGF-β调节肽包含TGFBR3胞外结构域。进一步优选还包含其他片段。例如，Fc多肽、其突变体或其功能片段。本发明的Fc片段有利于延长蛋白的半衰期和提高稳定性。优选使用较长的Fc片段以增大分子体积。但是如果分子体积过大，则可能影响TGF-β调节肽的活性。因此，Fc片段的长度或大小影响本发明目的实现。对于本发明而言，Fc片段的长度一般为115-320AA，优选120-310AA。

本发明中，TGF-β调节肽的编码核酸不特别限定，此类核酸可以是例如包括SEQ IDNo.3所示序列的核酸，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。更优选地，编码核酸的序列为SEQ ID No.3所示序列。

已知CD80属免疫球蛋白超家族(immunogloblin superfamily，IgSF)，其以寡聚体形式存在于多数抗原呈递细胞，如树突状细胞、活化的T细胞、B细胞以及巨噬细胞等。CD80结合于细胞表面，是APC上的重要协同刺激分子，与T细胞的CD28结合后，对于抗原诱导初始T细胞活化、增殖及效应功能的产生具有重要的始动调节作用，是一个正性因子。本发明发现与CD80相比，可溶性的sCD80更能与本发明的其他成分组合发挥协同作用。其原因可能在于sCD80为小分子多肽，以可溶形式存在于胞外，具有更高的自由度，从而能更强地与T细胞表面的受体CD28结合，引起下游正向信号的转导。另外，有研究表明，CD80通过与T细胞表面的CTLA-4结合，抑制T细胞的活化。而本发明的sCD80可能不与CTLA-4结合或者结合后不能引起负性信号的转导。即相对于与细胞膜结合的CD80，sCD80只转导正向信号而不再转导负向信号，从而能够保证其与其他成分的协同作用，提供T细胞活化的共刺激信号，诱导T细胞的增殖和细胞因子的分泌。

优选地，本发明的sCD80的编码核酸包括SEQ ID No.4所示的序列，或其与同源性为95％以上，优选98％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。更优选地，其编码核酸序列由SEQ ID No.4所示的序列组成。

本发明的sCD80一般包含CD80的胞外结构域，可选地，还包括其他片段。其他片段的实例包括Fc多肽、其突变体或其功能片段。本发明的Fc片段有利于延长可溶性蛋白的半衰期和提高稳定性。优选使用较长的Fc片段以增大分子体积。但是如果分子体积过大，则可能影响可溶性CD80的活性。因此，Fc片段的长度或大小影响本发明目的实现。对于本发明而言，Fc片段的长度一般为115-320AA，优选120-310AA。优选地，本发明中的蛋白中，Fc片段为由包含SEQ ID No.6所示的核酸编码。

[抗原递呈细胞]

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，其为人为改造的细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，从外周血单核细胞(PBMC)中分离单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在具体实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子其实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或能够产生抗原的核酸，和第一方面所述的组合物。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由APC捕获并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原为肝细胞癌的抗原GPC3。

[用于协同解除免疫细胞衰竭的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其包括使根据第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体；

本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定，例如，所述步骤的顺序可以是(1)、(2)、(3)、(4)。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行，例如步骤(3)和(4)可同时进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在上述步骤(1)-(4)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。

制备例1

本制备例为制备编码抗原以及本组合物的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码本发明所述TGF-β调节肽、CD-80以及IL15/IL15RαmRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码序列，本发明GPC3的编码序列由SEQ ID NO.7所示的序列组成，氨基酸序列由SEQ ID NO.8所示的序列组成。GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用CN107583042A中公开的抗原。

表-1 DNA序列表

名称	序列号
		IL-15	SEQ ID No.1
IL-15Rα	SEQ ID No.2
		TGF-β调节肽	SEQ ID No.3
sCD80	SEQ ID No.4
		GPC3	SEQ ID No.7

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例1

本实施例用于研究本发明组合物对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.用组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的蛋白IL15/IL15Rα、CD-80和TGF-β调节肽的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

4)编码GPC3抗原的mRNA与sCD80的mRNA(CD-80组)

5)编码GPC3抗原的mRNA与TGF-β调节肽的mRNA(TGF-β调节肽组)

6)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα、TGF-β调节肽和sCD80的mRNA(实验组)

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述六个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM Monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，CD4T和CD8 T细胞免疫应答结果如图1和图2所示，使用GPC3抗原负载DC细胞，在体外致敏实验中，能够激起一定程度的CD4和CD8 T细胞应答，如INF-γ阳性CD8 T细胞占CD8 T细胞比例为0.66％，TNF-α和IFN-γ双阳性CD8 T细胞比例为0.14％，比不转染抗原的mDC细胞引起的细胞应答强。

在使用了编码本发明所述的分子的mRNA后，与只使用GPC3抗原负载DC细胞比，CD4以及CD8 T细胞应答有显著提高。使用了本发明所述的IL15/IL15Rα+TGF-β调节肽+CD80组合物的实验组中，CD4 T细胞亚群中IFN-γ阳性细胞比例为2.1％，TNF-α阳性细胞比例为2.03％，IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例为0.75％，分别提高0.37倍、1.09倍以及2.75倍。在CD8T细胞亚群中，IFN-γ阳性细胞比例为5.7％，比GPC3组提高了7.64倍，TNF-α阳性细胞比例为3.95％，比GPC3组提高了10.97倍，IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例为2.52％，是GPC3组的18倍。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 北京启辰生生物科技有限公司

<120> 用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物及应用

<141> 2019-11-22

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

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<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

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<210> 3

<211> 2637

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

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acaggcgtgt ccagactgtt cctggtgtcc gaaggcagcg tggtgcagtt tagcagcgct 420

aacttcagcc tgaccgccga aaccgaggag agaaacttcc cccacggcaa cgagcacctg 480

ctgaattggg ccaggaagga gtacggagcc gtgaccagct tcaccgagct gaagatcgcc 540

cggaacatct acatcaaggt cggcgaggac caggtgttcc cacccaagtg caacatcggc 600

aagaacttcc tgagcctgaa ctacctggcc gagtatctgc agcctaaagc cgcagagggc 660

tgcgtgatgt ctagccagcc ccagaacgag gaggtgcaca tcatcgagct gatcaccccc 720

aacagcaacc cctacagcgc cttccaggtg gacatcacca tcgacatccg gcctagccag 780

gaggatctgg aggtcgtgaa gaacctgatc ctgatcctca agtgcaagaa gagcgtgaat 840

tgggtcatca agagcttcga cgtgaagggc agcctgaaga tcatcgcccc caacagcatc 900

ggctttggca aagagagcga gcggagcatg accatgacca agagcatccg ggacgacatc 960

ccctctacac agggcaacct cgtcaagtgg gcactggata acggctacag ccctatcacc 1020

agctacacca tggccccagt ggccaacaga ttccacctgc ggctggagaa caacgccgaa 1080

gagatgggcg acgaggaagt gcacaccatc cctcccgagc tgagaatcct gctggacccc 1140

ggcgccctgc cagctctgca gaatcctcct attagaggcg gcgagggaca gaacggagga 1200

ctgcctttcc ctttccccga catcagcagg agagtgtgga acgaggaggg cgaagacgga 1260

ctgcctagac ctaaggaccc cgtgatccct agcatccagc tgttcccagg cctgagagag 1320

ccagaggaag tgcagggaag cgtggacatc gctctgagcg tcaagtgcga caacgagaag 1380

atgatcgtgg ccgtggagaa ggacagcttc caggctagcg gatacagcgg aatggacgtg 1440

accctgctgg accctacttg caaggccaag atgaacggca cccacttcgt gctggagtcc 1500

cccctgaacg gttgcggcac aagacctagg tggagcgctc tggacggagt ggtgtactac 1560

aactccatcg tgatccaggt gcccgctctg ggagattcta gcggttggcc agacggctac 1620

gaggatctgg agagcggaga caacggcttc ccaggcgata tggacgaggg agacgcttct 1680

ctgttcacca ggcccgagat cgtggtgttc aattgcagcc tgcagcaggt ccgcaaccct 1740

tctagcttcc aggagcagcc tcacggcaac atcaccttca acatggagct gtacaacacc 1800

gacctgttcc tggtgccatc acagggagtg ttcagcgtgc ccgagaacgg acacgtgtac 1860

gtggaggtgt ccgtgaccaa ggcagaacag gagctgggct tcgccatcca gacttgcttc 1920

atcagcccct acagcaacga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1980

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2040

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2100

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2160

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2220

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2280

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2340

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2400

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2460

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2520

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2580

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 2637

<210> 4

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60

cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120

gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180

caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240

atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300

attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360

tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420

gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480

atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540

gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600

agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660

ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720

gataacgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 780

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 1425

<210> 5

<211> 1126

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttgag cccgccccac gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca cgaccccatc 540

atccaattcc gccccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 600

gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 660

ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 720

gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 780

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 840

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 900

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 960

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 1020

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 1080

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaac 1126

<210> 6

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210> 7

<211> 1985

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

gagaccggcc ucgagcagcu gaagcuuccu gcaggucgac ucuagagcca ccaugagggc 60

ccugugggug cugggccucu gcugcguccu gcugaccuuc gggucgguca gagcugacga 120

ugaaguugau gugcagccuc cuccuccucc uccagacgcu acaugucacc agguccgcuc 180

cuucuuccag aggcugcagc caggacucaa gugggugcca gagacaccag ugccaggaag 240

cgaucugcag gucugucugc cuaagggccc uaccuguugc ucccggaaga uggaggagaa 300

guaccagcug accgccaggc ugaacaugga acagcugcug cagagcgcca gcauggagcu 360

gaaguuccug aucauccaga acgccgccgu guuccaggag gccuucgaga ucgucgugcg 420

gcacgccaag aacuacacca acgccauguu caagaacaac uaccccagcc ugacaccuca 480

ggccuuugag uucguggggg aguucuucac cgacgugucu cuguacaucc ugggcagcga 540

caucaacgug gacgacaugg ugaacgagcu guucgacagc cuguuccccg ugaucuacac 600

ccagcugaug aacccaggcc ugccagauag cgcucuggau aucaacgagu gccugagggg 660

agccagaaga gaccugaagg uguucggcaa cuuccccaag cugaucauga cccagguguc 720

caagagccug caggucacca ggaucuuccu gcaggcccug aaccugggca ucgaggucau 780

caacaccacc gaccaccuga aguucagcaa ggauugcggc cggaugcuca cccgcaugug 840

guauuguagc uauugccagg gccugaugau ggugaagccu ugcggcggcu auugcaacgu 900

cgugaugcag gguuguaugg ccggcguggu ggagaucgac aaguauuggc gggaguacau 960

ccugagccug gaggagcugg ugaacggcau guaccggauc uacgacaugg agaacgugcu 1020

gcugggccug uucuccacca uccacgacag cauccaguac gugcagaaga acgccggcaa 1080

gcugacaacc accaucggaa agcucugcgc ccacucucag cagaggcagu acagaagcgc 1140

cuacuacccc gaggaccugu ucaucgacaa gaaggugcug aagguggccc acguggaaca 1200

cgaagagaca cugagcagcc ggaggagaga gcugauccag aagcugaagu ccuucaucuc 1260

cuucuacagc gcccugccag gcuacauuug cagccacagc ccaguggccg agaacgacac 1320

ccucuguugg aacggccagg agcuggugga gagauacucu cagaaggccg ccaggaacgg 1380

caugaagaac caguucaacc ugcacgagcu gaagaugaag ggcccagagc cagugguguc 1440

ccagaucauc gacaagcuga agcacaucaa ccagcugcug cggaccauga gcaugccuaa 1500

gggcagggug cuggacaaga accuggacga ggagggcuuc gagucaggag auugcggcga 1560

cgacgaagac gaguguauug gcggaagcgg cgacggcaug aucaagguca agaaccagcu 1620

gcgguuccug gccgaacugg ccuacgaucu ggacguggac gacgcuccag gcaauucuca 1680

gcaggccaca ccuaaggaca acgagaucag caccuuccac aaccugggca acgugcacuc 1740

uccucugaag cugcugacca gcauggccau uagcgucguc ugcuucuucu uccuggugca 1800

ucugaucccc aucgcugugg guggugcccu ggcggggcug guccucaucg uccucaucgc 1860

cuaccucguc ggcaggaaga ggagucacgc aggcuaccag acuaucuagg aauucuuaau 1920

uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaa 1985

<210> 8

<211> 618

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Gln Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp

50 55 60

Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met

65 70 75 80

Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr

115 120 125

Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser

165 170 175

Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp

180 185 190

Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu

195 200 205

Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys

210 215 220

Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile

225 230 235 240

Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly

245 250 255

Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met

260 265 270

Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys

275 280 285

Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu

290 295 300

Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu

305 310 315 320

Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr

325 330 335

Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys

340 345 350

Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp

355 360 365

Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu

370 375 380

Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser

385 390 395 400

Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser

405 410 415

Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val

420 425 430

Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe

435 440 445

Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln

450 455 460

Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser

465 470 475 480

Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe

485 490 495

Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu

515 520 525

Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln

530 535 540

Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn

545 550 555 560

Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val

565 570 575

Cys Phe Phe Phe Leu Val His Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala

580 585 590

Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg

595 600 605

Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

610 615

Claims

1.一种用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，包含(1)IL-15/IL-15Rα复合物、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(2)TGF-β调节肽、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和(3)sCD80、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸。

2.根据权利要求1所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，所述IL-15/IL-15Rα复合物的编码核酸为编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸，其中，编码IL-15的核酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列，编码IL-15Rα的核酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列。

3.根据权利要求1所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，所述IL-15和IL-15Rα复合物的编码核酸为同时编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。

4.根据权利要求1所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，所述TGF-β调节肽具有SEQ ID No.3所示的基因编码的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，所述TGF-β调节肽包含TGFBR3在金属蛋白酶作用下进行裂解后产生的可溶性功能片段。

6.根据权利要求1所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，所述sCD80包含CD80的胞外结构域。

7.根据权利要求1所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的组合物，其特征在于，所述sCD80具有SEQ ID No.4所示的基因编码的氨基酸序列。

8.一种抗原递呈细胞，其特征在于，所述抗原递呈细胞包含抗原或能够产生所述抗原的前体，和根据权利要求1-7任一项所述的组合物。

9.一种用于协同解除免疫细胞衰竭的方法，其特征在于，包括使根据权利要求8所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

10.根据权利要求9所述的用于协同解除免疫细胞衰竭的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体；

(3)进行体外诱导培养以获得用于表达步骤(2)核糖核酸分子的抗原递呈细胞；和