CN110841058B

CN110841058B - 用于协同改善免疫应答的组合物及应用

Info

Publication number: CN110841058B
Application number: CN201911145737.1A
Authority: CN
Inventors: 孙圣楠; 吴斐然; 文高柳
Original assignee: Beijing Tricision Biotherapeutics Inc
Current assignee: Beijing Tricision Biotherapeutics Inc
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110841058A

Abstract

本发明公开用于协同改善免疫应答的组合物及应用。本发明的组合物包含IL‑15/IL‑15Rα复合物或者能够形成IL‑15/IL‑15Rα复合物的前体、TGF‑β调节肽或者能够形成TGF‑β调节肽的前体和程序性死亡受体1或者能够形成程序性死亡受体1的前体。本发明的组合物各成分之间能够协同作用改善免疫应答。

Description

用于协同改善免疫应答的组合物及应用

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及用于协同改善免疫应答的组合物及应用。

背景技术

在机体免疫应答过程中，树突状细胞(DC)是连接先天性免疫和获得性免疫的桥梁，是机体识别和摄取病原体和肿瘤抗原的关键细胞。随着对肿瘤免疫学的研究，尤其是对负载肿瘤肿瘤抗原的DC疫苗的深入研究发现，经肿瘤抗原致敏DC输回机体可以激发更强的免疫应答。

例如，CN 105030825 A公开了mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其增强性制备方法和CTL细胞，包括如下步骤：获取肺癌干细胞的mRNA、以及IL-2和IFN-γ，将mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中后，进行体外培养。该发明的方法基于DC能够接受外源mRNA并进行翻译，以及密码子具有通用性的技术基础，以肺癌干细胞的mRNA导入后表达成抗原蛋白替换灭活蛋白刺激的方式对DC进行刺激，同时将IL-2和IFN-γ转染至DC中在免疫应答过程中即开始成熟诱导，提升细胞成熟的效率。

再例如，Sergiusz Markowicz等人通过对Ⅲ期恶性黑素瘤患者进行的DC疫苗临床研究发现，22例在接受5-16-次负载有MHCⅠ类限制性黑色素瘤抗原肽DC疫苗的患者中，15例皮肤出现迟发型超敏反应和/或产生分泌IFN-γ的CD8+淋巴细胞，治疗组的三年总生存率(OS)为68.2％，对照组仅为25.7％[Markowicz S,Nowecki ZI,Rutkowski P,etal.Adjuvant vaccination with melanoma antigen-pulsed dendritic cells in stageIII melanoma patients[J].Med Oncol,2012,29(4):2966-2977]。

目前有大量的使用负载了抗原的DC疫苗治疗肿瘤的报道，从报道的数据来看，DC疫苗似乎代表了一种用于改善的肿瘤免疫治疗的新的非常有潜力的方法。然而，单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。目前的临床实验表明，DC治疗性疫苗的应答率很少超过15％，总体应答率偏低。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种组合物，本发明使用提供的组合物能够改善DC疫苗致敏T细胞的能力，提高DC疫苗治疗肿瘤的效。本发明的组合物中各成分之间协同作用大大增强抗原递呈细胞致敏T细胞能力，诱导产生更多的有抗肿瘤活性的CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于协同改善免疫应答的组合物，该组合物包含IL-15/IL-15Rα复合物或者能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体、TGF-β调节肽或者能够形成TGF-β调节肽的前体和可溶性程序性死亡受体1或者能够形成该可溶性程序性死亡受体1的前体。

在某些具体实施方案中，所述能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体为编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸，其中，编码IL-15的核酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列，编码IL-15Rα的核酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列。

在某些具体实施方案中，所述能够形成IL-15和IL-15Rα复合物的前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。此类核酸的实例包括SEQ ID No.5所示的序列。

在某些具体实施方案中，所述能够形成TGF-β调节肽的前体为编码TGF-β调节肽的核酸，所述核酸序列包括SEQ ID No.3所示的序列。

在某些具体实施方案中，所述TGF-β调节肽优选为TGFBR3在金属蛋白酶作用下进行裂解后产生的可溶性功能片段。优选地，TGF-β调节肽包含TGFBR3的胞外结构域。

在某些具体实施方案中，所述能够形成可溶性程序性死亡受体1的前体为编码程序性死亡受体1胞外结构域的核酸，所述核酸序列包括SEQ ID No.4所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，所述抗原递呈细胞包含抗原或能够产生所述抗原的核酸，和第一方面所述的组合物。

在某些具体实施方案中，抗原递呈细胞中包含的抗原为GPC3抗原。

本发明的第三方面，提供一种用于协同改善免疫应答的方法，包括使第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

在某些具体实施方案中，用于协同改善免疫应答的方法包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体，其中核酸构建体包括编码IL-15/IL-15Rα复合物的核酸、编码TGF-β调节肽的核酸和编码可溶性程序性死亡受体1的核酸，以及编码相应抗原的核酸；

(2)进行体外转录以获得用于改善免疫应答组合物的核糖核酸分子；

(3)进行体外诱导培养以获得用于表达步骤(2)核糖核酸分子的抗原递呈细胞；

(4)通过转染使步骤(2)的核糖核酸分子导入步骤(3)的抗原递呈细胞并进行表达；和

(5)使步骤(4)转染后的抗原递呈细胞与T细胞共培养的步骤。

本发明通过利用IL15/IL15Rα调节T细胞活化和增殖的能力，协同TGF-β调节肽和可溶性程序性死亡受体1促使DC细胞诱导产生的特异的细胞毒性T细胞持续扩增，产生更多的有抗肿瘤活性的淋巴细胞，提高治疗肿瘤，例如DC疫苗在治疗肿瘤的效果。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图1的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+,TNF-α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+,TNF-α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明的“复合物”指的是白细胞介素与其他蛋白(例如受体)之间通过非共价键或共价键结合形成的聚集体。此处，非共价键结合的作用力的实例包括范德华力、疏水作用、氢键结合力和电荷吸引力等。非共价健结合的实例包括但不限于配体受体之间的结合。这种情况形成的复合物一般是可以再次分开，从而形成单独的白介素与单独的其他蛋白。共价健结合的实例包括二硫键或肽键。在通过肽键使两个蛋白或两个不同多肽片段结合的情况下，可以理解为复合物为一种融合蛋白。融合蛋白的两个蛋白或不同多肽片段之间通常通过柔性连接子连接，从而有利于两个蛋白或不同多肽片段之间的结合形成复合物。

本发明的“前体”是指能够形成复合物的任何物质。前体的实例包括能够形成复合物的以单独、分离形式存在的各组成成分。例如，单独、分离形式存在的白介素或与其结合的另外的蛋白，例如受体。本发明的前体还包括能够形成白介素或与其结合的另外的蛋白的物质，例如，能够编码产生白介素的核酸(为方便说明在本文中其可称作第一核酸)，和能够编码产生与白介素结合的另外的蛋白的核酸(为方便说明其可称作第二核酸)。此处，第一核酸和第二核酸分别包括DNA和mRNA。在某些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过连接形成一个核酸分子，从而使第一核酸和第二核酸分别成为该核酸分子的一部分。在某些实施方案中，连接形成的核酸分子可以同时产生两种不同的蛋白或两种不同的多肽片段。在某些实施方案中，连接形成的核酸分子可以产生融合蛋白。在某些实施方案中，第一核酸与第二核酸分别为单独的分子。

[组合物]

本发明的第一方面，提供一种用于协同改善免疫应答的组合物，本文有时也简称为“本发明的组合物”。本发明的组合物包含IL-15/IL-15Rα复合物或者能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体、TGF-β调节肽或者能够形成TGF-β调节肽的前体和可溶性程序性死亡受体1或者能够形成该可溶性程序性死亡受体1的前体。

本发明中，白介素-15(interleukin-15,IL-15)是指天然存在或野生型白细胞介素-15，包括不同的剪接变体和天然生成的变体。IL-15可以是任何物种的IL-15。例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。本发明中，IL-15受体α(IL-15Rα)是IL-15受体的α、β和γ三条链中的α链，是形成高特异性、高亲和力IL-15Rαβγ的必要亚单位。

已知在天然条件下IL-15与由IL-15Rαβγ形成的受体结合，从而转导下游信号，刺激T细胞增殖、诱导细胞毒性T细胞(CTL)产生，促进B细胞增殖和免疫球蛋白合成，诱导NK细胞产生。本发明发现在不存在βγ两亚基的情况下，IL-15/IL-15Rα复合物同样具有类似功能，并且在与其他成分组合的情况下能大大改善免疫应答，特别是能够解除免疫抑制作用。其原因可能在于IL-15通过与高亲和力的IL-15受体α结合，激活下游的JAK1、JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、LCK和SYK的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。

优选地，本发明中能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体为编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。

优选地，本发明中能够形成IL-15和IL-15Rα复合物的前体为同时编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。本发明中，IL-15和IL-15Rα的编码序列不特别限定，IL-15的编码序列其实例包括SEQ ID No.1所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。IL-15Rα的编码序列其实例包括SEQ ID No.2所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本文中，“同时编码”是指同一个核酸分子可以编码两种以上的蛋白。此时两种以上的蛋白可以融合形式存在，但更优选地，同一核酸分子编码产生两种以上单独存在的蛋白。在同一核酸分子同时产生两种以上的蛋白的情况下，可通过使相临的两个基因之间连接例如核糖体进入位点(IRES)来实现。可选地，还可以通过使相临的两个基因之间连接编码自剪切多肽序列的核酸序列来实现。

本发明中，TGF-β调节肽源自TGF-β信号传递途径的共同受体。优选地，本发明的TGF-β调节肽为TGFBR3在金属蛋白酶作用下进行裂解后产生的可溶性功能片段。优选地，TGF-β调节肽包含TGFBR3的胞外结构域，本发明的TGF-β调节肽虽然为截短的多肽片段，但是其能够参与介导SMAD依赖的和SMAD非依赖的下游信号途径，能够抑制细胞的迁移和侵袭，表明具有抑制肿瘤进展和转移的功能。

在某些实施方案中，本发明的TGF-β调节肽中除了TGFBR3的胞外结构域外还包含其他氨基酸序列，从而增强调节肽的功能。此类其他氨基酸序列的实例包括Fc片段。

优选地，本发明能够形成TGF-β调节肽的前体为编码TGF-β调节肽的核酸。本发明中，TGF-β调节肽的编码核酸序列不特别限定，包含SEQ ID No.3所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本发明的可溶性程序性死亡受体1，本文有时也简称为“sPD-1”，是指源自程序性死亡受体1的功能片段。此处的“功能”是指与程序性死亡受体1的配体结合而不能进行信号转导的功能。本发明发现sPD-1由于其可溶性而具有更高的自由度，与细胞表面结合的PD-1相比，sPD-1更易于与其配体的结合，从而竞争性抑制PD-1的信号转导，进而可以解除T细胞的耗竭以及凋亡。

优选地，本发明的sPD-1的前体包含编码程序性死亡受体1胞外结构域的核酸。本发明中，sPD-1的编码序列不特别限定，包含SEQ ID No.4所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。更优选地，作为sPD-1前体的编码核酸序列由SEQ ID No.4所示的序列组成。优选地，除了程序性死亡受体1的胞外结构域外，本发明的sPD-1还可在其任一端或中间包含其他氨基酸序列，从而增强sPD-1本身的功能或增加新的功能。此类其他氨基酸序列的实例包括Fc片段，从而增强其稳定性。

[抗原递呈细胞]

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，其为人为改造的细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，通过从外周血单核细胞(PBMC)中分离的单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在具体实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子其实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或能够产生抗原的前体，和第一方面所述的组合物。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由APC捕获并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原为GPC3。

[用于协同改善免疫应答的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于协同改善免疫应答的方法，其包括使根据第二方面所述的抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体；

(5)使步骤(4)的转染后的抗原递呈细胞与T细胞共培养的步骤。

本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定，例如，所述步骤的顺序可以是(1)、(2)、(3)、(4)和(5)；还可以是其他顺序。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在上述步骤(1)-(5)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。

制备例1

本制备例为制备编码抗原以及本组合物的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码本发明所述TGF-β调节肽、PD-1以及IL15/IL15RαmRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码序列，本发明GPC3的编码序列由SEQ ID No.6所示的序列组成，氨基酸序列由SEQ ID No.7所示的序列组成。GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用CN107583042A中公开的抗原。

表-1 DNA序列表

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例1

本实施例用于研究本发明组合物对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.用组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的蛋白IL15/IL15Rα、PD-1和TGF-β调节肽的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

4)编码GPC3抗原的mRNA与sPD-1的mRNA(PD-1组)

5)编码GPC3抗原的mRNA与TGF-β调节肽的mRNA(TGF-β调节肽组)

6)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα、TGF-β调节肽和sPD-1的mRNA(实验组)

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述六个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM Monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，CD4T和CD8 T细胞免疫应答结果如图1和图2所示，使用本发明提供的组合物能够显著提高CD4T细胞亚群中IFN-γ和TNF-α双阳性细胞比例，尤其是与单独使用组合物中一种或两种以上的组合相比，本发明组合物具有协同的免疫增强效果。

仅仅使用编码GPC3抗原的mRNA负载的DC细胞，仅能引起少部分的CD4以及CD8 T细胞应答。使用本发明所述的组合物后，在CD8 T细胞中，引起的免疫应答与GPC3组比，没有显著的变化。但使用了本发明所述组合物的实验组中，CD4 T细胞应答显著提高。IFN-γ阳性细胞的比例占CD4 T细胞的4.78％，比GPC3组的1.53％提高了2.12倍。TNF-α阳性细胞比例为3.59％，比GPC3组的0.97％提高了2.7倍。IFN-γ和TNF-α双阳性细胞的比例为2.52％，比GPC3组的0.2％提高了11.6倍。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 北京启辰生生物科技有限公司

<120> 用于协同改善免疫应答的组合物及应用

<141> 2019-11-21

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

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<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

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<210> 3

<211> 2637

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

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agctacacca tggccccagt ggccaacaga ttccacctgc ggctggagaa caacgccgaa 1080

gagatgggcg acgaggaagt gcacaccatc cctcccgagc tgagaatcct gctggacccc 1140

ggcgccctgc cagctctgca gaatcctcct attagaggcg gcgagggaca gaacggagga 1200

ctgcctttcc ctttccccga catcagcagg agagtgtgga acgaggaggg cgaagacgga 1260

ctgcctagac ctaaggaccc cgtgatccct agcatccagc tgttcccagg cctgagagag 1320

ccagaggaag tgcagggaag cgtggacatc gctctgagcg tcaagtgcga caacgagaag 1380

atgatcgtgg ccgtggagaa ggacagcttc caggctagcg gatacagcgg aatggacgtg 1440

accctgctgg accctacttg caaggccaag atgaacggca cccacttcgt gctggagtcc 1500

cccctgaacg gttgcggcac aagacctagg tggagcgctc tggacggagt ggtgtactac 1560

aactccatcg tgatccaggt gcccgctctg ggagattcta gcggttggcc agacggctac 1620

gaggatctgg agagcggaga caacggcttc ccaggcgata tggacgaggg agacgcttct 1680

ctgttcacca ggcccgagat cgtggtgttc aattgcagcc tgcagcaggt ccgcaaccct 1740

tctagcttcc aggagcagcc tcacggcaac atcaccttca acatggagct gtacaacacc 1800

gacctgttcc tggtgccatc acagggagtg ttcagcgtgc ccgagaacgg acacgtgtac 1860

gtggaggtgt ccgtgaccaa ggcagaacag gagctgggct tcgccatcca gacttgcttc 1920

atcagcccct acagcaacga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1980

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2040

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2100

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2160

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2220

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2280

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2340

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2400

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2460

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2520

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2580

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 2637

<210> 4

<211> 501

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagttcca a 501

<210> 5

<211> 1126

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttgag cccgccccac gacccgcagc gcccgaccga aaggagcgca cgaccccatc 540

atccaattcc gccccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 600

gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 660

ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 720

gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 780

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 840

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 900

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 960

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 1020

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 1080

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaac 1126

<210> 6

<211> 1985

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

gagaccggcc ucgagcagcu gaagcuuccu gcaggucgac ucuagagcca ccaugagggc 60

ccugugggug cugggccucu gcugcguccu gcugaccuuc gggucgguca gagcugacga 120

ugaaguugau gugcagccuc cuccuccucc uccagacgcu acaugucacc agguccgcuc 180

cuucuuccag aggcugcagc caggacucaa gugggugcca gagacaccag ugccaggaag 240

cgaucugcag gucugucugc cuaagggccc uaccuguugc ucccggaaga uggaggagaa 300

guaccagcug accgccaggc ugaacaugga acagcugcug cagagcgcca gcauggagcu 360

gaaguuccug aucauccaga acgccgccgu guuccaggag gccuucgaga ucgucgugcg 420

gcacgccaag aacuacacca acgccauguu caagaacaac uaccccagcc ugacaccuca 480

ggccuuugag uucguggggg aguucuucac cgacgugucu cuguacaucc ugggcagcga 540

caucaacgug gacgacaugg ugaacgagcu guucgacagc cuguuccccg ugaucuacac 600

ccagcugaug aacccaggcc ugccagauag cgcucuggau aucaacgagu gccugagggg 660

agccagaaga gaccugaagg uguucggcaa cuuccccaag cugaucauga cccagguguc 720

caagagccug caggucacca ggaucuuccu gcaggcccug aaccugggca ucgaggucau 780

caacaccacc gaccaccuga aguucagcaa ggauugcggc cggaugcuca cccgcaugug 840

guauuguagc uauugccagg gccugaugau ggugaagccu ugcggcggcu auugcaacgu 900

cgugaugcag gguuguaugg ccggcguggu ggagaucgac aaguauuggc gggaguacau 960

ccugagccug gaggagcugg ugaacggcau guaccggauc uacgacaugg agaacgugcu 1020

gcugggccug uucuccacca uccacgacag cauccaguac gugcagaaga acgccggcaa 1080

gcugacaacc accaucggaa agcucugcgc ccacucucag cagaggcagu acagaagcgc 1140

cuacuacccc gaggaccugu ucaucgacaa gaaggugcug aagguggccc acguggaaca 1200

cgaagagaca cugagcagcc ggaggagaga gcugauccag aagcugaagu ccuucaucuc 1260

cuucuacagc gcccugccag gcuacauuug cagccacagc ccaguggccg agaacgacac 1320

ccucuguugg aacggccagg agcuggugga gagauacucu cagaaggccg ccaggaacgg 1380

caugaagaac caguucaacc ugcacgagcu gaagaugaag ggcccagagc cagugguguc 1440

ccagaucauc gacaagcuga agcacaucaa ccagcugcug cggaccauga gcaugccuaa 1500

gggcagggug cuggacaaga accuggacga ggagggcuuc gagucaggag auugcggcga 1560

cgacgaagac gaguguauug gcggaagcgg cgacggcaug aucaagguca agaaccagcu 1620

gcgguuccug gccgaacugg ccuacgaucu ggacguggac gacgcuccag gcaauucuca 1680

gcaggccaca ccuaaggaca acgagaucag caccuuccac aaccugggca acgugcacuc 1740

uccucugaag cugcugacca gcauggccau uagcgucguc ugcuucuucu uccuggugca 1800

ucugaucccc aucgcugugg guggugcccu ggcggggcug guccucaucg uccucaucgc 1860

cuaccucguc ggcaggaaga ggagucacgc aggcuaccag acuaucuagg aauucuuaau 1920

uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaa 1985

<210> 7

<211> 618

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Gln Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp

50 55 60

Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met

65 70 75 80

Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr

115 120 125

Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser

165 170 175

Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp

180 185 190

Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu

195 200 205

Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys

210 215 220

Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile

225 230 235 240

Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly

245 250 255

Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met

260 265 270

Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys

275 280 285

Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu

290 295 300

Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu

305 310 315 320

Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr

325 330 335

Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys

340 345 350

Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp

355 360 365

Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu

370 375 380

Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser

385 390 395 400

Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser

405 410 415

Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val

420 425 430

Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe

435 440 445

Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln

450 455 460

Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser

465 470 475 480

Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe

485 490 495

Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser

500 505 510

Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu

515 520 525

Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln

530 535 540

Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn

545 550 555 560

Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val

565 570 575

Cys Phe Phe Phe Leu Val His Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala

580 585 590

Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg

595 600 605

Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

610 615

Claims

1.免疫调节组合物和GPC3抗原在制备用于协同改善免疫应答的抗原递呈细胞中的用途，其特征在于，所述组合物包含IL-15/IL-15Rα复合物或者能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体、TGF-β调节肽或者能够形成TGF-β调节肽的前体和可溶性程序性死亡受体1或者能够形成所述可溶性程序性死亡受体1的前体，其中，编码IL-15的核酸序列如SEQ ID No.1所示，编码IL-15Rα的核酸序列如SEQ ID No.2所示；编码TGF-β调节肽的核酸如SEQ IDNo.3所示；编码程序性死亡受体1的胞外结构域的核酸如SEQ ID No.4所示；编码GPC3抗原的核酸如SEQ ID No.6所示；

所述改善包括提高T淋巴细胞中TNF-α和/或IFN-γ阳性CD4T细胞比例。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体为编码IL-15和IL-15Rα两者的核酸。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TGF-β调节肽为TGFBR3在金属蛋白酶作用下进行裂解后产生的可溶性功能片段。

4.一种体外提高T淋巴细胞中TNF-α和/或IFN-γ阳性CD4 T细胞比例的方法，其特征在于，包括使抗原递呈细胞与T细胞接触的步骤，其中所述抗原递呈细胞包括免疫调节组合物和GPC3抗原，所述组合物包含IL-15/IL-15Rα复合物或者能够形成IL-15/IL-15Rα复合物的前体、TGF-β调节肽或者能够形成TGF-β调节肽的前体和可溶性程序性死亡受体1或者能够形成所述可溶性程序性死亡受体1的前体，其中，编码IL-15的核酸序列如SEQ ID No.1所示，编码IL-15Rα的核酸序列如SEQ ID No.2所示；编码TGF-β调节肽的核酸如SEQ ID No.3所示；编码程序性死亡受体1的胞外结构域的核酸如SEQ ID No.4所示；编码GPC3抗原的核酸如SEQ ID No.6所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体；

(4)通过转染使步骤(2)的核糖核酸分子导入步骤(3)的抗原递呈细胞并进行表达的步骤；和

(5)使步骤(4)转染后的抗原递呈细胞与T细胞共培养。