CN110732021B

CN110732021B - 用于解除肿瘤免疫抑制的组合物及其应用

Info

Publication number: CN110732021B
Application number: CN201911147677.7A
Authority: CN
Inventors: 孙圣楠; 林鑫; 文高柳; 吴斐然
Original assignee: Beijing Tricision Biotherapeutics Inc
Current assignee: Beijing Tricision Biotherapeutics Inc
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110732021A

Abstract

本发明公开用于解除肿瘤免疫抑制的组合物及其应用。本发明的组合物包含下述(a)至(e)成分或它们的编码核酸：(a)IL‑15、其突变体或其功能片段；(b)IL‑15受体α、其突变体或其功能片段；(c)IL‑12、其突变体或其功能片段；(d)TGF‑β调节肽、其突变体或其功能片段和(e)PD1‑CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段。本发明的组合物能够协同提高T淋巴细胞的免疫应答。

Description

用于解除肿瘤免疫抑制的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及用于解除肿瘤免疫抑制的组合物及其应用。

背景技术

传统上，肿瘤细胞免疫疗法主要为通过接种或过继细胞免疫疗法刺激免疫系统，从而引发免疫应答。这种方法是基于这样的假设：肿瘤细胞表达肿瘤特异性抗原，并被主要组织相容性复合体(MHC)呈递到肿瘤细胞表面，而抗肿瘤T细胞没有被充分激活。因此，为了解决这个问题，主要是尝试通过刺激关键的正的共免疫性和先天免疫途径，如CD28，CD40L(CD154)和各种TLR受体，或者抑制负的免疫抑制途径，如CTLA-4受体，PD-1受体而增加这些抗原的识别。

现有研究表明，癌组织中CD80的表达量明显低于癌周组织和正常组织，通常表达于细胞浆区和细胞核内，因此难以诱导肿瘤特异性T细胞激活，这是肿瘤逃逸免疫监视的重要原因。树突状细胞(DC)是目前已知最强的抗原呈递细胞(APC)，表面表达丰富的CD80，能在体内外摄取肿瘤抗原，直接激活初始T淋巴细胞，促进T辅助细胞(Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成，从而在肿瘤免疫中发挥重要作用。

大量研究发现，肿瘤组织及其区域淋巴结中浸润性树突状细胞(TIDC)的膜上的CD80表达明显受到抑制，使DC不能有效地诱导抗肿瘤免疫而引起局部免疫功能低下，从而导致肿瘤细胞逃逸。

另外研究表明，肿瘤可以通过分泌转化生长因子-β(TGFβ)抑制机体的免疫功能，如：TGFβ通过阻断DC成熟，造成不成熟DC数量增多，进而可造成T细胞功能丧失的免疫抑制状态，这种无效的肿瘤特异性抗原呈递促进了肿瘤生长。

近年来，DC肿瘤疫苗在肿瘤的预防和治疗中方面展现了较好的应用前景。DC是目前已知最强的APC，表面表达丰富的CD80，能在体内外摄取肿瘤抗原，直接激活初始T淋巴细胞，促进T辅助细胞(Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成，从而在肿瘤免疫中发挥重要作用。DC相关疫苗在前列腺癌中的研究较为深入。如Sipuleucel-T直接将前列腺癌酸性磷酸酶抗原转染DC激发机体产生特异性的抗肿瘤反应。IMPACT研究显示，尽管客观有效率评价显示治疗效果有限(<5％)，Sipuleucel-T组的中位生存时间(25.8个月)要高于对照组(21.7个月)4.1个月。2010年4月，美国FDA批准Sipuleucel-T用于治疗无症状或症状轻微的转移性去势治疗无效的难治性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)。

然而，Sipuleucel-T上市后，一直销量不佳，原制造商丹德里昂公司(DendreonCorporation)宣告破产。而且其他几个大型的基于DC细胞的肿瘤疫苗三期临床均失败告终。例如默克公司的Stimuvax(靶向MUC1，2013年更名为tecemotide)III期研究两度宣告失败，葛兰素史克公司的GSK1572932A(靶向MAGEA3)也止步于临床III期，这些数据表明，单独的DC疫苗的使用通常不能导致所期待的免疫治疗效果的改善，不能得到令人满意的临床效果。这可能是因为受各种免疫抑制因素的影响，导致DC疫苗没有诱导产生足够多的抗肿瘤的T细胞，进而导致临床的失败。

发明内容

本发明的发明人在免疫调节剂研发领域进行了深入研究，基于高通量筛选技术发现，通过同时调节多个通路，并进一步使用TGF-β调节肽和PD1-CD80来增强信号通路阻断，可以发挥各组分的协同作用，解除T淋巴细胞的免疫抑制，大大提升抗原递呈细胞的活性。至少部分地基于上述发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于解除肿瘤免疫抑制的组合物，该组合物包含下述(a)至(e)成分：

(a)IL-15、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(b)IL-15受体α、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(c)IL-12、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；

(d)TGF-β调节肽、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；和

(e)PD1-CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段，或者其编码核酸。

在某些具体实施方案中，所述TGF-β调节肽的序列为下述(a’)至(c’)中的一种：

(a’)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；

(b’)与(a’)具有相同物种来源且同源性为95％以上的氨基酸序列；

(c’)在(a’)的基础上经氨基酸突变得到且保留活性的序列。

在某些具体实施方案中，所述组合物中(a)和(b)能够结合形成复合物，且所述组合物中包含有Fc结构域。

在某些具体实施方案中，(a)成分包含SEQ ID No.1所示的序列，(b)成分包含SEQID No.3所示的序列，(c)成分包含SEQ ID No.4所示的序列，(e)成分包含SEQ ID No.8所示的序列。

在某些具体实施方案中，编码所述(a)成分和(b)成分的核酸为同一核酸，且其具有SEQ ID No.2所示的序列，编码所述(c)成分的核酸具有SEQ ID No.5所示的序列，编码所述(d)成分的核酸具有SEQ ID No.7所示的序列，和编码所述(e)成分的核酸具有SEQ IDNo.9所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种工程化的抗原递呈现细胞，其能够用于解除肿瘤免疫抑制，在工程化的免疫细胞内包含第一方面所述的组合物。

在某些具体实施方案中，所述抗原递呈细胞进一步包括抗原或表达所述抗原的核酸。

在某些具体实施方案中，抗原递呈细胞为树突状细胞。

本发明的第三方面，提供工程化的抗原递呈细胞的制备方法，包括使含有第一方面所述的组合物包含于抗原递呈细胞，从而获得所述工程化的抗原递呈细胞的步骤。

在某些具体实施方案中，工程化的抗原递呈细胞的制备方法包括：

(1)构建能够产生(a)至(e)成分的核酸；

(2)从静脉血中分离得到外周血单核细胞，并诱导分化得到抗原递呈细胞；和

(3)将步骤(1)的核酸引入步骤(2)的抗原递呈细胞，并在适于所述核酸表达的条件下培养所述抗原递呈细胞。

本发明通过利用IL15、IL15Rα和IL12调节T细胞活化和增殖的能力，促使DC细胞诱导产生的特异的细胞毒性T细胞持续扩增，产生更多的有抗肿瘤活性的淋巴细胞，提高治疗肿瘤，例如DC疫苗在治疗肿瘤的效果。更进一步地，本发明使用TGF-β调节肽，其与TGF-β的亲和力大于与TGFBR1或TGFBR2的亲和力，从而解除TGFβ对DC成熟的阻断，进而解除T细胞功能丧失的免疫抑制状态，并通过PD1-CD80蛋白阻断PD-L1/2与T细胞表面的PD-1结合，解除对T细胞的抑制，释放其杀伤肿瘤的功能。本发明的实验证实IL15、IL15Rα通路的激活和TGF-β通路的阻断以及与PD1-CD80的组合能够产生多通路协同作用，大大提高了各成分的效果。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，术语“突变体”是指与天然存在蛋白或野生型蛋白相比具有突变但基本同源且仍保留原有活性的蛋白。其中，突变可以是例如一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代或它们的组合。此类突变可以天生产生的突变，也可以是人工引入的突变。在突变为氨基酸取代的情况下，优选为保守性氨基酸取代，即一个残基被具有类似性质的另一个取代。典型的取代是在脂肪族氨基酸组中、在含有脂族羟基侧链的氨基酸组中、在含有酸性基团的氨基酸组中、在含有酰胺衍生物的氨基酸组中，在含有碱性基团的氨基酸组中或在含有芳族基团的氨基酸之间的取代。

本发明中，“基本同源”是指与对象序列之间的相同程度为60％以上，优选为80％以上，更优选90％以上。例如，95％以上，97％以上，最优选99％以上。

本发明中，术语“功能片段”是指由源自天然存在蛋白或野生型蛋白的一部分连续氨基酸组成且仍保留原有活性的蛋白。

本发明中，术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(即DNA)和核糖核酸(即RNA)。在RNA的情况下，为了防止RNA的不稳定性和多种途径的降解，根据已知的RNA多种天然降解途径，可以对核酸分子进行多种优化。例如，末端结构对mRNA的稳定是至关重要的。比如，在天然存在的mRNA的5’端，存在有修饰的鸟苷核苷酸，称之为5’帽子结构，并且3’端有一段长约150-300个碱基的腺苷核苷酸(即多聚A尾巴)结构，例如150-200个，220-270个等，5’和3’端的UTR序列，比如人的beta-球蛋白的UTR序列。

[组合物]

本发明的第一方面，提供一种用于解除肿瘤免疫抑制的组合物，本文有时也简称为“本发明的组合物”。本发明的组合物包含下述(a)至(e)成分：(a)IL-15、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(b)IL-15受体α、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(c)IL-12、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸；(d)TGF-β调节肽、其突变体或其功能片段，或者它们的编码核酸和(e)PD1-CD80融合蛋白、其突变体或其功能片段，或者其编码核酸。

本发明中，IL-15(interleukin-15,IL-15)是指天然存在或野生型白细胞介素-15，包括不同的剪接变体和天然生成的变体。IL-15可以是任何物种的IL-15。例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴子，优选人类。

本发明的IL-15是一种与IL-2结构类似的细胞因子，广泛表达在各种细胞和组织中，如单核细胞、巨噬细胞、DC细胞和纤维细胞等。本发明的IL-15能够与IL-15受体α结合，激活下游的JAK1，JAK3，导致下游STAT3和STAT5的磷酸化和信号通路的激活，诱导BCL2、MAP激酶通路、LCK和SYK的磷酸化，导致细胞的增殖和成熟。另外，IL-15能够调节T细胞和NK细胞的活化和增殖，能够维持在缺乏抗原刺激下记忆性T细胞的存活。有研究证明，在啮齿类动物的淋巴细胞中，IL-15通过诱导BCL2L1/BCL-x(L)而抑制凋亡。同样地，本发明中也发现在人体内IL-15通过诱导BCL2和/或BCL-xL抑制T淋巴细胞的凋亡。

本发明中，IL-15的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.1所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。

本发明中，IL-15受体α(IL-15Rα)是IL-15受体的α、β和γ三条链中的α链，是形成高特异性、高亲和力IL-15Rαβγ的必要亚单位。本发明发现仅通过α链的过表达而无需其他两个亚基即可实现在IL-15通路的激活，实现下游信号的转导。本发明发现，IL-15受体α的氨基酸序列不特别限定，只要能够具备结合IL-15的功能即可，其实例包括SEQ ID No.3所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-15受体α由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成。

在具体实施方案中，本发明组合物的成分(a)和(b)，即，IL-15和IL-15受体α分别为单独的蛋白，两者之间可结合，从而形成复合物。本发明组合物中成分(a)和(b)的摩尔比优选为(0.7-1.2):1，更优选为1:1。

在某些实施方案中，在本发明的组合物包含核酸的情况下，本发明的核酸可以是同时编码多种蛋白的核酸，也可以是分别编码不同蛋白的核酸的组合，且每种核酸仅编码一种蛋白。优选地，本发明的核酸为同时编码两种以上蛋白的核酸。本文中，“同时编码”是指同一个核酸分子可以编码两种以上的蛋白。此时两种以上的蛋白可以融合形式存在，但更优选地，同一核酸分子编码产生两种以上单独存在的蛋白。在同一核酸分子同时产生两种以上的蛋白的情况下，可通过使相临的两个基因之间连接例如核糖体进入位点(IRES)来实现。可选地，还可以通过使相临的两个基因之间连接编码自剪切多肽序列的核酸序列来实现。

作为示例性实例，本发明的核酸可为同时编码IL-15和IL-15Rα的核酸。此类核酸的实例包括但不限于SEQ ID No.2所示的核酸，该核酸可同时编码产生单独的IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白。

本发明中，IL(interleukin，IL)12是免疫网络中占有十分重要地位的核心细胞因子，是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁，已知其免疫调节作用和生物学效应包括：IL-12调节Th1/Th2应答，使其向Th1倾斜，诱导Th1细胞发育和增殖，增强T细胞的杀伤功能。活化NK细胞产生细胞毒作用，增强NK/LAK细胞溶解活性。促进NK细胞的增殖，诱生T细胞、NK细胞产生IFN-γ。

本发明中，IL-12的氨基酸序列不特别限定，其实例可以是包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的IL-12由包含SEQ ID No.5所示的序列的核酸编码。

本发明的TGF-β调节肽用于调节TGF-β与其信号受体的结合，优选用于抑制TGF-β与其受体特别是1类或2类受体结合后的信号转导，从而解除免疫抑制作用。优选地，TGF-β调节肽包含下述(a’)至(c’)之一的序列：

(a’)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；

(c’)在(a’)的基础上经氨基酸突变得到的序列。

优选地，本发明的TGF-β调节肽的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的序列。更优选地，本发明的TGF-β调节肽由SEQ ID No.7所示的核酸编码。

本发明的中，PD1-CD80为PD1或其片段与CD80或其片段的融合蛋白。优选地，PD1的片段为其胞外域，CD80的片段为其胞外域。本发明中，CD80属于免疫球蛋白超家族(immunogloblin superfamily，IgSF)，作为表达在APC上的重要协同刺激分子，CD80在与T细胞CD28结合后，对抗原诱导初始T细胞活化、增殖及效应功能的产生具有重要的始动调节作用，是一个正性因子。PD-1属于CD28超家族成员，与配体程序性死亡配体1(programmeddeath ligand 1，PD-L1)或者程序性死亡配体2(programmed deaTh ligand 2，PD-L2)结合后向T细胞受体(T cell receptor，TCR)传递共抑制信号。PD-1主要表达于活化的T细胞表面，也可表达于B细胞、Treg细胞、NK细胞和骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)。其配体PD-L1和PD-L2主要表达于巨噬细胞、单核细胞等多种炎性细胞。除了免疫细胞，肿瘤细胞表面亦可表达PD-1配体，如黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌和非小细胞肺癌等。T细胞的活化需要两个信号，第一信号来自TCR和抗原的特异性结合，第二信号来自CD80/CD28等辅助分子的激活。当位于T细胞表面的PD-1和配体结合，PD-1胞质区的免疫受体酪氨酸活化基序结构域中的酪氨酸发生磷酸化，募集含两个SH结构的蛋白酪氨酸磷酸酶，使TCR和CD28下游的ζ链相关蛋白激酶70和磷脂酰肌醇3激酶发生去磷酸化，从而阻断T细胞的激活。PD-1可以在炎性介质，如干扰素γ(interferonγ，IFN-γ)作用下诱导性表达，引起T细胞对PD-1进行转录。

同时，IFN-γ的刺激还可以上调细胞表面的PD-L1表达。在肿瘤微环境中，T细胞识别肿瘤抗原后活化扩增为效应T细胞，特异性地杀伤肿瘤细胞，并分泌大量炎性因子IFN-γ。活化后的T细胞开始表达PD-1，长时间抗原刺激引起T细胞过度表达PD-1，导致T细胞失能。多数肿瘤细胞通过这种方式逃避免疫细胞的攻击。因此使用阻断剂阻断PD-1与PD-L1间的相互作用，可恢复T细胞的活性和杀伤肿瘤细胞的能力，这是目前临床治疗中使用PD-1/PD-L1抗体进行免疫治疗的理论依据。

本发明中，PD1-CD80融合蛋白的氨基酸序列不特别限定，包含SEQ ID No.8所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。优选地，本发明的PD1-CD80融合蛋白由包含SEQ ID No.9所示的序列的核酸编码。

在某些实施方案中，本发明组合物的TGF-β调节肽和PD1-CD80进一步含有Fc片段。优选地，Fc片段为较长的Fc片段。一般而言分子体积过大可能影响组合物的稳定性和活性。因此，Fc片段的长度或大小影响本发明目的实现。对于本发明而言，Fc片段的长度一般为200-350AA，优选220-300AA。本发明的Fc片段可包含免疫球蛋白中天然存在的片段，还可包括通过已知的基因工程手段对天然存在的Fc片段进行改造，以获得更优性能的突变型Fc片段。例如，Fc片段包含“YTE”3个突变的片段，即252、254和256位的蛋氨酸(Met，M)、丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)分别被酪氨酸(Tyr，Y)、和谷氨酸(Glu，E)替换，由此获得半衰期更长的融合蛋白。再例如，通过对Fc片段的二硫键的基因工程改造和修饰，可以使Fc融合蛋白聚集成多聚体的复合物，由此获得稳定性更优的融合蛋白。优选地，本发明的Fc片段由SEQ ID No.10所示的序列编码。

本发明的组合物中，成分(a):(b):(c):(d):(e)的摩尔比一般为1:1:(0.7-1.2):(0.7-1.2)，更优选为1:1:(0.95-1.2):(0.95-1.2)。

[用于解除肿瘤免疫抑制的抗原递呈细胞]

本发明的第二方面，提供一种抗原递呈细胞，其为人为改造的细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，从外周血单核细胞(PBMC)中分离出单个核细胞，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导单个核细胞成为DC细胞。在某些实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或其编码核酸。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由抗原递呈细胞(APC)捕获，并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原为肝细胞癌抗原，例如GPC3抗原。

[工程化的抗原递呈细胞的制备方法]

本发明的第三方面，提供工程化的抗原递呈细胞的制备方法，工程化的抗原递呈细胞用于解除肿瘤免疫抑制，其包括将第一方面所述的组合物引入抗原递呈细胞，从而使抗原递呈细胞工程化。

在某些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：

(1)构建能够产生(a)至(e)成分的核酸；

在优选地实施方案中，本发明的方法还包括(4)构建产生抗原的核酸的步骤。

在某些实施方案中，本发明的方法包括制备包含有IL-15、IL-15受体α、IL-12、TGF-β调节肽和PD1-CD80融合蛋白和抗原相应DNA质粒。之后进行步骤(2)的体外转录过程，首先使用限制性内切酶将质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备核糖核酸分子。最后进行抗原递呈细胞的体外诱导培养和转染表达过程。

本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定，例如，所述步骤的顺序可以是(1)、(2)、(3)；还可以是(2)、(1)、(3)等。此外，两个以上的上述步骤可合并同时进行，例如步骤(1)和(4)可同时进行。另外，本领域技术人员还应理解的是，在上述步骤(1)-(4)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。

制备例

本制备例为制备编码抗原以及免疫检验点抑制剂的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码本发明所述IL12、IL15、IL15Rα以及TGF-β调节肽和PD1-CD80 mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码序列，本发明GPC3的编码序列由SEQ ID No.11所示的序列组成，氨基酸序列由SEQ ID No.12所示的序列组成。GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用CN107583042A中公开的抗原。

表-1DNA序列表

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例1

本实施例用于研究本发明组合物对T细胞应答的影响。

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.用组合物转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的蛋白IL15/IL15Rα、IL12、PD1-CD80和TGF-β调节肽的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL12的mRNA(IL12组)

4)编码GPC3抗原的mRNA与IL15/IL15Rα的mRNA(IL15组)

5)编码GPC3抗原的mRNA与PD1-CD80的mRNA(PD1-CD80组)

6)编码GPC3抗原的mRNA与TGF-β调节肽的mRNA(TGF-β调节肽组)

7)编码GPC3抗原的mRNA与IL12+IL15/IL15Rα(IL12+IL15组)

8)编码GPC3抗原的mRNA与IL12+IL15+TGF-β结合肽+TGF-β调节肽(IL12+IL15+TGF-β结合肽+TGF-β调节肽组)

9)编码GPC3抗原的mRNA与IL12+IL15+PD1-CD80+TGF-β结合肽(IL12+IL15+PD1-CD80+TGF-β结合肽组)

10)编码GPC3抗原的mRNA与IL12+IL15/IL15Rα+TGF-β调节肽+PD1-CD80的mRNA(实验组)

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述十个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM Monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

所得结果如表2及图1和2所示。

表2

在图1和图2中，仅仅使用编码GPC3抗原的mRNA负载的DC细胞，仅能引起少部分的CD4以及CD8 T细胞应答。在使用编码IL12、IL15/IL15Rα、TGF-β调节肽或PD1-CD80 mRNA后，不管是CD4 T细胞应答还是CD8 T细胞应答，相比不使用这些mRNA的组相比，均有显著的提高。而使用本发明所述组合IL12+IL15/IL15Rα+TGF-β调节肽+PD1-CD80的实验组中，不管与只使用GPC3抗原mRNA的组(GPC3对照组)，还是与使用了本发明所述组合物的部分组分的组相比，其CD4以及CD8 T细胞的应答均有显著的提高。如实验组中，IFN-γ阳性的CD8 T细胞比例为24.68％，比GPC3对照组的1.71％提高了13.43倍。跟其他只使用单一组分的组比，IFN-γ阳性的CD8T细胞比例是其他效果最好的组(IL12组，IFN-γ阳性的CD8 T细胞比例为10.8％)的2.28倍。同样地，TNF-α阳性CD8 T细胞比例比GPC3组提高了7.07倍。TNF-α和IFN-γ双阳性CD8 T细胞的比例在实验组中为6.18％，比GPC3组的0.41％提高了14.07倍。在CD4T细胞中，实验组IFN-γ阳性细胞的比例为7.6％，比GPC3组提高了3.55倍。TNF-α阳性细胞比例为3.7％，是GPC3组的1.91倍。TNF-α和IFN-γ双阳性CD4 T细胞的比例在实验组中为2.47％，比GPC3组的0.59％提高了3.19倍。

实施例2

除了将实施例1的抗原改为AFP以外，以与实施例1相似的方式进行实验。所得结果如表3所示。

表3

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 北京启辰生生物科技有限公司

<120> 用于解除肿瘤免疫抑制的组合物及其应用

<141> 2019-11-21

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

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cccctgaacg gttgcggcac aagacctagg tggagcgctc tggacggagt ggtgtactac 1560

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gaggatctgg agagcggaga caacggcttc ccaggcgata tggacgaggg agacgcttct 1680

ctgttcacca ggcccgagat cgtggtgttc aattgcagcc tgcagcaggt ccgcaaccct 1740

tctagcttcc aggagcagcc tcacggcaac atcaccttca acatggagct gtacaacacc 1800

gacctgttcc tggtgccatc acagggagtg ttcagcgtgc ccgagaacgg acacgtgtac 1860

gtggaggtgt ccgtgaccaa ggcagaacag gagctgggct tcgccatcca gacttgcttc 1920

atcagcccct acagcaacga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1980

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2040

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2100

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2160

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2220

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2280

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2340

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2400

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2460

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2520

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2580

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 2637

<210> 8

<211> 622

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

165 170 175

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

180 185 190

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

195 200 205

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

210 215 220

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

225 230 235 240

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

245 250 255

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

260 265 270

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

275 280 285

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

290 295 300

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

305 310 315 320

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

325 330 335

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

340 345 350

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

355 360 365

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

370 375 380

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu

385 390 395 400

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Val Ile

405 410 415

His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His

420 425 430

Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys

435 440 445

Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp

450 455 460

Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser

465 470 475 480

Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys

485 490 495

Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala

500 505 510

Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser

515 520 525

Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr

530 535 540

Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu

545 550 555 560

Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu

565 570 575

Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His

580 585 590

Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr

595 600 605

Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

610 615 620

<210> 9

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagttcca agagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 540

tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 600

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 660

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 720

acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 840

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 900

tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960

gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080

aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1140

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaagag 1200

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagttatcca cgtgaccaag 1260

gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 1320

caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 1380

atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 1440

attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 1500

tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 1560

gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 1620

atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 1680

gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 1740

agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 1800

ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 1860

gataactga 1869

<210> 10

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 651

<210> 11

<211> 1985

<212> RNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

gagaccggcc ucgagcagcu gaagcuuccu gcaggucgac ucuagagcca ccaugagggc 60

ccugugggug cugggccucu gcugcguccu gcugaccuuc gggucgguca gagcugacga 120

ugaaguugau gugcagccuc cuccuccucc uccagacgcu acaugucacc agguccgcuc 180

cuucuuccag aggcugcagc caggacucaa gugggugcca gagacaccag ugccaggaag 240

cgaucugcag gucugucugc cuaagggccc uaccuguugc ucccggaaga uggaggagaa 300

guaccagcug accgccaggc ugaacaugga acagcugcug cagagcgcca gcauggagcu 360

gaaguuccug aucauccaga acgccgccgu guuccaggag gccuucgaga ucgucgugcg 420

gcacgccaag aacuacacca acgccauguu caagaacaac uaccccagcc ugacaccuca 480

ggccuuugag uucguggggg aguucuucac cgacgugucu cuguacaucc ugggcagcga 540

caucaacgug gacgacaugg ugaacgagcu guucgacagc cuguuccccg ugaucuacac 600

ccagcugaug aacccaggcc ugccagauag cgcucuggau aucaacgagu gccugagggg 660

agccagaaga gaccugaagg uguucggcaa cuuccccaag cugaucauga cccagguguc 720

caagagccug caggucacca ggaucuuccu gcaggcccug aaccugggca ucgaggucau 780

caacaccacc gaccaccuga aguucagcaa ggauugcggc cggaugcuca cccgcaugug 840

guauuguagc uauugccagg gccugaugau ggugaagccu ugcggcggcu auugcaacgu 900

cgugaugcag gguuguaugg ccggcguggu ggagaucgac aaguauuggc gggaguacau 960

ccugagccug gaggagcugg ugaacggcau guaccggauc uacgacaugg agaacgugcu 1020

gcugggccug uucuccacca uccacgacag cauccaguac gugcagaaga acgccggcaa 1080

gcugacaacc accaucggaa agcucugcgc ccacucucag cagaggcagu acagaagcgc 1140

cuacuacccc gaggaccugu ucaucgacaa gaaggugcug aagguggccc acguggaaca 1200

cgaagagaca cugagcagcc ggaggagaga gcugauccag aagcugaagu ccuucaucuc 1260

cuucuacagc gcccugccag gcuacauuug cagccacagc ccaguggccg agaacgacac 1320

ccucuguugg aacggccagg agcuggugga gagauacucu cagaaggccg ccaggaacgg 1380

caugaagaac caguucaacc ugcacgagcu gaagaugaag ggcccagagc cagugguguc 1440

ccagaucauc gacaagcuga agcacaucaa ccagcugcug cggaccauga gcaugccuaa 1500

gggcagggug cuggacaaga accuggacga ggagggcuuc gagucaggag auugcggcga 1560

cgacgaagac gaguguauug gcggaagcgg cgacggcaug aucaagguca agaaccagcu 1620

gcgguuccug gccgaacugg ccuacgaucu ggacguggac gacgcuccag gcaauucuca 1680

gcaggccaca ccuaaggaca acgagaucag caccuuccac aaccugggca acgugcacuc 1740

uccucugaag cugcugacca gcauggccau uagcgucguc ugcuucuucu uccuggugca 1800

ucugaucccc aucgcugugg guggugcccu ggcggggcug guccucaucg uccucaucgc 1860

cuaccucguc ggcaggaaga ggagucacgc aggcuaccag acuaucuagg aauucuuaau 1920

uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaa 1985

<210> 12

<211> 618

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Gln Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu

35 40 45

Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp

50 55 60

Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met

65 70 75 80

Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr

115 120 125

Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser

165 170 175

Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp

180 185 190

Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu

195 200 205

Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys

210 215 220

Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile

225 230 235 240

Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly

245 250 255

Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met

260 265 270

Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys

275 280 285

Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu

290 295 300

Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu

305 310 315 320

Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr

325 330 335

Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys

340 345 350

Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp

355 360 365

Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu

370 375 380

Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser

385 390 395 400

Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser

405 410 415

Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val

420 425 430

Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe

435 440 445

Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln

450 455 460

Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser

465 470 475 480

Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe

485 490 495

Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser

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Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu

515 520 525

Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln

530 535 540

Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn

545 550 555 560

Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val

565 570 575

Cys Phe Phe Phe Leu Val His Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala

580 585 590

Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg

595 600 605

Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile

610 615

Claims

1.工程化的抗原递呈细胞用于在体外致敏T细胞的实验中增强CD8 T细胞免疫应答的用途，其特征在于，所述工程化的抗原递呈细胞包含用于解除肿瘤免疫抑制的组合物和GPC3抗原，或包含用于解除肿瘤免疫抑制的组合物和表达GPC3抗原的核酸，所述组合物由下述(a)至(e)成分或编码(a)至(e)成分的核酸组成：

(a) 序列如SEQ ID No.1所示的IL-15；

(b) 序列如SEQ ID No.3所示的IL-15受体α；

(c) 序列如SEQ ID No.4所示的IL-12；

(d) 序列如SEQ ID No.6所示的TGF-β调节肽，和

(e) 序列如SEQ ID No.8所示的PD1-CD80融合蛋白；

其中，所述抗原递呈细胞为树突状细胞，所述免疫应答是指提高CD8T细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，编码所述(a)成分和(b)成分的核酸具有SEQ ID No.2所示的序列，编码所述(c)成分的核酸具有SEQ ID No.5所示的序列，编码所述(d)成分的核酸具有SEQ ID No.7所示的序列，和编码所述(e)成分的核酸具有SEQ ID No.9所示的序列。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述工程化的抗原递呈细胞的制备方法包括：

(1) 构建能够产生(a)至(e)成分的核酸；

(2) 从静脉血中分离得到外周血单核细胞，并诱导分化得到抗原递呈细胞；和

(3) 将步骤(1)的核酸引入步骤(2)的抗原递呈细胞，并在适于所述核酸表达的条件下培养所述抗原递呈细胞。