PT2229956E

PT2229956E - Contruções multiméricas

Info

Publication number: PT2229956E
Application number: PT101651594T
Authority: PT
Inventors: Abraham Scaria; Peter Pechan; Samuel Wadsworth
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2013-07-31
Also published as: WO2006031689A2; ES2347340T3; CY1114155T1; US20070224178A1; DK1804835T3; MX2007002942A; CN101094688A; DK2229956T3; IL181839A0; PL1804835T3; JP4944032B2; DE602005021811D1; EP2229956A1; WO2006031689A3; IL216095A; JP2008512127A; HK1144663A1; EP1804835B9; ATE470454T1; EP1804835A4

Description

DESCRIÇÃO

CONSTRUÇÕES MULTIMÉRICAS

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a proteínas recombinantes, úteis no tratamento de casos de neovascularização patológica, como por exemplo asma, artrite, cancro e degeneração macular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A neovascularização patológica é um componente fundamental de doenças como a degeneração macular relacionada com a idade (AMD) exsudativa, retinopatia diabética proliferativa, artrite reumatóide, osteoartrite e asma. Esta também desempenha um papel importante no desenvolvimento e no crescimento de tumores. A neovascularização é regulada por um equilíbrio delicado de factores pró-angiogénicos e anti-angiogénicos.

Sabe-se que o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é necessário para a neovascularização. Foi demonstrado que a inibição da atividade do VEGF inibiu a neovascularização em modelos animais com AMD, artrite e em vários modelos de tumores. Os métodos utilizados para inibir a atividade do VEGF incluem o uso de anticorpos, proteínas de fusão receptoras, peptídeos e pequenas moléculas.

Demonstrou-se que as proteínas VEGF-Rl (Flt-1) e VEGF-R2 (KDR) ligam o VEGF com elevada afinidade. Tanto o Flt-1 como o KDR possuem sete domínios de imunoglobina (Ig) em sua região extracelular. Demontrou-se que o domínio 2 é 1 essencial para a ligação do VEGF. As fusões de cada um dos receptores solúveis (domínios 1-7) e dos domínios 1-3 da IgG Fc ligam o VEGF de forma maneira eficiente. No entanto, as fusões da IgG Fc apenas com o domínio 2 da Igte, não foi capaz de realizar a ligação do VEGF, como o foi uma combinação dos domínios 1 e 2 da Ig. Davis-Smyth, 1996. Portanto, aparentemente são necessários os domínios 1 e 3 da Ig, juntamente com o domínio 2, para uma ligação eficiente do VEGF.

Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sei. vol. 99(17): 11393-11398 (2002) divulga outros polipeptídeos de fusão incluindo porções do receptor VEGF-RI fundido à porção Fc da cadeia pesada humana IgGl. A WO 00/75319 divulga polipeptídeos receptores Fltl quiméricos modificados que alegadamente têm um perfil farmacocinético melhorado. A WO 97/44453 descreve proteínas quiméricas do receptor de VEGF, que supostamente se ligam a VEGF e para antagonizar a atividade angiogénica e proliferativa de células endoteliais da mesma.

Olafsen et al. (Protein Engineering, Design & Selection, v.17 (4), p. 315-323 (2004)) descreve a caracterização da concepção de fragmentos de anticorpo anti-pl85HER~2 (scFv-CH3)2.

Hu et al. (Câncer Research, v 56 (13), p. 3.055-3.061 (1996) ) revela um fragmento de anticorpo de antígeno 2 carcinoembrionário modificado (scFv-CH3) , que supostamente exibe rápida segmentação de alto nivel de xenotransplantes.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente divulgação, produz-se uma proteína de fusão. A proteína de fusão possui a fórmula X-Y-Z. X contém um polipeptídeo selecionado no grupo composto por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um resíduo de aminoácido de polipeptídeo 5 - 25. Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada da IgG.

Outro aspecto da presente divulgação é um polipeptídeo da fórmula X-Y-Z. X contém um polipeptídeo selecionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um grupo ligante, que produz a separação espacial dos resíduos de aminoácidos 5-25. Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada da IgG.

Ainda outro aspecto da presente divulgação é uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z. X contém um polipeptídeo selecionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5-25. Zé uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo.

Uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z é também fornecida pela presente divulgação. X contém um polipeptídeo 3 seleccionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de uma grupo ligante, que proporciona a separação espacial dos resíduos de aminoácido 5-25. Z é uma porção de Fc de uma molécula de anticorpo.

Ainda outro aspecto da presente divulgação é um método de muitimerização de um polipeptídeo X. Um polipeptídeo X é ligado a um polipeptídeo Z através de de um polipeptídeo Y para formar o polipeptídeo XYZ. X compreende um polipeptídeo selecionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de um polipeptídeo de resíduo de aminoácido 5-25. Zé uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG. 0 polipeptídeo XYZ que é formado multimeriza-se.

Ainda outro aspecto da presente divulgação oferece um método de multimerzação de polipeptídeo X. 0 polipeptídeo X é ligado a um polipeptídeo Z através de um grupo Y para formar o polímero XYZ. X contém um polipeptídeo selecionado do grupo constituído por um receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento. Y consiste essencialmente de uma grupo ligante, que fornece a separação espacial dos resíduos de aminoácido 5-25. Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG. 0 polipeptídeo XYZ que se forma multimeriza-se.

Num aspecto da presente divulgação produz-se uma molécula de ácido nucleico. A molécula de ácido nucleico codifica uma proteína de fusão, que contém um domínio semelhante a 4

Ig2 do VEGF-R1 (Flt-1); um ligante; e um domínio de multimerização. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25.

Noutro aspecto da presente divulgação, produz-se uma proteína de fusão. A proteína de fusão contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-RI (Flt-1) , um ligante e um domínio de multimerização. A proteína de fusão contém uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25.

Noutro aspecto da presente divulgação, produz-se um método in vitro. Fornece-se uma molécula de ácido nucleico a uma célula de mamífero isolada. A molécula de ácido nucleico codifica uma proteína de fusão, que contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-Rl (Flt-1); um ligante; e um domínio de multimerização. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25. A expressão da proteína de fusão é controlada por um promotor. Forma-se uma célula que expressa uma proteína de fusão.

Outro aspecto da presente divulgação constitui um método de fornecer uma proteína de fusão a um mamífero. Uma célula de mamífero que expressa a proteína de fusão é fornecida a um mamífero. A célula expressa e segrega a proteína de fusão, fornecendo, assim, a proteína de fusão ao mamífero. A proteína de fusão contém um domínio Ig-like 2 do VEGF-Rl (Flt-1), um ligante e um domínio de multimerização. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25.

Outro aspecto da presente divulgação constitui um método de 5 fornecimento de uma proteína de fusão para um mamífero. A proteína de fusão, que inclui um domínio Ig-like 2 do VEGF-R1 (Flt-1), um ligante e um domínio de multimerização, é fornecido para um mamífero. A proteína de fusão inclui uma sequência seleccionada no grupo constituído pela SEQ ID N°: 2, 8, 21, 23 e 25. Uma construção de ácido nucleico, que codifica a referida proteína de fusão pode, em alternativa, ser fornecida ao mamífero, através da qual a proteína de fusão é expressa pelo mamífero.

Estes e outros aspectos da presente divulgação, que serão descritos mais pormenorizadamente de seguida, disponibilizam métodos e agentes para o tratamento de doenças relacionadas com a proliferação e inflamação vascular. Os agentes podem oferecer uma maior estabilidade e biodisponibilidade relativamente às formas naturais das proteínas.

Uma parte da divulgação incluída nesta divulgação disponibiliza os aspectos e modalidades da presente invenção. Mais especificamente, um primeiro aspecto da presente invenção fornece uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z, na qual: X contém uma porção do receptor VEGF; em que a porção ligante Y é um polipéptido de 5-50 resíduos de aminoácidos que têm uma flexibilidade maior do que a média conforme determinado pelo método de previsão de flexibilidade Karpuss & Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, e em que a referida proteína de fusão se liga ao VEGF quando multimerizada.

Num aspecto relacionado, a presente invenção disponibiliza uma composição que contém a proteína de fusão da invenção, que inclui também um ou mais excipientes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. 6

Noutro aspecto, a presente invenção disponibiliza um método para multimerizar um polipeptídeo X, que compreende: a ligação de um polipeptideo X a um polipeptideo Z por meio de um polipeptideo Y para formar um polipeptideo XYZ, em que: X compreende uma porção de um receptor de VEGF; Y é uma porção ligante e Z é um dominio de multimerização, em que a porção ligante Y é um polipéptido de 5-50 residuos de aminoácidos que têm uma flexibilidade maior do que média conforme determinado pelo método de previsão de flexibilidade Karpuss & Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, e em que a referida proteina de fusão se liga ao VEGF quando multimerizada.

Noutros aspectos, a presente invenção oferece uma molécula de ácido nucleico, que codifica a proteina de fusão da presente invenção; um vector contendo a molécula de ácido nucleico; uma célula de mamifero contendo a molécula de ácido nucleico; bem como um método in vitro incluindo o fornecimento de molécula de ácido nucleico a uma célula de mamifero isolada para formar uma célula que expressa a proteina de fusão.

Noutros aspectos, a presente invenção fornece a proteina de fusão, o ácido nucleico, o vector ou a célula de mamífero da presente invenção para uso no tratamento de um mamífero. Numa das modalidades, o mamífero apresenta degeneração macular relacionada com a idade (exsudativa) ou retinopatia diabética proliferativa. Noutra modalidade, o mamífero apresenta cancro. Noutra modalidade, o mamífero apresenta artrite reumatóide. Noutra modalidade, o mamífero apresenta asma. Noutra modalidade, o mamífero apresenta osteoartrite.

Os aspectos e modalidades suplementares da presente 7 invenção são estabelecidos nas reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1. Região flexivel do ligante 9-Gly na construção D2-9Gly-Fc. A flexibilidade relativa prevista pelo método de Carpus and Schultz (1985) mostra o ligante da poliglicina 9-mer (9-Gly) (aa 94 a 103) na proteina D2-9Gly-Fc como uma região com maior flexibilidade que a média (>1) em comparação com a construção D2-Fc, que não contém o ligante 9-Gly. Ambas as proteínas de fusão contêm sequências de aminoácidos idênticas protegidas por caixas: sp - peptídeo sinal (aa -24 a -1) , domínio 2 do Flt-1 (aa 1 a 93) e resíduos IgGl-Fc (244 aa) . A seta representa o sítio de clivagem da peptidase sinal conforme previsto através do programa SignalP V2.0 (Nielsen et al., 1997).

Fig. 2. Atividade biológica de D2-901y-Fc vs. D2-Fc. Células 293 foram cultivadas em meio deficiente (M199 + 5% FCS) e transfectadas com plasmídeos contendo cassetes de expressão D29Gly-Fc e D2-Fc sob o controlo do promotor de CMV. O meio condicionado (CM) foi colectado após 72 horas. As HUVECs foram cultivadas em placas de 96 poços (2E3 células/poço) em meio deficiente + VEGF (10 ng/mL), e 50 ul de CM, juntamente com VEGF (10 ng/mL) foi adicionado 24 horas depois. Os controlos (+/- VEGF) foram incubados com CM do controlo do transfecção do plasmídeo pEGFP (Clontech; o pEGFP contém um variante deslocado para o vermelho ("red-shifted") da proteína fluorescente verde (GFP) em estado natural, que foi optimizada para uma maior fluorescência e uma maior expressão em células de mamíferos) . O controlo positivo foi tratado com 50 ng de proteína recombinante Flt-I-IgG (R&D Systems). As HUVECs foram submetidas ao ensaio de proliferação 3 dias após o tratamento com o 8 reagente CellTiter 96® AQueous (Promega) . Os dados representam os meios dos valores médios de OD490 de duas experiências submetidas ao ensaio em triplicata.

Fig. 3. Análise Western Blot de D2-9Gly-Fc e D2-Fc. A dimensão das proteinas D2-9Gly-Fc e D2-Fc aparenta ser duas vezes maior durante o processo de migração em gel não redutor em comparação com a migração em gel redutor. As proteinas foram carregadas no meio condicionado no seguimento da transfecção de células 293 de plasmideos expressando D2-9Gly-Fc e D2-Fc foram separadas por electroforese SDS e transferidas para a membrana de PVDF. 0 Western Blot foi examinado com os anticorpos anti-IgGl Fc de cabra anti-humano e IgG-HRP de coelho anti-cabra.

Fig. 4. Proteinas hibridas sFlt-1 contendo o ligante 9Gly e 0 VEGF Ex3. Comparação da estrutura de D2-9Gly-Ex3/CH3 com proteinas previamente construídas. Todas as três proteinas contêm sequência de aminoácidos idênticas para o dominio 2 do Flt-1, constituídas por 24 para o peptídeo sinal do Flt- 1 e 93 para o domínio 2 do Flt-1. 0 D2-9Gly-Ex3/CH3 contém 9 do ligante 9Gly, 14 do VEGF Ex3 e 120 da região CH3 da cadeia pesada humana IgGl Fc.

Fig. 5. Atividade biológica de D2-9Gly-Ex3/CH3 vs. D2-9Gly-Fc. A proteína D2-9GlyEx3/CH3, em que o domínio 2 é ligado à região CH3 por meio do ligante 9Gly e do VEGF Ex 3, também inibe de forma eficiente a proliferação dos HUVECs dependentes do VEGF em comparação com as proteínas de controlo D2-9Gly-Fc e D2-Fc. Utilizaram-se 50 ng do recombinante Flt-1-IgG (R&D Systems) para controlo.

Fig. 6. Ensaio de proliferação das HUVECs comparando a atividade da proteína D2-(Gly4Ser) 3-Fc com D2-9Gly-Fc e D2-9Gly-Ex3/CH3. 9

Fig. 7. Proteínas do Western Blot. (em gel redutor e não redutor) no meio condicionado de células 293 transfectadas (15 ul de CM) com plasmídeos expressando proteínas (1): D2-9Gly-Fc; (2): D2-(G4S)3-Fc e (3) - EGFP foram separadas por electroforese SDS e transferidas para a membrana de PVDF. 0 Western Blot foi examinado com os anticorpos IgGl Fc de cabra anti-humano e IgG-HRP de coelho anti-cabra.

Fig. 8. Combinações de proteínas com/sem ligante 901y ou VEGF Ex3. Comparação de estrutura de três proteínas novas com ou sem ligante 9Gly e/ou VEGF Ex3, D2-9Gly-CH3, D2-CH3 e D2-Ex3/CH3.

Fig. 9. Ensaio de proliferação das HUVECs com as construções do Flt-1(D2) contendo combinações de 9Gly, Ex3 e CH3. 0 meio condicionado das células 293 (5 ul) contendo proteínas D2Ex3/CH3, D2-901y-CH3 e D2-CH3 foi comparado com D2-9Gly-Fc e D2-9GlyEx3/CH3.

Fig. 10. As células 293 do Western Blot foram transfectadas com plasmídeos expressando: (1) D29Gly-Fc; (2) D2-901y-C113 (52/26 kDa); e (3) D2-CH3 (50/25 kDa). As proteínas do meio condicionado das células 293 (15 ul de CM não redutor e/ou redutor) foram separadas por electroforese SDS e transferidas para a membrana de PVDF. O Western Blot foi examinado com o conjugado anti-humano VEGF-R1 HRP (R&D Systems).

Fig. 11. Ensaio de ligação do VEGF "in vitro". O meio condicionado das células 293 contendo concentrações conhecidas dos receptores solúveis de controlo D2-9Gly-Fc e Flt-1 D(1-3) (variando entre concentrações de 0,29 - 150 pM) foi diluído em série e misturado a 10 pM de VEGF. A 10 quantidade de VEGF livre foi então medida por meio do teste ELISA. D2-9Gly-Fc liga o VEGF com maior afinidade em comparação com as outras construções, "n" representa o número de experiências independentes (transfecção e ensaio de ligação).

Fig. 12. A cinética de ligação das construções do solúvel Flt-1 foi medida por ressonância de plásmons de superfície com um instrumento BlAcore. As construções do sFlt-1 foram imobilizadas num sensor de chip, e o VEGF165 foi injectado em concentrações que variam entre 0,2 e 15 nM. Os sensorgramas foram avaliados através do programa de avaliação BIA, determinaram-se as constantes de velocidade Ka e Kd, e calculou-se a constante de dissociação (KD) a partir da razão entre Kd/Ka = KD. O menor valor de KD significa melhor afinidade.

Fig. 13A-13C. A Fig. 13A mostra os níveis de expressão das construções do Flt-1 contendo diversos ligantes. A Fig. 13B mostra a dimerização ou multimerização das construções do Flt-1 contendo diversos ligantes, bem como uma molécula CH3 do Fc do IgGl . A diferença entre as condições reduzidas e não reduzidas indica que as proteínas se multimerizaram. A Fig. 13C mostra a bioatividade inibitória das construções indicadas do Flt-1, presentes no meio de condição de um ensaio de proliferação da HUVEC com a presença do VEGF. Cada uma das construções demonstrou atividade inibitória alcançando os níveis de proliferação da HUVEC na ausência do VEGF.

Fig. 14. Utilizando retinopatia induzida por oxigénio em modelos murinos (01R) de neovascularização da retina (NV) , administrou-se uma das construções do Flt-1 nos olhos de um rato, e estabeleceu-se a neovascularização. Os ratos foram 11 expostos a condições hiperóxicas. 0 número de eventos neovasculares foi determinado nos olhos tratados em comparação com os eventos nos olhos não tratados dos mesmos animais. 0 animal era considerado "respondente" em caso de redução superior a 50% nos eventos neovasculares.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Trata-se de uma descoberta dos presentes inventores que prova que um dominio semelhante a Ig2 do Flt-1 sem os dominios 1 e 3 tem capacidade de ligar de forma eficiente o VEGF e de inibir a proliferação de células endoteliais dependentes do VEGF. O dominio 2 pode ser covalentemente ligado a um dominio de multimerização por meio de um ligante. Geralmente, os ligantes são cadeias de polipeptideos. O comprimento da cadeia pode ser de 6, 7, 9, 11, 13, 15 ou mais resíduos de aminoácidos, mas, em geral, situa-se entre 5 e 25 resíduos. Dependendo do comprimento e da composição da cadeia lateral, um ligante poderá ter, mas não necessita de ter uma flexibilidade mais elevada do que a média. A flexibilidade pode ser calculada por meio de algoritmos conhecidos. Os domínios de multimerização são as porções de proteínas multiméricas que promovem a associação de sub-unidades para formar, por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros etc. Proteínas recombinantes apropriadas para uma ligação eficiente do VEGF e/ou inibir a proliferação de células endoteliais dependentes do VEGF são seleccionadas no grupo constituído pela SEQ ID: 2, 8, 21, 23 e 25.

Além disso, os inventores descobriram que os domínios de multimerização e os ligantes podem ser utilizados com várias outras proteínas ou porções de proteínas para induzir a multimerização. Essas proteínas podem ser as que 12 se ligam ao ligante ou ao receptor apenas quando sofrem multimerização, ou podem ser aquelas cuja afinidade de ligação aumenta com a multimerização. As proteinas adequadas para a multimerização contêm receptores extracelulares (incluindo porções das mesmas), regiões variáveis de anticorpo, citocinas, quimiocinas e factores de crescimento. As proteinas adequadas contêm receptores tirosina-quinase e receptores serina-treonina quinase. Os exemplos específicos de receptores extracelulares incluem o receptor EGFR, receptores acoplados às proteinas G, o receptor FGFR, receptores Fc, receptores de células T, etc. Os exemplos de regiões variáveis de anticorpo incluem Fab, F(ab')2 e ScFv. Os exemplos de citocinas incluem GM-CSF, IL-la, 1L-113, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, II-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, 11-18, IL-21, IL-23, IFN-a, IFN-0, MlP-la, M1P-13, TGF-13, TNFa e T'NF-13. Os exemplos de quimiocinas incluem BCA-1 / BLC, BRAK, quimiocina CC-2, CTACK, CXCL-16, ELC, ΕΝΑ, ENA-70, ENA-74, ENA-78, Eotaxin, Exodus-2, Fractalquina, GCP-2, GRO, GRO alfa (MGSA), GRO-beta, GRO-gama, HCC-1, HCC-4, 1-309, IP-10, 1-TAC, LAG-1, LD78-beta, LEC / NCC-4, LL-37, Linfotactina, MCP, MCAF (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC, MDC, MDC-2, MDC-4, MEC / CCL28, MIG, NIP, MEP-1 alfa, MIP-1 beta, mrp-l delta, MIP-3 / MPIF-1, MIP-3 alfa, MEP-3 beta, MIP-4 (PARC), MIP-5, NAP-2, PARC, PF-4, RANTES, RANTES-2, SDF-1 alfa, SDF-1 beta, TARC e TECK. Os exemplos de factores de crescimento incluem anfiregulina humana, proteinas angiogénicas humanas, ACE humano, angiogenina humana, angiopoietina humana, angiostatina humana, Betacelulina humana, BMP humana, BMP-13 / CDMP-2 humana, H11111911 BMP-14 /CDMP-1, BMP-2 humana, BMP-3 humana, BMP-4 humana, BMP-5 humana, BMP-6 humana, BMP-7 humana, BMP-8 humana, BMP-9 humana, factores de estimulação de colónias humanas, ligante flt3 humano, GCSF humano, GM-CSF humano, M-CSF humano, factor de crescimento 13 do tecido conectivo humano, Cripto-1 humano, crípticos humanos, ECGF humano, EGF humano, EG-VEGF humano, eritropoietina humana, fetuina humana, FGF humano, FGF-1 humano, FGF-10 humano, FGF-16 humano, FGF-17 humano, FGF-18 humano, FGF-19 humano, FGF-2 humano, FGF-20 humano, FGF-3 humano, FGF-4 humano, FGF-5 humano, FGF-6 humano, FGF-7 / KGF humano, FGF-8 humano, FGF-9 humano, aFGF humano, bFGF humano, GDF-11 humano, GDF-15 humano, factor de libertação do hormona de crescimento humano, HB-EGF humano, heregulina humana, HOF humano, MT humano, IGF-1 humano, IGF-II humano, inibina humana, KGF humano, LCGF humano, LIF humano, diversos factores de crescimento humano, MSP humano, miostatina humana, propeptídio-miostatina humana, factor de crescimento do nervo humano, oncostatina M humana, PD-ECOF humano, PDGF humano, PDGF humano (homodímero AA) , PDGF humano (heterodimero AB), PDGF humano (homodímero BB), PDGF humano (homodímero CC) , PIGF humano, PIGF humano, PIGF-1 humano, PIGF-2 humano, SCF humano, SMDF humano, factor de crescimento de células-tronco hematopoiéticas humano, SCGF-alfa humano, SCGF-beta humano, trombopoietina humana, factor de crescimento transformante humano, TGF-alfa humano, TGF-beta humano e VEGF humano. A proteína receptora Flt-1 possui uma porção extracelular com sete domínios de Ig. Estes localizam-se nos números de resíduos 32...123, 151...214, 230...327, 335...421, 428...553, 556...654 e 661...747 do número de acesso GenBank. P17948, consultar também a SEQ ID: 15. Os números de resíduos 1-26 possuem uma sequência sinal. A proteína Flt-1 é codificada pela sequência de ADN mostrada no número de acesso GenBank. NM_002019 (SEQ ID: 14).

Os domínios de multimerização que podem ser utilizados de acordo com a presente divulgação são conhecidos pelos 14

especialistas. Podem ser utilizadas sequências da porção do Fc de IgGl ou de IgG2 da cadeia pesada gama, como por exemplo o dominio CH3 isolado (aa 371-477) ou ambos os dominios CH2 e CH3 (aa 247-477) . A porção do Fc das moléculas de Ig é a obtida por meio da clivagem das moléculas de anticorpos completas através da utilização da enzima papaína. Podem ser utilizados outros meios para obtenção dessas porções. Para a sequência de proteina da cadeia pesada gama de IgGI, consulte o número de acesso GenBank Y14737 e a SEQ ID: 10. Podem ser utilizadas outras regiões do Fc, por exemplo a partir de outros tipos de IgG e de anticorpos IgA, IgD ou IgE. Pode também ser utilizada a região de multimerização do VEGF. Demonstra-se uma sequência de ADN realizando a codificação do VEGF no número de acesso GenBank. NM_003376 e SEQ ID: 11. Demonstra-se uma sequência de aminoácidos do VEGF no número de acesso GenBank. CAC19513 e SEQ ID: 12. A região de multimerização do VEGF (SEQ NO: 13), codificada pelo éxon 3 do VEGF (VEGF

Ex3), inclui, pelo menos, os resíduos de aminoácidos 7588 da proteina do VEGF (SEQ ID: 12) • Os domínios de multimerização irão produzir pelo menos 5 %, 10 %, 20 % , 30 %, 40 %, 50 % , 60 %, 75 %, 80 %, 85 % ’ ! 90 % ou 95 % das proteínas de fusão monoméricas para migrar em gel de poliacrilamida não desnaturante a uma taxa adequada para um multimero. A glicosilação pode afetar a migração de uma proteina num gel. Embora algumas sequências sejam mostradas aqui, podem ser utilizadas outras variantes (por exemplo, variantes alélicas). Em termos gerais, essas variantes têm pelo menos 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência divulgada. A multimerização pode ser ensaiada, por exemplo, em gel redutor e não redutor, conforme se demonstra na presente divulgação. A multimerização também pode ser ensaiada para 15 a detecção de aumento de afinidade de ligação do ligante/receptor de uma proteína. Os ensaios BiaCore™ de ressonância de plásmons de superfície podem ser utilizados para esses fins. Estes ensaios detectam alterações na massa através da medição de alterações no índice de refracção numa camada aquosa próxima da superfície de um sensor de chip. Qualquer método conhecido pode ser utilizado para detectar a multimerização.

Os grupos ligantes, segundo a presente divulgação, podem ser compostas, por exemplo, por 5-100, 5-75, 5-50, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10 ou 5-9 resíduos de aminoácidos. Exemplos de ligantes eficientes incluem: gly9 (SEQ ID: 27), glu9 (SEQ ID: 28), ser9 (SEQ ID: 29), gly5cyspro2Cys (SEQ ID: 30), (gly4ser)3 (SEQ ID: 31),

SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID: 32) , Pro Ser Cys Vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEQ ID: 13),. Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gin Lys (SEQ ID: 26) e G/y9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID: 34). Outros polipeptídeos ligantes que podem ser utilizados incluem uma poliglicina com comprimentos diferentes, incluindo os resíduos 5, 7, or 30. Além disso, podem ser utilizadas outras porções de Flt-1 como um ligante, por exemplo, o domínio 3 de FR-1. Consultar a SEQ ID: 15. Os grupos ligantes também podem ser produzidas a partir de outros polímeros, como o polietilenoglicol. Estes ligantes podem conter 10-1000, 10-500, 10-250, 10-100 ou 10-50 unidades de monómero etilenoglicol. Os polímeros adequados devem ter um comprimento semelhante à extensão atribuída aos resíduos de aminoácidos. Um polímero de comprimento característico deve apresentar um espaçamento a partir de cerca de 10-25 angstroms.

Independentemente dos aspectos gerais da divulgação acima 16 mencionada, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z, em que: X compreende uma porção de um receptor de VEGF; Y é uma porção ligante e Z é um dominio de multimerização, em que a porção ligante Y é um polipéptido de 5-50 resíduos de aminoácidos que têm uma flexibilidade maior do que média conforme determinado pelo método de previsão de flexibilidade Karpuss & Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, e em que a referida proteína de fusão se liga ao VEGF quando multimerizada.

As proteínas de fusão, de acordo com a presente divulgação, incluindo as proteínas de fusão da presente invenção, podem ser produzidas através de quaisquer meios conhecidos na técnica. Embora essas proteínas possam ser produzidas sinteticamente, ou através da ligação de suas porções, a produção recombinante também pode ser usada. Uma sequência de gene fundido pode ser produzida através das técnicas padrão de ADN recombinante. A sequência de gene fundido pode ser inserida num vector, por exemplo, num vector virai ou plasmidial, para efectuar a sua replicação. Uma sequência promotora, que é funcional na célula receptora final, pode ser introduzida na orientação reversa da sequência de gene fundido. Os promotores utilizados podem ser constitutivos, induzíveis ou reprimíveis. Os exemplos de cada tipo são conhecidos pelos especialistas. O vector pode ser introduzido numa célula hospedeira ou num mamífero através de qualaquer meio conhecido na técnica. Os vectores apropriados para uso incluem adenovírus, adenovírus associado, retrovírus, lentivírus e plasmídeos. Se o vector se encontra num vector virai e este foi empacotado, os vírions podem ser utilizados para infectar células. Caso seja utilizado o ADN nu, podem ser utilizados os procedimentos de transfecção ou transformação adequados para as células hospedeiras específicas. As formulações do 17 ADN nu que utilizam polímeros, lipossomas ou nanoesferas podem ser utilizadas para o fornecimento do gene de fusão. As células que podem ser transformadas ou transfectadas por meio de construções recombinantes, de acordo com a invenção, podem ser quaisquer células que sejam convenientes para o técnico. Os exemplos de tipos de células que podem ser utilizados incluem bactérias, germes, insectos e células de mamíferos. Nas células de mamíferos, poderão ser seleccionadas células de variados tipos de tecidos de acordo com a conveniência. Os exemplos de células que podem ser utilizadas são fibroblastos, hepatócitos, células endoteliais, células-tronco, células hematopoiéticas, células epiteliais, miócitos, células neuronais e queratinócitos. Essas células podem ser utilizadas para produzir proteínas in vitro, ou podem ser fornecidas a mamíferos, incluindo humanos, para produzir as proteínas codificadas in vivo. Esse meio de fornecimento é uma alternativa ao fornecimento de ácido nucleico, vector virai e proteína de fusão para um mamífero.

As composições de ácidos proteicos ou nucleicos podem encontrar-se em transportadores, como tampões, transportadores aquosos e lipofílicos, veículos estéreis ou não estéreis, pirogénicos ou não pirogénicos. Os veículos não pirogénicos são úteis para as formulações injectáveis. As formulações podem ser líquidas ou sólidas, a exemplo das formulações liofilizadas. As formulações também podem ser administradas sob a forma de aerossóis. As composições podem conter uma ou mais proteínas de fusão, um ou mais ácidos nucleicos, ou ambos, simultaneamente. As proteínas de fusão e/ou ácidos nucleicos numa composição podem ser homogéneos, dando origem a homomultímeros, ou podem ser heterogéneas, dando origem a heteromultímeros. No caso dos heteromultímeros, geralmente o grupo X varia entre as 18 proteínas de fusão, mas o grupo Z permanece inalterado.

As proteínas de fusão podem ser fornecidas a uma célula hospedeira ou a um mamífero hospedeiro através de qualquer um dos meios conhecidos na técnica. Podem ser fornecidas proteínas podem à célula ou ao hospedeiro. Podem ser administrados ácidos nucleicos à célula ou ao hospedeiro. Células transformadas ou transfectadas podem ser administradas à célula ou ao hospedeiro. Em último caso, espera-se que as células com o mesmo fundamento genético reduzam a rejeição de transplante.

As células apropriadas para serem fornecidas a animais mamíferos hospedeiros incluem quaisquer tipos de células de mamíferos de qualquer órgão, tumor ou linha celular. Por exemplo, podem ser utilizadas células de humanos, murinos, cabras, ovinos, bovinos, cães, gatos e suínos. Tipos de células adequadas para serem utilizadas incluem, sem limitação, fibroblastos, hepatócitos, células endoteliais, queratinócitos, células hematopoiéticas, células epiteliais, miócitos, células neuronais e células-tronco.

Os meios de fornecimento de proteínas de fusão ou ácidos nucleicos que codificam proteínas de fusão incluem o fornecimento de células que expressam as proteínas de fusão, o fornecimento das proteínas de fusão e o fornecimento de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão. As proteínas de fusão, células ou ácidos nucleicos podem ser fornecidos directamente ao órgão ou ao tumor desejado, por exemplo, por meio de injeção, cateterização ou endoscopia. Estes também podem ser administrados por via intravenosa, intrabronquial, intratumoral, intratecal, intramuscular, intraocular, tópica, subcutânea, transdermal ou por via oral.Os 19 pacientes com possibilidades de conseguir um tratamento eficiente incluem os que apresentam degeneração macular relacionada com a idade (exsudativa) retinopatia diabética proliferativa, artrite reumatoide, osteoartrite, uveite, asma e cancro. Os tratamentos melhorarão os sintomas e/ou os marcadores e/ou a gravidade da doença.

Podem ser ministrados ácidos nucleicos a mamíferos, e em particular, a humanos, em qualquer vector desejado. Estes compreendem vectores virais ou não virais, incluindo vectores adenovírus, vectores adenovírus associados, vectores retrovírus, vectores lentivírus e vectores plasmidiais. Exemplos de tipos de vírus incluem o HSV (vírus Herpes Simplex), o adenovírus, o AAV (adenovírus associado), o HIV (vírus da imunodeficiência humana), o BIV (vírus da imunodeficiência bovina) e o MLV (vírus da leucemia murina). Podem ser administrados ácidos nucleicos em qualquer formato desejado para produzir níveis de fornecimento suficientemente eficientes, inclusive em partículas, lipossomas, nanopartículas, e complexados com polímeros.

Podem ser utilizadas combinações de tratamentos com proteína e ácido nucleico. Por exemplo, pode ser administrada a um paciente uma proteína de fusão, de acordo com a presente divulgação, ou uma proteína de fusão, de acordo com a presente invenção. Caso se observe uma resposta favorável, poderá ser administrada uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão para um efeito a longo prazo. Em alternativa, a proteína e o ácido nucleico podem ser administrados simultânea ou quase simultaneamente. Noutra alternativa, um anticorpo ou uma proteína de fusão de um ligante pode ser administrado concomitantemente ou na sequência da administração de um 20 anticorpo ou de um antígeno de proteína de um receptor. Outra opção emprega uma combinação de ácidos nucleicos, onde um deles codifica um anticorpo e o outro codifica uma proteína de fusão. Alguns anticorpos que podem ser empregadas em combinação com as construções Fit-1 da presente divulgação, por exemplo, em combinação com as construções Fit-1 da presente invenção (na forma de proteína ou ácido nucleico), são o bevacizumab e ranibizumab, ambos aplicados directamente ao VEGF. Esses anticorpos são particularmente eficientes no tratamento de cancro e degeneração macular, respectivamente. A prática da presente divulgação, incluindo a prática da presente invenção, emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (bem como técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que fazem parte da técnica. Essas técnicas são explicadas por completo na literatura da área, como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook et al, 1989); Current Protocole In

Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987);

Oligonucleotide Synthesis (MI. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.L Freshney, ed., 1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook Of Experimental Immunology (D.M. Wei & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors For Mamiferoian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols In Immunology (J.E. Coligan et al. , eds., 1991); Antibodies: A Laboratory

Manual (E. Harlow and D. Lane eds. (1988)); and PCR 2: A

Practical Approach (Mi. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)). 0 veículo de fornecimento genético consiste em qualquer 21 molécula com capacidade para transportar polinucleotideos inseridos numa célula hospedeira. Os veiculos de fornecimento genético incluem lipossomos, polímeros biocompatíveis, incluindo polímeros naturais e sintéticos, lipoproteínas, polipeptídeos e polissacarídeos, lipopolissacarídeos, envelopes virais artificiais, partículas metálicas, além de bactérias, vírus, como o baculovírus, adenovírus e retrovírus, bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vectores fúngicos e outros veículos de recombinação tipicamente utilizados na técnica, que têm sido descritos na expressão de uma variedade de hospedeiras eucarióticas e procarióticas, e podem ser utilizados na terapia genética, bem como na expressão de proteínas simples.

Fornecimento genético, transferência genética, entre outros, conforme aqui utilizado, são termos que se referem à introdução de um polinucleotídeo exógeno (ocasionalmente referido como um "transgene") numa célula hospedeira, independente do método usado para essa introdução. Esses métodos incluem uma variedade de técnicas conhecidas, como a transferência genética mediada por vectores (por exemplo, por infecção/transfeção virai, ou por diversos outros complexos de fornecimento genético com base em proteínas ou lipídios), bem como técnicas para facilitar o fornecimento de polinucleotideos "nus" (como a eletroporação, o "gene gun" (biolística), e várias outras técnicas utilizadas para a introdução de polinucleotideos). 0 polinucleotídeo introduzido pode ser estável ou transitoriamente mantido na célula hospedeira. A manutenção estável geralmente exige que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se combine num "replicon" da célula hospedeira, como um "replicon" extracromossómico (por exemplo, um plasmídeo) ou um 22 cromossoma nuclear ou mitocondrial. Inúmeros vectores são conhecidos pela sua capacidade de mediar a transferência de genes para células de mamiferos, conforme se conhece na técnica e se descreve na presente divulgação.. 0 polinucleotideo exógeno é inserido num vector, como um adenovirus, um adenovirus parcialmente eliminado, um adenovirus completamente eliminado, um adenovirus associado (AAV), um retrovirus, um lentivirus, um plasmideo "nu", um complexo de plasmídeos/lipossomas etc., para o fornecimento ao hospedeiro por via intravenosa, intramuscular, intraportal ou outra via de administração. Os vectores de expressão que podem ser utilizados em métodos e composições da presente divulgação, por exemplo, nas composições da presente invenção, incluem, por exemplo, vectores virais. Um dos métodos de administração de terapia genética mais utilizados, tanto "in vivo" como "ex vivo", compreende o uso de vectores virais para o fornecimento do gene. São conhecidas muitas espécies de virus, e muitas delas foram estudadas para os propósitos da terapia genética. Os vectores virais frequentemente utilizados incluem os derivados de adenovirus, adenovirus associados (AAV) e retrovirus, incluindo lentivirus, como o virus da imunodeficiência humana (HIV). 0 adenovirus é um virus de ADN nuclear e não envelopado com um genoma de aproximadamente 36 kb, que foi bem caracterizado por meio de estudos em genética clássica e biologia molecular (Hurwitz, M.S., Adenoviruses Virology, 314 edition, Fields et al., eds., Raven Press, New York, 1996; Hitt, M.M. et al., Adenovirus Vectors, The Development of Human Gene Therapy, Friedman, T. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1999). Os genes virais são classificados em unidades transcricionais 23 precoces (designadas E1-E4) e tardias (designadas L1-L5), em referência à geração de duas classes temporais de proteínas virais. A demarcação desses eventos compreende a replicação do ADN virai. Os adenovírus humanos são divididos em inúmeros sorotipos (aproximadamente 47, numerados de acordo e classificados em 6 grupos: A, B, C, D, E e F) , com base em propriedades que incluem hemaglutinação de glóbulos vermelhos, oncogenicidade, composições e homologias de aminoácidos de proteínas e de ADN, bem como relações antigénicas.

Os vectores adenovirais recombinantes oferecem inúmeras vantagens enquanto veículos de fornecimento genético, incluindo tropismo em células divisoras e não divisoras, potencial patogénico mínimo, capacidade de replicação em "titer" elevado para a preparação de populações de vectores, e potencial para o transporte de grandes inserções (Berkner, KL., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:39-66, 1992; Jolly, D., Câncer Gene Therapy 1:51-64 1994). Produziram-se vectores adenovirais com deleções de várias sequências de genes adenovirais, como vectores pseudoadenovirais (PAVs) e adenovírus parcialmente sumprimidos (denominados de "DeAd") para explorar os aspectos desejáveis do adenovírus que o tornam um veículo apropriado para o fornecimento de ácidos nucleicos para células receptoras.

Em particular, os vectores pseudoadenovirais (PAVs), também conhecidos como adenovírus do tipo "gutless" ou vectores mini-adenovirais, são vectores adenovirais derivados do genoma de um adenovírus que contém sequências mínimas de nucleotídeos com interacções intramoleculares necessárias para a replicação e o empacotamento do genoma do vector, e que podem conter um ou mais transgenes (Consultar U.S. 24

Patent No. 5,882,877, que aborda os vectores pseudoadenovirais (PAV) e os seus métodos de produção). Os PAVs foram produzidos para explorar os aspectos desejáveis do adenovirus que o tornam um veiculo apropriado para o fornecimento genético. Enquanto os vectores adenovirais podem, em termos gerais, transportar inserções de até 8kb em tamanho por meio da deleção de reqiões que são dispensáveis ao crescimento virai, a capacidade máxima de transporte pode ser alcançada pelo uso de vectores adenovirais contendo as deleções da maioria das sequências de códigos virais, inclusive as dos PAVs. Consultar U.S. de Gregory et al.; Kochanek et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:5731-5736, 1996; Parks et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:13565-13570, 1996; Lieber et al., J. ViraL 70:8944-8960, 1996; Fisher et aL, Virology 217:11-22, 1996; 5,670,488; PCT Publication No. W096/33280, published October 24, 1996; PCT Publication No. W096/40955, published December 19, 1996; PCT. Publication No. W097/25446, published July 19, 1997; PCT Publication No. W095/29993, published November 9, 1995; PCT Publication No. W097/00326, published January 3, 1997; Morral et al., Hunt. Gene Ther. 10:2709-2716,1998. Os PAVs, que podem acomodar até 36 kb de ácido nucleico externo, aproximadamente, apresentam vantagens, visto que a capacidade de transporte do vector é aumentada, enquanto o potencial de resposta imunológica do hospedeiro ao vector ou a geração de virus com capacidade de replicação é reduzido. Os vectores PAV contêm a repetição terminal invertida (ITR) 5' e as sequências de nucleotideos de ITR 3' que contêm a origem da replicação, bem como a sequência de nucleotideos com interações intramoleculares necessária para o empacotamento do genoma do PAV, e podem acomodar um ou mais transgenes com elementos regulatórios apropriados, por exemplo, promotores, potencializadores etc. 25

De outro modo, os vectores adenovirais parcialmente eliminados produzem um vector adenoviral parcialmente eliminado (designado de "DeAd"), no qual a maior parte dos genes adenovirais precoces necessários para a replicação virai é eliminada do vector e inserida no cromossoma produtor de uma célula sob o controlo de um promotor condicional. Os genes adenovirais elimináveis que são inseridos na célula produtora podem incluir E1A/E1B, E2, E4 (apenas 0RF6 e ORF6/7 necessitam de ser inseridos na célula), pIX e pNa2. E3 pode também ser eliminado do vector, mas, visto não ser necessário para a produção do vector, pode ser omitido da célula produtora. Os genes adenovirais tardios, geralmente sob o controlo do promotor tardio principal (MLP), estão presentes no vector, mas o MLP pode ser substituído por um promotor condicional.

Os promotores condicionais apropriados para o uso em vectores DeAd, bem como em linhas de células produtoras incluem os que apresentam as seguintes características: baixa expressão basal no estado não induzido, de forma a que os genes adenovirais citotóxicos ou citostáticos não sejam expressados em niveis prejudiciais à célula; e expressão de alto nivel no estado induzido, de froma a que se produzam as quantidade suficientes de proteínas virais para oferecer suporte à replicação e ao conjunto de vectores. Promotores condicionais apropriados para uso em vectores DeAd e em linhas de células produtoras incluem o sistema de controlo genético do dimerizador, com base nos agentes imunosupressores FK506 e rapamicina, o sistema de controlo genético da ecdisona e o sistema de controlo genético da tetraciclina. Também útil na presente divulgação, incluindo a presente invenção, é a tecnologia "GeneSwitch™" (Valentis, Inc., Woodlands, TX) , descrita em 26

Abruzzese et al., Hum. Gene Ther. 1999 10:1499-507. O sistema de expressão adenoviral parcialmente eliminado também é descrito em W099/57296. O adenovirus associado (AAV) é um ADN de parvovírus humano cujo genoma apresenta um tamanho de 4,6 kb. O genoma AAV contém dois genes principais: o gene "rep", que codifica as proteinas "rep" (Rep 78, Rep 68, Rep 52 e Rep 40) envolvidas na replicação, no resgate, na transcrição e na integração do AAV; e o gene "cap", que codifica as proteinas "cap" que formam a particula virai do AAV. O nome AAV é derivado da sua dependência do adenovirus ou outro virus auxiliar (por exemplo, o herpesvirus) para fornecer produtos genéticos essenciais que permitam que o AAV seja submetido a uma infecção produtiva, ou seja, que este se reproduza na célula hospedeira. Na ausência de virus auxiliares, o AAV integra-se na forma de um provírus no cromossoma da célula hospedeira, até que este seja resgatado por superinfecção da célula hospedeira com um virus auxiliar, geralmente um adenovirus (Muzyczka, Curr. Top. Micor. Immunol. 158:97-127, 1992). O interesse no AAV como vector de transferência genética é justificado pelas diversas caracteristicas exclusivas da sua biologia. Em ambas as extremidades do genoma AAV há uma sequência de nucleotideos conhecida como repetição terminal invertida (ITR), que contém as sequências de nucleotideos com interações intramoleculares necessárias para a replicação, o resgate, o empacotamento e a integração do virus. A função de integração da ITR mediada pela proteina "rep" em "trans" permite que o genoma AAV se integre num cromossoma celular após a infecção, na ausência de um virus auxiliar. Essa propriedade exclusiva do virus tem relevância para o uso do AAV na transferência genética, já 27 que permite a integração de um AAV recombinante contendo o gene de interesse no genoma celular. Portanto, a transformação genética estável, ideal para muitos dos objectivos da transferência genética, pode ser alcançada através da utilização de vectores rAAV. Além disso, o sitio de integração do AAV é bem estabecido e foi localizado no cromossoma 19 dos humanos (Kotin et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. 87:2211-2215, 1990). A previsão do sitio de integração reduz o risco de eventos de inserção aleatórios no genoma celular que possam activar ou desactivar genes hospedeiros, ou interromper sequências de códigos, consequências estas que podem limitar o uso de vectores cuja integração do AAV e remoção do gene na produção dos vectores rAAV pode resultar em padrões de integração alterados, que foram observados nos vectores rAAV (Ponnazhagan et aL, Hum Gene Ther. 8 :275-284, 1997) .

Existem outras vantagens no uso do AAV para a transferência genética. A gama de hospedeiros do AAV é extensa. Além disso, ao contrário dos retrovirus, o AAV pode infectar células quiescentes e células divisoras ao mesmo tempo. Além disso, o AAV não foi associado a doenças humanas, obviando muitas das questões que têm sido levantadas em relação aos vectores de transferência genética derivados de retrovirus.

As abordagens clássicas da geração de vectores rAAV recombinantes têm exigido a coordenação de uma série de eventos intracelulares: transfecção da célula hospedeira por meio do genoma de um vector rAAV contendo um transgene de interesse acompanhado pelas sequências AAV ITR; transfecção da célula hospedeira por meio de um plasmídeo codificando os genes das proteínas "rep" e "cap" do AAV que são necessárias in "trans"; e infecção da célula 28 transfectada por meio de um vírus auxiliar para satisfazer as funções auxiliares não-AAV necessárias em "trans" (Muzyczka, N., Curr. Top. Micor. ImmunoL 158:97-129, 1992). As proteínas adenovirais (ou outro vírus auxiliar) activam a transcrição do gene "rep" do AAV, e as proteínas "rep", por sua vez, activam a transcrição dos genes "cap" do AAV. As proteínas "cap", então, utilizam as sequências ITR para empacotar o genoma rAAV numa partícula virai rAAV. Portanto, a eficiência do empacotamento é determinada, em parte, pela disponibilidade de quantidades adequadas de proteínas estruturais, bem como pela acessibilidade de quaisquer sequências de empacotamento com atividade intracelular necessária ao genoma do vector rAAV.

Vetores retrovirais são parte de uma técnica comum de fornecimento genético (Miller, Nature (1992) 357:455-460). A capacidade dos vectores retrovirais fornecerem um gene de cópia única não reorganizado, numa ampla variedade de células somáticas de roedores, primatas e humanos torna os vectores retrovirais bem adaptados para a transferência de genes para uma célula.

Os retrovírus são vírus RNA, nos quais o genoma virai é o RNA. Quando uma célula hospedeira é infectada com um retrovírus, o RNA genómico sofre transcrição reversa num ADN intermediário, que é integrado de forma eficiente no ADN cromossómico das células infectadas. Esse ADN intermediário integrado é referido como provírus. A transcrição do provírus e do conjunto para o vírus infeccioso ocorre na presença de um vírus auxiliar adequado ou numa linha celular contendo sequências apropriadas que permitem a encapsidação sem a produção coincidente de um vírus auxiliar contaminante. Não é necessário um vírus auxiliar para a produção de retrovírus recombinantes, se as 29 sequências de encapsidação forem produzidas por meio da co-transfecção com vectores apropriados. 0 genoma retroviral e o ADN proviral possuem três genes: o "gag", o "pol" e o "env", que são acompanhados por duas sequências de repetição terminal invertida (LTR). 0 gene "gag" codifica as proteínas da estrutura interna (matriz, capsídeo e nucleocapsídeo); o gene "pol" codifica a ADN polimerase orientada por RNA (transcriptase reversa) e o gene "env" codifica as glicoproteínas do envelope virai. As LTRs 5' e 3' servem para promover a transcrição e a poliadenilação dos RNAs dos vírions. A LTR contém todas as outras sequências de interação intracelular necessárias para a replicação virai. Os lentivírus possuem genes adicionais incluindo "vit vpr", "tat", "rev", "vpu", "nef" e "vpx" (em HIV-1, HIV-2 e/ou SIV). Paralelamente à LTR 5' encontram-se as sequências necessárias para a transcrição reversa do genoma (o sítio de ligação primário tRNA) e para a encapsidação eficiente do RNA virai em partículas (o sítio do Psi). Se as sequências necessárias para a encapsidação (ou empacotamento do RNA retroviral em vírions infecciosos) estiverem ausentes no genoma virai, o resultado é um defeito intracelular que impede a encapsidação do RNA genómico. Entretanto, o mutante resultante é ainda capaz de conduzir a síntese de todas as proteínas dos vírions.

Lentiviroses são retrovírus complexos que, juntamente com os genes retrovirais comuns "gag", "pol" e "env", contêm outros genes com função regulatória ou estrutural. A elevada complexidade permite que o lentivírus module o seu ciclo vital, assim como no curso da infecção latente. Um lentivírus típico é o vírus da imunodeficiência humana (HIV) , o agente etiológico da AIDS. In vivo, o HIV pode 30 infectar de maneira terminal, diferentes células, que raramente se dividem, como os linfócitos e os macrófagos. In vitro, o HIV pode infectar culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos (MDM), bem como HeLa-Cd4 ou células linfóides T retidas no ciclo celular por meio do tratamento com afidicolina ou irradiação gama. A infecção das células depende de uma importação nuclear activa de complexos de pré-integração do HIV por meio dos poros nucleares das células de interesse. Isso ocorre através da interacção de determinantes moleculares múltiplos e parcialmente redundantes no complexo contendo os mecanismos de importação nuclear da célula de interesse. Determinantes identificados incluem um sinal de localização nuclear (NLS) funcional na proteína da matriz "gag" (MA), uma proteína cariofílica associada a vírions, um "vpr" e um resíduo de f osf otirosina C-terminal na proteína "gag MA". 0 uso de retrovírus na terapia genética é descrito, por exemplo, na patente US 6.013.516; e na Patente US 5.994.136.

Outros métodos para o fornecimento de ADN para células não utilizam vírus. Por exemplo, os compostos anfifílicos catiónicos podem ser utilizados para fornecer o ácido nucleico da presente divulgação, por exemplo, o ácido nucleico da presente invenção. Uma vez que os compostos produzidos para facilitar o fornecimento intracelular das moléculas biologicamente activas devem interagir, ao mesmo tempo, com ambientes polares e não polares (por exemplo, no interior ou na superfície da membrana plasmática, dos fluidos teciduais, dos compartimentos no interior da célula e da própria molécula biologicamente activa), estes são produzidos geralmente para conter domínios polares e não polares. Compostos contendo ambos os domínios podem ser designados como anfifílicos, e muitos lipídios e lipidios sintéticos que foram divulgados para facilitar o 31 fornecimento intracelular (para aplicação in vitro ou in vivo) atendem a esta definição. Uma classe particularmente importante de anfifilicos é a dos anfifilicos catiónicos. Em geral, os anfifilicos catiónicos possuem grupos polares capazes de ser carregados positivamente com ou por pH fisiológico, e esta propriedade é conhecida na técnica por ser importante para definir o modo como os anfifilicos interagem com os variados tipos de moléculas biologicamente activas (terapêuticas) incluindo, por exemplo, polinucleotideos carregados negativamente, como o ADN.

Divulga-se a utilização das composições que compreendem compostos anfifilicos catiónicos para a entrega de gene, por exemplo, Pedidos de Patente US 5.049.386; US 5.279.833; US 5.650.096; US 5.747.471; US 5.767.099; US 5.910.487; US 5.719.131; US 5.840.710; US 5.783.565; US 5.925.628; US 5.912.239; US 5.942.634; US 5.948.925; US 6.022.874; U.S. 5.994.317; U.S. 5.861.397; U.S. 5.952.916; U.S. 5.948.767; U.S. 5.939.401; e U.S. 5.935.936.

Além disso, o ácido nucleico da presente divulgação, por exemplo, ácido nucleico da presente invenção, pode ser entregue utilizando "ADN simples". Os métodos para entrega de sequência de ADN não-infeccioso, não-integrante que codifica um polipeptideo desejado ou peptídeo ligado de forma operável a um promotor, livre de associação com as proteínas que facilitam a transfecção, partículas virais, formulações lipossomais, lipídios carregados e fosfato de cálcio que precipitam agentes que são descritos na Patente US 5.580.859; U.S. 5.963.622; U.S. 5.910.488.

Também foram informados sistemas de transferência de genes que combinam componentes virais e não-virais. Cristiano et al. , (1993) Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:11548; Wu et al. 32 (1994) J. Biol. Chem. 269:11542; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. &L USA 89:6099; Yoshimura et al. (1993).1. Biol. Chem. 268:2300; Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8850; Kupfer et al. (1994) Human Gene Ther. 5:1437; e Gottschalk et a/. (1994) Gene Ther. 1:185. Na maioria dos casos, o adenovirus foi incorporado nos sistemas de entrega de genes para aproveitar as suas propriedades endossomolíticas. As combinações informadas de componentes virais e não-virais, em geral, envolvem a sua fixação covalente do adenovirus para o complexo da entrega de genes ou co-internalização de adenovirus não-ligados com lipidio catiônico: complexos de ADN.

Para a entrega de ADN e proteina para os olhos, administração será, em geral, local. Esta tem a vantagem de limitar a quantidade ADN que precisa ser administrada e limitar efeitos colaterais sistémicos. Muitos modos possíveis de entrega podem ser utilizados, incluindo, entre outros; administração tópica sobre a córnea de uma arma genética, injeção subconjuntival, injeção intracameral, colirio para a córnea, injeção na câmara anterior através do limbus temporal, intra aplicação de injeção, aplicação da córnea combinada com pulsos elétricos, injeção intracorneal, injeção sub-retiniana, injeção intravitreal e injeção intra-ocular. Em alternativa, as células podem ser transfectadas ou transduzidas ex vivo e entregues por implantação intraocular. Ver, Auricchio, Mol. Ther. 6: 490-494, 2002; Bennett, Nature Med. 2: 649-654, 1996; Borras, Experimental Eye Research 76: 643-652, 2003; Chaum, Survey of Ophthalmology 47: 449-469, 2002; Campochiaro, Expert Opinions in Biological Therapy 2: 537-544 (2002); Lai, Gene Therapy 9: 804 813, 2002; Pleyer, Progress in Retinal and Eye Research, 22: 277-293, 2003. 33

Os efeitos de diversos agentes terapêuticos propostos e das administrações podem ser testados em modelos de animais apropriados para doenças especificas. Por exemplo, a retinopatia da prematuridade pode ser testada num modelo de retinopatia induzida por oxigénio no rato, conforme se descreve em Smith, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 35: 101-111, 1994. A neovascularização coroidal induzida por laser num rato pode ser utilizada como modelo para neovascularização coroidal humana (CNV) que ocorre em doenças tais como degeneração macular relacionada com a idade. Tobe, American Journal of Pathology 153: 1641-1646, 1998. Outros modelos de CNV foram desenvolvidos em primatas, ratazanas, miniporcos e coelhos. Os modelos de ratos de degeneração macular relacionada com a idade foram desenvolvidos em ratos geneticamente deficientes. Os ratos deficientes na proteina-1 quimioatraentre de monócito ou no receptor-2 C-C quimiocina desenvolveram caracteristicas de degeneração macular relacionada com a idade. Ambati, Nature Med. 9: 1390-1397, 2003.

Embora a invenção seja descrita em relação aos exemplos específicos incluindo modos preferidos de execução da invenção, os especialistas considerarão que há diversas variações e permutações dos sistemas acima descritos e técnicas que se encontram no âmbito das reivindicações em anexo.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Foram gerados dois constructos: o primeiro, D2-9Gly-Fc, com um ligante poliglicina 9-mer (901y) e o segundo, D2-Fc, com a mesma sequência à excepção do ligante 9Gly (Fig. 1). 34

Analisámos as sequências de aminoácido de proteínas D2-9Gly-Fc e D2-Fc utilizando o Protein Analysis Toolbox do programa de análise de sequência MacVector 6.5.1. (IBI, New Haven, CT) . 0 ligante poliglicina 9-mer na sequência D2-9Gly-Fc foi identificado como uma região com uma flexibilidade superior à média pelo método de previsão de flexibilidade de Karpus and Schultz (1985) Naturwiss, 72: 212-213. Nenhuma região foi detectada na sequência D2-Fc sequência (Fig. 1).

Exemplo 2

Testámos um domínio semelhante a Ig2 da Flt-1 ligado à região IgGl Fc por um ligante poliglicina 9-mer flexível (D2-9Gly-Fc) . A proteína de fusão D2-9Gly-Fc é capaz de se ligar de forma eficiente ao VEGF e inibir a proliferação de células endoteliais na veia umbilical humana dependente de VEGF (HUVEC) . Ver Fig. 2. Em contraste, quando o domínio Ig-like 2 da Flt-1 está ligado directamente à cadeia pesada de IgGl (Fc) para formar D2-Fc, apenas se observou a ligação mínima VEGF. Ver a figura 2. Tanto a dimerização através de IgGl Fc e a inserção de um ligante flexível parecem facilitar a ligação de VEGF a Flt-1 domínio 2. A presença de formas diméricas tanto no D2-901y-Fc como no D2-Fc foram confirmadas pela análise de Western blot. Ver Fig. 3.

Exemplo 3

Uma injeção intravitreal do vector AAV (1 x 108 to 1 x 109 partículas num volume de 0,0005 mL) é administrada a ratos C57BL/6 recém-nascidos (PO) ou com 1 dia de vida (Pl) . A neovascularização retinal (NV) é induzida em ratos C57BL/6 através da exposição das crias P7 e as suas mães a 35 hiperoxia durante 5 dias. As crias são devolvidas ao meio ambiente em P12 e sofrem eutanásia em P17 (tempo de pico NV). (Smith LEH, Weslowski E, McLellan A, Kostyk SK, D'Amato R, Sullivan and D'Amore PA. Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse. Ihvest Opth Vs Sei. 1994;35:101-111.). Os olhos embebidos totalmente em parafina são seccionados a intervalos de 5 microns. 0 grau de NV é determinado pela contagem do número de núcleos de células endoteliais internas da membrana de limitação interna nas seções retiradas a cada 100 microns.

Coortes de animais tratados com a codificação de vectores de AAV para os agentes anti-angiogénicos são comparados com coortes tratados com a codificação de vectores para transgenes irrelevantes ou com vectores que não codificam um transgene. O número médio de núcleos de células endoteliais em cada olho tratado é comparado com o outro olho não tratado de cada animal.

Exemplo 4

Geração de D2-9Gly-Ex3/CH3 O dominio 2 de Flt-1 tem se mostrado essencial para a ligação de VEGFi65· No entanto, foi demonstrado que Flt-1 de Dominio 2 por si só foi incapaz de se ligar a VEGF A. (Davis-Smyth et al., 1996). O VEGF A, quando presente enquanto dimero, liga-se a Flt-1 através de residuos de ácido (aminoácidos 63 -67 da proteina madura) que permite que um mecanismo possivel para a dimerização induzida pelo ligante do receptor (Keyt et al., 1996).

Portanto, a dimerização de dominio 2 do Flt-1 foi utilizada 36 como uma estratégia para restabelecer a ligação de dominio 2 de Flt-1 e VEGF A. A fusão com um fragmento de IgO de cadeia pesada pode ser utilizada para a dimerização de proteínas (Davis-Smyth et al., 1996). Aqui demonstramos que aminoácidos 75-88 (ou seja, PSCVPLMRCGGCCN; SEQ ID N°: 13) do VEGF-A (SEQ ID N°: 12) aumentaram a atividade biológica de proteínas híbridas sFlt-1.

Inicialmente, três proteínas híbridas foram projectadas: D2-9Gly-Fc, D2-Fc e D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 4). Todas as três proteínas híbridas contêm o mesmo Flt-1 de domínio D2 como D2-9Gly-Fc. Nenhuma ligação do VEGF foi observada com D2-Fc, que não contém o ligante poliglicina 9-mer (9Gly). A terceira proteína, D2-9Gly-Ex3/CH3, contém o ligante poliglicina 9-mer (9Gly) e o domínio de multimerização de VEGF (aa PSCVPLMRCGGCCN, SEQ ID N° : 13; Ex3 VEGF), mas também contém a região CH3 de cadeia pesada humana IgGl Fe (aa 371-477 da SEQ ID N°: 10). A proteína D2-Fc não mostrou atividade inibitória eficiente no ensaio de proliferação HUVEC (Fig. 5) e, por implicação, não se liga a VEGFi6s eficiente. No entanto, a terceira proteína híbrida, D2-9Gly-Ex3/CH3, que compreende Domínio 2 de Flt-1 fundida à região CH3 através tanto do ligante 9Gly como na região de dimerização VEGF165 (Ex 3) , não demonstrou atividade inibitória num ensaio de proliferação HUVECs dependente de VEGF (Fig. 5) . Isto implica que esta proteína híbridase liga a VEGFi65 de forma eficiente.

Exemplo 5

Uso do ligante (Gly4Ser)3 em constructo Flt-1 D2 O uso de vários ligantes poliglicina foi descrito 37 previamente para a melhoria das características da proteína (Mouz et al., 1996; Qiu et al, 1998). Para os próximos constructos, usámos outro tipo de ligante, o 15-mer (Gly-Oly-Gly-Gly-Ser) 3 (Huston et al., 1988). A proteína D2-(Gly4Ser)3-Fc foi gerada e contém Domínio 2 de Flt-1, ligante (Gly4Ser)3 e a região Fc da cadeia pesada humana IgGl. D2-(Gly4Ser) 3-Fc foi caracterizadomais detalhadamente num ensaio de proliferação HUVECs. A atividade biológica de D2-(Gly4Ser) 3-Fc segundo a medição da inibição da proliferação de HUVEC era similar à de D2-9Gly-Fc e D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 6) . 0 construto D2- (0ly4Ser) 3-Fc foi caracterizado com mais detalhe por Western blot e comparado com D2-9Gly-Fc (Fig.9). Ambos os contrutos estão presentes sobretudo em formas dimeras e as formas monómeras foram detectadas após a separação de amostras reduzidas.

Exemplo 6

Papel de 9Gly ou construtos VEGF Ex3 em Flt-I (D2)

Para investigar o papel do ligante 9Gly ou a sequência de dimerização VEGF Ex3 na ligação VEGF do receptor solúvel, foram gerados três outros constructos: D2-9Gly-CH3, D2-CH3 e D2-Ex3/CH3 (Fig. 8) . Todos os três constructos foram gerados e como todos os constructos anteriores também foram colocados sob o controlo do promotor CMV. A sua atividade de bloqueio VEGF foi avaliada em ensaio de proliferação HUVECs (Fig. 9). 0 ensaio de proliferação HUVEC de proteínas contendo a região CH3 de IgGl demonstrou que D2-9Gly-CH3 (sem Ex3) e a 38 proteína D2-Ex3/CH3 (sem ligante 9Gly) foram semelhantes à força de bloqueio de VEGF relativamente à proteína D2-9Gly Ex3/CH3 parenteral. No entanto, a proteína D2-CH3 parecia ser o inibidor mais fraco de VEGF de todos eles (Fig. 9).

Os dados ELISA de Flt-1 de meios condicionados de 293 células transfectadas mostraram níveis de Flt-1 similares para D2-9Gly-Ex3/CH3, D2-9Gly-CH3 e D2-Ex3/CH3 D2 e CH3 (70-90 ng / ml) e um pouco mais elevados (-150 ng/ml) para a forma menos activa de D2-CH3. O Western blot de constructos D2-9Gly-CH3 e CH3-D2 (Fig.10) mostrou uma prevalência das formas dímeras em condições não reduzidas.

Exemplo 7 D2-9Gly-Fc liga-se a 'VEGF melhor do que todos os constructos O ensaio de ligação VEGF permite-nos comparar as afinidades de ligação de VEGF dos nossos receptores VEGF solúveis num sistema livre de células.

Em resumo, os meios condicionados contendo concentrações conhecidas de receptor solúvel (em concentrações que variam entre 0,29 e 150 pM) foram diluídos em série e misturados com 10 pM de VEGF. A quantidade de VEGF desligado foi então medida por ELISA. D2 9Gly Fc-VEGF liga-se a VEGF com maior afinidade às concentrações do receptor que variam de 0,001 a 0,2 pM de todos os outros constructos. D2-CH3 tem a menor afinidade para se ligar a VEGF (Fig. 11). 39

Referências

Davis-Smyth, et al., EMBO J., 15, 1996,4919

Huston, J. S., et al. (1991) Methods Eynymol. 203, 46-88

Huston, J. S., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 5879-5883.

Johnson, S., et al. (1991) Methods Enzymol. 203, 88-98

Karpus, P. A., et al. (1985) Naturwiss., 72, 212-213.

Keyt, B. A., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5638 - 5646.

Kortt, A. A., etal. (1997) Protein Engng, 10, 423-433.

Lee, Y-L., etal. (1998) Human Gene Therapy, 9, 457-465 Mouz N., et al. (1996) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 93, 9414-9419. Nielsen, etal. (1997) Protein Eng., 10, 1 Qiu, H., etal. (1998) J. Biol. Chem. 273: 11173-11176.

Tabela de Sequências 40 SEQ ID NO clone Name Length Type 1 FLT1D29GLYFC 1077 DNA 2 FLT1D29GLYFC 358 Protein 3 FLT1D2DEL9GLYFC 1050 DNA 4 FLTID2DEL9GLYFC 349 Protein 5 FLT 1 D29GLYEx3 426 DNA 6 FLT 1 D29GLYEx3 141 Protein 7 FLT1D29GLYEX3 CH3 744 DNA 8 FLTID29GLYEX3 CH3 247 Protein 9 IGg1 HEAVY 1434 DNA 10 IgG 1 HEAVY 477 Protein 11 VEGF 648 DNA 12 VEGF 215 Protein 13 VEGF exon 3 (Ex3) 14 Protein 14 FLT-1 5777 DNA 15 FLT-1 1338 Protein 16 KDR 5830 DNA 17 KDR 1356 Protein 18 D2-CH3 675 DNA 19 D2-CH3 224 Protein 20 D2-EX3-CH3 717 DNA 21 D2-EX3-CH3 238 Protein 22 D2-9GLY-CH3 702 DNA 23 D2-9GLY-CH3 233 Protein 24 D2(G4S)3-FC 1095 DNA 25 D2(G4S)3-FC 364 Protein 26 random linker 9 Protein 27 linker 9 Protein 28 linker 9 Protein 29 linker 9 Protein 30 linker 9 Protein 31 linker 7 Protein linker 13 Protein linker 9 Protein linker 23 Protein 41

Formas de realização da presente divulgação são descritas a seguir e são referidas como formas de realização EI a E71.

El. Uma proteina de fusão da fórmula X-Y-Z, em que X compreende um polipeptideo selecionado a partir do grupo consistindo num receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento; e Y consiste essencialmente em 5-25 resíduos de aminoácidos do polipeptideo, e Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG. E2. A proteína de fusão de El em que X compreende um receptor extracelular e o referido receptor é selecionado a partir do grupo consistindo num receptor de tirosina-quinase e um receptor de serina-treonina-quinase. E3. A proteína de fusão de El em que X compreende um receptor extracelular e o referido receptor é um receptor de VEGF. E4. A proteína de fusão de El em que X é o domínio de tipo IgG 2 do VEGF-R1 (FLT-1). E5. A proteína de fusão de El, em que o polipeptideo Y é flexível. E6. A proteína de fusão de E 1, em que o polipeptideo Y é selecionado de entre o grupo constituído por gly9 (SEQ ID NO: 27), glug (SEQ ID NO: 28), ser9 (SEQ ID NO: 29), gly5 cyspro2 cys (SEQ ID NO: 30), (gly4 ser)3 (SEQ ID NO: 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 32), Pro Ser Cys Vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn 42

(SEQ ID NO : 13), Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEQ ID NO: 26), e

GlygProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 34) . E7. A proteína de fusão de EI em que Z é uma região CH3 de IgGl. E8. A proteína de fusão de E7, em que Z é uma região CH3 de IgG2. E9. Uma composição compreendendo a proteína de fusão de El, que compreende ainda um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. E10. A composição de E9 em que referida composição é uma formulação liquida.

Eli. A composição de E9 em que referida composição é uma formulação liofilizada. E12. Uma composição compreendendo uma ou mais proteínas de fusão de El, em que a referida composição compreende multímeros das referidas proteínas de fusão. E13. A composição de E12, em que a referida composição consiste essencialmente numa única espécie de proteínas de fusão que formam homomultímeros. E14. A composição de E12, em que a referida composição consiste essencialmente em proteínas de fusão, em que o radical X nas referidas proteínas de fusão na composição é heterogénea. E15. A composição de E12, em que o radical X é um receptor extracelular, e o referido receptor é selecionado a partir 43 do grupo consistindo num receptor de tirosina-quinase e num receptor de serina-treonina-quinase. E16. A composição de E12, em que o radical X é um receptor extracelular, e o referido receptor é um receptor de VEGF ou a uma porção respectiva E17. A composição de E12, em que o radical X é um dominio semelhante a IgG 2 do VEGF-R1 (FLT-1). E18. A composição de E12, em que Y é um polipeptideo flexível. E19. A composição de E12, em que Y é um polipeptideo selecionado de entre o grupo constituído por gly9 (SEQ ID NO: 27), glug (SEQ ID NO: 28), ser9 (SEQ ID NO: 29), gly5 cyspro2-Cys ( SEQ ID NO: 30), (gly4ser)3 (SEQ ID NO: 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 32), Pro Ser Cys Vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEQ ID NO: 13 ), Gly-Asp-Leu-Ile-Tir-Arg-Asn-Gln-Lys (SEQ ID NO: 26), e

GlygproSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 34) . E20. A composição de E12, em que Z é uma região CH3 e a referida região é uma região CH3 de IgGl. E21. A composição de E12, que compreende ainda um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. E22. A composição de E21, em que a referida composição é uma formulação líquida. E23. A composição de E21, em que a referida composição é uma formulação liofilizada. 44 X-Y-Z, de fórmula E24. Um polipeptídeo de fórmula X-Y-Z, em que X compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo num receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento; Y consiste essencialmente numa porção ligante, que proporciona a separação espacial de 5-25 resíduos de aminoácidos, e Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG. E25. 0 polipeptídeo de E24, em que a porção ligante é um oligómero de 10-100 resíduos de monómero de etileno glicol E26. Uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z, em que X compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo num receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento; e Y consiste essencialmente de 5-25 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo, e Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo. E27. A proteína de fusão de E26, em que o Fc é uma IgG Fc. E28. A proteína de fusão de E27, em que a IgG Fc é IgGl Fc. E29. Uma composição compreendendo a proteína de fusão de E26, que compreende ainda um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. E30. A composição de E29, em que Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo que é uma IgG Fc. 45 Ε31. A composição de E29, em que Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo que é uma IgGl Fc. E32. Uma proteína de fusão da fórmula X-Y-Z, em que X compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo num receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento; e Y consiste essencialmente numa porção ligante, que proporciona a separação espacial de 5-25 resíduos de aminoácidos, e Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo. E33. A proteína de fusão de E32, em que o Fc é uma IgG Fc. E34. A proteína de fusão de E33, em que a IgG Fc é IgGl

Fc. E35. A proteína de fusão de E32, em que a porção ligante é um oligómero de 10-100 resíduos de monómeros etileno-glicol. E36. Uma composição compreendendo a proteína de fusão de E32, que compreende ainda um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. E37. A composição de E36, em que Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo que é uma IgG Fc. E38. A composição de E36, em que Z é uma porção Fc de uma molécula de anticorpo que é uma IgGl Fc.

E39. Um método de multimerização de um polipeptídeo X compreendendo: 46 ligar um polipeptídeo X a um polipeptídeo Z através de um polipeptideo Y para formar um polipeptídeo XYZ, em que X compreende um polipeptideo selecionado a partir do grupo consistindo num receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento; Y consiste essencialmente em 5-25 resíduos de aminoácidos do polipeptídeo, e Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG; a qual o polipeptídeo XYZ multimeriza. E40. 0 método de E39, em que o passo de ligação compreende a construção de uma molécula de ácido nucleico que codifica cada um dos X, Y e Z como uma única estrutura de leitura aberta, em que o referido polipeptídeo XYZ é expresso da construção de ácido nucleico numa célula hospedeira. E41. Um método de multimerização do polipeptídeo X compreendendo: ligar um polipeptídeo X a um polipeptídeo Z através de uma porção Y para formar um polímero XYZ, em que X compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo num receptor extracelular, uma região variável de anticorpo, uma citocina, uma quimiocina e um factor de crescimento; Y consiste essencialmente numa porção ligante que proporciona a separação espacial de 5-25 resíduos de aminoácidos, e Z é uma região CH3 de uma molécula de cadeia pesada de IgG; a qual o polipeptídeo XYZ multimeriza. 47 a porção ligante consiste de 10-100 resíduos de Ε42 . 0 método de E41, em que essencialmente num oligómero monómeros de etileno-glicol. E43. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de acordo com El. E44. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de acordo com E26. E45. 0 ácido nucleico de E43 ou 44 em que X representa um domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1 (Flt-1). E4 6. 0 ácido nucleico de E43, em que X representa um domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1 (Flt-1) e a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 21 e 23. E47. O ácido nucleico de E44, em que X representa um domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1 (Flt-1) e a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e 25. E48. A proteína de fusão de El ou 26, em que X representa um domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1 (Flt-1). E4 9. A proteína de fusão de El em que X é um domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1 (Flt-1) e a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 21 e 23. E50. A proteína de fusão de E26, em que X representa um domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1 (Flt-1) e a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e 25. 48 Ε51. Uma célula de mamífero, que compreende o ácido nucleico de E43 ou 44. E52. A célula de mamífero de E51, que é uma célula humana. E53. A célula de mamífero de E52, que é selecionada de entre o qrupo que consiste num fibroblasto, um hepatócito, uma célula endotelial, um queratinócito, uma célula hematopoiética, sinoviito, células epiteliais, células da retina, e uma célula estaminal. E54. Um método in vitro que compreende: entreqa do ácido nucleico de E43 ou 44 a uma célula de mamífero isolada para formar uma célula que expressa a dita proteína de fusão. E55. 0 método de E54, em que a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 8, 21, 23, e 25. E56. 0 método de E54, compreendendo ainda: entrega da célula que expressa a dita proteína de fusão a um mamífero. E57. Um método que compreende: entrega da célula de mamífero de E51 a um mamífero. E58. Um método que compreende: entrega do ácido nucleico de E43 ou 44 a um mamífero, em que a referida proteína de fusão é expressa no mamífero. E59. 0 método de E58, em que a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 8, 21, 23, e 25. 49 Ε60. 0 método de E57, em que o mamífero tem a degeneração macular relacionada com a idade ou retinopatia diabética proliferativa. E61. 0 método de E58, em que o mamífero tem cancro. E62. 0 método de E58, em que o mamífero tem artrite reumatóide. E63. 0 método de E58, em que o mamífero sofre de asma. E64. 0 método de E58, em que o mamífero tem osteoartrite. E65. Um método que compreende: entrega da proteína de fusão de EI ou 26 a um mamífero. E66. 0 método de E65, em que o mamífero tem a degeneração macular relacionada com a idade ou retinopatia diabética proliferativa. E67. 0 método de E65, em que o mamífero tem cancro. E68. 0 método de E65, em que o mamífero tem artrite reumatóide. E69. 0 método de E65, em que o mamífero sofre de asma. E70. 0 método de E65, em que o mamífero tem osteoartrite. E71. 0 método de E65 , em que a proteína de fusão compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 8, 21, 23, e 25. 50

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genzyme Corporation

<120> MULTIMERIC CONSTRUCTS

<130> P30465EP-PCT <140> EP05810409.2 <141> 2005-09-13 <150> 60/658209 < 151 > 2005-03-04 <150> 60/608887 <151 > 2004-09-13 <160> 34 <170> FastSEQ for Windows version 4.0

<210> 1 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant fusion protein or sequence encoding same <400> 1 51 atggtcagct actgggacac cggggtcctg acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg gcaacagtca atgggcattt gtataagaca ggtggaggtg gaggtggagg tcctaaatct ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca accctcatga tctcccggac ccctgaggtc gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg aagccgcggg aggagcagta caacagcacg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac gcccccateg agaaaaccat ctccaaagcc accctgcccc catcccggga tgagctgacc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg cgggttacgt cacctaacat cactgttact cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa aactatctca cacatcgaca aaccggtgga tgtgacaaaa ctcaeacatg cccaccgtgc gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca taccgtgtgg tcagegtcct caccgtcctg aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat agcctctccc tgtctccggg taaatag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1077

<210> 2 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequenca <220> <223> Recombinant fusion protein or sequence encoding sams <400> 2

Met Vai Ser ryr Trp Asp Thr Gly vai Leu Leu Cys Ala Leu Leu ser 1 S 10

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg pro Phe vai Glu Met Tyr ser 20 2 S

Glu lie Pro Glu He xle Ris Met Thr Glu Gly *rg Glu Leu vai Xle 3S 40

Pro Cys Arg vai Thr Ser Pro Asn ile Thr vai Thr Leu Lys Lys Phe SO 55 60

Pro Leu Asp Thr Leu Xle Pro Asp Gly Lys Arg lie TrP AsP |?r 65 70 75 80 1 52

Arg Lys Gly Phe Xle 85 ile Ser Asn Ala Thr 90 Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn His 100 105 Gly Leu Thr Hl S Arg Gin Thr Gly Gly Gly 115 120 tys ser cys Asp Lys Thr Hl S Thr cys Pro 130 135 Phe teu Leu Gly Gly pro Ser Val phe Leu 145 150 Glu val 170 Thr Leu Met ile ser 165 Asp Arg Thr Pro vai ser Hl$ GlU Pro Glu Val Lys JLf V Phe 180 Thr 185 vai Glu val HiS Asn Ala Lys Lys Pro 195 200 Thr ser Thr Tyr Arg Val Val Ser val Leu 210 215 val Leu 225 Asn Gly Lys Glu Tyr 230 Lys cys Lys Ala pro xle Glu Lys Thr ile ser Lys Al a 245 250 ΡΓΟ Gin val Tyr Thr Leu Pro pro ser Arg 260 265 Gly Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys 275 280 Gin Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Pro 290 295 Gly Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Ser 305 310 Gin Gin Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp 325 His 330 ser val Met Hl S Glu Ala Leu Asn His 340 Gly 345 ser Leu Ser Pro Lys 355 <21G>3 <211> 1050 <212> DMA <213> Artificia! Sequence <220> <223> Recombinant fusion protein or sequence encoding same <400> 3

Tyr cys Glu Xle Gly 95 Leu Leu Tyr Lys Thr 110 Asn Tyr Gly Gly s? Gly Gly Pro Pro Cys 140 Pro Ala Pro Glu pro 155 Pro Lys Pro cys ASP 160 Thr Cys val val val 175 Asp ASP Asn Trp Tyr Val 190 Gly Arg Glu Glu 205 Gin Tyr Asn val Leu 220 His Gin ASP Trp ser 235 Asn Lys Ala Leu Pro 240 Lys Gly Gin pro Arg 255 Lys Glu Asp Glu Leu Thr 270 Asn Phe Tyr Pro 285 Ser Asp Ile Glu Asn 300 Asn Tyr Lys Thr Phe 315 Phe Leu Tyr Ser Lys 320 Gly aso val Phe Ser 335 cys Tyr Thr Gl n Lys 350 ser Leu atggtcagct actgggacac acaggatctg gtagaccttt actgaaggaa gggagctcgt ttaaaaaagt ttccacttga agaaagggct tcatcatatc gcaacagtca atgggcattt tctcgtgaca aaactcacac tcagtcttcc tcttcccccc gtcacatgcg tggtggtgga gtggacggcg tggaggtgca acgtaccgtg tggtcagcgt tacaagtgca aggtctccaa gccaaagggc agccccgaga accaagaacc aggtcagcct gtggagtggg agagcaatgg gactccgacg gctccttctt caggggaacg tcttctcatg aagagcctct ccctgtctcc cggggtcctg ctgtgcgcgc cgtagagatg tacagtgaaa cattccctgc cgggttacgt cactttgatc cctgatggaa aaatgcaacg tacaaagaaa gtataagaca aactatctca atgcccaccg tgcccagcac aaaacccaag gacaccctca cgtgagccac gaagaccctg taatgccaag acaaagccgc cctcaccgtc ctgcaccagg caaagccctc ccagccccca accacaggtg tacaccctgc gacctgcctg gtcaaaggct gcagccggag aacaactaca cctctacagc aagctcaccg ctccgtgatg catgaggctc gggtaaatag tgctcagctg tctgcttctc tccccgaaat tatacacatg eacctaacat cactgttact aacgcataat ctgggacagt tagggcttct gacctgtgaa cacatcgaca aacccctaaa ctgaactcct ggggggaccg tgatctcccg gacccctgag aggtcaagtt caactggtac gggaggagca gtacaacagc actggctgaa tggcaaggag tcgagaaaac catctccaaa ccccatcccg ggatgagctg tctatcccag cgacatcgcc agaccacgcc tcccgtgctg tggacaagag caggtggcag tgcacaacca ctacacgcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1050 53

<210=- 4 <211> 349 <212> PRT «213> Artificial sequence <220 <223> Recombinant fusion protein or sequence encoding same <4G0> 4

Met val ser Tyr Trp Asp 1 5 Gly cys Leu Leu Leu Thr 20 ile Glu ile Pro Glu Ile 35 Thr Pro cys Arg val ser 50 Ile Pro Leu Asp Thr Leu 65 70 Arg tys Gly Phe Ile 85 Ala Ile Leu Thr cys Glu rhr 100 Leu Thr HÍS Arg Gin Thr 115 Ala Pro Pro cys Pro pro 130 Phe pro pro Lys pro tys 145 150 val Thr Cys val val val 165 Phe Asn Trp Tyr val Asp 180 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 195 Gin Thr Val Leu HIS Asp 210 Ala val ser Asn Lys Leu 225 230 Ala Lys Gly Gin Pro Arg 245 Arg ASp Glu Leu Thr Lys 260 Gly Phe as Asn pro Ser Asp Pro Glu Asn Tyr Lys 290 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 Gin Gly Asn val Phe Ser 325 HIS Tyr Thr Gin Lys Ser 340

Thr Gly val Leu 10 Pro Leu Cys Ala ser Gly Arg 25 phe Val Glu His Met 40 Thr Glu Gly Arg Glu 45 pro 55 as« Ile Thr val Thr 60 Leu Pro ASp Gly Lys Arg 75 Ile Ile Ser ASR Ala Thr 90 Tyr Lys Glu val Asn Gly 105 His Leu Tyr Lys pro Lys 120 Ser Cys ASp Lys Thr 125 Glu 135 Leu Leu Gly Gly Pro 140 ser Asp Thr Leu Met ile 155 Ser Arg Asp val Ser HÍS 170 Glu Asp Pro Gly Val Glu 185 val His Asn Ala Asn ser 200 Thr Tyr Arg val val 205 Trp 215 teu Asn Gly Lys Glu 220 Tyr Pro Ala Pro ile Glu 235 Lys Thr Glu Pro Gin val 250 Ser Tyr Thr Leu Asn Gin Val 265 Leu Thr Cys Ile Ala 280 val Glu Trp Glu ser 285 Thr 295 Thr pro pro val Leu 300 ASp Lys Leu Thr val ASP 315 tys ser Cys Ser val Met 330 His Glu Ala Leu ser Leu 345 ser Pro Gly Lys teu Leu ser 15

Met Tyr Ser 30

Leu Vai Ile Lys Lys Phe

Trp Asp ser 80

Ile Gly Leu 85

Thr Asn Tyr 110

His Thr cys val Phe Leu

Thr Pro Glu 160

Glu Val Lys 175

Lys Thr Lys 190

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile ser Lys 240

Pro Pro Ser 2S5

Leu val Lys 270

Asn Gly Gin Ser Asp Gly

Arg Trp Gin 320

Leu His Asn 335 <210 5 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant fuslon protein or sequence encoding same <400> 5 54 atggtcagct actgggacac cggggtcctg acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg gcaacagtca atgggcattt gtataagaca ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt aattag ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg cgggttacgt cacctaacat cactgttact cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa aactatctca cacatcgaca aaccggtgga gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 60 120 180 240 300 360 420 426

<210> 6 <211=* 141 <212> PRT <213> Artificial sequence <220 <223> Recornbinantfuaion proteinor sequence encoding same <400> 6

Met Vai Ser Tyr Trp ASp Thr Gly Val Leu Leu cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 Glu 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Met Tyr Ser 20 25 30 val Glu Ile pro Glu Ile ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu ile 3S 40 45 Phe pro Cys 50 Arg val Thr ser Pro SS Asn Ile Thr val Thr 60 teu Lys Lys Pro Leu Asp Thr Leu ile Pro ASP Gly Lys ile ile Trp Asp ser 65 70 75 ile Gly 80 Arg Lys Gly Phe Ile ile Ser Asn Ala rhr Tyr cys Glu Leu 85 90 Thr 95 leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly HIS Leu Tyr Lys Asn Tyr 100 105 110 Leu Thr His Arg Gin Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro 115 120 Gly Gly 125 Ser Cys 130 Vai Pro Leu Met Arg 135 cys Cys cys 140 Asn

<210 7 <211> 744 <212> D NA <213> Artificial sequence <220 <223> Recornbinanl fusion protein or sequence encoding same <400>7 60 120 ISO 240 300 360 420 480 S40 600 660 720 744 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc aatcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cecgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagegacat cgecgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactaeac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atag <210> 8 55 <211 >247 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Recombinant fusion proteín or sequence encoding same <400>8

Met Vai ser Tyr Trp Asp 1 S Cys Leu Leu Leu Thr Gly 20 Glu He pro Glu He lie Pro Cys Arg vai Thr Ser

Thr Gly val Leu Leu 10 Ser Gly Arg pro Phe 25 His Met Thr Glu Gly 40 Pro Asn tle Thr val

Cys Val Arg Thr

Ala Glu Glu 45 leu Leu Leu 15 Ser Met 30 Leu Tyr ser val ile Lys Lys Phe 50 Pro Leu 65 Arg Lys teu Thr teu Thr ser cys 130 Glu Pro 145 Asn Gin ile Ala Thr Thr Lys Leu 210 Cys Ser 225 Leu Ser

Asp Thr Leu He 70 Gly Phe lie Xle 85 Cys Glu Ala Thr 100 His Arg Gin Thr 115 vai Pro Leu Met Gin Val Tyr Thr 150 val ser Leu Thr 165 val Glu Trp Glu 180 Pro Pro Val Leu 195 Thr val Asp Lys val Met His Glu 230 Leu Ser Pro Gly 245 55 Pro Asp Ser Asn val Asn Cly Jljj Arg cys 135 Leu Pro cys Leu Ser Asn Asp Ser 200 Ser Arg 215 Ala Leu Lys

Gly Lys Arg Ala Thr Tyr 90 Gly His Leu 105 Gly Gly Gly Gly Gly cys Pro ser Arg 155 val Lys Gly 170 Gly Gin Pro 185 Asp Gly ser Trp Gin Gin His as« His 60 lie Lys Tyr Gly cys 140 ASp Phe Glu Phe

Tyr ile Glu Lys Gly 125 Asn GlU Tyr Asn Phe 205 Asn Thr

Trp Asp Ser «η ile Gly os ou Leu Thr Asn Tyr 110 Gly Gly Pro Gin Pro Arg Leu Thr Lys 160 Pro Ser ASp 175 Asn Tyr Lys 190 Leu Tyr Ser val Phe ser Gin Lys ser 240 <210> 9 <211> 1434 <2:12> DNA <213> Hamo sapiens <400>9 56 gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 agagacaatt ecaagaacac gttgtatatg 300 gctgtgtatt attgtgcgag agagggtcgg 360 ggatactact ttgactactg gggccaggga 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc S40 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 720 gacaaaactC acacatgccc accgtgccca 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960 cgtgtggtca gegtcetcac cgtcctgcac 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080 gggcagcccc gagaaccaea ggtgtacacc 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1434 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg tgtgcagcgt ctggatteac cttcagtaat ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg tgggtacgat atactacggt gactactatc accctggtca ccgtctcctc agcctccacc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg gctctgcaca accactacac gcagaagagc

<210 10 <211> 477 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 10

Met Glu Phe dy teu ser Trp vai Phe teu vai Ala Leu teu Arg Gly l 5 10 ,, 15, vai Gin Cys Gin vai Gin Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai vai Gin 7 20 25 sO * pro Gly Arg ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr p e

Ser Asn Tyr Gly Met His Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly teu 57

Glu 65 50 Trp vai Ala Ala lie 70 55 Trp Tyr Asp Gly ser 75 60 Asn Lys Tyr Tyr Ala 80 ASP Thr ser Leu vai Tyr Lys Met Gly 85 Gin Arg Met Phe Asn Thr ser lie Leu ser 90 Arg Arg Ala ASp Glu Asn Asp Ser Thr 110 Thr Lys 95 Ala Asn Val Tyr Tyr Cys 115 Gly 100 Ala Arg Glu Gly Arg 120 Tyr 105 Trp val Arg Tyr Thr 125 val Thr Thr ile 130 Ser Ser Tyr Tyr Phe ASp 135 Lys Gly Trp Gly Gin Gly 140 Thr teu val Thr Vai 145 Ser ser Lys Ala Ser Ser Thr 165 Thr 150 Ser Gly Gly pro Thr ser Ala 170 val 155 Ala Phe Leu Pro Gly Leu Cys Ala Leu 175 Pro 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu pro vai Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 Gin 190 Gly Leu Thr ser Gly Vai Hi s Thr phe pro Ala val Leu ser Ser 195 200 205 Gly Leu Tyr ser Leu ser ser vai vai Thr val pro ser ser Ser Leu 210 215 220 Thr Thr 225 Gin Thr Tyr xle cys 230 Asn vai Asn His Lys 235 Pro Ser Asn Lys 240 vai ASP Lys Arg vai Glu Pro Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr cys 245 250 val 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Phe Leu 260 265 270 Glu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val vai Thr cys vai vai Vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Lys 290 295 300 Ala Thr Phe 305 Asn Trp Tyr Vai Asp 310 Gly Vai Glu val His 315 Asn Lys Lys 320 Pro Arg Glu Glu Gin 325 Tyr Asn Ser Thr Tyr 330 Arg val Val ser val 335 Leu Thr vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro rle Glu Lys Thr ile ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu pro Pro Ser 370 375 380 val Arg 385 Glu Glu Met Thr Lys 390 Asn Gin Vai ser Leu 395 Thr cys Leu Lys 400 Gly Phe Tyr Pro Ser 405 Asp lie Ala vai Glu 410 Trp Glu ser Asn «ϊ Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Gin Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp 435 440 445 His Gin Gly Asn vai Phe Ser cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Asn 450 Thr Gin 455 460 His Tyr Lys Ser Leu Ser Leu ser pro Gly lys 465 470 475 <210> 11 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 58 atgaactttc tgctgtcttg gceaagtggt cccaggctgc gtgaagttca tggatgtcta atcttccagg agtaccctga atgcgatgcg ggggctgctg aacatcacca tgcagattat agcttcctac agcacaacaa aaaaaatcag ttcgaggaaa aagtcctgga gcgttccctg gatccgcaga cgtgtaaatg ggtgcattgg agccttgcct acccatggca gaaggaggag tcagcgcagc tactgccatc tgagatcgag tacatcttca caatgacgag ggectggagt gcggatcaaa cctcaccaag atgtgaatgc agaceaaaga gggaaagggg caaaaacgaa tgggccttgc tcagagcgga ttcctgcaaa aacacagact tgctgctcta cctccaccat ggcagaatca teacgaagtg caatcgagac cctggtggac agccatcctg tgtgcccctg gtgtgcccac tgaggagtCC gccagcacat aggagagatg aagatagagc aagacaagaa agcgcaagaa atcccggtat gaaagcattt gtttgtacaa cgcgttgcaa ggcgaggcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt <210=· 12 <211> 215 «212> PRT <213> Homo sapjens <400> 12 gacaagccga ggeggtga 648

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp 1 5 Tyr Leu His HÍS Ala Lys rrp 20 Gly Gly Gin Asn His His Glu 35 His Ile Arg Ser Tyr cys pro 50 55 Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr 65 Gly 85 Asn 70 Met Arg Cys Gly Cys Cys Thr Glu Glu Ser ile Thr 100 Gly Gin Gly Gin His Ile Glu 115 Glu Cys 130 Arg Pro Lys Lys Asp 135 Arg 145 Gly Lys Gly Lys Gly 150 Gin Lys Ser Trp ser val 165 Pro Cys Leu Phe vai Gin 180 cys Asp pro Gin Asp Ser Arg Lys Ala Arg 195 Arg CVS 210 ASP Lys pro Arg Arg 215 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapjens

Val His Trp ser Leu Ala teu Leu Leu 10 IS ser Gin Ala Ala Pro Met Ala Glu dy 25 30 val Val Lys phe Met Asp val Tyr Gin 40 45 Glu Thr Leu Val Asp cn Ile Phe Gin Glu Ile Phe Lys pro OU Ser Cys val Pro Leu 75 80 Asn Asp Glu QA Gly Leu Glu cys val os Pro «et Gin 7v ile Met Arg Ile Lys pro His 105 110 Met Ser Phe Leu Gin His ASR Lys Cys 120 125 Arg Ala Arg Gin Glu 140 Lys Lys ser val Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 155 160 Gly Pro Cys ser Glu Arg Arg Lys His 170 175 Thr 31 Lys cys Ser Cys Lys 190 Asn Thr Gin Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr cys 200 205

<400> 13 pro Ser cys vai Pro Leu 1 5 <21Q> 14 <211> 5777 <212> DNA

Met Arg cys Gly Gly Cys Cys Asn 10 59 <213> Homo sapiens <400> 14 gcggacactc ctcteggctc ctccccggca tcgggtgcag cggccagegg gcctggcggc ggctggagcc gcgagacggg cgctcagggc gactctggcg gccgggtcgt tggccggggg gcgctcacca tggtcagcta etgggacacc ctgcttctca caggatctag ttcaggttca ggcacccage acateatgca agcaggccag gcccataaat ggtctttgcc tgaaatggtg aaatctgcct gtggaagaaa tggcaaacaa caagcaaacc acactggctt ctacagctgc aaggaaacag aatctgcaat ctatatattt atgtacagtg aaatccccga aattatacac tgccgggtta cgtcaeetaa catcactgtt atccctgatg gaaaacgeat aatctgggac acgtacaaag aaatagggct tctgacctgt acaaactatc tcacacatcg acaaaccaat cgcccagtca aattacttag aggccatact ttgaacacga gagttcaaat gacctggagt gcggcggcgg ctcggagcgg gctccggggc gaggattacc cggggaagtg gttgtctcct gcggggccgg cggcggcgaa cgagaggacg agcgcgggca ccgggcgagc aggccgcgtc ggggtcctgc tgtgcgcgct gctcagctgt aaattaaaag atcctgaact gagtttaaaa acactgeatc tecaatgcag gggggaagca agtaaggaaa gcgaaaggct gagcataact ttctgcagta ctttaacctt gaacacagct aaatatctag ctgtacctac ttcaaagaag attagtgata caggtagacc tttcgtagag atgactgaag gaagggagct cgtcattccc actttaaaaa agtttccact tgacactttg agtagaaagg gcttcatcat atcaaatgca gaagcaacag tcaatgggca tttgtataag acaatcatag atgtccaaat aagcacacca cttgtcctca attgtactgc taccactccc taccctgatg aaaaaaataa gagagcttcc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 60 gtaaggcgac gaattgacca aagcaattcc catgccaaca tattctacag tgttcttact 1140 attgacaaaa tgcagaacaa agacaaagga ctttatactt gtcgtgtaag gagtggacca 1200 tcattcaaat ctgttaacac ctcagtgcat atatatgata aagcattcat cactgtgaaa 1260 catcgaaaac agcaggtgct tgaaaccgta gctggcaagc ggtcttaccg gctctctatg 1320 aaagtgaagg catttccctc gccggaagtt gtatggttaa aagatgggtt acctgcgact 1380 gagaaatctg ctcgctattt gactcgtçge tactcgttaa ttatcaagga cgtaactgaa 1440 gaggatgcag ggaattatac aatcttgctg agcataaaac agtcaaatgt gtttaaaaac 1500 ctcactgcca ctctaattgt caatgtgaaa ccccagattt acgaaaaggc cgtgtcatcg 1560 tttccagacc cggctctcta cccactgggc agcagacaaa tcctgacttg taccgcatat 1620 ggtatccctc aacctacaat caagtggttc tggcacccct gtaaccataa tcattccgaa 1680 geaaggtgtg acttttgttc caataatgaa gagtccttta tcctggatgc tgacagcaac 1740 atgggaaaea gaattgagag catcactcag cgcatggcaa taatagaagg aaagaataag 1800 atggctagca ccttggttgt ggctgactct agaatttctg gaatctacat ttgcatagct 1860 tccaataaag ttgggactgt gggaagaaac ataagctttt atatcacaga tgtgccaaat 1920 gggtttcatg ttaacttgga aaaaatgccg acggaaggag aggacctgaa actgtettgc 1980 acagttaaca agttcttata cagagacgtt acttggattt tactgcggac agttaataac 2040 agaacaatgc actacagtat tagcaagcaa aaaatggcca tcactaagga gcactccatc 2100 actcttaatc ttaccatcat gaatgtttcc ctgcaagatt caggcaccta tgcctgcaga 2160 gccaggaatg tatacacagg ggaagaaatc ctccagaaga aagaaattac aatcagagat 2220 caggaagcac catacctcct gcgaaacctc agtgatcaca cagtggccat cagcagttcc 2280 accactttag actgtcatgc taatggtgtc cccgagcctc agatcacttg gtttaaaaac 2340 aaccacaaaa tacaacaaga gcctggaatt attttaggac caggaagcag cacgctgttt 2400 attgaaagag tcacagaaga ggatgaaggt gtctatcact gcaaagccac caaccagaag 2460 ggctctgtgg aaagttcagc atacctcact gttcaaggaa cctcggacaa gtctaatetg 2S20 gagctgatca ctctaacatg cacctgtgtg gctgcgactc tcttctggct cctattaacc 2580 ctccttatcc gaaaaatgaa aaggtcttct tctgaaataa agactgacta cctatcaatt 2640 ataatggacc cagatgaagt tcctttggat gagcagtgtg agcggctccc ttatgatgcc 2700 agcaagtggg agtttgcccg ggagagactt aaactgggca aatcacttgg aagaggggct 2760 tttggaaaag tggttcaagc atcagcattt ggcattaaga aatcacctac gtgccggact 2820 gtggctgtga aaatgctgaa agagggggcc acggccagcg agtacaaagc tctgatgact 2880 gagctaaaaa tcttgaceca cattggccac catctgaacg tggttaacct gctgggagcc 2940 tgcaccaagc aaggagggcc tctgatggtg attgttgaat actgcaaata tggaaatctc 3000 tccaactacc tcaagagcaa acgtgactta ttttttctca acaaggatgc agcactacac 3060 atggagccta agaaagaaaa aatggagcca ggcctggaac aaggcaagaa accaagacta 3120 gatagcgtca ccagcagcga aagctttgcg agctccggct ttcaggaaga taaaagtctg 3180 agtgatgttg aggaagagga ggattctgac ggtttctaca aggagcccat cactatggaa 3240 gatctgattt cttacagttt tcaagtggcc agaggcatgg agttcctgtc ttccagaaag 3300 tgcattcatc gggacctggc agcgagaaac attcttttat ctgagaacaa cgtggtgaag 3360 atttgtgatt ttggccttgc ccgggatatt tataagaacc ccgattatgt gagaaaagga 3420 gatactcgac ttcctctgaa atggatggct cccgaatcta tctttgacaa aatctacagc 3480 accaagagcg acgtgtggtc ttacggagta ttgctgtggg aaatcttctc cttaggtggg 3S40 tctccatacc caggagtaca aatggatgag gacttttgca gtcgcctgag ggaaggcatg 3600 aggatgagag ctcctgagta ctctactcct gaaatctatc agatcatgct ggactgctgg 3660 cacagagacc caaaagaaag gccaagattt gcagaacttg tggaaaaact aggtgatttg 372Ú cttcaagcaa atgtacaaca ggatggtaaa gactacatcc caatcaatgc catactgaca 3780 ggaaatagtg ggtttacata ctcaactcct gccttctctg aggacttctt caaggaaagt 3840 atttcagctc cgaagtttaa ttcaggaagc tctgatgatg tcagatatgt aaatgctttc 3900 aagttcatga gcctggaaag aatcaaaacc tttgaagaac ttttaccgaa tgccacctcc 3960 atgtttgatg actaccaggg cgacagcagc actctgttgg cctctcccat gctgaagcgc 4020 ttcacctgga ctgacagcaa acccaaggcc tcgctcaaga ttgacttgag agtaaccagt 4080 aaaagtaagg agtcggggct gtctgatgtc agcaggccca gtttctgcca ttccagctgt 4140 gggcacgtca gcgaaggcaa gcgcaggttc aectaegacc acgctgagct ggaaaggaaa 4200 atcgcgtgct gctccccgcc cccagactac aactcggtgg tcctgtactc caccccaccc 4260 atctagagtt tgacacgaag ccttatttct agaagcacat gtgtatttat acccccagga 4320 aactagcttt tgccagtatt atgcatatat aagtttacac ctttatcttt ccatgggagc 4380 cagctgcttt ttgtgatttt tttaatagtg cttttttttt ttgactaaca agaatgtaac 4440 tccagataga gaaatagtga caagtgaaga acactactgc taaatcctca tgttactcag 4500 tgttagagaa atccttccta aacccaatga cttccctgct ccaacccccg ccacctcagg 4S60 gcacgcagga ccagtttgat tgaggagctg cactgatcac ccaatgcatc acgtacccca 4620 ctgggccagc cctgcagccc aaaacccagg gcaacaagcc cgttagcccc aggggatcac 4680 tggctggcct gagcaacatc tcgggagtcc tctagcaggc ctaagacatg tgaggaggaa 4740 aaggaaaaaa agcaaaaagc aagggagaaa agagaaaccg ggagaaggcà tgagaaagaa 4800 tttgagacgc accatgtggg cacggagggg gacggggctc agcaatgcca tttcagtggc 4860 ttcccagctc tgacccttct acatttgagg gcccagccag gagcagatgg acagcgatga 4920 ggggacattt tctggattct gggaggcaag aaaaggacaa atatcttttt tggaactaaa 4980 gcaaatttta gacctttacc tatggaagtg gttctatgtc cattctcatt cgtggcatgt 5040 tttgatttgt agcactgagg gtggcactca actctgagcc catacttttg gctcctctag 5100 taagatgcac tgaaaactta gccagagtta ggttgtctcc aggccatgat ggccttacac 5160 tgaaaatgtc acattctatt ttgggtatta atatatagtc cagacactta actcaatttc 5220 ttggtattat tctgttttgc acagttagtt gtgaaagaaa gctgagaaga atgaaaatgc 5280 61 agtcctgagg agagttttct ccatatcaaa acgagggctg atggaggaaa aaggtcaata 5340 aggtcaaggg aagaccccgt ctctatacca accaaaccaa ttcaccaaca cagttgggac 5400 ccaaaacaca ggaagtcagt cacgtttect tttcatttaa tggggattcc actatctcac 5460 actaatctga aaggatgtgg aagagcatta gctggcgcat attaagcact ttaagctcct 5520 tgagtaaaaa ggtggtatgt aatttatgca aggtatttct ccagttggga ctcaggatat 5580 tagttaatga gccateacta gaagaaaagc ccattttcaa ctgctttgaa acttgcctgg 5640 ggtctgagca tgatgggaat agggagacag ggtaggaaag ggcgcctact cttcagggtc 5700 taaagatcaa gtgggccttg gatcgctaag ctggctctgt ttgatgctat ttatgcaagt S760 tagggtctat gtattta 5777 <210> 15 <211>1333 <212> PRT <213> Hemo sapiens <220> <221 > DOMAiN <222> (235)...(336) <223> domain 3 <400> 15 62

Met 1 val Ser Tyr cys Leu teu Leu 20 Gl u Leu ser 35 Leu teu His 50 Leu Gin Glu 65 Met val Ser Cys Gly Arg Asn Ala Gin Ala Asn 100 Pro Thr Ser 115 Lys ser Asp 130 Thr Gly Ile 145 ile His Met Thr Ser Pro Asn Leu Ile Pro ASP 180 Ile He Ser 195 Asn Ala Thr 210 val Asn Gin 225 Thr Asn Thr Lys Leu Leu Arg Pro Leu Asn Thr 260 Asn Lys Arg 27$ Ala Ala Asn 290 Ile Phe Asp 305 Ser Lys Gly Leu Val Asrt Thr Lys Hi s Arg Lys 340 Tyr Arg Leu 355 Ser Trp Leu Lys Asp

Trp Asp 5 Thr Gly Lys Gly cys Arg Lys Glu 70 Gly Lys 85 His Thr Lys Lys Arg Pro Thr Glu 150 lie Thr 165 Gly Lys Ala Thr Gly «is Ile Ile 230 Gly His 245 Arg vai ser vai Tyr Ser Tyr Thr 310 Ser vai 325 Gin Gin Met Lys Gly Leu

Thr Gly Ser Ser Thr Gin 40 Gly Glu 55 Ser Glu Gin Phe Gly Phe Glu Thr 120

Phe Vai 135 Gly Arg vai Thr

Arg lie

Tyr Lys 200

Leu Tyr 215

Asp Vai Thr Leu Gin Met Arg Arg 280 vai Leu 295 Cys Arg His ile vai Leu vai Lys 360 pro Ala vai Ser 25 His Ala Arg Cys Tyr 105 Glu Glu Glu Leu Ile 185 Glu Lys Glr» vai Thr 265 Arg Thr val Tyr Glu 345Ala Thr

Leu 10 Leu cys Ala Leu Leu 15 Ser Gly Ser Lys Leu Lys 30 ASP pro Ile Met Gin Ala 45 Gly Gin Thr Ala His Lys 60 Trp ser Leu pro Leu Ser 75 ile Thr Lys ser Ala 80 Ser 90 Thr Leu Thr Leu Asn 95 Thr Ser Cys Lys Tyr Leu 110 Ile Ala val ser Ala ile Tyr 125 Phe ile Met Tyr ser 140 Glu ile Pro Glu Leu val 155 Ile Pro Cys Arg Val 160 Lys 170 Lys Phe Pro Leu ASp 175 Thr Trp Asp ser Arg 3S Thr Gly Phe lie Gly Leu Leu 205 Leu cys Glu Thr A$n Tyr 220 Thr HiS Arg Ile Ser 235 Thr Pro Arg pro Val 240 Leu 250 Asn Cys Thr Ala Thr 255 Thr Trp Ser Tyr pro ASp 270 Glu Lys Ile Asp Gin Ser 285 Asn ser His He Asp Lys 300 Met Gin Asn Lys Arg ser 315 Gly Pro Ser Phe Lys 320 ASP 330 Lys Ala Phe ile Thr 335 Val Thr val Ala Gly Lys 350 Arg Ser Phe Pro ser pro 365 Ala Glu Val val Glu lys ser Arg ryr Leu 63 370 375 380 Glu Glu Ala Thr Arg Gly Tyr Ser Leu He lie Lys Asp val Thr Asp 385 390 395 val 400 Gly Asn Tyr Thr ile Leu Leu ser ile Lys Gin Ser Asn phe Lys 405 410 415 Glu Asn Leu Thr Ala Thr Leu ile val A$n val Lys Pro Gin ile Tyr 420 425 430 Lys Ala vai ser ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser 435 440 445 Ile Arg Gin Ile leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gin Pro Thr 450 455 HÍS His 475 460 Glu Ala Lys 465 Trp Phe Trp HIS Pro 470 Cys Asn Asn Ser Arg Cys 480 ASp Phe cys ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser 485 490 495 Ile Asn Met Gly Asn Arg ile Glu ser Ile Thr Gin Arg Met Ala ile 500 505 val Val Ala 510 Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Asp ser Arg 515 520 Ala 525 Gly val He Ser Gly ile Tyr lie Cys ile Ser Asn Lys val Thr S30 535 val 540 Gly phe HÍS Gly Arg Asn ile ser Phe Tyr ile Thr Asp Pro Asn 545 550 555 560 val Asn teu Glu Lys Met pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu ser 565 570 575 Cys Thr vai Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp vai Thr Trp Ile Leu Leu 580 585 ile 590 Arg Thr Val Asn A$n Arg Thr Met His Tyr Ser ser Lys Gin Lys 595 600 60S Met Ala ile Thr Lys Glu His ser ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met 610 615 620 Ala Asn Vai Ser Leu Gin Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Arg Asn 625 630 635 Glu 640 Vai Tyr Thr Gly Glu 645 Glu Ile Leu Gin Lys 650 Lys ile Thr Ile 655 Arg ASp Gin Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu ser Asp His Thr val 660 665 Ala 670 val Ala Ile ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Asn Gly Pro 67S 680 685 Glu Glu Pro Gin ile Thr Trp phe Lys Asn Asn HÍS Lys 700 ile Gin Gin 690 695 Glu pro Gly ile ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe ile Arg 705 710 715 720 vai Thr Glu Glu Asp Glu Gly val Tyr His Cys tys Ala Thr Asn Gin 725 730 735 Lys Gly ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr val Gin Gly Thr ser 740 745 750 Asp Lys ser Asn Leu Glu Leu ile Thr teu Thr Cys Thr Cys val Ala 755 760 Ile 765 Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu Arg Lys «et Lys 770 775 780 He ile Arg ser ser Ser Glu Ile tys Thr Asp Tyr Leu ser Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gin Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 Gly 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Lys Ser 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys val val Gin Ala ser Ala Phe Gly 835 840 845 ile tys Lys Ser Pro rhr cys Arg Thr Val Ala val Lys Met Leu Lys 850 855 860 GlU Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys 865 870 875 val 880 Ile Leu Thr His Ile Gly His His teu Asn Val Asn Leu Leu Gly 885 Gly 890 89 S Ala Cys Thr Lys Gin Gly Pro Leu Met val Ile val Glu Tyr Cys 900 905 910 phe Lys Tyr Gly 915 Asn Asn Leu Ser Asn Tyr 920 Leu Lys Ser Lys Arg 925 ASp Leu Phe Leu »-ys Asp Ala Ala Leu HÍS Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys 64 930 93S 940

Met Glu pro Gly Leu Glu Gin Gly Lys Lys Pro Arg teu Asp ser Vai 945 950 955 , 960

Thr Ser ser Glu Ser Phe Ala ser ser Gly Phe Gin Glu Asp Lys ser 965 970 _ 975

Leu Ser Asp vai Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu 980 985 990 pro lie Thr Met Glu Asp teu Xle Ser Tyr ser Phe Gin vai Ala Arg 995 1000 1005

Gly Met Glu Phe Leu Ser 5er Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020

Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Vai Vai Lys Ile Cys Asp 1025 1030 1035 „ 1040

Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro asp Tyr vai Arg Lys 1045 1050 , 1055 u

Gly asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu ser ile Phe 1060 1065 1070

Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Vai Trp Ser Tyr Gly Vai Leu 1075 1080 1085

Leu Trp Glu Ile Phe ser Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly vai Gin 1090 1095 1100

Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg teu Arg Glu Gly Met Arg Met Arg 1105 1110 1115 , ^ H20

Ala Pro Glu Tyr ser Thr Pro Glu ile Tyr Gin ile Met Leu Asp Cys 1125 1130 1135

Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Vai Glu 1140 1145 „ . 1150

Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gin Ala Asn vai Gin Gin Asp Gly Lys Asp 1155 1160 1165

Tyr ile Pro ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly Asn ser Gly Phe Thr Tyr 1170 1175 1180

Ser Thr Pro Ala Phe ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser rle ser Ala 1185 1190 1195 Tf00

Pro Lys Phe Asn ser Gly Ser Ser Asp Asp vai Arg Tyr vai Asn Ala 1205 1210 , 1215

Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu 3.220 1225

Pro Asn Ala Thr ser Met Phe Asp Asp Tyr Gin Gly Asp ser ser Thr 1235 1240 1245

Leu Leu Ala ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser Lys 1250 12S5 1260

Pro Lys Ala ser Leu ^p^Ile Asp Leu Arg Val^Thr ser Lys Ser Ly|^

Glu ser Gly Leu ser Asp vai ser Arg JJçq5®** Phe Cys H’S i295S6r

Cys Gly h1s vai sei^Glu Gly Lys Ar^Arg Phe Thr Tyr A|j3QHls Ala

Glu Leu Glu Arg°Lys ile Ala Cys cys Ser Pro Pro Pro Asp Tyr Asn 1315 1320 1325

Ser vai vai Leu Tyr ser Thr Pro Pro Ile 1330 1335 <210> 16 <211> 5830 <212> ONA <213> Homo sapiens <400> 16 65 actgagtccc gggaccccgg gagagcggtc agtgtgtggt cgctgcgttt cctctgcctg cgccgggcat cacttgcgcg ccgcagaaag tccgtctggc agcctggata tcctctccta ccggcacccg cagacgcccc tgcagccgcc ggtcggcgcc cgggctccct agccctgtgc gctcaactgt cctgcgctgc ggggtgccgc gagttccacc tccgcgcctc cttctctaga caggcgctgg gagaaagaae cggctcccga gttctgggca tttcgcccgg ctcgaggtgc aggatgcaga gcaaggtget gctggccgtc gccctgtggc tctgcgtgga gacccgggcc gcctctgtgg gtttgcctag tgtttctctt gatctgccca ggctcagcat acaaaaagac atacttacaa ttaaggctaa tacaactctt caaattactt gcaggggaca gagggacttg gactggcttt ggcccaataa tcagagtggc agtgagcaaa gggtggaggt gactgagtgc agcgatggcc tcttctgtaa gacactcaca attccaaaag tgatcggaaa tgacactgga gcctacaagt gcttctaccg ggaaactgac ttggcctcgg tcatttatgt etatgttcaa 66 gattacagat ctccatttat tgcttetgtt agtgaccaac atggagtcgt gtacattact 720 gagaacaaaa acaaaactgt ggtgattcca tgtctcgggt ccatttcaaa tctcaacgtg 780 tcactttgtg caagataccc agaaaagaga tttgttcctg atggtaacag aatttcctgg 840 gacagcaaga agggctttac tattcccagc tacatgatca gctatgctgg catggtcttc 900 tgtgaagcaa aaattaatga tgaaagttac cagtctatta tgtacatagt tgtcgttgta 960 gggtatagga tttatgatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 1020 gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 1080 tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaace 1140 cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 1200 agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 1260 acatttgtca gggtccatga aaaacctttt gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 1320 gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 1380 ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 1440 gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cactgtcatc 1500 cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt tgtgtatgtc 1560 ccaccccaga ttggtgagaa atctctaatc tctcctgtgg attcctacca gtacggcacc 1620 actcaaacgc tgacatgtac ggtctatgcc attcctcccc cgcatcacat ccactggtat 1680 tggcagttgg aggaagagtg cgccaacgag cccagccaag ctgtctcagt gacaaaccca 1740 tacccttgtg aagaatggag aagtgtggag gacttccagg gaggaaataa aattgaagtt 1800 aataaaaatc aatttgctct aattgaagga aaaaacaaaa ctgtaagtac ccttgttatc 1860 caagcggcaa atgtgtcagc tttgtacaaa tgtgaagcgg tcaacaaagt cgggagagga 1920 gagagggtga tctccttcca cgtgaccagg ggtcctgaaa ttactttgca acctgacatg 1980 cagcccactg agcaggagag cgtgtctttg tggtgcactg cagacagatc tacgtttgag 2040 aacctcacat ggtacaagct tggcccacag cctctgccaa tccatgtggg agagttgccc 2100 acacctgttt gcaagaactt ggatactctt tggaaattga atgccaccat gttctctaat 2160 agcacaaatg acattttgat catggagctt aagaatgcat ccttgcagga ccaaggagac 2220 tatgtctgcc ttgctcaaga caggaagacc aagaaaagac attgcgtggt caggcagctc 2280 acagtcctag agcgtgtggc acccacgatc acaggaaacc tggagaatca gacgacaagt 2340 attggggaaa gcatcgaagt ctcatgcacg gcatctggga atccccctcc acagatcatg 2400 tggtttaaag ataatgagac ccttgtagaa gactcaggca ttgtattgaa ggatgggaac 2460 cggaacctca ctatccgcag agtgaggaag gaggacgaag gcctctacac ctgccaggca 2520 tgcagtgttc ttggctgtgc aaaagtggag gcatttttca taatagaagg tgcccaggaa 2580 aagacgaact tggaaatcat tattctagta ggcacggcgg tgattgccat gttcttctgg 2640 ctacttcttg tcatcatcct acggaccgtt aagcgggcca atggagggga actgaagaca 2700 ggctacttgt ccatcgtcat ggatccagat gaactcccat tggatgaaca ttgtgaacga 2760 ctgccttatg atgccagcaa atgggaattc cccagagacc ggctgaagct aggtaagcct 2820 cttggccgtg gtgcctttgg ccaagtgatt gaagcagatg cctttggaat tgacaagaca 2880 gcaacttgca ggacagtagc agtcaaaatg ttgaaagaag gagcaacaca cagtgagcat 2940 cgagctctca tgtctgaact caagatcctc attcatattg gtcaccatct caatgtggtc 3000 aaccttctag gtgcctgtac caagccagga gggccactca tggtgattgt ggaattctgc 3060 aaatttggaa acctgtccac ttacctgagg agcaagagaa atgaatttgt cccctacaag 3120 accaaagggg cacgattccg tcaagggaaa gactacgttg gagcaatccc tgtggatctg 3180 aaacggcgct tggacagcat caccagtagc cagagctcag ccagctctgg atttgtggag 3240 gagaagtccc tcagtgatgt agaagaagag gaagctcctg aagatctgta taaggacttc 3300 ctgaccttgg agcatctcat ctgttacagc ttccaagtgg ctaagggcat ggagttcttg 3360 gcatcgcgaa agtgtatcca cagggacctg gcggcacgaa atatcctctt atcggagaag 3420 aacgtggtta aaatctgtga ctttggcttg gcccgggata tttataaaga tccagattat 3480 gtcagaaaag gagatgctcg cctccctttg aaatggatgg ccccagaaac aatttttgac 3540 agagtgtaca caatccagag tgacgtctgg tcttttggtg ttttgctgtg ggaaatattt 3600 tccttaggtg cttctceata tcctggggta aagattgatg aagaattttg taggcgattg 3660 aaagaaggaa ctagaatgag ggcccctgat tatactacac cagaaatgta ccagaccatg 3720 ctggactgct ggcacgggga gcccagtcag agacccaegt tttcagagtt ggtggaacat 3780 ttgggaaatc tcttgcaagc taatgctcag caggatggca aagactacat tgttcttccg 3840 atatcagaga ctttgagcat ggaagaggat tctggactct ctctgcctac ctcacctgtt 3900 tcctgtatgg aggaggagga agtatgtgac cccaaattcc attatgacaa cacagcagga 3960 atcagtcagt atctgeagaa cagtaagcga aagagccggc Ctgtgagtgt aaaaacattt 4020 gaagatatcc cgttagaaga accagaagta aaagtaatcc cagatgacaa ccagacggac 4080 agtggtatgg ttcttgcctc agaagagctg aaaactttgg aagacagaac caaattatct 4140 ccatcttttg gtggaatggt gcccagcaaa agcagggagt ctgtggcatc tgaaggctca 4200 aaccagacaa gcggctacca gtccggatat cactccgatg acacagacac caccgtgtac 4260 tccagtgagg aagcagaact tttaaagctg atagagattg gagtgcaaac cggtagcaea 4320 gcccagattc tccagcctga ctcggggacc acactgagct ctcctcctgt ttaaaaggaa 4380 gcatccacac cccaactccc ggacatcaca tgagaggtct gctcagattt tgaagtgttg 4440 ttctttccac cagcaggaag tagccgcatt tgattttcat ttcgacaaca gaaaaaggac 4500 ctcggactgc agggagccag tcttctaggc atatcctgga agaggcttgt gacccaagaa 4560 tgtgtctgtg tcttctccea gtgttgacct gatcctcttt tttcattcat ttaaaaagea 4620 ttatcatgcc cctgctgcgg gtctcaccat gggtttagaa caaagagctt caagcaatgg 4680 ccccatcctc aaagaagtag cagtacctgg ggagctgaca cttctgtaaa actagaagat 4740 aaaccaggca acgtaagtgt tcgaggtgtt gaagatggga aggatttgea gggctgagtc 4800 tatccaagag gctttgttta ggacgtgggt cccaagccaa gccttaagtg tggaattcgg 4860 67 attgatagaa aggaagacta acgttacctt gctttggaga gtactggagc ctgcaaatgc 4920 attgtgtttg ctctggtgga ggtgggcatg gggtctgttc tgaaatgtaa agggttcaga 4980 cggggtttct ggttttagaa ggttgcgtgt tcttcgagtt gggctaaagt agagttcgtt S040 gtgctgtttc tgactcctaa tgagagttcc ttccagaccg ttagctgtct ccttgccaag 5100 ccccaggaag aaaatgatgc agctctggct ccttgtctcc caggctgatc ctttattcag 5160 aataccacaa agaaaggaca ttcagctcaa ggctccctgc cgtgttgaag agttctgact S220 gcacaaacca gcttctggtt tcttctggaa tgaataccct catatctgtc ctgatgtgat 5280 atgtctgaga ctgaatgcgg gaggttcaat gtgaagctgt gtgtggtgtc aaagtttcag 5340 gaaggatttt acccttttgt tcttccccct gtccccaacc cactctcacc ccgcaaccca 5400 tcagtatttt agttatttgg cctctactcc agtaaacctg attgggtttg ttcactctct 5460 gaatgattat tagccagact teaaaattat tttatagccc aaattataac atctattgta 5520 ttatttagac ttttaacata tagagctatt tctactgatt tttgcccttg ttctgtcctt 5580 tttttcaaaa aagaaaatgt gttttttgtt tggtaccata gtgtgaaatg ctgggaacaa 5640 tgactataag acatgctatg gcacatatat ttatagtctg tttatgtaga aacaaatgta 5700 atatattaaa gccttatata taatgaaett tgtactattc acattttgta tcagtattat 5760 gtagcataac aaaggtcata atgctttcag caattgatgt cattttatta aagaacattg 5820 aaaaacttga 5830 <210> 17 <211» 1356 <212> PRT <213> Homosapiens <400> 17 68

Met Gin Ser 1 Thr Arg Ala Arg Leu ser 35 Leu Gin Ile 50 Asn Asn Gin 65 Asp Gly Leu Asp Thr Gly Vai Ile Tyr 115 vai ser Asp 130 Thr Vai Vai 145 Leu Cys Ala lie Ser Trp Ser Tyr Ala 195 Tyr Gin ser 210 Asp vai vai 225 Lys Leu Vai Asp Phe Asn vai Asn Arg 275 Leu Ser Thr 290 Tyr Thr cys 305 phe Vai Arg Glu ser Leu

Lys vai Leu Leu Ala vai 5 Ala ser Vai Gly Leu Pro 20 „ 25 lie Gin Lys Asp lie teu 40 Thr Cys Arg Gly Gin Arg 55 Ser Gly Ser Glu Gin Arg 70 phe cys Lys Thr Leu Thr 85 Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr 100 105 vai Tyr Vai Gin Asja Tyr Gin His Gly vai vai Tyr 135 lie Pro Cys Leu Gly ser 150 Arg Tyr Pro Glu tys Arg 165 Asp Ser Lys Lys Gly Phe 180 185 Gly Met vai Phe cys Glu 200 ile Met Tyr lie vai vai 215 Leu ser Pro Ser His Gly 230 Leu Asn cys Thr Ala Arg 245 Trp Glu Tyr Pro Ser ser 260 265 Asp Leu Lys Thr Gin ser 280 Leu Thr lie Asp Gly vai 295

Ala Ala Ser Ser Gly Leu 310 vai His Glu Lys Pro Phe 325 vai Glu Ala Thr Vai Gly 340 345

Ala 10 Ser Thr Asp vai ile 90 Arg Arg ile ile Phe 170 Thr Ala vai Ile Thr 250 Lys Gly Thr Met Vai 330 Glu

Leu vai ile Leu Glu 75 Pro Glu Ser Thr Ser 155 vai He Lys Vai Glu 235 Glu His ser Arg Thr 315 Ala Arg

Trp Leu Cys ser Leu Asp 30

Lys Ala Asn 45

Asp Trp Leu 60 val Thr Glu Lys vai lie Thr Asp Leu 110 Pro Phe Ile 125 Glu Asn Lys 140 Asn Leu Asn pro Asp Gly pro Ser Tyr 190 lie Asn Asp 20522$ Τ^Γ ΑΓ9 Leu ser vai Leu Asn vai Gin His Lys 270

Glu Met Lys 285 ser Asp Gin 300 Lys Lys Asn

Phe Gly ser vai Arg ile 350 val 15 Leu

Thr Trp cys Gly 95 Ala Ala Asn val Asn 175

Met Glu He Gly Gly 255 Lys Lys Gly ser Gly 335

Pro

Glu pro Thr pro ser 80 Asn Ser Ser Lys Ser 160 Arg Ile Ser Tyr Glu 240 Ile Leu phe Leu Thr 320 Met Ala 69

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro pro Pro 355 His 360 lie pro Leu Glu Ser Asn Thr 370 375 xle Met Glu Vai Ser Glu Arg ASp 385 He 390 Glu Lys Thr Asn Pro Ser Lys 405 Gly vai Tyr Vai Pro Pro Gin lie 420 Thr 440 ASp Ser Tyr 435 Glfl Tyr Gly Thr Ala lie Pro Pro Pro His His Xle 450 455 Gin Glu cys Ala Asn Glu pro ser 465 470 val pro cys Glu Glu Trp Arg Ser 485 Phe Xle Glu Vai Asn Lys Asn Gin 500 Gin Thr vai Ser Thr Leu val Ile 515 520 Lys Cys 530 Glu Ala val Asn Lys 535 val Phe His Vai Thr Arg Gly Pro Glu S4S 550 val Pro Thr Glu Gin Glu ser Ser 565 Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr 580 Thr lie His Vai Gly Glu Leu pro 595 600 Leu Trp Lys Leu Α5Π Ala Thr Met 610 615 Ala Leu lie Met Glu Leu Lys Asn 625 Gin 645 Vai 630 vai Cys Leu Ala Asp Arg Lys Arg Gin Leu Thr Leu Glu Arg 660 lie Leu Glu Asn Gin Thr Thr Ser 675 680 Thr Ala ser Gly Asn Pro pro Pro 690 695 Gly Glu Thr Leu Vai Glu Asp Ser 705 710 Val ASO Leu Thr il e Arg 725 Ser Arg Arg cys Gin Ala Cys Val Leu Gly 740 lie lie Glu Gly Ala Gin Glu Lys 755 760 Vai Gly 770 Thr Ala Val Xle Ala Met 775 Ala lie Leu Arg Thr Vai Lys Arg 785 Val 790 Tyr Leu Ser ile Met Asp pro 805 Ala Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 820 Arg Leu Lvs 835 Leu Gly Lys Pro Leu 840 lie Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile 850 vai 855 Glu vai Ala Lys Met Leu Lys 865 Glu 870 Xle Ala Leu Met Ser Leu Lys 885 Asn Vai vai Asn Leu Leu Gly Ala 900

Glu Ile Lys Trp Tyr 365 HiS Lys Asn Gly He Lys Ala Gly 380 Val Leu Thr Thr Gly Asn 395 Tyr Thr Val Ile Leu 400 Gin Ser 410 His val val Ser Leu val 415 Glu 425 Lys Ser Leu Ile Ser 430 Pro Val Gin Thr Leu Thr Cys 445 Thr val Tyr His Trp Tyr Trp 460 Gin Leu Glu Glu Ala val ser 475 val Thr Asn Pro Tyr 480 Glu Asp 490 Phe Gin Gly Gly Asn Lys 495 Ala 505 Leu ile Glu Gly Lys 510 Asn Lys Ala Ala Asn val ser 525 Ala Leu Tyr Gly Arg Gly Glu 540 Gin Arg val Ile Ser lie Thr Leu 555 Pro Asp Met Gin 560 Leu Trp 570 cys Thr Ala Asp Arg Ser 575 Lys 585 Leu Gly Pro Gin pro 590 Leu Pro Pro val Cys Lys Asn 605 Leu Asp Thr Phe Ser Asn ser 620 Thr Asn Asp xle Ser Leu Gin 635 Asp Gin Gly Asp Tyr 640 Thr Lys 650 Lys Arg His Cys val val 655 Val 665 Ala pro Thr Ile Thr 670 Gly Asn Gly Glu Ser Ile Glu 685 Val Ser cys Gin Ile Met Trp 700 phe Lys Asp Asn Xle val Leu 715 tys Asp Gly Asn Arg 720 Lys Glu 730 ASp Glu Gly Leu T^r Thr cys 745 Ala Lys val GlU Ala 750 Phe Phe Thr Asn Leu Glu ile 765 ile xle Leu Phe Phe Trp Leu 780 Leu teu val ile Α5Π Gly Gly 795 Glu Leu Lys Thr Gly 800 Asp Glu 810 Leu pro Leu Asp Glu His 815 Ser 825 Lys Trp Glu Phe Pro 830 Arg Asp Gly Arg Gly Ala Phe 845 Gly Gin val Asp Lys Thr Ala 860 Hi S Thr Cys Arg Thr Gly Ala Thr 875 Ser Glu His Arg 880 Leu He 890 His Ile Gly HiS His Leu 89S Cys 905 Thr Lys pro Gly Gly 910 pro Leu 70

Met val ile vai Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr teu 915 920 925

Arg ser Lys Arg Asn Glu Phe vai Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940

Phe Arg Gin Gly Lys Asp Tyr vai Gly Ala Ile Pro vai Asp Leu Lys 945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser ile Thr Ser Ser Gin Ser Ser Ala ser Ser Gly 965 970 975

Phe vai Glu Glu Lys ser Leu ser Asp Vai Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 . 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu ile cys Tyr 995 1000 1005 ser Phe Gin vai Ala tys Gly Met Glu Phe Leu Ala ser Arg Lys Cys 1010 1015 1020

Ile Mis Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn 1025 1030 1035 1040 val val Lys ile cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp ile Tyr Lys Asp 1045 1050 1055

Pro Asp Tyr val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met 1060 1065 1070

Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg val Tyr Thr He Gin Ser Asp Val 1075 1080 L 1085

Trp ser Phe Gly val Leu Leu Trp Glu Ile Phe ser Leu Gly Ala ser 1090 1095 , 1100 pro Tvr pro Gly val Lys ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu tys 1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr 1125 1130 1135

Gin Thr Met Leu Asp cys Trp His Gly Glu Pro ser Gin Arg Pro Thr 1140 1W5 1150

Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gin Ala Asn Ala 1155 1160 1165

Gin Gin Asp Gly Lys Asp Tyr ile val Leu Pro ile ser Glu Thr Leu 1170 1175 U80 ser Met Glu Glu Asp ser Gly Leu ser teu fro Thr ser Pro val Ser 1185 119Q H95 1200 cys Met Glu Glu Glu Glu val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn 1205 1210 1215

Thr Ala Gly ile Ser Gin Tyr Leu Gin Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg 1220 1225 „ 1230

Pro val ser val Lys Thr phe Glu Asp ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245

Val Lys val Ile Pro Asp Asp Asn Gin Thr Asp Ser Gly Met val Leu 1250 1255 1260

Ala ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu ser pro 1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser val Ala Ser 1285 1290 1295

Glu Gly ser Asn Gin Thr Ser Gly Tyr Gin Ser Gly Tyr His ser Asp 1300 1305 „ _ _ 1310

Asp Thr asp Thr Thr val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys 1315 1320 1325

Leu Ile Glu ile Gly val Gin Thr Gly Ser Thr Ala Gin ile leu Gin 1330 1335 1340

Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val 1345 1350 1355

<21G> 18 <211> 675 <212> DMA <213> Artificiai sequence <220> <223> Recombínant fusion protein or sequence encoding same <4Q0> 18 71 atggtcagct actgggacac cggggtcctg acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc ttaaaaaagt ttccacttga cacfcttgatc agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg geaacagtca atgggcattt gtataagaca cgagaaceae aggtgtacac cctgccccca agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac tctccgggta aatag ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120 cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180 cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240 tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300 aactatctca cacatcgaca aacccagccc 360 tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 420 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 480 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc S40 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 600 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 660

<210 19 <211 > 224 <212> PRT <213» Artificial sequence <220> <223» Recomblnant fuslon protein or sequence encoding same <400 19 vai Ser Tyr Trp s ASp Thr Gly val Leu 10 Pro Leu cys Ala Leu Leu 15 Tyr Ser Leu Leu Leu Thr Gly ser Gly Arg Phe vai Glu Met Ser 20 25 Glu 30 Ile Pro Glu lie lie HÍS Met Thr Glu Gly Arg Leu Val He 35 40 Thr 45 Cys Arg vai Thr Ser Pro Asn lie Thr vai Leu Lys Lys Phe 50 55 60 xle Leu Asp Thr Leu lie Pro Asp Gly Lys Arg lie Trp Asp ser 70 75 Glu He 80 uys Gly phe lie 85 lie Ser Asn Ala Thr Tyr 90 Lys Gly 95 Leu Thr cys Glu Ala Thr Vai Asn Gly HÍS Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 100 105 Gin val 110 Thr Thr HÍS Arg Gin Thr Gin Pro Arg Glu Pro Tyr Leu 115 120 125 Thr Pro ser Arg Asp elu Leu Thr Lys Asn Gin vai Ser Leu Cys 130 135 140 Glu Glu vai Lys Gly Phe Tyr 150 Pro ser ASp lie Ala 155 vai Trp Ser 160 Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp 165 170 Val 175 Asp Gly ser 180 phe Phe Leu Tyr ser 185 Lys Leu Thr Asp 190 Lys Ser Trp Gin Gin Gly Asn vai Phe ser Cys Ser val Met HÍS Glu Ala 195 200 205 Gly HÍS Asn HÍS Tyr Thr Gin Lys ser Leu Ser Leu Ser Pro Lys 210 215 220 <210 20 <211> 717 <212> DNA <213» Artificial Sequence

Met 1 cys

Glu

Pro

Pro 65

Arg

Leu

Pro

Leu 145 AST1 ser

Arg

Leu <220 <223> Recombinsnt fusion protein or sequence encoding same <400 20 72 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagetg tctgcttctc acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccecttcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc tgcaatcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgae ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc egtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag

<210 21 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant fusion proiein or sequence encociing same <400 21

Met val Ser Tyr rrp Asp Thr Gly val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 Val Glu 15 Cys Leu Leu LêU Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Met Tyr ser 20 25 30 Val He Glu He Pro Glu ile xle HÍS Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Phe Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn ile Thr val Thr Leu Lys Lys 50 55 60 xle Ser ΡΓΟ Leu Asp Thr Leu ile Pro Asp Gly Lys Arg lie Trp Asp 65 70 75 Glu Gly 95 80 Arg Lys Gly Phe lie 85 lie Ser Asn Ala Thr Tyr 90 Lys Ile teu Leu Thr Cys Glu Ala Thr val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 100 105 110 Gly Leu Thr Hl S Arg Gin Thr Pro Ser cys val Pro Leu Met Arg cys 115 120 Gin Val 125 Pro Gly CVS Cys Asn Gin Pro Arg Glu Pro Tyr Thr Leu pro 130 135 140 val 160 Ser 145 Arg Asp Glu Leu Thr 150 Lys Asn Gin Val Ser 155 Leu Thr Cys Leu Lys Gly Phe Tyr Pro 165 Ser Asp lie Ala Val Glu 170 Trp Glu ser Asn 175 Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu ASp Ser Asp 180 185 190 Trp Gly Ser Phe 195 Phe Leu Tyr Ser Lys 200 Leu Thr val Asp 2lí Ser Arg Gin Gin Gly Asn val Phe ser Cys ser val Met Hís Glu Ala Leu HÍS 210 215 220 Gly Asn Hís Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Lys 225 230 235

<210> 22 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 <223> Recombinant fusion protein or sequence encociing same 60 120 ISO 240 300 360 420 4S0 540 600 660 717 73 <400 22 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 702 atggteagct acaggatctg actgaaggaa ttaaaaaagt agaaagggct gcaacagtca ggtggaggtg cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc actgggacac gtagaccttt gggagctcgt ttccacttga tcatcatatc atgggeattt gaggtggagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct cggggtcctg cgtagagatg cattccctgc cactttgatc aaatgcaacg gtataagaca tcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct ctgtgcgcgc tacagtgaaa cgggttacgt cctgatggaa tacaaagaaa aactatctca gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tgctcagctg tccccgaaat cacctaacat aacgcataat tagggcttct cacatcgaca tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ag tctgcttctc tatacacatg cactgttact ctgggacagt gacctgtgaa aaccggtgga gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac

<210 23 <211*233 <212> PRT <213* Artificial sequence <220> <223* Recombinant fusion protein or sequence encoding same <400* 23

Gly vai Leu Leu cys Ala Leu Leu Ser 10 15 Gly Arg Pro Phe val Glu Met an Tyr Ser Met C. D Thr Glu Gly Arg Glu JW Leu val ile 40 45 Phe ASh Ile Thr val Thr Leu Lys Lys 60 Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser 80 Asn Ala Thr / J Tyr Lys Glu ile sly OV teu 90 95 Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr i m Asn Tyr Gly 120 Xv ) Gly Gly Gly Gly m Gly Gly Gin Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 140 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 155 Glu 160 Glu Ser Asn Gly Gin Pro Asn A$n 170 phe 190 175 Leu Asp 185 Ser Asp Gly Ser Phe Leu Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val 200 205 Thr Gin Glu Ala Leu His Asn His Tyr 220 Gly Lys

Met 1 Vai Ser Tyr Trp S Asp Thr Cys Leu Leu teu 20 Glu Thr Gly Ser Glu Ile Pro 35 Ile ile His ΡΓΟ a* Arg vai Thr ser Pro 55 pro 65 Leu Asp Thr Leu Ile 70 Pro Arg Lys Gly phe ile 85 Ala ile Ser Leu Thr Cys Glu 100 Thr Vai teu Thr HÍ5 115 Arg Gin Thr Gly ΡΓ0 Arg 130 Glu Pro Gin Vai Tyr 135 Thr 145 Lys Asrt Gin vai Ser 150 Leu Ser Asp lie Ala Vai 165 Glu Trp Tyr Lys Thr Thr 180 Pro Pro vai Tyr Ser Lys 195 Leu Thr vai ASP Phe Ser 210 Cys Ser vai Met HiS 215 Lys 225 Ser Leu Ser Leu Ser 230 pro <210*24 <211* 1095 <212> DNA <213* Artificial Sequence <220* <223* Recombinant fusion protein or sequence encoding same 74 «40Ο> 24 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360 ggtggatcgg gtggaggtgg atcgggtgga ggtggatcgc ctaagagctg cgacaaaact 420 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 480 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 540 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 600 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca aeagcacgta ccgtgtggtc 660 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 720 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 780 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 840 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 900 aatgggeagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 960 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1020 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1080 tctccgggta aatag 1095

«210 25 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinanífusion prateio or saquanee sncodíng same <400> 25 75

Met 1 vai ser Tyr Trp 5 cys Leu Leu Leu 20 Thr Glu lie Pro 35 Glu lie pro cys 50 Leu Arg vai Thr Pro 65 Arg ASP Thr Leu Lys Gly Phe lie 85 Ala Leu Thr cys Glu 100 Leu Thr HÍS 115 Gly Arg Gin Gly Gly 130 Gly Ser Pro 145 cys pro Ala Pro pro pro Lys Pro Lys 165 Thr cys vai vai 180 vai Asn Trp Tyr 195 vai Asp Arg Glu 210 Leu Glu Gin Tyr vai 225 HÍS Gin ASp Ser Asn Lys Ala Leu 245 Lys Gly Gin pro 260 Thr Arg ASP Glu Leu 275 Lys Phe Tyr 290 Pro ser Asp Glu 305 Asn Asn Tyr Lys phe Phe Leu Tyr Ser 325 Gly Asn vai phe 340 Lys ser Tyr Thr Gin 355 ser <210 26 <211>9 <212* PRT <213> Artificial seque π ee <220> <223> íínkerof fusion protein <400> 26

Asp Thr Gly vai Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 10 val 15 Gly Ser Gly Arg Pro phe Glu Met ryr Ser 25 30 xle HÍS Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu val xle 40 45 ser Pro Asn He Thr vai Thr Leu Lys Lys Phe 55 60 ile Pro ASp Gly Lys Arg xle lie Trp Asp ser 70 75 80 He Ser ASri Ala Thr Tyr Lys Glu ile Gly Leu 90 95 Thr Vai Asn Gly HÍS Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr 105 110 Thr Gly Gly 120 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 125 His Thr Gly ser pro Lys Cys Asp Lys Thr Cys Pro 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe teu Phe 150 155 160 Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr pro Glu val 170 175 ASp vai ser HÍS Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 185 190 Gly vai Glu 200 Vai HÍS Asn Ala Lys Thr 205 Lys Pro Asn ser Thr Tyr Arg val Val ser val Leu Thr 215 220 Lys val 240 Trp 230 Leu Asn Gly Lys Glu 235 Tyr tys cys Pro Ala pro ile Glu 250 Lys Thr Ile Ser L|| Ala Glu Pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 265 270 Lys Gly Asn Gin vai Ser Leu Thr Cys Leu val 280 285 ile Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin Pro 295 300 Gly ser Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp 310 315 320 Lys Leu Thr Vai ASP Lys Ser Arg Trp Gin Gin 330 Ala 335 Cys ser vai Met HÍS Glu Leu His Asn His 345 350 Leu ser Leu ser pro Gly Lys 360

Gly Asp Leu lie T^r Arg Asn Gin Lys <210 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence 76 <220 <223> Iinker moiety for fusion proteins <400 27

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 S

<210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220 <223> iinker moiely for fusian proteins <400> 28

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 29 <211> 9

<212> PRT <213> Artificiai Sequence <220 <223> iinker moiety for fusion proteins <400 29 ser Ser Ser ser ser ser Ser ser ser 1 5

<210 30 <211> 9 <212> PRT <213» Artificial Sequence <22Q> <223> Iinker moiety for fusion proteins <400> 30

Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys

<210> 31 <211 > 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220 <223> Iinker moiety for fusion proteins <400 31

Gly Gly Gly Gly ser ser ser 77

<210 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificiai sequence <220 <223> iinker moiety for fusion proteins <400> 32

Ser cys vai Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn 15 10

<210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificiai Sequence <220 <223> linker moiety for fusion proteins «400> 33

Gly Asp Leu Ile T^r Arg Asn Gin Ly$

<210> 34 <211 >23 <212> PRT <213> Artificiai Sequence <220 <223> linker moiety for fusion proteins <400 34

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser cys Vai Pro Leu Met 15 10 15

Arg cys Gly Gly cys Cys Asn 78 79

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Proteina de fusão de fórmula X-Y-Z, em que: X compreende uma porção do receptor VEGF; um polipeptídeo de 5-10 Y é uma porção ligante; e resíduos de aminoácidos; e Z é domínio de multimerização, em que a porção ligante Y é um polipeptídeo de 5-50 resíduos de aminoácidos a um ligante Y está a ter uma flexibilidade maior do que média, conforme determinado pelo método de previsão de flexibilidade de Karpus e Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, e em que a referida fusão se liga ao VEGF quando multimerizado.
2. Proteína de fusão da reivindicação 1, em que a porção ligante Y é selecionada de entre o grupo que consiste em: Gly9 (SEQ ID NO: 27), Glug (SEQ ID NO: 28), Serg (SEQ ID NO: 29), Gly5 CysProgCys (SEQ ID: 30) , (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 32), ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 13) , GlyAspLeulleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID NO: 26), GlygProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 34). 1
3. Proteína de fusão da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o domínio Z de multimerização provoca a migração de, pelo menos, 50% das proteínas de fusão monoméricas num gel de poliacrilamida não desnaturante a uma taxa que é apropriada para um multímero da proteína de fusão.
4. Proteína de fusão da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o domínio de multimerização Z é um fragmento de uma cadeia pesada de IgG.
5. Proteína de fusão da reivindicação 4, em que o domínio de multimerização Z é uma sequência de uma porção Fc de uma cadeia pesada de IgGl ou IgG2.
6. Proteína de fusão da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o domínio de multimerização Z é uma região CH3 de uma cadeia pesada de IgG ou uma porção Fc de uma molécula de anticorpo.
7. Proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que X compreende o domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1.
8. Proteína de fusão da reivindicação 7, em que X compreende o domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1, mas não possui os domínios semelhantes de Igl e 3 de VEGF-R1.
9. Proteína de fusão da reivindicação 8, em que X é o domínio semelhante a Ig2 de VEGF-R1.
10. Composição compreendendo a proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1-9, e um ou mais veículos farmacêuticos aceitáveis.
11. Método de multimerização de um polipeptídeo X, compreendendo o método a ligação do polipeptídeo X a um polipeptídeo Z através de um polipeptídeo Y de modo a 2 formar um polipeptídeo X-Y-Z, em que: X compreende uma porção de um receptor VEGF; Y é uma porção ligante; e Z é um dominio de multimerização, em que a porção ligante Y é um polipeptídeo de 5-50 resíduos de aminoácidos que têm uma maior flexibilidade do que média conforme determinado pelo método de previsão de flexibilidade de Karpus e Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, e em que a referida proteína de fusão se liga ao VEGF quando multimerizado.
12. Método da reivindicação 11, em que o passo de ligação compreende a construção de uma molécula de ácido nucleico que codifica a X, Y e Z como polipeptídeos de um único quadro de leitura aberta, em que o referido polipeptídeo X-Y-Z é expresso, a partir da referida molécula de ácido nucleico numa célula hospedeira.
13. Molécula de ácido nucleico que codifica a proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
14. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 13, que codifica para uma proteína de fusão da reivindicação 1, em que a proteína de fusão compreende uma sequência que é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 8, 21, 23 e 25.
15. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 13 ou 14.
16. Vector da reivindicação 15, em que o vector é um vector de vírus adeno-associado.
17. Célula de mamífero que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 13 ou 14, ou o vector da reivindicação 15 ou 16. 3
18. Método in vitro que compreende o fornecimento de ácido nucleico da reivindicação 13 ou 14, ou o vector da reivindicação 15 ou 16 para uma célula de mamifero, de modo a formar uma célula que expressa a dita proteína de fusão.
19. Proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, a molécula de ácido nucleico da reivindicação 13 ou 14, o vector da reivindicação 15 ou 16, ou a célula de mamífero da reivindicação 17, para utilização no tratamento de um mamífero.
20. Proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vector ou célula de mamífero para utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o mamífero tem degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, cancro, artrite reumatóide, asma ou osteoartrite. 4