ES2407859T3

ES2407859T3 - Construcciones multiméricas.

Info

Publication number: ES2407859T3
Application number: ES10165159T
Authority: ES
Inventors: Abraham Scaria; Peter Pechan; Samuel Wadsworth
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2013-06-14
Anticipated expiration: 2025-09-13
Also published as: PT2229956E; US20180155417A1; WO2006031689A3; IL216095A; EP1804835A4; US8658602B2; EP2229956A1; IL216095A0; DK2229956T3; CN101094688A; CN101094688B; WO2006031689A2; DE602005021811D1; CY1114155T1; EP1804835B1; US20070224178A1; ES2347340T3; US20110268735A1; US9815892B2; PL1804835T3

Abstract

Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende una porción del receptor de VEGF; Y es un resto enlazador; y Z es un dominio de multimerización, en donde el resto enlazador Y es un polipéptido de 5-50 restos aminoacídicos que tiene una flexibilidad por encimade la media como se determina por el método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz, 1985, Naturwiss, 72:212-213, y donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.

Description

Construcciones multiméricas.

Campo de la invención

La invención se refiere a proteínas construidas de forma recombinante útiles para tratar la neovascularizaciónpatológica, por ejemplo, asma, artritis, cáncer, y degeneración macular.

Antecedentes de la invención

La neovascularización patológica es un componente clave de enfermedades como degeneración macular relacionada con la edad (AMD) húmeda, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, osteoartritis, y asma. También desempaña un papel importante en el crecimiento y propagación de tumores. La neovascularización estáregulada por un delicado equilibrio de factores pro- y anti-angiogénicos.

Se sabe que el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es necesario para la neovascularización. Se ha demostrado que la inhibición de la actividad VEGF inhibe la neovascularización en modelos animales de AMD,artritis y en diversos modelos de tumor. Los métodos usados para inhibir la actividad VEGF incluyen anticuerpos,proteínas de fusión receptoras, péptidos y pequeñas moléculas.

Se ha demostrado que las proteínas VEGF-R1 (Flt-1) y VEGF-R2 (KDR) se unen a VEGF con elevada afinidad. Tanto Flt-1 como KDR tienen siete dominios tipo Ig en su región extracelular. Se ha demostrado que el domino 2 es esencial para la unión a VEGF. Fusiones de cada uno de los receptores solubles de longitud completa (dominios 17) y los dominios 1-3 con Fc de IgG se unen a VEGF de forma eficaz. Las fusiones de Fc de IgG con el dominio tipoIg 2 solo, sin embargo, eran incapaces de unirse a VEGF, ya que eran una combinación de dominio tipo Ig 1 y 2.Davis-Smyth, 1996. Por lo tanto, los dominios tipo Ig 1 y 3 parecen ser necesarios junto con el dominio 2 para launión eficaz a VEGF.

Holash et al. (Proceedings of the National Academy of Science, vol. 99(17): 11393-11398 (2002)) describepolipéptidos de fusión adicionales que comprenden partes del receptor de VEGF-R1 fusionadas a la parte Fc de lacadena pesada de IgG1.

WO 00/75319 describe polipéptidos que son receptores Flt1 quiméricos modificados y se dice que tienen un perfilfarmacocinético mejorado.

WO 97/44453 describe proteínas que son receptores quiméricos de VEGF y se dice que se unen a VEGF y queantagonizan su actividad angiogénica y proliferativa de las células endoteliales.

Olafsen et al. (Protein Engineering, Design & Selection, v. 17(4), p. 315-323 (2004)) describe la caracterización defragmentos de anticuerpos anti-p185HER-2 (scFv-CH3)2 construidos por ingeniería genética.

Hu et al. (Cancer Research, v. 56(13), p. 3055-3061 (1996)) describe un fragmento de anticuerpo anti-antígenocarcinoembrionario (scFv-CH3) construido por ingeniería genética y se dice que presenta focalización rápida y precisa de xenoinjertos.

Breve sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusióntiene la fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptorextracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y constaesencialmente de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadenapesada de IgG.

Otro aspecto de la presente descripción es un polipéptido de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador queproporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG.

Otro aspecto más de la presente descripción es una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo,una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restosaminoacídicos. Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

La presente descripción también proporciona una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptidoseleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador queproporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

Otro aspecto más de la presente descripción es un método para multimerizar un polipéptido X. Un polipéptido X seune a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar el polipéptido XYZ. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, unacitoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restosaminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que se forma semultimeriza.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para multimerizar un polipéptido X. Elpolipéptido X se une a un polipéptido Z mediante un resto Y para formar el polímero XYZ. X comprende unpolipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo,una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador queproporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que así se forma se multimeriza.

En un aspecto de la presente descripción se proporciona un ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico codificauna proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1); un enlazador; y un dominio demultimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por lasSEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

En otro aspecto de la presente descripción se proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusión comprendeun dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y un dominio de multimerización. La proteína de fusióncomprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

En otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método in vitro. Se suministra una molécula de ácido nucleico a una célula de mamífero aislada. La molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión quecomprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1); un enlazador; y un dominio de multimerización. La proteína defusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. Laexpresión de la proteína de fusión está controlada por un promotor. Se forma una célula que expresa una proteínade fusión.

Otro aspecto más de la presente descripción es un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero.Se suministra una célula de mamífero que expresa la proteína de fusión a un mamífero. La célula expresa y secretala proteína de fusión suministrando de este modo la proteína de fusión al mamífero. La proteína de fusión comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y un dominio de multimerización. La proteína defusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

Otro aspecto de la presente descripción es un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero. Sesuministra una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y undominio de multimerización a un mamífero. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre elgrupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. Como alternativa, puede suministrarse una construcción deácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión al mamífero, por lo cual el mamífero expresa la proteína defusión.

Estos y otros aspectos de la presente descripción que se describirán en más detalle a continuación proporcionan ala técnica métodos y agentes para tratar enfermedades relacionadas con la proliferación e inflamación vascular. Losagentes pueden proporcionar estabilidad y biodisponibilidad aumentadas con relación a las formas naturales de lasproteínas.

Ahora una parte de la descripción que está contenida en este documento proporciona los aspectos y realizacionesde la presente invención. Más particularmente, un primer aspecto de la presente invención proporciona una proteínade fusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominiostipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el resto Y; Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos; y Z es una región CH3 de una molécula decadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una composición que comprende esta proteína defusión de la invención, comprendiendo dicha composición adicionalmente uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para multimerizar un polipéptido X,comprendiendo el método: unir un polipéptido X a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar unpolipéptido XYZ, en el que: X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al polipéptido Z mediante elpolipéptido Y; Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos; y Z es una región CH3 de una molécula decadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo; por lo cual el polipéptido XYZ multimeriza.

En aspectos adicionales más, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica laproteína de fusión de la presente invención, un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, una célulade mamífero que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector, y un método in Vitro que comprendesuministrar la molécula de ácido nucleico o el vector a una célula de mamífero aislada para formar una célula queexprese la proteína de fusión.

En más aspectos adicionales, la presente invención proporciona la proteína de fusión, el ácido nucleico, el vector ola célula de mamífero de la presente invención, para su uso en el tratamiento de un mamífero. En una realización, el mamífero tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda o retinopatía diabética proliferativa. En otrarealización, el mamífero tiene cáncer. En otra realización, el mamífero tiene artritis reumatoide. En otra realización, el mamífero tiene asma. En otra realización, el mamífero tiene osteoporosis.

Se exponen aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Región flexible del enlazador 9-Gly en la construcción D2-9Gly-Fc. La flexibilidad relativa predicha por el método de Karpus y Schultz (1985) muestra al enlazador de 9 unidades de poliglicina (9-Gly) (aminoácidos 94 a 103) en la proteína D2-9Gly-Fc como una región con mayor flexibilidad que el promedio (>1) en comparación con laconstrucción D2-Fc que no contiene el enlazador 9-Gly. Ambas proteínas de fusión contienen secuencias deaminoácidos idénticas encerradas en los recuadros: sp -péptido señal (aminoácidos -24 a -1), dominio 2 de Flt-1(aminoácidos 1 a 93) y los restos de IgG1-Fc (244 aminoácidos). La flecha representa el sitio de escisión por lapeptidasa señal predicha usando el programa SignalP V2.0 (Nielsen et al., 1997).

Fig. 2. Actividad biológica de D2-9Gly-Fc frente a D2-Fc. Se cultivaron células 293 en el medio de privación (M199 +FCS al 5%) y se transfectaron con plásmidos que contenían los casetes de expresión D2-9Gly-Fc y D2-Fc bajo elcontrol de promotor CMV. Se recogió el medio condicionado (CM) 72 h después. Se sembraron HUVEC en placasde 96 pocillos (2E3 células/pocillo) en medio de privación + VEGF (10 ng/ml) y se añadieron 50 !l de CM más VEGF (10 ng/ml) 24 h después. Los controles (+/- VEGF) se incubaron con CM a partir de la transfección de plásmidopEGFP de control (Clontech; pEGFP lleva una variante cambiada a rojo de la proteína fluorescente verde de tiposilvestre (GFP) que se ha optimizado para una fluorescencia más brillante y mayor expresión en células de mamífero). El control positivo se trató con 50 ng de proteína recombinante Flt-1-IgG (R&D Systems). Las HUVEC seensayaron para la proliferación 3 días después del tratamiento usando el reactivo CellTiter 96® AQueous (Promega).Los datos representan las medias de los valores promedio de la OD490 de dos experimentos cada uno ensayado por triplicado.

Fig. 3. Análisis de transferencia de Western de D2-9Gly-Fc y D2-Fc. Parece que el tamaño de las proteínas tantoD2-9Gly-Fc como D2-Fc es el doble de grande cuando migra en gel no reductor en comparación con la migración engel reductor. Las proteínas se cargaron a partir del medio condicionado después de que las transfecciones encélulas 293 de plásmidos que expresan D2-9Gly-Fc y D2-Fc se separaran por electroforesis en SDS y se transfirieran a una membrana de PVDF. La transferencia se sondeó con anticuerpos de cabra anti-Fc de IgG1humana y de conejo anti-IgG de cabra-HRP.

Fig. 4. Proteínas híbridas sFlt-1 que contienen el enlazador 9Gly y VEGF Ex3. Comparación de estructura de D29Gly-Ex3/CH3 con proteínas construidas previamente. Las tres proteínas contienen idéntica secuencia deaminoácidos del dominio 2 de Flt-1, que consta de 24 aminoácidos del péptido señal de Flt-1 y 93 aminoácidos deldominio 2 de Flt-1. D2-9Gly-Ex3/CH3 contiene 9 aminoácidos del enlazador 9Gly, 14 aminoácidos de VEGF Ex3 y 120 aminoácidos de la región CH3 de Fc de cadena pesada de IgG1 humana.

Fig. 5. Actividad biológica de D2-9Gly-Ex3/CH3 frente a D2-9Gly-Fc. La proteína D2-9Gly-Ex3/CH3, en la que eldominio 2 está conectado a la región CH3 a través del enlazador 9Gly y VEGF Ex3, también inhibe de forma eficazla proliferación de HUVEC dependiente de VEGA en comparación con las proteínas de control D2-9Gly-Fc y D2-Fc.Se usaron 50 ng de Flt-1-IgG recombinante (R&D Systems) como control.

Fig. 6. Ensayo de proliferación de HUVEC que compara la actividad proteica de D2-(Gly4Ser)3-Fc con D2-9Gly-Fc y D2-9Gly-Ex3/CH3.

Fig. 7. Transferencia de Western. Se separaron las proteínas (no reducidas y reducidas) del medio condicionado decélulas 293 transfectadas (15 !l de CM) con plásmidos que expresaban proteínas (1): D2-9Gly-Fc; (2): D2-(G4S)3-Fc y (3): EGFP por electroforesis en SDS y se transfirieron a una membrana de PVDF. La transferencia se sondeó conanticuerpos de cabra anti-Fc de IgG1 humana y de conejo anti-IgG de cabra-HRP.

Fig. 8. Combinaciones con/sin enlazador 9Gly o VEGF Ex3. Comparación de estructura de tres nuevas proteínascon o sin enlazador 9Gly y/o VEGF Ex3, D2-9Gly-CH3, D2-CH3 y D2-Ex3/CH3.

Fig. 9. Ensayo de proliferación de HUVEC con las construcciones Flt-1(D2) con combinaciones 9Gly, Ex3 y CH3. Secomparó el medio condicionado de células 293 (5 !l) que contenían las proteínas D2-Ex3/CH3, D2-9Gly-CH3 y D2-CH3 con D2-9Gly-Fc y D2-9Gly-Ex3/CH3.

Fig. 10. Transferencia de Western. Se transfectaron células 293 con plásmidos que expresaban: (1) D2-9Gly-Fc; (2)D2-9Gly-CH3 (52/26 kDa); y (3) D2-CH3 (50/25 kDa). Las proteínas del medio condicionado de células 293 (15 !l de CM no reducido y/o reducido) se separaron por electroforesis en SDS y se transfirieron a una membrana de PVDF.La transferencia se sondeó con conjugado anti-VEGF-R1 humano HRP (R&D Systems).

Fig. 11. Ensayo de unión de VEGF "in vitro". Se diluyeron en serie los medios condicionados de células 293 que contenían concentraciones conocidas tanto de D2-9Gly-Fc como de los receptores solubles de control Flt-1 D(1-3)(que varían en las concentraciones de 0,29 - 150 pM) y se mezclaron con VEGF 10 pM. Después se midió lacantidad de VEGF no unido por ELISA. D2-9Gly-Fc se une a VEGF con mayor afinidad que todas las demásconstrucciones. "n" representa la cantidad de experimentos independientes (ensayo de transfección y unión).

Fig. 12. La cinética de unión de las construcciones solubles de Flt-1 se midió por resonancia de plasmón superficial con un instrumento BIAcore. Las construcciones sFlt-1 se inmovilizaron sobre un chip detector, y se inyectóVEGF165 a concentraciones que variaban de 0,2 a 15 nM. Los sensogramas se evaluaron usando el programa BIAEvaluation, se determinaron las constantes de velocidad Ka y Kd y se calculó la constante de disociación (KD) apartir de la proporción Kd/Ka = KD. Un menor valor de KD significa mejor afinidad.

Fig. 13A-13C. La Fig. 13A muestra los niveles de expresión de las construcciones de Flt-1 que tenían diversosenlazadores. La Fig. 13B muestra la dimerización o multimerización de construcciones de Flt-1 que tenían diversosenlazadores y un resto CH3 de Fc de IgG1. La diferencia entre las condiciones no reducidas y reducidas indica que las proteínas habían multimerizado. La Fig. 13C muestra la bioactividad inhibidora de las construcciones de Flt-1 indicadas presentes en medio condicionado en un ensayo de proliferación de HUVEC en presencia de VEGF. Cada una de las construcciones mostró actividad inhibidora que se acerca a los niveles de proliferación de las HUVEC enausencia de VEGF.

Fig. 14. Usando un modelo murino de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) de neovascularización retiniana (NV), se administró una de las construcciones de Flt-1 a los ojos del ratón y se determinó la neovascularización. Losratones se expusieron a condiciones hiperóxicas. La cantidad de acontecimientos neovasculares se determinó en losojos tratados en comparación con los acontecimientos en los ojos no tratados de los mismos animales. El animal seconsideró un "respondedor" si había una reducción de más del 50% en los acontecimientos neovasculares.

Descripción detallada de la invención

Es un descubrimiento de la presente invención que el dominio tipo Ig 2 Flt-1 sin los dominios 1 y 3 es capaz deunirse de forma eficaz a VEGF y de inhibir la proliferación de las células endoteliales dependiente de VEGF. El dominio 2 puede unirse covalentemente a un dominio de multimerización mediante un enlazador. Los enlazadores son típicamente cadenas polipeptídicas. La longitud de la cadena puede ser de 6, 7, 9, 11, 13, 15 o más restosaminoacídicos, pero típicamente está entre 5 y 25 restos. Dependiendo de la longitud y la composición de la cadenalateral, un enlazador puede tener, aunque no lo necesita, una flexibilidad mayor de la promedio. La flexibilidad puedecalcularse usando algoritmos conocidos en la técnica. Los dominios de multimerización son aquellas partes de lasproteínas multiméricas que promueven la asociación de subunidades para forma, por ejemplo, dímeros, trímeros,tetrámeros, etc. Las proteínas recombinantes adecuadas para la unión eficaz a VEGF y/o la inhibición de laproliferación de células endoteliales dependiente de VEGF se seleccionan entre el grupo compuesto por las SEC IDNº 2, 8, 21, 23, y 25.

Además, se ha descubierto que los dominios de multimerización y los enlazadores pueden usarse con una diversidad de proteínas diferentes o partes de proteínas para inducir la multimerización. Dichas proteínas pueden seraquellas que se unen a un ligando o receptor solamente cuando se multimerizan, o pueden ser aquellas cuyaafinidad de unión se potencia cuando se multimerizan. Las proteínas para la multimerización adecuadas incluyenreceptores extracelulares (que incluyen partes de los mismos), regiones variables de anticuerpos, citoquinas,quimioquinas, y factores de crecimiento. Las proteínas adecuadas incluyen receptores tirosina quinasa y receptoresserina-treonina quinasa. Los ejemplos específicos de receptores extracelulares incluyen el receptor de EGF, receptores acoplados a proteína G, el receptor de FGF, receptores Fc, receptores de células T, etc. Los ejemplos de regiones variables de anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, y ScFv. Los ejemplos de citoquinas incluyen GM-CSF, IL1a, IL-11, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, IFN-a, IFN-1, IFN-y, MIP-1a, MIP-11, TGF-1, TNFa, y TNF1. Los ejemplos de quimioquinas incluyen BCA-1/BLC, BRAK, quimioquina CC-2, CTACK, CXCL-16, ELC, ENA, ENA-70, ENA-74, ENA-78, eotaxina, exodus-2, fractalquina, GCP-2, GRO, GRO alfa (MGSA), GRO-beta, GRO-gamma, HCC-1, HCC-4, I-309, IP-10, I-TAC, LAG-1, LD78-beta, LEC/NCC-4, LL-37, linfotactina,MCP, MCAF (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC, MDC, MDC-2, MDC-4, MEC/CCL28, MIG, MIP, MTP-1 alfa,MIP-1 beta, MIP-1 delta, MIP-3/MPIF-1, MIP-3 alfa, MIP-3 beta, MIP-4 (PARC), MIP-5, NAP-2, PARC, PF-4,RANTES, RANTES-2, SDF-1 alfa, SDF-1 beta, TARC, y TECK. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyenanfirregulina humana, proteínas de angiogénesis humanas, ACE humana, angiogenina humana, angiopoyetina humana, angiostatina humana, betacelulina humana, BMP humana, BMP-13 humana/CDMP-2, BMP-14 humana/CDMP-1, BMP-2 humana, BMP-3 humana, BMP-4 humana, BMP-5 humana, BMP-6 humana, BMP-7humana, BMP-8 humana, BMP-9 humana, factores estimuladores de colonias humanos, ligando flt3 humano, G-CSFhumano, GM-CSF humano, M-CSF humano, factor de crecimiento de tejido conectivo humano, cripto-1 humano,cryptic humano, ECGF humano, EGF humano, EG-VEGF humano, eritropoyetina humana, fetuína humana, FGF humano, FGF-1 humano, FGF-10 humano, FGF-16 humano, FGF-17 humano, FGF-18 humano, FGF-19 humano, FGF-2 humano, FGF-20 humano, FGF-3 humano, FGF-4 humano, FGF-5 humano, FGF-6 humano, FGF-7 humano/KGF, FGF-8 humano, FGF-9 humano, FGF-ácido humano, FGF-básico humano, GDF-11 humano, GDF-15 humano, factor liberador de la hormona del crecimiento humano, HB-EGF humano, heregulina humana, HGF humano, IGF humano, IGF-I humano, IGF-II humano, inhibina humana, KGF humano, LCGF humano, LIF humano, factores misceláneos de crecimiento humanos, MSP humana, miostatina humana, propéptido de miostatina humano,factor de crecimiento nervioso humano, oncostatina M humana, PD-ECGF humano, PDGF humano, PDGF humano (homodímero AA), PDGF humano (heterodímero AB), PDGF humano (homodímero BB), PDGF humano(homodímero CC), PIGF humano, PIGF humano, PIGF-1 humano, PIGF-2 humano, SCF humano, SMDF humano,factores de crecimiento de células madre humanas, SCGF-alfa humano, SCGF-beta humano, trombopoyetinahumana, factor de crecimiento transformante humano, TGF-alfa humano, TGF-beta humano, y VEGF humano.

La proteína receptora Flt-1 tiene una parte extracelular que comprende siete dominios tipo Ig. Estos estánlocalizados en los restos con los números 32...123, 151...214, 230...327, 335...421, 428...553, 556...654, y 661...747 del número de acceso a Genbank P17948, véase también la SEC ID Nº 15. Los restos con los números 1-26 comprenden una secuencia señal. La proteína Flt-1 está codificada por la secuencia de ADN mostrada en el númerode acceso a Genbank NM_002019 (SEC ID Nº 14).

Los dominios de multimerización que pueden usarse de acuerdo con la presente descripción son conocidos en latécnica. Pueden usarse las secuencias de la parte Fc de la cadena pesada de IgG1 o IgG2 gamma, por ejemplo, CH3 solo (aminoácidos 371-477) o los dominios tanto CH2 como CH3 (aminoácidos 247-477). La parte Fc de lasmoléculas Ig es la que se obtiene por escisión de moléculas de anticuerpo completo con la enzima papaína. Puedenusarse otros medios para obtener estas partes. Para la secuencia proteica de la cadena pesada de IgG1 gamma,véase el número de acceso a Genbank Y14737 y la SEC ID Nº 10. Pueden usarse otras regiones Fc, por ejemplo,de otros tipos de IgG y de anticuerpos IgA, IgM, IgD, o IgE. También puede usarse la región de multimerización deVEGF. Se muestra una secuencia de ADN que codifica VEGF en el número de acceso a Genbank NM_003376 y laSEC ID Nº 11. Se muestra una secuencia de aminoácidos de VEGF en el número de acceso a Genbank CAC19513 y la SEC ID Nº 12. La región de multimerización de VEGF (SEC ID Nº 13), codificada por el exón 3 de VEGF (VEGF Ex3), está en aproximadamente los restos aminoacídicos 75-88 de la proteína VEGF (SEC ID Nº 12). Los dominiosde multimerización causarán que al menos el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de las proteínas de fusión monoméricas miren sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizante a una velocidad apropiada para un multímero. La glicosilación puede afectar a la migración de una proteína en un gel. Aunque aquíse muestran secuencias particulares, también pueden usarse variantes tales como variantes alélicas. Típicamentedichas variantes tendrán al menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia descrita.

La multimerización puede ensayarse, por ejemplo, usando geles reductores y no reductores, como se demuestra eneste documento. La multimerización también puede ensayarse por detección de afinidad de unión aumentada deuna proteína por su ligando/receptor. Pueden usarse ensayos de resonancia de plasmón superficial BiaCore™ aeste respecto. Estos ensayos detectan cambios en la masa midiendo los cambios en el índice de refracción en una capa acuosa cercana a la superficie de un chip detector. Cualquier método conocido en la técnica puede usarsepara detectar la multimerización.

Los restos enlazadores de acuerdo con la presente descripción pueden estar compuestos por, por ejemplo, 5-100restos aminoacídicos, 5-75 restos aminoacídicos, 5-50 restos aminoacídicos, 5-25 restos aminoacídicos, 5-20 restos aminoacídicos, 5-15 restos aminoacídicos, 5-10 restos aminoacídicos, o 5-9 restos aminoacídicos. Los ejemplos deenlazadores útiles incluyen: gly9 (SEC ID Nº 27), glu9 (SEC ID Nº 28), ser9 (SEC ID Nº 29), gly5cyspro2cys (SEC ID Nº 30), (gly4ser)3 (SEC ID Nº 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 32),ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 13), GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEC ID Nº 26), y Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 34). Otros enlazadores polipeptídicos que pueden usarse incluyen una poliglicina de diferentes longitudes, incluyendo de 5, 7, o 30 restos. Además, pueden usarse otras partes de Flt-1 como enlazador, por ejemplo, el dominio 3 de Flt-1. Véase la SEC ID Nº 15. Los restosenlazadores también pueden crearse a partir de otros polímeros, tales como polietilenglicol. Dichos enlazadorespueden tener de 10 a 1000, 10-500, 10-250, 10-100, o 10-50 unidades monoméricas de etilenglicol. Los polímerosadecuados deben ser de un tamaño similar al tamaño ocupado por el intervalo apropiado de restos aminoacídicos.Un polímero de tamaño ajustado típico proporcionaría un espaciado de aproximadamente 10-25 angstrom.

A pesar de la generalidad de la descripción anterior, sin embargo, la presente invención se refiere a una proteína defusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende una porción del receptor del VEGF, Y es un resto enlazador y Z esun dominio de multimerización, en donde el resto enlazador Y es un polipéptido de 5-50 restos aminoacídicos quetiene una flexibilidad por encima de la media como se determina por el método de predicción de la flexibilidad deKarpus & Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, y en donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.

Las proteínas de fusión de acuerdo con la presente descripción, incluyendo las proteínas de fusión de la presenteinvención, pueden crearse por cualquier medio conocido en la técnica. Aunque dichas proteínas pueden crearse deforma sintética, o uniendo partes que están hechas, también puede usarse la producción recombinante. Puede producirse una secuencia génica fusionada usando las herramientas convencionales de ADN recombinante. Lasecuencia génica fusionada puede insertarse en un vector, por ejemplo, un vector viral o plasmídico, para replicar lasecuencia génica fusionada. Puede introducirse una secuencia promotora que es funcional en la célula receptorafinal cadena arriba de la secuencia génica promotora. Los promotores usados pueden ser constitutivos, inducibles oreprimibles. Se conocen bien en la técnica ejemplos de cada tipo. El vector puede introducirse en una célulahospedadora o mamífero por cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores adecuados que pueden usarseincluyen adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, lentivirus, y plásmidos. Si el vector está en un vector viral y elvector se ha empaquetado, entonces pueden usarse los viriones para infectar células. Si se usa ADN desnudo,entonces pueden usarse los procedimientos de transfección o transformación que sean apropiados para las célulashospedadoras particulares. Pueden usarse formulaciones de ADN desnudo utilizando polímeros, liposomas, o nanoesferas para el suministro de genes de fusión. Las células que pueden transformarse o transfectarse conconstrucciones recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser cualesquiera que sean convenientes para elespecialista. Los tipos celulares ejemplares que pueden usarse incluyen bacterias, levaduras, células de insecto, y de mamífero. Entre las células de mamífero, pueden elegirse células de mucho tipos tisulares, según seaconveniente. Las células ejemplares que pueden usarse son fibroblastos, hepatocitos, células endoteliales, célulasmadres, células hematopoyéticas, células epiteliales, miocitos, células neuronales, y queratinocitos. Estas célulaspueden usarse para producir proteínas in vitro, o pueden suministrarse a mamíferos incluyendo seres humanos para producir las proteínas codificadas in vivo. Este medio de suministro es una alternativa al suministro de ácido nucleico a un mamífero, al suministro de un vector viral a un mamífero, y al suministro de la proteína de fusión a un mamífero.

Las composiciones de proteína o ácidos nucleicos pueden estar en vehículos, tales como tampones, vehículosacuosos o lipófilos, vehículos estériles o no estériles, pirogénicos o no pirogénicos. Los vehículos no pirogénicos sonútiles para formulaciones inyectables. Las formulaciones pueden ser líquidas o sólidas, por ejemplo, liofilizadas. Lasformulaciones también pueden administrarse en forma de aerosoles. Las composiciones pueden contener una omás proteínas de fusión o uno o más ácidos nucleicos, o tanto proteínas de fusión como ácidos nucleicos. Lasproteínas de fusión y/o los ácidos nucleicos en una composición pueden ser homogéneos, en cuyo caso se formaránproteínas homomultiméricas, o pueden ser heterogéneos en la composición, en cuyo caso se formarán proteínasheteromultiméricas. En el caso de heteromultímeros, típicamente el resto X variará entre proteínas de fusión, pero elresto Z será igual entre las proteínas de fusión.

Pueden proporcionarse proteínas de fusión a una célula u hospedador mamífero por cualquier medio conocido en latécnica. Puede suministrarse la proteína a la célula u hospedador. Puede administrarse el ácido nucleico a la célulau hospedador. Pueden administrarse las células transformadas o transfectadas a la célula u hospedador. En elúltimo caso, se desean células del mismo fondo genético para reducir el rechazo de transplante.

Las células adecuadas para el suministro a animales hospedadores mamíferos incluyen cualquier tipo celular demamífero de cualquier órgano, tumor, o línea celular. Por ejemplo, pueden usarse células humanas, murinas, decabra, ovinas, bovinas, de perro, de gato, y porcinas. Los tipos celulares adecuados para su uso incluyen, sinlimitación, fibroblastos, hepatocitos, células endoteliales, queratinocitos, células hematopoyéticas, células epiteliales,miocitos, células neuronales, y células madre.

Los medios de suministro de proteínas de fusión o ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión incluyen elsuministro de células que expresan las proteínas de fusión, el suministro de las proteínas de fusión, y el suministrode ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión, células, o ácidos nucleicos pueden suministrarse directamente al órgano o tumor deseado, por ejemplo, por inyección, cateterismo, o endoscopia. También pueden suministrarse por vía intravenosa, intrabronquial, intratumoral, intratecal, intramuscular, intraocular, tópica, subcutánea, transdérmica o per os. Los pacientes que pueden tratarse de forma eficaz incluyen aquellos con degeneración macular relacionada con la edad húmeda, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, osteoartritis, uveítis, asma, y cáncer. Los tratamientos mejorarán los síntomas y/olos marcadores de la enfermedad y/o la gravedad de la enfermedad.

Los ácidos nucleicos pueden suministrarse a mamíferos, y en particular, a seres humanos, en cualquier vectordeseado. Estos incluyen vectores virales o no virales, incluyendo vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, y vectores plasmídicos. Los tipos ejemplares de virus incluyenVHS (virus del herpes simple), adenovirus, AAV (virus adeno-asociado), VIH (virus de la inmunodeficiencia humana),VIB (virus de la inmunodeficiencia bovina), y VLM (virus de la leucemia murina). Los ácidos nucleicos pueden administrarse en cualquier formato deseado que proporcione niveles de suministro suficientemente eficaces, incluyendo en partículas virales, en liposomas, en nanopartículas, y en complejo con polímeros.

Pueden usarse combinaciones de tratamientos con proteína y ácido nucleico. Por ejemplo, puede administrarse unaproteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo, una proteína de fusión de acuerdo con lapresente invención a un paciente. Si se observa una respuesta favorable, entonces puede administrarse unamolécula de ácido nucleico que codifique la proteína de fusión para un efecto a largo plazo. Como alternativa, laproteína y el ácido nucleico pueden administrarse de forma simultánea o aproximadamente simultánea. En otraalternativa, puede administrarse un anticuerpo o proteína de fusión para un ligando seguido de o de formaconcomitante con un anticuerpo o compañero de fusión para un receptor. Otra opción emplea una combinación deácidos nucleicos en la que uno codifica un anticuerpo y otros codifica una proteína de fusión. Algunos anticuerposque pueden emplearse en combinación con las construcciones de Flt-1 de la presente descripción, por ejemplo, encombinación con las construcciones Flt-1 de la presente invención (sea en forma de proteína o de ácido nucleico)son bevacizumab y ranibizumab, ambos dirigidos contra VEGF. Estos son particularmente útiles para tratar el cáncer y la degeneración macular, respectivamente.

La práctica de la presente descripción, incluyendo la práctica de la presente invención emplea, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología,biología celular, bioquímica e inmunología, que pertenecen a las habilidades de la técnica. Dichas técnicas seexplican completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Sambrook et al., 1989); Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook Of Experimental Immunology (D.M. Wei & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols In Immunology (J.E. Coligan et al, eds., 1991); Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane eds. (1988)); y PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)).

Un vehículo de suministro de genes es cualquier molécula que puede transportar polinucleótidos insertados alinterior de una célula hospedadora. Ejemplos de vehículos de suministro de genes son liposomas, polímerosbiocompatibles, incluyendo polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos;lipopolisacáridos; envueltas virales artificiales; partículas metálicas; y bacterias, virus, tales como baculovirus,adenovirus y retrovirus, vectores bacteriófagos, cósmidos, plasmídicos, fúngicos y otros vehículos de recombinacióntípicamente usados en la técnica que se han descrito para la expresión en una diversidad de hospedadoreseucariotas y procariotas, y pueden usarse para terapia génica así como para la simple expresión de proteínas.

Suministro de genes, transferencia génica, y similares, como se usan en este documento, son términos que serefieren a la introducción de un polinucleótido exógeno (a veces mencionado como "transgén") en una célulahospedadora, independientemente del método usado para la introducción. Dichos métodos incluyen una diversidadde técnicas bien conocidas tales como transferencia génica mediada por vector (por, por ejemplo,infección/transfección vírica, o diversos complejos de suministro de genes basados en proteínas o basados enlípidos diferentes) así como técnicas que facilitan el suministro de polinucleótidos "desnudos" (tal como electroporación, suministro por "pistola génica" y diversas técnicas diferentes usadas para la introducción de polinucleótidos). El polinucleótido introducido puede mantenerse de forma estable o transitoria en la célula hospedadora. El mantenimiento estable típicamente requiere que el polinucleótido introducido contenga un origen dereplicación compatible con la célula hospedadora o se integre en un replicón de la célula hospedadora tal como unreplicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Se sabe que variosvectores son capaces de mediar la transferencia de genes a células de mamífero, que se conocen en la técnica y sedescriben en este documento.

El polinucleótido exógeno se inserta en un vector tal como adenovirus, adenovirus parcialmente eliminado, adenovirus completamente eliminado, virus adeno-asociado (AAV), retrovirus, lentivirus, plásmido desnudo, complejo plásmido/liposoma, etc. para el suministro al hospedador mediante vía intravenosa, intramuscular, a través de la porta u otra vía de administración. Los vectores de expresión que pueden usarse en los métodos y composiciones de la presente descripción, por ejemplo, en las composiciones de la presente invención incluyen, porejemplo, vectores virales. Uno de los métodos más frecuentemente usados de administración de terapia génica, tanto in vivo como ex vivo, es el uso de vectores virales para el suministro del gen. Se conocen muchas especies devirus, y muchas se han estudiado para propósitos de terapia génica. Los vectores virales más habitualmente usadosincluyen aquellos derivados de adenovirus, virus adeno-asociados (AAV) y retrovirus, incluyendo lentivirus, talescomo el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

El adenovirus es un virus de ADN nuclear, sin envuelta con a genoma de aproximadamente 36 kb, que se hacaracterizado bien a través de estudios en genética clásica y biología molecular (Hurwitz, M.S., AdenovirusesVirology, 3ª edición, Fields et al., eds., Raven Press, Nueva York, 1996; Hitt, M.M. et al., Adenovirus Vectors, The Development of Human Gene Therapy, Friedman, T. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York 1999).

Los genes virales se clasifican en unidades transcripcionales tempranas (denominadas E1-E4) y tardías (denominadas L1-L5), que se refieren a la generación de dos clases temporales de proteínas virales. La demarcación de estos acontecimientos es la replicación de ADN viral. Los adenovirus humanos se dividen en numerosos serotipos (aproximadamente 47, numerados en consecuencia y clasificados en 6 grupos: A, B, C, D, E y F), en base a propiedades que incluyen hemaglutinación de glóbulos rojos, oncogenicidad, composiciones yhomologías de ADN y aminoácidos proteicos, y relaciones antigénicas.

Los vectores adenovirales recombinantes tienen varias ventajas para su uso como vehículos de suministro degenes, incluyendo el tropismo por células tanto en división como no en división, potencial patogénico mínimo,capacidad de replicarse a un elevado título para la preparación de reservas de vector, y el potencial de portar grandes insertos (Berkner, K.L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158:39-66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1:5164 1994). Se han diseñado vectores adenovirales con deleciones de diversas secuencias génicas adenovirales,tales como vectores pseudoadenovirales (PAV) y adenovirales parcialmente eliminados (llamados "DeAd"), paraaprovechar las características deseables de los adenovirus que los convierten en un vehículo adecuado para elsuministro de ácidos nucleicos a células receptoras.

En particular, los vectores pseudoadenovirales (PAV), también conocidos como 'adenovirus gutless' o mini-vectoresadenovirales, son vectores adenovirales derivados del genoma de un adenovirus que contiene las secuenciasnucleotídicas de acción cis mínimas necesarias para la replicación y empaquetado del genoma del vector y quepueden contener uno o más transgenes (Véase, la patente de Estados Unidos Nº 5.882.877 que cubre los vectorespseudoadenovirales (PAV) y métodos para producir PAV). Los PAV se han diseñado para aprovechar lascaracterísticas deseables de los adenovirus que los convierten en un vehículo adecuado para el suministro degenes. Aunque los vectores adenovirales generalmente pueden portar insertos de hasta 8 kb de tamaño por ladeleción de regiones que son prescindibles para el crecimiento viral, la capacidad de carga máxima puedeconseguirse con el uso de vectores adenovirales que contienen deleciones de la mayoría de las secuenciascodificantes virales, incluyendo PAV. Véase, la patente de Estados Unidos Nº 5.882.877 de Gregory et al.; Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5731-5736, 1996; Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13565-13570, 1996; Lieber et al., J. Virol. 70:8944-8960, 1996; Fisher et al., Virology 217:11-22, 1996; la patente de EstadosUnidos Nº 5.670.488; la publicación PCT Nº WO96/33280, publicada el 24 de octubre de 1996; la publicación PCTNº WO96/40955, publicada el 19 de diciembre de 1996; la publicación PCT Nº WO97/25446, publicada el 19 de juliode 1997; la publicación PCT Nº WO95/29993, publicada el 9 de noviembre de 1995; la publicación PCT Nº WO97/00326, publicada el 3 de enero de 1997; Morral et al., Hum. Gene Ther. 10:2709-2716,1998. Dichos PAV, quepueden alojar hasta aproximadamente 36 kb de ácidos nucleico foráneo, son ventajosos porque la capacidad decarga del vector está optimizada, mientras que se reduce el potencia de respuestas inmunes del hospedador contrael vector o la generación de virus competentes para la replicación. Los vectores PAV contienen las secuencias denucleótidos de la repetición terminal invertida (ITR) 5' y la ITR 3' que contienen el origen de replicación, y lasecuencia de nucleótidos de acción cis necesaria para el empaquetado del genoma del PAV, y pueden alojar uno o más transgenes con elementos reguladores apropiados, por ejemplo, promotor, potenciadores, etc.

Otros, los vectores adenovirales parcialmente eliminados proporcionan un vector adenoviral parcialmente eliminado(llamado "DeAd") en el que la mayoría de los genes tempranos adenovirales necesarios para la replicación del virusse eliminan del vector y se colocan dentro del cromosoma de una célula productora bajo el control de un promotorcondicional. Los genes adenovirales que se pueden eliminar que se pueden colocar en la célula productora puedenincluir E1A/E1B, E2, E4 (solamente ORF6 y ORF6/7 tienen que colocarse en la célula), pIX y pIVa2. También puede eliminarse E3 del vector, pero como no es necesario para la producción del vector, puede omitirse de la célulaproductora. Los genes tardíos adenovirales, normalmente bajo el control del promotor tardío principal (MLP), estánpresentes en el vector, pero el MLP puede remplazarse por un promotor condicional.

Los promotores condicionales adecuados para su uso en vectores DeAd y líneas celulares productoras incluyenaquellos con las siguientes características: baja expresión basal en estado no inducido, de modo que no se expresen genes adenovirales citotóxicos o citostáticos a niveles dañinos para la célula; y expresión de elevado nivelen estado inducido, de modo que se produzcan suficientes cantidades de proteínas virales para soportar lareplicación y ensamblaje del vector. Los promotores condicionales preferidos adecuados para su uso en vectores DeAd y líneas celulares productoras incluyen el sistema de control génico del dimerizador, basado en los agentesinmunosupresores FK506 y rapamicina, el sistema de control génico de la ecdisona y el sistema de control génico dela tetraciclina. También puede ser útil en la presente descripción, incluyendo la presente invención, la tecnologíaGeneSwitch™ (Valentis, Inc., Woodlands, TX) descrita en Abruzzese et al., Hum. Gene Ther. 1999 10:1499-507. Elsistema de expresión adenoviral parcialmente eliminado se describe adicionalmente en el documento WO99/57296.

El virus adeno-asociado (AAV) es un parvovirus ADN humano de cadena sencilla cuyo genoma tiene un tamaño de4,6 kb. El genoma del AAV contiene dos genes principales: el gen rep, que codifica las proteínas rep (Rep 78, Rep68, Rep 52, y Rep 40) y que están implicadas en la replicación, rescate, transcripción e integración de AAV; y el gencap que codifica las proteínas cap que forman la partícula viral AAV. El AAV obtiene su de su dependencia en unadenovirus u otro virus auxiliar (por ejemplo, herpesvirus) para suministrar los productos génicos esenciales quepermitan que el AAV experimente una infección productiva, es decir, se reproduzca por sí mismo en la célulahospedadora. En ausencia del virus auxiliar, el AAV se integra en forma de un provirus en el cromosoma de la célulahospedadora, hasta que se ve rescatado por superinfección de la célula hospedadora con un virus auxiliar, habitualmente un adenovirus (Muzyczka, Curr. Top. Micor. Immunol. 158:97-127, 1992).

El interés en AAV como vector de transferencia génica está provocado por varias características de su biología. Enambos extremos del genoma de AAV hay una secuencia de nucleótidos conocida como repetición terminal invertida (ITR), que contiene las secuencias de nucleótidos de acción cis necesarias para la replicación, rescate,empaquetado e integración del virus. La función de integración de la ITR mediada por la proteína rep en trans permite que el genoma de AAV se integre en un cromosoma celular después de la infección, en ausencia de virusauxiliar. Esta propiedad única del virus tiene relevancia para el uso de AAV en transferencia de genes, ya quepermite la integración de un AAV recombinante que contenga un gen de interés en el genoma celular. Por lo tanto, puede conseguirse la transformación genética estable, ideal para muchos de los objetivos de la transferencia degenes, mediante el uso de vectores rAAV. Además, el sitio de integración para el AAV está bien establecido y se ha localizado en el cromosoma 19 del ser humano (Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2211-2215, 1990). Estapredecibilidad del sitio de integración reduce el peligro de acontecimientos de inserción aleatoria en el genomacelular que pueden activar o inactivar genes del hospedador o interrumpir las secuencias codificantes, consecuencias que pueden limitar el uso de vectores con integración de AAV, la eliminación de este gen en eldiseño de vectores rAAV puede provocar patrones de integración alterados que se han observado con vectoresrAAV (Ponnazhagan et al., Hum Gene Ther. 8:275-284, 1997).

Hay otras ventajas al uso de AAV para la transferencia de genes. El rango de hospedador de los AAV es amplio.Además, a diferencia de los retrovirus, los AAV pueden infectar células tanto quiescentes como en división. Además,los AAV no se han asociado con enfermedad humana, obviando muchas de las preocupaciones de han surgido conlos vectores de transferencia de genes derivados de retrovirus.

Los enfoques convencionales a la generación de vectores rAAV recombinantes ha requerido la coordinación de unaserie de acontecimientos intracelulares: la transfección de la célula hospedadora con un genoma de vector rAAV que contenga un transgén de interés flanqueado por las secuencias ITR de AAV, la transfección de la célula hospedadora por un plásmido que codifique los genes para las proteínas rep y cap de AAV que son necesarias en trans, y la infección de la célula transfectada con un virus auxiliar para suministrar las funciones auxiliares no AAVnecesarias en trans (Muzyczka, N., Curr. Top. Micor. Immunol. 158:97-129, 1992). Las proteínas adenovirales (uotros virus auxiliares) activan la transcripción del gen rep de AAV, y las proteínas rep después pueden activar latranscripción de los genes cap de AAV. Las proteínas cap después utilizan las secuencias ITR para empaquetar elgenoma del rAAV en una partícula viral rAAV. Por lo tanto, la eficacia del empaquetado está determinada, en parte,por la disponibilidad de cantidades adecuadas de las proteínas estructurales, así como la accesibilidad de cualquier secuencia de empaquetado de acción cis necesarias en el genoma del vector rAAV.

Los vectores retrovirales son una herramienta común para el suministro de genes (Miller, Nature (1992) 357:455460). La capacidad de los vectores retrovirales de suministrar una única copia no ordenada del gen en un ampliointervalo de células somáticas de roedores, primates y seres humanos hace a los vectores retrovirales muy adecuados para transferir genes a una célula.

Los retrovirus son virus ARN en los que el genoma viral es ARN. Cuando se infecta una célula hospedadora con unretrovirus, el ARN genómico se transcribe de forma inversa en un intermedio de ADN que se integra de forma muy eficaz en el ADN cromosómico de las células infectadas. Este intermedio de ADN integrado se conoce comoprovirus. La transcripción del provirus y su ensamblaje en virus infecciosos sucede en presencia de un virus auxiliar apropiado o en una línea celular que contenga secuencias apropiadas que posibiliten la encapsidación sin producción simultánea de un virus auxiliar contaminante. No es necesario un virus auxiliar para la producción deretrovirus recombinante si se proporcionan las secuencias para la encapsidación por co-transfección con vectoresapropiados.

El genoma retroviral y el ADN pro viral tienen tres genes: el gag, el pol, y el env, que están flanqueados por dossecuencias de repetición terminal larga (LTR). El gen gag codifica las proteínas estructurales internas (matriz,cápsida, y nucleocápsida); el gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa) y el genenv codifica las glucoproteínas de la envuelta viral. Las LTR 5' y 3' sirven para promover la transcripción y lapoliadenilación de los ARN de los viriones. La LTR contiene todas las demás secuencias de acción cis necesarias para la replicación viral. Los lentivirus tienen genes adicionales que incluyen vit, vpr, tat, rev, vpu, nef, y vpx (en VIH1, VIH-2 y/o VIS).Adyacentes a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (elsitio de unión del ARNt cebador) y para la encapsidación eficaz del ARN viral en partículas (el sitio Psi). Si lassecuencias necesarias para la encapsidación (o empaquetado del ARN retroviral en viriones infecciosos) estánausentes en el genoma viral, el resultado es un defecto en cis que evita la encapsidación del ARN genómico. Sinembargo, el mutante resultante aún es capaz de dirigir la síntesis de todas las proteínas del virión.

Los lentivirus son retrovirus complejos que, además de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienenotros genes con función reguladora o estructural. La mayor complejidad posibilita que los lentivirus modulen el ciclovital de los mismos, como en el transcurso de la infección latente. Un lentivirus típico es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico del SIDA. In vivo, el VIH puede infectar células diferenciadasde forma terminal que raramente se dividen, tales como linfocitos y macrófagos. In vitro, el VIH puede infectarcultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos (MDM) así como células HeLa-Cd4 o linfoides T detenidasen el ciclo celular por tratamiento con afidicolina o irradiación gamma. La infección de las células depende del aportenuclear activo de complejos de preintegración de VIH a través de los poros nucleares de las células diana. Esosucede por la interacción de múltiples determinantes moleculares parcialmente redundantes en el complejo con lamaquinaria de importación nuclear de la célula diana. Los determinantes identificados incluyen una señal de localización nuclear funcional (NLS) en la proteína de matriz gag (MA), la proteína asociada a viriones cariófila, vpr, yun resto de fosfotirosina C-terminal en la proteína MA gag. El uso de retrovirus para terapia génica se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 6.013.516; y la patente de Estados Unidos 5.994.136.

Otros métodos para suministrar ADN a las células no usan virus para el suministro. Por ejemplo, pueden usarsecompuestos anfífilos catiónicos para suministrar el ácido nucleico de la presente descripción, por ejemplo, el ácidonucleico de la presente invención. Como los compuestos diseñados para facilitar el suministro intracelular demoléculas biológicamente activas deben interaccionar con entornos tanto no polares como polares (en o sobre, porejemplo, la membrana plasmática, fluidos tisulares, compartimentos dentro de la célula, y la propia moléculabiológicamente activa), dichos compuestos se diseñan típicamente para que contengan dominios tanto polares comono polares. Los compuestos que tiene estos dos dominios pueden llamarse anfífilos, y muchos lípidos y lípidos sintéticos que se han descrito para su uso en la facilitación de dicho suministro intracelular (sean para aplicación in vitro o in vivo) cumplen esta definición. Una clase particularmente importante de dichos anfífilos es los anfífiloscatiónicos. En general, los anfífilos catiónicos tienen grupos polares que son capaces de cargarse positivamente en o aproximadamente a pH fisiológico, y esta propiedad se entiende que es importante en la técnica para definir cómointeraccionan los anfífilos con los muchos tipos de moléculas biológicamente activas (terapéuticas) incluyendo, por ejemplo, polinucleótidos cargados negativamente tales como ADN.

El uso de composiciones que comprenden compuestos anfífilos catiónicos para el suministro de genes se describe,por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.049.386; el documento US 5.279.833; el documento US 5.650.096;el documento US 5.747.471; el documento US 5.767.099; el documento US 5.910.487; el documento US 5.719.131; el documento US 5.840.710; el documento US 5.783.565; el documento US 5.925.628; el documento US 5.912.239; el documento US 5.942.634; el documento US 5.948.925; el documento US 6.022.874; el documento U.S. 5.994.317; el documento U.S. 5.861.397; el documento U.S. 5.952.916; el documento U.S. 5.948.767; el documento

U.S. 5.939.401; y el documento U.S. 5.935.936.

Además, el ácido nucleico de la presente descripción, por ejemplo, el ácido nucleico de la presente invención puedesuministrarse usando "ADN desnudo". Los métodos para suministrar una secuencia de ADN no integrante, noinfecciosa que codifica un polipéptido o péptido deseado unida de forma funcional a un promotor, libre de asociacióncon proteínas que faciliten la transfección, partículas virales, formulaciones liposomales, lípidos cargados y agentesde precipitación de fosfato cálcico se describen en la patente de Estados Unidos 5.580.859; el documento U.S.5.963.622; el documento U.S. 5.910.488.

También se ha informado de sistemas de transferencia de genes que combinan componentes virales y no virales.Cristiano et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11548; Wu et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:11542; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6099; Yoshimura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2300; Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Kupfer et al. (1994) Human Gene Ther. 5:1437; y Gottschalk et al. (1994) Gene Ther. 1:185. En la mayoría de los casos, se han incorporado adenovirus en los sistemas de suministro de genespara sacar provecho de sus propiedades endosomolíticas. Las combinaciones presentadas de componentes viralesy no virales generalmente implican unión covalente del adenovirus a un complejo de suministro de genes o cointernalización de adenovirus no unido con complejos de lípido catiónico:ADN.

Para el suministro de ADN y proteína al ojo, la administración típicamente será local. Esto tiene la ventaja de limitar la cantidad de ADN que tiene que administrar y de limitar los efectos secundarios sistémicos. Pueden usarsemuchos modos posibles de suministro incluyendo, aunque sin limitación: administración tópica sobre la córnea poruna pistola génica; inyección subconjuntival, inyección intracameral, mediante gotas oculares a la córnea, inyecciónal interior de la cámara anterior mediante el limbo temporal, inyección intraestromal, aplicación a la córnea combinada con pulsos eléctricos, inyección intracorneana, inyección subretiniana, inyección intravitreal, e inyecciónintraocular. Como alternativa, pueden transfectarse o transducirse células ex vivo y suministrarse por implante intraocular. Véase, Auricchio, Mol. Ther. 6: 490-494, 2002; Bennett, Nature Med. 2: 649-654, 1996; Borrás, Experimental Eye Research 76: 643-652, 2003; Chaum, Survey of Ophtalmology 47: 449-469, 2002; Campochiaro, Expert Opinions in Biological Therapy 2: 537-544 (2002); Lai, Gene Therapy 9: 804 813, 2002; Pleyer, Progress in Retinal and Eye Research, 22: 277-293, 2003.

Pueden ensayarse los efectos de diversos agentes terapéuticos y administraciones propuestas en modelos animalesadecuados para enfermedades particulares. Por ejemplo, la retinopatía del prematuro puede ensayarse en unmodelo de retinopatía inducida por oxígeno en ratones como se describe en Smith, Investigative Ophtalmology & Visual Science, 35: 101-111, 1994. Puede usarse neovascularización coroidal inducida por láser en ratones comomodelo para neovascularización coroidal humana (CNV) que sucede en enfermedades tales como degeneraciónmacular relacionada con la edad. Tobe, American Journal of Pathology 153: 1641-1646, 1998. Se han desarrollado otros modelos de CNV en primates, ratas, cerdos enanos, y conejos. Se han desarrollado modelos de ratón dedegeneración macular relacionada con la edad en ratones genéticamente deficientes. Los ratones deficientes en laproteína-1 quimioatrayente de monocitos o el receptor-2 de quimioquina C-C desarrollan características de degeneración macular relacionada con la edad. Ambati, Nature Med. 9: 1390-1397,2003.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a ejemplos específicos incluyendo los modos actualmente preferidos de realizar la invención, los especialistas en la técnica apreciarán que existen numerosas variaciones y permutaciones de los sistemas y técnicas descritas anteriormente que están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se generaron dos construcciones: la primera, D2-9Gly-Fc, que contenía un enlazador de 9 unidades de poliglicina(9Gly) y la segundo, D2-Fc, con la misma secuencia excepto el enlazador 9Gly (Fig. 1).

Se analizaron las secuencias de aminoácidos de las proteínas D2-9Gly-Fc y D2-Fc usando el Protein AnalysisToolbox del programa de análisis de secuencias Mac Vector 6.5.1. (IBI, New Haven, CT). El enlazador de 9 unidadesde poliglicina en la secuencia de D2-9Gly-Fc se identificó como una región con mayor flexibilidad promedio por elmétodo de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz (1985) Naturwiss, 72: 212-213. No se detectó dicha región en la secuencia de D2-Fc (Fig. 1).

Ejemplo 2

Se ensayó un dominio tipo Ig 2 Flt-1 conectado a la región Fc de IgG1 por un enlazador de 9 unidades de poliglicina(D2-9Gly-Fc) flexible. La proteína de fusión D2-9Gly-Fc es capaz de unirse de forma eficaz a VEGF y de inhibir laproliferación de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) dependiente de VEGF. Véase la Fig. 2. En contraste, cuando se une el dominio tipo Ig 2 Flt-1 directamente a la cadena pesada de IgG1 (Fc) para formar D2-Fc, se observó una unión solamente mínima a VEGF. Véase la Fig. 2. Tanto la dimerización mediante el Fc de IgG1 como la inserción de un enlazador flexible parecen facilitar la unión de VEGF al dominio 2 de Flt-1. Se confirmó la presencia de formas diméricas tanto en D2-9Gly-Fc como en D2-Fc por análisis de transferencia de Western. Véasela Fig. 3.

Ejemplo 3

Se administra una inyección intravitreal de vector AAV (de 1 x 108 a 1 x 109 partículas en un volumen de 0,0005 ml)a ratones C57BL/6 recién nacidos (P0) o de 1 día de edad (P1). Se induce neovascularización retiniana (NV) en los ratones C57BL/6 exponiendo crías P7 y sus hembras de lactación a hiperoxia durante 5 días. Las crías se devolvieron a aire ambiental en P12 y se sacrificaron en P17 (momento del pico de NV). (Smith LEH, Weslowski E, McLellan A, Kostyk SK, D'Amato R, Sullivan y D'Amore PA. Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse. Invest Opth Vis Sci. 1994; 35:101-111.) Se seccionaron de forma transversal en serie ojos completos impregnados en parafina aintervalos de 5 micrómetros. El grado de NV se determina contando la cantidad de núcleos de células endoteliales internos a la membrana de limitación interna en secciones tomadas cada 100 micrómetros.

Se comparan cohortes de animales tratados con los vectores AAV que codifican los agentes anti-angiogénicos concohortes tratadas con vectores que codifican transgenes irrelevantes o con vectores que no codifican un transgén.La cantidad promedio de núcleos de células endoteliales en cada ojo tratado se compara con el ojo similar notratado de cada animal.

Ejemplo 4

Generación de D2-9Gly-Ex3/CH3

Se ha demostrado que el dominio 2 de Flt-1 es esencial para la unión de VEGF165. Sin embargo, se demostró que eldominio 2 de Flt-1 solo era incapaz de unirse a VEGF A. (Davis-Smyth et al., 1996.) VEGF A, cuando está presenteen forma de dímero, se une a Flt-1 a través de restos ácidos (aminoácidos 63-67 de la proteína madura) que permiteun posible mecanismo para la dimerización inducida por ligando del receptor (Keyt et al, 1996).

Por lo tanto, se usó una dimerización del dominio 2 de Flt-1 como estrategia para restaurar la unión del dominio 2 deFlt-1 a VEGF A. Puede usarse la fusión con un fragmento de la cadena pesada de IgG para la dimerización deproteínas (Davis-Smyth et al., 1996). Aquí se demuestra que los aminoácidos 75-88 (es decir, PSCVPLMRCGGCCN; SEC ID Nº 13) de VEGF A (SEC ID Nº 12) aumentan la actividad biológica de las proteínas híbridas sFlt-1.

Inicialmente, se diseñaron tres proteínas híbridas: D2-9Gly-Fc, D2-Fc y D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 4). Las tres proteínashíbridas contienen el mismo dominio D2 de Flt-1 que D2-9Gly-Fc. No se observó unión de VEGF con D2-Fc, que nocontiene el enlazador de 9 unidades de poliglicina (9Gly). La tercera proteína, D2-9Gly-Ex3/CH3, contiene el enlazador de 9 unidades de poliglicina (9Gly) y el dominio de multimerización de VEGF (aminoácidosPSCVPLMRCGGCCN; SEC ID Nº 13; VEGF Ex3), pero también contiene la región CH3 de Fc de cadena pesada deIgG1 humana (aminoácidos 371-477 de la SEC ID Nº 10).

La proteína D2-Fc no mostró actividad inhibidora eficaz en el ensayo de proliferación de HUVEC (Fig. 5) y porimplicación no se unía a VEGF165 de forma eficaz. Sin embargo, la tercera proteína híbrida, D2-9Gly-Ex3/CH3, quecomprende el dominio 2 de Flt-1 fusionado con la región CH3 mediante tanto el enlazador 9Gly como la región dedimerización de VEGF165 (Ex3), mostraba actividad inhibidora en un ensayo de proliferación de HUVEC dependientede VEGF (Fig. 5). Esto implica que esta proteína híbrida se une a VEGF165 de forma eficaz.

Ejemplo 5

Uso del enlazador (Gly4Ser)3 en la construcción Flt-1 D2

El uso de varios enlazadores de poliglicina se ha descrito previamente para la mejora de las características proteicas(Mouz et al., 1996; Qiu et al., 1998). Para la siguiente construcción se ha usado otro tipo de enlazador, el oligómerode 15 unidades (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (Huston et al., 1988). Se generó la proteína D2-(Gly4Ser)3-Fc y contiene el dominio 2 de Flt-1, el enlazador (Gly4Ser)3 y la región Fc de la cadena pesada de IgG1 humana.

D2-(Gly4Ser)3-Fc se caracterizó adicionalmente en un ensayo de proliferación de HUVEC. La actividad biológica de D2-(Gly4Ser)3-Fc medida por la inhibición de la proliferación de HUVEC fue similar a la de D2-9Gly-Fc y D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 6).

La construcción D2-(Gly4Ser)3-Fc se caracterizó adicionalmente por transferencia de Western y se comparó con D29Gly-Fc (Fig.9). Ambas construcciones están presentes principalmente en una forma dimérica y se detectaronformas monoméricas después de la separación de muestras reducidas.

Ejemplo 6

Papel de 9Gly o VEGF Ex3 en construcciones Flt-1 (D2)

Para investigar el papel del enlazador 9Gly o la secuencia de dimerización de VEGF Ex3 sobre la unión del receptorsoluble VEGF, se generaron otras tres construcciones: D2-9Gly-CH3, D2-CH3 y D2-Ex3/CH3 (Fig. 8). Las tresconstrucciones se generaron y como todas las construcciones previas también se pusieron bajo el control delpromotor CMV. Su actividad de bloqueo de VEGF se ensayó en el ensayo de proliferación de HUVEC (Fig. 9).

El ensayo de proliferación de HUVEC de proteínas que contienen la región CH3 de IgG1 ha demostrado que D29Gly-CH3 (sin Ex3) y la proteína D2-Ex3/CH3 (sin enlazador 9Gly) tenían potencia de bloqueo de VEGF similar encomparación con la proteína D2-9Gly-Ex3/CH3 parental. Sin embargo, parece que la proteína D2-CH3 es el inhibidormás débil de VEGF entre todas ellas (Fig. 9).

Los datos de ELISA de Flt-1 de medios condiciones de células 293 transfectadas tienen niveles de Flt-1 similares para D2-9Gly-Ex3/CH3, D2-9Gly-CH3 y D2-Ex3/CH3 y D2-CH3 (70-90 ng/ml) y un poco mayores (�150 ng/ml) parala forma menos activa de D2-CH3. La transferencia de Western de las construcciones D2-9Gly-CH3 y D2-CH3 (Fig.10) demuestra un predominio de formas diméricas en condiciones no reducidas.

Ejemplo 7

D2-9Gly-Fc se une a VEGF mejor que todas las construcciones

El ensayo de unión de VEGF permite comparar las afinidades de unión relativas a VEGF de estos receptores deVEGF solubles en un sistema libre de células.

En resumen, se diluyeron en serie medios condicionados que contenían concentraciones conocidas de receptorsoluble (que variaban en las concentraciones de 0,29 - 150 pM) y se mezclaron con VEGF 10 pM. La cantidad deVEGF no unido se midió después por ELISA. D2-9Gly-Fc se une a VEGF con mayor afinidad en las concentracionesde receptor de 0,001 a ~0,2 pM que todas las demás construcciones. D2-CH3 tiene la afinidad más baja para unirsea VEGF (Fig. 11).

Referencias

Davis-Smyth, et al., EMBO J., 15,1996, 4919 Huston, J. S., et al. (1991) Methods Enzymol. 203, 46-88 Huston, J. S., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883. Johnson, S., et al. (1991) Methods Enzymol. 203, 88-98 Karpus, P. A., et al. (1985) Naturwiss., 72, 212-213. Keyt, B. A., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 5638 - 5646. Kortt, A. A., et al. (1997) Protein Engng, 10, 423-433. Lee, Y-L., et al. (1998) Human Gene Therapy, 9, 457-465 Mouz N., et al. (1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 9414-9419. Nielsen, et al. (1997) Protein Eng., 10, 1 Qiu, H., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 11173-11176.

Tabla de secuencias

SEC ID Nº: Nombre del clon Longitud Tipo

1: FLT1D29GLYFC 1077 DNA

2: FLT1D29GLYFC 358 Proteína

3: FLT1D2DEL9GLYFC 1050 DNA

4: FLT1D2DEL9GLYFC 349 Proteína

5: FLT1D29GLYEX3 426 DNA

6: FLT1D29GLYEX3 141 Proteína

7: FLT1D29GLYEX3CH3 744 DNA

8: FLT1D29GLYEX3CH3 247 Proteína

9: IgG1 HEAVY 1434 DNA

10: IgG1 HEAVY 477 Proteína

11: VEGF 648 DNA

12: VEGF 215 Proteína

13: VEGF exón 3 (ex3) 14 Proteína

14: FLT-1 5777 DNA

15: FLT-1 1338 Proteína

16: KDR 5830 DNA

17: KDR 1356 Proteína

18: D2-CH3 675 DNA

19: D2-CH3 224 Proteína

20: D2-EX3-CH3 717 DNA

21: D2-EX3-CH3 238 Proteína

22: D2-9GLY-CH3 702 DNA

23: D2-9GLY-CH3 233 Proteína

24: D2(G4S)3-Fc 1095 DNA

25: D2(G4S)3-Fc 364 Proteína

26: enlazador aleatorio 9 Proteína

27: enlazador 9 Proteína

28: enlazador 9 Proteína

29: enlazador 9 Proteína

30: enlazador 9 Proteína

31: enlazador 7 Proteína

32: enlazador 13 Proteína

33: enlazador 9 Proteína

34: enlazador 23 Proteína

A continuación se describen realizaciones preferidas de la presente descripción y se refieren como realizaciones E1 to E71.

E1. Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en donde

X comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento; e Y consiste esencialmente en un polipéptido de 5 a 25 restos aminoacídicos, y

Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG E2. La proteína de fusión de E1 en donde X comprende un receptor extracelular y dicho receptor se selecciona del grupo que consiste en un receptor tirosina quinasa y un receptor serina treonina quinasa.

E3. La proteína de fusión de E1 en donde X comprende un receptor extracelular y dicho receptor es un receptor del VEGF. E4. La proteína de fusión de E1 en donde X es el dominio 2 de tipo IgG de VEGF-R1 (FLT-1).

E5. La proteína de fusión de E1 en donde el polipéptido Y es flexible. E6. La proteína de fusión de E1 en donde el polipéptido Y se selecciona del grupo que consiste en gly9 (SEQ ID NO: 27), glu9 (SEQ ID NO: 28), ser9 (SEQ ID NO: 29), gly5cyspro2cys (SEQ ID NO: 30), (gly4ser)3 (SEQ ID NO: 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 32), Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEQ ID NO: 13), Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEQ ID NO: 26), y Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 34).

E7. La proteína de fusión de E1 en donde Z es una región CH3 de IgG1. E8. La proteína de fusión de E7 en donde Z es una región CH3 de IgG2. E9. Una composición que comprende la proteína de fusión de E1 que además comprende uno o más excipientes o

vehículos farmacéuticamente aceptables. E10. La composición de E9 en donde dicha composición es una formulación líquida. E11. La composición de E9 en donde dicha composición es una formulación liofilizada. E12. Una composición que comprende una o más proteínas de fusión de E1, en donde dicha composición

comprende multímeros de dichas proteínas de fusión.

E13. La composición de E12, en donde dicha composición consiste esencialmente en una sola especie de proteína de fusión que forma homomultimeros. E14. La composición de E12, en donde dicha composición consiste esencialmente en proteínas de fusión, en donde

los restos X en dichas proteínas de fusión en la composición son heterogéneos.

E15. La composición de E12 en donde el resto X es un receptor extracelular, y dicho receptor se selecciona del grupo que consiste en un receptor tirosina quinasa y un receptor serina treonina quinasa. E16. La composición de E12 en donde el resto X es un receptor extracelular, y dicho receptor es un receptor del

VEGF o una porción del mismo. E17. La composición de E12 en donde el resto X es el dominio 2 de tipo IgG de VEGF-R1 (FLT-1). E18. La composición de E12 en donde Y es un polipéptido flexible. E19. La composición de E12 en donde Y es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en gly9 (SEQ ID NO:

27), glug (SEQ ID NO: 28), ser9 (SEQ ID NO: 29), gly5cyspro2Cys (SEQ ID NO: 30), (gly4ser)3 (SEQ ID NO: 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 32), Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEQ ID NO: 13), Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEQ ID NO: 26), y Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID NO: 34).

E20. La composición de E12 en donde Z es una región CH3 y dicha región es una región CH3 de IgG1.

E21. La composición de E12 que además comprende uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. E22. La composición de E21 en donde dicha composición es una formulación líquida. E23. La composición de E21 en donde dicha composición es una formulación liofilizada. E24. Un polipéptido de fórmula X-Y-Z, en donde X comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un receptor extracelular, una región variable de

anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento;

Y consiste esencialmente en un resto enlazador que proporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos; y Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG.

E25. El polipéptido de E24 en donde el resto enlazador es un oligómero que tiene 10-100 restos monómeros de etilenglicol

E26. Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en donde X comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento; e

Y consiste esencialmente en un polipéptido de 5 a 25 restos aminoacídicos, y Z es una porción Fc de una molécula de anticuerpo. E27. La proteína de fusión de E26, en donde el Fc es un Fc de IgG. E28. La proteína de fusión de E27, en donde el Fc de IgG es Fc de IgG1. E29. Una composición que comprende la proteína de fusión de E26 que además comprende uno o más excipientes

o vehículos farmacéuticamente aceptables. E30. La composición de E29 en donde Z es una porción Fc de una molécula de anticuerpo que es un Fc de IgG. E31. La composición de E29 en donde Z es una porción Fc de una molécula de anticuerpo que es un Fc de IgG1. E32. Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en donde X comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un receptor extracelular, una región variable de

anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento; e

Y consiste esencialmente en un resto enlazador que proporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos, y Z es una porción Fc de una molécula de anticuerpo. E33. La proteína de fusión de E32, en donde el Fc es un Fc de IgG. E34. La proteína de fusión de E33, en donde el Fc de IgG es Fc de IgG1. E35. La proteína de fusión de E32 en donde el resto enlazador es un oligómero que tiene 10-100 restos monómeros

de etilenglicol. E36. Una composición que comprende la proteína de fusión de E32 que además comprende uno o más excipientes

o vehículos farmacéuticamente aceptables. E37. La composición de E36 en donde Z es una porción Fc de una molécula de anticuerpo que es un Fc de IgG. E38. La composición de E36 en donde Z es una porción Fc de una molécula de anticuerpo que es un Fc de IgG1. E39. Un método para multimerizar un polipéptido X que comprende: unir un polipéptido X a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar un polipéptido XYZ, en donde X comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un receptor extracelular, una región variable de

anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento Y consiste esencialmente en un polipéptido de 5 a 25 restos aminoacídicos, y Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG;

con lo que se multimeriza el polipéptido XYZ. E40. El método de E39 en donde la etapa de unión comprende construir una molécula de ácido nucleico que codifica cada uno de X, Y, y Z como un solo marco de lectura abierto, en donde dicho polipéptido XYZ se expresa a partir de la construcción de ácido nucleico en una célula hospedante.

E41. Un método para multimerizar un polipéptido X que comprende: unir un polipéptido X a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar un polipéptido XYZ, en donde X comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un receptor extracelular, una región variable de

anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento;

Y consiste esencialmente en un resto enlazador que proporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos, y Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG; con lo que se multimeriza el polipéptido XYZ.

E42. El método de E41 en donde el resto enlazador consiste esencialmente en un oligómero de 10-100 restos monómeros de etilenglicol. E43. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según E1. E44. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según E26.

E45. El ácido nucleico de E43 o 44 en donde X es el dominio 2 de tipo Ig de VEGF-R1 (Flt-1). E46. El ácido nucleico de E43 en donde X es el dominio 2 de tipo Ig de VEGF-R1 (Flt-1) y la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 21, y 23.

E47. El ácido nucleico de E44 en donde X es el dominio 2 de tipo Ig de VEGF-R1 (Flt-1) y la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y 25.

E48. La proteína de fusión de E1 o 26 en donde X es el dominio 2 de tipo Ig de VEGF-R1 (Flt-1). E49. La proteína de fusión de E1 en donde X es el dominio 2 de tipo Ig de VEGF-R1 (Flt-1) y la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 21, y 23.

E50. La proteína de fusión de E26 en donde X es el dominio 2 de tipo Ig de VEGF-R1 (Flt-1) y la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y 25. E51. Una célula de mamífero que comprende el ácido nucleico de E43 o 44.

E52. La célula de mamífero de E51 que es una célula humana. E53. La célula de mamífero de E52 que se selecciona del grupo que consiste en un fibroblasto, un hepatocito, una célula endotelial, un queratinocito, una célula hematopoyética, un sinoviocito, una célula epitelial, una célula retiniana, y una célula madre.

E54. Un método in vitro que comprende:

suministrar el ácido nucleico de E43 o 44 a una célula aislada de mamífero para formar una célula que expresa dicha proteína de fusión. E55. El método de E54 en donde la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que

consiste en SEQ ID NO: 2, 8, 21, 23, y 25. E56. El método de E54 que comprende además: suministrar la célula que expresa dicha proteína de fusión a un mamífero. E57. Un método que comprende: suministrar la célula de mamífero de E51 a un mamífero. E58. Un método que comprende: suministrar el ácido nucleico de E43 o 44 a un mamífero, con lo que dicha proteína de fusión es expresada en el

mamífero.

E59. El método de E58 en donde la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 8, 21, 23, y 25. E60. El método de E57 en donde el mamífero tiene degeneración macular húmeda relacionada con la edad o

retinopatía diabética proliferativa. E61. El método de E58 en donde el mamífero tiene cáncer. E62. El método de E58 en donde el mamífero tiene artritis reumatoide. E63. El método de E58 en donde el mamífero tiene asma. E64. El método de E58 en donde el mamífero tiene osteoartritis. E65. Un método que comprende: suministrar la proteína de fusión de E1 o 26 a un mamífero. E66. El método de E65 en donde el mamífero tiene degeneración macular húmeda relacionada con la edad o

retinopatía diabética proliferativa. E67. El método de E65 en donde el mamífero tiene cáncer. E68. El método de E65 en donde el mamífero tiene artritis reumatoide. E69. El método de E65 en donde el mamífero tiene asma.

E70. El método de E65 en donde el mamífero tiene osteoartritis.

E71. El método de E65 en donde la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 8, 21, 23, y 25.

5 Listado de secuencias

<110> Genzyme Corporation

<120> CONSTRUCCIONES MULTIMÉRICAS

<130> P30465EP-PCT

<140> EP05810409.2 10 <141> 2005-09-13

<150> 60/658209

<151>

<150> 60/608887

<151> 15 <160> 34

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 1077

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 1

25 <210> 2

<211> 358

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 2

<210> 3 5 <211> 1050

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma 10 <400> 3

<210> 4

<211> 349

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 4 <210> 5

<211> 426

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 5

<210> 6

<211> 141

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 6

<210> 7

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 7

<210> 8

<211> 247

<212>: PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 8

<210> 9

<211> 1434

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 477

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 648

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 215

<212>: PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 5777

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 1338

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> DOMINIO

<222> (235)...(336)

<223> dominio 3

<400> 15

<210> 16

<211> 5830

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 1356

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 675

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 18

10 <210> 19

<211> 224

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 19 <210> 20

<211> 717

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 20

10 <210> 21

<211> 238

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 21 <210> 22

<211> 702

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 22

10 <210> 23

<211> 233

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 23 <210> 24

<211> 1095

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 24

10 <210> 25

<211> 364

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína de fusión recombinante o secuencia que codifica la misma

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> enlazador de proteína de fusión

<400> 26

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 27

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 30

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 31

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 33

<210> 34

<211> 23

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> resto enlazador para proteínas de fusión

<400> 34

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende una porción del receptor de VEGF; Y es un resto enlazador; y Z es un dominio de multimerización, en donde el resto enlazador Y es un polipéptido de 5-50 restos aminoacídicos que tiene una flexibilidad por encima

de la media como se determina por el método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, y donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.
2.

La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto enlazador Y se selecciona entre el grupo compuesto por Gly9 (SEC ID Nº 27), Glu9 (SEC ID Nº 28), Ser9 (SEC ID Nº 29), Gly5CysPro2Cys (SEC ID Nº 30), (Gly4Ser)3 (SEC ID Nº 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 32), Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEC ID Nº 13),

Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEC ID Nº 26), y Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 34).
3.

La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio de multimerización Z causa la migración de al menos 50% de las proteínas de fusión monoméricas en un gel de poliacrilamida nodesnaturalizante a una velocidad que es apropiada para un multímero de la proteína de fusión.
4.

La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio de multimerización Z es un fragmento de una cadena pesada de IgG.
5.

La proteína de fusión de la reivindicación 4, en donde el dominio de multimerización Z es una secuencia de una porción de Fc de una cadena pesada de IgG1 o IgG2.
6.

La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio de multimerización Z es una región CH3 de una cadena pesada de IgG o es una porción de Fc de una molécula de anticuerpo.
7.

La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde X comprende el dominio 2 de tipoIgG de VEGF-R1.
8.

La proteína de fusión de la reivindicación 7, en donde X comprende el dominio 2 de tipo IgG de VEGF-R1 pero carece de los dominios 1 y 3 de tipo Ig de VEGF-R1.
9.

La proteína de fusión de la reivindicación 8, en donde X es el dominio 2 de tipo IgG de VEGF-R1.
10.

Una composición que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
11.

Un método para multimerizar un polipéptido X, comprendiendo el método unir el polipéptido X a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar un polipéptido X-Y-Z, en donde:

X comprende una porción de un receptor de VEGF; Y es un resto enlazador; yZ es un dominio de multimerización, en donde el resto enlazador Y es un polipéptido de 5 - 50 restos aminoacídicos que tiene una flexibilidad por encima de la media como se determina por el método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz, 1985, Naturwiss, 72: 212-213, y donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.
12.

El método de la reivindicación 11, en donde la etapa de unión comprende construir una molécula de ácidonucleico que codifica los polipéptidos X, Y y Z como un solo marco de lectura abierto, en donde dicho polipéptido X-Y-Z es expresado a partir de dicha molécula de ácido nucleico en una célula hospedante.
13.

Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
9.
14. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13, que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 8, 21, 23 y 25.

5 15. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14.
16. El vector de la reivindicación 15, en donde el vector es un vector viral adeno-asociado.
17. Una célula de mamífero que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14 o el vector de 10 la reivindicación 15 o 16.
18. Un método in vitro que comprende suministrar el ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14 o el vector de las reivindicaciones 15 o 16 a una célula de mamífero para producir una célula que expresa dicha proteína de fusión.

15 19. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14, el vector de la reivindicación 15 o 16, o la célula de mamífero de la reivindicación 17, para uso en el tratamiento de un mamífero.
20. La proteína de fusión, molécula de ácido nucleico, vector o célula de mamífero para uso según la reivindicación

20 19, en donde el mamífero tiene degeneración macular húmeda relacionada con la edad, retinopatía diabética proliferativa, cáncer, artritis reumatoide, asma, u osteoartritis.