KR20220087491A - TGF-β 폴리펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은, 예를 들어, 자가면역질환을 포함하는 질환의 치료적 치료에서의 용도를 발견하는 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 폴리펩타이드 작제물 및 복합체를 제공한다. 또한 작제물 및 복합체를 암호화하는 핵산 및 세포 기반 발현 시스템에서 작제물 및 복합체를 제조하는 방법이 기재된다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2019년 10월 23일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/925,227호의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 종이 사본과 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF) 둘 다로서 작용하고 파일명 "123640-8012WO00_seqlist.txt"로 이루어지며, 2020년 10월 21일자로 생성되고, 용량이 341,966 바이트이며, 본 명세서에 전체가 참조에 의해 원용되는, 전자적으로 제출된 서열목록을 포함된다.
I. 도입
A. TGF-β 및 이의 작용
형질전환 성장인자(TGF-β)는 3가지의 포유류(인간) 아이소폼, 즉, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 포함하는 형질전환 성장인자 슈퍼패밀리에 속하는 사이토카인이다. TGF-β는 TGF-β의 활성 형태로서 동형이량체화하는 TGF-β 서열에 추가로 프로펩타이드 영역을 포함하는 전구체 분자로서 합성된다. TGF-β는 2가지의 다른 폴리펩타이드 - 잠재성 TGF-β 결합 단백질(LTBP) 및 잠재성-연관 펩타이드(latency-associated peptide: LAP)와 조합된 잠재성 복합체에서 대식세포 및 기타 세포 유형에 의해 분비된다. 잠재성 TGF-β 복합체는, 예를 들어, (플라스민에 의해 활성될 수 있는 경우) 트롬보스폰딘-1을 통해 CD36에 의해 세포 표면에 결합되거나 또는 잠재성 형질전환 성장인자 베타 결합 단백질 1, 2, 3 및/또는 4(LTBP1-4)에 결합된 세포외 기질(ECM)에 저장된다.
TGF-β의 생물학적 기능은 잠재성 TGF-β 활성화 후에 나타나는데, 이는 ECM 교란(perturbation)에 반응하여 엄격하게 조절된다. TGF-β는 다양한 세포 또는 조직 특이적 경로, 또는 다수의 세포 또는 조직 유형에서 관찰된 경로에 의해 활성화될 수 있지만; 그러나, 이러한 활성화 경로 뒤의 완전한 메커니즘은 완전히 알려져 있지 않다. 활성제는 프로테아제, 인테그린, pH 및 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 사실상, 세포/조직 결합 잠재성 TGF-β 복합체는 공간적 및/또는 시간적 방식으로 활성 TGF-β를 방출하는 환경적 교란에 대해 기능하고, 감지하며, 반응한다. 방출된 TGF-β는 이의 방출 상황에 따라 세포 증상을 촉진시키거나 저해하는 작용을 한다. 이는 또한 조직 재생/리모델링 과정에 참여하는 줄기/조상 세포를 보충한다. TGF-β 리간드 발현, 생체이용률, 활성화, 수용체 기능 또는 전사 후 변형의 약어는 정상 기능을 방해하며, 과도한 조상세포의 보충을 통해(예를 들어, 퇴행성관절염 또는 카무라티-엥겔만병에서), 또는 체류 세포의 바람직하지 않은 계통으로 전환분화에 의해서와 같이(예를 들어, 암전이 또는 조직/기관 섬유증 동안에 상피의 중간엽으로의 전이에서) 다수의 질환과 연관된 병리학적 결과로 이어질 수 있다. Xu et al Bone Research, 6 (Article No. 2) (2018).
1
인테그린-독립적 및 인테그린-의존적 활성화
a. 인테그린-독립적 활성화
TGF-β 활성화의 인테그린-독립적 수단 중에는, 특히, 프로테아제 및/또는 메탈로프로테아제, 활성 산소종(ROS) 및 트롬보스폰딘-1의 작용을 통해 작용하는 것이 있다.
플라스민 및 몇몇 기질 금속단백질분해효소(MMP)는 세포외 기질 성분의 단백질분해에 의해 종양 침윤 및 조직 리모델링을 촉진시킨다. TGF-β는 기질로부터 잠재성 복합체를 방출시키는 이러한 프로테아제 작용에 의해 활성화되고, 이어서, LAP의 가수분해로 TGF-β를 이의 수용체에 방출시키는 것이 이어질 수 있다. 기질 메탈로프로테아제 -9와 -2는 둘 다 잠재성 TGF-β를 절단하는 것으로 알려져 있다.
TGF-β는 ROS 방출을 유도하기 위한 방사선 노출 후 생체내에서 빠르게 활성화되는 것으로 나타났다. ROS는 LAP와 TGF-β 사이의 상호작용을 변경시켜, 이의 활성화를 야기하는 것으로 생각된다.
건강한 개체의 혈장에서 발견되는 당단백질인 트롬보스폰딘-1(TSP-1)은 손상에 반응하여 증가되는 것으로 알려져 있다. TSP-1은 잠재성 TGF-β 복합체와의 직접 상호작용을 형성하고 이것이 성숙 TGF-β에 결합하는 것을 방지함으로써 잠재성 TGF-β를 활성화시키는 것으로 여겨진다. 트롬보스폰딘 매개 활성화는 상처(예를 들어, 진피 상처) 치유에 관여하는 것으로 여겨진다.
b. 알파(V) 함유 인테그린에 의한 활성화
인테그린, 및 특히 β6, αV 및 β8 함유 인테그린은 잠재성 TGF-β(예를 들어, TGF-β1) 활성화에 기여하는 것으로 이해된다. 활성화는 잠재성 TGF-β1 복합체에 대한 입체구조적 변화를 유도하여 활성 TGF-β1을 방출함으로써 또는 인테그린-프로테아제-의존적 메커니즘에 의해 일어나는 것으로 나타난다. 특히 상피 세포에서 단백질분해 없이 TGF-β1 활성화로 이어지는 입체구조적 변화는 LAP-β1 또는 LAP-β3에 존재하는 아르기닐-글리실-아스파르트산 세포 접착 모티프(RGD 모티프)에 대한 인테그린 결합을 통해 일어나는 것으로 이해된다. RGD 모티프를 포함하는 LAP는 대다수의 αV 함유 인테그린에 의해 인식된다. 예를 들어, αVβ6 인테그린은 LAP-β1 및 LAP-β3에 존재하는 RGD 모티프에 대한 결합에 의해 TGF-β1을 활성화/방출할 수 있다. 또한, TGF-β의 인테그린-프로테아제-의존적 활성화는 잠재성 TGF-β 복합체의 단백질 분해에 의해 TGF-β를 활성화시킬 수 있는, 잠재성 TGF-β 복합체와 MMP, 예컨대, MMP-2 및 MMP-9 사이의 연결을 생성함으로써 일어날 수 있다.
2
TGF-β 신호전달 및 작용
활성화된 TGF-β는 세포 분화뿐만 아니라 T-세포 조절에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 및 이의 인용문헌] 참조. TGF-β는 흉선 유래 Treg(tTreg), 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 및 CD8α+ T-세포 전구체의 생존을 지원하고, 그에 따라, 강한 작용제 리간드에 의해 유도 가능한 T-세포의 발생을 촉진시킴으로써 몇몇 T-세포 계통의 흉선 발생을 촉진시킨다. TGF-β는 인터류킨(IL)-7Rα의 흉선세포 발현을 촉진시킴으로써 통상적인 CD8+T 세포를 지원한다. TGF-β는 또한 저친화도 T 세포의 IL-7-의존적 생존을 촉진시킴으로써, 흉선세포 IL-7Rα 발현을 제어함으로써 그리고 자가반응 또는 고친화도 T 세포의 T-세포 수용체(TCR)-유도 활성화를 저해함으로써 말초 T-세포 항상성을 조절한다. 초기 CD8+ T-세포 분화에서, TGF-β는 세포독성 T 림프구(CTL) 형성을 저해하고, 단명 효과기 세포(short-lived effector cell: SLEC)의 세포자멸사를 촉진시키는 한편, CD103-발현 조직 체류 기억(TRM) 세포의 분화를 촉진시킨다. TGF-β는 T 헬퍼 1 및 2(Th1 및 Th2) 세포 분화를 저해하지만, 다른 인자와 작용하는 TGF-β는 다양한 T-세포의 발생을 촉진시킨다. TGF-β는 IL-2와 함께 말초 Treg (pTreg)의 생성을 촉진시키고, IL-6은 Th-17 세포의 생산을 촉진시키며, IL-4는 Th9 세포의 생산을 촉진시키고, IL-21 및/또는 23은 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포의 생성을 촉진시킨다.
T 세포 상에서의 이의 작용에 추가로, 다양한 다른 세포는 B 림프구 또는 "B 세포", 단핵구 및 대식세포를 포함하는 TGF-β에 의해 조절된다. TGF-β는 일반적으로 B 세포 상의 저해 작용을 가져서(Li et al., Annual Review of Immunology. 24 (1): 99-146 (2006) 및 Roes et al., PNAS USA, 100 (12): 7241-7246 (2003)); B 세포 증식을 저해하고, 미숙 또는 남아있는 B 세포의 세포자멸사를 유도한다(Arsura, et al., Immunity 5(1): 31-40.(1996)). B 세포 상에서 TGF-β 작용의 적어도 일부는 IL-1, TNF-a 및 디펜신을 포함하는 사이토카인의 생성을 조절하는 NF-κB의 저해제인 IKBa의 유도로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 및 이의 인용문헌]을 참조한다.
이의 B 세포 상에서의 작용에 추가로, TGF-β는 나머지 단핵구를 자극하고, 활성화된 대식세포를 저해한다. TGF-β는 Toll-유사-수용체("TLR") 리간드에 의해 자극된 대식세포의 전염증 반응과 같은 저해 효과를 나타낸다. TLR 리간드 또는 다른 사이토카인의 부재 하에 TGF-β 자극은 골수성 세포에 의한 몇몇 염증성 사이토카인의 생성을 촉진시킨다. TGF-β는 조직 내로 말초 혈액 단핵구 및 대식세포를 유도하고 단핵구 접착 특성을 향상시키는 것으로 나타났다. TGF-β는 주화성을 유도하고, 비만 세포의 접착 특성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 및 이의 인용문헌] 참조.
일단 TGF-β가 활성화되면, 이는 세포 표면 신호전달 수용체를 통해 작용하는 것으로 이해된다. 신호전달은 활성 TGF-β 리간드가 세포 표면 상의 형질전환 성장인자 베타 수용체 II("TβRII")에 결합할 때 시작된다. 이 상호작용은 형질전환 성장인자 베타 수용체 I("TβRI")의 보충을 초래할 수 있다. TβRII는 TGF-β1 단독에 결합할 수 있는 반면, TβRI은 TβRII와 협력할 때만 리간드에 결합할 수 있다. TβRI은 TβRII에 의해 인산화 및 활성화되어, R-Smad 단백질(Smad2 및 Smad3)의 보충 및 인산화를 통한 표준 신호전달을 통해 신호전달을 야기한다. 상기 Smad는 후속적으로 co-Smad(Smad4)에 결합하고, 함께 복합체가 몇몇 유전자의 전사를 유도한다. 문헌[Smith et al., Clin. Cancer Res.; 18(17): 4514-21 (2012)] 참조. TGF-β는 또한 리간드-점유 수용체에 의해 활성화되는, MAP 키나제 경로, Rho-유사 GTPase 신호전달 경로, 및 포스파티딜이노시톨-3-키나제/AKT 경로의 다양한 분지를 포함하는 비표준(비-Smad) 경로를 통해 신호를 전달할 수 있다. 비표준 경ㄹ오를 통한 신호전달은 하류의 세포 반응을 강화하거나, 약화시키거나, 또는 달리 조절할 수 있다. 문헌[Zhang Ye, Cell Res. 19(1):128-39 (2009)] 참조. TβRI 및 TβRII와 대조적으로, 형질전환 성장인자 베타 수용체 III("TβRIII" 수용체 또는 "베타 글리칸")은 TGF-β 신호 전달에 참여하지 않으며, 오히려 TGF-β에 대한 저장소로서 작용한다.
활성화 인자의 교란, 활성화된 TGF-β의 비정상 수준 및/또는 TGF-β 신호전달에서의 변경은 몇몇 질환 또는 합병 질환 상태를 야기할 수 있는 비조절 TGF-β 신호전달 수준으로 이어질 수 있다. 사실, TGF-β는 염증, 자가면역 장애, 섬유증, 암 및 백내장만큼 다양한 병태에 대해 효과를 갖는 것으로 나타났다.
TGF-β는 관용 유도에 관련된 인자로서 면역계의 항상성을 유지하는 데 중추적인 역할을 하고, 이에 의해 자가면역 반응에 영향을 미친다. TGF-β가 이러한 효과를 초래할 수 있는 한 가지 메커니즘은 (예를 들어, IL-2의 존재 하에) T-조절 세포 또는 "T-Reg" 세포로 분화시키기 위해 T-세포(예를 들어, CD4+, CD8+, CD4-CD8+ 및 CD4-CD8- 세포)를 유도하는 것에 의한다. 예를 들어, 문헌[Bettini and Vagnali, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1183:1-12 (2010)] 참조. T-Reg 세포는 면역관용의 유지에 필수적이다. 문헌[Josefowicz et al. Annu Rev Immunol, 30: 531-564. (2012)]. 자가항원을 포함하는 항원에 대해 관용을 유도함에 있어서 TGF-β의 역할은 이것을 발생 질환, 예컨대, 관절염(류마티스 관절염 또는 "RA"), 1형 당뇨병("T1D"), 다발성 경화증("MS") 및 전신 홍반성 루프스("SLE")에 대한 보호에서 중요한 인자로 만든다. 예를 들어, TGF-β의 중요한 기능 중에는 자가면역질환 및 관련된 염증 과정의 조절이 있다. 이는 염증성 장질환 또는 "IBD"와 같은 병태에서 대식세포 사이토카인 생성 및 점막 염증을 억제하는 것으로 여겨지는 장에서 특히 그러하다. 문헌[Sanjab et al. Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236] 참조. IBD와 같이, RA는 관절에서 관련된 염증 성분을 갖는 자가면역 장애이다. RA는 T 및/또는 B 세포에서의 비정상 반응으로부터 초래된다. 전신 TGF-β는 RA 발생으로부터의 보호를 제공하는 것으로 나타난다. 문헌[Schramm et al., Arthritis Res. Ther. 6:R114-R119 (2004)] 및 문헌[Sanjab et al. Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236)] 및 이들에 인용된 참고문헌을 참조한다.
TGF-β 작용을 효과적으로 중화시키기 위해 이를 격리시킴으로써 단백질 수준에서 이의 작용을 조절하는 다수의 접근은 문헌에 기재되어 있었다. 예를 들어, 단클론성 항체, 예컨대, TGF-β1로 향하는 메텔리무맙(Metelimumab)(CAT192) 및 TGF-β의 다수의 아이소폼으로 향하는 프레졸리무맙(Fresolimumab)은 생체내 TGF-β에 결합하고, 격리시키고, 중화하도록 개발되었다. 또한, TGF-β에 단단히 결합하고 격리시킴으로써 이를 격리 및 중화시키는 수용체 트랩이 또한 개발되었다(예를 들어, 문헌[Swaagrtra, et al., Mol Cancer Ther; 11(7): 1477-87 (2012)] 및 미국 특허 공개 제2018/0327477호 참조).
TGF-β에 결합하고 격리하도록 그리고 TGF-β 작용에 대한 길항제로서 작용하도록 설계된 상기 기재된 분자와 달리, 본 명세서에 기재된 마스킹된(masking) TGF-β 복합체는 활성 TGF-β 폴리펩타이드(예를 들어, TGF-β 신호전달 경로 작용제) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 가역적으로 마스킹하도록 서로 상호작용하는 마스킹 폴리펩타이드(예를 들어, TGF-β 수용체 단편)를 제공한다. 마스킹된 TGF-β 복합체는 이들의 상호 친화도를 감소시키고 TGF-β의 비마스킹(unmasking)에 기여할 수 있는 TGF-β에서 그리고/또는 마스킹 폴리펩타이드에서의 서열 변이를 포함할 수 있어서, 헤테로머 세포 표면 수용체를 통해(예를 들어, TβRII에 대한 결합 다음에 TβRI에 결합하여 헤테로머 수용체를 형성함) 이의 결합 신호 전달을 가능하게 한다. 일단 형성되면, TGF-β에 대해 고친화도를 갖는 헤테로머 TβRI-TβRII 폴리펩타이드 복합체는 마스킹 폴리펩타이드와 효과적으로 경쟁할 수 있다. TGF-β 및/또는 이의 마스킹 폴리펩타이드의 서열 변이는 또한 비마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드와 다른 분자 사이의 바람직하지 않은 상호작용의 회피를 가능하게 할 수 있다. 이러한 서열 변이는 TβRI에 대한 결합을 약화시키는 TβRII의 N-말단 부분의 결실, 및/또는 비-신호전달 TβRIII 분자의 저장소에 대한 비표적 결합을 제한하는 이량체화(예를 들어, C77S 치환)를 방지하는 TGF-β 서열 변이를 포함한다. 앞서 언급한 것에 추가로, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체는 또한 시험관내 효과 및 생체내 효과, 예컨대, 치료 결과를 포함하는 표적 세포에 대한 TGF-β 결합 결과에 실질적으로 영향을 미칠 수 있는 추가적인 야생형(wt.) 및/또는 변이체 면역조절 폴리펩타이드 서열(MOD)을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 TGF-β가 다른 폴리펩타이드에 의해 마스킹된 작제물("마스킹된 TGF-β 작제물", 예를 들어, 단일 폴리펩타이드 쇄를 갖는 도 1 구조 A), 및 TGF-β가 다른 폴리펩타이드에 의해 마스킹된 복합체("TGF-β 폴리펩타이드 복합체", 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 복합체를 나타내는 도 1 구조 B 내지 F)의 제조를 기재하며, 추가적이 요소를 또한 포함할 수 있는 이들 작제물과 복합체는 본 명세서에서 "마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체"로서 총괄적으로 지칭된다. 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체는 스캐폴드 폴리펩타이드(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역) 근처에서 만들어지고, TGF-β에 결합하는 마스킹 폴리펩타이드 서열("마스킹 폴리펩타이드 서열", "마스킹 폴리펩타이드" 또는 "마스킹 서열")을 포함한다. 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체는 또한 하나 이상의 독립적으로 선택된 면역조절 폴리펩타이드 서열, 예컨대, 야생형 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
마스킹된 비표적 TGF-β 활성이 비마스킹된 TGF-β에 의해 관찰된 정도로 세포에 유해하게 영향을 미치지 않기 때문에 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체는 수많은 포유류 세포 유형에서 발현될 수 있다.
마스킹된 TGF-β 작제물은:
i) 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
ii) TGF-β 폴리펩타이드 서열;
iii) TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 포함하는 마스킹 폴리펩타이드 서열;
iv) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열;
및
v) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 제1 폴리펩타이드로서 포함할 수 있되,
본 명세서에서 "마스킹된 TGF-β 작제물"로서 총괄적으로 지칭되는 이들 요소를 포함하는 작제물로서, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서로 결합된다. 상기 마스킹된 TGF-β 작제물은, 예를 들어, 하기의 순서(N-말단으로부터 C-말단까지):
i) 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는
ii) 제1 MOD 폴리펩타이드 서열, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는
iii) 제1의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 제2의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 MOD 폴리펩타이드 서열, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열
로 조직화될 수 있되,
마스킹된 TGF-β 작제물은 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
상기-언급된 마스킹된 TGF-β 작제물의 스캐폴드 폴리펩타이드는 동형이량체의 형성을 야기하는 종간(interspecific) 또는 비-종간 이량체화 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 선택적으로 서로에 대해 하나 이상의 공유 부착을 갖는다.
상기-언급된 마스킹된 TGF-β 작제물의 스캐폴드 폴리펩타이드는 또한 종간 이량체화 서열을 포함할 수 있고, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체를 형성하기 위해 상대 종간 이량체화 서열을 통해 (상기 기재한 바와 같은) 제1 폴리펩타이드와 이량체화되는 제2 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 다음의 구조 중 하나: (i) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열; (ii) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열; (iii) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 독립적으로 선택된 MOD 서열; 또는 (iv) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있되, 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 따라서 제2 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지, 다음의 구조 중 하나: (i) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열; (ii) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열; (iii) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열; 또는 (iv) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있되, 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체는 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로: (i) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; (ii) 제1 MOD 폴리펩타이드 서열, 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는 (iii) 제1의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 제2의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
마스킹된 TGF-β 복합체는 또한 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체로서 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함할 수 있되,
(i) 제1 폴리펩타이드는,
a) 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열,
b) TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 포함하는 마스킹 폴리펩타이드 서열,
c) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 및
d) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 포함하고,
(ii) 제2 폴리펩타이드는,
a) 제1 폴리펩타이드에서 종간 이량체화 서열에 대한 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열,
b) TGF-β 폴리펩타이드 서열,
c) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 및
d) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 포함하고,
"마스킹된 TGF-β 복합체"로서 총괄적으로 지칭되는 이들 요소를 포함하는 복합체로서, 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 상이한 폴리펩타이드 쇄 상에 제공되고, 서로 결합되며;
종간 결합 서열 및 상대 종간 결합 서열은 이형이량체에서 서로 상호작용하고; 그리고
마스킹된 TGF-β 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 TGF-β 아이소폼 중 어느 것으로부터 유래될 수 있고, 이량체화로부터 TGF-β 서열의 능력을 제한하는 치환을 포함할 수 있다. 마스킹 서열은, 예를 들어, 항-TGF-β 항체 서열 또는 TGF-β 수용체(TβR) 엑토도메인 서열일 수 있다. TβR 엑토도메인이 TGF-β 서열을 마스킹하는 데 사용되는 경우, 이들은 마스킹된 분자에 의한(예를 들어, TGF-β 서열과의 상호작용에 필수적이지 않은 엑토도메인의 모두 또는 일부의 결실에 의한) 부적절한 신호전달을 피하도록 변형될 수 있다.
본 개시내용은 또한 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 생산 방법, 및 다양한 세포 유형을 달성하고 자가면역 및 염증 질환을 포함하는 다양한 질환/장애를 치료함에 있어서의 이들의 사용 방법을 기재하고 제공한다. 본 명세서에 기재된 치료 방법은: 면역조절제(예를 들어, 인터류킨, 사이토카인, 케모카인 둥); 항체들 및 항체 단편(예를 들어, scFv, 나노바디 등); 소분자 치료제(예를 들어, 비타민 D 또는 레티노산); 및 목적하는 연구 또는 치료 결과를 달성하는 데 유리할 수 있는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 분자와 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 공동투여를 포함할 수 있다.
도 1은 TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하기 위해 TGF-β 수용체 서열이 사용되는 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 대한 일부 형식을 도시한 도면. 구조 A는 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 탠덤(tandem) 독립적으로 선택된 MOD의 세트)에 대해 단일 위치를 갖는 단량체 작제물을 도시한다. 구조 B는 폴리펩타이드가 2개의 폴리펩타이드를 연결하는 이황화결합을 자발적으로 형성할 수 있는 이들 각각의 Ig Fc 서열을 거쳐 상호작용하는 대칭적 동형이량체를 도시한다. 구조 C 내지 F는 TGF-β 및 TGF-β 수용체 서열이 이형이량체의 "시스"(동일한 폴리펩타이드 상) 또는 "트랜스"(상이한 폴리펩타이드 상)에 있는 이형이량체 구조를 도시한다. 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD가 위치될 수 있는 위치는 대각선 또는 수직선 또는 체크 패턴으로 채워진 원으로 나타낸다. 종간 결합쌍은 노브-인-홀(knob-in-hole) 서열로 나타내지만, 이하에 논의하는 바와 같은 임의의 다른 것일 수 있다. 작제물은 MOD를 포함하지 않을 수 있거나, MOD 서열을 탠덤으로 포함하는 1, 2개 이상의 독립적으로 선택된 MOD 서열을 포함할 수 있고, 이 MOD는 표시된 위치에 제공될 수 있다. 예시적인 MOD는, 예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체(예를 들어, 특정 수용체 또는 수용체에 대해 감소된 친화도 및/또는 선택적 친화도를 가짐) PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 및 IL-23 MOD 서열을 포함한다. TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하기 위해 TGF-β 수용체 서열이 사용되는 각 예에서, 수용체 폴리펩타이드는 TGF-β 폴리펩타이드에 대해 친화도를 갖는 다른 마스킹 폴리펩타이드, 예컨대, 항체 폴리펩타이드(예를 들어, scFV 또는 나노바디)로 대체될 수 있다. 스캐폴드 서열은 (예를 들어, 이황화 결합에 의해) 결합되어 공유적으로 연결된 동형이량체 또는 공유적으로 연결된 이형이량체를 형성할 수 있다. 도면에 나타낸 임의의 작제물은 이량체화하는 능력을 제한하는 TGF-β 폴리펩타이드에서 서열 변이(예를 들어, C77S 치환)를 가질 수 있다.
도 2A 내지 도 2H는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드의 아미노산 서열(aa)(서열번호 68 내지 83)을 제공하는 도면.
도 2I는 밑줄표시된 단일 펩타이드 aa 1 내지 22를 갖는 인간 J-쇄의 아미노산 서열(서열번호 84)을 제공한다.
도 2J는 Ig G1 중쇄 불변 영역 CH1 도메인의 서열을 제공하는 도면. MD13-유사 작제물의 형성을 위한 각각 글루탐산 및 발린에 의해 치환될 수 있는 70 및 72번 위치에서의 세린 잔기(S70E 및 S72V).
도 2K는 Ig κ 및 Ig λ 쇄로부터의 경쇄 불변 영역 "CL" 도메인의 서열을 제공하는 도면. 68번 위치에서의 세린 및 70번 위치에서의 트레오닌은 MD13-유사 작제물의 형성을 위해 각각 류신 및 세린으로 치환될 수 있다(S68L 및 T70S).
도 3은 프레프로단백질로서 TGF-β의 3가지 상이한 아이소폼 및 성숙 단백질의 C77S 돌연변이체와 함께 TGF-β3의 성숙 형태의 서열을 제공하는 도면.
도 4는 밑줄표시되어 있고 볼드체가 아닌 TGF-β 아이소폼 1 및 3의 다른 형태에서 TGF-β2의 aa 잔기 Lys 25, Cys 77, Ile 92 및/또는 Lys 94 및 이들의 대응하는 잔기를 제외하고, 볼드체인 TGF-β2의 성숙 형태에 대응하는 잔기를 갖는 TGF-β 아이소폼 1 내지 3의 정렬을 제공하는 도면.
도 5A는 1형 TGF-β 수용체(TβRI) 및 이의 엑토도메인의 서열을 제공하는 도면.
도 5B는 2형 TGF-β 수용체(TβRII), 이의 엑토도메인 및 엑토도메인의 서열을 제공하는 도면. 아이소폼 B에서 볼드체 및 밑줄표시로 나타낸 위치는 성숙 폴리펩타이드의 aa F30, D32, S52, E55 및 D118이며, 이 중 어느 것은 천연 유래 aa이 아닌 aa으로 치환될 수 있다.
도 5C는 3형 TGF-β 수용체(TβRIII)의 서열을 제공하는 도면.
도 6은 상이한 농도의 다양한 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체가 형광 유세포 분석에 기반하여 미경험 CD4 T 세포 상의 FoxP3 발현을 자극하는 능력을 나타내는 플롯을 나타낸 도면. 파트 A는 세포 배양물에서 5일 후에 50U/㎖의 첨가된 IL-2의 부재 및 존재 하에 표시된 농도의 TGF-β3 또는 마스킹된 TGF-β3WT 작제물에 기반하여 (CD4+ 세포의 백분율로서) FoxP3의 유도를 나타낸다(도 1, 구조 A 참조). 파트 B는 5일 동안 다양한 농도의 TGF-β3 또는 적어도 1개의 N-말단 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD를 보유하는 3개의 마스킹된 TGF-β3 작제물 또는 마스킹된 TGF-β3 복합체 중 하나로 처리한 미경험 T 세포의 집단에서의 (CD4 세포의 백분율로서의) FoxP3+ 세포의 분포를 나타낸다(구조에 대해 도 7G 내지 도 7I 참조). 부분 C는 0.1nM 또는 1000nM 농도에서 마스킹된 TGF-β3 폴리펩타이드(도 6의 파트 B에서 구조 (i))의 존재 하의 FoxP3+ CD4+ 세포의 유도를 나타낸다.
도 7A는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β(작제물 번호 3470)의 aa 서열인 서열번호 146을 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 wt., 인간 IL-2 (hIL2), G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3 (hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7B는 도 1 구조 B의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β(작제물 번호 3334)의 aa 서열인 서열번호 147을 제공하는 도면. 동형이량체를 형성하는 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지, H16T 및 F42A 치환을 갖는 hIL2, G4S의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc, G5S 및 G4S 링커의 2개의 반복부, hTβRIIΔ25, D118A, G4S의 5개의 반복부 및 hTGF-β3 서열을 포함한다.
도 7C는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 D의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드 작제물 번호:3618(서열번호 148)은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt hIL-2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3619), 서열번호 149는 N-말단으로부터 C-말단까지, wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B, G5S 링커 및 G4S 링커의 2개의 반복부, 및 hTβRIIΔ25, D118A 서열을 포함한다.
도 7D는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 E의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3618), 상기 기재한 서열번호 150은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt hIL-2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3855), 서열번호 151은 N-말단으로부터 C-말단까지, LALA, T366S, L368A, 및 Y407V 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B, G4S 링커의 3개의 반복부 및 hTβRIIΔ25, D118A 서열을 포함한다.
도 7E는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 F의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3891), 서열번호 152는, N-말단으로부터 C-말단까지, H16A, F42A를 갖는 hIL-2, G4S 링커 서열의 3개의 반복부, LALA 및 T366W 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G5S 및 G4S 링커의 2개의 반복부, hTβRIIΔ25, D118A, G4S 링커의 5개의 반복부 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3664), 서열번호 153은 N-말단으로부터 C-말단까지, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B를 포함한다.
도 7F는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 F의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3715), 서열번호 155는 N-말단으로부터 C-말단까지, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄, G4S 링커의 3개의 반복부 및 인간 wt IL2 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3714), 서열번호 156는, N-말단으로부터 C-말단까지, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 FcKiH 폴리펩타이드 쇄 B, G4S 링커의 3개의 반복부, D32N 및 D118A 치환을 갖는 hTβRIIΔ25, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다.
도 7A 내지 도 7F의 IL-2 서열 중 어느 것은 IL-2에 의해 대체되거나, N88, H16 및/또는 F42에서 치환(예를 들어, N88R, H16A 또는 H16T로부터 선택된 H16에서의 치환, 및/또는 F42A 및 F42T로부터 선택된 F42에서의 치환)을 갖는 IL-2 서열로 대체되는, MOD 또는 IL-2 이외의 변이체 MOD로 치환될 수 있다.
도 7G는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물(작제물 번호:3472)의 aa 서열인 서열번호 157을 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D32N 및 D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3 (hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7H는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물(작제물 번호:3466)의 aa 서열인 서열번호 158을 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3(hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7I는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물(작제물 번호:3468)의 aa 서열인 서열번호 159를 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 H16T F42A 치환을 갖는 hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D32N 및 D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3 (hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7J는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 D의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3618), 즉, 서열번호 148은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt hIL-2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3621), 즉, 서열번호 160은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B, G4S 링커의 3개의 반복부, 및 D32N 및 D118A 치환을 갖는 hTβRIIΔ25 서열을 포함한다.
도 8은 마스킹된 TGF-β 작제물(좌) 및 2개의 마스킹된 TGF-β 복합체(중앙 및 우측)를 나타낸 도면. 복합체 샘플은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 벡터를 작제하고, ExpiCHO 세포를 형질감염시키고, 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 제조된다. 폴리펩타이드는 단백질 A 크로마토그래피 다음에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 단백질에 SDS-PAGE가 실시되고, 얻어진 겔은 쿠마씨 블루로 염색되었다. NR = 환원 또는 비환원 샘플 없음, 및 R = 환원 샘플(이황화물 환원제에 의한 환원).
도 9는 TβRII 및 TGF-β3 또는 TGF-β1에 대한 이들의 친화도에 대해 성숙 TβRII 폴리펩타이드 서열(도 5B 참조)에서의 다양한 aa 치환 효과를 나타낸 도면(표, 상부 좌측). 도 9는 또한 TβRII 마스킹된 TGF-β 작제물과 고정된 TβRII-Fc 수용체 작제물 사이의 결합 상호작용에 대한 해당 치환 중 셋, 즉, E55A, D32N 및 S52L의 효과를 나타낸다. 수용체 작제물은 도면의 상부 우측에서 TGF-β3으르 갖는 포획 분석 형식으로 나타내며, 여기서, 모노-Fc는 다른 스캐폴드와의 종간 결합을 형성하지 않는 Ig 스캐폴드이고, 항-IL-2는 바이오틴 (B)로 표지된 IL-2에 대한 항체이다. Strep 및 HRP는 검출을 위해 사용되는 스트렙타비딘 및 겨자무과산화효소이다. 결합에 대한 효과는 4개의 마스킹된 작제물 각각에 대해 진행된 결합 곡선으로서 캡처에서 검출되었다(하부). 실시예 3 참조.
도 10은 마스킹된 TGF-β3 복합체 PSM-4033-4039를 형성하는 폴리펩타이드의 구조 및 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 11은 인간 말초 미경험 CD4+ T 세포로부터의 Foxp3+ iTreg를 유도하기 위해 PSM-4033-4039가 사용되는 실험 결과를 도시한 도면. 실시예 4 참조.
도 12는 T 세포 증식을 억제하기 위해 PSM-4033-4039에 의해 유도되는 Foxp3+ iTreg가 사용되는 실험 결과를 도시한 도면. 실시예 4 참조.
도 13은 미경험 및 기억 CD4+ T 세포를 포함하는 인간 말초 CD4+ T 세포로부터의 Foxp3+ iTreg의 발현을 유도하기 위해 PSM-4033-4039가 사용되는 실험 결과를 도시한 도면. 실시예 4 참조.
도 14A 및 도 14B는 동종이계 림프구 반응에 의해 활성화된 CD4+ T 세포로부터의 Foxp3+ iTreg를 유도하기 위해 PSM-4033-4039가 사용되는 실험의 결과를 나타낸 도면. 실시예 4 참조.
도 15는 주사 후 최대 72시간까지 다양한 간격으로 마우스에서의 혈청 농도를 결정하기 위해 PSM-4033-4039가 다양한 농도로 마우스에게 정맥내로 투여된 실험 결과를 나타낸 도면. 실시예 4 참조.
도 2A 내지 도 2H는 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드의 아미노산 서열(aa)(서열번호 68 내지 83)을 제공하는 도면.
도 2I는 밑줄표시된 단일 펩타이드 aa 1 내지 22를 갖는 인간 J-쇄의 아미노산 서열(서열번호 84)을 제공한다.
도 2J는 Ig G1 중쇄 불변 영역 CH1 도메인의 서열을 제공하는 도면. MD13-유사 작제물의 형성을 위한 각각 글루탐산 및 발린에 의해 치환될 수 있는 70 및 72번 위치에서의 세린 잔기(S70E 및 S72V).
도 2K는 Ig κ 및 Ig λ 쇄로부터의 경쇄 불변 영역 "CL" 도메인의 서열을 제공하는 도면. 68번 위치에서의 세린 및 70번 위치에서의 트레오닌은 MD13-유사 작제물의 형성을 위해 각각 류신 및 세린으로 치환될 수 있다(S68L 및 T70S).
도 3은 프레프로단백질로서 TGF-β의 3가지 상이한 아이소폼 및 성숙 단백질의 C77S 돌연변이체와 함께 TGF-β3의 성숙 형태의 서열을 제공하는 도면.
도 4는 밑줄표시되어 있고 볼드체가 아닌 TGF-β 아이소폼 1 및 3의 다른 형태에서 TGF-β2의 aa 잔기 Lys 25, Cys 77, Ile 92 및/또는 Lys 94 및 이들의 대응하는 잔기를 제외하고, 볼드체인 TGF-β2의 성숙 형태에 대응하는 잔기를 갖는 TGF-β 아이소폼 1 내지 3의 정렬을 제공하는 도면.
도 5A는 1형 TGF-β 수용체(TβRI) 및 이의 엑토도메인의 서열을 제공하는 도면.
도 5B는 2형 TGF-β 수용체(TβRII), 이의 엑토도메인 및 엑토도메인의 서열을 제공하는 도면. 아이소폼 B에서 볼드체 및 밑줄표시로 나타낸 위치는 성숙 폴리펩타이드의 aa F30, D32, S52, E55 및 D118이며, 이 중 어느 것은 천연 유래 aa이 아닌 aa으로 치환될 수 있다.
도 5C는 3형 TGF-β 수용체(TβRIII)의 서열을 제공하는 도면.
도 6은 상이한 농도의 다양한 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체가 형광 유세포 분석에 기반하여 미경험 CD4 T 세포 상의 FoxP3 발현을 자극하는 능력을 나타내는 플롯을 나타낸 도면. 파트 A는 세포 배양물에서 5일 후에 50U/㎖의 첨가된 IL-2의 부재 및 존재 하에 표시된 농도의 TGF-β3 또는 마스킹된 TGF-β3WT 작제물에 기반하여 (CD4+ 세포의 백분율로서) FoxP3의 유도를 나타낸다(도 1, 구조 A 참조). 파트 B는 5일 동안 다양한 농도의 TGF-β3 또는 적어도 1개의 N-말단 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD를 보유하는 3개의 마스킹된 TGF-β3 작제물 또는 마스킹된 TGF-β3 복합체 중 하나로 처리한 미경험 T 세포의 집단에서의 (CD4 세포의 백분율로서의) FoxP3+ 세포의 분포를 나타낸다(구조에 대해 도 7G 내지 도 7I 참조). 부분 C는 0.1nM 또는 1000nM 농도에서 마스킹된 TGF-β3 폴리펩타이드(도 6의 파트 B에서 구조 (i))의 존재 하의 FoxP3+ CD4+ 세포의 유도를 나타낸다.
도 7A는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β(작제물 번호 3470)의 aa 서열인 서열번호 146을 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 wt., 인간 IL-2 (hIL2), G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3 (hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7B는 도 1 구조 B의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β(작제물 번호 3334)의 aa 서열인 서열번호 147을 제공하는 도면. 동형이량체를 형성하는 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지, H16T 및 F42A 치환을 갖는 hIL2, G4S의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc, G5S 및 G4S 링커의 2개의 반복부, hTβRIIΔ25, D118A, G4S의 5개의 반복부 및 hTGF-β3 서열을 포함한다.
도 7C는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 D의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드 작제물 번호:3618(서열번호 148)은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt hIL-2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3619), 서열번호 149는 N-말단으로부터 C-말단까지, wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B, G5S 링커 및 G4S 링커의 2개의 반복부, 및 hTβRIIΔ25, D118A 서열을 포함한다.
도 7D는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 E의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3618), 상기 기재한 서열번호 150은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt hIL-2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3855), 서열번호 151은 N-말단으로부터 C-말단까지, LALA, T366S, L368A, 및 Y407V 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B, G4S 링커의 3개의 반복부 및 hTβRIIΔ25, D118A 서열을 포함한다.
도 7E는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 F의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3891), 서열번호 152는, N-말단으로부터 C-말단까지, H16A, F42A를 갖는 hIL-2, G4S 링커 서열의 3개의 반복부, LALA 및 T366W 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G5S 및 G4S 링커의 2개의 반복부, hTβRIIΔ25, D118A, G4S 링커의 5개의 반복부 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3664), 서열번호 153은 N-말단으로부터 C-말단까지, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B를 포함한다.
도 7F는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 F의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3715), 서열번호 155는 N-말단으로부터 C-말단까지, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄, G4S 링커의 3개의 반복부 및 인간 wt IL2 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3714), 서열번호 156는, N-말단으로부터 C-말단까지, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 FcKiH 폴리펩타이드 쇄 B, G4S 링커의 3개의 반복부, D32N 및 D118A 치환을 갖는 hTβRIIΔ25, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다.
도 7A 내지 도 7F의 IL-2 서열 중 어느 것은 IL-2에 의해 대체되거나, N88, H16 및/또는 F42에서 치환(예를 들어, N88R, H16A 또는 H16T로부터 선택된 H16에서의 치환, 및/또는 F42A 및 F42T로부터 선택된 F42에서의 치환)을 갖는 IL-2 서열로 대체되는, MOD 또는 IL-2 이외의 변이체 MOD로 치환될 수 있다.
도 7G는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물(작제물 번호:3472)의 aa 서열인 서열번호 157을 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D32N 및 D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3 (hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7H는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물(작제물 번호:3466)의 aa 서열인 서열번호 158을 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3(hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7I는 도 1 구조 A의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물(작제물 번호:3468)의 aa 서열인 서열번호 159를 제공하는 도면. N-말단으로부터 C-말단까지 H16T F42A 치환을 갖는 hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 모노 IgG Fc, G4S 링커의 3개의 반복부, D32N 및 D118A 치환을 갖는 인간 TβRII(hTβRII)Δ25 서열, G4S 링커의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β3 (hTGF-β3) 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
도 7J는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 도 1 구조 D의 전체 구조를 갖는 대표적인 마스킹된 TGF-β 작제물의 aa 서열을 제공하는 도면. 제1 폴리펩타이드(작제물 번호:3618), 즉, 서열번호 148은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt hIL-2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc 노브-인-홀(KiH) 폴리펩타이드 쇄 A, G4S 링커 서열의 5개의 반복부, 및 C77S 치환을 갖는 hTGF-β3 서열을 포함한다. 제2 폴리펩타이드(작제물 번호:3621), 즉, 서열번호 160은 N-말단으로부터 C-말단까지, wt. hIL2, G4S 링커의 3개의 반복부, LALA 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc KiH 폴리펩타이드 쇄 B, G4S 링커의 3개의 반복부, 및 D32N 및 D118A 치환을 갖는 hTβRIIΔ25 서열을 포함한다.
도 8은 마스킹된 TGF-β 작제물(좌) 및 2개의 마스킹된 TGF-β 복합체(중앙 및 우측)를 나타낸 도면. 복합체 샘플은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 벡터를 작제하고, ExpiCHO 세포를 형질감염시키고, 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 제조된다. 폴리펩타이드는 단백질 A 크로마토그래피 다음에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 단백질에 SDS-PAGE가 실시되고, 얻어진 겔은 쿠마씨 블루로 염색되었다. NR = 환원 또는 비환원 샘플 없음, 및 R = 환원 샘플(이황화물 환원제에 의한 환원).
도 9는 TβRII 및 TGF-β3 또는 TGF-β1에 대한 이들의 친화도에 대해 성숙 TβRII 폴리펩타이드 서열(도 5B 참조)에서의 다양한 aa 치환 효과를 나타낸 도면(표, 상부 좌측). 도 9는 또한 TβRII 마스킹된 TGF-β 작제물과 고정된 TβRII-Fc 수용체 작제물 사이의 결합 상호작용에 대한 해당 치환 중 셋, 즉, E55A, D32N 및 S52L의 효과를 나타낸다. 수용체 작제물은 도면의 상부 우측에서 TGF-β3으르 갖는 포획 분석 형식으로 나타내며, 여기서, 모노-Fc는 다른 스캐폴드와의 종간 결합을 형성하지 않는 Ig 스캐폴드이고, 항-IL-2는 바이오틴 (B)로 표지된 IL-2에 대한 항체이다. Strep 및 HRP는 검출을 위해 사용되는 스트렙타비딘 및 겨자무과산화효소이다. 결합에 대한 효과는 4개의 마스킹된 작제물 각각에 대해 진행된 결합 곡선으로서 캡처에서 검출되었다(하부). 실시예 3 참조.
도 10은 마스킹된 TGF-β3 복합체 PSM-4033-4039를 형성하는 폴리펩타이드의 구조 및 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 11은 인간 말초 미경험 CD4+ T 세포로부터의 Foxp3+ iTreg를 유도하기 위해 PSM-4033-4039가 사용되는 실험 결과를 도시한 도면. 실시예 4 참조.
도 12는 T 세포 증식을 억제하기 위해 PSM-4033-4039에 의해 유도되는 Foxp3+ iTreg가 사용되는 실험 결과를 도시한 도면. 실시예 4 참조.
도 13은 미경험 및 기억 CD4+ T 세포를 포함하는 인간 말초 CD4+ T 세포로부터의 Foxp3+ iTreg의 발현을 유도하기 위해 PSM-4033-4039가 사용되는 실험 결과를 도시한 도면. 실시예 4 참조.
도 14A 및 도 14B는 동종이계 림프구 반응에 의해 활성화된 CD4+ T 세포로부터의 Foxp3+ iTreg를 유도하기 위해 PSM-4033-4039가 사용되는 실험의 결과를 나타낸 도면. 실시예 4 참조.
도 15는 주사 후 최대 72시간까지 다양한 간격으로 마우스에서의 혈청 농도를 결정하기 위해 PSM-4033-4039가 다양한 농도로 마우스에게 정맥내로 투여된 실험 결과를 나타낸 도면. 실시예 4 참조.
A.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 아미노산(달리 표시되지 않는 한 단수일 때 "aa"로 약칭되며, 이는 복수일 수 있고, 복수 형태 "aas"로 약칭됨)은 천연 유래 유전단백체 알파 아미노산이 포유류 세포 번역에서 폴리펩타이드 및 단백질에 혼입된다는 것을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한: L(Leu, 류신), A(Ala, 알라닌), G(Gly, 글리신), S(Ser, 세린), V(Val, 발린), F(Phe, 페닐알라닌), Y(Tyr, 타이로신), H(His, 히스티딘), R(Arg, 아르기닌), N(Asn, 아스파라긴), E(Glu, 글루탐산), D(Asp, 아스파라긴), C(Cys, 시스테인), Q(Gln, 글루타민), I(Ile, 아이소류신), M(Met, 메티오닌), P(Pro, 프롤린), T(Thr, 트레오닌), K (Lys, 라이신) 및 W(Trp, 트립토판). 아미노산은 또한 포유류 세포에서 발견되는 일부 단백질에서 나타나는 아미노산 하이드록시프롤린 및 셀레노시스테인을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 서열" 및 "단백질"은 동의어이고, 폴리펩타이드 골격을 형성하기 위해 이들의 C-1 카복실기와 이들의 알파 아민 사이의 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된 aa 서열을 의미한다. 따라서, MOD 폴리펩타이드 서열, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, TGF-β 폴리펩타이드 서열 및/또는 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열) 중 어느 하나 이상을 포함하는 각각의 폴리펩타이드(예를 들어, 제1 폴리펩타이드)는 단일의 인접한 골격을 갖는 폴리펩타이드 쇄로서 해당 폴리펩타이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함한다. 이러한 폴리펩타이드(예를 들어, 제1 폴리펩타이드)는 공유 결합(예를 들어, 시스테인 잔기의 측쇄 사이의 이황화 결합)에 의해 다른 폴리펩타이드에 연결될 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드", "폴리펩타이드 서열" 및 "단백질"은 단백질이 목적하는 활성을 유지한다면, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대, 결실, 첨가 및 치환(일반적으로 당업자에게 공지된 바와 같은 특성이 보존적)을 포함한다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해 고려될 수 있거나, 또는 우연히, 예컨대, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이, 또는 PCR 증폭 또는 다른 재조합 DNA 방법으로 인한 오류를 통할 수 있다.
실시형태, 청구범위 또는 양상이 특정 유형의 포유류(예를 들어, 인간 또는 비-인간 대상체)에 관한 것인 경우, 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 해당 대상체로부터의 서열로 제한될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 단백질(예를 들어, TGF-β, TβR, 면역글로불린 및 MOD)의 폴리펩타이드 서열은 인간(호모 사피엔스(Homo Sapiens)) 서열이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "마스킹된"은 분자(예를 들어, 마스킹된 폴리펩타이드 또는 마스킹된 단백질)가 분자에 대해 또한 친화도를 갖는 다른 단백질(예를 들어, 세포 표면 수용체)에 대한 마스킹 분자의 이용 가능성을 제한하는 마스킹 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 단편)에 의해 결합되거나 또 다르게는 맞물린다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 마스킹된 TGF-β 작제물은 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하거나 달리 상호작용하는 TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β) 폴리펩타이드 서열과 마스킹 폴리펩타이드 서열을 둘 다 포함하는 단일 폴리펩타이드를 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 마스킹된 TGF-β 작제물은 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 면역조절(MOD) 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 마스킹된 TGF-β 복합체는 2개 이상의 폴리펩타이드(전형적으로 동형이량체 또는 이형이량체로서 배열되지만 보다 높은 차수의 다량체일 수 있는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드로 표기되는 2개의 폴리펩타이드)를 지칭한다. 마스킹된 TGF-β 복합체는 TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β) 폴리펩타이드 서열, TGF-β 폴리펩타이드에 결합하거나 달리 상호작용하는 마스킹 폴리펩타이드 서열, 및 TGF-β 복합체의 폴리펩타이드가 회합하는 것을 통해 이량체화 또는 다량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드를 포함한다. TGF-β 복합체 폴리펩타이드 중 임의의 하나 이상은 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
어구 "마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체"는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 마스킹된 TGF-β 복합체에 대한 약어이다. 약어는 이의 복수의 형태 "마스킹된 TGF-β 작제물들 또는 복합체들"로 사용될 수 있다.
어구 "마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체"는 "마스킹된 TGF-β 작제물"과 "마스킹된 TGF-β 복합체" 둘 다에 대한 약어이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 이량체화 및 다량체화 서열은 이량체(예를 들어, 이형이량체 또는 동형이량체), 또는 다량체(3, 4, 5개 이상의 폴리펩타이드 서열의 동형- 또는 이형- 다량체)로서 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 별개의 폴리펩타이드)의 회합을 가능하게 하는 폴리펩타이드 서열이다. 이량체화 및 다량체화 서열은 일부 환경 하에 공유 복합체(예를 들어, 폴리펩타이드 사이의 이황화 결합 형성)로 전환될 수 있는 비공유 방식으로 서열의 회합을 가능하게 한다.
종간 결합 서열은 폴리펩타이드의 비대칭 짝짓기(이형이량체 형성)를 가능하게 하는 이량체화 서열이다. 종간 결합 서열은 (동형이량체 형성과 대조적으로) 이들의 동족 결합 상대인 이들의 상대 종간 결합 서열(들)과의 이형이량체 형성을 선호한다. 키-인-홀(Key-in-hole)(또는 키-인투-홀(key-into-hole)) Fc 폴리펩타이드 쌍은 종간 결합 서열 및 이의 상대 종간 결합 서열의 일례를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 Nanobodies® 또는 나노바디는, 전체 항체와 같이, 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다.
aa 서열에 관해 야생형("wt."로 약칭됨)은 천연 유래 aa 서열, 또는 살아있는 유기체에서 자연적으로 발견되는 서열에 대해 변경되지 않은, 문맥으로부터 이해되는 바와 같은 천연 유래 aa 서열의 인접한 부분을 의미한다. 특정 천연 유래 서열은 참고를 위해 wt. 서열로서 표기될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "T 세포"는 T-헬퍼 세포(CD4+ 세포), 세포독성 T 세포(CD8+ 세포), T-조절 세포(Treg) 및 NK-T 세포를 포함하는 CD3을 발현시키는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "결합하는"은 두 분자 사이의 비-공유 상호작용, 예를 들어, MOD와 이의 co-MOD 사이의 비-공유 상호작용을 지칭한다. 비 공유적 결합은, 예를 들어, 염 브리지와 물 브리지와 같은 상호작용을 비롯한, 정전기적, 소수성, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용에 기인하는 두 분자 사이의 직접적 회합을 지칭한다. 비공유 결합 상호작용은 일반적으로 10-6M 미만, 10-7M 미만, 10-8M 미만, 10-9M 미만, 10-10M 미만, 10-11M 미만, 10-12M 미만, 10-13M 미만, 10-14M 미만 또는 10-15M 미만의 해리 상수(KD)를 특징으로 한다. "특이적 결합"은 일반적으로 적어도 약 10-7M 이상, 예를 들어, 5×10-7M, 10-8M, 5×10-8M, 10-9M 이상의 친화도를 갖는 결합을 지칭한다. "비특이적 결합"은 일반적으로 약 10-7M 미만의 친화도로 결합하는 것(예를 들어, 표시된 결합 부위 또는 수용체 이외의 모이어티에 대한 리간드의 결합)을 지칭한다(예를 들어, 10-6M, 10-5M, 10-4M의 친화도로 결합). 본 명세서에서 사용되는 "공유적으로 결합하는" 또는 "공유 결합"은 두 상이한 분자 사이의 하나 이상의 공유 화학 결합의 형성을 지칭한다.
"친화도"는 비공유 결합 강도를 지칭하며, 증가된 결합 친화도는 더 낮은 KD와 상호 관련된다. 본 명세서에서 용어 "친화도"는 2가지 제제(예를 들어, 항체 및 항원)의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하며 해리 상수(KD)로서 표현된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역조절 폴리펩타이드" 또는 MOD는 T 세포 상에서 동족 공동면역조절 폴리펩타이드에 특이적으로 결합함으로써 신호를 제공하는 항원 제시 세포(APC)(예를 들어, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 폴리펩타이드 또는 APC 상의 폴리펩타이드의 일부를 포함한다. 예를 들어, 세포 표면 IL-2 수용체(co-MOD)에 대한 인터류킨, 예컨대, IL-2 또는 이의 단편(MOD)의 결합은 세포에 신호를 제공한다. MOD는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 및 IL-23, PD-L1 및 Fas 리간드(FAS-L)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. MOD는 또한, 특히, coMOD에 의해 신호전달을 초래하는 T 세포 상에 존재하는 co-MOD 분자와 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 서열(예를 들어, 나노바디)을 포함한다. 본 명세서에 논의된 바와 같은 MOD는 또한 wt의 변이체를 포함한다. MOD는, 예를 들어, co-MOD에 대해 감소된 결합 친화도를 갖는 변이체 MOD를 포함한다. 이러한 감소된 친화도는 다수의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 변이체 IL-2 MOD는 IL-2R의 α, β 및/또는 γ 쇄 중 하나 이상에 대해 감소된 친화도를 가질 수 있다. 본 명세서에 논의된 바와 같은, 16 및 42번 위치에서 돌연변이를 포함하는 변이체 IL-2 MOD는 IL-2R의 α 쇄에 대해 실질적으로 결합을 나타내지 않고, IL-2R의 β 쇄에 대해 감소된 친화도를 나타낼 수 있다. 추가적으로, 1개 초과의 co-MOD를 갖는 MOD에 대해(예를 들어, CD80이 CD28과 CTLA-4 둘 다에 결합함), 변이체 MOD는 다른 co-MOD에 우선적 또는 선택적으로 결합하도록 co-MOD 중 하나에 대해 감소된 친화도를 가질 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3) 및 이들의 단편은 MOD로 간주되지 않는다.
달리 표시되지 않는 항, 용어 "실질적으로"는 "전체적으로" 그리고 "대체로이지만, 전체는 아닌"을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, IL-2R의 α 쇄에 대해 실질적으로 결합을 나타내지 않는 변이체 IL-2 MOD는 IL-2R의 α 쇄에 결합하지 않거나 또는 IL-2R의 α 쇄에 대체로 결합하지 않는 IL-2 변이체 MOD이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "생체내"는, 예를 들어, 자가면역 환자의 신체 내에서 생기는 임의의 과정 또는 절차를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "시험관내"는 생체외로서 지칭될 수 있는 절차를 포함하는 신체 외에서 생기는 임의의 과정 또는 절차를 지칭한다.
MOD 폴리펩타이드 서열의 위치를 설명하기 위해 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "탠덤"은 기껏해야 링커에 의해 분리되는(예를 들어, 사이에 있는 스캐폴드, 마스킹 폴리펩타이드 또는 TGF-β 서열 없음) 폴리펩타이드 상에 서로 인접하여 배열된 2개 이상의 MOD를 갖는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "엑토도메인"은 세포외 공간으로 연장되고 세포 막에 고정되게 하는 막관통 도메인의 충분한 부분을 포함하지 않는 막 단백질의 부분(도메인)을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "서열 동일성"은 두 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 두 폴리펩타이드 서열 사이의 aa 또는 뉴클레오타이드 동일성의 척도이다. 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 "서열 동일성"의 특정 백분율을 갖는다는 언급은, 정렬될 때, 염기 또는 아미노산의 백분율이 동일하고, 두 서열을 비교할 때 동일한 상대적 위치에 있다는 것을 의미한다. 서열 동일성은 다수의 상이한 방법으로 결정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 서열은 월드 와이드 웹 상에서 ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/를 포함하는 사이트에서 이용 가능한 다양한 편리한 방법 및 컴퓨터 프로그램(예를 들어, BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT 등)을 이용하여 정렬할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10] 참조. 달리 언급되지 않는 한, 서열 동일성은 (단백질에 대해 BLASTP 2.9.0+ 및 핵산에 대해 BLASTN 2.9.0+) 2019년 4월 1일자에 배포된 NCBI BLAST 알고리즘 버전 BLAST+ 2.9.0에 의해 수행된 정렬을 이용하여 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "재조합체"는 특정 핵산(DNA 또는 RNA)이 천연 시스템에서 발견되는 내인성 핵산과 구별되는 구조적 암호 또는 비암호 서열을 갖는 작제물을 야기하는 클로닝, 제한, 중합효소 연쇄 반응(중합효소 연쇄반응: PCR) 및/또는 결찰 단계의 다양한 조합물의 산물이라는 것을 의미한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 cDNA 단편으로부터 또는 일련의 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되어, 세포에서 또는 무 세포 전사 및 번역 시스템에서 함유된 재조합 전사 단위로부터 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공할 수 있다. 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질에 대해 사용되는 재조합체는 이들이 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 제조되었다는 것을 나타낸다.
양과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 양이 언급된 양의 10%만큼 다를 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, "약 100"은 90 내지 110의 양을 의미한다. 약이 범위와 관련하여 사용되는 경우, 범위의 보다 낮은 양과 관련하여 사용되는 "약"은 보다 낮은 양이 범위의 보다 낮은 양보다 10% 더 낮은 양을 포함하고, 범위의 보다 높은 양과 관련하여 사용되는 "약"은 범위의 보다 높은 양보다 10% 더 높은 양을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 100 내지 약 1000은 범위가 90 내지 1100으로 연장된다는 것을 의미한다.
용어 "치료", 치료하는" 등은 본 명세서에서 목적하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 상기 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 데 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유에 관해 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류에서 질환 또는 증상의 임의의 치료를 아우르며, (a) 질환 또는 증상을 획득하는 성향이 있을 수 있지만 그것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 질환 또는 증상이 생기는 것을 방지하는 것; (b) 질환 또는 증상을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 및/또는 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료제(예를 들어, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체)는 질환 또는 손상의 개시 전에, 개시 동안에 또는 개시 후에 투여될 수 있다. 진행 중인 질환의 치료에 특히 관심이 있으며, 치료는 환자의 원치 않는 임상 증상을 안정화시키거나 또는 감소시킨다. 이러한 치료는 영향받은 조직에서 기능의 완전한 상실 전에 바람직하게 수행된다. 치료적 치료는 질환의 증상 단계 동안, 일부 경우에 질환의 증상 단계 후에 투여될 수 있다.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 포유류 대상체를 지칭한다. 포유류는, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 토끼목(예를 들어, 토끼), 유제류(예를 들어, 소, 랫트, 염소, 양, 말, 돼지 등), 개과(예를 들어, 개), 고양잇과(예를 들어, 고양이) 등(예를 들어, 인간, 소, 개, 고양이, 설치류, 뮤린, 염소, 유인원, 양, 말, 토끼, 돼지 등)을 포함한다.
본 명세서에서 그리고 첨부하는 양상 및 청구범위에서 사용되는 단수의 형태는 명확하게 달리 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함하는 것으로 언급되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "Treg"에 대한 언급은 복수의 이러한 Treg를 포함하고, "TGF-β 폴리펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 TGF-β 폴리펩타이드 및 당업자에게 공지된 이의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 포함 또는 제외하도록 초안이 작성될 수 있다는 것을 추가로 주목한다. 이렇게 해서, 이 언급은 (예를 들어, "유일하게", "단지" 등과 같은 용어와 함께) 청구범위에서 이러한 요소의 사용(포함), 또는 청구범위로부터 이들의 제거를 위한 선행 사건 기반으로서 또는 임의의 구체적인 선택적 요소를 제외하는 "부정적" 제한에 대한 기초로서 작용하는 것으로 의도된다.
명확함을 위해, 별개의 양상 또는 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 후속적으로 청구된 것을 포함하는 단일 양상 또는 실시형태와 조합하여 제공될 수 있다는 것을 인식한다. 대조적으로, 간단함을 위해, 단일 실시형태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 본 발명이 속하는 실시형태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포괄되며, 각각의 그리고 모든 조합이 개별적으로 그리고 명확하게 개시되는 것과 같이 본 명세서에 개시된다. 추가로, 다양한 실시형태 및 이의 요소의 모든 하위 조합은 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 그리고 모든 이러한 하위 조합이 본 명세서에서 개별적으로 그리고 명확하게 개시되는 것과 같이 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명 때문에 이러한 간행물보다 선행한다는 자격이 부여되지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공되는 간행물의 날짜는 독립적으로 확인할 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과 상이할 수 있다.
B. 설명
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도입
TGF-β 슈퍼패밀리는 성장 저해 기능을 갖는 내인성 단백질을 포함한다. TGF-β 발현의 증가 또는 TGF-β 작용을 저해하는 세포 메커니즘에서의 결함은 특히 TGF-β의 면역억제 작용으로 인해 다수 암의 악성종양과 상관관계가 있었다. TGF-β의 면역억제 기능의 조절장애는 또한 자가면역질환과 연관된다. TGF-β는 면역기능의 중요한 조절제이기 때문에, 이는 수많은 연구의 표적이었고, TGF-β와 이의 신호전달 경로는 둘 다 염증 과정 및 자가면역 장애를 포함하는 다양한 질환의 치료를 위한 치료적 표적으로 간주된다.
치료제로서 TGF-β를 효과적으로 제조 및 전달하는 능력은 분자 독성 및 TGF-β의 수용체 시스템의 복잡성에 의해 복잡하게 된다. 포유류 세포 발현 시스템에서 다량으로 TGF-β의 생성은 다수의 포유류 세포에 대한 단백질의 독성에 의해 제한된다. TGF-β의 세포독성에 대한 세포 대상체는 생물학적 분자의 생성을 위해 사용되는 다수의 것, 예컨대, 상업적 단백질 생산을 위해 가장 강하고 흔히 사용되는 세포 중 하나인 중국 햄스터 난소 또는 "CHO" 세포를 포함한다. 치료제로서 TGF-β의 용도는 또한 약 8.59의 pI를 갖는 TGF-β1의 높은 pI(TGF-β3에 대해 약 6.1의 pI와 대조적), 산성이 아닌 조건 하에서의 이의 제한된 안정성/용해도(이러한 산성 조건은 일반적으로 치료적 용도에 적합하지 않음)에 의해 복잡하게 된다. 또한, (1 내지 2μM의 규모로) TGF-β에 대한 TβRII의 친화도에 비해 (예를 들어, TGF-β2에 대해 5nM의 규모로) 포유류 시스템에 존재하는 다량의 고친화도 TβRIII 수용체는 표적 조직에 대한 TGF-β 기반 생물제제의 접근을 제한하는 약력학적 싱크(sink)를 나타낸다. 유사하게, TβRII/TβRI 복합체에 TGF-β를 보충함에 있어서 TβRIII의 역할은 의도되지 않고, 바람직하지 않고, 심지어 독성 효과를 갖는 TGF-β의 유의미한 비표적 전달을 야기할 수 있다. 이러한 비표적 전달은 비특이적 활성화를 야기할 수 있고, 또한 활성 TGF-β의 추가적인 생성을 야기하여, 특히 TGF-β 신호전달이 피드-포워드(feed-forward) 제어 하에 있는 경우에, 이에 의해 추가적인 의도치 않은 그리고 바람직하지 않은 효과를 생성할 수 있었다. 예를 들어, 문헌[Jiang et al., Redox Biol. 2: 267-272 (2014)] 참조.
치료제로서 TGF-β의 효과적인 사용은 TGF-β 자극 결과를 지시하기 위해 세포에 추가적인 자극을 제공하는 필요에 의해 더욱 복잡하게 된다. 상기 주목한 바와 같이, 사이토카인, 예컨대, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 및 IL-23, PD-L1 및 Fas 리간드(FAS-L)는 TGF-β의 작용에 엄청난 영향을 가질 수 있다. 따라서, 사이토카인 등의 형태에서 TGF-β 및 추가적인 자극을 전달하는 능력은 특정 치료적 또는 세포 매개 결과(예를 들어, 시험관내 또는 생체내) 효과를 달성하는 데 유리할 수 있다.
이하에 더욱 상세하게 논의하는 바와 같이, 현재의 개시내용은 TβRI 및 TβRII 단백질을 보유하는 세포 상에서 상호작용하고 신호전달을 자극할 수 있는 TGF-β 폴리펩타이드의 사용을 기재한다. 유리하게는, TGF-β 폴리펩타이드는 스캐폴드(예를 들어, 1 또는 2개의 폴리펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 Fc 폴리펩타이드) 주위에서 만들어진 TGF-β 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 마스킹 서열로서 작용하는 TβRII 서열)에 결합하고 마스킹하는 폴리펩타이드를 또한 포함하는 융합 단백질(단일 폴리펩타이드 쇄) 또는 융합 단백질 복합체(2개 이상의 폴리펩타이드 쇄)인 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 부분이다. 이러한 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체의 예는 도 1에서 도시된다. 예를 들어, 세포 TβRIII와 상호작용하는 융합 단백질의 TGF-β 폴리펩타이드의 경우에, TGF-β에 결합하고 마스킹하는 융합 단백질의 일부는 TβRIII과 경쟁하고, TGF-β가 TβRIII 저장소에 격리되는 것을 방지한다. 또한, aa 치환을 이용하여 의도적으로 변화시킬 수 있는 TGF-β 폴리펩타이드에 대한 마스킹 폴리펩타이드의 친화도는 도 9에 입증된 바와 같이 마스킹된 폴리펩타이드의 표적 수용체(예를 들어, TβRII)에 대한 전반적인 효력을 제어한다. TGF-β 폴리펩타이드는 원칙적으로는 이황화연결된 이량체로서 TβRIII에 결합하기 때문에, 격리를 야기하는 해당 수용체와의 상호작용은 이하에 논의하는 바와 같이 이량체화(예를 들어, C77S) 또는 이량체 안정성을 제한하는 aa 치환을 포함함으로써 약화될 수 있다. TGF-β 융합 단백질 또는 융합 단백질 복합체와 TβRII와의 상호작용은 마스킹 서열을 변위시켜, 세포 표면 결합된 TGF-β/TβRII 복합체를 형성한다. 이형이량체 TGF-β 수용체를 형성하는 TβRI의 후속적 보충은 마스킹 폴리펩타이드 서열의 존재하에서조차 TGF-β에 단단히 결합하는 고친화도(예를 들어, 피코몰 친화도) 복합체를 제공한다. 따라서, 마스킹된 TGF-β는 여전히 이형이량체 TβRI/TβRII 수용체 복합체에 결합하고, 표준 Smad 단백질 경로, 비표준 Jun 키나제 경로 및 p38 신호전달 경로를 통해 신호전달할 수 있다. 사실상, 마스킹 폴리펩타이드는 TGF-β를 세포에 전달하고, 후속적으로 TβRI 단백질을 보충하는 세포 표면 TβRII 분자에 넘겨주어, 제자리에서 TGF-β 폴리펩타이드를 효과적으로 유지하는 기능성 및 활성 신호전달 복합체를 형성한다.
바람직하지 않은 비표적 상호작용을 피하는 형태로 TGF-β 결합 단백질(예를 들어, TGF-β 결합 엑토도메인의 모두 또는 일부를 포함하는 TGF-β 수용체의 단편)에 의해 마스킹된 TGF-β를 전달하는 것에 추가로, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 표적 세포 상에서의 TGF-β 작용의 결과에 영향을 미칠 수 있는 면역조절제("MOD" 폴리펩타이드)로서 작용하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. TGF-β와 면역조절제를 둘 다 함께 전달하는 능력은 지시될 TGF-β 활성화 신호의 작용을 허용할 뿐만 아니라, 면역조절제 단독의 투여에 대해 표적 세포 상에서의 동일한 효과를 생성하는 데 필요한 면역조절제의 양을 감소시킨다. 이는 동일한 표적 세포 상에서의 수용체에 대해 친화도를 갖는 2개의 폴리펩타이드 서열을 가짐으로써 (결합활성 향상을 통해) 얻어진 증가된 친화도의 결과이다. 하나 이상의 MOD를 보유하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 TGF-β 폴리펩타이드와 하나 이상의 MOD 둘 다에 대해 수용체를 보유하는 표적 세포 사이의 증가된 결합활성(이들의 수용체와의 MOD 상호작용으로 인한 결합의 증가된 자유 에너지, 즉, ΔG로부터 초래)은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 포화도 이하의 양이 존재하는 경우에 수용체 유형을 둘 다 갖는 표적 세포의 활성화에서 향상된 선택성을 제공한다. 예로서, IL-2 MOD를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물, 예컨대 도 1 구조 A 또는 도 7G의 것은 동등한(등몰) 양의 IL-2 MOD 폴리펩타이드의 존재 하에서조차 IL-2 MOD를 결여하는 다르게 동일한 마스킹된 TGF-β 작제물보다 미경험 CD4+ 세포의 iTReg 분화의 더 강한 유도자이다. 또한, 포화도 이하의 용량에서, 그리고 비슷한 수의 세포 유형이 존재할 때, 예를 들어, 도 7G에 나타낸 바와 같은 IL-2 MOD를 갖는 도 1 구조와 같은 작제물은 IL-2 MOD를 결여하는 작제물에 비해 TGF-β와 IL-2 수용체 둘 다를 갖는 세포에 선택적으로 결합한다.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 작용은 개개 폴리펩타이드 서열의 작용을 변경시키는 변형의 포함에 의해 더욱 구체화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이량체화하는 TGF-β의 능력을 변경시키는 aa 치환(예를 들어, TGF-β3에서 C77S 치환)이 포함될 수 있다. TGF-β의 단량체 형태는 TβRIII에 대한 친화도를 거의 나타내지 않기 때문에, 이량체화하는 TGF-β의 능력을 제한하는 돌연변이의 포함은 TGF-β "저장소"에 복합체를 끌어당기고 표적 세포를 자극하는 능력을 제한할 수 있는 TβRIII에 대한 비표적 결합을 제한한다.
변형(예를 들어, 치환, 결실, 삽입 등)은 또한 마스킹 폴리펩타이드 서열, 및 면역조절 폴리펩타이드 서열을 포함하는 TGF-β 폴리펩타이드 서열이 아닌 폴리펩타이드 서열로 만들어질 수 있다.
TGF-β 폴리펩타이드 서열의 변형에 추가로, TGF-β에 결합하고 이를 마스킹하는 폴리펩타이드에 대한 변형이 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 TGF-β에 대한 마스킹 폴리펩타이드의 친화도뿐만 아니라 마스킹 폴리펩타이드 및 TGF-β 폴리펩타이드의 호흡 속도(온 및 오프 속도)를 변화시킴으로써 TGF-β 폴리펩타이드 서열의 이용 가능성을 변경시킬 수 있다. 두 상이한 TGF-β 폴리펩타이드/마스킹 폴리펩타이드 복합체는 동일한 결합 회합 상수(kon 대 koff의 비)를 가질 수 있지만, 보다 높은 kon 및 koff를 갖는 복합체는 속도 상수, 특히 koff 속도에 따라 세포 표면 TβRII 결합에 효과적으로 더 이용 가능할 수 있다. 도 9는 TGF-β3에 대한 TβRII 결합에 대해 상이한 영향을 각각 갖는 3개의 치환 중 1개가 없거나 또는 있는 달리 동일한 TβRII 마스킹된 TGF-β 작제물의 친화도를 나타내는 그래프에 따라 TGF-β1 및 TGF-β3에 대한 친화도를 변경시키는 TβRII에서의 일부 aa 치환 목록을 제공한다.
단일쇄 항체 서열(예를 들어, 인간화된 단일쇄 항체 서열)을 둘 다 포함하는 TGF-β를 마스킹하기 위해 다양한 폴리펩타이드를 이용할 수 있지만, TGF-β에 결합하는 최소 TGF-β 수용체 서열이 사용될 수 있다(예를 들어, TβRI, TβRII 또는 TβRIII의 엑토도메인). TβRIII의 엑토도메인은 이량체 TGF-β에 대한 마스킹 폴리펩타이드로서 이용될 수 있지만; 그러나, TGF-β에 대한 이의 고친화도는 TβRII에 대한 TGF-β 폴리펩타이드 서열의 결합을 길항하게 하는 원인일 수 있다. 그럼에도 불구하고, TβRIII 마스킹 서열은 TGF-β 폴리펩타이드에 대해 보다 높은 친화도를 갖는 세포 표면 TβRI/TβRII에 의해 효과적으로 변위되어, 해당 세포 표면 수용체의 활성화를 가능하게 할 수 있다.
TβRII의 엑토도메인은 마스킹 폴리펩타이드로서 이용될 수 있다. TβRII의 N-말단의 아미노산(예를 들어, 델타 14 또는 25)의 결실은 D118A 치환의 존재 또는 부재 하에 약 4.5 내지 약 5.0(예를 들어, 약 4.7 내지 4.85)의 pI를 갖는 마스킹 TGF-β에 적합한 단백질(또는 폴리펩타이드)을 생성할 수 있다. TGF-β1 폴리펩타이드(높은 pI 값을 가짐)와 TβRII 마스킹 폴리펩타이드(예를 들어, N-말단의 결실을 갖는 것을 포함)의 조합은 TGF-β1 폴리펩타이드 전하를 잠재적으로 중화시킬 수 있다. TβRII의 계산된 pI(델타25, D118A)/TGFβ1은 6.23의 규모이며, 여기서 TGFβ1은 약 8.59의 pI를 가진다. 대조적으로, 델타 14 또는 델타 25 TβRII와 TGF-β3의 복합체(D118A 및/또는 C77S 치환이 있거나 없음)가 약 4.9 내지 약 5.3의 pI(약 5.06 내지 5.17의 pI)를 갖는 것으로 계산된다. 또한, TβRII 엑토도메인을 활성 TGF-β 폴리펩타이드와 조합하는 것은 세포 표면 TβRI와 상호작용함으로써, TGF-β TGF-β 신호전달에 영향을 미칠 수 있지만(예를 들어, 작용제, 부분적 작용제, 길항제 또는 부분적 길항제로서 작용), TβRI와의 aa 치환 제한적 상호작용의 혼입은 활성 신호전달에 참여하는 마스킹된 복합체의 능력을 제한 또는 차단한다. 따라서, 이하에 논의하는 바와 같이, TβRII의 N-말단이 무손상인 경우에 TGF-β를 마스킹하고, TβRII 엑토도메인 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드에 의한 세포의 자극을 방지하기 위해 TβRI에 대한 결합이 감소되거나 결합이 없는 N-말단의 결실(예를 들어, 14 내지 25aa의 결실, Δ14 내지 Δ25) 또는 치환(예를 들어, 아스파르트산 이외의 aa에 의한 D118에서의 치환, 예컨대, 예컨대, D118A, D118R 등)을 갖는 TβRII 엑토도메인 서열의 혼입이 사용될 수 있다. 결과적으로, TβRII의 N-말단 결실 돌연변이체에 의해 마스킹된 것을 포함하는 마스킹된 TGF-β 복합체는 TGF-β의 비마스킹(마스킹 펩타이드로부터의 해리 또는 폴딩된 분자의 개방)에 의해 작용하여, 활성 이형이량체 TβRI /TβRII 신호전달 복합체를 형성하도록 표적 세포의 TβRII 및 TβRI에 결합할 수 있다.
TGF-β의 마스킹은 세포 생존도의 감소 없이 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 고수준으로 이의 발현을 가능하게 한다. 이는 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드가 N-말단의 aa 결실, 치환 및/또는 다른 돌연변이에 의해 TβRI와 맞물리는 것을 차단하는 경우에 특히 그러하다. TβRIII 상호작용의 차단(예를 들어, 이량체화 차단에 의함)은 추가로 세포 발현과 연관된 문제를 감소시킬 수 있다.
C. 마스킹된 TGF-B 작제물 및 마스킹된 TGF-B 복합체
본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 작제물(예를 들어, 도 1, 구조 A 참조, 단일 폴리펩타이드 쇄가 있음) 및 마스킹된 TGF-β 복합체(예를 들어, 도 1, 구조 B 내지 F, 2개의 폴리펩타이드 쇄의 복합체를 가짐)의 제조를 기재한다. 마스킹된 TGF-β 작제물, 및 마스킹된 TGF-β 복합체는 이들의 성분으로서 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드 서열, 즉, TGF-β 폴리펩타이드(들), 및 선택적으로 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 면역조절 폴리펩타이드(MOD)에 결합하고 마스킹하는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하고, 이들 모두는 스캐폴드 구조 상에서 조립된다. 달리 언급되지 않는 한, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 마스킹된 TGF-β 복합체는 막 결합 단백질의 일부(예를 들어, TGF-β 수용체)를 포함하지만, 이들은 막 고정 도메인(예를 들어, 대다수의 발현된 단백질이 세포 막(예를 들어, 발현된 CHO 세포)에 고정되게 하는 데 충분한 막관통 도메인)의 일부를 포함하지 않는다.
도 1에 나타낸 형태를 포함하는 TGF-β 작제물 및 복합체의 비제한적 예를 이하에 기재한다.
MOD, 스캐폴드, 링커, TGF-β 폴리펩타이드 및 TGF-β 마스킹 폴리펩타이드(예를 들어, 단일쇄 항체 또는 TGF-β 수용체 엑토도메인)를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 성분은 각각 이하의 부문에 기재되어 있다.
D. 면역조절 폴리펩타이드 서열("MOD")
1
마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 MOD의 혼입
상기 논의한 바와 같이, 면역조절 폴리펩타이드(MOD)는 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드의 전달 또는 TβRI 및 TβRII 이형이량체 수용체를 통해 세포를 활성화시키는 이의 능력에는 필요하지 않지만, MOD는 TGF-β 수용체 활성화 결과에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 야생형(wt.) 또는 변이체 MOD(예를 들어, 감소된 친화도, 증가된 친화도, 또는 "co-MOD", "공동 면역조절 폴리펩타이드" 또는 "동족 공자극 수용체 또는 이들의 아형으로도 지칭되는 특정 수용체에 대해 선택성을 나타냄)를 혼입하는 것이 바람직할 수 있다. TGF-β는 면역조절 폴리펩타이드이지만, 본 명세서에 기재된 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에서 중요한 요소이기 때문에, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "MOD(들)"는 TGF-β 또는 이의 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체(예를 들어, 동형이량체 또는 이형이량체 복합체) 중 어느 것에 포함시키기에 적합한 MOD는 PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 및 IL-23을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, MOD는 성숙 PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 및 IL-23 폴리펩타이드 또는 이들 중 어느 것의 단편으로부터 독립적으로 선택된다. 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 혼입된 MOD 폴리펩타이드 서열(들)은 선택된 MOD 폴리펩타이드의 일부, 또는 이것이 막 고정 형태인 경우에, 전장 성숙 MOD 단백질의 세포외 부분만을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 MOD 폴리펩타이드 서열은, 일부 경우에, 일부 천연 유래 MOD에서 정상적으로 발견되는 단일 펩타이드, 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인 중 하나 이상(예를 들어, 각각)을 제외할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 포함시키기에 적합한 MOD 폴리펩타이드 서열은 천연 유래 MOD의 아미노산 서열의 모두 또는 일부(예를 들어, 세포외 부분)를 포함한다. 다른 예에서, 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 포함시키기에 적합한 MOD는 천연 유래 MOD의 아미노산 서열과 비교할 때 적어도 하나의 아미노산 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함하는 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된) 변이체 MOD를 포함한다.
일부 예에서, 변이체 MOD는 co-MOD에 대해 대응하는 천연 유래 MOD(예를 들어, 변이체에 존재하는 아미노산 치환(들)을 포함하지 않는 MOD)의 친화도보다 더 낮은 co-MOD에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 친화도의 감소에 따라서, co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 MOD의 사용은 TGF-β 폴리펩타이드가 결합 상호작용에 더 많은 영향을 갖거나, 심지어 지배하는 것을 가능하게 한다. TGF-β 폴리펩타이드의 결합 친화도가 MOD의 결합 친화도보다 더 높은 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 TGF-β 수용체 시스템(예를 들어, 고친화도 TGF-β 결합 이형이량체를 형성하는 TGF-βR1 및 TGF-βR2)을 갖는 세포와 회합하도록 유도할 수 있는 한편, 동시에 co-MOD가 풍부하지만 TGF-β 수용체가 없거나 거의 갖지 않는 세포에 대한 비표적 결합을 제한한다. 본질적으로, 세포 수용체에 대한 TGF-β 폴리펩타이드의 친화도(예를 들어, 결합의 ΔG)가 이들의 co-MOD(예를 들어, 결합의 ΔG)에 대한 MOD의 친화도보다 더 큰 경우에, TGF-β는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 결합 및 특이성을 유도한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체와 회합된 임의의 하나 이상의 MOD는 wt. 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다: PD-L1; FAS-L; IL-1; IL-2; IL-4; IL-6; IL-7; IL-10; IL-15; IL-21; IL-23; 및 이들의 조합.
일부 경우에, 예컨대, Treg 세포의 생산을 자극하는 것이 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 IL-2 폴리펩타이드 또는 IL-2 변이체 폴리펩타이드이다. IL-2에서의 서열 변이는 IL-2R 수용체 서브유닛의 상이한 조합을 보유하는 표적 세포에 IL-2 폴리펩타이드, 및 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 결합을 편향시키도록 선택될 수 있다. IL-2 수용체는 공통 IL-2Rγ 및 2개의 추가적인 IL-2Rα 및/또는 IL-2Rβ 서브유닛을 포함하여 삼량체(IL-2Rα)2-IL-2Rγ, (IL-2Rβ)2-IL-2Rγ, 또는 고친화도(Kd 약 10 피코몰) IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ 수용체를 형성한다. α 쇄(CD25)는 IL-2에 독특한 반면, β 쇄(CD122)가 IL-15 수용체 및 신호전달에 중요한 γ 쇄(CD132)와 공유되고, 다른 사이토카인 수용체 쇄를 동반할 수 있다. H16에서의 치환(예를 들어, H16A 또는 H16T) 또는 F42에서의 치환(예를 들어, F42A 또는 F42T)은 IL-2Rβ 서브유닛을 갖는 수용체에 우선적으로 결합을 편향시킬 수 있고; 따라서, 이들의 포함은 β-γ 수용체((IL-2R β)2-IL-2Rγ)를 나타내는 기억 T 세포 및 NK 세포, 또는 고친화도 α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ) 수용체를 나타내는 활성화된 T-세포 및 T reg에 대한 결합으로 편향된다. 대조적으로, N88에서의 치환(예를 들어, N88R)은 IL-2Rβ에 대한 결합을 감소시키고, IL-2Rα 서브유닛을 갖는 수용체에 우선적으로 결합을 편향시킬 수 있고; 따라서, N88에서의 치환은 α-γ((IL-2Rα)2-IL-2Rγ)) 및 α-β-γ(IL-2Rα-IL-2Rβ-IL-2Rγ) 수용체를 갖는 세포에 대한 결합으로 편향되는 반면, β-γ 수용체를 갖는 세포의 결합 및 활성화를 피한다. 예를 들어, 문헌[Skrombolas and Frelinger Expert Rev Clin Immunol., 10(2): 207-217 (2014)] 참조. co-MOD 또는 co-MOD를 나타내는 세포에 대한 치환된 MOD(예컨대, aa 치환을 갖는 IL-2 폴리펩타이드)의 결합과 관련하여 사용되는 바와 같은 편향은, 치환의 존재가 wt. MOD와 동일한 co-MOD 사이의 상호작용에 비해 치환된 MOD와 co-MOD의 상호작용의 양을 변화시킨다는 것을 의미한다. 예를 들어, 보다 낮은 부작용 프로파일(예를 들어, 보다 안전)을 갖고 인간 대상체에 의해 더 잘 용인되는 N88에서의 치환(예를 들어, N88R)을 갖는 IL-2 서열은 H16 및/또는 F42에서 상기 언급된 치환이 포함될 수 있다.
일부 경우에, 예컨대, iTreg 세포(CD4+ FoxP3+ 세포)의 생산을 자극하는 것(예를 들어, 효과기 T 세포를 능동적으로 억제하고/하거나 면역-매개 조직 손상을 저해하기 위해 말초 관용을 유도하는 것)이 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 MOD 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 문헌[Francisco et al., J. Exp. Med., 206(13): 3015-3029 (2009)] 참조. wt. 또는 변이체 PD-L1 서열에 추가로, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. IL-2에서의 서열 변이는 IL-2R 수용체 서브유닛의 상이한 조합을 보유하는 표적 세포에 IL-2 폴리펩타이드, 및 마스킹된 TGF-β 작제물의 결합을 편향시키도록 선택될 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, IL-2 변이체는 IL-2Rβ 서브유닛을 갖는 수용체에 우선적으로 결합을 편향시킬 수 있는 H16에서의 치환(예를 들어, H16A 또는 H16T) 및/또는 F42에서의 치환(예를 들어, F42A 또는 F42T); 및/또는 인간 대상체에 의해 더 잘 용인되는 IL-2Rβ에 대한 결합을 감소시키는 N88에서의 치환(예를 들어, N88R)을 갖는 IL-2를 포함한다. 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물/-β 복합체는 H16T와 F42A 둘 다, 또는 H16A 및 F42 치환 둘 다를 포함하며, 이의 쌍은 N88(예를 들어, N88R) 치환과 조합될 수 있다.
일부 경우에, 예컨대, 이것이 Th17 세포의 생산을 자극하는 데 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 IL-6 폴리펩타이드 또는 IL-6 변이체 폴리펩타이드이다.
일부 경우에, 예컨대, 이것이 Th9 세포의 생산을 자극하는 데 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 IL-4 폴리펩타이드 또는 IL-4 변이체 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 문헌[Elyaman et al Immunity., 36(4): 623-634, Immunity. (2012)]을 참조한다.
일부 경우에, 예컨대 저친화도 T 세포의 IL-7-의존적 생존을 촉진시키는 것이 바람직한 경우, 흉선세포 IL-7Ra 발현의 제어에 의해, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 IL-7 폴리펩타이드 또는 IL-7 변이체 폴리펩타이드이다.
일부 경우에, 예컨대, 이것이 T 여포 헬퍼(Tfh) 세포의 생성을 자극하는 데 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 IL-21 또는 IL-23 폴리펩타이드, 또는 IL-21 또는 IL-23 폴리펩타이드의 변이체이다.
일부 경우에, 예컨대, 이것이 관용을 유도하는 데 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 리간드(FasL) 폴리펩타이드의 변이체이다.
일부 경우에, 예컨대, II형 선천성 림프구 세포(ILC2 세포)를 저해하는 것(예를 들어, 천식 및 알레르기성 염증을 억제하는 것)이 바람직한 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 IL-10 폴리펩타이드, 또는 IL-10 폴리펩타이드의 변이체이다. 예를 들어, 문헌[Rajas et al., J Allergy Clin Immunol, 139(5):1468 (2017)]; 및 문헌[Ogasawara, et al., J Allergy Clin Immunol, 141(3): 1147-1151 (2018)] 참조. ILC2 세포의 저해는 생체내(조직 또는 체액에서) 또는 시험관내(배양 배지에서) 2형 사이토카인 IL-5 및 IL-13의 이들의 생산 감소에 의해 평가될 수 있다. IL-10 폴리펩타이드는 단량체 이성질체, 예컨대, 문헌[Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000)에 의해 기재되는 IL-10M1 분자, 또는 이들의 변이체일 수 있으며, 이들 둘 다 이하에 논의된다. 생물학적으로 활성인 형태가 2개의 IL-10 분자 및 4개의 IL-10Ra 수용체 쇄로 이루어진 복합체를 형성하는 IL-10 펩타이드의 뒤얽힌 쌍인 야생형 IL-10과 대조적으로, IL-10M1은 세포 증식 분석에서 생물학적으로 활성인 30㎚의 해리 상수를 갖는 가용성 IL-10Ra와의 1:1 복합체를 형성한다. Id.
2
감소된 친화도를 갖는 MOD 및 변이체 MOD
co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타낼 수 있는 적합한 MODS는 야생형 MOD 서열과 1개의 아미노산(aa) 내지 20 aa 차이를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 복합체에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열은 대응하는 야생형 MOD 폴리펩타이드 서열과 1 aa, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa 또는 10 aa만큼 아미노산의 차이가 있을 수 있다. 다른 예로서, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 대응하는 야생형 MOD 폴리펩타이드와 11 aa, 12 aa, 13 aa, 14 aa, 15 aa, 16 aa, 17 aa, 18 aa, 19 aa 또는 20 aa만큼 아미노산의 차이가 있다. 예로서, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 단일 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 2 aa 치환(예를 들어, 2개 이하의 aa 치환)을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 3 aa 치환(예를 들어, 3개 이하의 aa 치환)을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 4 aa 또는 5 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 6 aa 또는 7 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 8 aa 또는 9 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 10 aa 또는 11 aa 치환(예를 들어, 10개 이하의 aa 치환)을 포함한다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 11 aa 또는 12 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 13 aa 또는 14 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 15 aa 또는 16 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 17 aa 또는 18 aa 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 대응하는 기준(예를 들어, 야생형) MOD 서열과 비교할 때 19 aa 또는 20 aa 치환을 포함한다.
상기 논의한 바와 같이, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 포함시키기에 적합한 변이체 MOD는 동족 co-MOD에 대한 대응하는 야생형 MOD의 친화도와 비교할 때 이들의 동족 co-MOD에 대해 감소된 친화도를 나타낼 수 있다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열은 1nM 내지 100μM인 동족 co-MOD에 대해 결합 친화도를 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD 폴리펩타이드는 약 1nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 50nM, 약 50nM 내지 약 100nM, 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 동족 co-MOD에 대한 결합 친화도를 갖는다.
3
결합 친화도 결정
MOD(예를 들어, MOD 폴리펩타이드)와 이의 동족 co-MOD 사이의 결합 친화도는 정제된 MOD 및 정제된 동족 co-MOD를 이용하여 생물층 간섭계(BLI)에 의해 결정될 수 있다. MOD 및 MOD의 동족인 co-MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 사이의 결합 친화도는 또한 정제된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및 MOD의 동족인 co-MOD를 이용하는 BLI에 의해 결정될 수 있다. BLI 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lad et al. (2015) J. Biomol. Screen. 20(4):498-507; 및 Shah and Duncan (2014) J. Vis. Exp. 18:e51383]을 참조한다. MOD와 이의 동족 co-MOD 사이의, 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 MOD를 갖는 복합체 및 이의 동족 co-MOD 사이의 본 개시내용에 기재된 특정 및 상대적 결합 친화도는 다음의 절차를 이용하여 결정될 수 있다.
MOD-함유 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 MOD의 동족 co-MOD 사이의 결합 친화도를 결정하기 위해, BLI 분석은 다음과 같이 Octet RED 96() 기기 또는 유사한 기기를 이용하여 수행될 수 있다. 대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 야생형 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체)는 불용성 지지체("바이오센서") 상에 고정된다. 고정된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 "표적"이다. 고정화는 불용성 지지체 상에 포획 항체를 고정시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 포획 항체는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 고정시킨다. 예를 들어, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 Ig Fc 스캐폴드를 포함하는 경우, 불용성 지지체 상에 항-Ig Fc(예를 들어, 항-인간 IgG Fc) 항체를 고정시킴으로써 고정이 달성되며, 고정된 항-Ig Fc 항체는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 결합하고 고정된다. co-MOD는, 몇몇 상이한 농도에서, 고정된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 적용되고, 기기의 반응이 기록된다. 분석은 25mM HEPES pH 6.8, 5% 폴리(에틸렌 글리콜) 6000, 50 mM KCl, 0.1% 소 혈청 알부민 및 0.02% 트윈(Tween) 20 비이온성 세정제를 포함하는 액체 배지에서 수행된다. 고정된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 대한 co-MOD의 결합은 30℃에서 수행된다.
결합 및 결합 친화도에 대한 양성 대조군으로서, 항체(예를 들어, 단클론성 항체)가 사용될 수 있다. 항체는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 특정 구조에 기반하여 선택될 수 있다(예를 들어, 도 1 참조). 예를 들어, TGF-β, TGF-β 수용체, 스캐폴드 또는 MOD 폴리펩타이드 서열로 향하는 단클론성 항체(mAb)는 양성 대조군으로서 사용될 수 있으며, 단, 항체는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 지지체(바이오센서)로부터 분리되게 하지 않는다. 표준 곡선은 항-MHC 클래스 I 또는 클래스 II 단클론성 항체의 연속 희석을 이용하여 생성될 수 있다. co-MOD, 또는 항-MHC mAb는 "분석물"이다. BLI는 두 표면: i) 고정된 폴리펩타이드("표적"); 및 ii) 내부 기준층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자("분석물"; 예를 들어, co-MOD; 항-HLA 항체) 수의 변화는 간섭 패턴의 이동을 야기하며; 간섭 패턴의 이런 이동은 실시간으로 측정될 수 있다. 표적/분석물 상호작용의 친화도를 설명하는 두 동력학 용어는 결합 상수(k a) 및 해리 상수(k d)이다. 이들 두 용어의 비(k d/a)는 친화도 상수 KD를 생기게 한다.
상기 언급한 바와 같이, MOD(예를 들어, IL-2 또는 IL-2 변이체)와 그의 동족 co-MOD(예를 들어, IL-2R) 사이의 결합 친화도를 결정하는 것은 BLI에 의해 결정될 수 있다. 분석은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 대해 상기 기재한 것과 유사하다. BLI 분석은 다음과 같이, Octet RED 96(Pal FortιBio) 기기 또는 유사한 기기를 이용하여 수행될 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 성분 MOD(예를 들어, 본 개시내용의 변이체 IL-2 폴리펩타이드); 및 대조군 MOD(대조군 MOD가 야생형 MOD, 예를 들어, 야생형 IL-2를 포함함)는 불용성 지지체("바이오센서") 상에 별개로 고정된다. 각각의 MOD는 "표적"이다. 고정화는 불용성 지지체 상에 포획 항체를 고정시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 포획 항체는 MOD를 고정시킨다. 예를 들어, 표적이 면역-친화도 태그(예를 들어, FLAG, 인간 IgG Fc 등에 융합된다면, 면역화는 불용성 지지체 상에 면역-친화도 태그(예를 들어, 항-인간 IgG Fc)에 적절한 항체를 고정시킴으로써 달성될 수 있으며, 고정된 항체는 MOD에 결합하고 고정한다(여기서, MOD는 IgFc 폴리펩타이드를 포함한다). co-MOD(또는 폴리펩타이드)는, 몇몇 상이한 농도에서, 고정된 MOD에 적용되고, 기기의 반응이 기록된다. 대안적으로, co-MOD(또는 폴리펩타이드)는 바이오센서에 (예를 들어, IL-2 수용체 이형삼량체에 대해, 단량체 서브유닛, 이형이량체 부분복합체 또는 완전한 이형삼량체로서) 고정되고, MOD는 몇몇 상이한 농도로 고정된 co-MOD(들)에 적용되고, 기기의 반응은 기록된다. 분석은 25mM HEPES pH 6.8, 5% 폴리(에틸렌 글리콜) 6000, 50 mM KCl, 0.1% 소 혈청 알부민 및 0.02% 트윈(Tween) 20 비이온성 세정제를 포함하는 액체 배지에서 수행된다. 고정된 MOD에 대한 co-MOD의 결합은 30℃에서 수행된다. BLI는 두 표면: i) 고정된 폴리펩타이드("표적"); 및 ii) 내부 기준층으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자("분석물"; 예를 들어, co-MOD) 수의 변화는 간섭 패턴의 이동을 야기하며; 간섭 패턴의 이런 이동은 실시간으로 측정될 수 있다. 표적/분석물 상호작용의 친화도를 설명하는 두 동력학 용어는 결합 상수(k a) 및 해리 상수(k d)이다. 이들 두 용어의 비(k d/a)는 친화도 상수 KD를 생기게 한다. 야생형 MOD(예를 들어, IL-2)의 co-MOD(예를 들어, 이의 동족 결합 상대 또는 수용체; IL-2의 경우에, IL-2R)에 대한 결합 친화도와 변이체 MOD(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 IL-2 변이체)의 co-MOD(예를 들어, IL-2 변이체의 경우에, IL-2R)에 대한 결합 친화도를 둘 다 결정하는 것은, 따라서, 야생형 co-MOD와 비교할 때, co-MOD에 대한 변이체 co-MOD의 상대 결합 친화도를 결정하는 것을 가능하게 한다. 즉, 변이체 MOD의 co-MOD에 대한 결합 친화도가 야생형 MOD의 동일한 동족 co-MOD에 대한 결합 친화도에 비해 감소되는지의 여부, 및 만약에 그렇다면, 야생형 co-MOD의 결합 친화도로부터의 감소 백분율이 무엇인지를 결정할 수 있다.
BLI 분석은 다중-웰 플레이트에서 수행된다. 분석을 실행하기 위해, 플레이트 레이아웃을 정하고, 분석 단계를 정하고 나서, 바이오센서를 옥텟 데이터 획득 소프트웨어(Octet Data Acquisition software)에 배정한다. 바이오센서 조립체는 수화된다. 수화된 바이오센서 조립체 및 분석 플레이트는 옥텟 기기(Octet instrument) 상에서 10분 동안 평형상태가 된다. 일단 데이터가 획득되면, 획득된 데이터는 옥텟 데이터 분석 소프트웨어에 부하된다. 데이터는 기준 차감, y-축 정렬, 단계간 보정 및 사비츠기-골레이 필터링(Savitzky-Golay filtering)에 대한 방법을 구체화함으로써 가공 창에서 가공된다. 데이터는 분석을 위해 단계들(결합 및 해리)을 구체화하고, 곡선 적합 모델(1:1), 적합화 방법(글로벌(global)) 및 관심 대상의 창(초)을 선택함으로써 분석 창에서 분석된다. 적합도 품질이 평가된다. 각각의 데이터 추적에 대한 KD 값(분석물 농도)은 3배 범위 내라면 평균화될 수 있다. KD 오차값은 친화도 상수 값의 10배 내이어야 하고; R2 값은 0.95 초과이어야 한다. 예를 들어, 문헌[Abdiche et al. (2008) J. Anal. Biochem. 377:209] 참조.
일부 경우에, i) 동족 co-MOD에 대한 대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 결합 친화도(대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 야생형 MOD를 포함하는 경우) 대 ii) 동족 co-MOD에 대한 야생형 MOD의 변이체를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때(상기 기재된 바와 같음), 적어도 1.5:1, 적어도 2:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 500:1, 적어도 102:1, 적어도 5×102:1, 적어도 103:1, 적어도 5×103:1, 적어도 104:1, 적어도 105:1 또는 적어도 106:1이다. 일부 경우에, i) 동족 co-MOD에 대한 대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 결합 친화도(대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 야생형 MOD를 포함하는 경우) 대 ii) 동족 co-MOD에 대해 야생형 MOD 변이체를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 결합 친화도의 비는, BLI에 의해 측정될 때, 1.5:1 내지 106:1, 예를 들어, 1.5:1 내지 10:1, 10:1 내지 50:1, 50:1 내지 102:1, 102:1 내지 103:1, 103:1 내지 104:1, 104:1 내지 105:1, 또는 105:1 내지 106:1의 범위이다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 1nM 내지 100nM, 또는 100nM 내지 100μM인 동족 co-MOD에 대해 결합 친화도를 갖는다. 예를 들어, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 동족 co-MOD에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 약 1nM 내지 약 5nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 10nM 내지 약 50nM, 또는 약 50nM 내지 약 100nM인 동족 co-MOD에 대한 결합 친화도를 갖는다.
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PD-L1 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 PD-L1 또는 변이체 PD-L1 폴리펩타이드이다. 야생형 PD-L1은 PD1에 결합한다.
야생형 인간 PD-L1 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있고:
(서열번호 1); 여기서 aa 1 내지 18은 신호 서열을 형성하고, aa 19 내지 127은 Ig-유사 V-형 또는 IgV 도메인을 형성하며, 133 내지 225는 Ig-유사 C2 type 도메인을 형성한다.
야생형 인간 PD-L1 엑토도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있고:
MOD로서 사용하기에 적합한 야생형 PD-L1 IgV 도메인은 aa 18, 서열번호 1의 aa IgV aa 19 내지 127, 및 카복실 말단의 안정화 서열, 예컨대, 다음 서열의 마지막 7개 아미노산(볼드체 및 이탤릭체)을 포함할 수 있다:
서열번호 138. 카복실 안정화 서열이 약 aa 122에서 히스티딘(예를 들어, 서열번호 138의 aa 117로서 나타나는 tyr (Y)의 C-말단 측면에 대해 대략 5개 잔기인 히스티딘)을 포함하는 경우, 히스티딘은 aa 82 및 83(서열번호 138(서열번호 1의 Q107 및 L106)에서 볼드체 및 이탤릭체)에서 골격 아마이드와 안정화 정전 결합을 형성할 수 있다. 대안으로서, 안정화 이황화 결합은 aa 82 또는 83 중 하나(서열번호 1의 Q107 및 L106) 및 aa 잔기 121, 122 또는 123 중 하나(서열번호 1의 139 내지 141번 aa 위치와 동일)를 치환함으로써 형성될 수 있다.
야생형 PD-1 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 2의 변이체 또는 PD-L1의 IgV 도메인)는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해, PD-1(예를 들어, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 폴리펩타이드)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-L1 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 PD-1(예를 들어, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 폴리펩타이드)에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 2의 변이체 또는 이의 IgV 도메인)는 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)인 PD-1에 대한 (예를 들어, 서열번호 3의) 결합 친화도를 갖는다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 2의 변이체)는 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 PD1(예를 들어, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 PD1 폴리펩타이드)에 대한 결합 친화도를 갖는다.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 1의 aa 19 내지 127(IgV 도메인), 및 서열번호 138 중 어느 하나의 적어도 85개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100 또는 적어도 105개의 인접한 aa)에 대해 90% 초과(95%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 서열에 대해 치환을 포함하는 MOD로서 사용되는 PD-L1 엑토도메인 서열에서 다수의 aa 치환이 만들어질 수 있다. 치환은 (a) 이황화결합 치환 쌍 D103C 및 G33C, 또는 V104 및 S34C; (b) 치환 쌍 Q107D 및 K62R 또는 Q107D 및 S80R을 형성하는 염 브릿지; 및/또는 (c) Pi 적층 치환 M36Y 또는 M36F(서열번호 1에 기반함)를 포함할 수 있다. PD-L1 MOD 서열은 서열번호 2의 적어도 85개의 인접한 aa를 갖는 서열(예를 들어, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100 또는 적어도 105개의 인접한 aas), 및 적어도 하나의 이황화물, 염 브리지, 또는 Pi 적층 치환을 포함할 수 있다. PD-L1 MOD 서열은 서열번호 1의 aa 19 내지 127(IgV 도메인)의 적어도 85개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 또는 적어도 105개의 인접한 aa)을 갖는 서열, 및 적어도 하나의 이황화물, 염 브리지, 또는 Pi 적층 치환을 포함할 수 있다. PD-L1 MOD 서열은 서열번호 138의 aa의 적어도 85개의 인접한 aa를 갖는 서열(예를 들어, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100 또는 적어도 105개의 인접한 aas), 및 적어도 하나의 이황화물, 염 브리지, 또는 Pi 적층 치환을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2에 제시된 PD-L1 아미노산 서열 또는 PD-L1의 IgV 도메인과 비교할 때 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 PD-L1 폴리펩타이드 서열은 서열번호 2(예를 들어, 적어도 하나의 aa 삽입, 결실 또는 치환을 가짐) 적어도 170개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 180, 190 또는 200개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 적합한 변이체 PD-L1 IgV 폴리펩타이드 서열은 서열번호 2의 aa 1 내지 109(예를 들어, 적어도 하나의 aa 삽입, 결실 또는 치환을 가짐)의 적어도 70개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 80, 90, 100 또는 105개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
예에서, 변이체 PD-L1 폴리펩타이드 서열은 서열번호 2에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 98% 또는 99%), 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하되, 8번 위치에서 잔기는 D가 아닌 aa이고; 하나의 이러한 예에서, 잔기는 A이고, 다른 예에서는 R이다. 변이체 PD-L1 폴리펩타이드 서열은 서열번호 2에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 98% 또는 99%), 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하되, 36번 위치에서 잔기는 I가 아닌 aa이고; 하나의 이러한 예에서, 잔기는 A이고, 다른 예에서는 D이다. 변이체 PD-L1 폴리펩타이드 서열은 또한 서열번호 2에 대해 적어도 90%(예를 들어, 적어도 95%, 98% 또는 99%), 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하되, 54번 위치에서 잔기는 E가 아닌 aa이고; 하나의 이러한 예에서, 잔기는 A이고, 다른 예에서는 R이다.
5
IL-1 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 IL-1 또는 변이체 IL-1 폴리펩타이드이다. 야생형 IL-1은 2개의 아이소폼, 즉, IL-1α 및 IL-1β를 갖고, 이들 둘 다 IL-1 수용체에 결합한다.
야생형 인간 IL-1α 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
UniProtKB - P01583, NCBI 참조 서열 NP_000566.3, 이는 다음의 천연 유래 변이 R85Q, A114S, N125D, D138N 및 D176H 중 하나 이상을 가질 수 있다.
성숙 야생형 인간 IL-1α 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
야생형 인간 IL-1β 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
성숙 야생형 인간 IL-1β 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다
IL-1α와 IL-1β는 둘 다 하기 서열을 가질 수 있는 IL-1 수용체에 결합한다:
NCBI 참조 서열 NP_000868.1, 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 21 내지 569를 갖고, 이의 엑토도메인은 IL-1α 및 IL-1β에 대한 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 변이체 IL-1α 및 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-1 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때, 서열번호 8에 제시된 서열을 갖는 IL-1 수용체 또는 이의 엑토도메인에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 IL-1α 및 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95%미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 8에 제시된 IL-1 수용체 또는 엑토도메인의 성숙 단백질에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 5 또는 7의 변이체)는 서열번호 8에 제시된 서열을 갖는 IL-1 수용체에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 5 또는 7의 변이체)는 서열번호 8에 제시된 IL-1 수용체 또는 이의 엑토도메인에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-1α 또는 IL-1β 폴리펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 IL-1α 또는 IL-1β 아미노산 서열과 비교할 때 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-1α 또는 IL-1β폴리펩타이드 서열은 (예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 갖는) 서열번호 5 또는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열의 적어도 100개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
6
IL-2 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 IL-2 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 변이체 MOD는 변이체 IL-2 폴리펩타이드이다. 야생형 IL-2는 IL-2 수용체(IL-2R)에 결합한다. 야생형 IL-2 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다:
야생형 IL-2는 세포 표면 상의 IL-2 수용체(IL-2R)에 결합한다. IL-2 수용체는 일부 경우에 알파쇄(IL-2Rα; CD25로도 지칭됨), 베타쇄(IL-2Rβ; CD122로도 지칭됨: 및 감마쇄(IL-2Rγ; CD132로도 지칭됨)를 포함하는 이형삼량체 폴리펩타이드이다. 인간 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ의 아미노산 서열은 다음과 같을 수 있다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 변이체 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 동족 co-MOD는 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 IL-2R이다.
일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩타이드의 결합 친화도에 비해, IL-2R에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 동일한 조건 하에 분석할 때, IL-2R(예를 들어, 서열번호 10 내지 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2R)에 대해 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 IL-2R에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 9의 변이체)는 (예를 들어, 서열번호 10 내지 12의) IL-2R에 대한 결합 친화도가 100nM 내지 100μM이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 9의 변이체)는 IL-2R(예를 들어, 서열번호 10 내지 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 IL-2R)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 2 내지 10개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 2개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 3개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 4개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 5개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 6개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 7개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 8개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 9개의 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-2 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 IL-2 아미노산 서열에 비해 10개의 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열은 서열번호 9의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 aa 서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또한, IL-2 변이체는 다음의 변이체 IL-2 aa 서열(서열번호 13 내지 27 참조) 중 어느 하나의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 aa 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
APTSSSTKKT QLQLEXLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 15), 여기서 X(H16)는 His 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala(H16A)이다. 일부 경우에, X는 Arg이다. 일부 경우에, X는 Asn이다. 일부 경우에, X는 Asp이다. 일부 경우에, X는 Cys이다. 일부 경우에, X는 Glu이다. 일부 경우에, X는 Gln이다. 일부 경우에, X는 Gly이다. 일부 경우에, X는 Ile이다. 일부 경우에, X는 Lys이다. 일부 경우에, X는 Leu이다. 일부 경우에, X는 Met이다. 일부 경우에, X는 Phe이다. 일부 경우에, X는 Pro이다. 일부 경우에, X는 Ser이다. 일부 경우에, X는 Thr(H16T)이다. 일부 경우에, X는 Tyr이다. 일부 경우에, X는 Trp이다. 일부 경우에, X는 Val이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 16), 여기서 X(F42)는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala(F42A)이다. 일부 경우에, X는 Thr(F42T)이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKF X MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 17), 여기서 X는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이고;
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLIS X IN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 18), 여기서 X(N88)는 Asn 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala; 일부 경우에, X는 Arg이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X SIIS TLT(서열번호 19), 여기서 X는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X는 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLE X 1 LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 20), 여기서 X1(H16)은 His 이외의 임의의 아미노산이고, X2(F42)는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala(H16A, F42A)이다. 일부 경우에, X1은 Thr이고, X2는 Ala(H16T, F42A)이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고, X2는 Thr(H16A, F42T)이다. 일부 경우에, X1은 Thr이고, X2는 Thr(H16T, F42T)이다.
N88R 치환을 포함하는 APTSSSTKKT QLQLE X 1 LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLIS R IN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 21), 여기서 X1(H16)은 His 이외의 임의의 아미노산이고, X2(F42)는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Thr이고, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고, X2는 Thr이다. 일부 경우에, X1은 Thr이고, X2는 Thr이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X 1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 22), 여기서 X1은 Asp 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQL X 1 HLLL X 2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 3 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 23), 여기서 X1은 Glu 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Asp 이외의 임의의 아미노산이며; X3은 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, 임의의 둘 또는 셋의 X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLE X 1 LLL X 2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 3 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 24), 여기서 X1은 His 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Asp 이외의 임의의 아미노산이며; X3은 Phe 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X 1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X 3 SIIS TLT(서열번호 25), 여기서 X1는 Asp 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Phe 이외의 임의의 아미노산이며, X3은 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X 1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KF X 3 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 26), 여기서 X1은 Asp 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Phe 이외의 임의의 아미노산이며, X3은 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLE X 1 LLL X 2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 3 KF X 4 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(서열번호 27), 여기서 X1은 His 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Asp 이외의 임의의 아미노산이며; X3은 Phe 이외의 임의의 아미노산이고, X4는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, X4는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이고; X4는 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLEHLLL X 1 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KF X 3 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X 4 SIIS TLT(서열번호 139), 여기서 X1은 Asp 이외의 임의의 아미노산이며; X2는 Phe 이외의 임의의 아미노산이며, X3은 Tyr 이외의 임의의 아미노산이고, X4는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, X4는 Ala이다. 일부 경우에, X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이고; X4는 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLE X 1 LLL X 2 LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 3 KF X 4 MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X 5 SIIS TLT(서열번호 140), 여기서, X1은 His 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Asp 이외의 임의의 아미노산이며; X3은 Phe 이외의 임의의 아미노산이고, X4는 Tyr 이외의 임의의 아미노산이고, X5는 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, X4는 Ala이다. 일부 경우에, X5는 Ala이다. 일부 경우에, 임의의 2, 3, 4 또는 모두 5개의 X1은 Ala이고; X2는 Ala이며; X3은 Ala이고; X4는 Ala이고; X5는 Ala이다.
APTSSSTKKT QLQLE X 1 LLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML T X 2 KFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFC X 3 SIIS TLT(서열번호 141), 여기서 X1은 His 이외의 임의의 아미노산이고; X2는 Phe 이외의 임의의 아미노산이며; X3은 Gln 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, X1은 Ala이다. 일부 경우에, X2는 Ala이다. 일부 경우에, X3은 Ala이다. 일부 경우에, 임의의 둘 또는 셋의 X1은 Ala이고; X2는 Ala이고/이거나 X3은 Ala이다.
7
IL-4 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 IL-4 또는 변이체 IL-4 폴리펩타이드이다. 야생형 IL-4는 2개의 아이소폼, 즉, IL-4α 및 IL-4β를 갖고, 이들 둘 다 막 결합된 IL-4 수용체(아이소폼 1) 또는 이의 가용성 상대(아이소폼 2)에 결합한다.
야생형 인간 IL-4 아이소폼 1 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKYSK CSS(서열번호 28) NCBI 참조 서열 NP_000580.1.
성숙 야생형 인간 IL-4 아이소폼 1 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: KCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKYSK CSS(서열번호 29).
야생형 인간 IL-4 아이소폼 2 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRF LKRLDRNLWG LAGLNSCPVK EANQSTLENF LERLKTIMRE KYSKCSS, NCBI 참조 서열 NP_758858.1(서열번호 30).
성숙 야생형 인간 IL-4 아이소폼 2 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다 KCDIT LQEIIKTLNS LTEQKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRF LKRLDRNLWG LAGLNSCPVK EANQSTLENF LERLKTIMRE KYSKCSS(서열번호 31).
IL-4 아이소폼 1과 아이소폼 2는 둘 다 막 결합된 IL-4 수용체(IL-4R) 및/또는 이의 가용성 아이소폼 2에 결합한다. 막 결합된 IL-4는 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 26 내지 825 및 aa 233 내지 256 막관통 영역을 갖는 서열 MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMS ISTCEWKMNG PTNCSTELRL LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLL WKGSFKPSEH VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPD NYLYNHLTYA VNIWSENDPA DFRIYNVTYL EPSLRIAAST LKSGISYRAR VRAWAQCYNT TWSEWSPSTK WHNSYREPFE QHLLLGVSVS CIVILAVCLL CYVSITKIKK EWWDQIPNPA RSRLVAIIIQ DAQGSQWEKR SRGQEPAKCP HWKNCLTKLL PCFLEHNMKR DEDPHKAAKE MPFQGSGKSA WCPVEISKTV LWPESISVVR CVELFEAPVE CEEEEEVEEE KGSFCASPES SRDDFQEGRE GIVARLTESL FLDLLGEENG GFCQQDMGES CLLPPSGSTS AHMPWDEFPS AGPKEAPPWG KEQPLHLEPS PPASPTQSPD NLTCTETPLV IAGNPAYRSF SNSLSQSPCP RELGPDPLLA RHLEEVEPEM PCVPQLSEPT TVPQPEPETW EQILRRNVLQ HGAAAAPVSA PTSGYQEFVH AVEQGGTQAS AVVGLGPPGE AGYKAFSSLL ASSAVSPEKC GFGASSGEEG YKPFQDLIPG CPGDPAPVPV PLFTGFLDRE PPRSPQSSHL PSSSPEHLGL EPGEKVEDMP KPPLPQEQAT DPLVDSLGSG IVYSALTCHL CGHLKQCHGQ EDGGQTPVMA SPCCGCCCGD RSSPPTTPLR APDPSPGGVP LEASLCPASL APSGISEKSK SSSSFHPAPG NAQSSSQTPK IVNFVSVGPT YMRVS(서열번호 32), NCBI 참조 서열 NP_000409.1을 가질 수 있고; 단백질의 엑토도메인은 IL-4 아이소폼 1 또는 2에 대한 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
서열 MGWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMS ISTCEWKMNG PTNCSTELRL LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLL WKGSFKPSEH VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPDN YLYNHLTYAVN IWSENDPADF RIYNVTYLEP SLRIAASTLK SGISYRARVRA WAQCYNTTWSE WSPSTKWHNS NIC(서열번호 33), UniProtKB - P24394를 갖는 가용성 아이소폼 2는 또한 IL-4 아이소폼 둘 다의 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 29 또는 31의 변이체)는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-4 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때, 서열번호 32에 제시된 성숙 IL-4 수용체 서열 또는 이의 엑토도메인, 또는 서열번호 33에 제시된 가용성 IL-4 수용체에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 32(또는 이의 엑토도메인)에 또는 서열번호 33에 제시된 성숙 IL-4 수용체에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 29 또는 31의 변이체)는 서열번호 32(또는 이의 엑토도메인)에 또는 서열번호 33에 제시된 성숙 IL-4 수용체에 대해 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM 또는 100μM 내지 1mM)인 결합 친화도를 갖는다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 29 또는 31의 변이체)는 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 서열번호 32(또는 이의 엑토도메인)에 또는 서열번호 33에 제시된 성숙 IL-4 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.
일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-4 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2 폴리펩타이드는 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 IL-4 아이소폼 1 또는 2 아미노산 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-4 아이소폼 1 또는 2폴리펩타이드 서열은 서열번호 29 또는 서열번호 31(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 80개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 100 또는 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
8
IL-6 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 IL-6 또는 변이체 IL-6 폴리펩타이드이다. 야생형 IL-6은 IL-6 분자와 각 서브유닛을 갖는 2개의 삼량체의 신호전달 6량체를 형성하는, 알파 및 베타(gp130) 서브유닛으로 이루어진 IL-6 수용체에 결합한다. 예를 들어, 문헌[Lacroix et al., J. Biol. Chem. 290(45)26943-953 (2015)] 참조.
야생형 인간 IL-6 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MNSFSTSAFG PVAFSLGLLL VLPAAFPAPV PPGEDSKDVA APHRQPLTSS ERIDKQIRYI LDGISALRKE TCNKSNMCES SKEALAENNL NLPKMAEKDG CFQSGFNEET CLVKIITGLL EFEVYLEYLQ NRFESSEEQA RAVQMSTKVL IQFLQKKAKN LDAITTPDPT TNASLLTKLQ AQNQWLQDMT THLILRSFKE FLQSSLRALR QM(서열번호 34) NCBI 참조 서열 NP_000591.1.
성숙 야생형 인간 IL-6 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: VPPGEDSKDVA APHRQPLTSS ERIDKQIRYI LDGISALRKE TCNKSNMCES SKEALAENNL NLPKMAEKDG CFQSGFNEET CLVKIITGLL EFEVYLEYLQ NRFESSEEQA RAVQMSTKVL IQFLQKKAKN LDAITTPDPT TNASLLTKLQ AQNQWLQDMT THLILRSFKE FLQSSLRALR QM(서열번호 35).
IL-6은 알파 및 베타 서브유닛으로 이루어진 막 결합된 IL-6 수용체에 결합한다. 인간 IL-6R 알파 서브유닛은 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 26 내지 825, 및 막관통 영역의 aa 233 내지 256을 갖는, 서열 MLAVGCALLA ALLAAPGAAL APRRCPAQEV ARGVLTSLPG DSVTLTCPGV EPEDNATVHW VLRKPAAGSH PSRWAGMGRR LLLRSVQLHD SGNYSCYRAG RPAGTVHLLV DVPPEEPQLS CFRKSPLSNV VCEWGPRSTP SLTTKAVLLV RKFQNSPAED FQEPCQYSQE SQKFSCQLAV PEGDSSFYIV SMCVASSVGS KFSKTQTFQG CGILQPDPPA NITVTAVARN PRWLSVTWQD PHSWNSSFYR LRFELRYRAE RSKTFTTWMV KDLQHHCVIH DAWSGLRHVV QLRAQEEFGQ GEWSEWSPEA MGTPWTESRS PPAENEVSTP MQALTTNKDD DNILFRDSAN ATSLPVQDSS SVPLPTFLVA GGSLAFGTLL CIAIVLRFKK TWKLRALKEG KTSMHPPYSL GQLVPERPRP TPVLVPLISP PVSPSSLGSD NTSSHNRPDA RDPRSPYDIS NTDYFFPR(서열번호 36), NCBI 참조 서열: NP_000556.1을 가질 수 있다. IL-6에 결합한 후에, IL6 알파 서브유닛은 IL-6 베타 서브유닛에 결합한다.
인간 IL-6R 베타 서브유닛은 서열은 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 23 내지 918, 및 막관통 영역의 aa 620 내지 641을 갖는 서열
MLTLQTWLVQ ALFIFLTTES TGELLDPCGY ISPESPVVQL HSNFTAVCVL KEKCMDYFHV NANYIVWKTN HFTIPKEQYT IINRTASSVT FTDIASLNIQ LTCNILTGFQ LEQNVYGITI ISGLPPEKPK NLSCIVNEGK KMRCEWDGGR ETHLETNFTL KSEWATHKFA DCKAKRDTPT SCTVDYSTVY FVNIEVWVEA ENALGKVTSD HINFDPVYKV KPNPPHNLSV INSEELSSIL KLTWTNPSIK SVIILKYNIQ YRTKDASTWS QIPPEDTAST RSSFTVQDLK PFTEYVFRIR CMKEDGKGYW SDWSEEASGI TYEDRPSKAP SFWYKIDPSH TQGYRTVQLV WKTLPPFEAN GKILDYEVTL TRWKSHLQNY TVNATKLTVN LTNDRYLATL TVRNLVGKSD AAVLTIPACD FQATHPVMDL KAFPKDNMLW VEWTTPRESV KKYILEWCVL SDKAPCITDW QQEDGTVHRT YLRGNLAESK CYLITVTPVY ADGPGSPESI KAYLKQAPPS KGPTVRTKKV GKNEAVLEWD QLPVDVQNGF IRNYTIFYRT IIGNETAVNV DSSHTEYTLS SLTSDTLYMV RMAAYTDEGG KDGPEFTFTT PKFAQGEIEA IVVPVCLAFL LTTLLGVLFC FNKRDLIKKH IWPNVPDPSK SHIAQWSPHT PPRHNFNSKD QMYSDGNFTD VSVVEIEAND KKPFPEDLKS LDLFKKEKIN TEGHSSGIGG SSCMSSSRPS ISSSDENESS QNTSSTVQYS TVVHSGYRHQ VPSVQVFSRS ESTQPLLDSE ERPEDLQLVD HVDGGDGILP RQQYFKQNCS QHESSPDISH FERSKQVSSV NEEDFVRLKQ QISDHISQSC GSGQMKMFQE VSAADAFGPG TEGQVERFET VGMEAATDEG MPKSYLPQTV RQGGYMPQ,(서열번호 37), UniProtKB - P40189를 가질 수 있다.
막 결합된 IL-6R 알파 서브유닛에 대한 IL-6 결합에 대한 대안으로서, 이는 aa 20 내지 468을 포함하는 성숙 펩타이드, UniProtKB - P08887.1을 갖는 서열 MLAVGCALLA ALLAAPGAAL APRRCPAQEV ARGVLTSLPG DSVTLTCPGV EPEDNATVHW VLRKPAAGSH PSRWAGMGRR LLLRSVQLHD SGNYSCYRAG RPAGTVHLLV DVPPEEPQLS CFRKSPLSNV VCEWGPRSTP SLTTKAVLLV RKFQNSPAED FQEPCQYSQE SQKFSCQLAV PEGDSSFYIV SMCVASSVGS KFSKTQTFQG CGILQPDPPA NITVTAVARN PRWLSVTWQD PHSWNSSFYR LRFELRYRAE RSKTFTTWMV KDLQHHCVIH DAWSGLRHVV QLRAQEEFGQ GEWSEWSPEA MGTPWTESRS PPAENEVSTP MQALTTNKDD DNILFRDSAN ATSLPVQDSS SVPLPTFLVA GGSLAFGTLL CIAIVLRFKK TWKLRALKEG KTSMHPPYSL GQLVPERPRP TPVLVPLISP PVSPSSLGSD NTSSHNRPDA RDPRSPYDIS NTDYFFPR(서열번호 38)을 갖는 IL-6R 알파 서브유닛의 성숙 가용성 형태에 결합할 수 있다. 가용성 서브유닛은 막 결합된 IL-6R 알파 서브유닛을 대신할 수 있고, 결합 친화도 분석에서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 35의 변이체)는 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-6 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때 서열번호 36 및 37, 또는 서열번호 37 및 38에 제시된 성숙 IL-6 수용체에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-6 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 36 및 37, 또는 서열번호 37 및 38에 제시된 성숙 IL-6 수용체에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 35의 변이체)는 서열번호 36 및 37 또는 서열번호 37 및 38에 제시된 성숙 IL-6 수용체에 대해 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)인 결합 친화도를 갖는다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 35의 변이체)는 100nM 내지 100μM(예를 들어, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 또는 10μM 내지 100μM)인 서열번호 36 및 37, 또는 서열번호 37 및 38에 제시된 성숙 IL-6 수용체에 대한 친화도를 갖는다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 35의 변이체)는 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM인 서열번호 36 및 37, 또는 서열번호 37 및 38에 제시된 성숙 IL-6 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.
일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-6 폴리펩타이드는 서열번호 35에 제시된 IL-6 아미노산 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-6 폴리펩타이드 서열은 서열번호 35(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 80개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 100, 또는 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
9
IL-7 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 IL-7 또는 변이체 IL-7 폴리펩타이드이다. 야생형 IL-7은 4개의 아이소폼을 갖고, 이들 모두는 2개의 서브유닛, 알파 (α) 및 공통 감마(공통-γ) 쇄를 갖는 막 결합된 IL-7 수용체에 결합한다.
야생형 인간 IL-7 아이소폼 1 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ VKGRKPAALG EAQPTKSLEE NKSLKEQKKL NDLCFLKRLL QEIKTCWNKI LMGTKEH(서열번호 39) UniProtKB - P13232, NCBI 참조 서열 NP_000871.1.
성숙 야생형 인간 IL-7 아이소폼 1 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: DCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ VKGRKPAALG EAQPTKSLEE NKSLKEQKKL NDLCFLKRLL QEIKTCWNKI LMGTKEH(서열번호 40).
야생형 인간 IL-7 아이소폼 2 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKVKGR KPAALGEAQP TKSLEENKSL KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH(서열번호 41) NCBI 참조 서열: NP_ 001186815.1.
성숙 야생형 인간 IL-7 아이소폼 2 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: SDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKVKGR KPAALGEAQP TKSLEENKSL KEQKKLNDLC FLKRLLQEIK TCWNKILMGT KEH(서열번호 42).
야생형 인간 IL-7 아이소폼 3 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ EENKSLKEQK KLNDLCFLKR LLQEIKTCWN KILMGTKEH(서열번호 43) NCBI 참조 서열: NP_001186816.1.
성숙 야생형 인간 IL-7 아이소폼 3 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: CDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEGMF LFRAARKLRQ FLKMNSTGDF DLHLLKVSEG TTILLNCTGQ EENKSLKEQK KLNDLCFLKR LLQEIKTCWN KILMGTKEH(서열번호 44).
야생형 인간 IL-7 아이소폼 4 전구체 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MFHVSFRYIF GLPPLILVLL PVASSDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEENK SLKEQKKLND LCFLKRLLQE IKTCWNKILM GTKEH, NCBI 참조 서열: NP_001186817.1(서열번호 45).
성숙 야생형 인간 IL-7 아이소폼 4 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: SDCDIE GKDGKQYESV LMVSIDQLLD SMKEIGSNCL NNEFNFFKRH ICDANKEENK SLKEQKKLND LCFLKRLLQE IKTCWNKILM GTKEH(서열번호 46).
IL-7 수용체 알파 서브유닛은 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 21 내지 459, 및 막관통 영역의 aa 240 내지 264을 갖는 서열: MTILGTTGFM VFSLLQVVSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSF SCYSQLEVNG SQHSLTCAFE DPDVNITNLE FEICGALVEV KCLNFRKLQE IYFIETKKFL LIGKSNICVK VGEKSLTCKK IDLTTIVKPE APFDLSVVYR EGANDFVVTF NTSHLQKKYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTH VNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP ILLTISILSF FSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP ESFLDCQIHR VDDIQARDEV EGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVVITPES FGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDC RESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ(서열번호 47), NCBI 참조 서열 NP_002176.2를 가질 수 있다. 단백질의 수용체 서브유닛(예를 들어, 엑토도메인(aa 21 내지 239)의 모두 또는 일부는 IL-7 수용체 감마 서브유닛과 함께 IL-7 아이소폼에 대한 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
공통-γ 서브유닛(IL-7RG 또는 IL-R7γ)은 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 23 내지 369, 및 막관통 영역의 aa 263 내지 283을 갖는 서열 MLKPSLPFTS LLFLQLPLLG VGLNTTILTP NGNEDTTADF FLTTMPTDSL SVSTLPLPEV QCFVFNVEYM NCTWNSSSEP QPTNLTLHYW YKNSDNDKVQ KCSHYLFSEE ITSGCQLQKK EIHLYQTFVV QLQDPREPRR QATQMLKLQN LVIPWAPENL TLHKLSESQL ELNWNNRFLN HCLEHLVQYR TDWDHSWTEQ SVDYRHKFSL PSVDGQKRYT FRVRSRFNPL CGSAQHWSEW SHPIHWGSNT SKENPFLFAL EAVVISVGSM GLIISLLCVY FWLERTMPRI PTLKNLEDLV TEYHGNFSAW SGVSKGLAES LQPDYSERLC LVSEIPPKGG ALGEGPGASP CNQHSPYWAP PCYTLKPET, NCBI 참조 서열 NP_000197.1(서열번호 48)을 가질 수 있다. 단백질의 수용체 서브유닛(예를 들어, 엑토도메인(aa 23 내지 262))의 모두 또는 일부는 알파 서브유닛과 함께 IL-7에 대한 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, (예를 들어, 서열번호 40, 42, 44 또는 46의) 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4개의 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-7 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때, 성숙 IL-7 수용체 서열(예를 들어, 서열번호 47 및 48에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부, 예컨대, 이들의 엑토도메인을 포함하는 IL-7 수용체)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 47 및 48에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-7 수용체, 예컨대 이들의 엑토도메인에 결합한다.
일부 경우에, IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드의 변이체(예를 들어, 서열번호 40, 42, 44 또는 46의 변이체)는 서열번호 47 및 48에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-7 수용체, 예컨대 이들의 엑토도메인에 대한 결합친화도가 1nM 내지 1 mM이다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 40, 42, 44 또는 46의 변이체)는 서열번호 47 및 48에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 성숙 IL-7 수용체, 예컨대 이들의 엑토도메인에 대한 결합 친화도가 100nM 내지 100μM(예를 들어, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 또는 10μM 내지 100μM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 47 및 48, 예컨대 이들의 엑토도메인에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 성숙 IL-7 수용체에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드는 서열번호 40, 42, 44 또는 46에 제시된 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 아미노산 서열과 비교할 때 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-7 아이소폼 1, 2, 3 또는 4 폴리펩타이드 서열은 서열번호 40, 42, 44 또는 46(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 적어도 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
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IL-10 및 이의 변이체
한 가지 비제한적 예로서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD 또는 변이체 MOD는 IL-10 또는 변이체 IL-10 폴리펩타이드, 예컨대, 문헌[Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000)]에 기재된 D와 E 나선 사이의 힌지 영역에 삽입을 갖는 단량체 IL-10 변이체이다. 야생형 IL-10은 아이소폼을 갖고, 이들 모두는 알파 (α) IL-10RA와 베타(β) IL-10RB 서브유닛 둘 다에 결합하는 막 결합된 IL-10 수용체에 결합한다. 수용체는 세포(예를 들어, B 세포, T 세포, NK 세포, 비만 세포 및 수지상 세포)의 표면 상에서 사량체로서 존재한다.
야생형 인간 IL-10 아이소폼 1 전구체 폴리펩타이드는 H227L 서열 변이를 가질 수 있는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE FDIFINYIEA YMTMKIRN(서열번호 49) UniProtKB - P22301, NCBI 참조 서열 NP_000563.1.
성숙 야생형 인간 IL-10 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: SP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE FDIFINYIEA YMTMKIRN(서열번호 50).
인간 IL-10 폴리펩타이드 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: MIQFYLEEVM PQAENQDPDI KAHVNSLGEN LKTLRLRLRR CHRFLPCENK SKAVEQVKNA FNKLQEKGIY KAMS, UniProtKB - A0A286YEX3 1(서열번호 51).
IL-10 폴리펩타이드는 단량체 형태를 제공하는 IL-10 폴리펩타이드의 D와 E 나선 사이의 힌지 영역(예를 들어, 서열번호 51의 E48, N49, K50 또는 S51 중 어느 것에 인접한 5 내지 7 aa 삽입, 또는 서열번호 49 또는 50의 동등한 위치)에서의 삽입을 포함할 수 있다. 단량체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 51의 N49와 K50 사이(또는 서열번호 49 또는 50의 동등한 위치)의 5 내지 7 aa 삽입을 포함할 수 있다. 예에서, 5 내지 7개의 아미노산은 Ala, Gly 및/또는 Ser을 포함한다. 예에서, 5 내지 7개의 아미노산은 Ala 또는 Ser으로부터 선택된다. 예에서, 5 내지 7개의 aa은 Gly 및 Ser으로부터 선택된다. 일례에서, 삽입은 서열번호 51의 N49 내지 K50 사이(또는 서열번호 49 또는 50에서의 동등한 위치)의 IL-10M1 aa 삽입(GGGGSGGG 서열번호 142)을 포함한다. 일례에서, IL-10 변이체는 aa 49와 50 사이의 서열번호 51에 삽입된 IL-10M1(서열번호 189) GGGSGG로 이루어진다. 예를 들어, 문헌[Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000)] 참조.
IL-10 수용체 알파 서브유닛은 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 21 내지 587, 및 막관통 영역의 aa 236 내지 256을 갖는 서열:
MLPCLVVLLA ALLSLRLGSD AHGTELPSPP SVWFEAEFFH HILHWTPIPN QSESTCYEVA LLRYGIESWN SISNCSQTLS YDLTAVTLDL YHSNGYRARV RAVDGSRHSN WTVTNTRFSV DEVTLTVGSV NLEIHNGFIL GKIQLPRPKM APANDTYESI FSHFREYEIA IRKVPGNFTF THKKVKHENF SLLTSGEVGE FCVQVKPSVA SRSNKGMWSK EECISLTRQY FTVTNVIIFF AFVLLLSGAL AYCLALQLYV RRRKKLPSVL LFKKPSPFIF ISQRPSPETQ DTIHPLDEEA FLKVSPELKN LDLHGSTDSG FGSTKPSLQT EEPQFLLPDP HPQADRTLGN REPPVLGDSC SSGSSNSTDS GICLQEPSLS PSTGPTWEQQ VGSNSRGQDD SGIDLVQNSE GRAGDTQGGS ALGHHSPPEP EVPGEEDPAA VAFQGYLRQT RCAEEKATKT GCLEEESPLT DGLGPKFGRC LVDEAGLHPP ALAKGYLKQD PLEMTLASSG APTGQWNQPT EEWSLLALSS CSDLGISDWS FAHDLAPLGC VAAPGGLLGS FNSDLVTLPL ISSLQSSE(서열번호 52), NCBI 참조 서열 NP_001549.2를 가질 수 있다. 단백질의 수용체 서브유닛(예를 들어, 엑토도메인(aa 21 내지 235)의 모두 또는 일부는 IL-10 수용체 베타 서브유닛과 함께 IL-10 아이소폼에 대한 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
IL-10 수용체 베타 서브유닛은 성숙 폴리펩타이드를 형성하는 aa 20 내지 325, 및 막관통 영역의 aa 221 내지 242를 갖는 서열
MAWSLGSWLG GCLLVSALGM VPPPENVRMN SVNFKNILQW ESPAFAKGNL TFTAQYLSYR IFQDKCMNTT LTECDFSSLS KYGDHTLRVR AEFADEHSDW VNITFCPVDD TIIGPPGMQV EVLADSLHMR FLAPKIENEY ETWTMKNVYN SWTYNVQYWK NGTDEKFQIT PQYDFEVLRN LEPWTTYCVQ VRGFLPDRNK AGEWSEPVCE QTTHDETVPS WMVAVILMAS VFMVCLALLG CFALLWCVYK KTKYAFSPRN SLPQHLKEFL GHPHHNTLLF FSFPLSDEND VFDKLSVIAE DSESGKQNPG DSCSLGTPPG QGPQS, NCBI 참조 서열 NP_000619.3(서열번호 53)을 가질 수 있다. 단백질의 수용체 서브유닛(예를 들어, 엑토도메인(aa 20 내지 220))의 모두 또는 일부는 알파 서브유닛과 함께 IL-10에 대한 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 변이체 IL-10 아이소폼 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 50, 51의 변이체, 또는 상기 기재한 D와 E 나선 사이의 힌지에 5 내지 7 aa 삽입을 보유하는 해당 서열의 단량체 IL-10 변이체)는 서열번호 50 또는 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-10 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때 성숙 IL-10 수용체 서열(예를 들어, 서열번호 52 또는 53에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-10 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, IL-10 폴리펩타이드의 변이체(예를 들어, 서열번호 50 또는 51의 변이체)는 서열번호 52 또는 53에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-10 수용체(예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 (예를 들어, 서열번호 50 또는 51의) IL-10 아이소폼의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 52 및 53에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-10 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드(예를 들어, D와 E 나선 사이의 힌지 영역에 상기 언급된 삽입 중 하나를 포함할 수 있는 서열번호 50 또는 51의 변이체)는 IL-10 수용체(예를 들어, 서열번호 52 및 53에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 1 mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)이다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 50 또는 51의 변이체)는 성숙 IL-10 수용체(예를 들어, 서열번호 52 및 53에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 100nM 내지 100μM(예를 들어, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 또는 10μM 내지 100μM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 50 또는 51의 변이체)는 성숙 IL-10 수용체(서열번호 52 및 53에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 서열번호 50 또는 51에 제시된 IL-10 폴리펩타이드 서열에 비해 1 내지 10 aa 치환을 갖고, D와 E 나선 사이의 힌지 영역(예를 들어, 서열번호 50의 K49 및 N50)에 5 내지 7 aa 치환을 포함한다.
적합한 변이체 IL-10폴리펩타이드 서열은 서열번호 50 또는 51(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 50개의 인접한 aa(e.g., 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 적어도 160개)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
11
IL-15 및 이의 변이체
일부 경우에, 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD는 IL-15 폴리펩타이드이다. 상이한 전구체 단백질을 생성하는 대안의 스플라이싱에 의해 형성된 2개의 아이소폼을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 실시형태에서, wt. IL-15 폴리펩타이드는 단일 펩타이드로서 aa 1 내지 29, 및 프로펩타이드로서 30 내지 48을 갖는 서열: MRISKPHLRS ISIQCYLCLL LNSHFLTEAG IHVFILGCFS AGLPKTEANW VNVISDLKKI EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANN SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS(서열번호 54), UniProtKB - P40933, NCBI 참조 NP_000576.1, IL-15 프레단백질을 갖는다.
본 개시내용의 목적을 위해 아이소폼 1로서 나타내는 성숙 IL-15 폴리펩타이드는 형태 NW VNVISDLKKI EDLIQSMHID ATLYTESDVH PSCKVTAMKC FLLELQVISL ESGDASIHDT VENLIILANN SLSSNGNVTE SGCKECEELE EKNIKEFLQS FVHIVQMFIN TS(서열번호 55)를 가질 수 있다.
IL-15는 IL-2와 구조적으로 유사하고, IL-2 수용체와 동일한 베타 및 감마 쇄를 갖지만 별개의 IL-15 수용체 알파 (IL-15Rα) 서브유닛을 갖는 세포 표면 삼량체 수용체를 통해 신호를 전달한다. IL-15Rα 아이소폼 1 전구체 단백질의 아미노산 서열은 신호 서열을 형성하는 aa 1 내지 30, 및 성숙 폴리펩타이드의 aa 펩타이드 31 내지 267을 갖는, MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA KNWELTASAS HQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVE MEAMEALPVT WGTSSRDEDL ENCSHHL(서열번호 56) NCBI Ref NP_002180일 수 있다. IL-2Rβ, 및 IL-2Rγ의 서열은 서열번호 11 및 12로서 제공된다.
일부 경우에, 변이체 IL-15 아이소폼 1 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 55의 변이체)는 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때 성숙 IL-15 수용체 서열(예를 들어, 서열번호 11, 12 및 56에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-15 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, IL-15 폴리펩타이드의 변이체(예를 들어, 서열번호 55의 변이체)는 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-15 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 11, 12 및 56에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-15 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 55의 변이체)는 서열번호 11, 12 및 56에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-15 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 55의 변이체)는 서열번호 11, 12 및 56에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-15 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 55의 변이체)는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 55의 변이체)는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-15 폴리펩타이드는 서열번호 55에 제시된 IL-15 폴리펩타이드 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-15폴리펩타이드 서열은 서열번호 55의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 적어도 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 aa 서열 동일성을 갖고, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
12
IL-21 및 이의 변이체
일부 경우에, 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD는 IL-21 폴리펩타이드이다. 상이한 전구체 단백질을 생성하는 대안의 스플라이싱에 의해 형성된 2개의 아이소폼을 포함하는 IL-21 폴리펩타이드의 서열은 당업계에 공지되어 있다.
실시형태에서, 야생형(wt.) IL-21 아이소폼 1 폴리펩타이드는 서열 MRSSPGNMER IVICLMVIFL GTLVHKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS(서열번호 57), UniProtKB - Q9HBE4, NCBI Ref. NP_068575.1, 단일 펩타이드로서 aa 1 내지 29를 갖는 IL-21 단백질을 갖는다.
성숙 IL-21 아이소폼 1 폴리펩타이드는 aa 서열 Q GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS(서열번호 58)를 가질 수 있다.
실시형태에서, 야생형(wt.) IL-21 아이소폼 2 폴리펩타이드는 서열 MRSSPGNMER IVICLMVIFL GTLVHKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKMIHQ HLSSRTHGSE DS(서열번호 59), NP_001193935.1, 단일 펩타이드로서 aa 1 내지 29를 갖는 IL-21 단백질을 갖는다.
성숙 IL-21 아이소폼 2 폴리펩타이드는 aa 서열 MRSSPGNMER IVICLMVIFL GTLVHKSSSQ GQDRHMIRMR QLIDIVDQLK NYVNDLVPEF LPAPEDVETN CEWSAFSCFQ KAQLKSANTG NNERIINVSI KKLKRKPPST NAGRRQKHRL TCPSCDSYEK KPPKEFLERF KSLLQKVSTL SFI(서열번호 60)을 가질 수 있다.
IL-21은 IL-2 수용체와 동일한 감마 쇄를 갖지만 별개의 IL-21R 수용체 서브유닛을 갖는 이량체 세포 표면 수용체를 통해 신호를 전달한다. 인간 IL-21R 아이소폼 1 전구체 단백질의 aa 서열은 MPRGWAAPLL LLLLQGGWGC PDLVCYTDYL QTVICILEMW NLHPSTLTLT WQDQYEELKD EATSCSLHRS AHNATHATYT CHMDVFHFMA DDIFSVNITD QSGNYSQECG SFLLAESIKP APPFNVTVTF SGQYNISWRS DYEDPAFYML KGKLQYELQY RNRGDPWAVS PRRKLISVDS RSVSLLPLEF RKDSSYELQV RAGPMPGSSY QGTWSEWSDP VIFQTQSEEL KEGWNPHLLL LLLLVIVFIP AFWSLKTHPL WRLWKKIWAV PSPERFFMPL YKGCSGDFKK WVGAPFTGSS LELGPWSPEV PSTLEVYSCH PPRSPAKRLQ LTELQEPAEL VESDGVPKPS FWPTAQNSGG SAYSEERDRP YGLVSIDTVT VLDAEGPCTW PCSCEDDGYP ALDLDAGLEP SPGLEDPLLD AGTTVLSCGC VSAGSPGLGG PLGSLLDRLK PPLADGEDWA GGLPWGGRSP GGVSESEAGS PLAGLDMDTF DSGFVGSDCS SPVECDFTSP GDEGPPRSYL RQWVVIPPPL SSPGPQAS(서열번호 61) NCBI Ref Seq. NP_068570.1일 수 있고, 신호 서열을 형성하는 aa 1 내지 19, 성숙 폴리펩타이드의 aa 20 내지 538, 막관통 도메인의 aa 233..253, 및 엑토 도메인의 aa 20 내지 232를 갖는다.
일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드는 서열번호 58 또는 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 wt. IL-21 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때 성숙 IL-21 수용체 서열(예를 들어, 서열번호 12 및 61에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-21 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 서열번호 58 또는 60을 포함하는 IL-21 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 58 또는 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 wt. IL-21 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 서열번호 12 및 61에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-21 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 58 또는 60의 변이체)는 IL-21 수용체(예를 들어, 서열번호 12 및 61에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)이다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 58 또는 60의 변이체)는 성숙 IL-21 수용체(예를 들어, 서열번호 12 및 61에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)의 모두 또는 일부에 대한 결합 친화도가 100nM 내지 100μM(예를 들어, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 또는 10μM 내지 100μM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 58 또는 60의 변이체)는 IL-21 수용체의 모두 또는 일부(예를 들어, 서열번호 12 및 61에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 58 또는 60의 변이체)는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 58 또는 60의 변이체)는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-21 폴리펩타이드는 서열번호 58 또는 60에 제시된 IL-21 폴리펩타이드 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 IL-21폴리펩타이드 서열은 서열번호 58 또는 60의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 적어도 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 aa 서열 동일성을 갖고, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
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IL-23 및 이의 변이체
일부 경우에, 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD는 IL-23 폴리펩타이드이다. IL-23은 IL-23A(IL-23p19) 서브유닛 및 IL-12B(IL-12p40) 서브유닛(IL-12와 공유됨)으로 구성된 이형이량체 사이토카인이다.
실시형태에서, 야생형(wt.) IL-23A 폴리펩타이드는 단일 펩타이드로서 aa 1 내지 19, 및 성숙 펩타이드로서 20 내지 189를 갖는 서열: MLGSRAVMLL LLLPWTAQGR AVPGGSSPAW TQCQQLSQKL CTLAWSAHPL VGHMDLREEG DEETTNDVPH IQCGDGCDPQ GLRDNSQFCL QRIHQGLIFY EKLLGSDIFT GEPSLLPDSP VGQLHASLLG LSQLLQPEGH HWETQQIPSL SPSQPWQRLL LRFKILRSLQ AFVAVAARVF AHGAATLSP(서열번호 62), NCBI 참조 서열 NP_057668.1 단백질을 갖는다.
성숙 IL-23A 폴리펩타이드는 aa 서열: R AVPGGSSPAW TQCQQLSQKL CTLAWSAHPL VGHMDLREEG DEETTNDVPH IQCGDGCDPQ GLRDNSQFCL QRIHQGLIFY EKLLGSDIFT GEPSLLPDSP VGQLHASLLG LSQLLQPEGH HWETQQIPSL SPSQPWQRLL LRFKILRSLQ AFVAVAARVF AHGAATLSP(서열번호 63)를 가질 수 있다.
실시형태에서, 야생형 (wt) IL-12B 폴리펩타이드는 단일 펩타이드로서 aa 1 내지 22, 및 성숙 펩타이드로서 23 내지 328를 갖는 서열: MCHQQLVISW FSLVFLASPL VAIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS(서열번호 64), UniProtKB - P29460 단백질을 갖는다.
성숙 IL-12B 폴리펩타이드는 aa 서열: IWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS(서열번호 65)를 가질 수 있다.
IL-23은 IL-23 수용체 폴리펩타이드(IL-23R) 및 12RB1 또는 12Rβ1로 나타내는 IL-12 수용체와 공통적으로 갖는 서브유닛으로 이루어진 이량체 세포 표면 수용체를 통해 신호를 전달한다.
IL-23R 아이소폼 1 전구체 단백질 서열은 신호 서열을 형성하는 aa 1 내지 23, 성숙 폴리펩타이드의 aa 24 내지 629, 막관통 도메인의 aa 356 내지 376 및 엑토도메인의 aa 24 내지 355를 갖는: MNQVTIQWDA VIALYILFSW CHGGITNINC SGHIWVEPAT IFKMGMNISI YCQAAIKNCQ PRKLHFYKNG IKERFQITRI NKTTARLWYK NFLEPHASMY CTAECPKHFQ ETLICGKDIS SGYPPDIPDE VTCVIYEYSG NMTCTWNAGK LTYIDTKYVV HVKSLETEEE QQYLTSSYIN ISTDSLQGGK KYLVWVQAAN ALGMEESKQL QIHLDDIVIP SAAVISRAET INATVPKTII YWDSQTTIEK VSCEMRYKAT TNQTWNVKEF DTNFTYVQQS EFYLEPNIKY VFQVRCQETG KRYWQPWSSL FFHKTPETVP QVTSKAFQHD TWNSGLTVAS ISTGHLTSDN RGDIGLLLGM IVFAVMLSIL SLIGIFNRSF RTGIKRRILL LIPKWLYEDI PNMKNSNVVK MLQENSELMN NNSSEQVLYV DPMITEIKEI FIPEHKPTDY KKENTGPLET RDYPQNSLFD NTTVVYIPDL NTGYKPQISN FLPEGSHLSN NNEITSLTLK PPVDSLDSGN NPRLQKHPNF AFSVSSVNSL SNTIFLGELS LILNQGECSS PDIQNSVEEE TTMLLENDSP SETIPEQTLL PDEFVSCLGI VNEELPSINT YFPQNILESH FNRISLLEK(서열번호 66) NCBI 참조 서열NP_653302.2일 수 있다.
12RB1 아이소폼 1 전구체 단백질 aa 서열은 신호 서열을 형성하는 aa 1 내지 23, 성숙 폴리펩타이드의 aa 24 내지 662, 막관통 도메인의 aa 546 내지 570, 및 엑토도메인의 aa 24 내지 545를 갖는: MEPLVTWVVP LLFLFLLSRQ GAACRTSECC FQDPPYPDAD SGSASGPRDL RCYRISSDRY ECSWQYEGPT AGVSHFLRCC LSSGRCCYFA AGSATRLQFS DQAGVSVLYT VTLWVESWAR NQTEKSPEVT LQLYNSVKYE PPLGDIKVSK LAGQLRMEWE TPDNQVGAEV QFRHRTPSSP WKLGDCGPQD DDTESCLCPL EMNVAQEFQL RRRQLGSQGS SWSKWSSPVC VPPENPPQPQ VRFSVEQLGQ DGRRRLTLKE QPTQLELPEG CQGLAPGTEV TYRLQLHMLS CPCKAKATRT LHLGKMPYLS GAAYNVAVIS SNQFGPGLNQ TWHIPADTHT EPVALNISVG TNGTTMYWPA RAQSMTYCIE WQPVGQDGGL ATCSLTAPQD PDPAGMATYS WSRESGAMGQ EKCYYITIFA SAHPEKLTLW STVLSTYHFG GNASAAGTPH HVSVKNHSLD SVSVDWAPSL LSTCPGVLKE YVVRCRDEDS KQVSEHPVQP TETQVTLSGL RAGVAYTVQV RADTAWLRGV WSQPQRFSIE VQVSDWLIFF ASLGSFLSIL LVGVLGYLGL NRAARHLCPP LPTPCASSAI EFPGGKETWQ WINPVDFQEE ASLQEALVVE MSWDKGERTE PLEKTELPEG APELALDTEL SLEDGDRCKA KM(서열번호 67) NCBI 참조 서열NP_005526.1일 수 있다.
일부 경우에, 변이체 IL-23(예를 들어, 서열번호 63 및/또는 65의 변이체를 포함) 폴리펩타이드는 서열번호 63 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-23 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때 성숙 IL-23 수용체 서열(예를 들어, 서열번호 66 및 67에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 IL-23 수용체, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, IL-23 폴리펩타이드의 변이체(예를 들어, 서열번호 63 및/또는 65의 변이체를 포함)는 서열번호 63 또는 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL-23 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 IL-23 수용체(예를 들어, 서열번호 66 및 67에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 63 및/또는 65의 변이체를 포함)는 IL-23 수용체(예를 들어, 서열번호 66 및 67에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 63 및/또는 65의 변이체를 포함)는 성숙 IL-23 수용체(예를 들어, 서열번호 66 및 67에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함함, 예컨대, 이들의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 63 및/또는 65의 변이체를 포함)는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 63 및/또는 65의 변이체를 포함)는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 IL-23 폴리펩타이드는 서열번호 63 및/또는 65에 제시된 IL-23 폴리펩타이드 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 IL-23 폴리펩타이드 서열은 서열번호 63 및/또는 65의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 220, 적어도 240, 적어도 260, 적어도 280, 적어도 300, 적어도 320 또는 적어도 340개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖고, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
14
Fas 리간드(FasL) 및 이의 변이체
일부 경우에, 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD는 Fas 리간드(FasL)이다. FasL은 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리에서 동형 II형 막관통 단백질이다. FasL은 표적 세포의 세포자멸사를 야기하는 사멸-유도 복합체를 형성하는 표적 세포에서의 Fas 수용체의 삼량체화에 의해 신호를 전달한다. 가용성 FasL은 보존된 부위에서 막-결합 FasL의 기질 금속 단백분해효소-7(MMP-7) 절단으로부터 초래된다.
실시형태에서, wt. 호모 사피엔스 FasL 단백질은 서열
MQQPFNYPYP QIYWVDSSAS SPWAPPGTVL PCPTSVPRRP GQRRPPPPPP PPPLPPPPPP PPLPPLPLPP LKKRGNHSTG LCLLVMFFMV LVALVGLGLG MFQLFHLQKE LAELRESTSQ MHTASSLEKQ IGHPSPPPEK KELRKVAHLT GKSNSRSMPL EWEDTYGIVL LSGVKYKKGG LVINETGLYF VYSKVYFRGQ SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMM SYCTTGQMWA RSSYLGAVFN LTSADHLYVN VSELSLVNFE ESQTFFGLYK L(서열번호 143), NCBI 참조 서열NP_000630.1, UniProtKB - P48023을 갖고, 잔사 1 내지 80은 세포질이고, 810102는 막관통 도메인이며, aa 103 내지 281은 세포외(엑토도메인)이다.
적합한 FasL 폴리펩타이드는 FasL QLFHLQKE LAELRESTSQ MHTASSLEKQ IGHPSPPPEK KELRKVAHLT GKSNSRSMPL EWEDTYGIVL LSGVKYKKGG LVINETGLYF VYSKVYFRGQ SCNNLPLSHK VYMRNSKYPQ DLVMMEGKMM SYCTTGQMWA RSSYLGAVFN LTSADHLYVN VSELSLVNFE ESQTFFGLYK L.(서열번호 144)의 엑토도메인의 모두 또는 일부를 포함한다.
Fas 수용체는 서열
MLGIWTLLPL VLTSVARLSS KSVNAQVTDI NSKGLELRKT VTTVETQNLE GLHHDGQFCH KPCPPGERKA RDCTVNGDEP DCVPCQEGKE YTDKAHFSSK CRRCRLCDEG HGLEVEINCT RTQNTKCRCK PNFFCNSTVC EHCDPCTKCE HGIIKECTLT SNTKCKEEGS RSNLGWLCLL LLPIPLIVWV KRKEVQKTCR KHRKENQGSH ESPTLNPETV AINLSDVDLS KYITTIAGVM TLSQVKGFVR KNGVNEAKID EIKNDNVQDT AEQKVQLLRN WHQLHGKKEA YDTLIKDLKK ANLCTLAEKI QTIILKDITS DSENSNFRNE IQSLV(서열번호 145) NCBI 참조 서열: NP_000034.1, UniProtKB - P25445를 가질 수 있으며, aa 26 내지 173은 엑토도메인(세포외 도메인)을 형성하고, aa 174 내지 190은 막관통 도메인을 형성하며, 191 내지 335는 세포질 도메인을 형성한다. 엑토도메인은 FasL과의 결합 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 144의 변이체를 포함)는 서열번호 144에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FasL 폴리펩타이드의 결합 친화도와 비교할 때, 성숙 Fas 수용체 서열(예를 들어, 서열번호 145에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함하는 FasL 수용체, 예컨대, 이의 엑토도메인)에 대해 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 144의 변이체를 포함)는 서열번호 144에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FasL 폴리펩타이드의 결합 친화도보다 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만인 결합 친화도로 Fas 수용체(예를 들어, 서열번호 145에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이의 엑토도메인)에 결합한다.
일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 144의 변이체를 포함)는 Fas 수용체(예를 들어, 서열번호 145에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 1nM 내지 1mM(예를 들어, 1nM 내지 10nM, 10nM 내지 100nM, 100nM 내지 1μM, 1μM 내지 10μM, 10μM 내지 100μM, 또는 100μM 내지 1mM)이다. 다른 예로서, 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 144의 변이체를 포함)는 성숙 Fas 수용체(예를 들어, 서열번호 145에 제시된 폴리펩타이드의 모두 또는 일부를 포함, 예컨대, 이의 엑토도메인)에 대한 결합 친화도가 약 100nM 내지 약 200nM, 약 200nM 내지 약 300nM, 약 300nM 내지 약 400nM, 약 400nM 내지 약 500nM, 약 500nM 내지 약 600nM, 약 600nM 내지 약 700nM, 약 700nM 내지 약 800nM, 약 800nM 내지 약 900nM, 약 900nM 내지 약 1μM, 약 1μM 내지 약 5μM, 약 5μM 내지 약 10μM, 약 10μM 내지 약 20μM, 약 20μM 내지 약 30μM, 약 30μM 내지 약 50μM, 약 50μM 내지 약 75μM, 또는 약 75μM 내지 약 100μM이다.
일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 144의 변이체를 포함)는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 단일 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 144의 변이체를 포함)는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 내지 10 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 2 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 3 aa 또는 4 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 5 aa 또는 6 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 7 aa 또는 8 aa 치환을 갖는다. 일부 경우에, 변이체 FasL 폴리펩타이드는 서열번호 144에 제시된 FasL 폴리펩타이드 서열에 비해 9 aa 또는 10 aa 치환을 갖는다.
적합한 변이체 FasL 폴리펩타이드 서열은 서열번호 144(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160 또는 적어도 180개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
E. 스캐폴드
스캐폴드 폴리펩타이드는 특히 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 다른 성분이 조직화될 때 프레임워크를 제공하는 구조적 요소로서 작용한다(예를 들어, IgFc 스캐폴드를 갖는 도 1, 구조 A 참조). TGF-β 폴리펩타이드 및 TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하는 폴리펩타이드 서열이 트랜스로(복합체의 상이한 폴리펩타이드 상에) 위치되는 경우에, 종간 및 비-종간 이중가닥(또는 보다 고차 구조)을 형성하는 스캐폴드 서열은 복합체가 TGF-β 폴리펩타이드 서열과 개방 형태이고 (마스킹 서열과 직접 접촉하지 않는) 다른 분자와 상호작용할 수 있는 기간 동안조차 TGF-β 폴리펩타이드와 회합된 마스킹 폴리펩타이드 서열을 유지할 수 있다. 스캐폴드의 특성에 따라서, 이는 또한 단백질 폴딩 및 이량체화 또는 다량체화(예를 들어, 이량체화 서열을 통해 수행된 동형이량체화 또는 이형이량체화)에 대해 보다 고차 구조를 제공하는 조직화된 요소로서 작용할 수 있다. 스캐폴드는 또한 면역글로불린 중쇄 불변 영역(예를 들어, Ig Fc)인 경우에 혈청 안정성에 기여할 수 있다. 적합한 스캐폴드 폴리펩타이드는 일부 경우에 반감기 연장 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 경우에, 적합한 스캐폴드 폴리펩타이드는 상이한, 비-면역글로불린 서열이 있는 스캐폴드 폴리펩타이드를 갖는 대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 비교할 때, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 생체내 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배 또는 100배 초과만큼 증가시킨다. 예로서, 일부 경우에 Ig Fc 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 종간 Ig 서열, 예컨대, 노브-인-홀 서열쌍을 포함)은 링커(예를 들어, 동일한 서열 길이의 GGGS aa 반복부)로 대체된 Ig Fc 폴리펩타이드 서열을 갖는 대조군 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 비교할 때 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 안정성 및/또는 생체내 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 증가시킨다. 생체내 반감기의 증가는 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 25배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 또는 100배 초과만큼일 수 있다. Ig Fc 폴리펩타이드가 마스킹된 TGF-β 작제물에서 사용되는 경우, Ig Fc는 마스킹된 TGF-β 작제물의 이량체의 자발적 형성을 방지할 돌연변이를 포함할 수 있고(예를 들어, 문헌[Tianlei Ying et al., J. Biol. Chem., 287 (23), pp 19399-19408 (June 1, 2012)]), 추가적으로, 예를 들어, 상보체-의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 세포 용해를 유도하는 Ig 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 감소 또는 제거하는 돌연변이(예를 들어, 이하에 논의하는 LALA 돌연변이)를 포함할 수 있다.
마스킹된 TGF-β 작제물의 스캐폴드 폴리펩타이드 서열이 스캐폴드가 다른 스캐폴드 분자와 상호작용하는(특이적으로 결합하는) 것을 가능하게 하는 하나 이상의 서열을 포함하는 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물은 동형이량체 복합체(예를 들어, 도 1, 구조 B 참조) 또는 이형이량체 복합체(예를 들어, 도 1, 구조 C 내지 F 참조)를 형성할 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물은 또한 스캐폴드가 보다 고차의 구조를 형성하는 다른 스캐폴드 분자와 상호작용하는(특이적으로 결합하는) 것을 가능하게 하는 하나 이상의 aa 서열을 포함할 수 있다. 보다 고차의 다량체 구조를 형성하는 서열은 보다 고차(예를 들어, 삼량체, 사량체, 오량체 등)의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 형성을 가능하게 한다. 예로서, IgM Fc 영역을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 83)는 오량체(특히 j-쇄 서열이 또한 발현될 때, 예를 들어, 서열번호 84) 또는 육량체 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 형성을 가능하게 한다. 문헌[ et al., Med Hypotheses. 77(6):959-61 (2011)]. 동형- 및 이형-이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 형태로 마스킹된 TGF-β 작제물은 마스킹된 TGF-β 복합체로서 지칭된다.
마스킹된 TGF-β를 하나 이상의 다른 폴리펩타이드 서열(예컨대, 하나 이상의 특이적 MOD 또는 MOD의 복제물)와 합치는 것이 바람직한 경우, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 이들의 상대 종간 결합(이량체화) 서열과 이형이량체를 형성하는 경향이 있는 종간 이량체화 서열을 포함할 수 있다. 종간 결합 서열은 일부 예에서 동형이량체를 형성할 수 있지만, 이들의 상대 종간 결합 서열과 우선적으로 이량체화할 수 있다(더 강하게 결합할 수 있다). 따라서, 특이적 이형이량체는 종간 이량체화 서열 및 이의 상대 종간 결합 서열이 폴리펩타이드 쌍에 혼입될 때 형성될 수 있다(경향이 있을 수 있다). 예로서, 종간 이량체화 서열 및 이의 상대가 이형이량체를 선택적으로 형성하는 폴리펩타이드 쌍에 혼입되는 경우에, 펩타이드의 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 초과의 등몰 혼합물은 이형이량체 형성에 관여하며, 펩타이드의 나머지는 단량체 또는 동형이량체로서 존재한다.
서로 또는 그 자체가 충분한 친화도로 특이적으로 결합하는 다양한 aa 서열은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 이량체화 서열로서 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0138440호 참조). 서열은 상대적으로 빽빽한 크기를 가질 수 있다(예를 들어, 약 300, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75 또는 50 aa 미만). 이량체화/다량체화 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Ig Fc) 폴리펩타이드 서열(면역글로불린의 CH2-CH3 영역을 포함하는 서열; 예를 들어, 도 2A 내지 도 2H 및 서열번호 68 내지 83); Fc 노브-인-홀 서열(예를 들어, 서열번호 77 및 78); 콜라겐 반복부 Gly-Xaa-Yaa로 이루어진 콜라겐 도메인을 함유하는 콜렉틴 패밀리의 폴리펩타이드(예를 들어, ACRP30 또는 ACRP30-유사 단백질); 또꼬인 나선 도메인; 류신-지퍼 도메인; Fos/Jun 결합쌍; Ig 중쇄 영역 1(CH1) 및 경쇄 불변 영역 CL 서열(CH1/CL 쌍, 예컨대, κ 또는 λ Ig 경쇄 불변 영역 서열과 짝지어진 CH1 서열)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 이량체화 또는 다량체화 서열로서 작용하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH2-CH3) 폴리펩타이드 서열을 포함한다(예를 들어, 도 2A 내지 도 2H 및 서열번호 68 내지 83). 실시형태에서, Ig 폴리펩타이드는, 예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)의 활성화를 통해 세포 용해를 실질적으로 유도하지 않을 것이고, 따라서 세포 용해를 유도하는 Ig 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 감소 또는 제거하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 경우에, Fc 서열은 도 2A 내지 도 2H에 도시된 Fc 영역의 aa 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는다. 이러한 면역글로불린 서열은 마스킹된 TGF-β 복합체의 폴리펩타이드를 1 또는 2개의 쇄간 이황화결합을 형성함으로써 함께 공유적으로 연결할 수 있다. 이하에 논의되는 바와 같이, 특히 종간 Ig 서열의 쌍, 예컨대 노브-인-홀 폴리펩타이드 쌍이 사용되는 경우에, 이량체를 안정화하는 데 추가적인 이황화결합이 도입될 수 있다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2A에 도시된 IgA Fc 서열(서열번호 68)의 적어도 150개의 인접한 aa(적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 325, 또는 적어도 350개의 인접한 aa), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2B에 도시된 IgD Fc 서열(서열번호 69)의 적어도 150개의 인접한 aa(적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 325, 또는 적어도 350개의 인접한 aa), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2C에 도시된 IgE Fc 서열(서열번호 70)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 200개의 인접한 aa), 또는 모든 aa은 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 wt. IgG Fc 폴리펩타이드 서열, 예컨대 도 2D에 도시된 IgG1 Fc 서열(서열번호 71 내지 78)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175 또는 적어도 200개의 인접한 aa), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2E에 도시된 IgG2 Fc 폴리펩타이드 서열(서열번호 79)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275 또는 적어도 300), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2F에 도시된 IgG3 Fc 서열(서열번호 80)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 또는 적어도 225)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2G에 도시된 IgG4 Fc 서열(서열번호 81 또는 82)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225 또는 적어도 250)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2H에 도시된 IgM Fc 폴리펩타이드 서열(서열번호 83)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225 또는 적어도 250)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. (예를 들어, 도 2A 내지 도 2H에 도시된) 면역글로불린 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 복합체의 상기-열거된 폴리펩타이드는 이들의 힌지 영역에 인접한 시스테인 사이에 1 또는 2개의 쇄간 이황화결합의 형성에 의해 함께 공유적으로 연결될 수 있다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 도 2D에 도시된 인간 IgG1 Fc 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 90%, 95%, 98%, 99%또는 100%) aa 서열 동일성을 갖고, N297의 알라닌으로의 치환(N297A 치환 또는 도 2D에 넘버링된 바와 같은 N77, 서열번호 74) 치환을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 아스파라긴이 아닌 aa으로의 N297의 치환(도 2D에 도시된 aa 서열의 N77)을 제외하고, 도 2D에 도시된 aa 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. N297에서의 치환은 탄수화물 변형 및 wt. 단백질에 비해 감소된 보체 성분 1q("C1q") 결합을 갖는 얻어진 항체 서열, 그에 따른 보체-의존적 세포독성의 감소를 야기한다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 류신이 아닌 aa으로의 L234의 치환(도 2D에 도시된 aa 서열의 L14)을 제외하고, 도 2D에 도시된 aa 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. IgG의 더 낮은 힌지 영역(예를 들어, 서열번호 71의 aa 14 내지 19에 대응하는 aa 234-LLGGPS-239)에서 L234 및 다른 aa은 Fc 람다 수용체(FcλR)에 대한 결합에 연관되고, 따라서, 해당 위치에서 (wt. 단백질에 대해) 수용체에 대한 결합을 감소시킨다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 류신이 아닌 aa으로의 L235의 치환(도 2D에 도시된 aa 서열의 L15)을 제외하고, 도 2D에 도시된 aa 서열(인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 L234A 및 L235A("LALA") 치환(도 2D에 도시된 wt. aa 서열의 14 및 15번 위치에 대응하는 위치; 예를 들어, 서열번호 75 참조)을 갖는 도 2D에 도시된 aa 서열(예를 들어, wt. 인간 IgG1 서열)을 포함한다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 프롤린이 아닌 aa으로의 P331의 치환(도 2D에 도시된 aa 서열의 P111)을 갖는 도 2D에 도시된 aa 서열(인간 IgG1 Fc)을 ?l함하고; 일부 경우에, 치환은 P331S 치환이다. N297에서의 치환과 같은 P331에서의 치환은 wt. 단백질에 비해 C1q에 대해 감소된 결합을 야기하고, 그에 따른 보체-의존적 세포독성의 감소를 야기한다. 예를 들어, 알라닌으로의 D270, K322 및/또는 P329(도 2D에서 서열번호 71의 D50, K122 및 P119에 대응)의 치환은 C1q에 대한 결합을 감소시키기 위해 단독으로 또는 P331 치환 대신에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 L234A 및/또는 L235A 치환(도 2D에 도시된 aa 서열의 L14 및/또는 L15에서 류신의 Ala으로의 치환)을 포함하는 IgG1 Fc 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 L234 및/또는 L235(도 2D에 도시된 aa 서열의 L14 및/또는 L15)에서 류신 이외의 aa으로의 치환, 및 P331(도 2D에 도시된 aa 서열의 P111)의 프롤린 이외의 aa으로의 치환을 제외하고, 도 2D에 도시된 서열(wt. 인간 IgG1 Fc)을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 L234F, L235E 및 P331S 치환(도 2D에 도시된 aa 서열의 14, 15 및 111번 aa 위치에 대응)을 포함하는 도 2D에 도시된 "삼중 돌연변이체" aa 서열(서열번호 73)(인간 IgG1 Fc)을 포함한다.
마스킹된 TGF-β 복합체의 두 폴리펩타이드 사이의 비대칭 쌍이 요망되는 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 스캐폴드 폴리펩타이드의 이량체화 서열은 종간 결합 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 종간 결합 서열은 이들의 동족 폴리펩타이드 서열(즉, 종간 서열 및 이의 상대 종간 서열), 특히 면역글로불린 Fc 서열 변이체에 기반한 것을 갖는 이형이량체의 형성을 선호한다. 이러한 종간 폴리펩타이드 서열은 (KiH) 없이 또는 (KiH)s-s와 함께 이황화결합, HA-TF, ZW-1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s 및 A107 서열을 안정화시키는 노브-인-홀을 포함한다. 하나의 종간 결합쌍은 IgG1의 CH3 도메인 계면에서 T366Y 및 Y407T 돌연변이체, 또는 다른 면역글로불린의 대응하는 잔기를 포함한다. 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9:7, 617-621 (1996)]을 참조한다(치환은 문헌[Kabat et al. (1991)]의 EU 넘버링 체계로 나타냄). 제2 종간 결합쌍은 T366W 치환에 의해 노브, 및 상보적 Fc 서열 상의 삼중 치환 T366S, L368A 및 Y407V에 의해 홀의 형성을 수반한다. 문헌[Xu et al. mAbs 7:1, 231-242 (2015)]을 참조한다. 다른 종간 결합쌍은 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 치환을 갖는 제1 Fc 폴리펩타이드 및 S354C 및 T366W 치환을 갖는 제2 Fc 폴리펩타이드를 갖는다(이황화결합은 Y349C와 S354C 사이에 형성될 수 있다). 문헌[Brinkmann and Konthermann, mAbs 9:2, 182-212 (2015)] 참조. 노브-인-홀 변형이 있거나 또는 없는 Fc 폴리펩타이드 서열은 Fc 폴리펩타이드 사이의 이황화결합(예를 들어, 힌지 영역 이황화결합) 형성에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 종간 폴리펩타이드 결합 서열은 이들이 wt에서 나타나는 바와 같은 aa 위치의 넘버링에 대한 상호 참조와 함께 표 1에 요약되어 있다. IgG1 서열(서열번호 71)은 괄호 "{}"에 나타낸 도 2D에 제시된다.
표 1에서 서열의 종간 쌍에 추가로, 종간 서열의 IgG1 CH3 도메인에서 IgA로부터 유래된 45개의 잔기 및 상대 종간 서열 상의 IgA CH3에서 IgG1로부터 유래된 57개의 잔기를 갖는 종간 "SEED" 서열. 문헌[Ha et al., Frontiers in Immunol.7:1-16 (2016)]을 참조한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 발견된 스캐폴드 서열은 노브-인-홀(KiH); 안정화 이황화물을 갖는 노브-인-홀(KiHs-s); HA-TF; ZW-1; 7.8.60; DD-KK; EW-RVT; EW-RVTs-s; A107; 또는 SEED 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 종간 결합 서열 또는 이의 상대 종간 결합 서열을 포함한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 T146W KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 T146W, L148A 및 Y187V KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 스캐폴드 aa 서열 중 하나 또는 둘 다는 Kabat 넘버링을 이용하여 L234 및 L235(예를 들어, L234A/L235A "LALA" 또는 L234F/L235E), N297(예를 들어, N297A), P331(예를 들어, P331S), L351(예를 들어, L351K), T366(예를 들어, T366S), P395(예를 들어, P395V), F405(예를 들어, F405R), Y407(예를 들어, Y407A) 및 K409(예를 들어, K409Y) 중 하나 이상에서 치환을 선택적으로 포함함. 상기 치환은 서열번호 71의 IgG1 서열에서 L14 및 L15(예를 들어, L14A/L15A "LALA" 또는 L14F/L15E), N77(예를 들어, N77A), P111(예를 들어, P111S), L131(예를 들어, L131K), T146(예를 들어, T146S), P175(예를 들어, P175V), F185(예를 들어, F185R), Y187(예를 들어, Y187A), 및 K189(예를 들어, K189Y)에서 나타난다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 T146W KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 T146S, L148A 및 Y187V KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다. 예를 들어, 도 2D 서열번호 77 및 78을 참조한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 T146W 및 S134C KiHs-s 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 T146S, L148A, Y187V 및 Y129C KiHs-s 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 S144H 및 F185A HA-TF 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 Y129T 및 T174F HA-TF 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 T130V, L131Y, F185A, 및 Y187V ZW1 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 T130V, T146L, K172L 및 T174W ZW1 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 K140D, D179M, 및 Y187A 7.8.60 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 E125R, Q127R, T146V, 및 K189V 7.8.60 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 K189D 및 K172D DD-KK 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 D179K 및 E136K DD-KK 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 K140E 및 K189W EW-RVT 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 Q127R, D179V 및 F185T EW-RVT 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 K140E, K189W 및 Y129C EW-RVTs-s 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 Q127R, D179V, F185T 및 S134C EW-RVTs-s 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 K150E 및 K189W A107 치환을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 E137N, D179V 및 F185T A107 치환을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는다.
스캐폴드로서 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 사용에 대한 대안으로서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 형성하거나, 이의 일부인 이량체화 서열로서 중쇄 CH1 서열과 짝지어질 수 있다. 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 Ig CH1 도메인(예를 들어, 서열번호 85의 폴리펩타이드)을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 Ig κ 쇄 불변 영역 서열(서열번호 86)을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 각각 서열번호 85 및/또는 86의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 또는 적어도 110개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 도 2J 및 도 2K 참조. CH1 및 Ig κ 서열은 서로에 대해 이들의 친화도를 증가시키고, 따라서, 이량체화 서열로서 이들을 이용하여 형성된 임의의 이형이량체의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. CH1- Ig κ 이형이량체의 안정성을 증가시키는 치환 중에는 문헌[Chen et al., MAbs, 8(4):761-774 (2016)]에서 MD13 조합으로서 확인된 것이 있다. MD13에서, CH1 및 Igκ 서열 각각에 2개의 치환이 도입된다. CH1 서열은 S64E 및 S66V 치환(도 2J에 나타낸 서열번호 85에서 S70E 및 S72V)을 포함하도록 변형된다. Ig κ 서열은 S69L 및 T71S 치환(도 2K에 나타낸 서열번호 86에서 S68L 및 T70S)을 포함하도록 변형된다.
다른 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 제1 스캐폴드 서열에서 Ig CH1 도메인(예를 들어, 서열번호 85의 폴리펩타이드)을 포함하고, 제2 스캐폴드 서열에서 Ig λ 쇄 불변 영역 서열(서열번호 87)을 포함하며, 여기서, 스캐폴드는 각각 서열번호 85 및/또는 87의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 또는 적어도 110개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 도 2J 및 도 2K를 참조한다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 각각 류신 지퍼 폴리펩타이드를 이량체화 서열로서 포함한다. 류신 지퍼 폴리펩타이드는 서로 결합되어 이량체(예를 들어, 동형이량체)를 형성한다. 류신-지퍼 폴리펩타이드의 비제한적 예는, 예를 들어, 다음의 aa 서열 중 어느 하나의 펩타이드를 포함한다: RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER(서열번호 88); LSSIEKKQEEQTSWLIWISNELTLIRNELAQS(서열번호 89); LSSIEKKLEEITSQLIQISNELTLIRNELAQ(서열번호 90; LSSIEKKLEEITSQLIQIRNELTLIRNELAQ(서열번호 91); LSSIEKKLEEITSQLQQIRNELTLIRNELAQ(서열번호 92); LSSLEKKLEELTSQLIQLRNELTLLRNELAQ(서열번호 93); ISSLEKKIEELTSQIQQLRNEITLLRNEIAQ(서열번호 94). 일부 경우에, 류신 지퍼 폴리펩타이드는 다음의 aa 서열을 포함한다: LEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRLRNRVSQYRTRYGPLGGGK(서열번호 95). 추가적인 류신-지퍼 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 어느 것은 이량체화 서열로서 스캐폴드로서 사용하기에 또는 스캐폴드에 혼입되기에 적합하다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 각각 이량체(예를 들어, 동형이량체)를 형성하는 또꼬인 나선 펩타이드를 포함한다. 또꼬인 나선 폴리펩타이드의 비제한적 예는, 예를 들어, 다음의 aa 서열 중 어느 하나의 펩타이드를 포함한다: LKSVENRLAVVENQLKTVIEELKTVKDLLSN(서열번호 96); LARIEEKLKTIKAQLSEIASTLNMIREQLAQ(서열번호 97); VSRLEEKVKTLKSQVTELASTVSLLREQVAQ(서열번호 98); IQSEKKIEDISSLIGQIQSEITLIRNEIAQ(서열번호 99); LMSLEKKLEELTQTLMQLQNELSMLKNELAQ(서열번호 100).
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 및 제2 폴리펩타이드의 이량체화(동형이량체화)를 가능하게 하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 각각 이황화결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 이러한 폴리펩타이드 서열의 예는 인간 FasL 폴리펩타이드 VDLEGSTSNGRQCAGIRL(서열번호 101); EDDVTTTEELAPALVPPPKGTCAGWMA(서열번호 102); 및 GHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGQMA(서열번호 103)를 포함한다.
다량체화(올리고머화) 서열로서 적합한 펩타이드는 이량체보다 더 큰 마스킹된 TGF-β 복합체(예를 들어, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 등)의 형성을 가능하게 하며, (특히, 도 2I에 제공된 것과 같은 신호 서열을 결여하는 성숙 j-쇄 펩타이드와 조합될 때) 육량체 또는 오량체를 형성하는 IgM 불변 영역(예를 들어, 도 2H 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 삼량체를 형성하는 콜라겐 도메인이 또한 사용될 수 있다. 콜라겐 도메인은 (Gly-Xaa-Xaa)n을 포함하며, 여기서, Xaa는 임의의 aa이거나, 그리고, n이 정수(예를 들어, 10 내지 40)이며; Xaa 및 Yaa는 독립적으로 임의의 aa이고, n은 10 내지 40의 정수이다. Gly-Xaa-Yaa 서열에서, Xaa 및 Yaa는 빈번하게는 각각 Gly-Xaa-Yaa 발생의 25%, 50%, 75%, 80% 90% 또는 95% 초과에서, 또는 Gly-Xaa-Yaa 발생 각각에서 프롤린 및 하이드록시프롤린이다. 일부 경우에, 콜라겐 도메인은 서열 (Gly-Xaa-Pro)n을 포함하며, 여기서 n은 정수(예를 들어, 10 내지 40)이다. 콜라겐 올리고머화 펩타이드는 다음의 aa 서열을 포함할 수 있다: VTAFSNMDDMLQKAHLVIEGTFIYLRDSTEFFIRVRDGWKKLQLGELIPIPADSPPPPALSSNP(서열번호 104).
F. TGF-β 폴리펩타이드
상기 언급한 바와 같이, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드(예를 들어, 하나 이상의 독립적으로 선택된 TGF-β 폴리펩타이드)를 포함한다. TGF-β 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 TGF-β 폴리펩타이드는 TGF-β1 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 TGF-β 폴리펩타이드는 TGF-β2 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 TGF-β 폴리펩타이드는 TGF-β3 폴리펩타이드이다.
TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3 폴리펩타이드 서열이 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 혼입될 수 있지만, 다양한 인자는 특정 TGF-β 폴리펩타이드, 및 특정 서열 및 사용될 aa 치환의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, TGF-β1 및 TGF-β3은 다수의 포유류 세포 시스템(예를 들어, CHO 세포)에서 발현될 때, 이들의 아미노산 서열의 "클리핑"이 실시된다. 또한, 이량체화된 TGF-β(예를 들어, TGF-β2)는 TβR2 수용체에 대해서보다 TβR3(베타 글리칸 수용체)에 대해 보다 높은 친화도를 갖는데, 이는 비-신호전달 TβR3 분자의 거대한 생체내 풀(pool)에 대해 생물학절 활성 마스킹 단백질의 비표적 결합 및 상실을 야기할 수 있다. TβR3에 대한 고친화도 비표적 결합을 최소화하기 위해, 이황화결합에 의해 결합되는 이량체 TGF-β 분자로 이어지는 잔기를 치환하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 시스테인 77(C77)은 시스테인 이외의 아미노산(예를 들어, C77S 치환을 형성하는 세린)에 의해 치환될 수 있다.
적합한 TGF-β 폴리펩타이드는 약 70 aa 내지 약 125 aa의 길이를 가질 수 있고; 예를 들어, 적합한 TGF-β 폴리펩타이드는 약 70 aa 내지 약 80 aa, 약 80 aa 내지 약 90 aa; 약 90 aa 내지 약 100 aa; 약 100 aa 내지 약 105 aa, 약 105 aa 내지 약 110 aa, 약 110 aa 내지 약 112 aa, 약 113 aa 내지 약 120 aa, 또는 약 120 aa 내지 약 125 aa의 길이를 가질 수 있다. 적합한 TGF-β 폴리펩타이드는 인간 TGF-β1 폴리펩타이드, 인간 TGF-β2 폴리펩타이드 또는 인간 TGF-β3 폴리펩타이드의 성숙 형태의 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 또는 적어도 110개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
1
TGF-β1 폴리펩타이드
적합한 TGF-β1 폴리펩타이드는 다음의 TGF-β1 아미노산 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 또는 112 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: AL DTNYCFSSTE KNCCVRQLYI DF R KDLGWKW IHEPKGYHAN FCLGPCPYIW SLDTQYSKVL ALYNQHNPGA SAAP C CVPQA LEPLPIVYY V G R KPKVEQLS NMIVRSCKCS(서열번호 105, 112 aa의 길이); 여기서, TGF-β1 폴리펩타이드는 약 112 aa의 길이를 갖는다. TGF-β1 프레프로단백질은 도 3에서 서열번호 106으로서 제공된다. 아미노산 R25, C77, V92 및 R94는 볼드체이며, 이탤릭체로 표시되어 있다, 도 4 참조.
일부 경우에, 적합한 TGF-β1 폴리펩타이드는 C77S 치환을 포함한다. 따라서, 일부 경우에, 적합한 TGF-β1 폴리펩타이드는 다음의 TGF-β1 아미노산 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 또는 112 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: AL DTNYCFSSTE KNCCVRQLYI DF R KDLGWKW IHEPKGYHAN FCLGPCPYIW SLDTQYSKVL ALYNQHNPGA SAAP S CVPQA LEPLPIVYY V G R KPKVEQLS NMIVRSCKCS(서열번호 107), 여기서, 아미노산 77은 Ser이다. 25, 77, 92 및 94번 위치는 볼드체이며, 이탤릭체이다.
2
TGF-β2 폴리펩타이드
적합한 TGF-β2 폴리펩타이드는 다음의 TGF-β2 아미노산 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 또는 112 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: ALDAAYCFR NVQDNCCLRP LYIDF K RDLG WKWIHEPKGY NANFCAGACP YLWSSDTQHS RVLSLYNTIN PEASASPCCV SQDLEPLTIL YY I G K TPKIE QLSNMIVKSC KCS(서열번호 108), 여기서, TGF-β2 폴리펩타이드는 약 112 aa의 길이를 갖는다. TGF-β2 프레프로단백질은 도 3에서 서열번호 109로서 제공된다. 잔기 Lys 25, Ile 92 및/또는 Lys 94는 볼드체이며, 이탤릭체이다.
일부 경우에, 적합한 TGF-β2 폴리펩타이드는 C77S 치환을 포함한다. 따라서, 일부 경우에, 적합한 TGF-β2 폴리펩타이드는 다음의 TGF-β2 아미노산 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 또는 112 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: ALDAAYCFR NVQDNCCLRP LYIDFKRDLG WKWIHEPKGY NANFCAGACP YLWSSDTQHS RVLSLYNTIN PEASASPSCV SQDLEPLTIL YYIGKTPKIE QLSNMIVKSC KCS(서열번호 110), 여기서, 아미노산 77은 Ser이다.
3
TGF-β3 폴리펩타이드
적합한 TGF-β3 폴리펩타이드는 다음의 TGF-β3 아미노산 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 또는 112 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDF R QDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY Y V G R TPKVEQ LSNMVVKSCK CS(서열번호 111), 여기서, TGF-β3 폴리펩타이드는 약 112 aa의 길이를 갖는다. TGF-β3 아이소폼 1 프레프로단백질은 도 3에서 서열번호 112로서 제공된다. 25, 92 및 94번 위치는 볼드체이며, 이탤릭체이다.
일부 경우에, 적합한 TGF-β3 폴리펩타이드는 C77S 치환을 포함한다. 일부 경우에, 적합한 TGF-β3 폴리펩타이드는 다음의 TGF-β3 아미노산 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 또는 112 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%, aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDF R QDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPSCVP QDLEPLTILY Y V G R TPKVEQ LSNMVVKSCK CS(서열번호 113), 여기서, 아미노산 77은 Ser이다. 25, 92 및 94번 위치는 볼드체이며, 이탤릭체이다.
4
추가적인 TGF-β 폴리펩타이드 서열 변이
TGF-β 분자 이량체화를 변경시키는 서열 변이(예를 들어, 시스테인 77 치환, 예컨대, C77S)에 추가로, 친화도 및 다른 특성에 영향을 미치는 서열 변이를 갖는 TGF-β1-3 폴리펩타이드는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 혼입될 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 마스킹 폴리펩타이드(예를 들어, TβR 폴리펩타이드, 예컨대, TβRII 폴리펩타이드)에 대해 감소된 친화도를 갖는 TGF-β 변이체를 포함할 때, 해당 성분은 더 용이하게 해리되어, 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드를 세포의 TβR 단백질에 더 이용 가능하게 된다. TβRII 단백질은 일반적으로 TGF-β와 상호작용하는 헤테로머 TβR 신호전달 복합체의 제1 펩타이드이기 때문에, TβRII와의 상호작용은 활성 신호전달 복합체에 TGF-β의 유입을 효과적으로 제어한다. 따라서, TβRII에 대한 TGF-β의 친화도를 제어하는 변이체는 활성 신호전달 복합체에 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 유입을 효과적으로 제어한다.
본 개시내용은 서로에 대해 (서열 변이(들) 없이 달리 동일한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 대해) 변경된(예를 들어, 감소된) 친화도를 갖는 변이체 마스킹 TβR(예를 들어, TβRII) 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 TGF-β 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체를 포함하고, 제공한다. TGF-β 폴리펩타이드와 TβR(예를 들어, TβRII) 폴리펩타이드 사이의 친화도는 MOD 및 이들의 co-MOD에 대해 상기 기재한 것과 같은 (BLI)를 이용하여 결정될 수 있다.
a. 추가적인 TGF-β2 서열 변이체
본 개시내용은 마스킹 TβR(예를 들어, TβRII) 폴리펩타이드 서열 및 wt. 또는 변이체 TGF-β2 폴리펩타이드 중 하나를 포함하는 마스킹된 TGF-β2 작제물 및 복합체를 포함하고 제공하며; 여기서, 변이체 폴리펩타이드는 마스킹 TβR에 대해(서열 변이가 없는 달리 동일한 wt. TGF-β 폴리펩타이드 서열에 대해) 감소된 친화도를 갖는다.
본 개시내용은 서열번호 108의 적어도 100개의 인접한 aa에 대해 85% 초과(예를 들어, 90%, 95%, 98% 또는 99% 초과)의 서열 동일성을 갖는 마스킹 TβRII 수용체 서열 및 변이체 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함하고, TβRII 수용체 서열에 대해 변이체 TGF-β2 폴리펩타이드의 친화도를 감소시키는 치환을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 제공한다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Lys 25, Ile 92 및/또는 Lys 94 중 하나 이상, 둘 이상 또는 모두 셋 이상에서 치환을 포함하는 마스킹 TβRII 폴리펩타이드 및 변이체 TGF-β(예를 들어, TGF-β2) 폴리펩타이드를 포함한다(잔기 위치에 대해 서열번호 108, 및 TGF-β1 및 TGF-β3에서 대응하는 잔기에 대해 도 4 참조). 해당 aa 잔기는 TβRII 폴리펩타이드에 대한 TGF-β2의 친화도에 영향을 미치는 것으로 나타났다(문헌[Crescenzo et al., J. Mol. Biol. 355: 47-62 (2006)] 참조). 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD, 예컨대, IL-2 또는 이의 변이체를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 서열번호 108의 25번 위치에서 Lys 또는 Arg이 아닌 aa를 갖는 마스킹 TβRII 폴리펩타이드 및 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함하고; 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 또는 이의 감소된 친화도 변이체)를 포함한다. 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 서열번호 108의 92번 위치에서 Ile 또는 Val 이외의 aa(또는 92번 위치에서 Ile, Val 또는 Leu이 아닌 aa)을 갖는 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함할 수 있고; 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 또는 이의 감소된 친화도 변이체)를 포함한다. 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 서열번호 108의 94번 위치에서 Lys 또는 Arg 이외의 aa을 갖는 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며; 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 또는 이의 감소된 친화도 변이체)를 포함한다. 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Lys 25, Ile 92 및/또는 Lys 94 중 하나 이상, 둘 이상 또는 모두 셋에서 치환을 포함하는 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD를 추가로 포함한다. 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Lys 25, Ile 92 및/또는 Lys 94 중 하나 이상, 둘 이상 또는 모두 셋에서 치환을 포함하는 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 또는 이의 감소된 친화도 변이체를 추가로 포함한다.
b. 추가적인 TGF-β1 및 TGF-β3 서열 변이체
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 TGF-β2 서열번호 108에서 Lys 25, Ile 92 및/또는 Lys 94에 대응하는 하나 이상, 둘 이상 또는 모두 3개의 aa 위치에서 치환을 포함하는 마스킹 TβRII 폴리펩타이드 및 변이체 TGF-β1 또는 TGF-β3 폴리펩타이드를 포함한다. TGF-β1 또는 TGF-β3에서, 대응하는 aa은: Lys 25는 Arg 25이고, Ile 92는 Val 92이며, Lys 94는 Arg 94이고, 이들 각각은 보존적 치환이다. 예를 들어, TGF-β1에 대해 서열번호 106 및 107 및 TGF-β3에 대해 서열번호 112 및 113을 참조한다.
상기 언급한 바와 같이, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD, 예컨대, IL-2 또는 이의 변이체를 포함한다. 일례에서, 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 25번 위치에서 Arg 또는 Lys이 아닌 aa을 갖는 TGF-β1 또는 β3 폴리펩타이드를 포함하고; 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 또는 이의 감소된 친화도 변이체)를 포함한다. 일례에서, 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 92번 위치에서 Val 또는 Ile이 아닌 aa(또는 92번 위치에서 Ile, Val 또는 Leu이 아닌 aa)을 갖는 TGF-β1 또는 β3 폴리펩타이드를 포함하고; 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 또는 이의 감소된 친화도 변이체)를 포함한다. 다른 예에서, 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Arg 또는 Lys이 아닌 aa을 갖는 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함하고; 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD(예를 들어, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 또는 이의 감소된 친화도 변이체)를 포함한다. 하나의 구체적 예에서, 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Arg 25, Val 92 및/또는 Arg 94 중 하나 이상, 둘 이상 또는 모두 셋에서 치환을 포함하는 TGF-β1 또는 β3 폴리펩타이드를 포함하고, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD를 추가로 포함한다. 다른 구체적 예에서, 마스킹 TβRII 폴리펩타이드를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Arg 25, Val 92 및/또는 Arg 94 중 하나 이상, 둘 이상 또는 모두 셋에서 치환을 포함하는 TGF-β1 또는 β3 폴리펩타이드를 포함하고, 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-2 MOD, 또는 이의 감소된 친화도 변이체를 추가로 포함한다.
G. TGF-β 수용체 폴리펩타이드 및 TGF-β에 결합하고 마스킹하는 다른 폴리펩타이드
상기-언급된 TGF-β 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체 중 어느 것에서, TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 마스킹하는 폴리펩타이드("마스킹 폴리펩타이드")는 TβRI, TβRII, TβRIII의 단편 및 항 TGF-β 항체 또는 이들의 단편(예를 들어, Fab, 단일 쇄 항체 등)을 포함하는 다양한 형태를 취할 수 있다.
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TGF-β 수용체 폴리펩타이드
마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에서 TGF-β의 마스킹은 TGF-β 폴리펩타이드(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)에 결합하는 데 충분한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 TGF-β 수용체 단편(예를 들어, TβRI, TβRII 또는 TβRIII의엑토도메인 서열)을 이용함으로써 달성될 수 있다. 실시형태에서, 마스킹 서열은 TβRI, TβRII 또는 TβRIII 엑토도메인의 모두 또는 일부를 포함한다.
a. TGF-β 수용체 I(TβRI)
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 폴리펩타이드 서열 마스킹 TGF-β는 TβRI(예를 들어, 아이소폼 1 서열번호 114)로부터 유래될 수 있고, TβRI 엑토도메인의 모두 또는 일부(aa 34 내지 126)를 포함할 수 있으며, 일부 경우에, 마스킹 TGF-β에 대한 적합한 TβRI 폴리펩타이드는 다음의 TβRI 엑토도메인 aa 서열: LQCFCHL CTKDNFTCVT DGLCFVSVTE TTDKVIHNSM CIAEIDLIPR DRPFVCAPSS KTGSVTTTYC CNQDHCNKIE LPTTVKSSPG LGPVEL(서열번호 115)의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 103 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
b. TGF-β 수용체 II(TβRII)
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 폴리펩타이드 서열 마스킹 TGF-β는 TβRII(예를 들어, 아이소폼 A 서열번호 116)로부터 유래될 수 있고, TβRII 엑토도메인 서열(aa 24 내지 177)의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 마스킹 TGF-β에 대해 적합한 TβRII 아이소폼 A 폴리펩타이드는 다음의 TβRII 아이소폼 A 엑토도메인 aa 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 적어도 154 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: IPPHVQK SDVEMEAQKD EIICPSCNRT AHPLRHINND MIVTDNNGAV KFPQLCKFCD VRFSTCDNQK SCMSNCSITS ICEKPQEVCV AVWRKNDENI TLETVCHDPK LPYHDFILED AASPKCIMKE KKKPGETFFM CSCSS D ECND NIIFSEE(서열번호 117). B 아이소폼에서 D118에 대응하는 아스파르트산 잔기의 위치는 볼드체, 밑줄표시, 및 이탤릭체이다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 폴리펩타이드 서열 마스킹 TGF-β는 TβRII(아이소폼 B 서열번호 118)로부터 유래될 수 있고, TβRII 엑토도메인 서열(aa 24 내지 166)의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 마스킹 TGF-β에 대해 적합한 TβRII 아이소폼 B 폴리펩타이드는 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인 aa 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 적어도 103 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다: IPPHVQKSVN NDMIVTDNNG AVKFPQLCK F C D VRFSTCDN QKSCMSNCSI T S IC E KPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSS D EC NDNIIFSEEY NTSNPDLLLV IFQ(서열번호 119). 이하에 논의하는 바와 같이, F30, D32, S52, E55 또는 D118 중 임의의 하나 이상(이탤릭체 및 볼드체)은 해당 위치에서 천연 유래 aa(예를 들어, 알라닌) 이외의 아미노산에 의해 치환될 수 있다. TGF-β를 마스킹하는 폴리펩타이드 서열은 D118A 또는 D118R 치환을 보유하는 서열번호 119의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 또는 D118R 치환 및 F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 하나 이상을 보유하는 서열번호 119의 펩타이드를 포함할 수 있다.
TβRII의 엑토도메인은 마스킹 폴리펩타이드로서 이용될 수 있지만, 단백질의 해당 영역은 하전되고, 바람직하지 않은 pI를 야기할 수 있는 소수성 패치는 폴리펩타이드를 발현시키는 세포에 대해 독성일 수 있다. 또한, TβRII 엑토도메인을 활성 TGF-β 폴리펩타이드와 조합하는 것은 표면 TβRI와 조합하고 해당 신호전달 수용체의 활성화(예를 들어, Smad 경로를 통한 신호전달)을 야기할 수 있는 복합체를 생성할 수 있다. TβRI 회합에 관여된 서열을 제거 또는 변경시킴으로써 TGF-β를 마스킹하는 데 사용되는 TβRII 엑토도메인 서열을 변형시키는 것은 이들 자신의 세포 표면 이형이량체 TβRI /TβRII 복합체를 통하는 것을 제외하고 마스킹된 TGF-β에 의한 세포의 비의도적인 자극을 피할 수 있다. TβRII의 변형은 또한 TGF-β(예를 들어, TGF-β3)에 대한 TβRII의 친화도를 변경(예를 들어, 감소)시켜, 신호전달 분자로서 TGF-β 비마스킹 및 이의 이용 가능성의 제어를 가능하게 할 수 있다. TGF-β(예를 들어, TGF-β3)에 대해 가장 높은 친화도를 갖는 TβR을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, TβRII) 펩타이드는 TGF-β 서열을 가장 단단하게 마스킹하고, 동일한 효과를 달성하는 데 보다 높은 용량을 필요로 한다. 대조적으로, 친화도를 더 낮추는 TβRII에서의 aa 치환은 TGF-β 폴리펩타이드를 비마스킹하며, 보다 저용량에서 생물학적으로 효과적이다. 예를 들어, 실시예 3을 참조한다.
따라서, TβRI를 통해 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드에 의해 신호전달을 차단/제어하고/하거나 마스킹 TβRII 폴리펩타이드의 친화도를 변형시키는(예를 들어, 감소시키는) 것이 바람직한 경우에, TβRII에 대한 TGF-β 다수의 변경이 TβRII 폴리펩타이드 서열에 혼입될 수 있다. 만들어질 수 있는 변형은 1 내지 25 aa 길이의 N-말단의 25개 아미노산의 상기 언급된 결실(예를 들어, Δ14, Δ25) 및/또는 L27, F30, D32, S49, 150, T51, S52, I53, E55, V77, D118 및/또는 E119 중 하나 이상에서의 치환을 포함한다. TβRII와의 TβRI 회합의 감소 및 TGF-β에 대한 감소된 친화도를 야기하는 일부 구체적인 변형은 서열번호 119에 기반하여 L27A, F30A, D32A, D32N, S49A, I50A, T51A, S52A, S52L, I53A, E55A, V77A, D118A, D118R, E119A 및/또는 E119Q 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 문헌[J. Groppe et al. Mol Cell 29, 157-168, (2008) 및 De Crescenzo et al. JMB 355, 47-62 (2006)] 참조. TGF-β3-TβRII 및 TβRI-TβRII 복합체에 대한 상기 치환의 효과에 대해 도 X를 참조한다. N-말단의 Δ25 결실 및/또는 F24에서의 치환(예를 들어, F24A 치환)을 포함하는 TβRII의 변형은 표준 SMAD 신호전달 경로를 통해 신호를 실질적으로 또는 완전히 차단한다. 일 양상에서, 성숙 TβRII B 아이소폼(서열번호 119)의 118번 위치(D118)에서의 아스파르트산은 Asp 또는 Glu이 아닌 아미노산, 예컨대, Ala에 의해 대체되어 "D118A" 치환을 만들거나, Arg에 의해 D118R 치환을 생성한다. D118에 대응하는 Asp 잔기는 표시된 서열번호 117 내지 123이다(도 5B에서 볼드체 및 밑줄표시됨). 1 내지 25 aa 길이의 N-말단의 결실(예를 들어, Δ25 결실) 및/또는 F24에서의 치환(예를 들어, F24A 치환)은 D118 치환(예를 들어, D118A 또는 D118R)과 조합될 수 있다. 1 내지 25 aa 길이의 N-말단의 결실(예를 들어, Δ25 결실) 및/또는 F24에서의 치환(예를 들어, F24A 치환)은 또한 L27, F30, D32, S49, 150, T51, S52, I53, E55, V77, D118 및/또는 E119 중 어느 것에서의 치환(예를 들어, D118A) 치환, 및 특히 친화도를 변경시키기 위해 상기 기재한 서열번호 119에서의 해당 위치에 대해 열거된 특정 위치 중 어느 것과 조합될 수 있다.
TβRII 폴리펩타이드의 N-말단의 결실은 또한 TβRI 상호작용의 상실을 초래할 수 있으며, TβRII 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체가 TβRI 신호전달과 맞물리고 활성화시키는 구성적으로 활성인 복합체로서 작용하는 것을 방지한다. TβRII 폴리펩타이드의 14 aa 결실(Δ14)은 TβRI와 상기 단백질의 상호작용을 실질적으로 감소시키고, TβRII의 Δ25 aa 결실은 TβRI와의 상호작용을 완전히 없애는 것을 나타난다. N-말단의 결실은 또한 단백질의 pI를 실질적으로 변경시키며, Δ14 TβRII 엑토도메인 돌연변이체는 약 4.5 내지 5.0(예를 들어, 약 4.74)의 pI를 나타낸다. 따라서, TGF-β 작제물 또는 복합체는 N-말단의 결실을 갖는 TβRII 엑토도메인 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 117 또는 118의 폴리펩타이드), 예컨대, 14 내지 25 aa(예를 들어, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 aa)을 포함할 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하는 데 이용될 수 있는 TβRI와의 상호작용을 제한하는 것을 포함하는 변형된 엑토도메인 서열은 다음의 단락에 기재되어 있다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 103 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다: IPPHVQKSVN NDMIVTDNNG AVKFPQLCK F C D VRFSTCDN QKSCMSNCSI T S IC E KPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSS D EC NDNIIFSEE(서열번호 120). F30, D32, S52, E55 또는 D118 중 임의의 하나 이상(이탤릭체 및 볼드체)은 해당 위치에서 천연 유래 aa(예를 들어, 알라닌) 이외의 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 실시형태에서, 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 치환을 보유하는 서열번호 120의 펩타이드를 포함한다. 실시형태에서, 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 치환 및 F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 하나 이상을 보유하는 서열번호 120의 폴리펩타이드를 포함한다.
TβRI와 상호작용하는 마스킹된 TGF-β/TβRII 복합체로 인한 부적절한 세포 신호전달을 차단하는 TβRII의 N-말단의 결실의 조합, 예컨대 14 내지 25 aa(e.g., 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 aa)은 F30, D32, S52, E55 및/또는 D118 중 어느 하나 이상에서의 것을 포함하는 다른 TβRII 엑토도메인 치환과 조합될 수 있다. 결실과 치환의 조합은 세포의 막결합 TβRI & TβRII 수용체를 통하는 것을 제외하고 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 세포 신호전달을 야기하지 않는다는 것을 보장한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 103 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다: TDNNG AVKFPQLCK F C D VRFSTCDN QKSCMSNCSI T S IC E KPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSS D EC NDNIIFSEE(서열번호 121), 이는 aa 1 내지 14가 결실된다(Δ14). F30, D32, S52, E55 또는 D118 중 임의의 하나 이상(이탤릭체 및 볼드체)은 해당 위치에서 천연 유래 aa(예를 들어, 알라닌) 이외의 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 실시형태에서, 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 치환을 보유하는 서열번호 120의 펩타이드를 포함한다. 실시형태에서, 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 치환 및 F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 하나 이상을 보유하는 서열번호 121의 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 하기 서열의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 103 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다: QLCK F C D VRFSTCDN QKSCMSNCSI T S IC E KPQEV CVAVWRKNDE NITLETVCHD PKLPYHDFIL EDAASPKCIM KEKKKPGETF FMCSCSS D EC NDNIIFSEE(서열번호 122), 이는 aa 1 내지 25가 결실된다(Δ25). F30, D32, S52, E55 또는 D118 중 임의의 하나 이상(이탤릭체 및 볼드체)은 해당 위치에서 천연 유래 aa(예를 들어, 알라닌) 이외의 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 실시형태에서, 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 치환을 보유하는 서열번호 122의 폴리펩타이드를 포함한다(도 5B에서 서열번호 123으로서 나타냄). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 치환 및 F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 하나 이상을 보유하는 서열번호 122의 펩타이드를 포함한다. 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 및 F30A 치환을 보유하는 서열번호 122의 펩타이드를 포함한다(도 5B 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 및 D32N 치환을 보유하는 서열번호 122의 펩타이드를 포함한다(도 5B 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 및 S52L 치환을 보유하는 서열번호 122의 펩타이드를 포함한다(도 5B 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 서열 마스킹 TGF-β는 D118A 및 E55A를 보유하는 서열번호 122의 펩타이드를 포함한다(도 5B 참조).
c. TGF-β 수용체 III(TβRIII)
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 폴리펩타이드 서열 마스킹 TGF-β는 TβRIII(예를 들어, 아이소폼 A 서열번호 124 및 아이소폼 B 125)로부터 유래될 수 있고, TβRIII 엑토도메인의 모두 또는 일부(A 아이소폼의 aa 27 내지 787 또는 B 아이소폼의 27 내지 786)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 마스킹 TGF-β에 대한 적합한 TβRIII 폴리펩타이드는 TβRIII A 아이소폼 또는 B 아이소폼 엑토도메인 서열(예를 들어, 도 5C에서 서열번호 124 또는 서열번호 125로서 제공됨)의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 120 aa에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
2
항체
TGF-β 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, 엑토도메인 서열)가 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 작용을 할 수 있지만, TGF-β 서열에 결합하는 다른 폴리펩타이드 서열(단백질 서열)이 또한 마스킹 폴리펩타이드로서 사용될 수 있다. TGF-β를 마스킹하는 데 사용될 수 있는 적합한 폴리펩타이드 또는 단백질 서열 중에는 TGF-β에 대해 친화도를 갖는 항체(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3 중 하나 이상에 특이적인 항체) 또는 이들의 단편, TGF-β 폴리펩타이드에 대해 친화도를 갖는 나노바디, 및 특히 단일 쇄 항-TGF-β 항체(예를 들어, 이 중 어느 것은 인간화될 수 있음)가 있다. TGF-β에 결합하고 이를 중화시키는 scFV 항체를 포함하는 일부 항체가 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,090,685호를 참조한다. 본 개시내용에 기재된 본 발명의 실시형태 및/또는 양상 전체적으로, TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하는 데 사용되는 TβR(예를 들어, TβRII) 서열은 TGF-β 폴리펩타이드에 대해 친화도를 갖는 마스킹 항체 서열(예를 들어, scFV 또는 나노바디)로 대체될 수 있다. 예를 들어, 도 1에서 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 각각에서, TGF-β 수용체 서열이 TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하는 데 사용되는 경우, 수용체 폴리펩타이드는 TGF-β 폴리펩타이드에 대한 친화도를 갖는 마스킹 항체 폴리펩타이드(예를 들어, scFV 또는 나노바디)로 대체될 수 있다.
마스킹 폴리펩타이드로서 항체(예를 들어, 단일 쇄 항체)를 이용하는 것의 한 가지 잠재적 이점은 마스킹될 TGF-β 폴리펩타이드(들)의 아이소폼으로 제한하는 능력이다. 예로서, TGF-β1로 향하는 메텔리무맙(CAT192)에 기반한 단일 쇄 항체 서열(예를 들어, 문헌[Lord et al., mAbs 10(3): 444-452 (2018)])은 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재할 때 해당 TGF-β 아이소폼을 마스킹하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, TGF-β2에 특이적인 단일 쇄 항체 서열은 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재할 때 해당 TGF-β 아이소폼을 마스킹하는 데 사용된다. 다른 실시형태에서, TGF-β3에 특이적인 단일 쇄 항체 서열은 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재할 때 해당 TGF-β 아이소폼을 마스킹하는 데 사용된다. 단일 쇄 항체는 또한 TGF-β1과 TGF-β2; TGF-β1과 TGF-β3; 및 TGF-β2와 TGF-β3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 나타나는 TGF-β 아이소폼(예를 들어, 엑토도메인 서열)의 조합에 특이적일 수 있다. 단일 쇄 항체는 또한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에서 나타나는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 엑토도메인 서열에 pan-특이적일 수 있다, 예를 들어, WO 2014/164709를 참조한다. TGF-β 아이소폼에 대해 목적하는 특이성 및 친화도를 갖는 항체 및 단일 쇄 항체는 표적 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 대해 친화도를 갖는 항체의 가변 영역 서열에 대해 하이브리도마 및/또는 변형(예를 들어, 조합적 변형)을 선별하는 단계를 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 TGF-β 서열(예를 들어, TGF-β3 서열)을 마스킹하기 위해 단일 쇄 항체를 포함한다. 한 가지 이러한 실시형태에서, 단일 쇄 아미노산 서열은 C77S 치환을 포함하는 서열번호 111에 제시된 TGF-β3에 특이적이다(서열번호 112 참조).
H. 링커
상기 언급한 바와 같이, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 임의의 두 요소 사이에 개재된 링커 펩타이드/폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 용어 "링커"가 사용되지만, 링커들과 같이 이하에 기재되는 동일한 서열은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에서, 예를 들어, 단백질 분해에 대한 보호로서 위치될 수 있다.
적합한 링커(또한 "스페이서"로서 지칭됨)는 용이하게 선택될 수 있고, 다수의 적합한 길이, 예컨대, 1 aa 내지 25 aa, 3 aa 내지 20 aa, 2 aa 내지 15 aa, 3 aa 내지 12 aa, 4 aa 내지 10 aa, 5 aa 내지 9 aa, 6 aa 내지 8 aa, 또는 7 aa 내지 8 aa 중 어느 것일 수 있다. 적합한 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 aa 길이일 수 있다. 적합한 링커는 25 내지 35 aa 길이일 수 있다. 적합한 링커는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 aa 길이일 수 있다. 적합한 링커는 또한 35 내지 45 aa 길이일 수 있다. 적합한 링커는 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 aa 길이일 수 있다. 적합한 링커는 45 내지 50 aa 길이일 수 있다. 적합한 링커는 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 aa 길이일 수 있다.
예시적인 링커는 약 2 내지 약 50개(예를 들어, 2 내지 4, 4 내지 7, 7 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 35 또는 35 내지 50개)의 인접한 글리신 잔기로부터의 서열을 포함하는 글리신, 또는 폴리글리신을 포함하는 것; 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 126) 및 (GGGS)n(서열번호 127)을 포하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수임(예를 들어, 1 내지 10, 10 내지 20 또는 20 내지 30)); 글리신-알라닌 중합체 또는 알라닌-세린 중합체(예를 들어, 1 내지 10, 10 내지 20 또는 20 내지 30aa의 길이를 가짐); 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체가 사용될 수 있으며; Gly과 Ser은 둘 다 상대적으로 불포화이고, 따라서 성분 사이의 중성 테터(tether)로서 작용할 수 있다. 글리신 중합체가 사용될 수 있으며; 글리신은 심지어 알라닌보다 상당히 더 많은 파이-프사이 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한되어 있다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 예시적인 링커는 GGSG(서열번호 128), GGSGG(서열번호 129), GSGSG(서열번호 130), GSGGG(서열번호 131), GGGSG(서열번호 132), GSSSG(서열번호 133) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 링커는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복될 수 있는 GGSG(서열번호 134)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 링커는 2, 3 또는 4회 반복될 수 있는 아미노산 서열(GSSSS)(서열번호 135)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 4 또는 5회 반복되는 아미노산 서열(GSSSS)(서열번호 135)을 포함한다. 예시적인 링커는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복될 수 있는 (GGGGS)(서열번호 136)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 링커는 1회 또는 2회 반복되는 아미노산 서열(GGGGS)(서열번호 136)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 3 또는 4회 반복되는 아미노산 서열(GGGGS)(서열번호 136)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 5, 6 또는 7회 반복되는 아미노산 서열(GGGGS)(서열번호 136)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 8, 9 또는 10회 반복되는 아미노산 서열(GGGGS)(서열번호 136)을 포함한다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드에 존재하는 링커 폴리펩타이드는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 제2 폴리펩타이드에 존재하는 시스테인 잔기와 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 예를 들어, 적합한 링커는 아미노산 서열 G C GASGGGGSGGGGS(서열번호 137)를 포함한다.
I. 예시적인 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체
상기 논의한 바와 같이, 본 개시내용에 기재된 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체 중 어느 것에서, TGF-β 폴리펩타이드 서열에 결합하고 이를 마스킹하는 마스킹 폴리펩타이드는 다양한 형태를 취할 수 있다. 마스킹 펩타이드는 항체, 항체의 결합 단편, 단일 쇄 항체 또는 TGF-β에 결합하는 이의 일부(예를 들어, scFv), 또는 나노바디일 수 있으며; 이 중 어느 것은 인간화될 수 있다. 마스킹 폴리펩타이드는 또한 TGF-β 폴리펩타이드(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)에 결합하는 데 충분한 폴리펩타이드 서열을 포함하는 TGF-β 수용체 단편(예를 들어, TβRI, TβRII 또는 TβRIII의 엑토도메인 서열)일 수 있다.
상기-언급된 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체 중 어느 것에서, 사용되는 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3에 기반할 수 있다. 실시형태에서, TGF-β 폴리펩타이드는 TGF-β3 서열을 포함한다. 전장 성숙 TGF-β 단백질 서열은 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 필요하지 않고, TGF-β의 일부만이 세포 표면 TβRII와 상호작용하는 데 필요하며, 세포 표면 TβRII와의 마스킹된 TGF-β 복합체를 허용하여 TβRI를 구성하고 이에 의해 신호전달(예를 들어, Smad 및 non-Smad 경로를 통한 신호전달)을 개시한다.
면역조절 폴리펩타이드(MOD)는 마스킹된 TGF-β의 전달 또는 TβRI 및 TβRII를 보유하는 세포를 활성화시키는 이의 능력에 필요하지 않지만, 상기 언급한 바와 같이, MOD의 존재는 TGF-β 세포 활성화의 결과에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. 결과적으로, 상기-언급된 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체 중 어느 것에서 MOD의 혼입은 본 명세서에 기재된 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 사용으로부터 치료적 결과를 포함하는 다양한 결과를 유도하는 데 사용될 수 있다. 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 MOD는 PD-L1, Fas-L, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-21, IL-23, 및 이들의 co-MOD에 대해 감소된 친화도를 갖는 것을 포함하는 이들의 어느 것의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
MOD를 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체에 혼입시키는 것이 바람직할 수도 있지만, 이들의 존재는 모든 경우에, 특히 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체가 사이토카인(e.g., 하나 이상의 독립적으로 선택된 인터류킨, 림포카인, 인터페론, 케모카인 및/또는 종양 괴사 인자)을 포함하는 다른 물질과 함께 투여되는 경우에 필수적이지 않다. 예를 들어, 인터류킨 7 수용체(예를 들어, IL-7Ra)의 흉선세포 발현을 촉진시킴으로써 통상적인 CD8+ T 세포의 발생(또는 저친화도 CD8+ T 세포의 생존)을 지원하는 것이 바람직한 경우에, MOD 폴리펩타이드가 없는 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체("MOD-less")가 사용될 수 있다. 유사하게, 강한 작용제 리간드에 의해 유도되는 T-세포 집단의 발생을 촉진시키는 것이 바람직한 경우, MOD-함유 또는 MOD-less 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체는 흉선 유래 Treg(tTreg), 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 및 CD8αα+ T-세포 전구체의 생존을 지원하는 데 사용될 수 있다.
다음은 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 비제한적 예이다.
1
마스킹된 TGF-β 작제물
마스킹된 TGF-β 작제물의 경우에, 모든 성분(예를 들어, TGF-β, 스캐폴드, 마스킹 폴리펩타이드, 예컨대, TβRII 서열 및 선택적으로 하나 이상의 MOD)는 단일 폴리펩타이드 쇄의 부분이다(예를 들어, 도 1, 구조 A 참조). 이러한 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드는 다른 스캐폴드 폴리펩타이드를 갖는 이량체 또는 보다 고차의 구조를 형성하지 않으며, 따라서, 마스킹된 TGF-β 작제물은 동형이량체, 이형이량체 또는 보다 고차의 다량체 구조(삼량체 등)의 형태가 아니다.
도 1, 구조 A에서 마스킹된 TGF-β 작제물의 경우에, 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지: 선택적으로 하나 이상의 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 폴리펩타이드; 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 마스킹된 TGF-β 작제물은 하기의 경우를 포함한다:
(i) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβR 폴리펩타이드; 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우;
(ii) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβRII 폴리펩타이드; 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우;
(iii) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβR 폴리펩타이드; 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우;
(iv) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 IL-2 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβR 폴리펩타이드; 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우;
(v) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β3 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβR 폴리펩타이드; 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우;
(vi) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β3 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβRII 폴리펩타이드; 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우; 및
(vii) 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지: 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 IL-2 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); TGF-β3 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβRII 폴리펩타이드; 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열을 포함하는 경우.
본 명세서에 기재된 마스킹된 TGF-β 작제물의 임의의 예에서, TGF-β 폴리펩타이드 서열의 C77은 이량체화를 방지하도록 치환될 수 있고(예를 들어, C77S 치환), MOD 및 TβR 폴리펩타이드 서열에서의 변형에 따라, TGF-β 폴리펩타이드는 (예를 들어, aa 25, 92 및/또는 94 중 하나, 둘 또는 모두 셋에서) 마스킹 TβR 폴리펩타이드에 대한 이들의 친화도를 감소시키는 변형을 추가로 포함할 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물에 혼입될 수 있는 예시적인 TβR 폴리펩타이드 서열은 TβRI 맞물림을 약화시키는 D118A 또는 D118R 치환을 선택적으로 갖는 Δ14 또는 Δ25 TβRII 폴리펩타이드를 포함한다. MOD 변이체는 이들의 폴리펩타이드 서열에 따라 기재되고, TβRI, TβRII 및 TβRIII의 추가적인 변형은 상기 기재되어 있다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물은 서열번호 146에 제시된 서열을 갖는다(도 7A 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물은 서열번호 147에 제시된 서열을 갖는다(도 7B 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물은 서열번호 157에 제시된 서열을 갖는다(도 7G 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물은 서열번호 158에 제시된 서열을 갖는다(도 7H 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물은 서열번호 159에 제시된 서열을 갖는다(도 7I 참조).
2
마스킹된 TGF-β 복합체
마스킹된 TGF-β 복합체는 적어도 2개의 폴리펩타이드, 즉, 제1 및 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 이들 각각은 다른 스캐폴드 폴리펩타이드와 회합되는 스캐폴드 폴리펩타이드를 포함하여, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 함께 복합체가 되게 한다. 결과적으로, TGF-β 폴리펩타이드 복합체는 동형이량체, 이형이량체 또는 보다 고차의 다량체 구조를 형성한다:
(i) 제1 예에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드 서열, 하나 이상의 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 적어도 하나의 폴리펩타이드(예를 들어, 각각의 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 대한 마스킹 서열), 및 선택적으로 도 1, 구조 B에서와 같이 동형이량체(예를 들어, 대칭적 이량체)를 형성하도록 이량체화될 수 있는 스캐폴드 구조 상에서 조립된 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함한다. 이러한 동형이량체에서, Ig Fc 폴리펩타이드는 각 작제물의 스캐폴드에서 Ig Fc 폴리펩타이드 사이에서 이형화결합의 자발적 형성을 허용할 수 있고, 예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해, 세포 용해를 유도하는 Ig 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 감소 또는 제거하는 돌연변이(예를 들어, 본 명세서에 논의된 LALA 돌연변이)를 포함할 수 있다.
(ii) 제2 예에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는,
(a) 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드 서열, 하나 이상의 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 적어도 하나의 폴리펩타이드(예를 들어, 각각의 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 대한 마스킹 서열), 및 선택적으로 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 구조 상에서 조립된 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및
(b) 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드 서열, 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 적어도 하나의 폴리펩타이드, 및 선택적으로 제1 폴리펩타이드의 종간 이량체화 서열에 대한 상대를 포함하는 스캐폴드 구조 상에서 조립된 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되,
제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 도 1, 구조 C에서와 같은 종간 이량체화 서열의 상호작용을 통해 이형이량체를 형성한다.
(iii) 제3 예에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는
(a) 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드 서열, 적어도 하나 이상의 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 적어도 하나늬 폴리펩타이드(예를 들어, 각각의 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 대한 마스킹 서열), 및 선택적으로 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 구조 상에서 조립된 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및
(b) 제1 폴리펩타이드의 종간 이량체화 서열에 대한 상대를 포함하는 스캐폴드 구조, 및 선택적으로 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하되,
제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 도 1, 구조 F에서와 같은 종간 이량체화 서열의 상호작용을 통해 이형이량체를 형성하고, 그리고
(iv) 제4 예에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는
(a) 적어도 하나의 TGF-β 폴리펩타이드 서열, 및 선택적으로 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 구조 상에서 조립된 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및
(b) 적어도 하나 이상의 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 적어도 하나의 폴리펩타이드, 및 선택적으로 제1 폴리펩타이드의 종간 이량체화 서열에 대한 상대를 포함하는 스캐폴드 구조 상에서 조립된 하나 이상의 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되,
제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 도 1, 구조 D 및 E에서와 같은 종간 이량체화 서열의 상호작용을 통해 이형이량체를 형성한다.
일부 예에서, 마스킹된 TGF-β 복합체(도 1, 구조 B, C 및 F), TGF-β 폴리펩타이드(제1 폴리펩타이드)를 포함하는 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지: 선택적으로 하나 이상의 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열이 있거나 없음); TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 폴리펩타이드; 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 도 1에서, 구조 F에서 TGF-β 서열을 포함하지 않는 폴리펩타이드(제2 폴리펩타이드)는 종간 결합 서열을 갖는 스캐폴드 폴리펩타이드를 포함하고, 선택적으로 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 둘 다에서 MOD를 포함한다.
일부 예에서, 도 1, 구조 D 및 E에서 마스킹된 TGF-β 복합체, TGF-β 폴리펩타이드 서열-함유 폴리펩타이드(제1 폴리펩타이드)는 N-말단으로부터 C-말단까지: 하나 이상의 선택적인 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 도 1, 구조 D 및 E에서 TGF-β 서열을 포함하지 않는 폴리펩타이드(제2 폴리펩타이드)는, N-말단으로부터 C-말단까지: 선택적으로 하나 이상의 MOD, 종간 결합 서열을 갖는 스캐폴드 폴리펩타이드 및 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 도 1에 도시하지는 않지만, TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드는 하나 이상의 MOD를 포함하지 않을 수도 있고, 마스킹 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드는 하나 이상의 MOD를 포함할 수 있다.
마스킹된 TGF-β 복합체의 상기 기재한 예는 제1 폴리펩타이드가 N-말단으로부터 C-말단까지, 하기를 포함하는 것을 포함한다:
(i) 선택적으로 하나 이상의 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열;
(ii) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열;
(iii) 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β1 또는 2 폴리펩타이드 서열;
(iv) 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 IL-2 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 없음); 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열;
(v) 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열;
(vi) 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열; 또는
(vii) 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 IL-2 MOD; 스캐폴드 폴리펩타이드(종간 결합 서열 있음); 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열. 각 예에서, 제2 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지 제1 폴리펩타이드의 종간 결합에 대한 상대를 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드(이량체화 서열) 다음에 제1 폴리펩타이드의 TGF-β 폴리펩타이드에 결합하고 이를 마스킹하는 TβR(예를 들어, TβRII) 폴리펩타이드를 포함한다. 도 1, 구조 F에서와 같이 마스킹된 TGF-β 복합체의 경우에, TβR(예를 들어, TβRII) 폴리펩타이드는 N-말단의 MOD(존재하는 경우) 사이에 개재될 수 있으며, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드는 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 감소된 친화도 변이체 MOD(예를 들어, wt. 또는 변이체 IL-2 MOD)가 N- 또는 C-말단에 부착될 수 있는 제1 폴리펩타이드의 종간 결합(이량체화 서열)에 대한 상대를 포함한다.
본 명세서에 기재된 마스킹된 TGF-β 복합체의 임의의 예에서, TGF-β 폴리펩타이드 서열의 C77은 이량체화를 방지하도록 치환될 수 있고(예를 들어, C77S 치환), MOD 및 TβR 폴리펩타이드 서열에서의 변형에 따라, TGF-β 폴리펩타이드는 (예를 들어, aa 25, 92 및/또는 94 중 하나, 둘 또는 모두 셋에서) 마스킹 TβR 폴리펩타이드에 대한 이들의 친화도를 감소시키는 변형을 추가로 포함할 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물에 혼입될 수 있는 예시적인 TβR 폴리펩타이드 서열은 D118A 치환을 선택적으로 갖는 Δ14 또는 Δ25 TβRII 폴리펩타이드를 포함한다. MOD 변이체는 이들의 폴리펩타이드 서열에 따라 기재되고, TβRI, TβRII 및 TβRIII의 추가적인 변형은 상기 기재되어 있다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 서열번호 148 및 149에 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(도 7C 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 서열번호 150 및 151에 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(도 7D 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 서열번호 152 및 153에 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(도 7E 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 서열번호 155 및 156에 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(도 7F 참조). 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 복합체는 서열번호 148 및 160에 제시된 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(도 7J 참조).
J. 핵산
본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 재조합 발현 벡터이고; 따라서, 본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 재조합 발현 벡터이고; 따라서, 본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 다음의 핵산의 논의는 본 개시내용의 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
단일 쇄 항원-제시 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산
상기 기재한 바와 같은, 마스킹된 TGF-β 작제물은 단일 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 단일 쇄 마스킹된 TGF-β 작제물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 단일쇄 마스킹된 TGF-β 작제물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 전사 제어 요소(들), 예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
마스킹된 TGF-β 복합체를 암호화하는 핵산(들)
상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체는 적어도 2개의 별개의 폴리펩타이드 쇄(제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄)를 포함한다. 본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 개개 폴리펩타이드 쇄는 별개의 핵산에서 암호화된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 모든 폴리펩타이드 쇄는 단일 핵산에서 암호화된다. 일부 경우에, 제1 핵산은 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 제2 핵산은 마스킹된 TGF-β 복합체의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 단일 핵산은 작동 가능하게 연결되고 단일 프로모터 또는 2개의 독립적으로 선택된 프로모터의 전사 제어 하에 있을 수 있는 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 개개 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 별개의 핵산
상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 개개 폴리펩타이드 쇄는 별개의 핵산에 의해 암호화된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 별개의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 예컨대 진핵 세포에서 기능성인 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용은 제1 핵산 및 제2 핵산을 제공하며, 여기서, 제1 핵산은 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 핵산은 마스킹된 TGF-β 복합체의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 진핵 세포에서 기능성인 프로모터이다. 일부 경우에, 핵산은 별개의 발현 벡터에 존재한다.
일부 경우에, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일부 경우에, 전사 제어 요소는 진핵 세포에서 기능성인 프로모터이다. 일부 경우에, 핵산은 별개의 발현 벡터에 존재한다.
마스킹된 TGF-β 복합체에 존재하는 2 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산
본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 복합체의 적어도 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체가 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드 및 제3 폴리펩타이드를 포함하는 경우에, 상기 핵산은 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드 및 제3 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 단백질 분해에 의해 절단 가능한 부위 또는 암호화된 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이에 개재된 링커를 암호화한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 암호화된 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이에 개재된 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 사이에 개재된 리보솜 스키핑 신호(또는 시스-작용성 가수분해 효소 요소, CHYSEL)를 암호화하는 서열을 포함한다.
일부 경우에, 제1 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터, mRNA, 바이러스 RNA 등)은 마스킹된 TGF-β 복합체의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 제2 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터, mRNA, 바이러스 RNA 등)은 마스킹된 TGF-β 복합체의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열은 각각 독립적으로 선택된 전사 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 예컨대 진핵 세포에서 기능성인 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
재조합 발현 벡터
본 개시내용은 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 일부 경우에, 재조합 발현 벡터는 비바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 재조합 발현 벡터는 바이러스 작제물, 예를 들어, 재조합 아데노-연관 바이러스 작제물(예를 들어, 미국 특허 제7,078,387호 참조), 재조합 아데노바이러스 작제물, 재조합 렌티바이러스 작제물, 재조합 레트로바이러스 작제물, 비통합 바이러스 벡터 등이다.
적합한 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 백시니아 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(예를 들어, 문헌[Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노-연관 바이러스(예를 들어, 문헌[Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996]; WO 93/09239에서의 Srivastava, 문헌[Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617]); SV40; 단순포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, 문헌[Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999]); 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터); 등에 기반한 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 수많은 적합한 발현 벡터는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 다수는 상업적으로 입수 가능하다.
이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라서, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 비롯한 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544] 참조).
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 전사 제어 요소, 예컨대 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 전사 제어 요소는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포; 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고세균 세포) 중 하나에서 기능성일 수 있다. 일부 경우에, DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 원핵 세포와 진핵 세포 둘 다에서 DNA-표적화 RNA 및/또는 부위-지정 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 하는 다중 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
적합한 진핵 프로모터(진핵 세포에서 기능성인 프로모터)의 비제한적 예는 거대세포바이러스(CMV) 급초기, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(LTR), 및 마우스 메탈로티오네인-I로부터의 프로모터를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에서 용이하다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위해 적절한 서열을 포함할 수 있다.
마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체를 발현시키는 유전자 변형된 숙주 세포의 제조 및 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체의 정제
본 개시내용은 유전자 변형된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들)을 이용하여 유전자 변형된다.
적합한 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대 숙주 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 포함한다. 일부 경우에, 숙주 세포는 포유류 세포주의 세포이다. 적합한 포유류 세포주는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유류 세포주는 HeLa 세포(예를 들어, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection: ATCC) No. CCL-2), CHO 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예를 들어, ATCC 번호CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포(예를 들어, ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예를 들어, ATCC 번호 CCL10), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유전자 변형된 숙주 세포는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형된 숙주 세포는 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터(들), 예컨대, 상기 기재한 것을 숙주 세포에 도입하고, 이에 의해 유전자 변형된 숙주 세포를 생성함으로써, 마스킹된 TGF-β 복합체 또는 단일쇄 마스킹된 TGF-β 작제물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 구성적으로 발현시키거나, 또는 유도자에 대한 노출에 반응하여 이를 발현시킬 수 있으며, 여기서, 프로모터 유도 발현은 유도성이다(예를 들어, 테트라사이클린에 대한 노출에 의해 유도된 CMV 프로모터 및 테트라사이클릭 내성 오페론).
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 세포로부터 얻어지거나, 또는 폴리펩타이드(들)가 신호 서열의 혼입에 의해 분비 경로로 표적화된다면, 세포 배양 배지로부터 얻어진다. 단백질은, 예를 들어, 침전(예를 들어, 황산암모늄 또는 에탄올), 등전점 전기영동 및 크로마토그래피 중 하나 이상의 유형 중 하나 이상을 포함하는, 당업게에 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 적합한 크로마토그래피 방법은 크기-기반 크로마토그래피 분리(예를 들어, 크기 배제 또는 겔 투과), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 면역글로불린 폴리펩타이드 서열을 (예를 들어, 스캐폴드로서) 포함하는 경우에, 단백질 A 또는 단백질 G는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 친화도 정제에 사용될 수 있다. 면역글로불린 폴리펩타이드의 부재 하에, 복합체는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 폴리펩타이드로 향하는 항체를 이용하여; 또는 대안적으로, 친화도 태그, 예컨대, myc 에피토프(CEQKLISEEDL 서열번호 154), "HIS" 태그(2가 금속 이온 수지 결합에 대해), 또는 "FLAG" 태그의 혼입에 의해 친화도 정제될 수 있다. 앞서 언급한 방법 중 어느 것과 조합될 수 있는 정제 및/또는 농축 단계는 실질적으로 상이한 분자량을 갖는 오염물질을 제거하고/하거나 정제된 단백질을 농축시키기 위해 사용될 수 있는 크기 제한 반투과성 막(예를 들어, 투석막 또는 압력 셀)을 사용한다.
실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)에 도입된 핵산 서열로부터 발현되고, 이것이 세포로부터 이의 배양 배지(예를 들어, 무혈청 배지)로 분비되도록 분비 경로로 표적화된다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 친화도 크로마토그래피 단독으로 또는 크기 기반 분리(예를 들어, 크기-기반 크로마토그래피 또는 막 분리)와 조합하여 이용해서 세포 배양 배지로부터 정제된다. 이러한 실시형태의 구체적 예에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 면역글로불린 스캐폴드(예를 들어, IgG 폴리펩타이드 서열)를 포함하고, 정제는 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 G) 단독으로 또는 크기 기반 분리(크기-기반 크로마토그래피)와 조합하여 수행된다.
K. 조성물
본 개시내용은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다.
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마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하는 조성물
본 개시내용의 조성물은, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 추가로, 염, 예를 들어, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 등; 완충제, 예를 들어, Tris 완충제, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES), 2-(N-몰폴리노)에탄설폰산(MES), 2-(N-몰폴리노)에탄설폰산 나트륨염(MES), 3-(N-몰폴리노)프로판설폰산(MOPS), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS) 등; 가용화제; 세정제, 예를 들어, 비이온성 세정제, 예컨대 트윈(Tween)-20 등; 프로테아제 저해제; 글리세롤 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있으며, 이 중 다수는 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에서 상세하게 논의할 필요가 없다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어, 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19th Ed. (1995), 또는 최종판, Mack Publishing Co; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]을 포함하는 다양한 간행물에 충분히 기재되어 있다.
약제학적 조성물은: i) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체; 및 ii) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상 약제학적 조성물은 대상체에 대한 투여에 적합할 것이며, 예를 들어, 멸균일 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상 약제학적 조성물은, 예를 들어, 조성물이 멸균이고, 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 실질적으로 없거나, 또는 이러한 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소는 해당되는 규제 기관, 예를 들어, USF&DA에 의한 허용 가능한 한계 설정값 이내의 수준에서 존재하는 경우에, 인간 대상체에 대한 투여에 적합할 것이다.
단백질 조성물은 다른 성분, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 탤컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 마그네슘, 탄산염 등을 포함할 수 있다. 조성물은 생리적 조건에 근접하게 하는데 필요한 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨, 염산, 황산염, 용매화물(예를 들어, 혼합된 이온성염, 물, 유기물), 수화물(예를 들어, 물) 등을 함유할 수 있다.
예를 들어, 조성물은 수용액, 분말 형태, 과립, 정제, 알약, 좌약, 캡슐, 현탁액, 스프레이 등을 포함할 수 있다. 조성물은 이하에 기재되는 다양한 투여 경로에 따라 제형화될 수 있다.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 이용되거나(예를 들어, 세포 배양 시스템에 도입되거나) 조직 내로 직접 주사 가능하다면 (예를 들어, 피하로, 복강내, 근육내, 림프액내 및/또는 정맥내) 투여되는 경우, 제형은 바로 사용 가능한 투약 형태로서, 또는 비수성 형태(예를 들어, 재구성될 수 있는 저장-안정성 분말) 또는 수성 형태, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제로 구성된 액체로서 제공될 수 있다. 단백질-함유 제형은 또한 투여 후 대상체 단백질의 혈청 반감기를 향상시키는 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 리포좀 제형에서 제공될 수 있고, 콜로이드 또는 혈청 반감기를 연장시키기 위한 다른 통상적인 기법으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka et al. 1980 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467], 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호에 기재된 리포좀을 제조하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 제제는 또한 제어 방출 또는 서방출 형태로 제공될 수 있다.
일부 경우에, 조성물은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체; 및 b) 식염수(예를 들어, 0.9% NaCl)를 포함한다. 일부 경우에, 조성물은 멸균이다. 일부 경우에, 조성물은, 예를 들어, 조성물이 멸균이고, 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 실질적으로 없거나, 또는 이러한 검출 가능한 발열원이 허용 가능한 제한 이내의 양으로 존재하는 경우에, 인간 대상체에게 투여하기에 적합하다. 따라서, 본 개시내용은 조성물이 멸균이고 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 실질적으로 없는 경우, 또는 이러한 검출 가능한 발열원 및/또는 다른 독소가 허용 가능한 제한 이내의 양으로 존재하는 경우에: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체; 및 b) 식염수(예를 들어, 0.9% NaCl)를 포함하는 조성물을 제공한다.
비경구 투여에 적합한 제형의 다른 예는 등장성 멸균 주사 용액, 항산화제, 제균제, 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함한다. 예를 들어, 대상 약제학적 조성물은 용기, 예를 들어, 멸균 용기, 예컨대 주사기에 제공될 수 있다. 제형은 단일 용량 또는 다회 용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 부형제, 예를 들어, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
제형 중 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 농도는, 예컨대, 약 0.1중량% 미만(보통 적어도 약 2%에서)에서 20중량% 내지 50중량% 이상(예를 들어, 0.1중량% 내지 1중량%, 1중량% 내지 5중량%, 5중량% 내지 10중량%, 10중량% 내지 20중량% 또는 20중량% 내지 50중량%)만큼 많게까지 크게 다를 수 있고, 보통 유체 용적, 점성도 및 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따르는 환자 기반 인자일 것이다.
본 개시내용은 조성물, 예를 들어, 액체 조성물을 포함하는 용기를 제공한다. 용기는, 예를 들어, 주사기, 앰플 등일 수 있다. 일부 경우에, 용기는 멸균이다. 일부 경우에, 용기와 조성물 둘 다 멸균이다.
2
핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 조성물
본 개시내용은 조성물, 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 매우 다양한 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 상세하게 논의할 필요는 없다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어, 문헌[A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]을 포함하는 다양한 간행물에 다양하게 기재되었다.
본 개시내용의 조성물은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 재조합 발현 벡터; 및 b) 완충제, 계면활성제, 항산화제, 친수성 중합체, 덱스트린, 킬레이트제, 현탁제, 가용화제, 농후제, 안정제, 세균발육저해제, 습윤제 및 보존제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 (예컨대 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산(BES), 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄(BIS-Tris), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'3-프로판설폰산(EPPS 또는 HEPPS), 글리실글리신, N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 3-(N-몰폴리노)프로판 설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄-설폰산)(PIPES), 중탄산나트륨, 3-(N-트리스(하이드록시메틸)-메틸-아미노)-2-하이드록시-프로판설폰산)(TAPSO), (N-트리스(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산(TES), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-글리신(트리신(Tricine)), 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(Tris) 등)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 염은, 예를 들어, NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4 등을 포함한다.
약제학적 제형은 약 0.001% 내지 약 99%(w/w)(예를 들어, 0.001 내지 0.1, 0.1 내지 1.0, 1.0 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 40, 40 내지 80 또는 80 내지 100 w/w%)의 양으로 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함할 수 있다. 제형의 설명에서, 이하의 "대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터"는 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 대상 제형은 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함한다.
대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 다른 화합물 또는 화합물의 혼합물과 혼합, 캡슐화, 접합 또는 달리 결합될 수 있고; 이러한 화합물은, 예를 들어 리포좀 또는 수용체 표적화 분자를 포함할 수 있다. 대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 섭취, 분포 및/또는 흡수를 돕는 1종 이상의 성분과 제형에서 조합될 수 있다.
대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터 조성물은 임의의 다수의 가능한 투약 형태, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질젤, 좌약 및 관장제로 제형화될 수 있다. 대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 배지에서 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스나트륨, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다.
대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 제형은 리포좀 제형일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층들에 배열된 양친매성 지질로 구성된 소수포를 의미한다. 리포좀은 전달될 조성물을 함유하는 친유성 물질 및 수성 내부로부터 형성된 막을 갖는 단일층 또는 다층 소수포이다. 양이온성 리포좀은 음으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성할 수 있는 양으로 하전된 리포좀이다. pH 민감성 또는 음으로 하전된 리포좀은 그것과의 복합체보다는 DNA를 붙잡는 것으로 여겨진다. 양이온성 리포좀과 비양이온성 리포좀은 둘 다 대상 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
리포좀은 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 리포좀 내로 혼입될 때 전문화된 지질이 없는 리포좀에 비해 향상된 순환 수명을 초래하는 1종 이상의 전문화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭하는 용어인 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예는 리포좀의 소수포-형성 지질 부분이 1종 이상의 당지질을 포함하거나 또는 1종 이상의 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티에 의해 유도체화된다. 리포좀 및 그들의 용도는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
제형 및 조성물은 또한 계면활성제를 포함할 수 있다. 약물 제품, 제형 중의 그리고 에멀션 중의 계면활성제의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 그들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 핵산의 효율적인 전달을 달성하기 위한 다양한 침투 향상제가 포함된다. 세포막을 가로지르는 비친수성 약물의 확산을 돕는 것에 추가로, 침투 향상제는 또한 친유성 약물의 투과성을 향상시킨다. 침투 인핸서는 5가지 넓은 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙염, 킬레이트제, 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 향상제 및 그들의 용도는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 현탁액 또는 수 중 또는 비수성 배지 중의 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사쉐, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 적합한 경구 제형은 대상 안티센스 핵산이 1종 이상의 향상제 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것을 포함한다. 적합한 계면활성제는, 지방산 및/또는 에스터 또는 이들의 염, 담즙산 및/또는 이들의 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 담즙산/염 및 지방산 및 그들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다. 또한 침투 향상제, 예를 들어, 지방산/담즙산/염과 조합한 염의 조합물이 적합하다. 예시적인 적합한 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에터 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 침투 향상제는 또한 프로필렌 글리콜, 다이메틸설폭사이드, 트라이에탄올아민, N,N-다이메틸아세트아마이드, N,N-다이메틸폼아마이드, 2-피롤리돈 및 이들의 유도체, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올 및 AZONE™을 포함한다.
L. 제형
적합한 제형은 상기 기재되어 있고, 여기서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 등급을 갖는다(예를 들어, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제(들) 및 활성 분자를 포함한다). 일부 경우에, 적합한 제형은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체; 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며; 일부 예에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 경우에, 적합한 제형은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산; b) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산; 및 c) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 경우에, 적합한 제형은: a) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 재조합 발현 벡터; b) 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 및 c) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 상기 기재되어 있다.
M. 방법
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 T 세포의 활성을 조절하는 데 유용하다. 따라서, 본 개시내용은 T 세포의 활성을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 일반적으로 표적 T 세포를 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 단계를 수반한다.
1
특정 면역 세포 유형을 생성, 자극 또는 저해하는 단계를 포함하는 면역 세포 활성을 조절하는 방법.
본 개시내용은 TβRI 및 TβRII를 발현시키는 세포의 활성을 선택적으로 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 수지상 세포 및 과립구를 포함하는 선천성 세포)를 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, T 세포를 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 단계는 에피토프-특이적 T 세포의 활성을 선택적으로 조절한다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 시험관내에서 일어난다. 일부 경우에, 접촉시키는 단계는 생체내에서 일어난다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 처리된 세포의 활성(예를 들어, 표준 경로, 비-표준 경로 및/또는 하류의 유전자 발현의 신호전달)은 TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출되지 않은 처리군(예를 들어, 세포 대상)에 대해 평가될 수 있다.
본 개시내용은 T 세포 또는 B 세포(예를 들어, 병원성 자가반응 T 세포 및/또는 병원성 자가반응 B 세포)의 수 및/또는 활성을 감소시키는 방법을 제공하며; 상기 방법은 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 조절 T 세포(Treg)의 수 및/또는 활성을 증가시켜, T 세포 또는 B 세포(예를 들어, 하나 이상의 자가반응 T 세포 및/또는 하나 이상의 자가반응 B 세포)의 감소된 수 및/또는 활성을 초래하되, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체로 처리된 T 세포 또는 B 세포의 수 및/또는 활성의 감소는 TGF-β 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출되지 않은 처리군(예를 들어, 세포 대상)에 대해 평가된다.
선택적으로 하나 이상의(예를 들어, 하나, 둘 이상 또는 셋 이상) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여는 다양한 세포 집단을 직접적으로 또는 간접적으로 달성할 수 있다. 예로서, 선택적으로 하나 이상의 야생형 또는 변이체 IL-2 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여는 FoxP3+ Treg 세포(생체내 또는 시험관내)의 발생 및/또는 생존을 직접적으로 자극할 수 있다. TGF-β/IL-2 복합체가 다양한 면역 세포에 미치는 임의의 직접적인 작용에 추가로, 얻어진 Treg 세포는, 예를 들어, T 세포 활성화 및/또는 T 세포 반응의 효과기 단계의 유도를 차단하고/하거나, B 세포 활성화를 억제하고/하거나 자연 살해 세포의 분화 및/또는 증식을 저해함으로써 면역 반응을 억제할 수 있다.
a.
Treg
(i)
IL-2를 포함하는 tTreg, pTreg, iTreg 및 TGF-β 작제물 또는 복합체
본 개시내용은 흉선 유래 Treg(tTreg) 및/또는 말초 Treg(pTreg)(Treg는 자가반응 T 세포 및 B 세포를 억제할 수 있는 CD4+, FoxP3+ 및 CD25+ 세포임)의 발생(예를 들어, 확장) 및/또는 생존을 촉진시키는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 한 명 이상의 대상체에게) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 (예를 들어, 조직 배양물, 혈액에서, 또는 특정 조직 위치, 예컨대 상처에서) 이와 CD4+ T 세포(예를 들어, 미경험 CD4+ T 세포)를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서 투여 또는 접촉된 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 투여 또는 접촉시키는 단계는 비타민 D(예를 들어, 비타민 D3 또는 이의 유사체), 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산), 및/또는 라파마이신의 포유류 표적의 저해제(mTOR)(예를 들어, 라파마이신 또는 이의 기능성 유사체, 예컨대, 시롤리무스, 에베롤리무스 또는 템시롤리무스)를 투여 또는 이들과 세포를 접촉시키는 것과 함께 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 FoxpP3+, FoxP3+ 흉선 유래 Treg(tTreg) 및/또는 FoxP3+ 말초 Treg(pTreg)인 유도된 조절 T 세포(iTreg)의 발생 및/또는 생존을 촉진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 선택적으로 비타민 D 또는 이의 유사체, 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 또는 이의 유사체, 및/또는 라파마이신 또는 이의 유사체의 존재 하에, 하나 이상의 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 투여하거나, 이와 CD4+ T 세포를(예를 들어, 미경험 CD4+ T 세포) 접촉시키는 단계를 포함한다. 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의한 투여 또는 처리 효과는 기준값(예를 들어, 처리 전 세포 수)에 대해 또는 시험군과 (예를 들어, 달리 동일한) 매칭되지만, TGF-β 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 평가될 수 있다.
본 개시내용은 Treg의 유도/증식을 증가시키고/시키거나, Treg를 유지하고/하거나 이들의 기능을 지속하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 T 세포(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 CD4+ T 세포)를 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉시키는 단계는 접촉 전에 결정된 기준 값에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉된 적이 없는 달리 동일한 세포의 대조군에 비해 Treg의 유도/증식을 증가시키고/시키거나, Treg를 유지하고/하거나, 이들의 기능을 지속한다. 본 개시내용은 상기 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하고, 제공한다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 A, B 또는 C에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 D 또는 E에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 F에 기재된 구조적 조직화를 갖는다.
본 개시내용은 Treg의 유도/증식을 증가시키고/시키거나, Treg를 유지하고/하거나 이들의 기능을 지속하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 T 세포(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 CD4+ T 세포)를 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉시키는 단계는 접촉 전에 결정된 기준 값에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉된 적이 없는 달리 동일한 세포의 대조군에 비해 Treg의 유도/증식을 증가시키고/시키거나, Treg를 유지하고/하거나, 이들의 기능을 지속한다. 본 개시내용은 상기 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하고, 제공한다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 A, B 또는 C에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 D 또는 E에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 F에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 Treg(예를 들어, Tbet+ FoxP3+ iTreg 세포)를 유도/증식하고, Treg를 유지하고/하거나 이들의 기능을 지속하기 위해 IL-2(예를 들어, 재조합 IL-2, 예컨대, 프로류킨(알데스류킨))와 함께 투여될 수 있다.
본 개시내용은 Treg의 유도/증식을 증가시키고/시키거나, Treg(예를 들어, Treg 수)를 유지하고/하거나 이들의 기능을 지속하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 T 세포(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 CD4+ 세포)를 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 접촉시키는 단계는 접촉 전에 결정된 기준 값에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉된 적이 없는 달리 동일한 세포의 대조군에 비해 Treg의 유도/증식을 증가시키고/시키거나, Treg를 유지하고/하거나, 이들의 기능을 지속한다. 본 개시내용은 상기 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하고, 제공한다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 A, B 또는 C에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 D 또는 E에 기재된 구조적 조직화를 갖는다. 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 F에 기재된 구조적 조직화를 갖는다.
T 세포(예를 들어, 미경험 CD4+ 세포)를 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 단독으로 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열과 조합하여 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 생체내 또는 시험관내)와 접촉시키는 단계는 FoxP3 및 Treg 세포 유도(예를 들어, Tbet+ FoxP3+ iTreg 세포)의 발현을 증가시킬 수 있다. 유사하게, T 세포(예를 들어, 미경험 CD4+ 세포)를 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 PD-L1 또는 PDL2 및/또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 단독으로 또는 IL-2(예를 들어, 재조합 인간 IL-2)와 조합하여 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)와 접촉시키는 단계는 FoxP3 및 Treg 세포 유도(예를 들어, Tbet+ FoxP3+ iTreg 세포)의 발현을 증가시킬 수 있다. IL-2 둘 다 및 PD-L1 또는 PD-L2 중 하나가 세포에 제공되는 경우, 접촉시키는 단계는 T reg 엔도리소좀 아스파라긴일 엔도펩티다제를 감소시킬 수 있다. Treg에서 Foxp3의 탈안정화를 초래하는 엔도리소좀 아스파라긴일 엔도펩티다제의 감소는 Treg(예를 들어, iTreg)의 유지를 초래하고, 이들의 기능을 지속한다. 예를 들어, 문헌[Francsisco et al., J Exp. Med., 206(13) 3015-3029 (2018) 및 Stathopoulou et al. Immunity 49(2): 247-263 (2018)]을 참조한다. 따라서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 IL-2 둘 다 및 PD-L1 또는 PD-L2 중 하나를 포함하는 경우에, T-세포를 접촉시키는 단계는 Treg의 증가된 수뿐만 아니라 해당 세포의 증가된 안정성 및 기능을 초래할 수 있다.
IL-2 MOD(wt. 및/또는 변이체) 및/또는 PD-L1 및/또는 PD-L2(wt. 및/또는 변이체) 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 접촉이 생체내에서(또는 환자에 투여되는 처리 세포를 갖는 시험관내에서) 일어나는 경우에, 접촉은 처리를 구성할 수 있다. 이러한 처리는 개체 또는 개체 집단에서 증가된 Treg 세포 수준(예를 들어, 조직에서 또는 혈액에서 순환하는 iTreg 또는 이들의 분획의 총 수)을 초래한다. 처리는 또한 Treg에서 FoxP3의 상승된 수준을 초래할 수 있다.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(들)을 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열(들)과 조합하여 포함하는 경우에, 개체 또는 개체의 집단에서 증가된 Treg 세포 수준(예를 들어, 조직에서 또는 혈액에서 순환하는 iTreg 또는 이들의 분획의 총 수)은 PD-L1 서열(들)이 없는 달리 동일한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체로 개체 또는 개체 집단(예를 들어, 연령, 성별, 체중 및/또는 질환 상태에 대해 매칭)을 처리할 때 관찰된 것보다 더 긴 기간 동안 지속된다. wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열과 조합하여 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의한 처리는 또한, PD-L1 폴리펩타이드 서열이 없는 달리 동일한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의해 처리가 수행될 때 관찰된 수준에 비해 Treg에서의 FoxP3의 지속적으로 상승된 수준을 초래할 수 있다. wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열과 조합하여 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의한 처리는 또한, PD-L1 MOD 폴리펩타이드 서열이 없는 달리 동일한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체로 처리된 개체(또는 평균적으로 개체의 그룹)의 T 세포에서 해당 효소의 활성에 비해 Treg 세포에서의 엔도리소좀 아스파라긴일 엔도펩티다제의 감소된 활성을 초래할 수 있다.
T-세포를 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 단독으로 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열과 조합하여(예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내, 예컨대 개체 치료 과정에서) 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉시키는 과정은 T 세포를 비타민 D 또는 이의 유사체, 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 또는 이의 유사체, 및/또는 mTOR 저해제, 예컨대, 라파마이신 또는 이의 유사체)의 존재와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 해당 제제의 존재를 접촉시키는 단계는 접촉시키는 단계 전에 결정된 기준값에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 접촉된 적이 없는 대조군(예를 들어, 개체의 그룹)에서 결정된 값에 비해 Treg 수준(예를 들어, Treg 표현형을 갖는 세포의 증식 또는 유지로 인한 개체 또는 조직에서의 Treg의 수 또는 상대적 수)을 증가시킬 수 있다. 개체의 대조군이 사용되는 경우에, 개체는 연령, 성별 및 체중 중 하나 이상에 대해 매칭될 수 있다. 개체는 또한 민족성, 알코올 소비 및/또는 흡연 상태에 대해 매칭될 수 있다.
본 개시내용은 한 명 이상의 대상체(예를 들어, 개체 또는 환자)에서 Treg 수를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하고 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하며, 투여하는 단계는 한 명 이상의 대상체에서 Treg의 수 증가를 초래한다. 예를 들어, (예를 들어, 혈액 또는 조직, 또는 상처와 같은 위치에서) Treg의 평균 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 개체에서의 Treg의 수에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 대조군에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다.
본 개시내용은 한 명 이상의 대상체(예를 들어, 개체 또는 환자)에서 Treg 수를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 한 명 이상의 대상체에게 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 및/또는 PD-L2 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 IL-2(예를 들어, 재조합 IL-2, 예컨대, 프로류킨(알데스류킨))와 조합하여 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여하는 단계는 한 명 이상의 대상체에서 Treg 수의 증가를 초래한다. 예를 들어, (예를 들어, 혈액 또는 조직, 또는 상처와 같은 위치에서) Treg의 평균 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 개체에서의 Treg의 수에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 대조군에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다.
b.
T 헬퍼 세포
(i)
IL-4를 포함하는 Th9 세포 및 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체
본 개시내용은 흉선 유래 Th9 세포(CD4 및 CCR6의 발현 및 CCR4의 결여를 특징으로 하는 CD4+ 세포)의 발생 및/또는 생존을 촉진시키는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 CD4+ T 세포 (예를 들어, 미경험 CD4+ T 세포 또는 Th2 세포)를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서 투여 또는 접촉된 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 미경험 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, Th9 세포의 발생 및/또는 생존을 촉진시키는 방법을 제공하며, 투여하는 단계는 개체에서의 Th9 세포 수의 증가를 초래한다. 예를 들어, (예를 들어, 조직 배양물, 혈액에서 또는 특정 조직 위치에서) Th9 세포의 수는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다.
(ii)
IL-17를 포함하는 Th17 세포 및 TGF-β 작제물 또는 복합체
본 개시내용은 Th17 세포(IL-17의 이들의 생산에 의해 정해지는 T 세포)의 생성을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 적어도 하나의 IL-6 또는 변이체 IL-6 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 IL-6 및/또는 변이체 IL-6 MOD 폴리펩타이드)를 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 CD4+ T 세포(예를 들어, 미경험 CD4+ T 세포)를 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, (예를 들어, 조직 배양물, 혈액에서 또는 특정 조직 위치에서) Th17 세포의 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 존재하는 수에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 대조군에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다. 상기 방법은 장 점막 장벽 기능을 유지하는 데 유용할 수 있고, 병원성 박테리아에 대한(예를 들어, 시트로박터(Citrobacter)에 대한) 보호를 위해 그리고 세포외 진균(예를 들어, 점막피부 칸디다(Candida))을 공격하고 파괴하는 호중구 및 단핵구 및 호중구를 보충하기 위해 필요할 수 있다.
(iii)
IL-21 및 IL-23을 포함하는 Tfh 세포 및 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체
본 개시내용은 T 여포 헬퍼 (Tfh) 세포(CXCR5 발현에 의해 정해지는 T 세포)의 생산을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) IL-21 MOD 폴리펩타이드, IL-23 MOD 폴리펩타이드, IL-21의 변이체 또는 IL-23 MOD 폴리펩타이드의 변이체로부터 독립적으로 선택된 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개)를 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계 또는 이들과 대식세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, (예를 들어, 조직 배양물, 혈액에서 또는 특정 조직 위치, 예컨대 림프 여포에서) Tfh 세포의 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 존재하는 수에 비해 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 대조군에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다. 상기 방법은 항원-특이적 항체 반응의 발생을 지원하는 데 유용할 수 있다.
c.
IL-7을 포함하는 T 효과기 세포 및 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체
(i)
IL-7 및 CD8+ T 세포
본 개시내용은 (예를 들어, IL-7R(예를 들어, IL-7Rα)의 흉선세포 발현을 촉진시킴으로써) CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 발생(계통 전념(lineage commitment))을 촉진시키는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 전구체 CD4+CD8+ T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에서 투여 또는 접촉된 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 (예를 들어, 인터류킨(IL)-7Rα의 흉선세포 발현을 촉진시킴으로써) CD4+ 또는 CD8+ 계통에 전념된 세포의 발생을 촉진시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 CD4+ 및 또는 CD8+ 세포 전구체(예를 들어, CD4+8+ T-세포)를 접촉시키는 단계를 포함하되; CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 발생 및/또는 생존은 말초 혈액 또는 특정 조직(예를 들어, 흉선) CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 수를 모니터링함으로써 평가된다.
(i)
IL-7 및 저친화도 T-세포
본 개시내용은 MHC 단백질에 의해 제시되고 있는 펩타이드에 대해 낮은 친화도를 갖는 T-세포 수용체를 갖는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 IL-7-의존적 생존을 촉진시킴으로써 말초 T-세포 항상성을 조절하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 및 이의 인용문헌] 참조. 상기 방법은 흉선세포 IL-7Rα 발현을 제어함으로써 조작할 수 있다. IL-7-의존적 생존을 촉진시키는 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함한다. 투여되는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 말초 T-세포 항상성을 조절하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열 및/또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여는 투여 전 해당 세포 수에 비해 대상체, 또는 대상체 그룹에서의 말초 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 수를 증가시킨다.
d.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및 IL-10
본 개시내용은 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) 독립적으로 선택된 4 야생형 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)를 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 이용하여 2형 선천성 림프구 세포(ILC2 세포)를 저해하는 방법을 제공한다(예를 들어, 천식 및 알레르기 염증을 억제하기 위함, 예를 들어, 문헌[Rajas et al., J Allergy Clin Immunol, 139(5):1468 (2017); 및 Ogasawara, et al., J Allergy Clin Immunol, 141(3): 1147-1151 (2018)] 참조). 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드는 단량체 IL-10 폴리펩타이드의 모두 또는 일부(예를 들어, 상기 언급한 나선 D와 E 사이의 힌지 영역에서 5 내지 7 aa 삽입으로 치환된 서열번호 50 또는 51의 모두 또는 일부)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Josephson et al., J. Biol. Chem. 275:13552-13557 (2000)] 참조. II형 선천성 림프구 세포를 저해하는 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 선택적으로 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 IL-10 MOD를 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 II형 선천성 림프구 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. ILC2 세포의 저해는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 2형 사이토카인의 양에 비해, 또는 TGF-β 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출되지 않은 대조군에서(예를 들어, 대상체로부터의 세포, 조직 또는 체액에서) 2형 사이토카인의 양에 비해 ILC2 세포에 의한 2형 사이토카인(예를 들어, IL-3 및/또는 IL-13)의 억제에 의해 평가된다.
TGF-β 및 IL-10은 TGF-β의 상류와 하류 둘 다에서 작용하는 IL-10에 의해 위장 항상성을 유지하는 데 흔치않은 역할을 한다. 예를 들어, IL-10은 점막고유층 T 세포에 의해 TGF-β 발현 및 분비를 유도할 수 있고, 이는 Treg 세포의 분화를 촉진시키기 위해 TGF-b와 협력하여 작용한다. 따라서, 본 개시내용은 wt. 또는 변이체 IL-10 서열 또는 IL-2와 IL-10 aa 서열을 둘 다 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서의 장 항상성 및 Treg 세포의 분화를 유지하는 방법을 제공하며, 이들 중 하나 또는 둘 다 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 서열일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2017;9:a022236 및 이의 인용 문헌] 참조.
일부 경우에, 예컨대, 관용을 유도하는 것이 바람직한 경우에, 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재한다. 예를 들어, 문헌[Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 306: G575-G581 (2014)] 및 문헌[Levings et al. Int Arch Allergy Immunol. 129(4):263-76 (2002)]을 참조한다. 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드는 단량체 IL-10 폴리펩타이드의 모두 또는 일부(예를 들어, 상기 언급한 바와 같은 단량체 IL-10을 형성하기 위해 나선 D와 E 사이의 힌지 영역에서 5 내지 7 aa 삽입으로 치환된 서열번호 50 또는 51의 모두 또는 일부)를 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 wt. 또는 변이체 IL-10 서열 또는 IL-2와 IL-10 폴리펩타이드 서열을 둘 다 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 관용을 유도하는 방법을 제공한다. 대안적으로, wt. 또는 변이체 IL-10(예를 들어, 단량체 IL-10) 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 (동시에 또는 조합하여) 투여될 수 있다.
e.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및 FasL
일부 경우에, 예컨대, 관용을 유도하거나 T-효과기 세포를 억제하는 것이 바람직한 경우에, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 존재하는 적어도 하나의 MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 MOD)는 Fas 리간드(FasL) 폴리펩타이드, 또는 Fas 리간드 폴리펩타이드의 변이체를 포함할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Qiu et. al. J Surg Res. 218:180-193 (2017)] 참조). 상기 논의한 바와 같이, IL-10 또는 변이체 IL-10 폴리펩타이드는 또한 관용을 유도하는 데 이용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 wt. 또는 변이체 FasL 폴리펩타이드 서열 또는 IL-2와 FasL 폴리펩타이드 서열을 둘 다 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 관용을 유도하거나 T-효과기 세포를 억제하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 관용 유도를 제공한다. 대안적으로, wt. 또는 변이체 FasL 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체와 (동시에 또는 조합하여) 투여될 수 있다.
f.
다른 세포의 조절 방법
본 개시내용은 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포의 발생 및/또는 생존을 지원하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 iNKT 세포 전구체 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 발생 및/또는 생존은 TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 평가된다.
본 개시내용은 대식세포(예를 들어, Toll 유사 수용체 리간드 또는 사이토카인 자극에 의해 활성화된 대식세포)를 저해하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 대식세포를 접촉시키는 단계를 포함하되; 저해는 TGF-β 및/또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출되지 않은 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 평가된다. 대식세포 활성화의 활성화 및 저해는 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 활성화된 대식세포에 의한 산화질소 생성에 의해 평가된다.
TGF-β는 단핵구에 의한 H2O2 생산을 저해하고, 피브로넥틴 접착을 저해하는 단핵구에 대해 화학유인물질이다. 예를 들어, 문헌[Warwick Davies and Cole, J Immunol. 155(6): 3186-3193 (1995)]을 참조한다. 따라서, 본 개시내용은 이동을 진행하기 위해 단핵구(예를 들어, 휴지 단핵구)를 자극하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 단핵구를 접촉시키는 단계를 포함하되; 자극은 TGF-β 및/또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 평가된다. 활성화, 및 단핵구 활성화의 저해는 H2O2 생산 및 피브로넥틴 접착의 측정을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 평가된다. H2O2 생산은 (예를 들어, 단핵구 자극에 반응하여) 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 10배, 20배, 30배 이상)만큼 감소될 수 있다.
본 개시내용은 말초 혈액 단핵구 및/또는 대식세포 이동(예를 들어, 시간차 현미경 또는 보이덴(Boyden) 챔버 분석에 의해 평가) 조직(예를 들어, 손상 또는 염증 조직)으로 변경시키고/시키거나 대식세포 및/또는 단핵구 접착 특성을 향상시키는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 선택적으로 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 골수성 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되; 이동 및/또는 접착 특성은 TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 평가된다. 예를 들어, 일부 예에서, 세포 또는 조직과 TGF-β(예를 들어, TGF-β1)의 단기간 상호작용은 대식세포 또는 단핵구의 이동을 자극한 반면, 장기간 노출은 이들의 이동을 감소시켰다. 예를 들어, 문헌[Kim et al., Blood 108:1821-1829 (2006), 및 Xu et al Bone Research, 6 (Article No. 2) (2018)] 참조.
본 개시내용은 주화성(예를 들어, 시간차 현미경 또는 보이덴 챔버 분석에 의해 평가)을 유도하고/하거나 비만 세포의 접착 특성을 향상시키는 방법을 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 비만 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되; 주화성 및/또는 접착 특성은 TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 평가된다.
본 개시내용은 자가 반응성 및/또는 염증 T 세포(예를 들어, Th1, Th2, Th17 및/또는 Th22 세포)를 조절하는 방법을 포함하고, 제공한다. 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 T 세포를 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내에서) 접촉시키는 단계를 포함한다. 하나 이상의 야생형 및/또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 TGF-β 작제물 또는 복합체는 이러한 염증 T 세포와 직접 상호작용할 수 있고/있거나, 방출된 분자(예를 들어, 사이토카인/인터류킨)를 통해 또는 다른 세포 집단을 통해 이러한 세포에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 하나 이상의 야생형 및/또는 변이체 IL-2 MOD를 선택적으로 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(TGF-β/IL-2 복합체)의 투여는 (시험관내 또는 생체내에서) FoxP3+ T reg 세포의 발생 및/또는 생존을 직접적으로 자극할 수 있다. FoxP3+ T reg 세포를 초래하는 세포와 TGF-β/IL-2 복합체의 직접적인 상호작용에 추가로, 얻어진 T reg는, 예를 들어, T 세포 활성화 및/또는 T 세포 반응의 효과기 단계의 유도를 차단하고/하거나, B 세포 활성화를 억제하고, 자연 살해 세포의 분화 및/또는 증식을 저해함으로써, 다른 세포에 영향을 미칠 수 있다. T reg에 의한 이러한 작용은 IL-10, TGF-β의 생산, 및/또는 항원 제시 세포 상의 B7(B7-1 또는 CD80/B7-2 또는 CD86)에 대한 Treg 상의 CTLA-4의 결합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 수단을 통해 수행되어, 해당 세포의 CD28 공자극과 경쟁할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 Th1, Th2, Th17, Th22 등과 같은 계통에 속하는 자가반응 T 세포 및 염증 T 세포를 조절하는 방법을 포함하고, 제공한다. 자가반응 세포는 방관자 T 세포(예를 들어, 방관자 Th1, Th2 및/또는 Th17 세포)의 집단일 수 있다. 예를 들어, 셀리악병에서, 조절되는 T 세포는 장 점막에서 발견되는 Th17 세포를 포함하여, IL-17A, IL-17F, IL-21 및/또는 IL-22의 감소된 발현, 분비 및/또는 점막 조직 수준을 초래할 수 있다.
본 개시내용은 CD4+ Th1 세포의 작용을 저해하고(예를 들어, 인터페론 γ 및/또는 TNF의 이들의 분비를 감소시킴), 이에 의해 대식세포의 활성화(예를 들어, 육아종 염증을 포함하는 염증 질환의 성분인 지연형 과민증 또는 "DTH"에서의 식세포작용 및 대식세포 관여) 방법을 포함하고, 제공한다. 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 CD4+ Th1 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되; Th1 세포 작용의 저해는 TGF-β 및/또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 인터페론 γ 및/또는 TNF의 생산에 의해 평가된다.
본 개시내용은 CD4+ Th2 세포의 작용(활성화)(예를 들어, 감소된 IgE, 비만 세포, 및 호산구 매개 반응)을 저해하는 방법을 포함하고, 제공하며; 상기 방법은 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상 또는 3개 이상의) 독립적으로 선택된 야생형 또는 변이체 MOD를 선택적으로 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계, 또는 이들과 CD4+ Th2 세포를 접촉시키는 단계를 포함하되; Th2 세포 작용(Th2 세포 활성화 정도)의 저해는 TGF-β 및/또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 노출된 적이 없는 처리군(예를 들어, 세포 또는 대상체)에 대해 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 생산에 의해 평가된다.
2
공자극 폴리펩타이드를 선택적으로 전달하는 방법
본 개시내용은 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 이용하여 하나 이상의(예를 들어, 1개, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 및/또는 변이체 MOD에 따라 마스킹된 형태로 TGF-β를 전달하는 방법을 제공한다. TβR을 포함하는 세포에 대한 MOD의 전달은 TβR을 함유하거나 또는 함유하지 않는 세포 상에서의 이들의 수용체(co-MOD)와 MOD의 상호작용으로 인해 복잡하게 될 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 TβR에 대한 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드의 유효 친화도에 대해 MOD의 수 및 이들의 대응하는 co-MOD의 친화도를 변화시킴으로써 세포에 대해 표적화될 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD를 혼입하는 것은 TGF-β 폴리펩타이드가 더 강하게 영향을 미치게 하거나, 또는 심지어 결합 상호작용을 지배한다. 감소된 친화도를 갖는 변이체 MOD(단, 이들은 여전히 이들의 co-MOD를 자극할 수 있음) 및 TβR에 대해 상대적으로 강한 친화도를 갖는 TGF-β 폴리펩타이드의 조합을 혼입하는 것은 TβR과 대응하는 co-MOD(들)를 둘 다 갖는 세포에 대한 이들의 결합에서 편향될(또는 심지어 선택적인) 하나 이상의 MOD(들)를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체를 허용한다. 이러한 조합물은 또한 TβR 없이 co-MOD를 보유하는 세포의 비표적 자극을 피한다.
본 개시내용은 TβR(예를 들어, TβRII 및/또는 TβRI) 및 적어도 하나의 변이체 MOD에 대응하는 co-MOD를 발현시키는 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내) 표적 세포에 대해 이들의 표면 막 상에서 TGF-β 폴리펩타이드와 적어도 하나의 변이체 MOD 둘 다의 선택적인 전달을 제공한다. 이와 관련하여 사용될 때, "선택적 전달"은 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 MOD가 TβR을 포함하지 않는 세포, 즉, "비-표적 세포"에 대해서 보다 TβR(예를 들어, TβRII 및/또는 TβRI)을 발현시키는 보다 많은 수의 세포, 즉, "표적 세포" 상에서 co-MOD에 전달된다는 것을 의미한다.
앞서 언급한 것을 고려하여, 본 개시내용은 TβR(예를 들어, TβRII 및/또는 TβRI) 및 적어도 하나의 변이체 MOD에 대응하는 co-MOD를 발현시키는 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대해 이들의 표면 막 상에서 선택적으로 TGF-β 폴리펩타이드와 적어도 하나의 변이체 MOD 둘 다의 전달을 제공하되; 상기 방법은: 세포 상에 존재하는 TβR을 포화시키는 데(예를 들어, 세포 상에 존재하는 TβR의 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30% 미만으로 점유하는 데) 불충분한 적어도 하나의 감소된 친화도 변이체 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 양과 세포 집단을 접촉시키는 단계; 및 적어도 하나의 감소된 친화도 변이체 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 세포와 상호작용하도록(예를 들어, 결합하는 데 충분한 시간 동안) 허용하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, (i) 적어도 하나의 감소된 친화도 변이체 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의해 결합된 TβR과 co-MOD를 둘 다 발현시키는 세포 수를 적어도 하나의 감소된 친화도 변이체 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의해 결합된 co-MOD를 발현시키는 세포 수로 나눈 비는 (ii) wt. wt. MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의해 결합된 co-MOD를 발현시키는 세포 수로 나눈 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의해 결합된 TβR과 co-MOD를 둘 다 발현시키는 세포 수의 비보다 더 크다.
본 개시내용은 선택적으로 비타민 D, 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 및/또는 라파마이신의 존재 하에 표적 세포를 적어도 하나의 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체과 접촉시키는 단계를 포함하는 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드와 적어도 하나의 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 둘 다의 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 전달을 제공한다. 일례에서, 적어도 하나의 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드는 비타민 D, 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 및/또는 라파마이신 중 임의의 하나, 임의의 둘 또는 모두 셋의 존재 하에 전달된다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 IL-6 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 IL-15 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 IL-21 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 IL-23 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 PD-L1 MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
본 개시내용은 표적 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)에 대한 적어도 하나의 야생형 및/또는 변이체 FasL MOD 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 둘 다의 전달 및 선택적으로 선택적 전달을 제공한다.
3
치료 또는 예방 방법
본 개시내용은 치료 및 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포의 표적 세포 집단 활성을 선택적으로 조절하고/하거나 개체를 치료하는 데 효과적인 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039), 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 또는 발현 벡터의 유효량을 개체로부터의 세포의 표적 집단(예를 들어, 시험관내 또는 생체내)과 접촉시키고/시키거나 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 표적 세포가 개체와 별개로(즉, 시험관내) 처리되는 경우에, 세포 또는 이들의 자손의 모두 또는 일부는 개체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 치료 또는 예방 방법은 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 치료 또는 예방 방법은 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 mRNA 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 치료 또는 예방 방법은 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체로부터의 세포의 표적 집단(즉, 시험관내)을 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039)와 접촉시킴으로써, 세포의 접촉된 표적 집단을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 세포의 접촉된 표적 집단(및/또는 이들의 자손)의 모두 또는 일부를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우에, 치료 또는 예방 방법은 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039), 또는 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 조성물(예를 들어, PSM-4033-4039)을 투여하는 단계를 포함한다. 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 포함하는 조성물(예를 들어, PSM-4033-4039)로 처리될 수 있는(예를 들어, 증상을 치유하고/하거나 개선하는) 조건은 불충분한 수의 Treg 세포 또는 불충분하게 활성인 Treg 세포와 연관된 병태, 자가면역질환 또는 장애, 알레르기 반응(들), 상처(예를 들어, 진피 및/또는 점막 상처) 및/또는 화상을 포함한다. 또한, 장기 이식을 받는 개체는 또한 치료로 부터 유익을 얻을 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 불충분한 수의 FoxP3+ Treg 세포 또는 불충분하게 활성인 FoxP3+ Treg 세포를 갖는 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 PSM-4033-4039를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. IL-2 또는 변이체 IL-2 MOD가 있거나 또는 없는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)은 비타민 D(예를 들어, 1α,25-다이하이드록시비타민 D3 또는 1α,25-다이하이드록시콜레칼시페롤) 또는 비타민 D 유사체, 라파마이신 및/또는 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 중 어느 하나 이상의 투여 전에, 투여 동안에(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 자가면역질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 또는 예방을 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-2 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, PSM-4033-4039)을 포함한다. 제2 예에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 적어도 하나의 독립적으로 선택된 IL-2 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 및 적어도 하나의 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 제2 예에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 자가면역질환은 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역-연관 불임, 자가면역 혈소판 감소 자색반, 수포성 유사천포창, 크론병, 굿파스쳐 증후군, 사구체 신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증근무력증(MG), 천포창(예를 들어, 심상성 천포창), 악성빈혈, 다발근염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스(SLE), 혈관염 및 백반증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 자가면역질환은 T1D이다. 실시형태에서, 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 자가면역질환은 셀리악병이다. T1D 및/또는 셀리악병은 또한 본 개시내용의 방법으로 치료되는 자가면역질환으로부터 제외될 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 Th17 세포에서 결핍증을 갖는 개체(예를 들어, 장에서 박테리아 및/또는 진균 감염에 충분히 반응할 수 없는 개체)에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-6 또는 변이체 IL-6 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 장에서의 박테리아 및/또는 진균 감염에 충분히 반응할 수 없는 개체에게 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-6 및/또는 변이체 IL-6 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-6 및/또는 변이체 IL-6 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 Th9 세포에서 결핍증을 갖는 개체(예를 들어, 연충 감염에 충분히 반응할 수 없는 개체)에게 연충 감염에 반응하는 데 충분한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-4 또는 변이체 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 연충 감염에 충분히 반응할 수 없는 개체에게 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-4 및/또는 변이체 IL-4 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-4 및/또는 변이체 IL-4 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 Tfh 세포에서 결핍증을 갖는 개체(예를 들어, 고친화도 항체 또는 충분한 양의 고친화도 항체를 생성할 수 없는 개체)에게 고친화도 항체의 생산을 증가시키는 데 충분한 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-21, IL-23, 변이체 IL-21 또는 변이체 IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 고친화도 항체 또는 불충분한 양의 고친화도 항체를 생산할 수 없는 개체에게 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-21, IL-23, 변이체 IL-21 또는 변이체 IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-21, IL-23, 변이체 IL-21 또는 변이체 IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열, 또는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 대조군에 비해 과량의 Th1 세포 활성을 갖는 개체(예를 들어, 표적 조직 또는 순환에서 상승된 수준의 활성화된 대식세포 및/또는 상승된 수준의 인터페론 감마 "IFN-γ"를 갖는 개체)에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 상승된 수준의 활성화된 대식세포 및/또는 상승된 수준의 인터페론 감마 "IFN-γ"를 갖는 개체에게(예를 들어, 순환 또는 표적 조직에서) 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다.
치료 또는 예방 방법은 대조군에 비해 과량의 Th2 세포 활성을 갖는 개체(예를 들어, 상승된 수준의 활성화된 비만 세포(MAST cell) 및/또는 순환 또는 조직 국소화되는 상승된 수준의 IgE를 갖는 개체)에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 상승된 수준의 활성화된 비만 세포 및/또는 상승된 수준의 IgE(순환 또는 조직 국소화)를 갖는 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 자가반응 T 세포(또는 고친화도 T-세포)의 T-세포 수용체-유도 활성화를 갖는 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 자가반응 T-세포를 갖는 개체에게 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039), 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 (예를 들어, 흉선세포 IL-7Ra 발현의 제어에 의해) 저친화도 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 IL-7-의존적 생존을 촉진시키는 것이 바람직한 개체에게 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-7 또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 저친화도 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 수준을 충분히 유지할 수 없는 개체에게 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-7 및/또는 변이체 IL-7 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 IL-7 및/또는 변이체 IL-7 폴리펩타이드를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 특정 세포(예를 들어, 암세포 또는 특정 마커를 보유하는 암 세포, 예컨대, 암 항원 15 내지 3, 27 내지 29, 125, 암태아성 항원, 알파-태아단백질 및/또는 베타 2-마이크로글로불린)의 세포자멸사를 촉진시키는 것이 바람직한 개체에게 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039)를 암호화하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 wt. Fas 리간드 또는 변이체 Fas 리간드 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
치료 또는 예방 방법은 iTreg(CD4+ FoxP3+) 세포를 유도하는 것이 바람직한 개체(예를 들어, 효과기 T(T eff) 세포를 적극적으로 억제하고/하거나 면역-매개 조직 손상을 저해하는 말초 관용을 유도하는 것이 바람직한 개체)에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 다른 예에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 wt. 및/또는 변이체 PD-L1 MOD 폴리펩타이드 서열 및 하나 이상의 wt. 및/또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 실시형태에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 (i) 1개의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 MOD 폴리펩타이드 서열 및 (ii) 1개의 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 서열을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Francisco et al., J. Exp. Med., 206(13): 3015-3029 (2009)] 참조.
치료 또는 예방 방법은 II형 선천성 림프구 세포(ILC2 세포)를 저해하는 것(예를 들어, 천식, 알레르기 반응 및/또는 알레르기 염증을 억제하는 것)이 바람직한 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다. IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD가 있거나 또는 없는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)은 글루코코르티코이드(예를 들어, 덱사메타손, 프레드니손 등), 항히스타민(예를 들어, 다이펜하이드라민, 클로르페니라민 등), 및/또는 에피네프린의 투여 전에, 투여 동안에(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
치료 또는 예방 방법은 알레르기, 알레르기 염증 및/또는 상승된 수준의 IgE(순환 또는 조직 국소화)를 갖는 개체에게 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 치료 또는 예방 방법은 상승된 수준의 IgE(순환 또는 조직 국소화)를 갖는 개체에게 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD가 있거나 또는 없는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)은 글루코코르티코이드(예를 들어, 덱사메타손, 프레드니손 등), 항히스타민(예를 들어, 다이펜하이드라민, 클로르페니라민 등), 및/또는 에피네프린의 투여 전에, 투여 동안에(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 투여될 수 있다. TGF-β 및 IL-10은 비만 세포을 활성화시키는 고친화도 IgE 수용체(Fc1RI)의 발생을 억제하는 작용을 하고, IL-10은 추가적으로 만성 염증의 과도한 비만 세포 활성화 및 발생을 방지하는 작용을 한다. 예를 들어, 문헌[Kennedy et al. Journal of Immunology, 180(5) 2848-2854 (2008)]을 참조한다.
예방 방법은 다발성 경화증으로 진단되거나 이를 갖는 개체에게, 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 일례에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
적어도 하나의 피부 또는 점막 화상을 갖는 개체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 예에서, 상기 방법은 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 화상은 1도, 2도 또는 3도 화상일 수 있다.
적어도 하나의 피부 또는 점막 상처(표피 또는 점막의 찰과상, 박리, 절개, 열상 또는 천공)를 갖는 개체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 상처봉합에 속도를 내거나(봉합까지의 시간 감소), 치유 시간을 감소시키거나, 치료되지 않은 상처에 대한 흉터 형성을 감소시키기 위해 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 예에서, 상기 방법은 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. IL-10 MOD 폴리펩타이드가 있거나 없는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 TGF-β1 폴리펩타이드를 포함할 때, 상기 방법은 손상 부위에 대한 염증 세포의 보충; 세포외 기질 단백질, 예컨대, 피브로넥틴, 콜라겐 (예를 들어, I형 및/또는 III), 및/또는 VEGF의 발현; 상처봉합을 가능하게 하는 자극 섬유아세포 수축; 인테그린, 예컨대, β1, α5, αv 및 β5의 상처 부위 발현; 및 각질형성세포 이동 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. IL-10 MOD 폴리펩타이드가 있거나 또는 없는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 TGF-β2 폴리펩타이드를 포함할 때, 상기 방법은 순환 및 상처 가장자리로부터 상처 부위로의 섬유아세포와 면역 세포 둘 다의 보충; 콜라겐(예를 들어, I 및/또는 III형)의 발현; 및 피브로넥틴의 발현 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pakyari et al Adv Wound Care, 2(5): 215-224 (2013)]을 참조한다. 이러한 방법에서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 상체에 직접 적용되거나 또는 주사될 수 있다.
적어도 하나의 피부 또는 점막 상처(표피 또는 점막의 찰과상, 박리, 절개, 열상 또는 천공)를 갖는 개체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 치료되지 않은 상처에 대한 흉터 형성을 감소시키기 위해 개체에게 유효량의 마스킹된 TGF-β(예를 들어, TGF-β3) 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β3 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 예에서, 상기 방법은 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 및/또는 마스킹된 TGF-β(예를 들어, TGF-β3) 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β(예를 들어, TGF-β3) 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 마스킹된 TGF-β(예를 들어, TGF-β3) 작제물 또는 복합체는 상체에 직접 적용되거나 또는 주사될 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, TGF-β3은 1형 콜라겐 침착을 감소시키는 한편 MMP-9에 의한 콜라겐 분해를 촉진시켜, 감소된 흉터 형성을 야기한다는 것이 이해될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pakyari et al Adv Wound Care, 2(5): 215-224 (2013)]을 참조한다.
개체에서 장기 이식을 용이하게 하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에게 절개 봉합에 속도를 내거나(봉합까지의 시간을 감소), 회복 시간을 감소시키거나, 또는 봉합까지의 평균 시간에 비해 흉터 형성을 감소시키거나, 장기 이식 유형, 연령, 성별, 흡연 습관 및/또는 체질량 지수에 대해 매칭된 비치료 개체에서의 회복 시간 또는 흉터 형성을 감소시키기 위해 유효량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 투여하는 단계를 포함한다. 예에서, 상기 방법은 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2 또는 3개의) 독립적으로 선택된 IL-10 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
이식편대 숙주질환(GVHD, 급성 GVHD를 포함)을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에게 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
임의의 앞서 언급한 방법에서, 달리 구체화되지 않는 한, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 TGF-β 폴리펩타이드는 앞서 언급한 부문에서 논의된 바와 같은 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3 폴리펩타이드 또는 이의 변이체(예를 들어, TGF-β 폴리펩타이드 이량체화를 제한하는 대응하는 돌연변이를 갖는 TGF-β3 C77S 변이체 또는 TGF-β1 또는 TGF-β2 변이체)일 수 있다. 유사하게, TGF-β 폴리펩타이드를 마스킹하는 폴리펩타이드는 상기 기재한 것(예를 들어, 항체 또는 이들의 단편, 단일 쇄 항체, 또는 TGF-β에 결합하는 TβRI 또는 TβRII 엑토도메인 단편)으로부터 선택될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 치료 또는 예방의 대상 방법을 수행함에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 그 자체로 투여된다. 다른 예에서, 치료 또는 예방의 대상 방법을 수행함에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산은 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에게 투여된다. 따라서, 다른 예에서, 하나 이상의 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 재조합 발현 벡터는 이를 필요로 하는 개체에게 투여된다.
N. 투약량
적합한 투약량은 다양한 임상 인자에 기반하여 담당 의사 또는 다른 자격있는 의료인에 의해 결정될 수 있다. 의학 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 한 명의 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 폴리펩타이드 또는 핵산, 환자의 성별, 시간 투여 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여 중인 다른 약물을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 1ng/㎏ 체중 내지 20㎎/㎏ 체중/용량, 예를 들어, 0.1㎎/㎏ 체중 내지 10㎎/㎏ 체중, 예를 들어, 0.5㎎/㎏ 체중 내지 5㎎/㎏ 체중의 양으로 투여될 수 있지만; 그러나, 특히 앞서 언급한 인자를 고려하여 이 범위 미만의 또는 초과의 용량이 생각된다. 요법이 연속 주입이라면, 이는 또한 1㎍ 내지 10㎎/체중 킬로그램/분의 범위일 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 약 1㎎/㎏ 체중 내지 50㎎/㎏ 체중, 예를 들어, 약 1㎎/㎏ 체중 내지 약 5㎎/㎏ 체중, 약 5㎎/㎏ 체중 내지 약 10㎎/㎏ 체중, 약 10㎎/㎏ 체중 내지 약 15㎎/㎏ 체중, 약 15㎎/㎏ 체중 내지 약 20㎎/㎏ 체중, 약 20㎎/㎏ 체중 내지 약 25㎎/㎏ 체중, 약 25㎎/㎏ 체중 내지 약 30㎎/㎏ 체중, 약 30㎎/㎏ 체중 내지 약 35㎎/㎏ 체중, 약 35㎎/㎏ 체중 내지 약 40㎎/㎏ 체중, 또는 약 40㎎/㎏ 체중 내지 약 50㎎/㎏ 체중의 양으로 투여된다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 적합한 용량은 0.01㎍ 내지 100 g/㎏ 체중, 0.1㎍ 내지 10 g/㎏ 체중, 1㎍ 내지 1 g/㎏ 체중, 10㎍ 내지 100㎎/㎏ 체중, 100㎍ 내지 10㎎/㎏ 체중, 또는 100㎍ 내지 1㎎/㎏ 체중이다. 당업자는 체액 또는 조직 내 투여된 제제의 측정된 체류 시간 및 농도에 기반하여 투약에 대한 반복 속도를 용이하게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후에, 환자는 질환 상태의 재발을 방지하기 위한 유지 요법을 받는 것이 바람직할 수 있되, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 또는 단일쇄 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 0.01㎍ 내지 100g/㎏ 체중, 0.1㎍ 내지 10g/㎏ 체중, 1㎍ 내지 1g/㎏ 체중, 10㎍ 내지 100㎎/㎏ 체중, 100㎍ 내지 10㎎/㎏ 체중, 또는 100㎍ 내지 1㎎/㎏ 체중 범위의 유지 용량으로 투여된다.
당업자는 용량 수준이 특정 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 증상의 중증도 및 대상체의 부작용에 대한 감수성의 함수로서 다를 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 주어진 화합물의 바람직한 투약량은 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정 가능하다.
일부 경우에, 다회 용량의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터가 투여된다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터의 투여 빈도는 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 증상의 중증도 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 1개월당 1회, 1개월당 2회, 1개월당 3회, 격주(qow), 주당 1회(qw), 주당 2회(biw), 주당 3회(tiw), 주당 4회, 주당 5회, 주당 6회, 격일(qod), 매일(qd), 1일 2회(qid), 또는 1일 3회(tid)로 투여된다.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터의 투여의 지속기간, 예를 들어, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터가 투여되는 기간은 임의의 다양한 인자, 예를 들어, 환자 반응 등에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 약 1일 내지 약 1주, 약 2주 내지 약 4주, 약 1개월 내지 약 2개월, 약 2개월 내지 약 4개월, 약 4개월 내지 약 6개월, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 1년, 약 1년 내지 약 2년, 또는 약 2년 내지 약 4년 또는 그 이상의 범위의 시간 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
O. 투여 경로
활성제(마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터)는 생체내 및 시험관내 방법을 포함하는 약물 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 방법 및 투여 경로뿐만 아니라 전신 및 국소화된 투여 경로를 이용하여 개체에게 투여된다.
통상적인 및 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로는 종양내, 종양 주위, 근육내, 기관내, 림프내, 두개내, 피부, 피하, 진피내, 국소 적용, 정맥내, 동맥내, 직장, 비강, 경구 및 다른 장 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는 원한다면 조합될 수 있고, 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 및/또는 원하는 효과에 따라 조절될 수 있다. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 또는 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 정맥내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 근육내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 림프내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 국소로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 종양내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 종양 주위로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 두개내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 피부로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 피하로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 상처(예를 들어, 진피 또는 점막 상처)에 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 화상 조직(예를 들어, 진피 화상)에 투여된다.
일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 정맥내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 근육내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 국소로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 종양내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 종양주위로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 두개내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 피부로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 피하로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 림프내로 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 상처(예를 들어, 진피 또는 점막 상처)에 투여된다. 일부 경우에, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 화상 상처(예를 들어, 진피 화상)에 투여된다.
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터는 전신 또는 국소화된 경로를 포함하는 통상적인 약물의 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 통상적인 방법 및 경로를 이용하여 숙주에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법에서 사용하기 위해 상정된 투여 경로는 장, 비경구, 피부 및 흡입 경로를 포함하지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
흡입 투여 이외의 비경구 투여 경로는 국소, 경피, 피하, 근육내, 안와내, 낭내, 척수내, 흉골내, 종양내, 림프내, 종양 주위, 및 정맥내 경로, 즉, 소화관을 통하는 것 이외의 임의의 투여 경로를 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지는 않는다. 비경구 투여는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 핵산 또는 재조합 발현 벡터의 전신 또는 국소 전달을 달성하기 위해 수행될 수 있다. 전신 전달이 요망되는 경우, 투여는 전형적으로 약제학적 제제의 침습성 또는 전신으로 흡수된 국소 또는 점막 투여를 수반한다.
P. 치료에 적합한 대상체
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039)에 의한, 예컨대 본 명세서에 기재된 방법에 의한 치료에 적합한 대상체는 자가면역질환, 알레르기 반응(들), 상처(예를 들어, 진피 및/또는 점막 상처) 및/또는 화상을 갖는 개체(예를 들어, 인간)을 포함한다. 대상체는 추가적으로 장기 이식을 받는 개체를 포함한다. 인간에 추가로, 대상체는 치료를 필요로 하는 소, 개, 염소, 긴꼬리원숭이, 고양이, 토끼, 토끼, 뮤린, 양, 돼지 또는 유인원 대상체 또는 환자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 비-인간 포유류를 포함한다.
자가면역질환 또는 병태를 갖고, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, PSM-4033-4039)를 이용하는 치료에 적합한 대상체(개체)는 자가면역질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단된 개체, 및 자가면역질환 또는 병태에 대해 치료된 적이 있지만 치료에 반응하지 않은 개체를 포함한다. 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 자가면역질환 및 병태는 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 뇌척수염,, 자가면역 결장염, 자가면역 위염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역-연관 불임, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막병증, 자가면역 혈소판 감소 자색반 자반병, 자가면역 두드러기, 수포성 유사천포창, 셀리악병, 크론병, 굿파스쳐 증후군, 사구체 신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 이식편대숙주질환(GVHD, 급성 GVHD를 포함), 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 염증성 장질환, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증근무력증(MG), 천포창(예를 들어, 심상성 천포창), 악성빈혈, 다발근염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스(SLE), 이식거부, 1형 당뇨병(T1D) 혈관염 및 백반증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 자가면역질환은 T1D이다. 실시형태에서, 자가면역질환은 셀리악병이다. T1D 및/또는 셀리악병을 갖는 개체는 치료에 적합한 대상으로부터 제외될 수 있다. 유사하게, T1D 및/또는 셀리악병은 치료에 대한 자가면역질환 대상으로부터 제외될 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 자가면역질환 및 병태는 류마티스 관절염(RA), 건선/건선성 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장질환, 애디슨병, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 중증근무력증, 자가면역 혈관염 및 악성빈혈을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
알레르기 반응을 갖는 대상체는 알레르겐이 열거하기에 너무 많기 때문에 알레르겐에 의해 용이하게 범주화될 수 없다. 예로서, 그러나, 알레르기 반응(들)을 갖는 대상체(예를 들어, 알레르기에 대해 이전에 치료를 받은 개체 또는 치료된 적이 없는 개체)는 땅콩 및 낭욜매(tree nut), 식물 꽃가루, 라텍스 등에 대해 반응을 갖는 것을 포함한다. 예를 들어, 땅콩 알레르겐에 대해 알레르기 반응을 갖는 대상체는 7가지 단백질 패밀리로부터 유래된 Ara h 1 내지 13 단백질에 대해 반응을 갖는 것을 포함하고, Ara h 1(예를 들어, PGQFEDFF(서열번호 161), YLQGFSRN(서열번호 162), FNAEFNEIRR(서열번호 163), QEERGQRR(서열번호 164), DITNPINLRE(서열번호 165), NNFGKLFEVK(서열번호 166), GNLELV(서열번호 167), RRYTARLKEG(서열번호 168), ELHLLGFGIN(서열번호 169), HRIFLAGDKD(서열번호 170), IDQIEKQAKD(서열번호 171), KDLAFPGSGE(서열번호 172), KESHFVSARP(서열번호 173), NEGVIVKVSKEHVEELTKHAKSVSK(서열번호 174), Ara h 2(예를 들어, HASARQQWEL(서열번호 175), QWELQGDRRC(서열번호 176), DRRCQSQLER(서열번호 177), LRPCEQHLMQ(서열번호 178), KIQRDEDSYE(서열번호 179), YERDPYSPSQ(서열번호 180), SQDPYSPSPY(서열번호 181), DRLQGRQQEQ(서열번호 182), KRELRNLPQQ(서열번호 183), QRCDLDVESG(서열번호 184) 및 Ara h 3(예를 들어, IETWNPNNQEFECAG(서열번호 185), GNIFSGFTPEFLAQA(서열번호 186), VTVRGGLRILSPDRK(서열번호 187), DEDEYEYDEEDRRRG(서열번호 188)의 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zhou et al, (2013) Intl. J. of Food Sci. 2013 8 페이지 article ID 909140]을 참조한다. 알레르기 반응을 갖는 대상체는 또한 막시류 단백질에 대해 반응을 갖는 갖는 것(예를 들어, 봉독 및 말벌독의 알레르겐, 예컨대, 포스포리파제 A2, 멜리틴, 말벌독에서 발견되는 "항원 5" 및 하이알루로니다제)을 포함한다.
상처를 갖는 대상체는 표피 또는 점막의 찰과상, 박리, 절개, 열상 및 천공을 갖는 개체를 포함한다. 장기 이식을 받은 대상체들은 이들의 특성에 따라 해당 상처 유형 중 하나 이상을 가질 것임이 이해될 수 있다.
V.
특정 양상
상기 기재한 TGF-β 작제물 또는 복합체에 관한 대상의 양상을 포함하는 특정 양상은 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 양상, 예컨대, TGF-β 작제물 및 복합체에 관해 이해에 열거되는 것, 이들의 제조 방법 및 (예를 들어, 치료제로서) 이들의 사용 방법과 조합할 때 유리할 수 있다.
1. 작제물로서,
i) 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
ii) TGF-β 폴리펩타이드 서열;
iii) 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열);
iv) 선택적으로, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열;
및
v) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이)
을 제1 폴리펩타이드로서 포함하되,
이들 요소를 포함하는 작제물은 "마스킹된 TGF-β 작제물"로서 총괄적으로 지칭되고, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서로 결합된(TGF-β 폴리펩타이드 서열을 마스킹하기 위해 서로 상호작용하는), 작제물. 예를 들어, 도 1, 구조 A를 참조한다.
2. 양상 1에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로:
i) 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는
ii) 제1 MOD 폴리펩타이드 서열, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는
iii) 제1의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 제2의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열(탠덤으로 MOD), 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열
을 포함하되,
마스킹된 TGF-β 작제물은 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 (예를 들어, 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이에) 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물.
3. 양상 1 또는 양상 2에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드는 이량체화(또는 다량체화) 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물.
4. 양상 3에 있어서, 마스킹된 TGF-β 복합체 동형이량체의 형태로, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 선택적으로 서로에 대해 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 공유 부착(예를 들어, 이황화결합)을 갖되(예를 들어, 제1 폴리펩타이드로서 마스킹된 TGF-β 작제물의 제1 분자는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열의 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 제2 폴리펩타이드로서 마스킹된 TGF-β 작제물의 제2 분자와 이량체화되어 동형이량체를 형성하고), 선택적으로 스캐폴드는, 예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 세포 용해를 유도하는 Ig 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 감소 또는 제거하는 돌연변이(예를 들어, LALA 돌연변이)를 포함하는 Ig Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. 예를 들어, 도 1, 구조 B를 참조한다.
5. 양상 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드는 종간 이량체화 서열(예를 들어, 동형이량체화와 대조적으로 상대 종간 결합 서열과 우선적으로 이량체화하는 이량체화 서열)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. 예를 들어, 도 1, 구조 C 및 F를 참조한다.
6. 양상 5에 있어서, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체를 형성하기 위해 제1 폴리펩타이드와 이량체화되는 제2 폴리펩타이드를 더 포함하되,
상기 제2 폴리펩타이드는 제1 폴리펩타이드의 종간 결합 서열에 대한 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고; 상기 종간 결합 서열 및 상기 상대 종간 결합 서열은 이형이량체에서 서로 상호작용하는, 마스킹된 TGF-β 작제물.
7. 양상 6에 있어서, 제2 폴리펩타이드는:
(i) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
(ii) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열(예를 들어, 탠덤으로) 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
(iii) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 독립적으로 선택된 MOD 서열; 또는
(iv) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열(예를 들어, 탠덤으로) 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열
을 포함하되,
상기 제1 폴리펩타이드 및 또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 (예를 들어, 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이에) 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 예를 들어, 도 1, 구조 F를 참조한다.
8. 양상 6 또는 7에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지:
i) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
(ii) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열(예를 들어, 탠덤으로) 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
(iii) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열; 또는
(iv) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열(예를 들어, 탠덤으로) 및 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열
을 포함하되,
상기 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 예를 들어, 도 1, 구조 F를 참조한다.
9. 양상 6에 있어서, 제2 폴리펩타이드는:
i) 선택적으로, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열;
ii) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
iii) TGF-β 폴리펩타이드 서열;
iv) 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열);
및
v) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 제2 폴리펩타이드 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이)
을 포함하되,
상기 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서로 결합된(TGF-β 폴리펩타이드 서열을 마스킹하기 위해 서로 상호작용하는), 마스킹된 TGF-β 복합체. 예를 들어, 도 1, 구조 C를 참조한다.
10. 양상 9에 있어서, 상기 제2 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로:
i) 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열;
ii) 제1 MOD 폴리펩타이드 서열, 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는
iii) 제1의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 제2의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체. 예를 들어, 도 1, 구조 C를 참조한다.
11. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 이형이량체(또는 다량체)로서 포함하는 복합체로서,
(i) 제1 폴리펩타이드는,
a) 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열,
b) 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열),
c) 선택적으로, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 및
d) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 제1 폴리펩타이드 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이)을 포함하고;
(ii) 제2 폴리펩타이드는,
a) 제1 폴리펩타이드에서 종간 이량체화 서열에 대한 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열,
b) TGF-β 폴리펩타이드 서열,
c) 선택적으로, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 및
d) 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 제2 폴리펩타이드 앞서 언급한 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이)
을 포함하되,
이들 요소를 포함하는 복합체는 "마스킹된 TGF-β 복합체"로서 총괄적으로 지칭되고, 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열) 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서로 결합되고(TGF-β 폴리펩타이드 서열을 마스킹하기 위해 서로 상호작용하고),
종간 결합 서열 및 상대 종간 결합 서열은 이형이량체에서 서로 상호작용하고(예를 들어, 비공유적으로 결합하고); 그리고
마스킹된 TGF-β 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 (예를 들어, 이들의 폴리펩타이드 서열 중 어느 것 사이에) 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 복합체. 예를 들어, 도 1, 구조 D 및 E.
12. 양상 11에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지:
a) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 a) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열, 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열), 또는
b) 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열)
을 포함하되,
제2 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열, 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체.
13. 양상 1 내지 12 중 어느 것에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(들)은 Ig Fc 폴리펩타이드 서열(예를 들어, CH2-CH3 영역 서열); Ig 중쇄 영역 1 (CH1) 도메인; 경쇄 불변 영역("CL")(예를 들어, Ig κ 쇄(카파 쇄) 불변 영역 또는 Ig λ 쇄(람다 쇄)); 류신 지퍼 폴리펩타이드 서열; Fos 또는 Jun 결합쌍 서열; 콜렉틴 폴리펩타이드(예를 들어, ACRP30 또는 ACRP30-유사 단백질); 또꼬인 나선 도메인; 및 앞서 언급한 것중 어느 것의 변이체(예를 들어, 노브-인-홀 및 표 1의 다른 종간 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
14. 양상 1 내지 13 중 어느 것에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 Ig Fc 폴리펩타이드 서열(면역글로불린 서열); Ig 중쇄 서열(예를 들어, CH2-CH3 영역 서열); Ig 중쇄 영역 1(CH1) 도메인; 경쇄 불변 영역("CL")(예를 들어, Ig κ 쇄(카파 쇄) 및 앞서 언급한 것 중 어느 것의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체. 일 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드는 MD13 치환을 보유하는 Ig CH1 도메인 또는 MD13 치환을 보유하는 Ig κ 쇄 서열로부터 선택된다.
15. 양상 14에 있어서, 면역글로불린 서열은 서열번호 68 내지 83 또는 85 내지 87 중 어느 것에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체. 예를 들어, 도 2A 내지 도 2H, 및 도 2J 내지 도 2K를 참조한다. (면역글로불린 서열은 이량체를 형성할 수 있고, IgM 서열의 경우에, 예컨대 도 2H에서, 다량체를 형성할 수 있다).
16. 15에 있어서, 면역글로불린 서열은 서열번호 68 내지 83 중 어느 것에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 면역글로불린 중쇄 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체. 예를 들어, 도 2A 내지 도 2H를 참조한다. (면역글로불린 서열은 이량체를 형성할 수 있고, IgM 서열의 경우에, 예컨대 도 2H에서, 다량체를 형성할 수 있다).
17. 양상 4 및 6 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 서로에 대해 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 공유 부착을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
18. 양상 17에 있어서, 하나 이상의 공유 부착 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2개 이상)는 제1 폴리펩타이드의 스캐폴드 폴리펩타이드 서열과 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 폴리펩타이드 서열 사이의 이황화결합인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
19. 양상 14 내지 18 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 서열은 선택적으로 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 이황화결합에 의해 공유적으로 연결된 CH2-CH3 면역글로불린 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Ig Fc) 폴리펩타이드 서열인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
20. 양상 5에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드는 i) 종간 면역글로불린(Ig) 중쇄 서열; ii) Ig CH1 도메인; iii) Ig 경쇄 불변 영역("CL")(예를 들어, Ig κ 쇄(카파 쇄) 또는 Ig λ 쇄(람다 쇄) 불변 영역); 및 (iv) Fos/Jun 결합쌍의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 종간 이량체화 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. 일 실시형태에서, 스캐폴드 폴리펩타이드는 MD13 치환을 보유하는 Ig CH1 도메인 또는 MD13 치환을 보유하는 Ig κ 쇄 서열로부터 선택된 종간 이량체화 서열을 포함한다.
21. 양상 20에 있어서, 종간 결합 서열은 서열번호 68 내지 82 또는 85 내지 87 중 어느 것에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. 예를 들어, 도 2A 내지 도 2G, 및 도 2J 내지 도 2K를 참조한다.
22. 양상 4 및 6 내지 12 중 어느 것에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 폴리펩타이드는 종간 이량체화 서열, 및 (i) 종간 면역글로불린(Ig) 중쇄 서열(예를 들어, 중쇄 CH1-CH2 영역); (ii) Ig CH1 도메인 및 이의 상대 종간 경쇄 불변 영역("CL") 중 하나(예를 들어, Ig κ 쇄(카파 쇄) 불변 영역 또는 Ig λ 쇄(람다 쇄) 불변 영역); (iii) Fos/Jun 결합쌍; 및 (iv) Ig 중쇄 영역 1(CH1) 및 경쇄 불변 영역("CL") 서열(CH1/CL 쌍, 예컨대, κ 또는 λ Ig 경쇄 불변 영역 서열과 짝지어진 CH1 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된, 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 일 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 폴리펩타이드는 종간 이량체화 서열, 및 MD13 치환을 보유하는 Ig CH1 도메인 및 MD13 치환을 보유하는 Ig κ 쇄 서열을 포함하는 상대 종간 이량체화 서열쌍을 포함한다.
23. 양상 22에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 서로에 대해 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 공유 부착을 갖는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
24. 양상 22에 있어서, 하나 이상의 공유 부착 중 적어도 하나(예를 들어, 1, 2개 이상)는 제1 폴리펩타이드의 스캐폴드 서열과 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 서열 사이의 이황화결합인, 마스킹된 TGF-β 복합체.
25. 양상 22 내지 24 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 서열은 선택적으로 (제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이에) 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 이황화결합에 의해 공유적으로 연결된 CH2-CH3 면역글로불린 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Ig Fc) 폴리펩타이드 서열인, 마스킹된 TGF-β 복합체.
26. 양상 22 내지 25 중 어느 것에 있어서, 종간 결합 서열 및/또는 상대 종간 결합 서열은 서열번호 68 내지 82 또는 85 내지 87 중 어느 것에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 예를 들어, 도 2A 내지 도 2G, 및 도 2J 내지 도 2K를 참조한다.
27. 26에 있어서, 면역글로불린 서열은 서열번호 68 내지 83 중 어느 것에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% aa 서열 동일성을 갖는 면역글로불린 중쇄 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 예를 들어, 도 2A 내지 도 2H를 참조한다. (면역글로불린 서열은 이량체를 형성할 수 있고, IgM 서열의 경우에, 예컨대 도 2H에서, 다량체를 형성할 수 있다).
27. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2A에 도시된 IgA Fc 서열(서열번호 68)의 적어도 150개의 인접한 aa(적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 325 또는 적어도 350개의 인접한 aa), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
28. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2B에 도시된 IgD Fc 서열(서열번호 69)의 적어도 150개의 인접한 aa(적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 325 또는 적어도 350개의 인접한 aa), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
29. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2C에 도시된 IgE Fc 서열(서열번호 70)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 200개의 인접한 aa) 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
30. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 wt. IgG Fc 폴리펩타이드 서열, 예컨대 도 2D에 도시된 IgG1 Fc 서열(서열번호 71 내지 78)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 또는 적어도 200개의 인접한 aa) 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
31. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2E에 도시된 IgG2 Fc 폴리펩타이드 서열(서열번호 79)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275 또는 적어도 300), 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
32. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2F에 도시된 IgG3 Fc 서열(서열번호 80)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 또는 적어도 225) 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
33. 양상 1 내지 27 중 어느 것에 있어서, 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 선택적으로 종간 이량체화 서열 및/또는 상대 종간 이량체화 서열을 포함하되, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열은 도 2G에 도시된 IgG4 Fc 서열(서열번호 81 또는 82)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225 또는 적어도 250) 또는 모든 aa에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
34. 양상 27 내지 33 중 어느 것에 있어서, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서열의 이들의 힌지 영역에 인접한 시스틴 사이)에 1 또는 2개의 쇄간 이황화결합을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
35. 양상 1 내지 34 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 스캐폴드 폴리펩타이드는 보체 성분 1q(C1q) 및/또는 Fc 람다 수용체(FcλR)에 대한 폴리펩타이드의 결합을 제한하고(예를 들어, 감소시키고)/하거나 보체-의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해 세포 용해를 유도하는 Ig 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 감소 또는 제거하는 하나 이상의 치환을 보유하는 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
36. 양상 35에 있어서, 각각의 스캐폴드 폴리펩타이드는 wt. IgG1 Fc 서열(서열번호 71)의 적어도 125개의 인접한 aa(적어도 150, 적어도 175, 적어도 200 또는 적어도 220개의 인접한 aa)에 대해 적어도 약 70%(예를 들어, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 면역글로불린(Ig) 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
37. 양상 36에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 aa 234, 235, 236, 237, 238, 및 239(234-LLGGPS-239) 중 어느 1, 2개 이상의 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
38. 양상 36 또는 37에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 N297, P331, D270, K322 및/또는 P329 중 어느 1, 2개 이상에서 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
39. 양상 36 내지 38 중 어느 것에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 아스파라긴 이외의 aa으로의 N297 치환(서열번호 71의 N77)(예를 들어, 서열번호 74에서와 같이 N297A를 제공하는 알라닌)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
40. 양상 36 내지 38 중 어느 것에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 류신 이외의 aa으로의 L234 및/또는 L235(서열번호 71에서 L14 및 L15) 치환(예를 들어, 알라닌, L234A 및/또는 L235A)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
41. 39에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 L234A 및/또는 L235A 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 서열번호 75 참조).
42. 양상 36 내지 41 중 어느 것에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 프롤린 이외의 aa으로 치환된 P331(서열번호 71의 P111)(예를 들어, P331S 치환에 대해 세린)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
43. 양상 36 내지 38 중 어느 것에 있어서, 상기 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 L234 및/또는 L235에서 치환 및 P331의 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
44. 양상 43에 있어서, 면역글로불린 폴리펩타이드 서열은 (i) L234F, L235E 및 P331S 또는 (ii) L234A, L235A 및 P331S 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
45. 양상 20 내지 44 중 어느 것에 있어서, KiH, KiHs-s, HA-TF, ZW-1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s 및 A107 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 종간 이량체화 쌍의 종간 이량체화 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 표 1 참조).
46. 양상 4 및 22 내지 44 중 어느 것에 있어서, 종간 이량체화 서열 및 상대 종간 이량체화 서열은 KiH, KiHs-s, HA-TF, ZW-1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVTs-s 및 A107 서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 쌍인, 마스킹된 TGF-β 복합체(예를 들어, 표 1 참조).
47. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 하나는 T366Y 치환 및 다른 Y407T 치환, 또는 다른 종간 면역글로불린 중쇄 서열에서 대응하는 치환을 포함하는 종간 IgG1폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 71의 서열)(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 서열을 포함하는 종간 서열)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
48. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 하나는 T366W 치환 및 다른 T366S, L368A 및 Y407V 치환, 또는 다른 종간 면역글로불린 중쇄 서열에서 대응하는 치환을 포함하는 종간 IgG1폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 71의 서열)(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 서열을 포함하는 종간 서열)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
49. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 하나는 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 치환 및 다른 S354C 및 T366W 치환, 또는 다른 종간 면역글로불린 중쇄 서열에서 대응하는 치환을 포함하는 종간 IgG1폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 71의 서열)(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 서열을 포함하는 종간 서열)을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
50. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 T146W KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 T146W, L148A 및 Y187V KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하며, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170(예를 들어, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220 또는 모두 227)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 서열번호 71에 넘버링된 바와 같은 L14 및 L15(예를 들어, L14A/L15A "LALA" 또는 L14F/L15E); N77(예를 들어, N77A); P111(예를 들어, P111S); L131(예를 들어, L131K); T146(예를 들어, T146S); P175(예를 들어, P175V); F185(예를 들어, F185R); Y187(예를 들어, Y187A); 및 K189(예를 들어, K189Y) 중 하나 이상에서 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
51. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 T146W KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 T146S, L148A 및 Y187V KiH 서열 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하며, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170(예를 들어, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 서열 중 하나 또는 둘 다는 L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하는 N77 치환(N297, 예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G)을 포함하거나, 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 예를 들어, 도 2D 서열번호 77 및 78을 참조한다.
52. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 T146W 및 S134C KiHs-s 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 T146S, L148A, Y187V 및 Y129C KiHs-s 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하며, 스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170(예를 들어, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 aa 서열 중 하나 또는 둘 다는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하기 위해(예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G 치환) L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 N77(Kabat 넘버링에서 N297) 치환을 포함하거나, 이들 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
53. 양상 46에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는:
S144H 및 F185A 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 Y129T 및 T174F 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드 제2 폴리펩타이드;
T130V, L131Y, F185A 및 Y187V 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 130V, T146L, K172L 및 T174W 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
K140D, D179M 및 Y187A 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 E125R, Q127R, T146V 및 K189V 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
K189D 및 K172D 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 D179K 및 E136K 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
K140E 및 K189W 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 Q127R, D179V, 및 F185T 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드 제2 폴리펩타이드;
K140E, K189W 및 Y129C 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 Q127R, D179V, F185T 및 S134C 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
및
K150E 및 K189W 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 E137N, D179V, 및 F185T 치환을 갖는 IgG1 스캐폴드 제2 폴리펩타이드
로부터 선택되되,
스캐폴드는 서열번호 71의 IgG1의 적어도 170(예를 들어, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 적어도 220, 또는 모두 227)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 그리고
제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 스캐폴드 aa 서열 중 하나 또는 둘 다는 Fcγ 수용체와의 상호작용을 차단함으로써 효과기 기능을 제거하기 위해 (예를 들어, Kabat 넘버링에서 N297A 또는 N297G 치환) L14 및 L15 치환(예를 들어, Kabat 넘버링에서 L234A 및 L235A "LALA"), 및/또는 N77(Kabat 넘버링에서 N297) 치환을 포함하거나, 이들 서열 중 어느 것도 이들 치환을 포함하지 않는, 마스킹된 TGF-β 복합체.
54. 양상 20에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드는:
(i) Ig 중쇄 CH1 도메인 (예를 들어, 서열번호 85의 폴리펩타이드);
(ii) Ig κ 쇄 불변 영역 서열(예를 들어, 서열번호 86); 및
(iii) Ig λ 쇄 불변 영역 서열(예를 들어, 서열번호 87)
로 이루어진 군으로부터 선택된 종간 이량체화 서열을 포함하되,
스캐폴드는 서열번호 85, 86 또는 87 각각의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 인접한 aa에 대해 적어도 80% (85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. 도 2J 및 도 2K를 참조한다. Ig CH1 도메인 및/또는 Ig κ 쇄 서열은 선택적으로 이들 각각의 MD13 치환을 포함한다.
55. 양상 22에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 중 하나의 스캐폴드 폴리펩타이드는 Ig 중쇄 CH1 도메인(예를 들어, 서열번호 85의 폴리펩타이드)을 포함하고; 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 다른 하나는 Ig κ 쇄 불변 영역 서열(예를 들어, MD13 치환을 선택적으로 포함하는 서열번호 86) 또는 Ig λ 쇄 불변 영역 서열(예를 들어, 서열번호 87) 중 하나를 포함하고;
상기 스캐폴드는 서열번호 85, 86 또는 87 각각의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80% (85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체. 도 2J 및 도 2K를 참조한다.
56. 양상 1 내지 56 중 어느 것에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개, 또는 적어도 3개의) 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
57. 양상 56에 있어서, 독립적으로 선택된 링커는 약 1 aa 내지 약 25 aa, (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 aa 길이)의 길이를 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
58. 양상 56에 있어서, 상기 독립적으로 선택된 링커는 약 25 내지 약 35 aa 길이(예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 aa 길이)를 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
59. 양상 56에 있어서, 독립적으로 선택된 링커는 약 35 내지 약 50 aa 길이(예를 들어, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45, 46, 47, 48, 49 또는 50, aa 길이)를 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
60. 양상 56 내지 59 중 어느 것에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개의) 독립적으로 선택된 링커는
(i) 약 2 내지 약 50개의 인접한 글리신 잔기를 갖는 서열을 포함하는 글리신 또는 폴리글리신;
(ii) 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 126), (GGGGS)n 서열번호 136 및 (GGGS)n(서열번호 127), 여기서, n은 적어도 1(예를 들어, 1 내지 10, 10 내지 20 또는 20 내지 30)의 정수임; 또는
(iii) 글리신-알라닌 중합체 또는 알라닌-세린 중합체(예를 들어, 1 내지 10, 10 내지 20 또는 20 내지 30 aa의 길이를 가짐)
를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
61. 양상 56 내지 59 중 어느 것에 있어서, 독립적으로 선택된 링커 중 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개)는 GGSG(서열번호 128), GGSGG(서열번호 129), GSGSG(서열번호 130), GSGGG(서열번호 131), GGGSG(서열번호 132), GSSSG(서열번호 133), GSGS(서열번호 134), GSSSSS(서열번호 135), GGGGS 서열번호 136 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 aa 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
62. 양상 56 내지 59 중 어느 것에 있어서, 독립적으로 선택된 링커 중 적어도 하나는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 제2 폴리펩타이드의 링커)에 존재하는 시스테인 잔기와의 이황화결합을 형성할 수 있거나 형성하는 시스테인 잔기(예를 들어, G C GASGGGGSGGGGS 링커 aa 서열 서열번호 137)를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
63. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은: PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 이들 중 어느 것의 변이체(예를 들어, 이들의 수용체에 대해 대응하는 wt. MOD 폴리펩타이드 서열에 비해 감소된 친화도를 갖는 변이체)로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
64. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은: PD-L1, FAS-L, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-21, IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 이들 중 어느 것의 변이체(예를 들어, 이들의 수용체에 대해 대응하는 wt. MOD 폴리펩타이드 서열에 비해 감소된 친화도를 갖는 변이체)로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
65. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은: PD-L1, FAS-L, IL-2, IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 이들 중 어느 것의 변이체(예를 들어, 이들의 수용체에 대해 대응하는 wt. MOD 폴리펩타이드 서열에 비해 감소된 친화도를 갖는 변이체)로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
66. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, MOD 폴리펩타이드 서열 중 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2개)는
(i) 서열번호 9의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖거나; 또는
(ii) 서열번호 13 내지 27의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖는,
IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
67. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 임의의 이들의 변이체(예를 들어, 이들의 수용체에 대해 대응하는 wt. MOD 폴리펩타이드 서열에 비해 감소된 친화도를 갖는 변이체)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) MOD 폴리펩타이드 서열
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
68. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 PD-L1 또는 PD-L2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, PD1 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
69. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) FAS-L MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 FAS-L MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, Fas 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
70. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-1 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-1 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, IL-1 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
71. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, IL-4 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
72. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-6 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-6 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, IL-6 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
73. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-7 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, IL-7 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
74. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-10 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, IL-10 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
75. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-15 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-15 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, IL-15 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐)
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
76. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-21 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 58 또는 60의 서열) 또는 변이체 IL-21(예를 들어, IL-21 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐) MOD 폴리펩타이드 서열
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
77. 양상 1 내지 62 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2개 이상의) 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 9의 서열을 포함) 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 양상 66의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열); 및
(ii) 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 63 또는 65) 또는 변이체 IL-23(예를 들어, IL-23 수용체에 대해, 대응하는 wt. 서열에 비해 감소된 친화도를 가짐) MOD 폴리펩타이드 서열
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
78. 양상 63 내지 77 중 어느 것에 있어서, TGF-β 폴리펩타이드/폴리펩타이드 복합체가 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함할 때, 변이체 IL-MOD 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 9의 변이체)는 N88, F42 및/또는 H16 중 어느 하나, 둘 또는 모두에서 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
79. 양상 78에 있어서, 적어도 하나의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 F42A, F42T, H16A 또는 H16T 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
80. 양상 78에 있어서, 적어도 하나의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은: (i) F42A 및 H16A; (ii) F42T 및 H16A; (iii) F42A 및 H16T; 또는 (iv) F42T 및 H16T 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
81. 양상 78에 있어서, 적어도 하나의 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은: (i) N88R, F42A 및 H16A; (ii) N88R, F42T 및 H16A; (iii) N88R, F42A 및 H16T; 또는 (iv) N88R, F42T 및 H16T 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
82. 양상 1 내지 81 중 어느 것에 있어서, 마스킹 폴리펩타이드 서열은 I형(TβRI), II형(TβRII) 또는 III형(TβRIII) TβR의 엑토도메인 단편을 포함하는 TGF-β 수용체("TβR") 폴리펩타이드 서열인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
83. 양상 82에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은 서열번호 117에 제시된 TβRII 아이소폼 A 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 154)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
84. 양상 82에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은 서열번호 119에 제시된 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140 또는 적어도 143)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
85. 양상 82에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은 서열번호 120에 제시된 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140 또는 적어도 143)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
86. 양상 82에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은: 서열번호 120의 엑토도메인 단편; 서열번호 121에서 TβRII 엑토도메인 N-말단의 Δ14(델타 14) aa 결실 서열; 서열번호 122에 제시된 N-말단의 Δ25(델타 25) aa 결실 서열; 또는 해당 TβRII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열 중 어느 것의 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 118개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 TβRII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
87. 양상 83 내지 86 중 어느 것에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은 F30, D32, S52, E55 및/또는 D118(예를 들어, 알라닌 또는 아르기닌에 의함) 중 어느 1, 2, 3, 4 또는 모두 5개의 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
88. 양상 83 내지 87 중 어느 것에 있어서,
D118A 또는 D118 R 치환(예를 들어, TβRII 엑토도메인에 대해 N-말단의 Δ25 결실 및 D118 치환을 갖는 서열번호 123 참조); 또는
D118A 또는 D118R 치환 및 F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 1, 2, 3 또는 모두 4개
를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
89. 양상 87에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은 서열번호 119 또는 서열번호 120(예를 들어, 서열번호 121의 서열 참조) 최대 14 aa의 N-말단의 결실(Δ14 aa 결실) 및 D118 치환(예를 들어, D118A 또는 D118R); 또는 해당 TβRII 폴리펩타이드 서열 중 어느 것의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 118)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
90. 양상 89에 있어서, F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 1, 2, 3 또는 모두 4개를 더 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
91. 양상 87에 있어서, TβRII 엑토도메인 서열은 서열번호 119 또는 서열번호 120의 최대 25 aa의 N-말단의 결실(Δ25 aa 결실) 및 D118 치환(예를 들어, D118A 또는 D118R, 서열번호 123 참조); 또는 해당 TβRII 폴리펩타이드 서열 중 어느 것의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
92. 양상 91에 있어서, F30A, D32N, S52L 및/또는 E55A 치환 중 1, 2, 3 또는 모두 4개를 더 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
93. 양상 82에 있어서, TβR 폴리펩타이드 서열은 TβRI 엑토도메인 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
94. 양상 93에 있어서, TβRI 엑토도메인 서열은 서열번호 115의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90 또는 93)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
95. 양상 82에 있어서, TβR 폴리펩타이드 서열은 TβRIII 엑토도메인 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
96. 양상 95에 있어서, TβRIII 엑토도메인 서열은 (A 아이소폼 서열번호 124의 aa 27 내지 787 또는 B 아이소폼 서열번호 125의 aa 27 내지 786)의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 600)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
97. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, TGF-β 폴리펩타이드 서열은 인간 TGF-β1 폴리펩타이드, 인간 TGF-β2 폴리펩타이드, 또는 인간 TGF-β3 폴리펩타이드의 성숙 형태의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 적어도 110)개의 인접한 aa을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
98. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 105의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 112)개의 인접한 aa(예를 들어, 서열번호 106의 aa 279 내지 390)에 대해 적어도 60%(적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TGF-β1 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
99. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 107의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 112) aa에 대해 적어도 60%(적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%)의 인접한 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 C77S 치환을 보유하는 TGF-β1 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
100. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은(서열번호 108)의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 112)개의 인접한 aa(예를 들어, 서열번호 109의 aa 302 내지 413)에 대해 적어도 60%(적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TGF-β2 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
101. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 110의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 112) aa에 대해 적어도 60%(적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%)의 인접한 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 C77S 치환을 보유하는 TGF-β2 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
102. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 112)개의 인접한 aa(예를 들어, 서열번호 112의 aa 301 내지 412)에 대해 적어도 60%(적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TGF-β3 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
103. 양상 1 내지 96 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 113의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%)의 aa 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 C77S 치환을 보유하는 TGF-β3 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
104. 양상 97 내지 103 중 어느 것에 있어서, TGF-β 폴리펩타이드 서열은 성숙 TGF-β 폴리펩타이드 서열의 25, 92 및/또는 94번 위치 중 하나 이상에서 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 도 3 및 도 4에서 서열번호 112 참조).
105. 양상 100 내지 101 중 어느 것에 있어서, TGF-β 폴리펩타이드 서열은 성숙 TGF-β 폴리펩타이드 서열의 25, 92 및/또는 94번 위치 중 하나 이상에서 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(예를 들어, 도 3 및 도 4에서 서열번호 112 참조).
106. 양상 97 내지 105 중 어느 것에 있어서, TGF-β 폴리펩타이드 서열은:
(i) 25번 위치에서 Lys 또는 Arg 이 아닌 aa
(ii) 92번 위치에서 Ile 또는 Val이 아닌 aa; 및/또는
(iii) (예를 들어, 서열번호 108 또는 서열번호 110에 기반하여) 94번 위치에서 Lys 또는 Arg이 아닌 aa
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
107. 양상 1 내지 106 중 어느 것에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1에서 구조 A 내지 F 중 어느 하나의 형태를 갖는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
108. 양상 107에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1의 구조 A 형태를 갖는 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
109. 양상 108에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2개 이상의) wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드.
110. 양상 107에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1의 구조 B 형태를 갖는 마스킹된 TGF-β 복합체인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
111. 양상 110에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2개 이상의) wt. 또는 돌연변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드.
112. 양상 107에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1의 구조 C 형태를 갖는 종간 마스킹된 TGF-β 복합체인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
113. 양상 112에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2개 이상의) wt. 또는 돌연변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드.
114. 양상 107에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1의 구조 D 또는 E 형태를 갖는 종간 마스킹된 TGF-β 복합체인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
115. 양상 114에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2개 이상의) wt. 또는 돌연변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드.
116. 양상 107에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1의 구조 F 형태를 갖는 종간 마스킹된 TGF-β 복합체인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
117. 양상 116에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 1, 2개 이상의) wt. 또는 돌연변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드.
118. 양상 107 내지 117 중 어느 것에 있어서,
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111에 제시된 TGF-β3 서열의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 적어도 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 wt. TGF-β3 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 111의 서열을 포함) 또는 아미노산 서열을 포함하고;
마스킹 폴리펩타이드 서열은 wt. TβRII 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 117의 서열을 포함) 또는 서열번호 117에 제시된 TβRII 아이소폼 A 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 154)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 TβRII 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는(예를 들어, 서열번호 9의 서열을 포함하는), 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
119. 양상 107 내지 117 중 어느 것에 있어서,
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111에 제시된 TGF-β3 서열의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 적어도 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 wt. TGF-β3 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 111의 서열을 포함) 또는 아미노산 서열을 포함하고;
마스킹 폴리펩타이드 서열은 wt. TβRII 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 119의 서열을 포함) 또는 서열번호 119에 제시된 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 143)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 TβRII 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는(예를 들어, 서열번호 9의 서열을 하는), 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
120. 양상 107 내지 117 중 어느 것에 있어서,
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111에 제시된 TGF-β3 서열의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 적어도 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 wt. TGF-β3 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 111의 서열을 포함) 또는 아미노산 서열을 포함하고;
마스킹 폴리펩타이드 서열은 wt. TβRII 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 120의 서열을 포함) 또는 서열번호 120에 제시된 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120 또는 적어도 129)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 TβRII 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는(예를 들어, 서열번호 9의 서열을 포함하는), 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
121. 양상 107 내지 117 중 어느 것에 있어서,
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111에 제시된 TGF-β3 서열의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 적어도 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 wt. TGF-β3 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 111의 서열을 포함) 또는 아미노산 서열을 포함하고;
마스킹 폴리펩타이드 서열은 wt. TβRII 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 117의 서열을 포함) 또는 서열번호 117에 제시된 TβRII 아이소폼 A 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 154)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 TβRII 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 서열번호 9의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 aa 서열을 포함하는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
122. 양상 107 내지 117 중 어느 것에 있어서,
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111에 제시된 TGF-β3 서열의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 적어도 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 wt. TGF-β3 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 111의 서열을 포함) 또는 아미노산 서열을 포함하고;
마스킹 폴리펩타이드 서열은 wt. TβRII 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 119의 서열을 포함) 또는 서열번호 119에 제시된 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 143)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 TβRII 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 서열번호 9의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 aa 서열을 포함하는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
123. 양상 107 내지 117 중 어느 것에 있어서,
TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서열번호 111에 제시된 TGF-β3 서열의 적어도 70(예를 들어, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110 또는 적어도 112)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 wt. TGF-β3 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 111의 서열을 포함) 또는 아미노산 서열을 포함하고;
마스킹 폴리펩타이드 서열은 wt. TβRII 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 서열번호 120의 서열을 포함) 또는 서열번호 120에 제시된 TβRII 아이소폼 B 엑토도메인의 적어도 90(예를 들어, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120 또는 적어도 129)개의 인접한 aa에 대해 적어도 60%(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 TβRII 폴리펩타이드 서열이고; 그리고
마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 서열번호 9의 적어도 80(예를 들어, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%) aa 서열 동일성을 갖는 aa 서열을 포함하는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
124. 양상 121 내지 123 중 어느 하나에 있어서, TGF-β3 폴리펩타이드 서열은 C77S 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
125. 양상 121 내지 124 중 어느 하나에 있어서, TβRII 폴리펩타이드 서열은 N-말단의 Δ14 및 D118A 또는 D118R 서열 변형 중 하나, 또는 N-말단의 Δ25 및 D118A 또는 D118R 서열 변형 중 하나를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
126. 양상 121 내지 125 중 어느 하나에 있어서, IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 H16에서의 aa 치환 또는 F42에서의 aa 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
127. 양상 121 내지 125 중 어느 하나에 있어서, IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 H16 및 F42에서의 aa 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
128. 양상 125 내지 127 중 어느 것에 있어서, H16 및 F42에서의 치환은 H16A, H16T, F42A 및 F42T(예를 들어, H16A 및 F42A 또는 H16T 및 F42A)로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
129. 양상 121 내지 128 중 어느 하나에 있어서, IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 N88R aa 치환을 더 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
130a. 양상 121 내지 129a 중 어느 것에 있어서,
TGF-β3 폴리펩타이드 서열은 C77S 치환을 포함하고;
TβRII 폴리펩타이드 서열은 N-말단의 Δ14 및 D118A 또는 D118R 서열 변형 또는 N-말단의 Δ25 및 D118A 또는 D118R 서열 변형을 포함하고; 그리고
IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 H16 및 F42에서 aa 치환을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
130b. 양상 130a에 있어서, H16 및 F42에서 치환은 H16A 및 F42A 치환 또는 H16T 및 F42A 치환 중 하나인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
131. 양상 1 내지 130b 중 어느 것에 있어서, PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택된 야생형 또는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열을 더 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
132. 양상 1 내지 130b 중 어느 것에 있어서, PD-L1, FAS-L, IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 야생형 또는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
133. 양상 1 내지 132 중 어느 것에 있어서, 상기 TGF-β 폴리펩타이드/복합체는 마스킹 폴리펩타이드(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드) 서열에 대해 서열 변이가 없는 달리 동일한 wt. TGF-β 폴리펩타이드에 비해 적어도 10% 미만(예를 들어, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만)으로 감소된 친화도를 갖는 변이체 TGF-β 폴리펩타이드를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
134. 양상 1 내지 133 중 어느 것에 있어서, TGF-β 폴리펩타이드/복합체는 TGF-β 폴리펩타이드에 대해 서열 변이가 없는 대응하는 wt. TβR 폴리펩타이드 서열에 비해 감소된 친화도(적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 70% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만, 또는 95% 이상의 수 미만)로 하나 이상의 서열 변이(예를 들어, 하나 이상의 aa 결실, 삽입 또는 치환)를 갖는 TβR 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
135. 마스킹된 TGF-β 복합체 PSM-4033-4039.
136. 양상 1 내지 135 중 어느 것의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하거나 또는 양상 4 및 6 내지 135 중 어느 것의 마스킹된 TGF-β 복합체를 암호화하는, 하나 이상의 핵산(예를 들어, 발현 벡터(들)).
137. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 Treg 세포를 유도하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 135 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
138. 양상 137에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
139. 양상 137에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 (i) wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 (ii) wt. 또는 변이체 PL-L1 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
140. 양상 137 내지 139 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 비타민 D(예를 들어, 1α, 25-다이하이드록시 비타민 D3 또는 비타민 D 유사체(예를 들어, 비타민 D3), mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신) 및/또는 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 중 어느 하나 이상의 투여 전에, 투여 동안에(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
141. 양상 137 내지 140 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 처리군(예를 들어, 1명의 대상체 또는 2명 이상의 대상체로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 Treg 세포의 양에 비한
세포 수에 비해 해당 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체 용적 중 FoxP3+ Treg 세포(예를 들어, 유도된 조절 T 세포(iTreg); 흉선 유래 Treg 세포(tTreg) 및/또는 말초 Treg 세포 (pTreg) 중 어느 하나 이상) 수의 증가를 야기하는 방법.
142. 양상 141에 있어서, Treg 세포(예를 들어, FoxP3+ 세포, iTreg, tTreg 및/또는 pTreg)의 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 Treg의 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 조직 또는 체액 용적에서 증가되는, 방법.
143. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 Th9 세포를 유도하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
144. 양상 143에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
145. 양상 143 내지 144 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 Th9 세포의 양에 비한
세포 수에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체의 용적 중 Th9 세포 수의 증가를 야기하는, 방법.
146. 양상 145에 있어서, Th9 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 Th9 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 조직 또는 체액 용적에서 증가되는, 방법.
147. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 Th17 세포를 유도하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
148. 양상 147에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-6 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
149. 양상 147 내지 148 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 Th17 세포의 양에 비한
세포 수에 비해 해당 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체의 용적 중 Th17 세포 수의 증가를 야기하는, 방법.
150. 양상 149에 있어서, Th17 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 Th17 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 조직 또는 체액 용적에서 증가되는, 방법.
151. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 Thf 세포를 유도하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
152. 양상 151에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-21 및/또는 IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
153. 양상 152에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 적어도 하나의 wt. 또는 변이체 IL-21 및 적어도 하나의 wt. 또는 변이체 IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
154. 양상 151 내지 153 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 Thf의 수에 비한
세포 수에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체의 용적 중 Thf 세포 수의 증가를 야기하는, 방법.
155. 양상 154에 있어서, Thf 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 Thf 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 조직 또는 체액 용적에서 증가되는, 방법.
156. 포유류 대상체(또는 세포, 조직 또는 이의 유체)에서 Th1 세포 작용을 저해하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
157. 양상 156에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-4 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
158. 양상 156 내지 157 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 인터페론 γ 및/또는 TNF의 양에 비한
양에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 용적에(또는 얻어진 농도에) 인터페론 γ 및/또는 TNF의 Th1 매개 방출의 저해를 야기하는, 방법.
159. 양상 149에 있어서, 조직 또는 체액 용적 중 인터페론 γ 및/또는 TNF의 양은 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 조직 또는 체액 용적 중 인터페론 γ 및/또는 TNF의 양에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 감소되는, 방법.
160. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 Th2 세포의 작용 및/또는 증식을 저해하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
161. 양상 160에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액에서의 양에 비한
양에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 용적에(또는 얻어진 농도에) IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 Th2 매개 방출의 저해를 야기하는, 방법.
162. 양상 161에 있어서, 조직 또는 체액 용적 중 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 양은 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 조직 또는 체액 용적 중 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 양에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군으로부터의 조직 또는 체액 중 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%)만큼 감소되는, 방법.
163. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 이의 조직 또는 체액 중 II형 선천성 림프구 세포(ILC2 세포)의 작용을 저해하는 방법으로서, 상기 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-10 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 단량체 형태, 예컨대, IL-10M1)을 포함하는, 방법.
164. 양상 160에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체에 의한 처리의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액에서의 양에 비한
양에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 용적에(또는 얻어진 농도에) IL-5 및/또는 IL-13의 ILC2 세포 매개 방출의 저해를 야기하는, 방법.
165. 양상 164에 있어서, 조직 또는 체액 용적 중 IL-5 및/또는 IL-13의 양은 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 조직 또는 체액 용적 중 IL-5 및/또는 IL-13의 양에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군으로부터의 조직 또는 체액 용적 중 IL-5 및/또는 IL-13의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%)만큼 감소되는, 방법.
166. 양상 164에 있어서, 조직 또는 체액 용적 중 IL-5 및/또는 IL-13의 양은 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 조직 또는 체액 용적 중 IL-5 및/또는 IL-13의 양에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군으로부터의 조직 또는 체액 용적 중 IL-5 및/또는 IL-13의 평균 값에 비해 적어도 25%만큼 감소되는, 방법.
167. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포의 발생 및/또는 생존을 지원하는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
168. 양상 167에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
169. 양상 167 내지 168 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 iNKT 세포의 수에 비한
세포수에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체의 용적 중 iNKT 세포 수의 증가를 야기하는, 방법.
170. 양상 169에 있어서, iNKT 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 iNKT 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%)만큼 조직 또는 체액 용적에서 증가되는, 방법.
171. 양상 169에 있어서, iNKT 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 iNKT 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 25만큼 조직 또는 체액 용적에서 증가되는, 방법.
172. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 CD4+ T 세포 수의 증가를 차단하거나 CD4+ T 세포 수를 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
173. 양상 172에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 추가로 적어도 하나의 wt. 또는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
174. 양상 172 내지 173 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 CD4+ T 세포의 수에 비한
세포 수에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체의 용적 중 CD4+ T 세포 수의 감소를 야기하는, 방법.
175. 양상 174에 있어서, CD4+ 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 CD4+ 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 조직 또는 체액 용적에서 감소되는, 방법.
176. 양상 174에 있어서, CD4+ 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 CD4+ 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 25%만큼 조직 또는 체액 용적에서 감소되는, 방법.
177. 포유류(예를 들어, 인간) 대상체 또는 세포, 조직 또는 이의 유체에서 CD4+ T 세포 수의 증가를 차단하거나 CD8+ T 세포 수를 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
178. 양상 172에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 추가로 적어도 하나의 wt. 또는 변이체 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
179. 양상 172 내지 173 중 어느 것에 있어서, 상기 투여는:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전 또는 투여 없는; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 대조군(예를 들어, 개체 그룹으로부터의 평균)의 조직 또는 체액 중 CD8+ T 세포의 수에 비한
세포 수에 비해 대상체로부터의 조직 또는 체액(예를 들어, 혈액 또는 림프) 유체의 용적 중 CD8+ T 세포 수의 감소를 야기하는, 방법.
180. 양상 174에 있어서, CD8+ 세포 수는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 투여 전의 조직 또는 체액의 용적 중의 CD8+ 세포 수에 비해, 또는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 받지 않은 매칭된 대조군의 평균 값에 비해 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 이상)만큼 조직 또는 체액 용적에서 감소되는, 방법.
181. 상처, 알레르기 반응, 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법으로서, 상처, 알레르기 반응, 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 (i) 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 독립적으로 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 및/또는 (ii) 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 독립적으로 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 중 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
182. 양상 181에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개의) 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
183. 양상 182에 있어서, 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 이의 변이체의 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
184. 양상 183에 있어서, 독립적으로 선택된 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은:
(i) 서열번호 9의 적어도 80(예를 들어, 적어도 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성; 또는
(ii) 서열번호15 내지 27 중 어느 것의 적어도 80(예를 들어, 적어도 90, 100, 110, 120, 130 또는 133)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성
을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
185. 양상 182 내지 184 중 어느 하나에 있어서, 독립적으로 선택된 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 N88, F42 및/또는 H16 중 어느 하나, 둘 또는 모두 셋에서 치환을 포함하는, 방법.
186. 양상 182 내지 185 중 어느 하나에 있어서, 독립적으로 선택된 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열은 (i)F42A; (ii) F42T; (iii) H16A; (iv) H16T; (v) F42A 및 H16A; (vi) F42T 및 H16A; (vii) F42A 및 H16T; 또는 (viii) F42T 및 H16T 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환 쌍을 포함하는, 방법.
187. 양상 181 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 PD-L1 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
188. 양상 187에 있어서, 독립적으로 선택된 변이체 PD-L1 폴리펩타이드 서열은 서열번호 2의 적어도 170개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 180, 190 또는 200개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
189. 양상 181 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-10 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 단량체 이성질체, 예컨대, IL-10M1)을 포함하는, 방법.
190. 양상 189에 있어서, 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-10 폴리펩타이드 서열은 서열번호 50 또는 51의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150 또는 적어도 160)개의 인접한 aa(예를 들어, 서열이 변이체 IL-10 서열일 때, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)에 대해 적어도 80%(적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하고; 변이체 IL-10 폴리펩타이드 서열은 선택적으로 서열번호 51의 N49와 K50 사이에, 또는 서열번호 49 또는 50의 동일한 위치에 5 내지 7 aa을 포함하는(예를 들어, 서열번호 51에서 aa 49와 aa 50 사이에 삽입된 IL-10M1 GGGSGG), 방법.
191. 양상 181 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 독립적으로 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 FasL 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
192. 양상 191에 있어서, 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 FasL 폴리펩타이드 서열은 서열번호 144(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 50개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160 또는 적어도 180개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
193. 양상 181 내지 192 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 비타민 D(예를 들어, 1α,25-다이하이드록시 비타민 D3), 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 및/또는 라파마이신 중 어느 1, 2 또는 모두 3가지의 투여 전에, 투여와 동시에, 투여와 조합하여 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
194. 양상 181 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 자가면역질환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법: 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역-연관 불임, 자가면역 혈소판 감소 자색반 자반병, 수포성 유사천포창, 셀리악병, 크론병, 굿파스쳐 증후군, 사구체 신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염), 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증근무력증(MG), 천포창(예를 들어, 심상성 천포창), 악성빈혈, 다발근염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스(SLE), 1형 당뇨병(T1D), 혈관염 및 백반증.
195. 양상 181 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 자가면역질환은 T1D 또는 셀리악병인, 방법.
196. 양상 181 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 자가면역질환은 T1D 또는 셀리악병이 아닌, 방법.
197. 양상 181 내지 193 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 알레르기 반응의 치료 또는 예방 방법인, 방법.
198. 양상 197에 있어서, 알레르기 반응은 땅콩, 낭욜매, 식물 꽃가루, 라텍스, 봉독 또는 말벌독 알레르겐에 대한 반응인, 방법.
199. 양상 181 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 화상 또는 상처에 대한 치료 또는 예방을 제공하는 방법인, 방법.
200. 양상 199에 있어서, 상처는 표피 또는 점막의 찰과상, 박리, 절개, 열상 또는 천공인, 방법.
201. 양상 200에 있어서, i) 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 독립적으로 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 및/또는 (ii) 양상 1 내지 134 중 어느 것에 따른 하나 이상의 독립적으로 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 상처 형성 전에, 형성 동안 및/또는 형성 후에 투여되는, 방법.
202. 양상 199 내지 201 중 어느 것에 있어서, 화상 및/또는 상처는 수술 또는 기타 의학적 절차 동안에 일어나거나, 이들의 결과인, 방법.
203. 양상 199 내지 202 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 독립적으로 선택된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 상처 또는 화상 부위에 투여되는, 방법.
204. 양상 199 내지 203 중 어느 하나에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체(유효량) 및/또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 재조합 발현 벡터)의 투여는 치료되지 않은 대상체 또는 상처에 비해 상처봉합에 속도를 내게 하거나(봉합까지의 시간을 감소시킴), 치유 시간을 감소시키거나, 또는 흉터 형성을 감소시키는, 방법.
205. 양상 181에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개의) 독립적으로 선택된 wt.(예를 들어, 서열번호 29 또는 서열번호 31) 또는 변이체 IL-4 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
206. 양상 205에 있어서, 변이체 IL-4 폴리펩타이드 서열은 서열번호 29 또는 서열번호 31(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 80개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 100 또는 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
207. 양상 205 내지 206 중 어느 것에 있어서, 질환 또는 장애는 연충 감염인, 방법.
208. 양상 181에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개의) 독립적으로 선택된 wt.(예를 들어, 서열번호 35의 폴리펩타이드) 또는 변이체 IL-6 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
209. 양상 208에 있어서, 변이체 IL-6 폴리펩타이드 서열은 서열번호 35(예를 들어, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 가짐)의 적어도 80개의 인접한 aa(예를 들어, 적어도 100 또는 110개의 인접한 aa)에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
210. 양상 204 내지 209 중 어느 것에 있어서, 질환 또는 장애는 (예를 들어, 장에서의) 박테리아 및/또는 진균 감염인, 방법.
211. 양상 181에 있어서, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개 또는 적어도 3개의) 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 IL-21 및/또는 IL-23 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
212. 양상 209에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-21 MOD 폴리펩타이드 서열은 (i) 서열번호 58 또는 60의 폴리펩타이드 서열 또는 (ii) 서열번호 58 또는 60의 적어도 50(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100 또는 적어도 110)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖고, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 갖는, 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
213. 양상 211 또는 212에 있어서, 적어도 하나의(예를 들어, 적어도 2개의) IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열은 (i) 서열번호 63 또는 65 서열의 폴리펩타이드 또는 (ii) 서열번호 63 및/또는 65의 적어도 50(예를 들어, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 적어도 220, 적어도 240, 적어도 260, 적어도 280, 적어도 300, 적어도 320, 또는 적어도 340)개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) aa 서열 동일성을 갖고, 적어도 하나의 aa 치환, 결실 또는 삽입을 갖는, 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 방법.
214. 양상 211 내지 213 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 장애는 고친화도 항체 또는 충분한 양의 고친화도 항체를 생산하는 것의 불능인, 방법.
215. 포유류 대상체의 관용을 유도하는 방법으로서, 대상체에게:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 양상 1 내지 136 중 어느 것에 따른 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 발현 벡터(들)),
(ii) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 양상 1 내지 136 중 어느 것에 따른 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 발현 벡터(들))으로서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 작제물 또는 복합체, 또는 핵산;
(iii) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 양상 1 내지 136 중 어느 것에 따른 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 발현 벡터(들))으로서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 FasL 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 작제물 또는 복합체, 또는 핵산; 또는
(iv) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 양상 1 내지 136 중 어느 것에 따른 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 발현 벡터(들))으로서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 적어도 하나는 wt. 또는 변이체 FasL 폴리펩타이드 서열 또는 wt. 또는 변이체 IL-10 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 작제물 또는 복합체, 또는 핵산
을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
216. 양상 137 내지 215 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안에(동시에 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)(예를 들어, Cox-1 및/또는 Cox-2 저해제, 예컨대, 셀레콕십, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜 및 나프록센)을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
217. 양상 137 내지 216 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안에(동시에 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 코르티코스테로이드(예를 들어, 코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 에타메타소넵, 플루드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 프레드니솔론 및 트라이암시놀론)를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
218. 양상 137 내지 217 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안에 또는 투여 후에 종양 괴사 인자 알파(예를 들어, 항-TNF 알파, 예컨대, 골리무맙, 인플릭시맙, 세르톨리주맙, 아달리무맙 또는 TNF 알파 유인 수용체(decoy receptor), 예컨대, 에타너셉트)의 하나 이상의 작용을 차단하는 제제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
219. 양상 137 내지 218 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에, IL-1과 경쟁적으로 IL-1 수용체에 결합하는 제제(예를 들어, 아나킨라)를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법. 이 양상은 대상체에게 투여되는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 어느 것이 IL-1 폴리펩타이드를 포함하는 경우에 IL-1과 경쟁적으로 IL-1 수용체에 결합하는 제제가 투여되지 않는 조건으로 처리될 수 있다.
220. 양상 137 내지 219 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에, IL-6 수용체에 결합하고 수용체를 통해 신호전달로부터 IL-6을 저해하는 제제(예를 들어, 토실리주맙)를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법. 이 양상은 대상체에게 투여되는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 중 어느 것이 IL-6 폴리펩타이드를 포함하는 경우에 IL-6 수용체에 결합하는 제제가 투여되지 않는 조건으로 처리될 수 있다.
221. 양상 137 내지 220 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에, CD80 또는 CD86 수용체에 결합하고 T 세포 증식 및/또는 B 세포 면역 반응을 저해하는 제제(예를 들어, 아바타셉트)를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
222. 양상 137 내지 221 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에, 투여 동안(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에, B-세포사를 초래하는 CD20에 결합하는 제제(예를 들어, 리툭시맙)를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
223. 양상 137 내지 222 중 어느 것에 있어서, 포유류 대상체는 인간, 소, 개, 고양이, 설치류, 뮤린, 염소, 유인원, 양, 말, 토끼, 돼지 등의 대상체로부터 선택되는, 방법.
224. 양상 137 내지 223 중 어느 것에 있어서, 상기 대상체는 인간(예를 들어, 치료 또는 예방을 필요로 하는 인간 환자 또는 인간 대상체)인, 방법.
225. TGF-β 폴리펩타이드 또는 TGF-β 폴리펩타이드 및 면역조절 폴리펩타이드(MOD)를 세포에 전달하는 방법으로서, 세포를 (i) 양상 1 내지 134 중 어느 하나의 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, (ii) 양상 1 내지 134 중 어느 하나의 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 MOD 서열을 포함하는 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체, 또는 (iii) 하나 이상의 독립적으로 선택된 wt. 또는 변이체 MOD를 암호화하는 양상 135 내지 136 중 어느 하나의 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
226. 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 발현시키는 세포의 생산 방법으로서, 양상 1 내지 134 중 어느 것의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 발현 벡터(들))을 세포(예를 들어, 시험관내 포유류 세포)에 도입하는 단계, 및 선택적으로 적어도 하나의 세포 염색체에 비통합 및/또는 통합된 하나 이상의 핵산의 모두 또는 일부를 포함하는 세포를 선택하는 단계(예를 들어, 항생제 선택 후, 하나 이상의 핵산 중 어느 것이 세포 염색체에 통합되는지의 여부를 결정하기 위한 분석)를 포함하는, 방법.
227. 양상 224에 있어서, 세포는 HeLa 세포, CHO 세포, 293 세포, Vero 세포, NIH 3T3 세포, Huh-7 세포, BHK 세포, PC12, COS 세포, COS-7 세포, RAT1 세포, 마우스 L 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 및 HLHepG2 세포로부터 선택된 포유류 세포주의 세포인, 방법.
228. 양상 226 또는 227의 방법에 의해 제조된 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 일시적으로 또는 안정하게 발현시키는 세포.
229. 양상 228에 있어서, 세포는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체를 발현시키지 않는 달리 동일한 세포에 비해 생존도의 실질적인 감소 없이(5%, 10% 또는 15% 미만의 감소) 약 25 내지 약 350㎎/리터 이상(예를 들어, 약 25 내지 약 100, 약 100 내지 약 200, 약 200 내지 약 300, 약 300 내지 약 350㎎/리터, 또는 350㎎/리터 초과)의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체로부터 발현되는, 세포.
230. 양상 138 내지 142 중 어느 것에 있어서, wt. 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열을 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여는 대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 하나 이상의 T 세포(예를 들어, 염증 T 세포, 예컨대, Th1, Th2, Th17 및/또는 Th22 세포)의 조절을 초래하는, 방법.
231. 양상 230에 있어서, 하나 이상의 T 세포는 Th1 세포이고, 조절은:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 또는 투여 없이; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 처리군(예를 들어, 1명의 대상체 또는 2명 이상의 대상체로부터의 평균)의 대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 인터페론 γ의 양에 비해,
대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 Th1 세포 수의 감소, Th1 세포에 의한 인터페론 γ의 발현 또는 분비 감소, 또는 인터페론 γ 수준에 의해 평가되는, 방법.
232. 양상 230에 있어서, 하나 이상의 T 세포는 Th2 세포이고, 조절은:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 또는 투여 없이; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 처리군(예를 들어, 1명의 대상체 또는 2명 이상의 대상체로부터의 평균)의 대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 L-4, IL-5 및/또는 IL-13의 양에 비해,
대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 Th2 세포 수의 감소, Th2 세포에 의한 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13의 발현 또는 분비 감소, 또는 L-4, IL-5 및/또는 IL-13 수준에 의해 평가되는, 방법.
233. 양상 230에 있어서, 하나 이상의 T 세포는 Th17 세포이고, 조절은:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 또는 투여 없이; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 처리군(예를 들어, 1명의 대상체 또는 2명 이상의 대상체로부터의 평균)의 대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 IL-17 및/또는 IL-22의 양에 비해,
대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 Th17 세포 수의 감소, Th17 세포에 의한 IL-17 및/또는 IL-22의 발현 또는 분비 감소, 또는 IL-17 및/또는 IL-22 수준에 의해 평가되는, 방법.
234. 양상 230에 있어서, 하나 이상의 T 세포는 Th22 세포이고, 조절은:
(i) 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체의 투여 전에 또는 투여 없이; 또는
(ii) 대상체와 매칭되었지만(예를 들어, 질환 상태, 연령, 성별, 신장, 체중 및/또는 흡연 습관 중 하나 이상) TGF-β 또는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체가 투여되지 않은 처리군(예를 들어, 1명의 대상체 또는 2명 이상의 대상체로부터의 평균)의 대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 IL-22, IL-13 및 TNF-알파의 양에 비해,
대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 Th22 세포 수의 감소, Th22 세포에 의한 IL-22, IL-13 및/또는 TNF-알파 중 적어도 둘의 발현 또는 분비 감소, 또는 IL-22, IL-13 및/또는 TNF-알파 수준에 의해 평가되는, 방법.
235. 양상 234에 있어서, 상기 방법은 대상체, 세포, 조직 또는 체액 중 IL-4, IL-17 및/또는 인터페론 γ 중 하나 이상의 발현, 분비, 또는 IL-4, IL-17 및/또는 인터페론 γ 중 하나 이상의 수준을 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
236. 양상 230 내지 235 중 어느 것에 있어서, T 세포는 방관자 T 세포인, 방법.
237. 양상 230 내지 236 중 어느 것에 있어서, 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 비타민 D(예를 들어, 1α, 25-다이하이드록시 비타민 D3 또는 비타민 D 유사체(예를 들어, 비타민 D3), mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신) 및/또는 레티노산(예를 들어, 올 트랜스 레티노산) 중 어느 하나 이상의 투여 전에, 투여 동안에(동시 또는 병용 투여) 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
238. 양상 230 내지 237 중 어느 것에 있어서, wt. 또는 변이체 IL-2 MOD를 포함하는 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체는 도 1 구조 A 내지 F에 제시된 구조를 갖는, 방법.
239. 양상 238에 있어서, Fc 영역은 면역글로불린 효과기 서열(wt. 단백질에 비해 보체 성분 1q("C1q") 결합이 감소되고, 그에 따라 보체-의존적 세포독성에 참여하는 능력이 감소됨)을 결여하는, 방법.
VI. 실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 보다 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시하며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도하지도 또는 이하의 실험이 모든 또는 단지 수행되는 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지도 않는다. 사용한 수(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량부이며, 분자량은 평균분자량이고, 온도는 섭씨이며, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다. 표준 약어, 예를 들어, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로염기(들); ㎕, 마이크로리터(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); 분, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로염기(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오타이드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c., 피하(로); wt., 야생형 등이 사용될 수 있다.
A. 실시예 1:
1
단일 폴리펩타이드 쇄 마스킹된 TGF-β 작제물
목적하는 성분을 암호화하는 색산의 제하고, 포유류 세포에 대해 발현 벡터를 이용하여 발현을 유도함으로써 마스킹된 TGF-β 단백질을 제시하는 무손상 단일 폴리펩타이드 쇄의 안정한 발현을 입증하였다. 핵산은 N-에서 C-말단까지: MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, wt. IL-2 폴리펩타이드 서열, 예컨대, 서열번호 20, 또는 H16 및/또는 F42에서 치환을 보유하는 IL-2 폴리펩타이드의 변이체; Fc 이량체화를 방지하는 치환과 함께 L234A 및 L235A 치환을 보유하는 IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, II형 TGF-β 수용체(예를 들어, D32N 및/또는 D118A 서열 변이를 갖는 TGF-βRII B 아이소폼 폴리펩타이드 서열), 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열(예를 들어, wt. TGF-β3 또는 C77S 서열 변이체)을 포함하는, 폴리펩타이드를 암호화한다. 발현된 단백질의 전체 구조를 갖는 개략도를 도 1에서 구조 A로서 나타내고, 이 중 하나의 예는 도 7A에서 작제물 3470(서열번호 146)으로서 나타내고, 이러한 폴리펩타이드의 aa 서열의 다른 예는 표지된 요소와 함께 정렬된 작제물 번호 3472이며, 도 7G에서 서열번호 157로서 나타낸다. 포유류 단백질 발현에 적합한 플라스미드에서(예를 들어, 중국 햄스터 난소 또는 CHO 세포에서) 핵산을 작제한 후에, 단백질을 발현시키고, 단백질 A 및 크기 분리 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
작제물 3470 및 3472의 작제 및 단리에 추가로, 2개의 추가적인 단일 폴리펩타이드 쇄 마스킹된 TGF-β 작제물인 3466 및 3468을 준비하였다. 작제물 3470은 작제물 3472, 3466 및 3468(이하에 (i) 내지 (iii)으로서 넘버링됨)과 함께 특히 고전적 Fc 회합을 통해 실질적으로 이량체화하지 않는 단일 쇄 마스킹된 TGF-β 단백질을 제조하는 것의 실현 가능성을 입증한다. 폴리펩타이드는 N-에서 C-말단까지 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
(i) wt. IL-2-IgG Fc-TβRIIΔ25(D32N, D118A) 치환-TGF-β3(C77S) (도 7G, 작제물 번호 3472) 서열번호 157;
(ii) IL-2(H16T, F42A)-IgG Fc-TβRII Δ25(D118)-TGF-β3(C77S) (도 7H, 작제물 번호 3466)서열번호 158; 및
(iii) IL-2(H16T, F42A)-IgG Fc- TβRII Δ25(D32N, D118)- TGF-β3 (C77S) (도 7I, 작제물 번호 3468) 서열번호 159.
상기 나타낸 바와 같이, 단일 폴리펩타이드 쇄 마스킹된 TGF-β 작제물은, 예를 들어, 서열번호 71의 IgG1 서열에서와 같이 넘버링된 L131(예를 들어, L131K), T146(예를 들어, T146S), P175(예를 들어, P175V), F185(예를 들어, F185R), Y187(예를 들어, Y187A) 및 K189(예를 들어, K189Y)에서 Fc 영역의 이량체화를 방지하는 치환을 포함할 수 있다. (i) 내지 (iii)의 상기-언급된 작제물은 서열번호 71의 IgG1 서열에 넘버링된 바와 같은 L131K, T146S, P175V, F185R, Y187A 및 K189Y를 포함한다.
2
이형이량체 폴리펩타이드 쇄
2개의 폴리펩타이드로 이루어진 마스킹된 TGF-β 복합체의 안정한 발현은 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 제2 핵산을 제조하고 포유류 발현 벡터(예를 들어, CHO 세포에서 플라스미드 발현 시스템)를 이용하여 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 마스킹된 TGF-β 작제물을 입증하였다. 예를 들어, MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열), IgG Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, KiH Fc), 및 TGF-β 폴리펩타이드 서열(예를 들어, wt. 또는 TGF-β1 또는 wt. TGF-β3을 보유하는 서열 변이체)을 포함하는, 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 도 7J 작제물 3618 참조). 예를 들어, MOD 폴리펩타이드 서열(예를 들어, wt. 또는 변이체 IL-2 폴리펩타이드 서열), IgG Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 제1 폴리펩타이드의 KiH 서열의 반대 부분), 및 II형 TGF-β 수용체(TGF-β RII) 폴리펩타이드 서열(wt. 또는 서열 변이 있음)을 포함하는, 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 도 7J 작제물 3621). 발현된 단백질의 개략적 구조를 도 1에서 구조 D로서 나타낸다. N-에서 C-말단까지 다음의 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 폴리펩타이드인 (iv.a) 및 (iv.b) 중 하나의 이러한 쌍의 발현 및 정제(크로마토그래피에 의한 단백질 A 및 크기 분리):
(iv.a) IL-2 (wt. MOD)- 노브-인-홀 Fc(예를 들어, 노브 Fc)-TGF-β3(wt.), 도 7J 작제물 3618(서열번호 148) 참조; 및
(iv.b) IL-2 (wt. MOD)- 노브-인-홀 Fc(예를 들어, 홀 Fc)- TβRII(D32N), 도 7J 작제물 3621(서열번호 160).
작제물 (iv.a) 또는 (iv.b)에서, IL-2 폴리펩타이드는 H16 및/또는 H42, 예컨대, H16T 및 F42A 치환 또는 H16A 및 F42A 치환에서 치환을 포함할 수 있다.
3
마스킹된 TGF-β 작제물의 활성
다양한 농도의 정제된 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드 복합체 및 작제물(예를 들어, 본 실시예의 파트 1 및 2에서 제조한 폴리펩타이드(vi.a) 및 (vi.b)의 작제물 (i) 내지 (iii) 및 복합체)을 FoxP3을 생성하기 위해 미경험 CD4 세포를 유도하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 분석을 위해, 105개의 미경험 CD4 세포를 표시한 바와 같이 1㎍/㎖의 항-CD28 및 마스킹된 TGF-β 폴리펩타이드 복합체 또는 작제물과 함께 5㎍/㎖의 결합된 항-CD3을 함유하는 웰에 플레이팅시켰다. 배양물에서 5일 후에, 유세포 분석에 의해 형광 표지된 항-CD4 및 항-FoxP3을 이용하여 FoxP3 CD4+ 이중 양성 세포 수를 평가하였다. TGF-β3 또는 TGF-β3 중 하나 및 재조합 인간 IL-2 100 U/㎖에 의해 자극을 제공하는 대조군을 또한 병행하여 실행하였다.
도 6, A에서 wt. IL-2-IgG Fc(mFc)-TβRII를 포함하는 도 1, A에 나타낸 전체 구조를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물과 D32N 치환 -TGF-β3의 비교를 IL-2의 존재 또는 부재 하에 wt. TGF-β3의 효과와 비교하여 FoxP3 발현에 대해 시험하였다. 도 6의 A에 나타낸 결과는 wt. TGF-β3이 시험 조건 하에 FoxP3을 효과적으로 자극하지 않지만, wt. IL-2 보충이 FoxP3 발현을 야기할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 6, B에서, 본 실시예의 파트 1 및 2로부터의 마스킹된 TGF-β 작제물 (i), (ii) 및 (iii)의 비교, 및 폴리펩타이드(iv.a) 및 (iv.b)를 포함하는 마스킹된 TGF-β 복합체를 IL-2의 존재 하의 wt. TGF-β3의 효과와 비교하여 FoxP3 발현에 대해 시험하였다. 도 6, B에 나타낸 결과는 wt. IL-2를 갖는 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체가 IL-2 치환 H16T 및 F42A를 갖는 것보다 더 강력하다는 것을 나타낸다. H16T 및 F42A에서의 치환은 FoxP3을 발현시키는 세포 수에 기반하여 최대 효능의 실질적인 변화 없이 약 5 나노몰 내지 약 50 나노몰 규모만큼 마스킹된 복합체의 효력을 이동시킨다. 도 6의 A에 나타낸 결과에 따라, 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체는 FoxP3을 생성하기 위해 T 세포를 유도하는 데 IL-2 및 TGF-β3보다 더 효과적이었다.
CD4+ 및 FoxP3에 기반한 세포의 개폐 및 분리의 예를 도 6의 C에 나타낸다. 결과는 1,000nM의 마스킹된 TGF-β 작제물에 노출된 세포에서의 FoxP3의 유도가 0.1nM의 동일한 작제물에 노출된 세포 이상으로 FoxP3 발현에서 대략 30배의 증가를 나타낸다는 것을 입증한다.
B. 실시예 2
1
비-종간인 스캐폴드
본 부문은 종간 스캐폴드를 사용하지 않고, 따라서, 단량체이거나, 이들이 이량체화되는 경우에, 상대 서열과 이형이량체를 우선적으로 형성하지 않는, 마스킹된 TGF 베타 서열을 기재한다.
a.
단일 폴리펩타이드 쇄 마스킹된 TGF-β 작제물
N-에서 C-말단까지, MOD 폴리펩타이드 서열: wt. IL-2 폴리펩타이드 서열(서열번호 20), L234A 및 L235A("LALA")를 보유하는 IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열 wt. IgG1 aa 11 내지 215(Δ10), L351K, T366S, P395V, F405R, Y407A 및 K409Y 치환, D118A 치환(*D119A, 도 5B의 언급을 참조)을 갖는 성숙 단백질 aa 26 내지 136 aa의 TGF-β RII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β 3형 아이소폼 1 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산. 발현된 단백질의 개략적 구조를 도 1에서 구조 A(서열번호 146)로서 나타낸다. 단백질을 단백질 A 및 크기 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
b.
동형이량체 폴리펩타이드 복합체
N-에서 C-말단까지, MOD 폴리펩타이드 서열(H16T 및 F42A 치환을 갖는 IL-2 서열번호 20), IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1), D118A 치환(*D119A, 도 5B의 언급을 참조)을 갖는 성숙 단백질의 aa 26 내지 136 aa의 TGF-β RII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β 3형 아이소폼 1 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산. 발현된 단백질의 개략적 구조를 도 1에서 구조 B로서 나타낸다. 표지된 요소로 정렬한 대응하는 aa 산 서열을 도 7B에 나타낸다(서열번호 147). 단백질을 단백질 A 및 크기 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2
종간 스캐폴드 폴리펩타이드와의 이형이량체 마스킹된 TGF-β 복합체
a.
IL-2 MOD 폴리펩타이드를 각각 보유하는 종간 스캐폴드를 갖는 이형이량체 마스킹된 TGF-β 복합체
2개의 폴리펩타이드로 이루어진 마스킹된 TGF-β 복합체의 안정한 발현은 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 제2 핵산을 제조하고 포유류 발현 벡터(예를 들어, CHO 세포에서 플라스미드 발현 시스템)를 이용하여 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 마스킹된 TGF-β 작제물을 입증하였다.
wt. IL-2 폴리펩타이드(서열번호 20), IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1 잔기 1 내지 225), 및 T366W KiH "노브" 치환, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β 3형 아이소폼 1 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 제1 폴리펩타이드.
wt. IL-2 폴리펩타이드(서열번호 20), IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1 잔기 1 내지 225), 및 T366S, L368A 및 Y407V KiH "홀" 치환, 및 D118A 치환을 갖는 성숙 단백질 aa 26 내지 136 aa의 TGF-β RII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드. 발현된 단백질의 개략적 구조를 도 1에서 구조 D로서 나타낸다. 표지된 요소로 정렬한 대응하는 aa 산 서열을 도 7C에 나타낸다. 발현 및 정제(단백질 A 다음에 크기 배제 크로마토그래피)는 이형이량체 복합체를 제공한다.
b.
MOD 폴리펩타이드를 보유하는 단일 쇄가 있는 종간 스캐폴드를 갖는 이형이량체 마스킹된 TGF-β 복합체
2개의 폴리펩타이드로 이루어진 마스킹된 TGF-β 복합체의 안정한 발현은 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 제2 핵산을 제조하고 포유류 발현 벡터(예를 들어, CHO 세포에서 플라스미드 발현 시스템)를 이용하여 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 마스킹된 TGF-β 작제물을 입증하였다.
wt. IL-2 폴리펩타이드(서열번호 20), IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1 잔기 1 내지 225), 및 T366W(노브) 치환, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β 3형 아이소폼 1 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드.
IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A ("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1 잔기 1 내지 225), 및 T366S, L368A 및 Y407V "홀" 치환, 및 D118A 치환을 갖는 성숙 단백질 aa 26 내지 136 aa의 TGF-β RII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드.
발현된 단백질의 개략적 구조를 도 1에서 구조 E로서 나타낸다. 표지된 요소로 정렬한 대응하는 aa 산 서열을 도 7D에 나타낸다. 발현 및 정제(단백질 A 다음에 크기 배제 크로마토그래피)는 이형이량체 복합체를 제공한다.
c.
IL-2 MOD 폴리펩타이드를 보유하는 단일 쇄가 있는 종간 스캐폴드 폴리펩타이드 안정화를 갖는 이형이량체 마스킹된 TGF-β 복합체
2개의 폴리펩타이드로 이루어진 마스킹된 TGF-β 복합체의 안정한 발현은 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 제2 핵산을 제조하고 포유류 발현 벡터(예를 들어, CHO 세포에서 플라스미드 발현 시스템)를 이용하여 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 마스킹된 TGF-β 작제물을 입증하였다.
IL-2 폴리펩타이드 서열(H16T 및 F42A 치환을 갖는 서열번호 20), IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1 잔기 1 내지 225), 및 T366W(노브) 치환, D118A 치환을 갖는 성숙 단백질의 aa 26 내지 136 aa의 TGF-β RII 아이소폼 B 폴리펩타이드 서열, 및 C77S 치환을 갖는 인간 TGF-β 3형 아이소폼 1 폴리펩타이드 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드.
IgG1 Fc 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(예를 들어, L234A 및 L235A("LALA") 치환을 보유하는 wt. IgG1 잔기 1 내지 225), 및 T366S, L368A 및 Y407V "홀" 치환을 포함하는 제2 폴리펩타이드.
발현된 단백질의 개략적 구조는 제2 폴리펩타이드 상의 임의의 면역조절 폴리펩타이드 서열이 없는 것을 제외하고, 도 1의 구조 F로서 구조의 변형을 나타낸다. 표지된 요소로 정렬한 대응하는 aa 산 서열을 도 7E에 나타낸다. 발현 및 정제(단백질 A 다음에 크기 배제 크로마토그래피)는 이형이량체 복합체를 제공한다.
C. 실시예 3 발현 및 정제
2개의 마스킹된 TGF-β 복합체를 암호화하는 마스킹된 TGF-β 작제물 핵산을 암호화하는 핵산을 제조하였다(도 8 참조). 핵산 작제물로 ExpiCHO 세포를 형질감염시키고, 세포가 폴리펩타이드를 발현시키도록 함으로써 복합체의 샘플을 제조하였다. 폴리펩타이드는 단백질 A 크로마토그래피 다음에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 단백질에 SDS-PAGE가 실시되고, 얻어진 겔은 쿠마씨 블루로 염색되었다. NR = 환원 또는 비환원 샘플 없음, 및 R = 환원 샘플(이황화물 환원제에 의한 환원).
D. 실시예 4 마스킹 폴리펩타이드와 TGF-β 사이의 생물학적 활성 및 친화도
TGF-β의 생물학적 이용 가능성, 및 TβRII와 상호작용하는 이의 능력이 TGF-β 폴리펩타이드 서열에 대한 마스킹 폴리펩타이드의 친화도에 반비례한다는 것을 입증하기 위해 마스킹된 TGF-β 작제물의 시리즈를 제조하였다. 작제물은 도 1의 구조 A 형태를 갖고, N-말단으로부터 C-말단까지, MOD는 IL-2 폴리펩타이드이며; 스캐폴드는 IgG 폴리펩타이드이고; 마스킹 수용체는 N-말단의 aa 1 내지 25가 결실되고(Δ25) D118A 치환(표시한 바와 같이 추가적인 치환 E55A, D32N, 또는 S52L을 포함함), 및 TGF-β3 폴리펩타이드 서열을 갖는 서열번호 119의 TβRII 폴리펩타이드이다.
TβRII-Ig Fc 융합을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 포획하고 다양한 농도의 4가지 작제물을 웰에 적용한 포획 분석을 이용하여 마스킹된 TGF-β 작제물과 TβRII와의 상호작용을 평가하였다. 비결합 작제물을 린스한 후에, 결합된 작제물을 검출하고, 바이오틴 표지된 항 IL-2 다음에 스트렙타비딘-겨자무과산화효소 및 450 nm에서의 색채학적 검출(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 이용하여 측정하였다. 도 9에 나타낸 결과는 Δ25 - D118A 작제물이 TβRII에 가장 낮은 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다(TβRII-Ig 융합). TGF-β3-TβRII 복합체에 대해 해리 상수의 점점 더 큰 영향을 갖는 E55A, D32N 또는 S52L의 첨가는 외인성 TβRII(본 경우에 TβRII-Ig 융합)에 대해 증가된 친화도를 갖는 복합체를 제공한다.
E. 실시예 5 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드를 보유하는 단일 쇄르르 갖는 종간 스캐폴드 폴리펩타이드 안정화를 갖는 이형이량체 마스킹된 TGF-β 복합체(PSM-4033-4039)의 생물학적 활성
도 10A에 나타낸 바와 같은 마스킹된 TGF-β 복합체인 PSM-4033-4039를 제조하였다. 복합체는 각각 도 10B 및 도 10C에 나타낸 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 4033 및 4039를 포함한다. 이어서, PSM-4033-4039를 이용하여 일련의 실험을 수행하였다.
실험 1: 인간 말초 미경험 CD4
+
T 세포로부터의 Foxp3
+
iTreg의 유도.
미경험 CD4+ T 세포를 인간 혈액으로부터 분류하고, 항-인간 CD3 (5㎍/㎖), 항-인간 CD28(1㎍/㎖), 및 증가된 용량의 PSM-4033-4039 또는 단일 용량의 재조합 TGFb3 및 양성 대조군으로서 IL-2와 함께 플레이팅하였다. 배양물에서 5일 후, 세포를 전사 인자 Foxp3의 발현에 대해 유세포분석에 의해 평가하였다. n = 2, 표준편차. 도 11에 제공한 결과는 최대 1,000nM의 농도로 PSM-4033-4039에 노출된 세포에서 FoxP3의 유의미한 유도를 나타낸다. 이들 결과는 다른 마스킹된 TGF-β 작제물 및 복합체와 함께 도 6B에 나타낸 것과 유사하며, 추가로 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체는 천연 및 유도된 Treg 둘 다 포함하는 Treg에서 유전자 발현의 주요 조절자이며 Treg 정체 및 기능에 대해 중심이 되는 FoxP3의 유의미한 유도를 달성할 수 있다는 것을 입증한다.
실험 2: PSM-4033-4039 유도 Foxp3
+
iTreg에 의한 T 세포 증식의 억제.
PSM-4033-4039 유도 Foxp3+ T 조절 세포(iTreg)를 통상적인 T 세포(T반응자)에 대해 상이한 비로 배양시키고, 항-인간 CD3(1㎍/㎖) 및 미토마이신 C 처리 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)로 자극하였다. T반응자 세포에서 세포 흔적 바이올렛(cell trace violet: CTV)의 희석에 의해 4일 후에 유세포 분석에 의해 증식을 평가하였다. 도 12에 나타낸 데이터는 3명의 공여자의 평균을 나타내고, 각각 2회 중복해서 플레이팅하였다. 대조군으로서 iTreg 대신에 TGF-β3 및 IL-2 유도 T 조절 세포 또는 총 말초 CD4+ T 세포를 사용하였다. 억제를 iTreg 대조군을 첨가하지 않은 것(평균 78% CTV 희석)과 비교할 때 더 적은 CTV 희석%로서 정한다. 본 실험의 결과는 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체, 예를 들어, PSM-4033-4039에 의해 유도되는 Foxp3+ T 조절 세포는 CD3 가교 및 공자극에 의해 활성화되고, PBMC에서 항원 제시 세포에 의해 제공되는 T 세포의 증식을 억제할 수 있다는 것을 입증한다.
전사 인자인 Foxp3의 발현 이상으로 Treg의 정해진 특징은 다른 백혈구의 활성화 및 기능을 억제하는 이들의 능력이다. 본 실험은 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체에 의해 유도된 iTreg가 정말로 CD3 가교 및 공자극에 의해 활성화되고, PBMC에서 항원 제시 세포에 의해 제공되는 T 세포의 증식을 억제할 수 있다는 것을 입증한다.
실험 3: PSM-4033-4039에 의한 인간 말초 CD4
+
T 세포로부터의 Foxp3
+
발현의 유도.
총 CD4+ T 세포를 인간 혈액으로부터 분류하고, 항-인간 CD3 (5㎍/㎖), 항-인간 CD28(1㎍/㎖), 및 증가된 용량의 PSM-4033-4039와 함께 플레이팅하였다. 배양물에서 5일 후, 세포를 전사 인자 Foxp3의 발현에 대해 유세포분석에 의해 평가하였다. n = 2. 데이터를 도 13A에 도시한다.
CD4+ T 세포 유형의 혼합물에서 세포 유형이 Foxp3 발현 세포로 분화될 수 있는지를 결정하기 위해, 상이한 집단을 분류하고, 개별적으로 PSM-4033-4039를 이용하여 처리하였다. 따라서, 도 13A의 공여자와 상이한 공여자에 대한 미경험, 총 및 기억 CD4+ T 세포를 분류하고, PSM-4033-4039(300nM)와 함께 또는 이것 없이 상기와 동일한 방법으로 배양시키고, Foxp3을 제5일에 유세포분석에 의해 평가하였다. 데이터를 도 13B에 도시한다.
본 실험에서 Foxp3 발현 세포로 분화되는 총 CD4+ T 세포는 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체, 예를 들어, PSM-4033-4039가 생체내에 투여될 때 직면하는 세포 유형의 혼합물인 미경험과 기억 말초 T 세포를 둘 다 나타낸다. 이 데이터는 혼합된 T 세포 집단에서조차, 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체, 예를 들어, PSM-4033-4039가 T 조절 세포를 정하는 유전자 발현의 주된 조절자인 Foxp3을 발현시키는 세포 빈도를 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 13B에 나타낸 결과는 미경험 CD4+ T 세포보다 더 낮은 빈도에서조차 기억 CD4+ T 세포가 Foxp3+ 세포로 분화하도록 PSM-4033-4039가 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실험 4: 동종이계 림프구 반응에 의해 활성화된 CD4
+
T 세포로부터의 PSM-4033-4039에 의한 Foxp3
+
iTreg의 유도.
총 말초 CD4+ T 세포를 인간 혈액으로부터 분류하고, T 세포 증식을 유도하기 위해 동종이계 단핵구-유래 DC(moDC)와 함께 플레이팅하였다. T 세포를 대조군으로서 자가 moDC와 함께 혼합하고, 동종이계 또는 자가 공여자 조합물을 둘 다 추가적인 대조군으로서 가용성 항-CD3(1㎍/㎖)으로 처리하였다. T 세포를 동종이계 활성화에 반응한 트랙 세포에 대한 세포 미량 바이올렛(CTV)으로 표지하였다. 제5일에 유세포분석에 의해 Foxp3의 증식 및 발현을 분석하였고, Foxp3을 발현시키는 증식 세포의 빈도를 도 14A 및 도 B에 플롯팅한다. 2명의 공여자의 조합물을 나타낸다. n = 2, 표준편차. 특히, 결과는 골수 또는 줄기 세포 이식 환자에서 생기는 이식편대숙주질환의 치료를 위한 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체, 예를 들어, PSM-4033-4039의 잠재적 용도를 입증한다.
실험 5: PSM-4033-4039를 이용하는 마우스에서의 PK 실험.
PSM-4033-4039를 Balb/c 마우스에 단일 용량으로서 0.1, 1 또는 10㎎/㎏으로 정맥내로 투여하였다. 이어서, 투약 후 5분, 2, 8, 24 및 72시간에 말초 혈액 샘플을 수집하였다. 이어서, 항-IL2 항체를 이용하여 분자를 포획한 리간드 결합 분석을 이용하여 PSM-4033-4039의 혈청 농도를 결정하였고, 항-TGFB3 항체를 이용하여 분자를 검출하였다. 도 15에 제공한 결과는 본 명세서에 개시된 마스킹된 TGF-β3 작제물 및 복합체, 예를 들어, PSM-4033-4039가 투여 후 72시간 초과 동안 생물학적으로 적절한 농도에서 혈청 중에 존재하는 채로 남아있을 수 있다는 것을 나타낸다. 작제물 4033의 서열을 도 10B에 제공하고(서열번호 191), 작제물 4039의 서열을 도 10C에 제공한다(서열번호 192).
* * *
본 개시내용은 이의 특정 실시형태를 참고로 하여 기재하였지만, 본 개시내용의 진정한 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 동등물이 치환될 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해되어야 한다. 추가로, 본 개시내용의 목적, 정신 및 범주에 대해 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 적합화시키기 위한 다수의 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본 명세서에 첨부하는 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Cue Biopharma, Inc.
<120> TGF-beta Polypeptides
<130> WO/2021/081258
<140> PCT/US2020/056937
<141> 2020-10-22
<150> US 62/925,227
<151> 2019-10-23
<160> 192
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
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Leu Ser Pro Ser Thr
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
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Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
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Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
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<213> Homo sapiens
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Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
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145 150 155 160
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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65 70 75 80
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Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg
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Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile
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<213> Homo sapiens
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Pro Arg Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe
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Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln
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50 55 60
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Ala
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
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180 185 190
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro
195 200 205
Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr
210 215 220
Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu
225 230 235 240
Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro
260 265 270
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg
275 280 285
Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg
290 295 300
Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile
305 310 315 320
Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys
325 330 335
His Met Ile Gly Ile Cys Val Thr Leu Thr Val Ile Ile Val Cys Ser
340 345 350
Val Phe Ile Tyr Lys Ile Phe Lys Ile Asp Ile Val Leu Trp Tyr Arg
355 360 365
Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro Ile Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr
370 375 380
Tyr Asp Ala Tyr Ile Leu Tyr Pro Lys Thr Val Gly Glu Gly Ser Thr
385 390 395 400
Ser Asp Cys Asp Ile Phe Val Phe Lys Val Leu Pro Glu Val Leu Glu
405 410 415
Lys Gln Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Val
420 425 430
Gly Glu Asp Ile Val Glu Val Ile Asn Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg
435 440 445
Arg Leu Ile Ile Ile Leu Val Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu
450 455 460
Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gln Ile Ala Met Tyr Asn Ala Leu Val Gln
465 470 475 480
Asp Gly Ile Lys Val Val Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gln Asp Tyr
485 490 495
Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gln Lys His Gly Ala
500 505 510
Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gln Gly Pro Gln Ser Ala Lys Thr
515 520 525
Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr His Met Pro Val Gln Arg Arg Ser
530 535 540
Pro Ser Ser Lys His Gln Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu Lys Leu
545 550 555 560
Gln Arg Glu Ala His Val Pro Leu Gly
565
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 10
<211> 251
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
210 215 220
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245 250
<210> 11
<211> 524
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn
1 5 10 15
Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys
20 25 30
Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu
35 40 45
Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly
50 55 60
Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg
65 70 75 80
Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp
85 90 95
Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln
100 105 110
Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser
115 120 125
Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys
145 150 155 160
Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln
165 170 175
Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr
180 185 190
Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala
195 200 205
Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu
210 215 220
Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys
225 230 235 240
Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro
245 250 255
Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp
260 265 270
Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro
275 280 285
Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp
290 295 300
Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala
305 310 315 320
Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly
325 330 335
Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln
340 345 350
Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly
355 360 365
Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu
370 375 380
Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu
385 390 395 400
Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr
405 410 415
Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu
420 425 430
Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro
435 440 445
Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu
450 455 460
Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu
465 470 475 480
Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg
485 490 495
Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu
500 505 510
Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
515 520
<210> 12
<211> 347
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met
35 40 45
Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr
50 55 60
Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys
65 70 75 80
Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln
85 90 95
Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn
115 120 125
Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser
130 135 140
Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys
145 150 155 160
Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr
165 170 175
Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp
180 185 190
Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu
195 200 205
Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp
210 215 220
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
225 230 235 240
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
245 250 255
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys
260 265 270
Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp
275 280 285
Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser
290 295 300
Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu
305 310 315 320
Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp
325 330 335
Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
340 345
<210> 13
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> X is any amino acid other than Glu, or X is Ala.
<400> 13
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Xaa His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<400> 14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 15
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> X is any amino acid other than His, or X is Ala, Arg, Asn, Asp,
Cys, Glu, Gln, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr,
Trp, or Val.
<400> 15
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 16
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> UNSURE
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala or Thr.
<400> 16
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (45)..(45)
<223> X is any amino acid other than Tyr, or X is Ala.
<400> 17
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 18
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (88)..(88)
<223> X is any amino acid other than Asn, or X is Ala or Arg.
<400> 18
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Xaa Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 19
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (126)..(126)
<223> X is any amino acid other than Gln, or X is Ala.
<400> 19
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 20
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> X is any amino acid other than His, or X is Ala or Thr.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala or Thr.
<400> 20
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 21
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> X is any amino acid other than His, or X is Ala or Thr.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala or Thr.
<400> 21
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> X is any amino acid other than Glu, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Xaa His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> X is any amino acid other than His, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (126)..(126)
<223> X is any amino acid other than Gln, or X is Ala.
<400> 25
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 26
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (45)..(45)
<223> X is any amino acid other than Tyr, or X is Ala.
<400> 26
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 27
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> X is any amino acid other than His, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (45)..(45)
<223> X is any amino acid other than Tyr, or X is Ala.
<400> 27
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 28
<211> 153
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
20 25 30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys
35 40 45
Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr
50 55 60
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
65 70 75 80
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
85 90 95
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
100 105 110
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
115 120 125
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
130 135 140
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
145 150
<210> 29
<211> 128
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu
1 5 10 15
Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe
20 25 30
Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala
35 40 45
Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys
50 55 60
Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg
65 70 75 80
Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn
85 90 95
Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu
100 105 110
Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
115 120 125
<210> 30
<211> 137
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln
20 25 30
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr
35 40 45
Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr
50 55 60
Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln
65 70 75 80
Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg
85 90 95
Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala
100 105 110
Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met
115 120 125
Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
130 135
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu
1 5 10 15
Thr Glu Gln Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala
20 25 30
Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys
35 40 45
Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg
50 55 60
Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn
65 70 75 80
Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu
85 90 95
Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
100 105 110
<210> 32
<211> 825
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
20 25 30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
35 40 45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
50 55 60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
85 90 95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
100 105 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
130 135 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
165 170 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr
195 200 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
210 215 220
Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser
225 230 235 240
Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr
245 250 255
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
260 265 270
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
275 280 285
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
290 295 300
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
305 310 315 320
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
325 330 335
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
340 345 350
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
355 360 365
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
370 375 380
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
385 390 395 400
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
405 410 415
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
420 425 430
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
435 440 445
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
450 455 460
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
465 470 475 480
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
485 490 495
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
500 505 510
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
515 520 525
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
530 535 540
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
545 550 555 560
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
565 570 575
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
580 585 590
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
595 600 605
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
610 615 620
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
625 630 635 640
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Gly Phe
645 650 655
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
660 665 670
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
675 680 685
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
690 695 700
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
705 710 715 720
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
725 730 735
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
740 745 750
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
755 760 765
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
770 775 780
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
785 790 795 800
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
805 810 815
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
820 825
<210> 33
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
20 25 30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
35 40 45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
50 55 60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
85 90 95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
100 105 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
130 135 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
165 170 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr
195 200 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
210 215 220
Asn Ile Cys
225
<210> 34
<211> 212
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
20 25 30
Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100 105 110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gln Met
210
<210> 35
<211> 183
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln
1 5 10 15
Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu
20 25 30
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met
35 40 45
Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro
50 55 60
Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu
65 70 75 80
Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr
85 90 95
Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg
100 105 110
Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys
115 120 125
Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala
130 135 140
Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met
145 150 155 160
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
180
<210> 36
<211> 468
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
275 280 285
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
290 295 300
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu
355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile
370 375 380
Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly
385 390 395 400
Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu
405 410 415
Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val
420 425 430
Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro
435 440 445
Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr
450 455 460
Phe Phe Pro Arg
465
<210> 37
<211> 918
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys
35 40 45
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr
50 55 60
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr
65 70 75 80
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser
85 90 95
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Gly Phe Gln Leu Glu
100 105 110
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys
115 120 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys
130 135 140
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu
145 150 155 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg
165 170 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val
180 185 190
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr
195 200 205
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro
210 215 220
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu
225 230 235 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys
245 250 255
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile
260 265 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp
275 280 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu
290 295 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile
325 330 335
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val
355 360 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala
370 375 380
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu
385 390 395 400
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile
405 410 415
Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala
420 425 430
Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu
435 440 445
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala
450 455 460
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
485 490 495
Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala
500 505 510
Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys
515 520 525
Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val
530 535 540
Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr
545 550 555 560
Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu
565 570 575
Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met
580 585 590
Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe
595 600 605
Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro
610 615 620
Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys
625 630 635 640
Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro
645 650 655
Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro
660 665 670
Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe
675 680 685
Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe
690 695 700
Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn
705 710 715 720
Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser
725 730 735
Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn
740 745 750
Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg
755 760 765
His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln
770 775 780
Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp
785 790 795 800
His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys
805 810 815
Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu
820 825 830
Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu
835 840 845
Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln
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Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly
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Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala
885 890 895
Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln
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Gly Gly Tyr Met Pro Gln
915
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
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Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
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130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
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210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
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355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile
370 375 380
Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly
385 390 395 400
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420 425 430
Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro
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450 455 460
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465
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
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Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
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His
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
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50 55 60
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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<213> Homo sapiens
<400> 48
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Thr
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<213> Homo sapiens
<400> 49
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
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<210> 52
<211> 578
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
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65 70 75 80
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Ser Val Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln
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195 200 205
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Ser Leu Thr Arg Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Val Ile Ile Phe Phe
225 230 235 240
Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Leu
245 250 255
Gln Leu Tyr Val Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Ser Val Leu Leu Phe
260 265 270
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275 280 285
Thr Gln Asp Thr Ile His Pro Leu Asp Glu Glu Ala Phe Leu Lys Val
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Ser Pro Glu Leu Lys Asn Leu Asp Leu His Gly Ser Thr Asp Ser Gly
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325 330 335
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435 440 445
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<210> 53
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
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1 5 10 15
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165 170 175
Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg
180 185 190
Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val
195 200 205
Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala
210 215 220
Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly
225 230 235 240
Cys Phe Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe
245 250 255
Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His
260 265 270
Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu
275 280 285
Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser
290 295 300
Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly
305 310 315 320
Gln Gly Pro Gln Ser
325
<210> 54
<211> 162
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
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115 120 125
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180 185 190
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195 200 205
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
210 215 220
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
225 230 235 240
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
245 250 255
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260 265
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
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20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
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Asp Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile
1 5 10 15
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35 40 45
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Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser
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Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys
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Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys
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Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His
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Gly Ser Glu Asp Ser
130
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
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65 70 75 80
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Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
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Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
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Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
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Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
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Asp Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
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Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
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<213> Homo sapiens
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Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
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Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
130 135 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
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Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
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Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
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210 215 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu
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Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys
245 250 255
Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser
260 265 270
Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe
275 280 285
Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly
290 295 300
Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His
305 310 315 320
Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu
325 330 335
Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp
340 345 350
Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp
355 360 365
Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala
370 375 380
Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro
385 390 395 400
Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp
405 410 415
Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser
420 425 430
Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg
435 440 445
Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro
450 455 460
Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser
465 470 475 480
Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly
485 490 495
Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp
500 505 510
Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro
515 520 525
Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
530 535
<210> 62
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
1 5 10 15
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20 25 30
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
35 40 45
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly
85 90 95
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
100 105 110
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu
115 120 125
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
130 135 140
Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu
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Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
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Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
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<210> 63
<211> 170
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln
1 5 10 15
Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val
20 25 30
Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp
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65 70 75 80
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Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu
100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Phe
130 135 140
Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val
145 150 155 160
Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
165 170
<210> 64
<211> 328
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
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Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
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Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
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Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 65
<211> 306
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
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100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
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130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
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Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
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Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
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Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
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Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 66
<211> 629
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Met Asn Gln Val Thr Ile Gln Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile
1 5 10 15
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290 295 300
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325 330 335
Thr Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn Arg Gly
340 345 350
Asp Ile Gly Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser
355 360 365
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370 375 380
Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro
500 505 510
Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro
515 520 525
Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile
530 535 540
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595 600 605
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
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Asp Leu Arg Cys Tyr Arg Ile Ser Ser Asp Arg Tyr Glu Cys Ser Trp
50 55 60
Gln Tyr Glu Gly Pro Thr Ala Gly Val Ser His Phe Leu Arg Cys Cys
65 70 75 80
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Leu Gln Phe Ser Asp Gln Ala Gly Val Ser Val Leu Tyr Thr Val Thr
100 105 110
Leu Trp Val Glu Ser Trp Ala Arg Asn Gln Thr Glu Lys Ser Pro Glu
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130 135 140
Asp Ile Lys Val Ser Lys Leu Ala Gly Gln Leu Arg Met Glu Trp Glu
145 150 155 160
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180 185 190
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225 230 235 240
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245 250 255
Thr Leu Lys Glu Gln Pro Thr Gln Leu Glu Leu Pro Glu Gly Cys Gln
260 265 270
Gly Leu Ala Pro Gly Thr Glu Val Thr Tyr Arg Leu Gln Leu His Met
275 280 285
Leu Ser Cys Pro Cys Lys Ala Lys Ala Thr Arg Thr Leu His Leu Gly
290 295 300
Lys Met Pro Tyr Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Asn Val Ala Val Ile Ser
305 310 315 320
Ser Asn Gln Phe Gly Pro Gly Leu Asn Gln Thr Trp His Ile Pro Ala
325 330 335
Asp Thr His Thr Glu Pro Val Ala Leu Asn Ile Ser Val Gly Thr Asn
340 345 350
Gly Thr Thr Met Tyr Trp Pro Ala Arg Ala Gln Ser Met Thr Tyr Cys
355 360 365
Ile Glu Trp Gln Pro Val Gly Gln Asp Gly Gly Leu Ala Thr Cys Ser
370 375 380
Leu Thr Ala Pro Gln Asp Pro Asp Pro Ala Gly Met Ala Thr Tyr Ser
385 390 395 400
Trp Ser Arg Glu Ser Gly Ala Met Gly Gln Glu Lys Cys Tyr Tyr Ile
405 410 415
Thr Ile Phe Ala Ser Ala His Pro Glu Lys Leu Thr Leu Trp Ser Thr
420 425 430
Val Leu Ser Thr Tyr His Phe Gly Gly Asn Ala Ser Ala Ala Gly Thr
435 440 445
Pro His His Val Ser Val Lys Asn His Ser Leu Asp Ser Val Ser Val
450 455 460
Asp Trp Ala Pro Ser Leu Leu Ser Thr Cys Pro Gly Val Leu Lys Glu
465 470 475 480
Tyr Val Val Arg Cys Arg Asp Glu Asp Ser Lys Gln Val Ser Glu His
485 490 495
Pro Val Gln Pro Thr Glu Thr Gln Val Thr Leu Ser Gly Leu Arg Ala
500 505 510
Gly Val Ala Tyr Thr Val Gln Val Arg Ala Asp Thr Ala Trp Leu Arg
515 520 525
Gly Val Trp Ser Gln Pro Gln Arg Phe Ser Ile Glu Val Gln Val Ser
530 535 540
Asp Trp Leu Ile Phe Phe Ala Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Ile Leu
545 550 555 560
Leu Val Gly Val Leu Gly Tyr Leu Gly Leu Asn Arg Ala Ala Arg His
565 570 575
Leu Cys Pro Pro Leu Pro Thr Pro Cys Ala Ser Ser Ala Ile Glu Phe
580 585 590
Pro Gly Gly Lys Glu Thr Trp Gln Trp Ile Asn Pro Val Asp Phe Gln
595 600 605
Glu Glu Ala Ser Leu Gln Glu Ala Leu Val Val Glu Met Ser Trp Asp
610 615 620
Lys Gly Glu Arg Thr Glu Pro Leu Glu Lys Thr Glu Leu Pro Glu Gly
625 630 635 640
Ala Pro Glu Leu Ala Leu Asp Thr Glu Leu Ser Leu Glu Asp Gly Asp
645 650 655
Arg Cys Lys Ala Lys Met
660
<210> 68
<211> 353
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
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1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
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210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
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1 5 10 15
Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly Tyr
20 25 30
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Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr Met
50 55 60
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Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile
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100 105 110
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115 120 125
Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu
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165 170 175
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180 185 190
Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys
195 200 205
Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn
210 215 220
Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp
225 230 235 240
Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro
245 250 255
Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val
260 265 270
Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
290 295 300
Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
305 310 315 320
Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp
325 330 335
Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
340 345 350
Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser
355 360 365
Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys
370 375 380
<210> 70
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Ala Asp Pro Cys Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr
85 90 95
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100 105 110
Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp
115 120 125
Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe
130 135 140
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Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu
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Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro
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Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 71
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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65 70 75 80
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85 90 95
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
225
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
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1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 73
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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50 55 60
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115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 74
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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225
<210> 75
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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Pro Gly Lys
225
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
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1 5 10 15
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
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Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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<210> 77
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro
225
<210> 78
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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195 200 205
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210 215 220
Pro
225
<210> 79
<211> 325
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
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35 40 45
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65 70 75 80
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Leu Ser Pro Gly Lys
325
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<211> 246
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
35 40 45
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
100 105 110
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
115 120 125
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
145 150 155 160
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
165 170 175
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
180 185 190
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
195 200 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
210 215 220
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
225 230 235 240
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
<210> 81
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 82
<211> 223
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
<210> 83
<211> 276
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 83
Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glx Ser Asp Trp Leu Gly Glu Ser
1 5 10 15
Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn
20 25 30
Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe
35 40 45
Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys
50 55 60
Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asx Ser Val Thr Ile
65 70 75 80
Ser Trp Thr Arg Glu Glu Asn Gly Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile
85 90 95
Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser
100 105 110
Ile Cys Glu Asp Asx Asp Trp Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val
115 120 125
Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro
130 135 140
Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asx Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
145 150 155 160
Arg Glx Glx Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val
165 170 175
Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Glu Trp Met Gln Arg Gly
180 185 190
Glu Pro Leu Ser Pro Gln Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu
195 200 205
Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser
210 215 220
Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Gly Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His
225 230 235 240
Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr
245 250 255
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
260 265 270
Gly Thr Cys Tyr
275
<210> 84
<211> 159
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 84
Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys
1 5 10 15
Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp
20 25 30
Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser
35 40 45
Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val
50 55 60
Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg
65 70 75 80
Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro
85 90 95
Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg
115 120 125
Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr
130 135 140
Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp
145 150 155
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 85
Phe Thr Val Arg Glu Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1 5 10 15
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
20 25 30
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
35 40 45
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
50 55 60
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
85 90 95
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
100 105 110
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile
1 5 10 15
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Arg
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<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Gln Glu Glu Gln Thr Ser Trp Leu Ile
1 5 10 15
Trp Ile Ser Asn Glu Leu Thr Leu Ile Arg Asn Glu Leu Ala Gln Ser
20 25 30
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Thr Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Thr Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Leu Ser Ser Ile Glu Lys Lys Leu Glu Glu Ile Thr Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Leu Ser Ser Leu Glu Lys Lys Leu Glu Glu Leu Thr Ser Gln Leu Ile
1 5 10 15
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 94
Ile Ser Ser Leu Glu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Thr Ser Gln Ile Gln
1 5 10 15
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20 25 30
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<213> Homo sapiens
<400> 95
Leu Glu Ile Glu Ala Ala Phe Leu Glu Arg Glu Asn Thr Ala Leu Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Val Ser Gln Tyr Arg Thr Arg Tyr Gly Pro Leu Gly Gly Gly Lys
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 96
Leu Lys Ser Val Glu Asn Arg Leu Ala Val Val Glu Asn Gln Leu Lys
1 5 10 15
Thr Val Ile Glu Glu Leu Lys Thr Val Lys Asp Leu Leu Ser Asn
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<213> Homo sapiens
<400> 97
Leu Ala Arg Ile Glu Glu Lys Leu Lys Thr Ile Lys Ala Gln Leu Ser
1 5 10 15
Glu Ile Ala Ser Thr Leu Asn Met Ile Arg Glu Gln Leu Ala Gln
20 25 30
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Val Ser Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ser Gln Val Thr
1 5 10 15
Glu Leu Ala Ser Thr Val Ser Leu Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Ile Gln Ser Glu Lys Lys Ile Glu Asp Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gln
1 5 10 15
Ile Gln Ser Glu Ile Thr Leu Ile Arg Asn Glu Ile Ala Gln
20 25 30
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<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Leu Met Ser Leu Glu Lys Lys Leu Glu Glu Leu Thr Gln Thr Leu Met
1 5 10 15
Gln Leu Gln Asn Glu Leu Ser Met Leu Lys Asn Glu Leu Ala Gln
20 25 30
<210> 101
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gln Cys Ala Gly Ile
1 5 10 15
Arg Leu
<210> 102
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro
1 5 10 15
Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala
20 25
<210> 103
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Gly His Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Pro Lys Gly Ala Cys Thr Gly Gln Met Ala
20 25
<210> 104
<211> 64
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Val Thr Ala Phe Ser Asn Met Asp Asp Met Leu Gln Lys Ala His Leu
1 5 10 15
Val Ile Glu Gly Thr Phe Ile Tyr Leu Arg Asp Ser Thr Glu Phe Phe
20 25 30
Ile Arg Val Arg Asp Gly Trp Lys Lys Leu Gln Leu Gly Glu Leu Ile
35 40 45
Pro Ile Pro Ala Asp Ser Pro Pro Pro Pro Ala Leu Ser Ser Asn Pro
50 55 60
<210> 105
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 106
<211> 390
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
355 360 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 107
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp
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Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu
50 55 60
Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Ser Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 108
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys
1 5 10 15
Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys
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Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
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<210> 109
<211> 413
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe
20 25 30
Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu
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Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe
100 105 110
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130 135 140
Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg Val
145 150 155 160
Pro Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp Leu
165 170 175
Thr Ser Pro Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr Arg
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Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His Glu
195 200 205
Trp Leu His His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu His
210 215 220
Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro Asn
225 230 235 240
Lys Ser Glu Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr Ser
245 250 255
Thr Tyr Thr Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys Lys
260 265 270
Asn Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser Tyr
275 280 285
Arg Leu Glu Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp
290 295 300
Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro
305 310 315 320
Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu
325 330 335
Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu
340 345 350
Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr
355 360 365
Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu
370 375 380
Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu
385 390 395 400
Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys
1 5 10 15
Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp
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Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu
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Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro
85 90 95
Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys
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85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 112
<211> 412
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Met Lys Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
Phe Ala Thr Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe
20 25 30
Gly His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu
35 40 45
Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His
50 55 60
Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu
65 70 75 80
Glu Glu Met His Gly Glu Arg Glu Glu Gly Cys Thr Gln Glu Asn Thr
85 90 95
Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln
100 105 110
Gly Leu Ala Glu His Asn Glu Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr
115 120 125
Ser Lys Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Arg Thr
130 135 140
Asn Leu Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser
145 150 155 160
Ser Lys Arg Asn Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Glu His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Gly Gly Lys Asn Leu Pro
180 185 190
Thr Arg Gly Thr Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val
195 200 205
Arg Glu Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser
210 215 220
Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu
225 230 235 240
Asn Ile His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu
245 250 255
Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp
260 265 270
His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu
275 280 285
Asp Asn Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr
290 295 300
Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro
325 330 335
Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu
355 360 365
Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu
370 375 380
Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln
385 390 395 400
Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
405 410
<210> 113
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys
1 5 10 15
Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp
20 25 30
Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys
35 40 45
Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu
50 55 60
Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser Cys Val Pro
65 70 75 80
Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro
85 90 95
Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
100 105 110
<210> 114
<211> 503
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr
20 25 30
Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys
35 40 45
Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys
50 55 60
Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg
65 70 75 80
Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr
85 90 95
Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro
100 105 110
Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala
115 120 125
Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met
130 135 140
Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn
145 150 155 160
Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr
165 170 175
Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln
195 200 205
Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp
210 215 220
Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg
225 230 235 240
Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His
245 250 255
Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr
260 265 270
Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu
275 280 285
Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys
290 295 300
Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile
305 310 315 320
Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser
325 330 335
Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu
340 345 350
Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala
355 360 365
Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu
370 375 380
Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp
385 390 395 400
Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser
405 410 415
Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val
420 425 430
Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln
435 440 445
Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu
450 455 460
Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala
465 470 475 480
Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser
485 490 495
Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met
500
<210> 115
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys Val
1 5 10 15
Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys Val
20 25 30
Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro Thr
65 70 75 80
Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu
85 90
<210> 116
<211> 592
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp
20 25 30
Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn
35 40 45
Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
50 55 60
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
85 90 95
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
100 105 110
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
115 120 125
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
145 150 155 160
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
180 185 190
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
195 200 205
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
210 215 220
Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His
225 230 235 240
Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys
245 250 255
Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp
260 265 270
Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe
290 295 300
Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser
305 310 315 320
Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu
325 330 335
Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe
340 345 350
His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser
355 360 365
Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala
370 375 380
His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile
385 390 395 400
Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu
405 410 415
Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr
420 425 430
Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg
435 440 445
Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val
450 455 460
Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp
465 470 475 480
Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu
485 490 495
Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met
500 505 510
Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe
515 520 525
Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu
530 535 540
Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala
545 550 555 560
Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser
565 570 575
Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
580 585 590
<210> 117
<211> 154
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln Lys
1 5 10 15
Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu Arg
20 25 30
His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys
35 40 45
Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp
50 55 60
Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu
65 70 75 80
Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn
85 90 95
Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp
100 105 110
Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys
115 120 125
Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu
130 135 140
Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu
145 150
<210> 118
<211> 567
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn
180 185 190
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys
195 200 205
Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg
210 215 220
Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu
225 230 235 240
Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala
245 250 255
Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu
260 265 270
Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys
275 280 285
Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile
290 295 300
Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln
305 310 315 320
Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr
325 330 335
Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser
340 345 350
Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys
355 360 365
Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn
370 375 380
Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser
405 410 415
Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser
420 425 430
Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr
435 440 445
Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val
450 455 460
Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu
465 470 475 480
His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly
485 490 495
Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met
500 505 510
Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg
515 520 525
Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu
530 535 540
Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
565
<210> 119
<211> 143
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln
130 135 140
<210> 120
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu
<210> 121
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys
1 5 10 15
Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn
20 25 30
Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala
35 40 45
Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His
50 55 60
Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser
65 70 75 80
Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe
85 90 95
Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser
100 105 110
Glu Glu
<210> 122
<211> 104
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
20 25 30
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
35 40 45
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
85 90 95
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu
100
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
1 5 10 15
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
20 25 30
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
35 40 45
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
65 70 75 80
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn
85 90 95
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
100 105 110
<210> 124
<211> 851
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Met Thr Ser His Tyr Val Ile Ala Ile Phe Ala Leu Met Ser Ser Cys
1 5 10 15
Leu Ala Thr Ala Gly Pro Glu Pro Gly Ala Leu Cys Glu Leu Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ser His Pro Val Gln Ala Leu Met Glu Ser Phe Thr Val
35 40 45
Leu Ser Gly Cys Ala Ser Arg Gly Thr Thr Gly Leu Pro Gln Glu Val
50 55 60
His Val Leu Asn Leu Arg Thr Ala Gly Gln Gly Pro Gly Gln Leu Gln
65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Leu His Leu Asn Pro Ile Ser Ser Val His Ile His
85 90 95
His Lys Ser Val Val Phe Leu Leu Asn Ser Pro His Pro Leu Val Trp
100 105 110
His Leu Lys Thr Glu Arg Leu Ala Thr Gly Val Ser Arg Leu Phe Leu
115 120 125
Val Ser Glu Gly Ser Val Val Gln Phe Ser Ser Ala Asn Phe Ser Leu
130 135 140
Thr Ala Glu Thr Glu Glu Arg Asn Phe Pro His Gly Asn Glu His Leu
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ala Arg Lys Glu Tyr Gly Ala Val Thr Ser Phe Thr Glu
165 170 175
Leu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Tyr Ile Lys Val Gly Glu Asp Gln Val
180 185 190
Phe Pro Pro Lys Cys Asn Ile Gly Lys Asn Phe Leu Ser Leu Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Glu Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Ala Glu Gly Cys Val Met Ser
210 215 220
Ser Gln Pro Gln Asn Glu Glu Val His Ile Ile Glu Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asn Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp Ile
245 250 255
Arg Pro Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Val Lys Asn Leu Ile Leu Ile
260 265 270
Leu Lys Cys Lys Lys Ser Val Asn Trp Val Ile Lys Ser Phe Asp Val
275 280 285
Lys Gly Ser Leu Lys Ile Ile Ala Pro Asn Ser Ile Gly Phe Gly Lys
290 295 300
Glu Ser Glu Arg Ser Met Thr Met Thr Lys Ser Ile Arg Asp Asp Ile
305 310 315 320
Pro Ser Thr Gln Gly Asn Leu Val Lys Trp Ala Leu Asp Asn Gly Tyr
325 330 335
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340 345 350
Leu Arg Leu Glu Asn Asn Ala Glu Glu Met Gly Asp Glu Glu Val His
355 360 365
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370 375 380
Ala Leu Gln Asn Pro Pro Ile Arg Gly Gly Glu Gly Gln Asn Gly Gly
385 390 395 400
Leu Pro Phe Pro Phe Pro Asp Ile Ser Arg Arg Val Trp Asn Glu Glu
405 410 415
Gly Glu Asp Gly Leu Pro Arg Pro Lys Asp Pro Val Ile Pro Ser Ile
420 425 430
Gln Leu Phe Pro Gly Leu Arg Glu Pro Glu Glu Val Gln Gly Ser Val
435 440 445
Asp Ile Ala Leu Ser Val Lys Cys Asp Asn Glu Lys Met Ile Val Ala
450 455 460
Val Glu Lys Asp Ser Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Met Asp Val
465 470 475 480
Thr Leu Leu Asp Pro Thr Cys Lys Ala Lys Met Asn Gly Thr His Phe
485 490 495
Val Leu Glu Ser Pro Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Pro Arg Trp Ser
500 505 510
Ala Leu Asp Gly Val Val Tyr Tyr Asn Ser Ile Val Ile Gln Val Pro
515 520 525
Ala Leu Gly Asp Ser Ser Gly Trp Pro Asp Gly Tyr Glu Asp Leu Glu
530 535 540
Ser Gly Asp Asn Gly Phe Pro Gly Asp Met Asp Glu Gly Asp Ala Ser
545 550 555 560
Leu Phe Thr Arg Pro Glu Ile Val Val Phe Asn Cys Ser Leu Gln Gln
565 570 575
Val Arg Asn Pro Ser Ser Phe Gln Glu Gln Pro His Gly Asn Ile Thr
580 585 590
Phe Asn Met Glu Leu Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Leu Val Pro Ser Gln
595 600 605
Gly Val Phe Ser Val Pro Glu Asn Gly His Val Tyr Val Glu Val Ser
610 615 620
Val Thr Lys Ala Glu Gln Glu Leu Gly Phe Ala Ile Gln Thr Cys Phe
625 630 635 640
Ile Ser Pro Tyr Ser Asn Pro Asp Arg Met Ser His Tyr Thr Ile Ile
645 650 655
Glu Asn Ile Cys Pro Lys Asp Glu Ser Val Lys Phe Tyr Ser Pro Lys
660 665 670
Arg Val His Phe Pro Ile Pro Gln Ala Asp Met Asp Lys Lys Arg Phe
675 680 685
Ser Phe Val Phe Lys Pro Val Phe Asn Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln
690 695 700
Cys Glu Leu Thr Leu Cys Thr Lys Met Glu Lys His Pro Gln Lys Leu
705 710 715 720
Pro Lys Cys Val Pro Pro Asp Glu Ala Cys Thr Ser Leu Asp Ala Ser
725 730 735
Ile Ile Trp Ala Met Met Gln Asn Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Leu Thr Val Met Gly Ile Ala Phe Ala Ala Phe Val Ile Gly Ala Leu
785 790 795 800
Leu Thr Gly Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Gly Glu Thr Ala
805 810 815
Gly Arg Gln Gln Val Pro Thr Ser Pro Pro Ala Ser Glu Asn Ser Ser
820 825 830
Ala Ala His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Ser Ser
835 840 845
Ser Thr Ala
850
<210> 125
<211> 850
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Met Thr Ser His Tyr Val Ile Ala Ile Phe Ala Leu Met Ser Ser Cys
1 5 10 15
Leu Ala Thr Ala Gly Pro Glu Pro Gly Ala Leu Cys Glu Leu Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ser His Pro Val Gln Ala Leu Met Glu Ser Phe Thr Val
35 40 45
Leu Ser Gly Cys Ala Ser Arg Gly Thr Thr Gly Leu Pro Gln Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Leu His Leu Asn Pro Ile Ser Ser Val His Ile His
85 90 95
His Lys Ser Val Val Phe Leu Leu Asn Ser Pro His Pro Leu Val Trp
100 105 110
His Leu Lys Thr Glu Arg Leu Ala Thr Gly Val Ser Arg Leu Phe Leu
115 120 125
Val Ser Glu Gly Ser Val Val Gln Phe Ser Ser Ala Asn Phe Ser Leu
130 135 140
Thr Ala Glu Thr Glu Glu Arg Asn Phe Pro His Gly Asn Glu His Leu
145 150 155 160
Leu Asn Trp Ala Arg Lys Glu Tyr Gly Ala Val Thr Ser Phe Thr Glu
165 170 175
Leu Lys Ile Ala Arg Asn Ile Tyr Ile Lys Val Gly Glu Asp Gln Val
180 185 190
Phe Pro Pro Lys Cys Asn Ile Gly Lys Asn Phe Leu Ser Leu Asn Tyr
195 200 205
Leu Ala Glu Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Ala Glu Gly Cys Val Met Ser
210 215 220
Ser Gln Pro Gln Asn Glu Glu Val His Ile Ile Glu Leu Ile Thr Pro
225 230 235 240
Asn Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile Asp Ile
245 250 255
Arg Pro Ser Gln Glu Asp Leu Glu Val Val Lys Asn Leu Ile Leu Ile
260 265 270
Leu Lys Cys Lys Lys Ser Val Asn Trp Val Ile Lys Ser Phe Asp Val
275 280 285
Lys Gly Ser Leu Lys Ile Ile Ala Pro Asn Ser Ile Gly Phe Gly Lys
290 295 300
Glu Ser Glu Arg Ser Met Thr Met Thr Lys Ser Ile Arg Asp Asp Ile
305 310 315 320
Pro Ser Thr Gln Gly Asn Leu Val Lys Trp Ala Leu Asp Asn Gly Tyr
325 330 335
Ser Pro Ile Thr Ser Tyr Thr Met Ala Pro Val Ala Asn Arg Phe His
340 345 350
Leu Arg Leu Glu Asn Asn Glu Glu Met Gly Asp Glu Glu Val His Thr
355 360 365
Ile Pro Pro Glu Leu Arg Ile Leu Leu Asp Pro Gly Ala Leu Pro Ala
370 375 380
Leu Gln Asn Pro Pro Ile Arg Gly Gly Glu Gly Gln Asn Gly Gly Leu
385 390 395 400
Pro Phe Pro Phe Pro Asp Ile Ser Arg Arg Val Trp Asn Glu Glu Gly
405 410 415
Glu Asp Gly Leu Pro Arg Pro Lys Asp Pro Val Ile Pro Ser Ile Gln
420 425 430
Leu Phe Pro Gly Leu Arg Glu Pro Glu Glu Val Gln Gly Ser Val Asp
435 440 445
Ile Ala Leu Ser Val Lys Cys Asp Asn Glu Lys Met Ile Val Ala Val
450 455 460
Glu Lys Asp Ser Phe Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Met Asp Val Thr
465 470 475 480
Leu Leu Asp Pro Thr Cys Lys Ala Lys Met Asn Gly Thr His Phe Val
485 490 495
Leu Glu Ser Pro Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Pro Arg Trp Ser Ala
500 505 510
Leu Asp Gly Val Val Tyr Tyr Asn Ser Ile Val Ile Gln Val Pro Ala
515 520 525
Leu Gly Asp Ser Ser Gly Trp Pro Asp Gly Tyr Glu Asp Leu Glu Ser
530 535 540
Gly Asp Asn Gly Phe Pro Gly Asp Met Asp Glu Gly Asp Ala Ser Leu
545 550 555 560
Phe Thr Arg Pro Glu Ile Val Val Phe Asn Cys Ser Leu Gln Gln Val
565 570 575
Arg Asn Pro Ser Ser Phe Gln Glu Gln Pro His Gly Asn Ile Thr Phe
580 585 590
Asn Met Glu Leu Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Leu Val Pro Ser Gln Gly
595 600 605
Val Phe Ser Val Pro Glu Asn Gly His Val Tyr Val Glu Val Ser Val
610 615 620
Thr Lys Ala Glu Gln Glu Leu Gly Phe Ala Ile Gln Thr Cys Phe Ile
625 630 635 640
Ser Pro Tyr Ser Asn Pro Asp Arg Met Ser His Tyr Thr Ile Ile Glu
645 650 655
Asn Ile Cys Pro Lys Asp Glu Ser Val Lys Phe Tyr Ser Pro Lys Arg
660 665 670
Val His Phe Pro Ile Pro Gln Ala Asp Met Asp Lys Lys Arg Phe Ser
675 680 685
Phe Val Phe Lys Pro Val Phe Asn Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gln Cys
690 695 700
Glu Leu Thr Leu Cys Thr Lys Met Glu Lys His Pro Gln Lys Leu Pro
705 710 715 720
Lys Cys Val Pro Pro Asp Glu Ala Cys Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile
725 730 735
Ile Trp Ala Met Met Gln Asn Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu Ala
740 745 750
Val Ile His His Glu Ala Glu Ser Lys Glu Lys Gly Pro Ser Met Lys
755 760 765
Glu Pro Asn Pro Ile Ser Pro Pro Ile Phe His Gly Leu Asp Thr Leu
770 775 780
Thr Val Met Gly Ile Ala Phe Ala Ala Phe Val Ile Gly Ala Leu Leu
785 790 795 800
Thr Gly Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Gly Glu Thr Ala Gly
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Arg Gln Gln Val Pro Thr Ser Pro Pro Ala Ser Glu Asn Ser Ser Ala
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Ala His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Ser Ser Ser
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Thr Ala
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Gly Cys Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<213> Homo sapiens
<400> 138
Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp
20 25 30
Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile
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Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Thr Gln His Ser Ser Tyr
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Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala
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Val Asn Ala Pro Tyr Ala Ala Ala Leu His Glu His
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
<223> X is any amino acid other than Asp, or X is Ala.
<220>
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<220>
<221> VARIANT
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<220>
<221> VARIANT
<222> (126)..(126)
<223> X is any amino acid other than Gln, or X is Ala.
<400> 139
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr
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<210> 140
<211> 133
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<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (20)..(20)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (45)..(45)
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<220>
<221> VARIANT
<222> (126)..(126)
<223> X is any amino acid other than Gln, or X is Ala.
<400> 140
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Xaa Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
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115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 141
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> X is any amino acid other than His, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> X is any amino acid other than Phe, or X is Ala.
<220>
<221> VARIANT
<222> (126)..(126)
<223> X is any amino acid other than Gln, or X is Ala.
<400> 141
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Xaa Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Xaa Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
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<213> Homo sapiens
<400> 142
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 143
<211> 281
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 144
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro
20 25 30
Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr
35 40 45
Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr
50 55 60
Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val
65 70 75 80
Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg
85 90 95
Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg
100 105 110
Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met
115 120 125
Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly
130 135 140
Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser
145 150 155 160
Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu
165 170 175
Tyr Lys Leu
<210> 145
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp
165 170 175
Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg
180 185 190
Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly
195 200 205
Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu
210 215 220
Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met
225 230 235 240
Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu
245 250 255
Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu
260 265 270
Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys
275 280 285
Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys
290 295 300
Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser
305 310 315 320
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
325 330 335
<210> 146
<211> 627
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe
370 375 380
Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser
385 390 395 400
Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val
405 410 415
Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys
420 425 430
His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala
435 440 445
Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe
450 455 460
Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe
465 470 475 480
Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu
515 520 525
Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly
530 535 540
Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser
545 550 555 560
Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val
565 570 575
Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Ser
580 585 590
Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly
595 600 605
Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys
610 615 620
Lys Cys Ser
625
<210> 147
<211> 637
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145 150 155 160
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165 170 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290 295 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305 310 315 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325 330 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser
385 390 395 400
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Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met
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Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn
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Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
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<212> PRT
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Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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195 200 205
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260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
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370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 191
<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein construct
<400> 191
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
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115 120 125
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Claims (15)
- 작제물로서,
i) 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
ii) TGF-β 폴리펩타이드 서열;
iii) TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 포함하는 마스킹(masking) 폴리펩타이드 서열;
iv) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열;
및
v) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 제1 폴리펩타이드로서 포함하되,
이들 요소를 포함하는 작제물은 "마스킹된 TGF-β 작제물"로서 총괄적으로 지칭되고, 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열과 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서로 결합된, 작제물. - 제1항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로:
i) 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열;
ii) 제1 MOD 폴리펩타이드 서열, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열; 또는
iii) 제1의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 제2의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열
을 포함하되,
상기 마스킹된 TGF-β 작제물은 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드는 이량체화 서열을 포함하되, 선택적으로 상기 스캐폴드 폴리펩타이드는 종간(interspecific) 이량체화 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체를 형성하기 위해 상기 제1 폴리펩타이드와 이량체화되는 제2 폴리펩타이드를 더 포함하되,
상기 제2 폴리펩타이드는
i) 스캐폴드 폴리펩타이드 서열;
ii) TGF-β 폴리펩타이드 서열;
iii) TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 포함하는 마스킹 폴리펩타이드 서열;
iv) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열;
및
v) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. - 제4항에 있어서,
상기 제1 폴리펩타이드는 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드를 포함하고,
상기 제2 폴리펩타이드는 상기 제1 폴리펩타이드의 상기 종간 결합 서열에 대한 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열을 포함하고; 그리고
상기 종간 결합 서열 및 상기 상대 종간 결합 서열은 상기 이형이량체에서 서로 상호작용하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. - 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 이형이량체로서 포함하는 TGF-β 복합체로서,
(i) 상기 제1 폴리펩타이드는
a) 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열,
b) TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열 또는 항-TGF-β 폴리펩타이드 서열을 선택적으로 포함하는 마스킹 폴리펩타이드 서열,
c) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 및
d) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 포함하고; 그리고
(ii) 상기 제2 폴리펩타이드는
a) 상기 제1 폴리펩타이드에서 상기 종간 이량체화 서열에 대한 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열,
b) TGF-β 폴리펩타이드 서열,
c) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열, 및
d) 선택적으로, 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열
을 포함하되,
이들 요소를 포함하는 복합체는 "마스킹된 TGF-β 복합체"로서 총괄적으로 지칭되며,
상기 마스킹 폴리펩타이드 서열 및 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열은 서로 결합하고;
상기 종간 결합 서열 및 상기 상대 종간 결합 서열은 상기 이형이량체에서 서로 상호작용하고(예를 들어, 공유적 또는 비공유적으로 결합하고); 그리고
상기 마스킹된 TGF-β 제1 폴리펩타이드 및/또는 제2 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 독립적으로 선택된 링커 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물. - 제6항에 있어서,
상기 제1 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지,
a) 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열, 상기 종간 이량체화 서열을 포함하는 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열 및 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열; 또는
b) 종간 이량체화 서열을 포함하는 스캐폴드 폴리펩타이드 서열, 및 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열(예를 들어, TGF-β 수용체 폴리펩타이드 서열)
을 포함하되,
상기 제2 폴리펩타이드는, N-말단으로부터 C-말단까지, 1 또는 2개(이상)의 독립적으로 선택된 MOD 서열, 상기 상대 종간 이량체화 서열을 포함하는 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열 및 상기 TGF-β 폴리펩타이드 서열을 포함하는, 마스킹된 TGF-β 복합체 이형이량체. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 폴리펩타이드 서열(들)은 Ig Fc 폴리펩타이드 서열 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되되, 선택적으로 상기 Ig Fc 폴리펩타이드 서열은, 예를 들어, 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 통해, 보체 성분 1q(C1q) 및/또는 Fc 람다 수용체(FcλR)에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 감소시키고/시키거나 세포 용해를 유도하는 상기 Ig 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 감소 또는 제거하는 돌연변이를 포함하는, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 독립적으로 선택된 MOD 폴리펩타이드 서열은: PD-L1, FAS-L, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-23 MOD 폴리펩타이드 서열, 및 이들 중 어느 것의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MOD 폴리펩타이드 서열 중 적어도 하나는:
(i) 서열번호 9의 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성을 갖거나; 또는
(ii) 서열번호 13 내지 27 중 하나의 적어도 80, 90, 100, 110, 120, 130 또는 133개의 인접한 aa에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% aa 서열 동일성 또는 100% 서열 동일성을 갖는
wt. IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열 또는 변이체 IL-2 MOD 폴리펩타이드 서열인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마스킹 폴리펩타이드 서열은 I형(TβRI), II형(TβRII) 또는 III형(TβRIII) TβR의 엑토도메인 단편을 포함하는 TGF-β 수용체("TβR") 폴리펩타이드 서열인, 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체.
- 제7항에 있어서, 상기 복합체는 폴리펩타이드 작제물 4033(서열번호 191) 및 폴리펩타이드 작제물 4039(서열번호 192)의 조합물로부터 형성된, 마스킹된 TGF-β 복합체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 마스킹된 TGF-β 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산.
- 포유류 대상체에서 Treg 세포를 유도하거나 대상체에서의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 마스킹된 TGF-β 작제물 또는 복합체 또는 제13항의 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 방법은 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역-연관 불임, 자가면역 혈소판 감소 자색반 자반병, 수포성 유사천포창, 셀리악병, 크론병, 굿파스쳐 증후군, 사구체신염, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 중증근무력증(MG), 천포창, 악성빈혈, 다발근염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스(SLE), 1형 당뇨병(T1D), 셀리악병, 혈관염 및 백반증으로 이루어진 군으로부터 선택된 자가면역병태 또는 질환의 치료를 위한, 방법.
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