CZ291372B6 - Rekombinantní adenovirový vektor a jeho použití - Google Patents

Abstract

Rekombinantní adenovirový expresní vektor, zahrnující a) inzert exogenní DNA, zahrnující gen kódující cizí protein, a b) adenovirovou DNA, v níž byly vypuštěny všechny kódující sekvence E1a, E1b a proteinu IX a alespoň část E3, farmaceutický přípravek na bázi tohoto vektoru a použití tohoto vektoru k přípravě farmaceutického prostředku.ŕ

Description

Předložený vynález se týká rekombinantního adenovirového vektoru a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

V tomto popisu jsou různé publikace uváděny citacemi v závorkách a v seznamu literatury, který je uveden před patentovými nároky. Tyto publikace jsou zde zahrnuty do popisu, aby byl plně popsán stav techniky v oboru, kterého se předložený vynález týká.

Produkce rekombinantních adenovirů vhodných pro genovou terapii vyžaduje použití buněčné linie, schopné nahrazení v transgenových produktech virových El regionu, které jsou v těchto rekombinantních virech deletovány. V současnosti je použitelnou dostupnou buněčnou linií pouze 293 buněčná linie původně popsaná Grahamem a spol. 1977. Buňky 293 obsahují zleva přibližně 12 % (4,3 kb) genomu adenovirů typu 5 (Aiello (1979) a Spector (1983).

Adenovirové vektory v současné době testované pro aplikace v genové terapii jsou typicky zbaveny Ad2 nebo Ad5 DNA zasahující přibližně od 400 páru bází od 5' konce virového genomu do přibližně 3,3 kb od 5' konce, pro celkovou El deleci 2,9 kb. Existuje zde tak omezená oblast homologie přibližně 1 kb mezi DNA sekvencí rekombinantního viru a Ad5 DNA v buněčné linii. Tato homologie definuje oblast potenciální rekombinace mezi virovými a buněčnými adenovirovými sekvencemi. Taková rekombinace vede kfenotypově standardnímu typu viru, nesoucímu Ad5 El region z 293 buněk. Tato rekombinace je přičítána převážně časté detekci standardního typu adenovirů v přípravcích rekombinantního viru a bylo přímo demonstrováno, že vyvolává standardní typ kontaminace Ad2 na bázi rekombinantního viru Ad2/CFTR-1 (Rich a spol. (1973)).

Díky vysokému stupni homologie s typem C adenovirové podskupiny se tato rekombinace pravděpodobně objevuje, jeli vektor na bázi jakékoliv skupiny C adenovirů (typy 1, 2, 5, 6).

V produkci rekombinantních adenovirů v malém měřítku, generování kontaminace virem standardního typu může být dosaženo screeningovým procesem, který odkládá ty preparáty viru, které byly shledány kontaminovanými. Se vzrůstáním měřítka virové produkce pro splnění požadavků genové terapie, bude pravděpodobnost jakéhokoliv podílu, kontaminovaného standardním typem viru, také stoupat a stejně tak obtížnost poskytnutí nekontaminovaných přípravků.

V tomto roce bude diagnostikován více než jeden milion nových případů rakoviny, a polovina z tohoto počtu je spojena s úmrtím (Američan Cancer Society, 1993). p53 mutace jsou nejčastější genetickou změnou spojenou s lidskými rakovinami, objevující se v 50-60 % lidských rakovin (Hollstein a spol. (1991); Bartek a spol. (1991); Levine (1993). Cílem genové terapie v léčbě p53 defícientních tumorů je, například, reinstalace normální, funkční kopie standardního p53 genu, takže se obnoví řízení buněčné proliferace. p53 hraje podstatnou roli v progresi buněčného cyklu, znemožnění růstu tak, že se může objevit oprava nebo apoptosis v odpovědi na DNA poškození. Standardní typ p53 byl v současnosti identifikován jako nezbytná složka pro apoptosis indukovanou ozářením nebo ošetřením některými chemoterapeutickými činidly (Lowe a spol. (1993) A a B). Vzhledem k vysokému rozšíření p53 mutací v lidských tumorech je možné, že tumory, které byly odolné k chemoterapeutické a ozařovací léčbě, se tak mohou chovat proto, že postrádají standardní typ p53. Při dodání funkčního p53 do těchto tumorů se tyto stávají náchylnými k apoptosis normálně spojené s DNA poškozením vyvolaným ozářením a chemoterapií.

-1 CZ 291372 B6

Jedním z kritických bodů v úspěšné humánní tumorové supresorové genové terapii je schopnost ovlivňovat významnou frakci rakovinových buněk. Použití retrovirálních vektorů bylo rozsáhle vyzkoušeno na mnoha tumorových modelech. Například u léčby jatemích malignancí byly použity retrovirové vektory s malým úspěchem, protože tyto vektory nejsou schopny dosáhnout vysoké hladiny genového transferu vyžadovaného pro in vivo genovou terapii (Huber B.E. a spol., 1991, Caruso M. a spol., 1993).

Pro dosažení trvalejšího zdroje virové produkce se výzkumníci snažili překonat problém spojený s nízkou hladinou genového transferu přímou injekcí retrovirových obalových („packaging“) buněčných linií do pevných tumorů (Caruso M. a spol., 1993, Ezzidine Z.D. a spol., Culver K.W. a spol., 1992). Tyto metody jsou však nevhodné pro použití u lidských pacientů,protože tato metoda je obtížná a vyvolává u pacientů zánětlivou odpověď na obalovou buněčnou linii. Další nevýhodou retrovirových vektorů je, že vyžadují rozdělení buněk do účinného integrátu a expresi rekombinantního genu (Huber Β. E., 1991). Stálá integrace do základního hostitelského genu může vést k vývoji nebo dědění patogenních chorobných stavů.

Rekombinantní adenoviry mají významné výhody vůči metodám retrovirového a jiného genového doručování (přehled viz Siegfried (1993). Adenoviry nebyly nikdy prokázány jako vyvolávající tumory u lidí a byly bezpečně užívány jako živé vakcíny (Straus (1984)). Replikace defícientních rekombinantních adenovirů může být produkována nahrazením El oblasti nezbytné pro replikaci s cílovým genem. Adenovirus neintegruje do lidského genomu jako normální následek infekce, čímž se většinou redukuje riziko inzerční mutageneze možné s retrovirovými nebo adenospojenými virovými (AAV) vektory. Ztráta stabilní integrace také vede k dalšímu bezpečnému rysu tím, že účinek transferovaného genu bude přechodný, přitom, jak se extrachromozomální bude postupně ztrácet s kontinuálním dělením normálních buněk. Stabilně může být vysoký titr rekombinantního adenovirů produkován v hladinách nedosažitelných s retrovirem nebo AAV, což umožňuje, aby byl produkovaný materiál použit pro ošetření velkého množství populace pacientů. Navíc jsou adenovirové vektory schopny vysoké účinnosti in vivo genového transferu do širokého rozsahu typů tkání a tumorových buněk. Například bylo prokázáno, že adenovirové zprostředkované genové doručování má silný potenciál pro genovou terapii pro choroby jako je cystická fíbroza (Rosenfeld a spol. (1992), Rich a spol. (1993)). a a ]- antitrypsinovou nedostatečnost (Lemarchand a spol. (1992)). I když v současné době jsou využívány i jiné alternativy genového doručování, jako jsou komplexy kationický liposom/DNA, nikdo dosud neobjevil, jak účinně tak adenovirové zprostředkované genové doručování.

Jako u léčby p53 defícientních tumorů je cílem genové terapie u jiných tumorů obnovení řízení buněčné proliferace. V případě p53 zavedení funkčního genu obnovuje kontrolu buněčného cyklu umožněním apoptické buněčné smrti indukované terapeutickými činidly. Podobně je stejně tak genová terapie aplikovatelná na jiné tumor potlačující geny, které mohou být použity bud samotné nebo v kombinaci s terapeutickými činidly pro kontrolu progrese buněčného cyklu tumorových buněk a/nebo indukci buněčné smrti.

Navíc mohou být použity v genově terapeutických postupech geny, které nekódují regulátorové proteiny buněčného cyklu, ale přímo indukují buněčnou smrt, jako jsou sebevražedné geny nebo geny, které jsou přímo toxické pro buňky, pro přímé odstranění progrese buněčného cyklu tumorových buněk.

Bez ohledu na to, který gen se použije pro reinstalaci řízení progrese buněčného cyklu, je racionální a praktická použitelnost tohoto přiblížení identická. Totiž dosažení vysokých účinností genového transferu k expresi terapeutických množství rekombinantního produktu. Volba toho, který vektor se použije k umožnění vysoké účinnosti genového transferu s minimálním rizikem pro pacienta, je proto důležitá pro úroveň úspěchu ošetření genovou terapií.

-2CZ 291372 B6

Existuje zde tedy potřeba vektorů a metod, které poskytují vysokou hladinu účinností genového transferu a proteinové exprese, které poskytují bezpečná a účinná ošetření genovou terapií. Předložený vynález naplňuje tuto potřebu a poskytuje s tím spojené výhody.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje rekombinantní adenovirový expresní vektor, charakterizovaný parciální nebo úplnou delecí adenovirové protein IX DNA a mající gen, kódující cizí protein nebo funkční fragment nebo jeho mutant.

Předmětem vynálezu je rekombinantní adenovirový expresní vektor, zahrnující

a) inzert exogenní DNA, zahrnující gen kódující cizí protein, a

b) adenovirovou DNA, v níž byly vypuštěny všechny kódující sekvence Ela, Elb a proteinu IX a alespoň část E3.

Dále vynález zahrnuje farmaceutický přípravek na bázi tohoto vektoru a použití tohoto vektoru k přípravě farmaceutického prostředku.

Adenovirový vektor podle vynálezu může například obsahovat cizí gen pro expresi cyklu, jako je p53, Rb nebo mitosin, nebo v indukci buněčné smrti jako je podmiňovací sebevražedný gen thymidin kinázy. (Posledně uvedený musí být, aby byl účinný, použit ve spojení s metabolitem thymidin kinázy).

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr.l představuje rekombinantní adenovirový vektor podle předloženého vynálezu. Tento konstrukt byl sestaven jak je ukázáno na obr. 1. Výsledný vir nese 5 delecí adenovirových sekvencí rozkládající se od nukleotidu 356 do 4020 a eliminuje Ela a Elb geny, jakož i celou protein IX kódující sekvenci s ponecháním polyadenylačního místa stříhaného u Elb a pIX genů intaktního pro použití v terminační transkripci jakéhokoliv požadovaného genu.

Obr. 2 představuje aminokyselinovou sekvencí pl 10^RB.

Obr. 3 představuje DNA sekvenci, kódující retinoblastomový tumor potlačující protein.

Obr. 4 představuje schematicky rekombinantní p53/adenovirus konstrukty v rozsahu tohoto vynálezu. p53 rekombinanty jsou založeny na Ad 5 a mají hlavu El regionu nukleotidů 360-3325 nahrazenou 1,4 kb plné délky p53 cDNA řízenou Ad 2 mlP (A/M/53) nebo lidskými CMV (A/C/53) promotory následovanou Ad 2 tripartitní leader cDNA. Kontrolní virus A/M má stejné Ad5 delece jako A/M/53 virus, ale postrádá 1,4 kf p53 cDNA inzert. Zbývající Elb sekvence (705 nukleotidů) byla deletována pro vytvoření protein IX deletovaných konstruktů A/M/N/53 a A/C/N/53. Tyto konstrukty také mají 1,9 kb Xba I deleci v adenovirus typ 5 regionu E3.

Obr. 5A a 5B představují p53 proteinovou expresi v nádorových buňkách infikovaných s A/M/53 a A/C/53. Obr. 5A) Saos-2 (osteosarkom) buňky byly infikovány uvedenými násobky infekce (MOI) bud s A/M/53 nebo A/C/53 čištěný virus a sklizeny o 24 hodin později. p53 protilátka pAb 1801 byla použita k vybarvení imunoblotů vzorků o stejných celkových koncentracích proteinů. Extrakty o stejné proteinové koncentraci nadměrně exprimující mutantní p53 protein, byly použity jako markér pro velikost p53. „O“ pod A/C/53 záhlavím indikuje falešnou infekci, obsahující neošetřený Saos-2 lyzát. Obr. 5B) Hep 3B (hepatobuněčný karcinom) buňky byly

-3CZ 291372 B6 indikovány s A/M/53 nebo A/C/53 virem při uvedené MOI a analyzovány jako v části A). Šipka označuje polohu p53 proteinu.

Obr. 6A až 6C ukazuje p53 závislou Saos-2 morfologickou změnu. Subkonfluentní (1*10 buněk/10 cm plotna) Saos-2 buňky buď nebyly infikovány (A), byly infikovány při MOI = 50 s (B) kontrolním A/M virem nebo (C) A/C/53 virem. Buňky byly fotografovány 72 hodin po infekci.

Obr. 7 představuje p53 závislou inhibici DNA syntézy v lidské nádorové buněčné linii u A/M/N/53 a A/C/N/53. Devět různých buněčných linií bylo infikováno bud kontrolním adenovirem (A/M(-x-x-), nebo p53 exprimujícím Α/Μ/Ν/53/-Δ-Δ -), nebo A/C/N/53 (-O-Q-) virem při zvyšujících se MOI jak je uvedeno. Typ nádoru a p53 status je poznamenán u každé buněčné linie (wt = standardní typ, nula = neexprimován žádný protein, mut = exprimován mutantní protein). Syntéza DNA byla měřena 72 h po infekci jak je popsáno dále v pokusu č. II. Výsledky jsou ze trojnásobných měření v každé dávce (průměr +/- SD, a jsou graficky vyjádřeny jako % média kontroly versus MOI. H69 buňky byly testovány pouze s AIM a A/M/N/53 virem.

Obr. 8 ukazuje tumorigenicitu p53 infikovaných Saos-2 buněk u holé myši. Saos-2 buňky byly infektovány bud s kontrolním A/M virem nebo p53 rekombinantním A/M/N/53 pří MOI = 30. Ošetřené buňky byly injektovány subkutánně do boků holých myší a rozměry nádoru byly měřeny (jak popsáno v pokusu č. II) dvakrát za týden po 8 týdnů. Výsledky jsou graficky vyjádřeny jako velikosti nádorů proti dnům po implantaci nádorových buněk jak pro kontrolní A/M (-X-X-) tak A/M/N/53 (-Δ-Δ-) ošetřené buňky. Čáry pro chybu představují průměrnou velikost nádoru = /-SEM pro každou skupinu 4 zvířat v každém časovém bodě.

Obr. 9 je exprese rAd/p53 RNA v ustavených nádorech. H69 (SCLC) buňky byly injektovány subkutánně do holé myši a tumory byly ponechány vyvinout po 32 dnů do dosažení velikosti přibližně 25-50 m³. Myši byly náhodně rozděleny a injektovány peritumorálně s 2 x 10 pfu bud kontrolního A/C/β- gal nebo A/C/53 viru. Nádory byly vyříznuty 2. a 7. den po injekci a póly ARNA byla připravena z každého nádorového vzorku. RT-PCR byla provedena za použití stejných RNA koncentrací a primerů specifických pro rekombinantní p53 mediátor. PCR amplikace byla 30 cyklů při 94 °C I min, 55 °C 1,5 min, 72 °C 2 min a 10 min 72 °C konečná prodlužovací perioda v Omnigen termálním cyklovači (Hybaid). Byly použity PCR primery 5'tripartitní leader cDNA (5'-CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3')a 3’ p53 primer (5-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Dráhy 1,2,4 a 5 jsou p53 ošetřené vzorky vyříznuté 2. den nebo 7 den jak je uvedeno. Dráhy 3 a 6 jsou z β-gal ošetřených nádorů. Dráhy 7,8 a 9 jsou repliky drah 4,5 a 6, amplifíkované aktin primery pro ověření stejné vsádky. Dráha 10 je pozitivní kontrola používající tripartitní/p53 obsahující plazmid.

Obr. 10A a 10B znázorňují in vivo nádorové potlačení a zvýšení v časech přežití s A/M/N/53. H69 (SCLC) nádorové buňky byly injektovány subkutánně do holé myši a ponechány 2 týdny vyvíjet. Peritumorální injekce buď samotného pufru---), kontroly A/M adenoviru (-x-x-) nebo

A/M/N/ (-Δ-Δ), obou virů (2x10 pfu/injekce) byly podávány dvakrát týdně po celkem 8 dávkách. Rozměry nádorů byly měřeny dvakrát týdně a objemy nádorů byly hodnoceny jak je popsáno v experimentu č. IIA). Velikost nádoru se graficky vynese pro každý virus proti času (dny) po inokulaci H69 buněk. Úsečky chyb označují průměrnou velikost nádoru (+/-SEM pro každou skupinu 5 zvířat). Šipky označují dny po virové injekci. B) Myši byly sledovány na přežití a graficky je vynesen podíl myší přežívajících ve skupině proti času po inokulaci pufrem samotným (- —), kontrola A/M (.........) nebo A/M/N/53 ( ) virem ošetřenými H69 buňkami.

Obr. 11A až 11C představují mapy rekombinantních plazmidových konstrukcí. Plazmidy byly konstruovány jak je podrobně popsáno dále. Tučné čáry v konstruktech označují zájmové geny, zatímco tučná písmena označují restrikční místa použitá ke generování fragmentů, které se budou vzájemně ligovat za vzniku následného plazmidu, jak je označeno šipkami. Na obr.JlA byl

-4CZ 291372 B6 plazmid pACNTK konstruován subklonováním HSV-TK genu z pMLBKTK (ATCC č. 39369) do polylinkeru klonovacího vektoru s následující izolací TK genu s požadovanými konci pro klonování do pACN vektoru. pACN vektor obsahuje adenovirové sekvence nutné pro in vivo rekombinaci ktomu, aby se vytvořil rekombinantní adenovirus (viz obr. 12). Na obr. 11B je uvedena konstrukce plazmidu pAANTK začínající sPCR amplifikovanými fragmenty, kódujícími &-fetoprotein enhancerovou (AFP-E) a promotorovou (APP-P) oblast subklonované několika stupni do konečného plazmidu, kde AFP enhancer a promotor jsou proti směru HSV-TK genu následovány adenovirus typ 2 sekvencemi nezbytnými pro in vivo rekombinaci k dosažení vzniku rekombinantního adenoviru. Na obr. 11C je uvedena konstrukce plazmidu pAANCAT začínající s izolací chloramfenikol-acetyltransferázového (CAT) genu z komerčně dostupného plazmidu a jeho subklonováním do pAAN plazmidu (viz výše), za vzniku konečného plazmidu pAANCAT, kde AFP enhancer/promotor řídí transkripci CAT genu v adenovirus sekvenčním základu.

Obr. 12 je schematická mapa rekombinantních adenoviru ACNTK, AANTK a AANCAT. Ke konstrukci rekombinantních adenovirů a plazmidů popsaných na obr. 11, se linearizují 4 díly (20 pg) velkého fragmentu Cil štěpeného rekombinantního adenovirů (rACp-gal), obsahujícího deleci E3 regionu (Wils a kol., 1994). Ve výsledných virech jsou Ad5 nukleotidy 360-4021 nahrazeny buď CMV promotorem a tripartitní leader cDNA (TPL) nebo a -fetoprotein enhancerem a promotorem (AFP) řídícím expresi HSV-1 TK) nebo CAT genu jak uvedeno. Výsledné rekombinantní adenoviry jsou označeny ACNTK, AANTK a AANCAT.

Obr. 13 představuje promotorovou specifitu CAT exprese v rekombinantních adenovirových vektorech. Dva (2)*10⁶ označených buněčných linií se infikuje při MOI = 30 nebo 100 rekombinantního adenoviru AANCAT jak označeno nebo nalevo neinfikováno (UN). Hep G2 a Hep 3B buňky exprimují α-fetoprotein zatímco jiné buněčné linie ne. Po třech dnech se buňky sklidní, extraktové objemy se upraví na stejné proteinové koncentrace a měří se CAT aktivita, jak je popsáno dále v sekci Metody. Stejný počet neinfikovaných buněk slouží jako jednotlivé kontroly pro základní CAT aktivitu, zatímco ^I4C značený chloramfenikol (¹⁴C-pouze) a extrakt ze stabilní buněčné linie (B21), exprimující CAT aktivitu, slouží jako negativní a pozitivní kontroly. Procento konverze acetyl CoA je uvedeno, což demonstruje, že CAT exprese je omezena na ty buňky, které exprimují a -fetoprotein.

Obr. 14 představuje účinky TK/GCV ošetření na hepatocelulámí karcinomovou buněčnou linii a účinky promotorové specifity. Hep-G2 (AFP-pozitivní) a HLF (AFP negativní) buněčné linie byly infikovány přes noc pomocí ACNTK (-Δ-/, AANTK (-Δ-) nebo kontrolním ACN (--) virem v infekční multiplicitě 30 a následně ošetřeny jedinou dávkou gancicloviru v uvedených koncentracích. Buněčná proliferace byla hodnocena přídavkem ³H-thymidinu k buňkám přibližně 18 ho před sklizením. Inkorporace ³H-thymidinu do buněčné nukleové kyseliny byla měřena 72 hodin po infekci (Top Count, Packard) a vyjádřeny jako procenta (průměr +/- S.D.) neošetřené kontroly. Výsledky ukazují neselektivní dávkově závislou inhibici proliferace sCMV řízeným konstruktem, zatímco AFP řízený TK selektivně inhibuje Hep-G2.

Obr. 15 představuje cytotoxicitu ACNTK plus gancicloviru v HCC. HLF buňky byly infikovány při MOI 30 buď ACNTK (-·-) nebo kontrolní virus ACN (-□-) a ošetřeny ganciclovirem v uvedených dávkách. Sedmdesát dva (72) hodin po ošetření ganciclovirem se měří množství laktát-dehydrogenázy (LDH) uvolněné do buněčného supematantů kolorimetricky a vynese se do grafu (průměr +/- SEM) proti koncentraci gancicloviru pro dvě viry ošetřené skupiny.

Obr. 16A a 16B představují vliv ACNTK plus gancicloviru na ustavený hepatocelulámí karcinomové (HCC) tumoiy u holých myší. Jeden (l)x 10⁷ Hep 3B buněk bylo injektováno subkutámě do boku samice holé myši a ponecháno růst 27 dní. Myši pak dostaly intratumorální a peritumorální injekce buď ACNTK (-·-) nebo kontrolního ACN (-□-) viru (1x10 m.j. ve 100 μΐ objemu) každý další den v celkem třech dávkách (označeno šipkami). Injekce gancicloviru (100 mg/kg) začaly 24 hodin po počáteční virové dávce a pokračovaly celkem 10 dnů. Na obr.

-5CZ 291372 B6

16A jsou graficky vyneseny velikosti tumorů proti každému viru proti dnům po infekci (průměr +/- SEM). Na obr. 16B je vynesena tělesná hmotnost pro každou virem ošetřenou skupinu zvířat jako průměr +/- SEM proti dnům po infekci.

Podrobný popis vynálezu

Pro snížení četnosti kontaminace standardním typem adenoviru je žádoucí zlepšit bud’ virovou nebo buněčnou linii pro snížení pravděpodobnosti rekombinace. Například adenovirus ze skupiny s nízkou homologii ke skupině C virů by mohl být použit k vytvoření rekombinantních virů s malým sklonem krekombinaci sAd5 sekvencemi ve 293 buňkách. Nicméně alternativně snadnějším prostředkem k redukci je zvýšení velikosti delece v rekombinantním viru a tím redukce rozsahu podílu sekvence mezi ní a Ad5 geny ve 293 buňkách.

Delece, které zasahují po 3,5 kb od 5' konce adenovirového genomu napodobují gen pro adenovirální protein a nejsou považovány za žádoucí v adenovirálních vektorech (viz dále).

Protein IX gen adenoviru kóduje minoritní složku vnějšího adenovirového kapsidu, který stabilizuje skupinu devíti hexonů, které tvoří majoritu virového kapsidu (Stewart (1993)). Podle studie adenovirus delečních mutantů, protein IX byl na začátku považován za nepodstatnou složku adenoviru, ačkoliv jeho nepřítomnost byla spojena s větší tepelnou labilitou, než byla pozorována se standardním typem viru (Colby a Shenk (1991)). V nedávné době bylo objeveno, že protein IX je podstatný pro uzavření plné délky virové DNA do kapsidu a že v nepřítomnosti proteinu IX by pouze genomy o alespoň 1 kb menší než standardního typu mohly být propagovány jako rekombinantní viry (Ghosh-Choudhury a spol. (1987)). Vzhledem k tomuto uzavíracímu omezení protein IX delece záměrně nebyly uvažovány ve vytváření adenovirálních vektorů.

V tomto popisu je odkazováno na standardní učebnice molekulární biologie, které obsahují definice, metody a prostředky pro provedení základních technik, zahrnutých v předloženém vynálezu. Viz např. Sambrook a spol. (1989) a různé tam citované odkazy. Tyto odkazy a citované publikace jsou úmyslně zahrnuty v tomto popisu odkazem.

Na rozdíl od známého stavu techniky nárokuje předložený vynález použití rekombinantních adenovirů, nesoucích delece protein IX genu jako prostředek pro snížení rizika kontaminace standardním typem adenovirů ve virových přípravcích pro použití v diagnostických a terapeutických aplikacích jako je genová terapie. Jak je zde použito, je výraz „rekombinant“ míněn jako potomstvo vytvořené jako výsledek genového inženýrství. Tyto delece mohou odstranit dalších 500 až 700 párů bází DNA sekvence, která je přítomna v konvenčních El deletovaných virech (menší, méně žádoucí, delece částí pIX genu jsou možné a jsou zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu) a je dostupná pro rekombinaci s Ad5 sekvencemi integrovanými ve 293 buňkách. Rekombinantní adenoviry založené na jakékoliv skupině C viru, serotyp 1,2,5 a 6 jsou zahrnuty v tomto vynálezu. Také je v tomto vynálezu zahrnut hybrid Ad2/Ad5 na bázi rekombinantního viru, exprimujícího lidskou p53 cDNA zadenovir. typ 2 hlavního pozdního promotoru. Tento konstrukt je sestaven jak je uvedeno na obr. 1. Výsledný virus nese 5Δ deleci adenovirové sekvence rozkládající se od asi nukleotidu 357 do 4020 a eliminující Ela a Elb geny jakož i celý protein IX kódující sekvenci, činící polyadenylační místo podílející se na Elb a protein IX genech intaktní pro použití v terminační transkripci jakékoliv požadovaného genu. Provedení je znázorněno na obrázku 4. Alternativně může být delece rozšířena na dalších 30 až 40 párů bází bez ovlivnění sousedního genu pro protein IVa2, i když v tomto případě je exogenní polyadenylační signál poskytnut pro ukončení transkriptu genu inzertovaného do rekombinantního viru. Počáteční virus konstruovaný s těmito delecemi je snadno propagován ve 293 buňkách s řádnou zřejmou kontaminací standardního typu a řídí robustní p53 expresi z transkripční jednotky inzertované na místo delece.

-6CZ 291372 B6

Inzertní kapacita rekombinantních virů, nesoucích protein IX deleci popsanou výše, je přibližně 2,6 kb. Toto je dostačující pro mnoho genů, obsahujících p53 cDNA. Inzertní kapacita může být zvýšena zavedením jiných deleci do adenovirálního řetězce, například deleci v časných regionech 3 nebo 4 (viz Graham a Prevec (1991)). Například použití adenovirového řetězce, obsahujícího 1,9 kb deleci nepodstatné sekvence včasném regionu 3. S touto další deleci je inzertní kapacita vektoru zvýšena o přibližně 4,5 kb, což je dosti velké i pro mnoho větších cDNA včetně těch z retinoblastomového tumor supresorového genu.

Rekombinantní adenovirus expresní vektor charakterizovaný parciální nebo celkovou deleci adenovirové proteinové IX DNA a mající gen kódující cizí protein, nebo jeho funkční fragment nebo mutant, je poskytnut předloženým vynálezem. Tyto vektory jsou použitelné pro bezpečnou rekombinantní produkci diagnostických a terapeutických polypeptidů a proteinů a, co je důležitější, pro zavedení genů v genové terapii. Tak, například, může adenovirální vektor podle tohoto vynálezu obsahovat cizí gen pro expresi proteinu účinného v regulaci buněčného cyklu, jako je p53, Rb nebo mitosin nebo v indukci buněčné smrti jako je podmínění sebevražedný gen thymidin kinázy. (Posledně uvedený musí být použit ve spojení sthymidin kinázovým metabolitem proto, aby byl účinný). Jakákoliv expresní kazeta může být použita ve vektorech podle vynálezu. „Expresní kazeta“ znamená DNA molekulu, mající transkripční promotor/enhancer jako je CMV promotor enhancer, atd., cizí gen, a v některých dále definovaných provedeních, polyadenylační signál. Výraz „cizí gen“ zde používaný, označuje DNA molekulu nepřítomnou v exaktní orientaci a poloze jako partnera DNA molekuly nalezené ve standardním typu adenoviru. Cizí gen je DNA molekula s až 4,5 kilobázemi. „Expresní vektor“ znamená vektor, který vede k expresi inzertovaných DNA sekvencí, je-li propagován ve vhodné hostitelské buňce, tj. protein nebo polypeptid kódovaný DNA je syntetizován hostitelským systémem. Rekombinantní adenovirus expresní vektor může obsahovat část genu, kódujícího adenovirus protein IX, s podmínkou, že biologicky aktivní protein IX nebo jeho fragment není produkován. Příkladem takového vektoru je expresní vektor, mající restrikční enzymovou mapu na obr. 1 nebo 4.

V adenovirovém vektoru podle tohoto vynálezu mohou být také použity indukovatelné promotory. Tyto promotory budou iniciovat transkripci pouze za přítomnosti další molekuly. Příklady indukovatelných promotorů zahrnují ty, které jsou připravitelné z β-interferon genu, genu tepelného šoku, metallothioninový gen nebo ty geny, které jsou získatelné z genů, odpovídajících na steroidní hormony. Tkáňově specifická exprese byla dobře charakterizována v oblasti genové exprese a tkáňově specifické a indukovatelné promotory, jako jsou tyto, jsou v oboru dobře známé. Tyto geny jsou použity pro regulaci exprese cizího genu poté, co byl zaveden do cílové buňky.

Tento vynález také poskytuje rekombinantní adenovirus expresní vektor, jak je popsán výše, mající méně rozsáhlé delece protein IX genové sekvence, rozkládající se od 3500 bp od 5' virálního konce do přibližně 4000 bp, v jednom provedení. Ve zvláštním provedení může mít rekombinantní adenovirus expresní vektor další deleci nepodstatné DNA sekvence v adenovirovém časovém regionu 3 a/nebo 4 a/nebo deleci DNA sekvencí označených adenovirus Ela a Elb. V tomto provedení je cizí gen DNA molekula velikosti až 4,5 kilobází.

Další provedení má deleci až čtyřiceti nukleotidů umístěných 3’ k Ela a Elb deleci a pIX a cizí DNA molekulu kódující polyadenylační signál inzertovaný do rekombinantního vektoru v poloze vztažené k cizímu genu k regulaci exprese cizího genu.

Pro účely tohoto vynálezu může být rekombinantní adenovirus expresní vektor odvozen od standardní skupiny adenoviru, serotyp 1, 2, 5 nebo 6.

V jednom provedení má rekombinantní adenovirus expresní vektor cizí gen, kódující funkční nádorově supresorový protein, nebo jeho biologicky aktivní fragment. Jak je zde použito, výraz „funkční“ pokud je vztažen k nádorově supresorovému genu, označuje nádorově supresorové

-7CZ 291372 B6 geny, které účinně inhibují buňky od toho, aby se chovaly jako nádorové buňky. Funkční geny mohou například zahrnovat standardní typ normálního genu a modifikace normálních genů, které si uchovávají jejich schopnost kódovat účinné nádorové supresorové proteiny a jiné protinádorové geny jako je podmíněný sebevražedný protein nebo toxin.

Podobně „nefunkční“ jak je zde použito, je synonymem s „neaktivovaný“. Nefunkční nebo defektní geny mohou působit mnoho dějů, zahrnujících například bodové mutace, delece, methylace a jiné známé odborníkům v oboru.

„Aktivní fragment“ genu, jak je zde užíváno, zahrnuje menší části genu, které si udržují schopnost kódovat proteiny, mající nádor potlačující aktivitu, p 56^ popsaný podrobněji dále je ale jedním z příkladů aktivního fragmentu funkčního nádorového supresor genu. Modifikace nádorových supresor genů jsou také zahrnuty pod označení aktivní fragment, ať se jedná o adice, delece nebo substituce, pokud je zachována funkční aktivita nemodifikovaného genu.

Další příklad nádorového - supresor genu je retinoblastom (RB). Kompletní RB cDNA nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence výsledného RB proteinu (označení p HO⁸®) jsou uvedeny v práci Lee-a a spol. (1987) a na obr. 3. Vhodná pro expresi retinoblastom nádorového supresor proteinu je také DNA molekula, kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2 nebo mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 3. Vhodná je také zkrácená verze p 110^RB nazvaná p 56^. Sekvence p 56^RB viz Huang a spol. (1991). Další nádorové supresor geny mohou být použity ve vektorech podle tohoto vynálezu. Pouze pro ilustraci, může jimi být p!6 protein (Kamb a spol. (1994)/, p21 protein, WT1 protein Wilmova nádoru, mitosin, h-NUC, nebo DCC protein karcinomu kolonu. Mitosin je popsán v X.Lhu a W-H Lee, US přihláška č. 08/141239, podaná 22. října 1993, a v jejím pokračování od stejných autorů, značka autorů P-CJ 1191, podaném 24. října 1994, obě práce jsou zde zahrnuty jako odkazy. Podobně je h-NUC popsán v práci W-H Lee a P-L Chen, US přihláška č. 08/170586, podaná 20. prosince 1993, zahrnuté zde jako odkaz.

Jak je známo odborníkům v oboru, výraz „protein“ znamená lineární polymer aminokyselin spojených do specifické sekvence peptidovými vazbami. Jak je zde použit, znamená výraz „aminokyselina“ buď D nebo L stereoizomemí farmen aminokyseliny, pokud není specificky označena. V rozsahu tohoto vynálezu jsou ekvivalentní proteiny nebo ekvivalentní peptidy, např. mající biologickou aktivitu čištěného standardního typu nádorového supresor proteinu. „Ekvivalentní proteiny“ a „ekvivalentní polypeptidy“ označují sloučeniny, které se odlišují od lineární sekvence přirozeně se vyskytujících proteinů nebo polypeptidů, ale které mají aminokyselinové substituce, které nemění jejich biologickou aktivitu. Tyto ekvivalenty se mohou lišit od nativních sekvencí nahrazením jedné nebo více aminokyselin příbuznými aminokyselinami, například podobně nabitými aminokyselinami nebo substituci nebo modifikací vedlejších řetězců nebo funkčních skupin.

V definici funkčního nádorového supresor proteinu je zahrnut jakýkoliv protein, jehož přítomnost redukuje tumorigenicitu, malignantnost nebo hyperproliferativní fenotyp hostitelské buňky. Příklady nádorových supresor proteinů v této definici zahrnují, ale nejsou tak omezeny pl 10^RB, p56^RB, mitosin, h-NUC a p53. „Tumorigenicita“ je míněna jako prostředek, mající schopnost tvořit nádory nebo být schopen vyvolat tvorbu nádoru a je synonymem neoplastického růstu. „Malignantnost“ je míněna jako popisující tumorigenicitu buňky, mající schopnost metastázovat a ohrožovat život hostitelského organizmu. „Hyperproliferativní fenotyp“ je zamýšlen k popsání buněčného růstu a dělení při rychlosti za normálními mezemi růstu pro tento buněčný typ. „Neoplastický“ také zahrnuje buňky, postrádající endogenní funkční nádorový supresor protein nebo neschopnost buňky exprimovat endogenní nukleokyselinu, kódující funkční nádorový supresor protein.

-8CZ 291372 B6

Příkladem vektoru podle tohoto vynálezu je rekombinantní adenovirus expresní vektor, mající cizí gen, kódující p53 protein nebo jeho aktivní protein, poskytnutý tímto vynálezem. Kódující sekvence p53 genu je uvedena dále v tabulce I.

TABULKA 1

V*SHR PGSR* LLGSG DTLRS GWERA FHDGD TLPWI GSQTA FRVTA MEEPQ

100

SDPSV EPPLS QETFS DLWKL LPENN VLSPL PSQAM DDLML SPDDI EQWFT

150

EDPGP DEAPR MPEAA PPVAP ΑΡΑΑΡ ΤΡΆΑΡ APAPS WPLSS SVPSQ KTYQG 200

SYGFR LGFLH SGTAK SVTCT YSPAL NKMFC QLAKT CPVQL WVDST PPPGT

250

RVRAM AIYKQ SQHMT EWRR CPHHE RCSDS DGLAP PQHLI RVEGN LRVEY

300

LDDRN TFRHS VWPY EPPEV GSDCT TIHYN YMCNS SCMGG MNRRP ILTII

350

TLEDS SGNLL GRNSF EVRVC ACPGR DRRTE EENLR KKGEP HHELP PGSTK

400

RALPN NTSSS PQPKK KPLDG EYFTL QIRGR ERFEM FRELN EALEL KDAQA

GKEPG GSRAH SSHLK SKKGQ STSRH KKLMF KTEGP DSD* *Stop kodon

Jakékoliv ze zde popsaných vektorů jsou vhodné jako kompozice pro diagnózu nebo terapii.Vektory mohou být použity pro screening, které z mnoha nádorových supresor genů by mohly být použitelné v genové terapii. Například vzorek buněk, považovaných za neoplastické, může být odstraněn ze subjektu a savce. Buňky mohou pak být kontaktovány za vhodných podmínek a s účinným množstvím rekombinantního vektoru podle tohoto vynálezu, majícího 10 v sobě inzertovaný cizí gen, kódující jeden z některých funkčních nádorových supresor genů. Jak bude zavedení tohoto genu obracet maligní fenotyp, může být měřeno tvorbou kolonií v měkkém agaru nebo tvorbou nádorů u holé myši. Je-li obrácen maligní fenotyp, je potom cizí gen uznán jako pozitivní kandidát pro úspěšnou genovou terapii pro subjekt nebo savce. Jsou-li užity farmaceuticky, mohou být kombinovány s jedním nebo více farmaceutickými nosiči. Farmaceu15 tické nosiče jsou v oboru dobře známé a zahrnují vodné roztoky jako jsou fyziologické pufrované solné roztoky nebo jiná rozpouštědla nebo vehikula jako jsou glykoly, glycerin, rostlinné oleje

-9CZ 291372 B6 (např. olivový olej) nebo injektovatelné organické estery. Farmaceuticky přijatelný nosič může být použit pro podání instantní kompozice k buňce in vitro nebo subjektu in vivo.

Farmaceuticky přijatelný nosič může obsahovat fyziologicky přijatelnou sloučeninu, která působí, například, stabilizaci kompozice nebo zvýšení nebo snížení absorpce činidla. Fyziologicky přijatelná sloučenina může zahrnovat, například, cukry jako je glukóza, sacharóza, nebo dextrany, antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo glutathion, chelatační činidla, proteiny s nízkou molekulovou hmotností nebo jiné stabilizátory nebo přísady. Jiné fyziologicky přijatelné sloučeniny zahrnují smáčecí činidla, emulgační činidla, dispergační činidla nebo chránící činidla, která jsou zvláště vhodná pro prevenci růstu nebo působení mikroorganizmů. Různé chránící látky jsou dobře známé a například zahrnují fenol a kyselinu askorbovou. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že volba farmaceuticky přijatelného nosiče, zahrnujícího fyziologicky přijatelnou sloučeninu, závisí například na způsobu podání polypeptidu a konkrétních fyzikálně -chemických charakteristikách specifického polypeptidu. Například je fyziologicky přijatelná sloučenina, jako je monostearát hlinitý nebo želatina, zvláště vhodná jako zpožďující činidlo, které prodlužuje rychlost absorpce farmaceutické kompozice podávané subjektu. Další příklady nosičů, stabilizátorů nebo přísad, mohou být nalezeny v Martin, Remingtoďs Pharm. Sci., 15. vyd. (Mack, Co., Easton, 1975), zahrnutém zde jako odkaz. Farmaceutická kompozice může být také inkorporována, je-li to žádoucí, do liposomů, mikrosfér nebo jiných polymemích matric (Gregoriadis, Liposome Technology, Sv. 1 (CBC Press, Boča Raton, Florida 1984), zahrnuto zde jako odkaz). Liposomy, například, které tvoří fosfolipidy nebo jiné lipidy, jsou netoxické, fyziologicky přijatelné a metabolizovatelné nosiče, které je velmi snadné vyrobit a podávat.

„Farmaceutická kompozice“ jak je zde užíváno, označuje jakékoliv kompozice látky zde popsané v kombinaci s jedním nebo více z výše uvedených farmaceuticky přijatelných nosičů. Kompozice mohou být podávány terapeuticky nebo profylakticky. Mohou být kontaktovány s hostitelskou buňkou in vivo, ex vivo, nebo in vitro, v účinném množství. Podmínky kontaktování in vitro a ex vivo hostitelských buněk jsou uvedeny dále. Pracuje-li se in vivo, metody podávání léčiva, obsahujícího vektor podle předloženého vynálezu, jsou dobře známé v oboru a zahrnují, ale nejsou tak omezeny, podání orální, intratumorální, intravenózní, intramuskulární nebo intraperitoneální. Podání může být prováděno kontinuálně nebo přerušovaně a bude se měnit podle léčebného subjektu a podmínek, např. jako v případě jiných terapeutických kompozic (Laudmann a spol. (1992), Aulitzky a spol. (1991), Lantz a spol., (1990), Supersaxo a spol. (1988), Demetri a spol. (1989) a Le Maistre a spol. (1991).

Tento vynález dále poskytuje transformovanou prokaryotickou nebo eukaryotickou hostitelskou buňku, například živočišnou buňku nebo savčí buňku, mající inzertovaný rekombinantní adenovirus expresní vektor popsaný výše. Vhodné prokaryotické buňky zahrnují, ale nejsou tak omezeny, bakteriální buňky jako jsou E.coli buňky. Způsoby transformace hostitelských buněk retrovirálními vektory jsou v oboru známé, viz Sambrook a spol. (1989) a zahrnují, ale nejsou omezeny, transfekcí, elektroporaci a mikroinjektaci.

V tomto vynálezu je výraz živočich míněn jako synonymum k výrazu savec a zahrnuje, ale není tak omezen, hovězí dobytek, vepře, kočky, opice, psy, koně, myši, krysy a lidi. Další hostitelské buňky zahrnují, ale nejsou tak omezeny, jakékoliv neoplastické nebo nádorové buňky jako je osteosarkom, karcinom vaječníků, rakovina prsu, melanom, hepatokarcinom, rakovina plic, rakovina mozku, kolorektální rakovina, hematopoietická buňka, rakovina prostaty, cervikální rakovina, retinoblastom, rakovina esofágu, rakovina měchýře, neuroblastom nebo renální rakovina.

Dále je jako hostitel pro tento vektor vhodná jakákoliv eukaryotická buněčná linie, exprimující Ela a Elb nebo Ela, Elb a pí. V jednom provedení je vhodnou eukaryotickou hostitelskou linií 293 buněčná linie dostupná z Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20231.

-10CZ 291372 B6

Jakékoliv z transformovaných hostitelských buněk zde popsaných jsou vhodné jako kompozice pro diagnózu nebo terapii. Při farmaceutickém použití jsou kombinovány s různými farmaceutický' přijatelnými nosiči. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče jsou známé v oboru odborníkům a jsou například popsány výše. Kompozice může pak být podávána terapeuticky nebo profylakticky, v účinných množstvích, která jsou podrobněji popsána dále.

Předložený vynález také poskytuje způsob transformace hostitelské buňky. Tento způsob poskytuje kontaktování hostitelské buňky, tj. prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky, s jakýmkoliv z expresních vektorů zde popsaných a za vhodných podmínek. Hostitelské buňky transformované touto metodou jsou rovněž nárokovány v rozsahu tohoto vynálezu. Kontaktování může být provedeno in vitro, in vivo nebo ex vivo za použití metod dobře známých v oboru (Sambrook a spol. (1989)) a za použití účinných množství expresních vektorů. Tento vynález také poskytuje způsob produkce rekombinantního proteinu nebo polypeptidů při růstu transformované hostitelské buňky za vhodných podmínek pro transkripci a translaci inzertovaného cizího genu. Metody rekombinantní exprese v různých hostitelských buňkách, jako jsou savčí, kvasinkové, hmyzí nebo bakteriální buňky jsou dobře známé a zahrnují ty, které jsou popsány v práci Sambrooka a spol., supra. Translatovaný cizí gen může být pak izolován běžnými způsoby, jako je čistění na sloupci nebo čistění za použití antiproteinové protilátky. Izolovaný protein nebo polypeptid rovněž spadá do rozsahu tohoto vynálezu. Čištěný nebo izolovaný (jak je zde použito) znamená v podstatě prostý nativních proteinů nebo nukleových kyselin normálně spojených s proteinem nebo polypeptidem v nativním prostředí nebo v prostředí hostitelské buňky.

Tento vynález také poskytuje živočichy, kterými nejsou lidé, mající v sobě inzertované vektory nebo transformované hostitelské buňky podle vynálezu. Tito „transgeničtí“ živočichové byli připraveni použitím metod dobře známých v oboru odborníkům, například jak je popsáno v US patentu č. 5 175 384 nebo běžně ex vivo terapeutickými technikami, jak popsal Culver a spol. (1991).

Jak je podrobněji popsáno dále, rekombinantní adenoviry exprimující nádorově supresorový standardní typ p53, jak je popsáno výše, mohou účinně inhibovat DNA syntézu a potlačovat růst širokého rozmezí typů lidských nádorových buněk, zahrnujících klinické cíle. Dále mohou rekombinantní adenoviry exprimovat nádorově supresorové geny jako je p53 v in vivo se vyskytujícím nádoru bez provedení přímého injektování do nádoru nebo před ex vivo ošetřením rakovinových buněk. Exprimovaný p53 je funkční a účinně potlačuje růst nádoru in vivo a významně zvyšuje dobu přežití u modelu lidské plicní rakoviny holé myši.

Vektory podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro genovou terapii. V souladu s tím jsou metody genové terapie, používající tyto vektoiy v rozsahu tohoto vynálezu. Vektor se čistí a pak se podává účinné množství in vivo nebo ex vivo do subjektu. Způsoby genové terapie jsou dobře známé v oboru, viz např. Larrick J.W. a Burek K.L. (1991) a Kreigler M. (1990). „Subjektem“ je míněn jakýkoliv živočich, savec, krysa, myš, hovězí dobytek, vepř, kůň, králík, kočka nebo lidský pacient. Jestliže cizí gen kóduje nádorově supresorový gen nebo jiný protinádorový protein, používá se vektor pro ošetření nebo redukci hyperproliferativních buněk v subjektu, pro inhibici nádorové proliferace v subjektu nebo ke zmírnění určité stím spojené patologie. Patologické hyperproliferativní buňky jsou charakteristické pro následující chorobné stavy, thyroidní hyperplasii-Graveova choroba, psoriasis, benigní prostatická hypertrofie, Li-Fraumeni syndrom, zahrnující rakovinu prsu, sarkomy a jiné neoplazmy, rakovinu měchýře, rakovinu kolonu, rakovinu plic, různé leukemie a lymfomy. Příklady nepatologických hyperproliferativních buněk je možno například nalézt v savčích duktálních epitel iálních buňkách během vývoje laktace a také v buňkách spojených s hojením ran. Patologické hyperproliferativní buňky charakteristicky vykazují ztrátu kontaktní inhibice a úbytek své schopnosti selektivně adherovat, což zahrnuje změnu v povrchových vlastnostech buňky a další průlom v intercelulámí komunikaci. Tyto změny zahrnují stimulaci k rozdělení a schopnosti sekretovat proteolytické enzymy.

-11 CZ 291372 B6

Navíc se předložený vynález týká způsobu deplece vhodného vzorku patologických savčích hyperproliferativních buněk, kontaminujících heraatopoietické prekurzory během rekonstituce kostní dřeně přes zavedení standardního typu nádorového supresor genu do buněčného přípravku za použití vektoru podle tohoto vynálezu (získaného z autologní krve nebo kostní dřeně). Jak je zde použit, „vhodný vzorek“ je definován jako heterogenní buněčný přípravek získaný z pacienta, např. směsná populace buněk, obsahujících jak fenotypicky normální, tak patogenní buňky. „Podání“ zahrnuje, ale není omezeno, zavedení do buňky nebo subjektu intravenózně, přímou injekcí do nádoru, intranádorovou injekcí, intraperitoneálním podáním, aerosolovým podáním do plic nebo topicky. Takové podání může být spojeno s farmaceuticky přijatelným nosičem popsaným výše.

Výrazem „redukovaná tumorigenicita“ je míněno to, že nádorové buňky byly převedeny na méně tumorigenní nebo netumorigenní buňky. Buňky s redukovanou tumorigenicitou bud netvoří nádory in vivo nebo mají prodlouženou lag dobu týdny až měsíce před objevením se in vivo nádorového růstu a/nebo zpomalení růstu trojrozměrné nádorové hmoty ve srovnání s nádory, majícími plně inaktivovaný nebo nefunkčně nádorově supresorový gen.

Jak je zde použit znamená výraz „účinné množství“ množství vektoru nebo protirakovinového proteinu, kterým se dosáhne pozitivní kontroly buněčné proliferace. Například jedna dávka obsahuje od asi 10⁸ do asi 10 ³ infekčních jednotek. Typický průběh léčení by měl zahrnovat jednu takovou dávku denně po pět dnů. Účinné množství se bude měnit podle patologie nebo léčeného stavu, pacienta a jeho stavu a jiných faktorů, dobře známých odborníkům v oboru. Účinná množství odborník v oboru snadno stanoví.

V rozsahu tohoto vynálezu je způsob zmírnění patologie vyznačené hyperproliferativními buňkami nebo genetickým defektem u subjektu podáním subjektu účinného množství vektoru popsaného výše, obsahujícího cizí gen, kódující genový produkt, mající schopnost zmírňovat patologii, za vhodných podmínek. Jak je zde použito, výraz „genetický defekt“ znamená jakoukoliv chorobu nebo abnormalitu, která vzniká z inheritních faktorů, jako je anemie srpkovitých buněk nebo Tay-Sachsova choroba.

Tento vynález také poskytuje metodu pro redukci proliferace nádorových buněk v subjektu zavedením účinného množství adenovirálního, expresního vektoru, obsahujícího protinádorový gen jiný než nádorový supresor gen, do hmoty nádoru. Protinádorový gen může kódovat například thymidin kinázu (TK). Subjektu se pak podává účinné množství terapeutického činidla, které je za přítomnosti protinádorového genu toxické k buňce. Ve specifickém případě thymidin kinázy je terapeutickým činidlem metabolit thymidin kinázy jako je ganciclovir (GCV), 6-methoxypurin arabinonukleosid (araM) nebo jejich funkční ekvivalent. Jak thymidin kinázový gen tak thymidin kinázový metabolit musí být použity současně proto, aby byly pro hostitelskou buňku toxické. Nicméně v jejich přítomnosti je GCV fosforylován a stává se potentním inhibitorem DNA syntézy zatímco araM se konvertuje na cytotoxický anabolit araATP. Jiné protinádorové geny mohou být použity i v kombinaci s odpovídajícím terapeutickým činidlem pro snížení proliferace nádorových buněk. Takové kombinace jiného genu a terapeutického činidla jsou známé odborníkům v oboru. Dalším příkladem by mohl být vektor podle vynálezu, exprimující enzym cytosin deaminázu. Takový vektor by mohl být použit ve spojení s podáním léčiva 5-fluoracilu (Austin a Huber, 1993) nebo v poslední době popsaný E.Coli Deo A gen v kombinaci se 6-methyl-purin-2'-<leosribonukleosidem (Sorscher a spol. 1994).

Jako u použití nádorových supresor genů popsaných dříve, použití jiných protinádorových genů, buď samotných nebo v kombinaci s vhodným terapeutickým činidlem, poskytuje léčení nekontrolovaného buněčného růstu nebo proliferace charakteristických pro nádory a malignance. Vynález tak poskytuje terapii pro ukončení nekontrolovaného buněčného růstu u pacienta a tím odstranění symptomů choroby nebo kachecie přítomné u pacienta. Účinek tohoto léčení zahrnuje, ale není tak omezen, prodlouženou dobu přežití pacienta, redukci nádorové hmoty nebo obtíží,

-12CZ 291372 B6 apoptosis nádorových buněk nebo redukci počtu cirkulujících nádorových buněk. Prostředky ke kvantifikaci přínosných účinků této terapie jsou dobře známé odborníkům v oboru.

Vynález poskytuje rekombinantní adenovirui expresní vektor, charakterizovaný částečnou nebo úplnou delecí adenovirální protein IX DNA a mající cizí gen, kódující cizí protein, kde cizím genem je sebevražedný gen nebo jeho funkční ekvivalent. Protirakovinový gen TK popsaný výše je příkladem sebevražedného genu, protože, je-li exprimován, genový produkt je, nebo se může stát, letálním k buňce. U TX je letabilita indukována přítomností GCV. TK gen je odvozen z herpes simplex viru metodami dobře známými odborníkům v oboru. Plazmid pMLBKTK vE.coli HB101 (z ATCC č. 39369) je zdrojem herpes simplex virus (HSV-1) thymidin kinázového (TK) genu pro použití v tomto vynálezu. Avšak existuje i mnoho jiných zdrojů.

TK gen může být zaveden do nádorové hmoty kombinací adenovirálního expresního vektoru s vhodným farmaceuticky přijatelným nosičem. Zavedení může být například provedeno přímou injekcí rekombinantního adenoviru do nádorové hmoty. Ve specifickém případu rakoviny jako je hepatocelulámí rakovina (HCC), může být použita pro doručení přímá injekce do hepatické arterie, protože většina HCC odvozuje svoji cirkulaci z této arterie. Pro kontrolu proliferace nádoru je buněčná smrt indukována ošetřením pacientů s TK metabolitera jako je ganciclovir k dosažení redukce nádorové hmoty. TK metabolit může být podáván například systémově, místní inokulaci do nádoru nebo ve specifickém případě HCC, injekcí do hepatické arterie. TK metabolit je výhodně podáván alespoň jednou denně, ale může to být vícekrát denně nebo méněkrát podle potřeby. TK metabolit může být podáván současně nebo následně k podání TK obsahujícího vektoru. Odborníkům v oboru bude známé nebo mohou stanovit dávku a trvání, které je terapeuticky účinné.

Způsob nádorově specifického doručení nádorově supresor genu se provádí kontaktováním cílové tkáně živočicha účinným množstvím rekombinantního adenovirálního expresního vektoru podle tohoto vynálezu. Gen je zamýšlen ke kódování protinádorového činidla jako je funkční nádorově supresorový gen nebo sebevražedný gen. „Kontaktováním“ je míněna jakákoliv doručovací metoda pro účinný transfer vektoru, jako je intranádorová injekce.

Použití adenovirálního vektoru podle tohoto vynálezu pro přípravu léčiv pro léčení choroby nebo pro terapii poskytuje dále tento vynález.

Následující příklady jsou míněny k ilustrování, ne k omezení rozsahu tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Pokus č.1

Plazmid pAd/MLP/p53/Elb byl použit jako výchozí materiál pro tyto manipulace. Tento plazmid je založen na pBR322 derivátu pML2 (pBR322 deletovaný v bázových párech 1 140 až 2 490) a obsahuje adenovirus typ 5 sekvence, zasahující od bázového páru 1 k bázovému páru 5 788 s tím rozdílem, že jsou deletovaný bázové páry 357 až 3 327 adenovirus typu 5. Na místě Ad5 357/3327 dalece je inzertovana transkripční jednotka, která zahrnuje adenovirus typ 2 hlavní pozdní promotor, adenovirus typ 2 tripartitní leader c DNA a lidskou p53 cDNA. Typický El náhradový vektor je deletován u Ad5 Ela a Elb genů, ale obsahuje Ad5 protein IX gen (přehled adenovirových vektorů viz: Graham a Prevec (1992). Ad2 DNA byla získána od Gibco BRL. Restrikční endonukleázy a T4 DNA ligázy byly získány od New England Biolabs. E.coli DH5a kompetentní buňky byly zakoupeny u Gibco BRL a 293 buňky byly získány od Američan Type Culture Collection (ATCC). Prep-A-Gene DNA čistící pryskyřice byla získána od BioRad. LB půdní bakteriální růstové médium bylo získáno od Difco. Quiagen DNA Čistící kolony byly

-13CZ 291372 B6 získány od Quiagen lne. Ad5 d!327 byly získány od R. J. Schneidera, NYU.MBS DNA transfekční kit byl získán od Stratagene.

Jeden (1) pg p Ad/MLP/p53/Elb - byl štěpen se 20 jednotkami každého z restrikčních enzymů 5 Ecl 136II a NgoMI podle doporučení výrobce. Restrikční štěpení byla vložena do oddělených drah na 0,8 % agarózovém gelu a elektroforezována 2 hodiny při 100 voltech. 4 268 bp restrikční fragment z Pad/MLP/p53/Elb-vzorku a 6 437 bp fragment z Ad2 vzorku byly izolovány z gelu za použití Prep-A-gene DNA extrakční pryskyřice podle specifikací výrobce. Restrikční fragmenty byly smíšeny a zpracovány sT4 DNA ligázou v celkovém objemu 50μ1 při 16 °C po 16 hodin ío podle návodu výrobce. Po ligaci 5μ1 reakční směsi bylo použito ke transformování E.coli DH5a buněk k ampicilinové rezistenci podle postupu výrobce. Šest bakteriálních kolonií vzniklých z tohoto postupu bylo použito k inokulaci 2 ml kultur LB růstového media a inkubováno přes noc při 37 °C za třepáni. DNA byla připravena z každé bakteriální kultury za použití standardních postupů (Sambrook a spol.(1989)). Čtvrtina plazmidové DNA z každého izolátů byla štěpena 15 20 jednotkami restrikční endonukleázy Xhol ke screeningu správného rekombinantu, obsahujícího Xhol restrikční fragmenty 3627, 3167, 2466 a 1445 bázových párů. Pět ze šesti screenovaných izolátů obsahuje správný plazmid. Jeden z nich byl použit k inokulaci 1 litru kultury LB média pro izolaci velkých množství plazmidové DNA. Po inkubaci přes noc byla plazmidová DNA izolována z 1 litru kultury za použití Qiagen DNA čisticích kolon podle 20 doporučení výrobce. Výsledný plazmid byl označen Pad/MLP/p53/PIX- Vzorky tohoto plazmidů jsou uloženy v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 12301, 22. října 1993. Uložení bylo provedeno podle podmínek Budapeštské smlouvy o mezinárodním ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení. Uložení dostalo přírůstkové číslo ATCC č. 75576.

Pro konstrukci rekombinantního adenoviru bylo 10 fig Pad/MLP/p53/PIX-zpracováno se 40jednotkami restrikční endonukleázy EcoRI pro linearizaci plazmidů. Adenovirus typ 5 dl327 DNA (Thimmappaya (1982)) byl štěpen s restrikční endonukleázon Clal a velký fragment (přibližně 33 kilobázových párů) byl čištěn odstředováním se sacharózovým gradientem. Deset 30 (10) pg EcoRI zpracovaného Pad/MLP/p53/Elb-a 2,5 pg Clal zpracovaného Ad5 dl327 bylo smíšeno a použito k transfekci kitu podle doporučení dodavatele. Osm (8) dnů po transfekci byly 293 buňky seříznuty 1 až 3 do čerstvého media a dva dny poté byl zřejmý adenovirem indukovaný cytopatický účinek na transfektované buňky. 13. den po transfekci se připraví DNA z infikovaných buněk za použití standardních postupů (Graham a Prevec (1991)) a analyzuje se 35 restrikčním štěpením restrikční endonukleázou Xhol. Virem řízená exprese p53 byla ověřena po infekci SaoS2 osteosarkomových buněk virálním lyzátem a imunoblottingem santi-p53 monoklonální protilátkou označenou 1801 Novocasta Lab., Ltd., U.K.).

Pokus č. II

Materiály a metody

Buněčné linie

Rekombinantní adenoviry byly ponechány růst a rozmnožovat se v lidské embryonální ledvinové buněčné linii 293 (ATCC CRL 1573) udržované v DME médiu, obsahujícím 10% definované, doplněné telecí sérum (Hyclone). Saos-2 buňky byly udržovány v Kaighnově médiu doplněném 15 % fatálního telecího séra. HeLa a Hep 3B buňky byly udržovány v DME médiu doplněném 50 10 % telecího fatálního séra. Všechny buněčné linie rostly v Kaighnově médiu doplněném 10% fetálním telecím sérem. Saos-2 buňky byly laskavě poskytnuty Dr. Ericem Stanbridgem. Všechny ostatní buněčné linie byly získány z ATCC.

-14CZ 291372 B6

Konstrukce rekombinantního adenoviru

Pro konstrukci Ad5 p53 virů byl 1,4 kb HindlII-Smal fragment, obsahující plnou délku cDNA pro p53 (tabulka I) izolován z pGEMl-p53-B-T (dodán laskavě Dr. Wen Hwa Lee-em) a inzertován do vícenásobného klonovacího místa expresního vektoru pSP72 (Promega) za použití standardních klonovacích postupů (Sambrook a spol. (1989)). p53 inzert byl získán z tohoto vektoru po štěpení sXhoI-BglII a gelovou elektroforézou. p53 kódující sekvence byla pak inzertována buď do pNLBCMV adenovirus genových transfer vektorů (laskavě poskytnuty Dr. Robertem Schneiderem), který obsahuje Ad5 5' invertované terminální opakování a virální obalové signály a Ela enhancer ve směru proti bud Ad2 hlavnímu pozdnímu promotoru (MLP-major latě promotér) nebo lidskému cytomegalovirus bezprostřednímu časnému genovému promotoru (CMV), následovaného tripartitní leader cDNA a Ad5 sekvencí 3 325-5 525 bp v PPML2 základu. Tyto nové konstrukty nahrazují El region (bp 360-3 325) Ad5 s p53 řízeným buď Ad2 mlP (A/M/53) nebo lidským CMV promotorem (A/C/53), oba následované tripartitní leader CDNA (viz obr. 4). p53 inzerty užívají zbývající Elb polyadenylační po směru exprese umístěné místo. Byly vytvořeny další mlP a CMV řízené p53 rekombinanty (A/M/N/53), které měly další 705 nukleotidovou deleci Ad5 sekvence pro odstranění protein IX (PIX) kódujícího regionu. Jako kontrola byl vyvinut rekombinantní adenovirus z rodičovského PNL3C plazmidu bez p53 inzertu (A/M). Druhou kontrolu tvoří rekombinantní adenovirus, kódující beta-galaktosidázový gen pod kontrolou CMV promotoru (A/C/p-gal). Plazmidy byly linearizovány buď Nrul nebo EcoRI a kotransfektovány s velkým fragmentem Cli štěpených Ad5 d!309 nebo d!327 mutantů (Jones a Shenk (1979)) za použití Ca/PO4 transfekčního kitu (Stratagene). Virální plaky byly izolovány a rekombinanty identifikovány jak analýzou restrikčním štěpením tak PCR za použití rekombinantních specifických primerů proti tripartitní leader CDNA sekvenci ve směru p53 CDNA sekvence. Rekombinantní virus byl dále čištěn limitním ředěním a virové částice byly čištěny a titrovány standardními metodami (Graham a van der Erb (1973), Graham a Prevec (1991)).

Detekce p53 proteinu

Saos-2 nebo Hep 3B buňky (5x10^Λ) byly infikovány uvedenými rekombinantními adenoviry po dobu 24 h při zvyšujících se multiplicitách infekce (multiplicity of infection(MOI)) plakotvomých jednotek virus/buňka. Buňky pak byly jednou promyty s PBC a sklizeny v lýzovém pufru (50mM Tris-HCl pH 7,5. 250 m NaCl, 0,01% NpyO, 50mM Naf, 5mM EDTA, 10 pg/ml aprotininu, 10 (μ/ml leupeptinu a 1 mM PMSF). Buněčné proteiny (přibližně 30 pg) byly odděleny 10% SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózu. Membrány byly inkubovány s a —p53 protilátkou PAb 1801 (Novocastro) a pak konjugovány s ovčím anti-myším IgG s křenovou peroxidázou. p53 protein byl vizualizován chemiluminiscenci (ECL kit, Amersham) na Kodak XAR-5 filmu.

Měření rychlosti syntézy DNA

Buňky (5xl0³/jamka) byly umístěny na 96-jamkové titrační plotny (Costar) a ponechány přilnout přes noc (37 °C, 7 % CO₂). Buňky pak byly infikovány 24 hodin s čištěnými rekombinantními virovými částicemi při MOI v rozmezí 0,3 až 100 jak uvedeno. Média byla vyměněna 24 hodin po infekci a v inkubaci se pokračovalo celkem 24 hodin. ³H-thymidin (Amersham, 1 pCi/jamka) byl přidán 18 hodin před sklizením. Buňky byly sklizeny na filtry ze skleněných vláken a byly měřeny hladiny inkorporované radioaktivity na beta scintilačním čítači. Inkorporace ³H-thymidinu byla vyjádřena jako průměrná % (+/- SD) media kontroly a graficky vynesena proti MOI.

Tumorigenicita u holé myši

Přibližně 2,4*I0⁸ Saos-2 buněk, umístěných v T225 baňkách, bylo zpracováno v suspenzi pufru (1% sacharóza v PBS), obsahující buď A/M/N/53 nebo A/M čištěný virus při MOI 3 nebo 30. Po

-15CZ 291372 B6 infekci přes noc byly buňky injektovány subkutánně do levých a pravých boků BALB/c athymické holé myši (4 myši na skupinu). Jeden bok byl injektován s A/M/N/53 ošetřenými buňkami, zatímco kolaterální bok byl injektován s kontrolními A/M ošetřenými buňkami, každá myš slouží jako svá vlastní kontrola. Zvířata, která dostala bilaterální injekci pufrem zpracovaných buněk slouží jako další kontroly. Rozměry nádoru (délka, šířka a výška) a tělesné hmotnosti zvířat byly pak měřeny dvakrát týdně během 8 týdnů. Objemy nádorů byly hodnoceny pro každé zvíře s předpokladem sférické geometrie průměru naměřených nádorových rozměrů.

Intranádorová RNA analýza

BALB/c athymické holé myši (přibližně 5 týdnů staré) byly subkutánně injektovány s 1*10⁷ H69 buňkami malobuněčného plicního karcinomu (SCLC) do pravých boků. Nádory byly ponechány se rozvinout po 32 dnů do přibližně 25-50 m³. Myši dostaly peritumorální injekci buď A/C/53 nebo Α/Ο/β-gal rekombinantních adenovirových (2* 10⁹ plakotvomých jednotek (plaque forming units (pfu)) do subkutánního prostoru pod nádorovou hmotou. Nádory byly vyříznuty ze zvířat 2. a 7. den po ošetření adenovirem a PBS. Vzorky nádorů byly homogenizovány, a celková RNA byla izolována za použití TriReagent kitu (Molecular Research Center lne.). PolyA RNA byla izolována za použití PolyATract mRNA Isolation Systém (Promega) a přibližně 2pg vzorek byl použit pro RT-PCR stanovení rekombinantní p53 MRNA exprese (Wang a spol. (1989)). Byly připraveny primery pro amplifikaci sekvence mezi adenovirus tripartitní leader CDNA a p53 CDNA po směru exprese, zajišťující, že by měl být amplifikován pouze jeden rekombinant a ne endogenní p53.

p53 genová terapie ustavených nádorů v holé myši

Přibližně 1^χ10⁷ H69 (SCLC) nádorových buněk ve 200 μ! objemech bylo injektováno subkutánně do samic BALB/c athymické holé myši. Nádory byly ponechány 2 týdny vyvíjet a pak byla u zvířat náhodně stanovena velikost nádoru (N=5/skupina). Dvakrát týdně byly podávány peritumorální injekce, celkem 8 dávek/skupina. Rozměry nádoru a tělesné hmotnosti byly měřeny dvakrát týdně a objemy nádorů byly hodnoceny jak popsáno dříve. Zvířata pak byla pozorována na vliv ošetření na přežití myši.

Výsledky

Konstrukce rekombinantního p53-adenoviru p53 adenoviry byly konstruovány nahrazením části Ela a Elb regionu adenoviru typ 5 s p53 CDNA pod kontrolou buď Ad2 mlP (A/M/53) nebo CMV (A/C/53) promotoru (schematicky na obr. 4). Tato El substituce těžce zhoršuje schopnost rekombinantních adenoviru se replikovat, omezením jejich propagace na 293 buňky, což převádí Ad5 El genové produkty na trans (Graham a spol. (1977)). Po identifikaci p53 rekombinantního adenoviru jak restrikčním štěpením, tak PCR analýzou byla celá p53 CDNA sekvence z jednoho z rekombinantních adenoviru (A/M/53) sekvenována pro ověření, že je prostá mutací. Potom byly použity čištěné přípravky p53 rekombinantů k infekci HeLa buněk pro zkoušení přítomnosti fenotypově standardního adenoviru. HeLa buňky, které nejsou permisivní pro replikaci El-deletovaného adenoviru, byly infikovány s 1-4^χ 10⁹ infekčních jednotek rekombinantního adenoviru, kultivovány 4 týdny a pozorovány na objevení se cytopatického efektu (CPE).Použitím této zkoušky nebyla zaznamenána replikace rekombinantního adenoviru nebo kontaminace standardním typem, zřejmé u CPE pozorovaného v kontrolních buňkách infikovaných standardním typem adenoviru v hladině citlivosti přibližně 1 v 10⁹.

p53 proteinová exprese u rekombinantního adenoviru

Pro stanoveni, zda p53 rekombinantní adenoviry exprimují p53 protein, byly infikovány nádorové buněčné linie, které neexprimují protein p53. Lidské nádorové buněčné linie

-16CZ 291372 B6

Saos-2(osteosarkom) a Hep 3B (hepatocelulámí karcinom) byly infikovány po 24 hodin s p53 rekombinantními adenoviry A/M/53 nebo A/C/53 při MOI v rozmezí 0,1 až 200 pfu/buňku. Western analýzy lyzátů připravených z infikovaných buněk demonstrují dávkově závislou p53 proteinovou expresi v obou buněčných typech (obr. 5). Obě buněčné linie exprimují vyšší hladiny p53 proteinu po infekci s A/C/53 než s A/M/53 (obr. 3).

Žádný p53 protein nebyl detekován u neinfíkovaných buněk. Hladiny endogenního standardního typu p53 jsou normálně příliš nízké a nejsou detekovatelné Western analýzou buněčných extraktů (Bartek a spol. (1991)). Je nicméně jasné, že hladiny standardního typu p53 proteinu jsou snadno detekovatelné po infekci s buď A/M/53 nebo A/C/53 při nižších MOI (obr. 5), což naznačuje, že i nízké dávky p53 rekombinantních adenoviru mohou produkovat účinné hladiny p53.

p53 závislé morfologické změny

Znovuzavedení standardního typu p53 do p53 negativní osteosarkomové buněčné linie, Saos-2, vede k charakteristickému prodloužení a zploštění těchto normálně vřetenovitě tvarovaných buněk (Chen a spol. (1990)). Nesouvislé Saos-2 buňky (l*10⁵ buňky/10 cm plotna) byly infikovány při MOI 50 buď s A/C/53 nebo kontrolním A/M virem a inkubovány při 37 °C po 72 hodin až jsou neinfíkované kontrolní plotny konfluentní. V tomto bodě byla očekávána morfologická změna zřejmá u A/C/53 ošetřené plotny (obr. 6 panel C), ale ne u neinfíkované (obr. 6, panel B). Tento účinek nebyl funkci buněčné hustoty, protože kontrolní plotna na počátku naočkovaná v nižší hustotě, si udržuje normální morfologii 72 hodin, kdy je jej i konfluence přibližně taková, jako u A/C/53 ošetřené plotny. Dřívej si výsledky demonstrovaly vyšší hladinu p53 proteinové exprese při MOI 50 v Saos-2 buňkách (obr. 5 A) a z těchto výsledků je zřejmé, že p53 protein exprimovaný těmito rekombinantními adenoviry byl biologicky aktivní.

p53 inhibice buněčné DNA syntézy

Pro další test aktivity p53 rekombinantních adenovirů byla hodnocena jejich schopnost inhibovat proliferaci lidských nádorových buněk měřením příjmu ³H-thymidinu. Dříve již bylo uvedeno, že zavedení standardního typu p53 do buněk, které neexprimují endogenní standardní typ p53 může zastavit buňky na přechodu G|/S, vést k inhibici příjmu značeného thymidinu do nově syntetizované DNA (Baker a spol. (1990), Mercer a spol. (1990), Diller a spol. (1990)). Různé p53-defícientní nádorové buněčné linie byly infikovány buď A/M/N/53, A/C/N/53 nebo p53 neexprimujícím kontrolním rekombinantním adenovirem (A/M). Byla pozorována silná, dávkově závislá inhibice DNA syntézy jak u A/M/N/53, tak A/C/N/53 rekombinantů v 7 z 9 různých nádorových testovaných linií (obr. 7). Oba konstrukty jsou schopny inhibovat DNA syntézu v těchto lidských nádorových buňkách, bez ohledu na to, zda jsou exprimovaný mutantem p53 nebo neexprimují p53 protein. Bylo také nalezeno v této studii, že A/C/N/53 konstrukt byl mnohem potentnější než A/M/N/53. V Saos-2 (osteosarkom) a MDA-MB468 (rakovina prsu) buňkách, bylo dosaženo téměř 100% inhibice DNA syntézy s A/C/N/53 konstruktem při tak nízké MOI jako 10. V dávkách, kde inhibice kontrolním adenovirem je pouze 10-30%, byla pozorována 50-100% redukce DNA syntézy za použití p53 rekombinantního adenovirů. Naopak nebyl žádný významný efekt pozorován za použiti konstruktu ve srovnáni s kontrolním virem v HEP g2 buňkách (hepatokarcinomová buněčná linie exprimující endogenní standardní typ p53, Bressac a spol. (1990)), ani v K.562 (p53 nula) leukemické buněčné linii.

Tumorigenicita u holé myši

V přísnějším testu funkce p53 rekombinantních adenovirů, byly nádorové buňky infikovány ex vivo a pak injektovány do holé myši k vyhodnocení schopnosti rekombinantů potlačovat růst nádoru in vivo. Saos-2 buňky infikované A/M/N/53 nebo kontrolním A/M virem při MOI 3 nebo 30, byly injektovány do protilehlých boků holé myši. Velikosti nádorů byly měřeny dvakrát za týden během 8týdenní periody. Při MOI 30 nebyl pozorován růst nádorů v p53-ošetřených bocích u jakékoliv ze zvířat, zatímco kontrolou ošetřené nádory pokračovaly v růstu (obr. 8).

- 17CZ 291372 B6

Progresivní zvětšení kontrolním virem ošetřených nádorů byla podobná jako byla pozorována u pufrem ošetřených kontrolních zvířat. Jasný je rozdíl v růstu nádoru mezi kontrolním adenovirem a p53 rekombinantem při MOI 3, ačkoliv nádory ze 2 ze 4 p53-ošetřených myší ukazovaly na startu stejný růst po přibližně 6 týdnech. Tak je A/M/N/53 rekombinantní adenovirus schopen zprostředkovat p53-specifícké nádorové potlačení v in vivo prostředí.

In vivo exprese Ad/p53

Ačkoliv ex vivo ošetření rakovinových buněk a následná injekce do zvířat poskytuje podstatný test nádorového potlačení, je klinicky relevantnějším experimentem stanovit, zda p53 rekombinantní adenovirus by mohl infikovat a exprimovat p53 v ustavených nádorech in vivo. Proto byly H69 (SCLC, p53^nula) buňky injektovány subkutánně do holé myši a nádory byly ponechány 32 dnů vyvíjet. Po této době byla jediná injekce 2* 10⁷ pfu buď A/C/53 nebo A/C/53-gal adenoviru injektována do peritumorálního prostoru, obklopujícího nádor. Nádory byly pak vyříznuty buď 2. nebo 7. den po injekci adenoviru a z každého nádoru byla izolována polyA RNA. RT-PCR za použití rekombinant-p53 specifických primerů pak byla použita k detekování p53 MRNA v p53 ošetřených nádorech (obr. 9, dráhy 1,2,4,5). Nebyl zřejmý žádný p53 signál z nádorů vyříznutých z β-gal ošetřených zvířat (obr. 9, dráhy 3 a 6). Amplifikace aktin příměry slouží jako kontrola pro RT-PCR reakci (obr. 9, dráhy 7-9), zatímco plazmid obsahující rekombinant p53 sekvence slouží jako pozitivní kontrola pro rekombinant-p53 specifický práh (obr. 9, dráha 10). Tento experiment demonstruje, že p53 rekombinantní adenovirus může specificky řídit expresi p53 mRNA s ustavenými nádory s následující jedinou injekcí do peritumorálního prostoru. Je také uvedena in vivo virální perzistence po alespoň jeden týden po infekci s p53 rekombinantním adenovirem.

Účinnost in vivo

K usnadnění genové terapie ustavených nádorů byl použit model nahé myši nesoucí nádor. H69 buňky byly injektovány do subkutánního prostoru do pravého boku myši a nádory byly ponechány růst dva týdny. Myši pak dostaly peritumorální injekce pufru nebo rekombinantního viru dvakrát týdně v celkem 8 dávkách. U myši ošetřené pufrem nebo kontrolním A/M virem pokračují nádory v rychlém růstu po celé ošetření, zatímco ty, které byly ošetřeny s A/M/N/53 virem rostly mnohem pomalejší lychlostí (obr. 10A). Poté, co se přestalo s injekcemi, kontrolní ošetřené nádory pokračují v růstu, zatímco p53 ošetřené nádory vykazují malý nebo žádný růst po alespoň jednom týdnu za nepřítomnosti jakéhokoliv dalšího doplňku exogenního p53 (obr. 10A). I když kontrolní zvířata ošetřená samotným pufrem měla urychlený růst nádoru ve srovnáni se skupinou ošetřenou virem, nebyl nalezen žádný podstatný rozdíl v tělesné hmotnosti mezi třemi skupinami během periody ošetření. Ulcerace nádoru u některých zvířat omezuje relevantnost měření velikosti nádoru ve 42. den. Nicméně pokračuje sledování zvířat pro stanovení doby přežití demonstrující výhodu přežívání u p53-ošetřených zvířat (obr. 10B). Poslední z kontrolních adenovirem ošetřených zvířat uhynulo 83. den, zatímco samotným pufrem ošetřená zvířata uhynula všechna 56. den. Naopak všech 5 zvířat ošetřených s A/M/N/53 dále přežívá (130. den po buněčné inokulaci). Tyto údaje společně představují p53-specifícký účinek jak na růst nádoru, tak na dobu přežití u zvířat s ustavenými p53-deficientními nádory.

Adenovirové vektory exprimující p53

Byly konstruovány rekombinantní adenovirové vektory, které jsou schopné exprimovat vysoké hladiny standardního typu p53 proteinu v dávkově závislém způsobu. Každý vektor obsahuje delece v Ela a Elb regionech, které činí virovou replikaci deficientní (Challberg a Kelly (1979), Horowitz (1991)). Dalším významem těchto delecí je, že tyto sekvence kódují Elb 19 a 55 kd protein. 15 kd protein je uváděn jako inhibující apoptosis (White a spol. (1992), Rao a spol. (1992), zatímco 55 kd protein je schopen vázat standardní typ p53 proteinu (Sarnow a spol. (1982), Heuwell a spol. (1990)). Při deleci těchto adenovirových sekvencí byly odstraněny potenciální inhibitory p53 funkce přímou vazbou kp53 nebo potenciální inhibici p53

-18CZ 291372 B6 zprostředkované apoptosis. Další konstrukty byly vyrobeny, mající zbývající 3'Elb sekvenci, zahrnující celý protein IX kódující sekvenci, rovněž deletovanou. I když bylo uváděno, že redukce obalové velikosti kapacity adenovirů na přibližně o 3 kb méně než u standardního typu viru (Ghosh-Choudhury a spol. (1987)), tyto konstrukty jsou také deletovány v E3 regionu tak, že A/M/N/53 a A/C/N/53 konstrukty jsou v tomto rozmezí velikostí. Při deleci pIX regionu jsou adenovirální sekvence homologní k sekvencím obsaženým ve 293 buňkách redukovány na přibližně 300 bázových párů, snižujících šanci regenerace replikačně schopného, adenovirů standardního typu rekombinací. Konstrukty, postrádající pIX kódující sekvenci se jeví být stejně účinné jako ty s pIX.

p53/adenovirus účinnost in vitro

V souladu se silnou dávkou závislosti pro expresi p53 proteinu v infikovaných buňkách, byla demonstrována p53-specifická inhibice růstu nádorových buněk. Buněčné dělení bylo inhibováno a demonstrováno inhibici DNA syntézy v širokém rozsahu typů nádorových buněk, o kterých je známo, že postrádají standardní typ p53 proteinové exprese. Barchetti a Graham (1993) v poslední době uvádějí p53 specifickou inhibici DNA syntézy v buněčné linii buněk karcinomu vaječníku SKOV-3 p53 rekombinantním adenovirem v podobných pokusech. Navíc ke karcinomu vaječníku byly demonstrovány další lidské nádorové buněčné linie představující klinicky důležité lidské rakoviny a zahrnující linie nadměrně exprimující mutant p53 protein, jako být inhibovány p53 rekombinanty podle tohoto vynálezu. Při MOI, kde je A/C/N/53 rekombinant z 9 až 100% účinný při inhibici DNA syntézy v nádorech těchto typuje kontrolní adenovirem zprostředkované potlačení menší než 20%.

I když Feinstein a spol. (1992) uvádějí, že znovu zavedení standardního p53 by mohlo vyvolat diferenciaci a zvýšení podílu buněk v Gi versus S+G₂ pro leukemické K562 buňky, žádný p53 specifický účinek nebyl v této linii nalezen. Horvath a Weber (1988) uvedli, že lymfocyty lidské periferní krve jsou vysoce nepermisivní v adenovirové infekci. V separátních pokusech rekombinant významně infikuje neodpovídající K562 buňky s rekombinantním A/C/p-gal adenovirem, zatímco ostatní buněčné linie, zahrnující kontrolní Hep G2 linii a ty, které vykazují silný p53 efekt, byly snadno infektovatelné. Tak alespoň část variability účinnosti by se mohla objevit díky variabilitě infekce, i když může obsahovat i jiné faktory.

Výsledky pozorované s A/M/N/53 virem na obr. 5 demonstrují, že je možné kompletní potlačení v in vivo prostředí. Obnovený růst nádorů ve 2 ze 4 u p53 ošetřených zvířat při nižších MOI nejpravděpodobněji vzniká z malého procenta buněk na počátku neinfíkovaných p53 rekombinantem v této dávce. Kompletní potlačení viditelné s A/M/N/53 ve vyšší dávce nicméně ukazuje, že schopnost růstu nádoru se obnovit může být překonána.

p53/adenovirus in vivo účinnost

Zde předložená práce a práce jiných skupin (Chen a spol. (1990), Takahoshi a spol. (1992), ukázaly, že lidské nádorové buňky postrádající expresi standardního typu p53 mohou být ošetřeny ex vivo s p53 a vést k potlačení nádorového růstu, jsou-li ošetřené buňky transferovány do zvířecího modelu. Přihlašovatelé předkládají první zmínku o nádorové supresor genové terapii in vivo ustaveného nádoru, vedoucí jak k potlačení nádorového růstu, tak ke zvýšení doby přežití.

V přihlašovatelově systému doručení do nádorových buněk není založeno na přímé injekci do nádorové hmoty. Spíše byl p53 rekombinantní adenovirus injektován do peritumorálního prostoru a v nádoru byla detekována p53 mRNA exprese. p53 exprimovaný rekombinanty byl funkční a silně potlačuje růst nádoru ve srovnání s kontrolními, p53-neexprimujícím adenovirem ošetřenými nádory. Nicméně jak p53 tak kontrolním virem ošetřené nádorové skupiny ukazují nádorové potlačení ve srovnání s pufrem ošetřenými kontrolami. Bylo demonstrováno, že místní exprese faktoru nádorové nekrózy (TNF), interferonu-y, interleukinu (IL)-2, IL-4 nebo IL-7 může vést k T-buněčně nezávislému přechodovému nádorovému potlačení u holé myši (Hoch a spol. (1992)). Vystavení monocytů adenovirovým virionům jsou také slabými induktoiy IFN-a

-19CZ 291372 B6 /β (přehled v práci Gooding a Wold (1990)). Proto není překvapující, že určité nádorové potlačení u holé myši bylo pozorováno i s kontrolním adenovirem. Toto virem zprostředkované nádorové potlačení nebylo pozorováno v ex vivo kontrolních virem ošetřených Saos-2 nádorových buňkách popsaných dříve. p53-specifické in vivo nádorové potlačení bylo silně demonstrováno pokračováním sledování zvířat na obr. 10. Doba přežití p53-ošetřené myši byla výrazně zvýšena, 5 z 5 zvířat přežívalo ještě více než 130 dnů od buněčné inokulace ve srovnání s O z 5 kontrolních zvířat ošetřených adenovirem. Přežívající zvířata ještě vykazují rostoucí nádory, které mohou působit buňky na počátku neinfikované s p53 rekombinantním adenovirem. Vyšší nebo častější režim dávkování je může odstranit. Dále promotorové odříznutí (Palmer aspol. (1991)) nebo další mutace mohou učinit tyto buňky rezistentní kp53 rekombinantnímu adenovirovému ošetření. Například mutace v poslední době popsaném WAF1 genu, genu indukovanému standardním typem p53, které následně inhibují progresi buněčného cyklu do S fáze /El-Deiry a spol. (1993), Hunter (1993) by mohly vést k p53-rezistentnímu nádoru.

Pokus č. III

Tento příklad ukazuje použití sebevražedných genů a tkáňově specifickou expresi takových genů v metodách genové terapie, zde popsaných. Hepatocelulámí karcinom byl zvolen jako cíl, protože je jednou z nejčastějších lidských malignancí postihujících člověka a vyvolávajících ročně ve světě 1 250 000 úmrtí. Výskyt této rakoviny je velmi vysoký v jihovýchodní Asii a Africe, kde je spojen s infekcí hepatitidou B a C a vystavením aflatoxinu. Chirurgie je v současnosti jedinou léčbou, která umožňuje potenciální uzdravení z HCC, i když je méně než 20 % pacientů považováno za kandidáty na resekci (Ravoet C a spol. 1993). Nicméně nádory jiné než hepatocelulámí karcinom jsou rovněž použitelné pro metody redukce jejich proliferace, které jsou zde popsány.

Buněčně linie

Všechny buněčné linie mimo HLF buněčné linie byly získány z Američan Type Tissue Culture Collection (ATCC) 12301 Parluawa Drove. Rockville Maryland. ATCC přírůstková čísla jsou uvedena v závorkách. Lidská embryonální ledvinová buněčná linie 293/CRL 1573) byla použita ke generování a rozmnožení rekombinantních adenovirů zde popsaných. Tyto byly udržovány v DME médiu, obsahujícím 10% definované doplněné telecí sérum (Hyclone). Hepatocelulámí rakovinové buněčné linie Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065) a HLF byly udržovány vDME/F12 médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem, a stejně tak buněčné linie MDA-MB 468(HTB 132) a BT-549 (HTB 122) rakoviny prsu. Chang jatemí buňky (CCL 13) rostly v MEM médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem. HLF buněčná linie byla získána od dr. T. Morsaki a Dr. H. Kitsuku z Kyushu University School of Medicine in Japan.

Konstrukce rekombinantního viru

Dva adenovirové expresní vektory označené zde jako ACNTK a AANTK a postrádající protein funkci (znázorněno na obr. 11) jsou schopné řízení exprese TK sebevražedného genu v nádorových buňkách. Třetí adenovirus expresní vektor označený AANCAT byl zkonstruován pro další demonstrování snadnosti exprese specificky cíleného genu ke specifickým buněčným typům za použití adenovirálních vektorů. Tyto adenovirální konstrukty byly sestaveny jak je znázorněno na obr. 11 a 12 a jsou deriváty těch, které byly dříve popsány pro expresi nádorových supresor genů.

Pro expresi cizího genu byly inzertovány expresní kazety, které využívají buď lidský cytomegalovirus bezprostřední časný promotor/enhancer (CMV) (Boshart M. a spol., 1985), nebo lidský alfa-fetoprotein (AFP) enhancer/promotor (Watanable K. a spol., 1987), Nakabayashi H. aspol., 1989) pro řízení transkripce TK genu nebo chloramfenikol acetyltransferázového genu (CAT). CMV enhancer promotor je schopen řízení robustní genové exprese v mnoha různých

-20CZ 291372 B6 buněčných typech, zatímco AFP enhancer/promotor konstrukt omezuje expresi k hepatocelulámím rakovinovým buňkám (HCC), které exprimují AFP uasi 70-80% populace HCC pacientů. Do konstruktu využívajícího CMV promotor/enhancer, byla také inzertována adenovirus typ 2 tripartitní leader sekvence. Ke zvýšení translace TK transkriptů (Berkner K.L. a Sharp. 1985). Navíc kEl deleci, jsou oba adenovirus vektory dále deletovány o 1,9 kilobází (kb) DNA ve virálním E3 regionu. DNA deletovaná v E3 regionu není podstatná pro rozmnožování viru a její delece zvyšuje inzertní kapacitu rekombinantního viru pro cizí DNA v ekvivalentním množství (1,9 kb) (Graham a Prevec, 1991).

K demonstrování specifíty AFP promotoru/enhancer, byl také konstruován virus AANCAT, kde je markér gen chloramfenikol acetyltransferázy (CAT) pod kontrolou AFP enhancer/promotoru. V ACNTK virovém konstruktu byla Ad2 tripartitní leader sekvence umístěna mezi CMV promotor/enhancer a TK gen. Tripartitní leader byl uváděn jako zvyšující translaci připojených genů. El substituce zhoršuje schopnost rekombinantních virů k replikaci, omezuje jejich pomnožení k293 buňkám, které doplňují Ad5 El genové produkty do trans (Graham a spol., 1977).

Adenovirální vektor ACNTK: Plazmid pMLBKTK vE.coli HB101 (z ATCC č. 39369) se použije jako zdroj herpes simplex virus (HSV-1) thymidin kinázového (TK) genu. TK se vyřízne zplazmidu jako 1,7 kb genový fragment štěpením s restrikčními enzymy Bgl II a pVU II a subklonuje se do kompatibilního Bam HI, EcoR V restrikčních míst plazmidu pSP72 (Promega) za použití standardních technik klonování (Sambrook a spol., 1989). TK inzert se pak izoluje jako 1,7 kg fragment z tohoto vektoru štěpením s Xba I a Bgl II a klonuje do Xba I, BamHI štěpeného plazmidu pACN (Wills a spol., 1994). Dvacet (20) pg tohoto plazmidu označeného pACNTK se linearizuje s Eco Rl a kontransfektuje do 293 buněk (ATCC CRL 1573) s 5 pg Cla 1 štěpeného ACBGL (Wills a spol., 1994 supra) za použití CaPO₄ transfekčního kitu (Stratagene, Saň Diego, Kalifornie). Virální plaky byly izolovány a rekombinanty, označené ACNTK byly identifikovány restrikční štěpnou analýzou izolované DNA pomocí Xho I a Bsi WI. Pozitivní rekombinanty byly dále čištěny omezujícím ředěním a expandovány a titrovány standardními metodami (Graham a Prevec, 1991).

Adenovirový vektor AANTK: α-Fetoprotein promotor (AFP-P) a enhancer (AFP-E) byly klonovány z lidské genomické cDNA (Clontech) za použití PCR amplifikace sprintery, obsahujícími restrikční místa na svých koncích. Primery použité k izolaci 210 bp AFP-E obsahujícímu Nhe I restrikční místo na 5' primerů a Xba I, Xho I, Κηρ I linker na 3'primeru. 5'-příměrová sekvence byla 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3¹. 5' příměrová sekvence byla 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG - 3'. Primery použité k izolaci 1763 bp AFE fragmentu obsahující Not I restrikční místo na 5' primerů a Xba I místo na 3' primerů. 5^? příměrová sekvence byla 5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TÁG GAA GTT TTC GCA - 3'. Pro PCR amplifikaci DNA byla denaturována při 97 °C 7 minut, s následujícími 5 cykly amplifikace při 97 °C, 1 min, 53 °C, 1 min, 72 °C, 2 min a nakonec 72 °C, 10 minut prodlužování. Amplifikovaný AFE byl štěpen sNot I a Xba I a inzertován do Not I, Xba I místo plazmidového vektoru (pA/lTR/B), obsahujícího adenovirus typ 5 sekvence 1-350 a 3330-5790 oddělené polylinkerem, obsahujícím Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Κρη I, Bam HI, Nco I, Srna I, a Bgl II místa. Amplifikovaný AFP-E byl štěpen s Nhe I a Κρη I a inzertován do AFP-E obsahujícího konstruktu popsaného výše, který byl štěpen s Xba I a Κρη I. Tento nový konstrukt byl pak dále štěpen x Xba I a Ngo Mi pro odstranění adenovirálních sekvencí 3330-5780, které byly následně nahrazeny s Xba I, NgoMI restrikčním fragmentem plazmidu pACN, obsahujícím nukleotidy 4021-10457 adenovirů typu 2 pro konstrukci plazmidu pAAN, obsahujícího jak α-fetoproteinový enhancer, tak promotor. Tento konstrukt byl pak štěpen sEco Rl a Xba I k izolaci 2,3 kb fragmentu, obsahujícího Ad5 invertované koncové opakování, AFP-E a AFP-P, které bylo následně ligováno s 8,55 kb fragmentem Eco Rl, Xba I štěpeného pACNTK popsaného výše pro přípravu pAANTK,kde TKgen je řízen a -fetoprotein enhancerem a promotorem v adenovirovém základu. Tento

-21 CZ 291372 B6 plazmid byl pak linearizován s Eco RI a kotransfektován s velkým fragmentem Cla I štěpeného ALBGL jako výše a byly izolovány a čištěny rekombinanty označené AANTK jak popsáno výše.

Adenovirální vektor AANCAT: chloramfenikol acetyltransferázový (CAT) gen byl izolován z pCAT-Basic Vektor (Promega Corporation) štěpením Xba I, Bam HI. Tento 1,64 kb fragment byl ligován do Xba I, Bam HI, štěpeného pAAN (popsán výše) pro vytvoření pAANCAT. Tento plazmid byl pak linearizován s Eco RI a kotransfektován s velkým fragmentem Cla I štěpeným ra/C/p-gal k vytvoření AANCAT.

Exprese reportér genu: β-Galaktosidázová exprese

Buňky byly umístěny v množství lxlO⁵ buněk jamka na 24-jamkovou tkáňovou kultivační plotnu (Costar) a ponechány přes noc adherovat (37 °C, 7 % O₂) · Infekce přes noc ACBGL byly provedeny při multiplicitě infekce (MOI) 30. Po 24 hodinách se buňky fixují se 3,7% formaldehydeim, PBS a vybarvují s 1 mg/ml Xgal činidla (USB). Data byla hodnocena (+,++,+++) vyhodnocením procent pozitivně vybarvených buněk při každé MOI (+ = 1-33 %, + + = 33-67 % a + + + = > 67 %).

Exprese reportér genu: CAT exprese

Dva (2)χ 10⁶ buněk (hep G2, Hep 3B, HLF, Chang a MDA-MB468) bylo vyseto na 10 cm plotny (trojmo) a inkubováno přes noc (37 °C, 7 % CO₂).Každá plotna pak byla infikována bud s AANCAT při MOI=30 nebo 100 nebo neinfikována a ponechána inkubovat 3 dny. Buňky byly pak tryptinizovány a promyty PBS a resuspendovány ve 100 μΐ 0,25 M Tris pH 7,8. Vzorky byly zmrazený a 3x ponechány roztát a supematant byl přenesen do nových zkumavek a inkubován při 60 °C 10 minut. Vzory pak byly rozvířeny při 4 °C po 5 minut a suspemanty sledovány na koncentraci proteinu použitím Bradfordovy eseje (Bio-Rad Protein Assay Kit). Vzorky byly upraveny na stejné koncentrace proteinu v konečném objemu 75 μΐ za použití 0,25 M Tris, 25 μΐ 4 mM acetyl CoA a 1 α 1 ^l4C-chloramfenikolu a inkubovány přes noc při 37 °C. Ke každému vzorku bylo přidáno 500 μΐ ethylacetátu a mícháno vortexováním s následujícím odstřeďováním po 5 minut při teplotě místnosti. Horní fáze se pak přenese do nové zkumavky a ethylacetát se odpaří odstřeďováním za vakua. Reakční produkty se pak znovu rozpustí ve 25 μΐ ethylacetátu a nanesou na desku pro chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a deska se pak umístí do TLC komory předem ekvilibrováné (95 % chloroform, 5 % methanol). Rozpouštědlo se nechá migrovat na konec desky a deska se pak suší a vystaví rentgenovému filmu.

Buněčná proliferace: Inkorporace ³H- thyroidinu

Buňky se umístí v množství 5 χ 10³ buněk/jamka na 96-jamkovou mikrotitrační plotnu (Costar) a nechají se inkubovat přes noc (37 °C, 7 % CO₂). Sériově ředěný ACN,ACNTK nebo AATK virus vDMEM, 15% FBS, 1% glutamin se použije pro transfektování buněk při multiciplitě infekce 30 přes noc, pak se k buňkám dávkuje (trojmo) ganciclovir (Cytovene) v log intervalech mezi 0,001 a 100 mM (mikromolární). Do každé jamky se 12-18 h před sklizením přidá lpCi ³H-thymidinu (Amersham). 72 hodin po infekci se buňky sklidí na filtry ze skleněných vláken a inkorporováný ³H-thymidin byl spočten za použití kapalinové scintilace (Top Count, Packard). Výsledky jsou graficky vyjádřeny jako procenta proliferace neošetřené kontroly a vyjádřeny tabelárně jako účinná dávka (ED5Q+SD) pro 50procentní redukci proliferace vzhledem ke kontrolnímu médiu. ED5Q hodnoty byly hodnoceny použitím logistické rovnice pro hodnoty závislosti na dávce.

Cytotoxicita: Uvolnění LDH

Buňky (HLF, lidský HCC) byly umístěny na plotnu, infikovány s ACN nebo ACNTK a ošetřeny s ganciclovirem jak je popsáno pro proliferační esej. 72 hodin po podání gancicloviru byly buňky rozvířeny, supematant byl odstraněn. Hladiny laktát dehydrogenázy byly naměřeny kolori

-22CZ 291372 B6 metricky (Promega, Cytotox 96%™). Průměrné uvolnění LDH (+/- S.D.) je graficky vyneseno proti M.O.I.

Lidské hepatocelulámí karcinomové buňky (Hep 3B) byly injektovány do deseti samic (10) athymické nu/nu myši (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Každé zvíře dostalo přibližně 1 * 10⁷ buněk do levého boku. Nádory byly ponechány růst po 27 dnů před náhodným hodnocením myši na velikost nádoru. Myši byly ošetřeny intratumorálními a peritumorálními injekcemi ACNTK nebo kontrolního viru ACN (1 χ 10⁹ iu ve 100 μΐ) každý další den v celkem třech dávkách. Za 24 hodin po počáteční dávce adenoviru bylo započato intraperitoneálním dávkováním io gancicloviru myši (Cytovene 100 mg/kg) denně po celkem 10 dnů. Myši byly sledovány na velikost nádoru a tělesnou hmotnost dvakrát týdně. Měření nádorů byla prováděna trojrozměrně za použití noniových hmatadel a objemy byly vypočteny použitím vzorce 4/3 πΓ³, kde r je polovina průměru rozměru nádoru.

Výsledky:

Rekombinantní adenoviiy byly použity k infikování tří HCC buněčných linií (HLF, Hep 3B a Hep-G2). Jedna lidská jaterní buněčná linie (Chang) a dvě buněčné linie rakoviny prsu (MDAMB 468 a BT 549) byly použity jako kontroly. K demonstrování specifity AFP 20 promotor/enhancer byl konstruován AANCAT. Tento virus byl použit pro infekci buněk, které buď exprimují (Hep 3B, Hep G2) nebo neexprimují (HLE, Chang, MDAMB 468) HCC nádorový markér a -fetoprotein (AFP). Jak je uvedeno na obr. 13, AANCAT řídí expresi CAT markér genu pouze v těch HCC buňkách, které jsou schopné exprese AFP (obr. 13).

Účinnost ACNTK a AANTK pro léčení HCC byla hodnocena za použití ³H-thymidin inkorporační eseje pro měření účinku kombinace HSV-TK exprese a ošetření ganciclovirem po buněčné proliferaci. Buněčné linie byly infikovány buď ACNTK nebo AANTK nebo kontrolním virem ACN (Wills a spol., 1994, supra), který neřídí expresi HSV-TK a pak ošetřeny s ACNTK nebo AANTK nebo kontrolním virem ACN (Wills a spol., 1994, supra), který neřídí expresi

HSV-TK a pak ošetřeny se stoupajícími koncentracemi gancicloviru. Účinek tohoto ošetření byl hodnocen jako funkce zvyšujících se koncentrací gancicloviru a byla stanovena koncentrace gancicloviru vyžadovaná pro inhibici ³H-thymidinu inkorporovaného z 50 % (ED ⁵⁰). Dále relativní míra adenovirus-zprostředkovaného genového transferu a exprese každé buněčné linie byla stanovena za použití kontrolního viru, který řídí expresi markér genu beta-galaktosidázy.

Data na obr. 14 a v tabulce 1 dále ukazují, že ACNTK virus/ganciclovir kombinační léčba byla schopná inhibovat buněčnou proliferaci ve všech buněčných zkoušených liniích ve srovnání s kontrolním adenovirem ACN v kombinaci s ganciclovirem. Naopak AANTK virální vektor byl účinný pouze v těch HCC buněčných linií, které byly demonstrovány jako exprimující a -fetoprotein. Dále byla kombinace AANTK/GCV mnohem účinnější, když byly buňky 40 umístěny na plotny ve vysokých hustotách.

Tabulka č. 1

Buněčná linie aFP β-gal ACN ED₅₀ AANTK exprese ACNTK

MDAMB468	-	+ + +	> 100	2	> 100
BT549	—	+ + +	> 100	>0,3	> 100
HLF	-	+ + +	> 100	0,8	> 100
CHANG	—	+ + +	> 100	22	> 100
HEP-3B	-	+	80	8	8
HEP-G2 LOW	+	+ +	90	2	35
HEP-G2 HIGH	+	+ +	89	0,5	4

-23CZ 291372 B6

Holé myši nesoucí Hep 3B nádory (N=5/skupina) byly ošetřeny intratumorálně a peritumorálně s ekvivalentními dávkami ACNTK nebo ACN kontroly. Dvacet čtyři hodin po prvním podání rekombinantního adenoviru se započalo u všech myší s denním ošetřováním ganciclovirem. Dvakrát týdně byly u všech myší měřeny rozměry nádoru pomocí hmatadel a průměrné velikosti nádorů jsou graficky znázorněny na obr. 16. Průměrná velikost nádoru 58. den byla menší než u ACNTK-ošetřených zvířat, ale rozdíl nebyl statisticky významný (p < 0,09, nepárovaný - test). Tato data podporují specifický účinek ACNTK na růst nádoru in vivo. Mezi skupinami nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v průměrné tělesné hmotnosti.

I když vynález byl popsán s ohledem na výše uvedená provedení, je třeba chápat, že jsou možné různé jeho modifikace, aniž by byla narušena myšlenka vynálezu. V souladu s tím je vynález omezen následujícími nároky.

Odkazy:

AIELLO, L. et al. (1979) Virology 94:460-469.

AMERIČAN CANCER SOCIETY. (1993) Cancer Facts and Figures.

AULITZKY et al. (1991) Eur. J. Cancer 27 (4):462^167.

AUSTIN, E. A. and HUBER, B.E. (1993) Mol. Pharmaceutical 43:380-387.

BACCHETTI, S. AND GRAHAM, F. (1993) Intemational Joumal of Oncology 3:781-788.

BAKER S. J., MARKOWITZ, S., FEARON E.R., WILLSON, J.K.V., AND VOGELSTEIN, B. (1990) Science 249:912-915.

BARTEK, J., BARTKOVA, J., VOJTESEK, B„ STAŠKOVA, Z., LUKÁŠ, J., REJTHAR, A., KOVAŘÍK, J., MIDGLEY, C. A., GANNON, J.V., A LANÉ, D. P. (1991) Oncogene 6:1699-1703.

BERKNER, K.L. a: SHARP (1985) Nucleic Acids Res 13:841-857.

BOSHART, M. et al. (1985) Cell 41:521-530.

BRESSAC, B., GALVIN, K.M., LIANG, T.J., ISSELBACHER, K.J., WANDS, J.R., AND OZTURK, M. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:1973-1977.

CARUSO M. et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:7024-7028.

CHALLBERG, M. D., KELLY, T. J. (1979) Biochemistry 76:655-659.

CHEN P.L., CHEN Y., BOOKSTEIN R., AND LEE W.H. (1991) Science 250:1576-1580.

CHEN, Y., CHEN, P. L., ARNAIZ, N., GOODRICH, D„ AI LEE, W.H. (1991) Oncogene 6:1799-1805.

CHENG, JL, YEE, J. K., YEARGIN, J., FRIEDMANN, T., A( HAAS, M. (1992) Cancer Research 52:222-226.

COLBY, W. W. AI SHENK, T. J. (1981) Virology 39:977-980.

CULVERET AL. (1991) P.N.A.S. (U.S.A.) 88:3155-3159.

-24CZ 291372 B6

CULVER, K.W. et al. (1992) Science 256:1550-1552.

DEMETR1 et al. (1989) J. Clin. Oncoi. 7 (10):1545-1553.

DILLER, L., etal. (1990) Mol. Cell. Biology 10:5772-5781.

EL-DEIRY, W.S., et al. (1993) Cell 75:817-825.

EZZIDINE, Z.D. et al. (1991) The New Biologist 3:608-614.

FEINSTEIN, E., GALE, R. P„ REED, J., A ’ CANAANI. E. (1992) Oncogene 7:1853-1857.

GHOSH-CHOUDHURY, G., HAJ-AHMAD, Y.. K. GRAHAM, F. L. (1987) EMBO Joumal 6:1733-1739.

GOODING, L.R., A WOLD, W.S.M. (1990) Crit. Rev. Immunol. 10:53-71.

GRAHAM F. L., P. VAN DER ERB A.J. (1973) Virolog} 52:456-467.

GRAHAM, F. L. A PREVEC, L. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunoloaical Problems. R. W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston. 363-390.

GRAHAM, F. L., SMILEY, J., RUSSELL, W.C. A NAIRN, R. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-74.

GRAHAM F.L. A PREVEC L. (1991) Manipulation of acienovirus vectors. In: Methocis in Molecular Biology. Vol 7: Gene Transfer anci Expression Protocols. Murray E.J. (ed.) The Humana Press lne., Clifton N.J., Vol 7:109-128.

HEUVEL, S. J. L., LAAR, T., KAST, W. M., MELIEF, C. J. Μ., ZANTEMA, A., A VAN DER EB, A. J. (1990) EMBO Journal 9:2621-2629.

HOCK, K., DORSCH, M., KUZENDORF, U., QIN, Z., DIAMANTSTEIN, T., A. BLANKENSTEIN, T. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:2774-2778.

HOLLSTEIN, M., SIDRANSKY, D., VOGELSTE1N, B., A. HARRIS, C. (1991) Science 253:49-53.

HOROWITZ, M. S. (1991) Adenoviridae and their replication. In Fields Virology. Β. N. Fields, ed. (Raven Press, New York). 1679-1721.

HORVATh, J., A. WEBER, J.M. (1988) J. Virol. 62:341-345.

HUANG et al. (1991) Nátuře 350:160-162.

HUBER, B.E. et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:8039-8043.

HUNTER, T. (1993) Cell 75:839-841.

JONES, N. A. SHENK, T. (1979) Cell 17:683-689.

KAMB et al. (1994) Science 264:436-440.

KEURBITZ, S. J., PLUNKETT, B. S., WALSH, W. V., AI KAŠTAN, Μ. B. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7491-7495.

-25 CZ 291372 B6

KREIGLER, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1990).

LANDMANN et al. (1992) J. Interferon Res. 12 (2).-103-111.

LANÉ, D. P. (1992) Nátuře 358:15-16.

LANTZ et al. (1990) Cytokine 2 (6) :402-406.

LARRICK, J.W. a:. BURCK, K.L. Gene Therapy; Application.of Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York, New York (1991).

LEE et al. (1987) Science 235:1394-1399.

LEMAISTRE et al. (1991) Lancet 337:1124-1125.

LEMARCHAND, P., et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:6482-6486.

LEVINE, A.J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rev. Biochem. 1993. 62:623-651.

LOWE S. W., SCHMITT, E.M., SMITH, S. W., OSBORNE, B. A., Ai JACKS, J. (1993) Nátuře 362:847-852.

LOWE, S.W., RULEY, H.E., JACKS, T„ A. HOUSMAN, D. E. (1993) Cell 74:957-967.

MARTIN (1975) In: Remingtonů Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

MERCER, W.E., et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:6166-6170.

NAKABAYASHI, H. et al. (1989) The Joumal of Biological Chemistry 264:266-271.

PALMER, T. D., ROSMAN, G. J., OSBORNE, W. R., A. MILLER, A.D. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci USA 88:1330-1334.

RAO, L., DEBBAS, M., SABBATINI, P., HOCKENBERY, D., KORSMEYER, S„ A WHITE, E. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:7742-7746.

RAVOET C. et al. (1993) Joumal of Surgical Oncology Supplement 3:104-111.

RICH, D.P., et al. (1993) Human Gene Therapy 4:460-476.

ROSENFELD, M.A., et al. (1992) Cell 68:143-155.

SAMBROOK J., FRITSCH E. F., A. MANIATIS T. (1989). Molecular Clonina; A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

SARNOW, P., HO, Y. S., W1LLIAMS, J., A. LEVINE, A. J. (1982) Cell 28:387-394.

SHAW, P„ BOVEY, R., TARDY, S„ SÁHLI, R., SORDAT, B„ A. COSTA, J. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:4495-4499.

SIEGFRIED, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101:7-11.

SORSCHER, E. J. et al. (1994) Gene Therapy 1:233-238.

-26CZ 291372 B6

SPECTOR, D.J. (1983) Virology 130:533-538.

STEWART, P.L. et al. (1993) EMBO Journal 12:2589-2599.

STRAUS. S.E. (1984) Adenovirus infections in humans. In: The Adenoviruses, Ginsberg HS, ed. Nexv York: Plenům Press, 451—496.

SUPERSAXO et al. (1988) Pharm. Res. 5 (8):472-476.

TAKAHASHI, T., et al. (1989) Science 246: 491-494.

TAKAHASHI, T., et al. (1992) Cancer Research 52:2340-2343.

TH1MMAPPAYA, B. et al. (1982) Cell 31:543-551.

WANG, A. M., DOYLE, Μ. V., A MARK, D.F. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci USA 86:9717-9721.

WATANABLE, K. et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry 262:4812-4818.

WHITE, E., et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580.

WILLS, K.N. et al. (1994) Hum. Gen. Ther. 5:1079-1088.

YONISH-ROUACH, E., et al. (1991) Nátuře 352:345-347.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (21)

1. Rekombinantní adenovirový expresní vektor, zahrnující

a. inzert exogenní DNA, zahrnující gen kódující cizí protein, a

b. adenovirovou DNA, v níž byly vypuštěny všechny kódující sekvence Ela, Elb a proteinu IX a alespoň část E3.

2. Vektor podle nároku 1, kde adenovirová DNA dále zahrnuje deleci neesenciální sekvence DNA v časné oblasti 3 a/nebo časné oblasti 4 adenoviru.

3. Vektor podle nároku 1 nebo 2, kde adenovirová DNA dále zahrnuje deleci až čtyřiceti nukleotidů ve směru 3' vzhledem k deleci Ela a Elb a proteinu IX, přičemž exogenní DNA dále zahrnuje polyadenylační signál.

4. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde adenovirová DNA je DNA adenoviru skupiny C, vybraného ze sérotypu 1, 2, 5 nebo 6.

5. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde genem kódujícím cizí protein je molekula DNA s až 2,6 kilobázemi.

6. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde genem kódujícím cizí protein je molekula DNA s až 4,5 kilobázemi.

-27CZ 291372 B6

7. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde gen kódující cizí protein kóduje cizí funkční protein nebo jeho biologicky aktivní fragment.

8. Vektor podle nároku 7, kde cizím funkčním proteinem je tumor supresorový protein nebo jeho biologicky aktivní fragment.

9. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde gen kódující cizí protein kóduje sebevražedný protein nebo jeho funkční ekvivalent.

10. Vektor podle nároku 9, kde sebevražedným proteinem je thymidin kináza herpes simplex I.

11. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

12. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro genovou terapií.

13. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro transformaci hyperproliferativní savčí buňky.

14. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčbu rakoviny.

15. Použití podle nároku 14, kde vektor zahrnuje gen kódující cizí funkční protein, kterým je tumor supresorový protein, a kde rakovina je spojena s nedostatkem endogenního standardního tumor supresorového proteinu.

16. Použití podle nároku 15, kde rakovinou je nemalobuněčná rakovina plic, malobuněčná rakovina plic, hepatokarcinom, melanom, retinoblastom, nádor prsu, kolorektální karcinom, leukemie, lymfom, mozkový nádor, cervikální karcinom, sarkom, nádor prostaty, nádor močového měchýře, nádor retikuloendotelových tkání, Wilmův nádor, astrocytom, glioblastom, neuroblastom, ovariální karcinom, osteosarkom a renální rakovina.

17. Použití vektoru podle nároku 1, kde genem kódujícím cizí protein je protinádorový gen, pro přípravu farmaceutického přípravku pro podávání účinného množství terapeutického činidla, které je v přítomnosti protinádorového genu toxické pro buňku, pro redukci proliferace nádorových buněk u subjektu.

18. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro inhibici proliferace nádoru u živočicha.

19. Použití vektoru podle nároku 1, kde gen kódující cizí protein kóduje thymidin kinázu, pro přípravu farmaceutického přípravku pro podávání účinného množství metabolitu thymidin kinázy nebo jeho funkčního ekvivalentu pro redukci proliferace nádorových buněk u subjektu.

20. Použití podle nároku 19, kde metabolitem thymidin kinázy je ganciklovir nebo 6-methoxypurin arabinonukleosid nebo jeho funkční ekvivalent.

21. Použití podle nároku 19, kde nádorové buňky představuje hepatocelulámí karcinom.