ES2256842T3 - Vector de adenovirus recombinante y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION PROPONE UN VECTOR RECOMBINANTE DE EXPRESION DE ADENOVIRUS CARACTERIZADO POR LA DELECION PARCIAL O TOTAL DE LA PROTEINA ADENOVIRAL IX ADN, QUE PRESENTA UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEINA EXTRAÑA O UN FRAGMENTO FUNCIONAL O UN MUTANTE DEL MISMO. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYEN CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS Y UN METODO PARA PRODUCIR PROTEINAS RECOMBINANTES Y TERAPIA GENICA. ASI POR EJEMPLO, EL VECTOR ADENOVIRAL DE ESTA INVENCION PUEDE CONTENER UN GEN EXTRAÑO PARA EXPRESAR UNA PROTEINA EFICAZ PARA REGULAR EL CICLO CELULAR, COMO P53, RB O MITOSINA, O PARA INDUCIR LA MUERTE CELULAR, COMO EL GEN SUICIDA CONDICIONAL DE TIMIDINA QUINASA (ESTE ULTIMO DEBE UTILIZARSE JUNTO CON UN METABOLITO DE TIMIDINA QUINASA PARA QUE RESULTE EFICAZ).

Description

Vector de adenovirus recombinante y métodos de uso.

Esta solicitud es una continuación en parte del documento U.S. nº de serie 0,8/233.777, presentado el 19 de mayo de 1994, que es una continuación en parte del documento U.S. nº de serie 0,8/142.669 presentado el 25 de octubre de 1993.

En toda esta solicitud, se alude a varias publicaciones mediante citas entre paréntesis y en la descripción bibliográfica, que precede inmediatamente a las reivindicaciones.

La producción de adenovirus recombinantes útiles para la terapia génica requiere la utilización de una línea celular capaz de proporcionar en trans los productos génicos de la zona vírica E1 que se eliminan en estos virus recombinantes. Actualmente la única línea celular útil disponible es la línea celular 293 descrita originalmente por Graham et al. en 1977. Las células 293 contienen aproximadamente el 12% a la izquierda (4,3 kb) del genoma del adenovirus tipo 5 (Aiello (1979) y Spector. (1983)).

Los vectores adenovíricos que están siendo probados actualmente para aplicaciones en terapia génica normalmente se eliminan para el ADN de Ad2 o Ad5 que se prolonga desde aproximadamente 400 pares de bases desde el extremo 5' del genoma vírico hasta aproximadamente 3,3 kb del extremo 5', para una deleción total de E1 de 2,9 kb. Por consiguiente, existe una zona limitada de homología de aproximadamente 1 kb entre la secuencia de ADN del virus recombinante y el ADN de Ad5 en la línea celular. Esta homología define una zona de recombinación potencial entre las secuencias de adenovirus vírica y celular. Dicha recombinación produce un virus con fenotipo natural que lleva la zona E1 de Ad5 de las células 293. Este episodio de recombinación supuestamente se tiene en cuenta para la detección frecuente del adenovirus natural en las preparaciones de virus recombinante y se ha demostrado directamente que es la causa de la contaminación natural del virus Ad2/CFTR-1 recombinante a base de Ad2 (Rich et al., (1993)).

Debido al alto grado de homología de la secuencia dentro del subgrupo del adenovirus tipo C dicha recombinación es probable que se produzca si el vector se basa en cualquier adenovirus del grupo C (tipos 1, 2, 5 y 6).

En la producción a pequeña escala de los adenovirus recombinantes, la generación del virus natural contaminante puede ser gestionada por un proceso de identificación que descarta aquellas preparaciones de virus que se observa que están contaminadas. A medida que crece la escala de producción del virus para satisfacer la demanda esperada de productos terapéuticos genéticos, la probabilidad de que cualquier lote individual esté contaminado con un virus natural también aumentará así como la dificultad de proporcionar preparaciones recombinantes no contaminadas.

Existirán más de un millón de nuevos casos de cáncer diagnosticados este año y la mitad de esta cifra serán muertes relacionadas con el cáncer (American Cancer Society, 1993). Las mutaciones p53 son las alteraciones genéticas más frecuentes relacionadas con los cánceres humanos, que se producen en el 50 al 60% de los cánceres humanos (Hollstein et al. (1991); Bartek et al. (1991); Levine (1993)). El objetivo de la terapia génica en el tratamiento de los tumores con insuficiencia de p53, por ejemplo, consiste en reinstalar una copia normal y operativa del gen p53 natural de modo que se rehabilite este control de proliferación celular. p53 desempeña una función central en la evolución del ciclo celular, deteniendo el crecimiento de modo que pueda tener lugar esta reparación o apoptosis en respuesta a la alteración del ADN. Recientemente se ha identificado el p53 natural como componente necesario para la apoptosis inducida por irradiación o el tratamiento con algunos agentes quimioterapéuticos (Lowe et al. (1993) A y B). Debido al gran número de casos de las mutaciones de p53 en tumores humanos, es posible que los tumores que se han vuelto refractarios a la quimioterapia y a los tratamientos de irradiación puedan haberse vuelto así debido en parte a la falta de p53 natural. Volviendo a suministrar p53 operativo a estos tumores, es razonable que ahora sean sensibles a la apoptosis normalmente asociada a la alteración del ADN inducida por radiación y quimioterapia.

Uno de los puntos críticos en la terapia génica lograda del supresor del tumor humano es la capacidad para afectar una fracción significativa de células cancerosas. Se ha explorado en gran medida la utilización de vectores retrovíricos con esta finalidad en varios modelos de tumor. Por ejemplo, para el tratamiento de cánceres hepáticos, se han empleado vectores retrovíricos con poco éxito debido a que estos vectores no son capaces de conseguir el alto nivel de transferencia génica requerido para la terapia génica in vivo (Huber, B. E. et al., 1991; Caruso M. et al., 1993).

Para conseguir una fuente más continua de producción de virus, los investigadores han intentado resolver el problema relacionado con el bajo nivel de transferencia génica mediante la inyección directa de líneas celulares de empaquetamiento retrovírico en tumores sólidos (Caruso, M. et al., 1993; Ezzidine, Z. D. et al., 1991; Culver, K. W. et al., 1992). Sin embargo, estos métodos son insatisfactorios para su utilización en pacientes humanos porque el método es engorroso e induce una respuesta inflamatoria contra la línea celular de empaquetamiento en el paciente. Otro inconveniente de los vectores retrovíricos es que requieren células en división para integrar y expresar eficazmente el gen recombinante de interés (Huber, B. E. 1991). La integración estable en un gen huésped esencial puede conducir al desarrollo o a la herencia de enfermedades patógenas.

Los adenovirus recombinantes presentan distintas ventajas sobre los métodos de administración retrovírica y otros de administración génica (para estudios, véase Siegfried (1993)). Nunca se ha demostrado que los adenovirus induzcan tumores en el hombre y se han utilizado satisfactoriamente como vacunas atenuadas (Straus (1984)). Los adenovirus recombinantes con replicación insuficiente pueden producirse sustituyendo la zona E1 necesaria para la replicación con el gen diana. Los adenovirus no se integran en el genoma humano como consecuencia normal de la infección, reduciendo de este modo en gran medida el riesgo de mutagénesis de inserción posible con vectores víricos retrovíricos o adenoasociados (AAV). Esta falta de integración estable conduce asimismo a una característica de seguridad adicional en la que el efecto del gen transferido será temporal, ya que el ADN extracromosómico se perderá gradualmente con la división continua de las células normales. El adenovirus estable, recombinante con título elevado puede producirse a concentraciones no alcanzables con retrovirus o AAV, permitiendo que se produzca suficiente material para tratar una gran población de pacientes. Además los vectores son capaces de transferencia génica in vivo muy eficaz en una amplia gama de tipos de tejido y de células tumorales. Por ejemplo, otros han demostrado que la administración del gen mediado por adenovirus presenta un fuerte potencial para la terapia génica para enfermedades tales como la fibrosis quística (Rosenfeld et al. (1992); Rich et al. (1993)) y la insuficiencia en \alpha_{1}- antitripsina (Lemarchand et al. (1992)). Aunque otras alternativas para la administración el gen, tales como los complejos de liposoma catiónico/ADN, se están explorando también actualmente, ninguna todavía parece ser eficaz como administración génica mediada por adenovirus.

Como en el tratamiento de los tumores con insuficiencia de p53, el objetivo de la terapia génica para otros tumores consiste en reinstalar el control de la proliferación celular. En el caso del p53, la introducción de un gen operativo reinstala el control del ciclo celular permitiendo la muerte de la célula apoptósica inducida por agentes terapéuticos. Asimismo, es igualmente aplicable la terapia génica a otros genes supresores del tumor que pueden utilizarse solos o en combinación con agentes terapéuticos para controlar la evolución del ciclo celular de las células tumorales y/o inducir la muerte celular. Además, los genes que no codifican las proteínas reguladoras del ciclo celular, pero inducen directamente la muerte celular tales como los genes suicidas o, los genes que son directamente tóxicos para la célula pueden utilizarse en los protocolos de terapia génica para eliminar directamente la evolución del ciclo celular de las células tumorales.

Independientemente de qué gen se utilice para reinstalar el control de la evolución del ciclo celular, la aplicabilidad lógica y práctica de este método es idéntica. Es decir, conseguir grandes eficacias de transferencia génica para expresar cantidades terapéuticas del producto recombinante. La elección de qué vector utilizar para permitir la transferencia génica con gran eficacia con mínimo riesgo para el paciente es por lo tanto importante en el contexto del éxito del tratamiento de la terapia génica.

Por lo tanto, existe necesidad de vectores y métodos que proporcionen eficacias de transferencia génica a alto nivel y expresión proteica que proporcione tratamientos de terapia génica seguros y eficaces. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.

Compendio de la invención

Esta invención proporciona un vector de expresión de adenovirus recombinante caracterizado por una deleción total del ADN adenovírico con proteína IX y que tiene un gen que codifica una proteína extraña o un fragmento operativo o uno de sus mutantes.

Por lo tanto, por ejemplo, el vector adenovírico de esta invención puede contener un gen extraño para la expresión de una proteína eficaz en la regulación del ciclo celular, tal como p53, Rb o mitosina o en la inducción de la muerte celular, tal como la timidina cinasa del gen suicida condicional. (Este último debe ser utilizado junto con el metabolito de timidina cinasa para ser eficaz).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta un vector adenovírico recombinante de esta invención. Este montaje se montó como se muestra en la Figura 1. El virus resultante lleva una deleción 5' de secuencias adenovíricas que se extienden desde el nucleótido 356 al 4.020 y elimina los genes E1a y E1b así como la secuencia de codificación completa de la proteína IX, dejando la secuencia de poliadenilación compartida por los genes E1b y pIX intactos para su utilización en la transcripción de la terminación de cualquier gen deseado.

La Figura 2 presenta la secuencia de aminoácidos de p110^{RB}.

La Figura 3 presenta una secuencia de ADN que codifica una proteína supresora del tumor retinoblastoma.

La Figura 4 presenta el esquema de los montajes de p53 recombinante/adenovirus con el alcance de esta invención. Los recombinantes p53 están basados en Ad5 y han tenido la zona E1 de los nucleótidos 360 a 3.325 sustituida por un ADNc de p53 completo de 1,4 kb dirigido por los activadores de Ad2 MLP (A/M/53) o CMV humano (A/C/53) seguido del ADNc principal del tripartito Ad2. El virus de referencia A/M presenta las mismas deleciones de Ad5 que el virus A/M/53 pero carece de la inserción del ADNc de p53 de 1,4 kb. La secuencia de E1b restante (705 nucleótidos), ha sido eliminada para crear los montajes A/M/N/53 y A/C/N/53 eliminados de la proteína IX. Estos montajes también tienen una deleción Xba I de 1,9 kb dentro de la zona E3 del adenovirus tipo 5.

Las Figuras 5A y 5B presentan la expresión de la proteína p53 en las células tumorales infectadas con A/M/53 y A/C/53. Figura 5A) Se infectaron células Saos-2 (osteosarcoma) a las multiplicidades de infección (MOI) indicadas con el virus purificado A/M/53 o A/C/53 y se recogieron 24 horas después. Se utilizó la pAb 1801 del anticuerpo p53 para teñir inmunotransferencias de muestras cargadas a concentraciones iguales de proteína total. Concentración igual de proteína de extractos celulares SW480, que sobrexpresa la proteína mutante p53 se utilizó como marcador para el tamaño de p53. "O" bajo el encabezamiento A/C/53 indica una infección simulada que contiene el lisado sin tratar de Saos-2. Figura 5B) Se infectaron células Hep 3B (carcinoma hepatocelular) con virus de A/M/53 o A/C/53 a la MOI indicada y se analizaron como en el apartado A). La flecha indica la posición de la proteína p53.

Las Figuras 6A a 6C presentan el cambio de morfología de Saos-2 dependiente de p53. Las células Saos-2 subconfluentes (1 \times 10^{5} células/placa de 10 cm) estaban sin infectar (A), infectadas a una MOI = 50 con (B) el virus A/M de referencia o (C) el virus A/C/53. Se fotografiaron las células 72 horas después de la infección.

La Figura 7 presenta la inhibición de la síntesis del ADN dependiente de p53 en las líneas celulares de tumor humano por A/M/N/53 y A/C/N/53. Se infectaron nueve líneas celulares tumorales diferentes con adenovirus A/M (-x-x-) de referencia, o virus A/M/N/53 (-\Delta-\Delta-) o A/C/N53 (-O- O-) que expresan a p53 a MOI creciente como se indica. Se indica el tipo de tumor y el estado de p53 para cada línea celular (wt = tipo natural, nulo = ninguna proteína expresada, mut = proteína mutante expresada). Se midió la síntesis de ADN 72 horas después de la infección como se describe más adelante en el Experimento nº II. Los resultados proceden de mediciones por triplicado a cada dosis (media +/- SD) y se representan como % de la referencia media frente a MOI. * Las células H69 se probaron solamente con virus A/M y A/M/N53.

La Figura 8 presenta la tumorigenicidad de las células Saos-2 infectadas con p53 en ratones lampiños. Se infectaron células Saos-2 con el virus A/M de referencia o el A/M/N/53 recombinante de p53 a MOI = 30. Se inyectaron por vía subcutánea las células tratadas en los costados de los ratones lampiños y se midieron las dimensiones del tumor (como se describe en el Experimento nº II) dos veces a la semana durante 8 semanas. Los resultados se representan como tamaño del tumor frente a los días después de la implantación de la célula tumoral para ambas células tratadas A/M de referencia (-x-x-) y A/M/N/53 (- \Delta-\Delta-). Las barras de error representan el tamaño del tumor medio =/- SEM para cada grupo de 4 animales en cada punto de tiempo.

La Figura 9 es la expresión del ARN de rAd/p53 en tumores demostrados. Se inyectaron por vía subcutánea células H69 (SCLC) en ratones lampiños y se dejaron desarrollar los tumores durante 32 días hasta que alcanzaron un tamaño de aproximadamente 25 a 50 mm^{3}. Se distribuyeron al azar los ratones y se les inyectó por vía peritumoral 2 \times 10^{9} pfu de virus A/C/\beta-gal de referencia o A/C/53. Se escindieron los tumores 2 y 7 días tras la inyección y se preparó poliA ARN de cada muestra de tumor. Se realizó la RT-PCR utilizando concentraciones iguales de ARN y cebadores específicos para el mensaje de p53 recombinante. La ampliación por PCR fue durante 30 ciclos a 94ºC 1 min., 55ºC 1,5 min., 72ºC 2 min. y un periodo de prolongación final de 10 min., 72ºC en un ciclador térmico Omnigen (Hybaid). Los cebadores de PCR utilizados fueron un ADN principal tripartito en 5' (5'-CGCCACCGAGGGACCCTGAGC
GAGTC-3') y un cebador de p53 en 3' (5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Las bandas 1, 2, 4 y 5 son muestras tratadas con p53 escindidas el día 2 o 7 como se indica. Las bandas 3 y 6 son de tumores tratados con \beta-gal. Las bandas 7, 8 y 9 son réplicas de las bandas 4, 5 y 6 respectivamente, ampliadas con cebadores de actina para verificar la carga igual. La banda 10 es una referencia positiva que utiliza un plásmido que contiene tripartito/p53.

Las Figura 10A y 10B presentan la supresión del tumor in vivo y el aumento del tiempo de supervivencia con A/M/N/53. Las células H69 (SCLC) del tumor se inyectaron por vía subcutánea en ratones lampiños y se dejaron desarrollar durante 2 semanas. Se administraron dos veces a la semana durante un total de 8 dosis inyecciones peritumorales de tampón solo (- - -), adenovirus A/M de referencia (-x-x-) o A/M/N/53 (-\Delta-\Delta-), ambos virus (2 \times 10^{9} pfu/inyección). Se midieron las dimensiones del tumor dos veces a la semana y se estimó el volumen del tumor como se describe en el Experimento nº II. A) Se representa el tamaño del tumor para cada virus frente al tiempo (días) después de la inoculación de células H69. Las barras de error indican el tamaño medio del tumor +/- SEM para cada grupo de 5 animales. Las flechas indican los días de las inyecciones de virus. B) Se controló la supervivencia de los ratones y se representa la fracción de ratones supervivientes por grupo frente al tiempo tras la inoculación de células H69 tratadas con tampón solo (- - - -), virus A/M de referencia (··· ··· ···) o A/M/N/53 (- - -).

Las Figuras 11A a 11C presentan cartografías de los montajes del plásmido recombinante. Los plásmidos se construyeron como se detalla a continuación. Las líneas en negrita en los montajes indican los genes de interés mientras que el tipo en negrita indica la zona de restricción utilizada para generar los fragmentos que deben ligarse para formar el plásmido subsiguiente como indican las flechas. En la Figura 11A, el plásmido pACNTK se construyó subclonando el gen HSV-TK del pMLBKTK (nº de ATCC 39369) en el polienlazador de un vector de clonación, seguido de aislamiento del gen TK con los extremos deseados para la clonación en el vector de pACN. El vector pACN contiene secuencias adenovíricas necesarias para producir la recombinación in vivo destinada a formar el adenovirus recombinante (véase la Figura 12). En la Figura 11B, se presenta la construcción del plásmido pAANTK empezando por los fragmentos ampliados por PCR que codifican el potenciador de \alpha-fetoproteína (AFP-E) y zonas del activador (AFP-P) subclonadas a través de varias etapas en un plásmido final en el que el potenciador y activador de AFP están aguas arriba del gen HSV-TK seguido de las secuencias del adenovirus Tipo 2 necesarias para que se produzca la recombinación in vivo para formar el adenovirus recombinante. En la Figura 11C, se presenta la construcción del plásmido pAANCAT empezando por el aislamiento del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de un plásmido disponible en el mercado y subclonándolo en el plásmido pAAN (véase anteriormente), generando el plásmido final pAANCAT en el que el potenciador/activador de AFP dirige la transcripción del gen CAT en un fondo de la secuencia de adenovirus.

La Figura 12 es una cartografía esquemática de los adenovirus recombinantes ACNTK, AANTK y AANCAT. Para construir adenovirus recombinantes a partir de los plásmidos descritos en la Figura 11, se linealizaron 4 partes (20 \mug) del plásmido pACNTK, pAANTK o pAANCAT con Eco R1 y se cotransfectaron con una parte (5 \mug) del fragmento grande de adenovirus recombinante digerido con Cla 1 (rAC\beta- gal) que contenía una deleción de la zona E3 (Wills et al., 1994). En los virus resultantes, los nucleótidos 360 a 4.021 de Ad 5 se sustituyeron por el activador de CMV y el ADNc principal tripartito (TPL) o por el potenciador de \alpha-fetoproteína y el activador (AFP) que dirige la expresión del gen TK o por CAT de HSV-1 como se indica. Los adenovirus recombinantes resultantes se digieren con ACNTK, AANTK y AANCAT respectivamente.

La Figura 13 presenta la especificidad del activador de la expresión de CAT en los vectores adenovíricos recombinantes. Se infectaron dos (2) \times 10^{6} de las líneas celulares diseñadas a las MOI = 30 o 100 del adenovirus recombinante AANCAT como se indica o se dejaron sin infectar (UN). Las células Hep G2 y Hep 3B expresan la \alpha-fetoproteína mientras que las demás líneas celulares no. Después de tres días, se recogieron las células, se ajustaron los volúmenes de extracto para concentraciones de proteína totales iguales y se midió la actividad de CAT como se describe en el apartado Métodos, más adelante. Un número igual de células no infectadas sirvió como referencias individuales para la actividad de fondo de CAT, mientras que el cloranfenicol marcado con ^{14}C (solamente ^{14}C) y el extracto de la línea celular estable (B21) que expresa la actividad de CAT sirvió como referencias negativas y positivas respectivamente. La conversión del porcentaje de acetil CoA está indicada, demostrando que la expresión de CAT está limitada a aquellas células que expresan la \alpha-fetoproteína.

La Figura 14 presenta los efectos del tratamiento de TK/GCV en las líneas celulares del carcinoma hepatocelular y los efectos de la especificidad del activador. Se infectaron las líneas celulares Hep-G2 (AFP positiva) y HLF (AFP negativa) durante la noche con virus ACNTK [-\Delta-], AANTK [-\ding{115}-], o ACN de referencia [-\Box-] a una multiplicidad de infección de 30 y se trataron sucesivamente con una sola dosis de ganciclovir a las concentraciones indicadas. Se evaluó la proliferación celular añadiendo ^{3}H-timidina a las células aproximadamente 18 horas antes de la recogida. La incorporación de ^{3}H-timidina en el ácido nucleico celular se midió 72 horas después de la infección (Top Count, Packard y se expresó en porcentaje (media +/- S.D) de la referencia sin tratar. Los resultados presentan una inhibición de la proliferación dependiente de la dosis no selectiva con el montaje dirigido por CMV, mientras TK dirigida por AFP inhibe selectivamente Hep-G2.

La Figura 15 presenta la citotoxicidad de ACNTK más ganciclovir en HCC. Se infectaron HLF a una MOI de 30 con ACNTK [-\bullet-] o el virus de referencia ACN [-\Box-] y se trataron con ganciclovir a las dosis indicadas. Setenta y dos (72) horas después del tratamiento con ganciclovir, se midió por colorimetría la cantidad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el sobrenadante celular y se representó (media +/- SEM) frente a la concentración de ganciclovir para los dos grupos de virus tratados.

Las Figuras 16A y 16B presentan el efecto de ACNTK más ganciclovir sobre los tumores de carcinoma hepatocelular (HCC) probados en ratones lampiños. Se inyectaron por vía subcutánea uno (1) \times 10^{7} células Hep 3B en el costado de ratones lampiños hembra y se dejaron desarrollar durante 27 días. Los ratones recibieron a continuación inyecciones intratumorales y peritumorales de virus ACNTK [-\bullet-] o ACN de referencia [-\Box-] (1 \times 10^{9} ui en un volumen de 100 \mul) cada dos días para un total de tres dosis (indicadas por flechas). Las inyecciones de ganciclovir (100 mg/kg ip) comenzaron 24 horas después de la dosis inicial de virus y continuaron durante un total de 10 días. En la Figura 6A, se representan las dimensiones del tumor para cada virus frente a los días después de la inyección (media +/- SEM). En la Figura 6B, el peso corporal para cada grupo animal tratado con virus se representa como media +/- SEM frente a los días después de la infección.

Descripción detallada de la invención

Para reducir la frecuencia de la contaminación con adenovirus natural, es deseable mejorar el virus o la línea celular para reducir la probabilidad de recombinación. Por ejemplo, un adenovirus de un grupo con baja homología con los virus del grupo C podría utilizarse para modificar genéticamente virus recombinantes con poca propensión a la recombinación con las secuencias Ad5 en células 293. Sin embargo, un medio alternativo, más fácil de reducir la recombinación entre las secuencias víricas y celulares consiste en aumentar el tamaño de la deleción en el virus recombinante y reducir de este modo la extensión de la secuencia compartida entre él y los genes Ad5 en las células 293.

Las deleciones que se extienden más allá de 3,5 kb del extremo 5' del genoma adenovírico afectan al gen para la proteína IX adenovírica y no se han considerado deseables en los vectores adenovíricos (véase más adelante).

El gen de la proteína IX de los adenovirus codifica un componente menor de la cápside adenovírica externa que estabiliza el grupo de nuevo hexones que componen la mayoría de la cápside vírica (Stewart (1993)). Basándose en el estudio de los mutantes de la deleción del adenovirus, se consideró inicialmente que la proteína IX no es un componente esencial del adenovirus, aunque su ausencia se asociara a la inestabilidad térmica mayor que la observada con el virus natural (Colby y Shenk (1981)). Más recientemente se descubrió que la proteína IX es esencial para el empaquetamiento del ADN vírico completo en cápsides y que en ausencia de la proteína IX, solamente los genomas al menos 1 kb más pequeños que los naturales podrían propagarse como virus recombinantes (Ghosh-Choudhury et al. (1987)). Dada esta limitación de empaquetamiento, las deleciones de la proteína IX deliberadamente no se han considerado en el diseño de los vectores adenovíricos.

Por ejemplo, el vector adenovírico dado a conocer en Venkatesh L. K. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) vol. 87, págs. 8746-8750) contiene una deleción en la zona E1a/E1b que se extiende desde la secuencia de restricción PvuII a una secuencia de restricción BgIII, de modo que el gen que codifica la proteína IX permanece intacto.

En esta solicitud, se hace referencia a los libros de texto habituales de biología molecular que contienen definiciones, métodos y medios para realizar las técnicas básicas, comprendidas en la presente invención. Véase por ejemplo Sambrook et al. (1989) y varias referencias citadas en la presente memoria.

Al contrario de lo que se conoce en la técnica, la presente invención reivindica la utilización de adenovirus recombinantes que llevan deleciones del gen de la proteína IX como un medio para reducir el riesgo de la contaminación por adenovirus natural en preparaciones de virus para su utilización en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas tal como la terapia génica. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "recombinante" pretende significar una descendencia formada como resultado de la modificación genética. Estas deleciones puede eliminar unos 500 a 700 pares de bases adicionales de la secuencia del ADN que está presente en los virus eliminados de E1 convencionales y está disponible para la combinación con las secuencias Ad5 integradas en las células 293. Los adenovirus recombinantes basados en cualquier virus del grupo C serotipo 1, 2, 5 y 6, se incuban en la presente invención. Así mismo está comprendido en esta invención un virus recombinante híbrido basado en Ad2/Ad5 que expresa el ADNc de p53 humano procedente del activador tardío principal del adnovirus tipo 2. Este montaje se montó como se muestra en la Figura 1. El virus resultante lleva una deleción en 5' de las secuencias adenovíricas que se extienden desde aproximadamente el nucleótido 357 al 4.020 y elimina los genes E1a y E1b así como la secuencia de codificación completa de la proteína IX, dejando la secuencia de poliadenilación compartida por los genes E1b y de la proteína IX íntegros para su utilización en la terminación de la transcripción de cualquier gen deseado. En la Figura 4 se presenta una forma de realización independiente. Como alternativa, la deleción puede extenderse unos 30 a 40 pares de bases adicionales sin afectar el gen adyacente a la proteína IVa2, aunque en este caso se proporciona una señal de poliadenilación exógena para terminar la transcripción de los genes insertados en el virus recombinante. El virus inicial construido con esta deleción se propaga fácilmente en las células 293 sin pruebas de contaminación vírica natural y dirige la expresión de p53 robusta de la unidad de transcripción insertada en el punto de la deleción.

La capacidad de inserción de los virus recombinantes que llevan la deleción de la proteína IX descrita anteriormente es aproximadamente de 2,6 kb. Ésta es suficiente para muchos genes incluyendo el ADNc de p53. La capacidad de inserción puede aumentarse introduciendo otras deleciones en el eje central adenovírico, por ejemplo, deleciones en las zonas primarias 3 o 4 (para estudios véase: Graham y Prevec (1991)). Por ejemplo, la utilización de un eje central adenovírico que contiene una deleción de 1,9 kb de la secuencia no esencial en la región primaria 3. Con esta deleción adicional, la capacidad de inserción del vector se aumenta en aproximadamente 4,5 kb, suficientemente grande para muchos ADNc mayores, incluyendo la del gen supresor del tumor de retinoblastoma.

Un vector de expresión del adenovirus recombinante caracterizado por una deleción total del ADN adenovírico con la proteína IX y que tiene un gen que codifica una proteína extraña o un fragmento operativo o uno de sus mutantes se proporciona en esta invención. Estos vectores son útiles para la producción recombinante segura de polipéptidos y proteínas para diagnóstico y terapéuticos, y de mayor importancia, para la introducción de genes en terapia génica. Por esta razón, por ejemplo, el vector adenovírico de esta invención puede contener un gen extraño para la expresión de una proteína eficaz para regular el ciclo celular, tal como p53, Rb o mitosina, o para inducir la muerte celular, tal como la timidina cinasa del gen suicida condicional. (Esta última debe utilizarse junto con un metabolito de timidina cinasa para que sea eficaz). En los vectores de esta invención puede utilizarse cualquier casete de expresión. Un "casete de expresión" significa una molécula de ADN que tiene un activador/potenciador de transcripción tal como el potenciador activador de CMV, etc., un gen extraño y en algunas realizaciones definidas más adelante, una señal de poliadenilización. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "gen extraño" significa una molécula de ADN no presente en la orientación y posición exactas como la molécula de ADN de contrapartida hallada en el adenovirus natural. El gen extraño es una molécula de ADN de hasta 4,5 kilobases. "Vector de expresión" significa un vector que produce la expresión de las secuencias del ADN insertado cuando se propagan en una célula huésped adecuada, es decir, la proteína o polipéptido codificado por el ADN es sintetizada por el sistema del anfitrión.

Los activadores inducibles también pueden utilizarse en el vector adenovírico de esta invención. Estos activadores iniciarán la transcripción solamente en presencia de otra molécula. Ejemplos de activadores inducibles incluyen los que pueden obtenerse a partir de un gen de interferón \beta, un gen de choque térmico, un gen de metalotionina o los que pueden obtenerse de los genes sensibles a la hormona esteroide. La expresión específica del tejido ha sido bien caracterizada en el campo de la expresión génica y los activadores específicos del tejido e inducibles tales como éstos son muy bien conocidos en la materia. Estos genes se utilizan para regular la expresión del gen extraño una vez ha sido introducido en la célula diana.

Esta invención también proporciona un vector de expresión de adenovirus recombinante, como el descrito anteriormente, con deleciones menos extensas de la secuencia del gen con la proteína IX que se extiende desde 3.500 bp de los terminales víricos 5' hasta aproximadamente 4.000 bp, en una realización. En una realización aparte, el vector de expresión de adenovirus recombinante puede tener una deleción adicional de una secuencia de ADN no esencial en la zona 3 y/o 4 inicial del adenovirus y/o una deleción de las secuencias de ADN denominadas E1a y E1b del adenovirus. En esta realización, el gen extraño es una molécula de ADN de un tamaño de hasta 4,5 kilobases.

Una realización adicional tiene una deleción de hasta 40 nucleótidos colocados en 3' con respecto a la deleción E1a y E1b y pIX y una molécula de ADN extraña que codifica una señal de poliadenilación insertada en el vector recombinante en una posición con respecto al gen extraño para regular la expresión del gen extraño.

Para los fines de esta invención, el vector de expresión del adenovirus recombinante puede proceder de adenovirus del grupo natural, serotipo 1, 2, 5 o 6.

En una realización, el vector de expresión del adenovirus recombinante tiene un gen extraño que codifica una proteína supresora del tumor operativa o uno de sus fragmentos biológicamente activo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "operativo" referido a un gen supresor del tumor, se refiere a los genes supresores del tumor que codifican las proteínas supresoras del tumor que inhiben eficazmente una célula del comportamiento como célula tumoral. Los genes operativos pueden incluir, por ejemplo, genes naturales normales y modificaciones de genes normales que conservan su capacidad para codificar proteínas supresoras tumorales eficaces y otros genes antitumorales tal como una proteína suicida condicional o una toxina.

Asimismo, "no operativo" tal como se utiliza en la presente memoria es sinónimo de "inactivado". Los genes no operativos o defectuosos pueden producirse mediante una variedad de fenómenos incluyendo por ejemplo las mutaciones, deleciones, metilación puntuales y otros conocidos por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "fragmento activo" de un gen incluye las fracciones más pequeñas del gen que conservan la capacidad de codificar proteínas con actividad supresora del tumor. p56^{RB}, descrito con más detalle más adelante, es solamente un ejemplo de un fragmento activo de un gen supresor del tumor operativo. Las modificaciones de los genes supresores del tumor se contemplan también dentro del significado de un fragmento activo, tales como las adiciones, deleciones o sustituciones, siempre que se conserve la actividad funcional del gen no modificado.

Otro ejemplo de gen supresor del tumor es el retinoblastoma (RB). Las secuencias completas del nucleótido del ADNc de RB y las secuencias de aminoácidos previstas de la proteína RB resultante (denominada p110^{RB}) se muestran en Lee et al. (1987) y en la Figura 3. Asimismo es útil para expresar la proteína del supresor del tumor retinoblastoma una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 o que tiene la secuencia de ADN mostrada en la Figura 3. También es útil una versión truncada de p110^{RB}, denominada p56^{RB}. Para la secuencia de p56^{RB}, véase Huang et al. (1991). Pueden utilizarse otros genes del supresor tumoral en los vectores de esta invención. A título de ilustración solamente, éstos pueden ser la proteína p16 (Kamb et al. (1994)), la proteína p21, la proteína WT1 del tumor de Wilms, mitosina, h-NUC o la proteína DCC del carcinoma de colon. La mitosina se describe en X. Zhu y W-H Lee, solicitud U.S. nº de serie 08/141.239, presentada el 22 de octubre de 1993 y una continuación subsiguiente en parte por los mismos inventores, número de etiqueta del apoderado P-CJ 1191, presentada el 24 de octubre de 1994. Asimismo, h-NUC está descrita por W-H Lee y P-L Chen, solicitud U.S. nº de serie 08/170.586 presentada el 20 de diciembre de 1993.

Como es sabido por los expertos en la materia, el término "proteína" significa un polímero lineal de aminoácidos unido a una secuencia específica por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido" se refiere a una de las dos formas D o L del estereoisómero del aminoácido, a menos que se designe específicamente de otra manera. También están comprendidas las proteínas o los péptidos equivalentes, p. ej., con actividad biológica de la proteína supresora del tumor natural purificada. "Proteínas equivalentes" y "polipéptidos equivalentes" se refieren a los compuestos que parten de la secuencia lineal de las proteínas o polipéptidos naturales, pero que tienen sustituciones de aminoácidos que no cambian su actividad biológicamente. Estos equivalentes pueden diferenciarse de las secuencias naturales por la sustitución de uno o más aminoácidos con aminoácidos relacionados, por ejemplo, asimismo aminoácidos con carga o la sustitución o modificación de cadenas laterales o grupos funcionales.

Así mismo está comprendida dentro de la definición de proteína operativa supresora del tumor cualquier proteína cuya presencia reduzca la oncogenicidad, malignidad o fenotipo hiperproliferante de la célula huésped. Ejemplos de proteínas supresoras del tumor dentro de esta definición incluyen, pero no se limitan a p110^{RB}, p56^{RB}, mitosina, h-NUC y p53. "Oncogenicidad" significa que tiene capacidad para formar tumores o que es capaz de producir formación tumoral y es sinónimo de desarrollo neoplásico. "Malignidad" pretende describir una célula tumorígena que tiene capacidad de metastasizar y poner en riesgo la vida del organismo anfitrión. "Fenotipo hiperproliferante" describe una célula que crece y se divide a una velocidad más allá de los límites normales de crecimiento para este tipo de célula. "Neoplásico" también incluye las células que carecen de la proteína operativa endógena supresora del tumor o la incapacidad de la célula para expresar el ácido nucleico endógeno que codifica una proteína operativa supresora del tumor.

Un ejemplo de un vector de esta invención es un vector de expresión del adenovirus recombinante que tiene un gen extraño que codifica la proteína p53 o uno de sus fragmentos activos es proporcionado por esta invención. La secuencia de codificación para el gen p53 se indica a continuación en la Tabla 1.

TABLA 1

100

Cualquiera de los vectores de expresión descritos en la presente memoria son útiles como composiciones para diagnóstico o terapia. Pueden utilizarse vectores para cuya identificación muchos genes supresores del tumor serían útiles en terapia génica. Por ejemplo, una muestra de células sospechosas de ser neoplásicas pueden eliminarse de un paciente y de un mamífero. Las células pueden ponerse en contacto a continuación, en condiciones adecuadas y con una cantidad eficaz de un vector recombinante de esta invención que tiene insertado en el mismo un gen extraño que codifica uno de los diversos genes operativos supresores del tumor. Si la introducción de este gen invierte el fenotipo maligno puede medirse mediante la formación de colonias en agar-agar blando o mediante la formación del tumor en ratones lampiños. Si el fenotipo maligno se invierte, entonces se determina que este gen extraño es un candidato positivo para la terapia génica lograda para el paciente o el mamífero. Cuando se utilizan farmacéuticamente, pueden combinarse con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la materia e incluyen soluciones acuosas tal como la solución salina fisiológicamente tamponada u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva) o ésteres orgánicos inyectables. Puede utilizarse un excipiente farmacéuticamente aceptable para administrar las composiciones instantáneas a una célula in vitro o a un paciente in vivo.

Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir la absorción del agente. Un compuesto fisiológicamente aceptable puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de peso molecular bajo u otros estabilizantes o excipientes. Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son particularmente útiles para impedir el crecimiento o actuación de los microorganismos. Varios conservantes son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la materia debe conocer que la elección de un excipiente farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración del polipéptido y de las características fisicoquímicas determinadas del polipéptido específico. Por ejemplo, un compuesto fisiológicamente aceptable tal como el monoestearato de aluminio o la gelatina es particular útil como agente retardador, que prolonga la velocidad de absorción de una composición farmacéutica administrada a un paciente. Ejemplos adicionales de excipientes, estabilizantes o adyuvantes pueden encontrarse en Martin, Remington's Pharm. Sci., 15ª ed. (Mack Publ. Co., Easton, 1975). La composición farmacéutica también puede incorporarse, si se desea, en liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (Gregoriadis, Liposome Technology, vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida 1984)). Los liposomas, por ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros lípidos, son excipientes no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente fáciles de preparar y administrar.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "composición farmacéutica" se refiere a cualquiera de las composiciones de materiales descritos en la presente memoria en combinación con uno o más de los excipientes farmacéuticamente aceptable anteriores. Las composiciones pueden administrarse a continuación terapéutica o profilácticamente. Pueden ponerse en contacto con la célula huésped in vivo, ex vivo o in vitro, en una cantidad eficaz. Los medios in vitro y ex vivo de poner en contacto las células huésped se proporcionan más adelante. Cuando se ponen en práctica in vivo, los métodos de administración de un producto farmacéutico que contiene el vector de esta invención, son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no se limitan a, la administración oral, intratumoral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. La administración puede efectuarse en continuo o intermitentemente y variará con el paciente y la enfermedad que deba tratarse, p. ej., como es el caso con otras composiciones terapéuticas (Landmann et al. (1992); Aulitzky et al. (1991); Lantz et al. (1990); Supersaxo et al. (1988); Demetri et al. (1989) ; y LeMaistre et al. (1991)).

Además esta invención proporciona una célula huésped procariótica o eucariótica transformada, por ejemplo una célula animal o una célula de mamífero, que tiene insertado un vector de expresión de adenovirus recombinante descrito anteriormente. Las células procarióticas adecuadas incluyen pero no se limitan a las células bacterianas tales como las células de E. coli. Los métodos de transformación de células huésped con vectores retrovíricos son conocidos en la materia, véase Sambrook et al. (1989) e incluyen, pero no se limitan a, la transfección, electroporación y microinyección.

Tal como se utiliza en toda esta aplicación, el término animal pretende ser sinónimo de mamífero e incluye, pero no se limita a bovino, porcino, felino, simio, canino, equino, murino, rata o humano. Las células huésped adicionales incluyen, pero no se limitan a, cualquier célula neoplásica o tumoral, tal como osteosarcoma, carcinoma de ovario, carcinoma de mama, melanoma, hepatocarcinoma, cáncer pulmonar, cáncer cerebral, cáncer colorrectal, célula hematopoyética, cáncer de próstata, carcinoma cervical, retinoblastoma, carcinoma de esófago, cáncer de vejiga, neuroblastoma o cáncer renal.

Además, cualquier línea celular eucariótica capaz de expresar E1a y E1b o E1a, E1b y pIX es un anfitrión adecuado para este vector. En una realización, una célula huésped eucariótica adecuada es la línea celular 293 disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. 20231.

Cualquiera de las células huésped transformadas descritas en la presente memoria son útiles como composiciones para diagnóstico o terapia. Cuando se utilizan farmacéuticamente, pueden combinarse con varios excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia y, por ejemplo, están descritos anteriormente. Las composiciones pueden administrarse a continuación terapéutica o profilácticamente, en cantidades eficaces, descritas con más detalle a continuación.

Se proporciona asimismo un método de transformación de una célula huésped. Este método proporciona la puesta en contacto de una célula huésped, es decir, una célula huésped procariótica o eucariótica, con alguno de los vectores de expresión descritos en la presente memoria y en condiciones adecuadas. La puesta en contacto puede efectuarse in vitro, in vivo o ex vivo, utilizando los métodos bien conocidos en la materia (Sambrook et al. (1989)) y utilizando cantidades eficaces de los vectores de expresión. En esta invención se proporciona también un método de producción de una proteína recombinante o de un polipéptido cultivando la célula huésped transformada en condiciones adecuadas que favorezcan la transcripción y la traducción del gen extraño insertado. Los métodos de expresión recombinante en una variedad de células huésped, tales como células de mamífero, levadura, insecto o bacterianas, son ampliamente conocidos, incluyendo los descritos en Sambrook et al., supra. El gen extraño traducido puede aislarse a continuación por métodos convencionales, tal como la purificación en columna o la purificación utilizando un anticuerpo antiproteína. La proteína o polipéptido aislados también se pretende que esté dentro del alcance de esta invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, purificado o aislado significa sustancialmente exento de proteínas o ácidos nucleicos naturales normalmente asociados con la proteína o el polipéptido en el medio natural o de la célula huésped.

Esta invención también proporciona animales no humanos que tienen insertados en ellos los vectores de expresión o las células huésped transformadas de esta invención. Estos animales "transgénicos" se preparan utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo como los descritos en la patente U.S. nº 5.175.384 o por técnicas convencionales de terapia ex vivo, como las descritas en Culver et al. (1991).

Como se muestra en detalle a continuación, los adenovirus recombinantes que expresan una p53 natural del supresor del tumor, como la descrita anteriormente, pueden inhibir eficazmente la síntesis del ADN y suprimir el crecimiento de un amplio espectro de tipos de células tumorales humanas, incluyendo las dianas clínicas. Además, los adenovirus recombinantes pueden expresar genes de supresión del tumor tales como p53 en un tumor demostrado in vivo sin depender de la inyección directa en el tumor o antes del tratamiento ex vivo de las células cancerosas. La p53 expresada es operativa y suprime eficazmente el crecimiento del tumor in vivo y aumenta significativamente el tiempo de supervivencia en un modelo de ratón lampiño de cáncer pulmonar humano.

De este modo, los vectores de esta invención son particularmente adecuados para la terapia génica. Por consiguiente, los métodos de terapia génica que utilizan estos vectores están dentro del alcance de esta invención. El vector se purifica y a continuación se administra al paciente una cantidad eficaz in vivo o ex vivo. Los métodos de terapia génica son bien conocidos en la materia, véase, por ejemplo Larrick, J. W. y Burck, K. L. (1991) y Kreigler, M. (1990). "Paciente" significa cualquier paciente animal, mamífero, rata, murino, bovino, porcino, equino, canino, felino o humano. Cuando el gen extraño codifica un gen supresor del tumor u otra proteína antitumoral, el vector es útil para tratar o reducir las células hiperproliferantes en un paciente, para inhibir la proliferación tumoral en un paciente o para mejorar una patología específica relacionada. Las células hiperproliferantes patológicas son características de las siguientes enfermedades, hipertiroidismo-enfermedad de Graves-Basedow, psoriasis, hipertrofia prostática benigna, síndrome de Li-Fraumeni incluyendo el cáncer de mama, sarcomas y otros neoplasmas, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer pulmonar, varias leucemias y linfomas. Ejemplos de células hiperproliferantes no patológicas se encuentran, por ejemplo, en las células epiteliales del conducto durante el desarrollo de la lactancia y también en las células asociadas a la reparación de la herida. Las células hiperproliferantes patológicas presentan de manera característica pérdida de inhibición de contacto y una disminución de su capacidad para adherirse selectivamente que implica un cambio en las propiedades superficiales de la célula y una degradación adicional en la comunicación intercelular. Estos cambios incluyen el estímulo para dividir y la capacidad para segregar enzimas proteolíticas.

Además, la presente invención se refiere a un método para reducir una muestra adecuada de células hiperproliferantes patológicas de mamífero que contaminan los precursores hematopoyéticos durante la reconstrucción de la médula ósea mediante la introducción de un gen supresor del tumor natural en una preparación celular que utiliza el vector de esta invención (si procede de la sangre periférica autóloga o de la médula ósea). Tal como se utiliza en la presente memoria, una "muestra adecuada" se define como una preparación celular heterogénea obtenida de un paciente, p. ej., una población mixta de células que contienen células tanto fenotípicamente normales como patogénicas. "Administrar" incluye, pero no se limita a, introducir en la célula o en el paciente por vía intravenosa, mediante inyección directa en el tumor, mediante inyección intratumoral, mediante administración intraperitoneal, mediante administración de aerosol en el pulmón o por vía tópica. Dicha administración puede combinarse con un excipiente farmacéuticamente aceptado, descrito anteriormente.

La expresión "oncogenicidad reducida" significa las células tumorales que han sido transformadas en células menos tumorígenas o no tumorígenas. Las células con oncogenicidad reducida no forman tumores in vivo o presentan un periodo de retraso prolongado de semanas a meses antes de la aparición del crecimiento del tumor in vivo y/o de la masa tumoral tridimensional con crecimiento más lento en comparación con los tumores que tienen el gen supresor del tumor inactivado o no operativo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" significa la cantidad de vector o proteína anticancerosa que consigue un resultado positivo en el control de la proliferación celular. Una dosis contiene, por ejemplo, desde aproximadamente 10^{8} a aproximadamente 10^{13} unidades infecciosas. Un ciclo típico de tratamiento consistiría en una de dichas dosis al día durante un periodo de cinco días. Una cantidad eficaz variará con la patología o enfermedad en tratamiento, por el paciente y su estado y otros factores bien conocidos por los expertos en la materia. Las cantidades eficaces son determinadas fácilmente por los expertos en la materia.

También está dentro del alcance de esta invención un método de mejora de una patología caracterizada por células hiperproliferantes o por el defecto genético en un paciente mediante la administración al paciente de una cantidad eficaz de un vector descrito anteriormente que contiene un gen extraño que codifica un producto génico con capacidad para mejorar la patología, en condiciones adecuadas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "defecto genético" significa cualquier enfermedad o anomalía que proceda de factores hereditarios, tal como la anemia depranocítica o la enfermedad de Tay-Sachs.

Esta invención también proporciona un método para reducir la proliferación de las células tumorales en un paciente introduciendo en la masa tumoral una cantidad eficaz de un vector de expresión adenovírico que contiene un gen antitumoral aparte del gen supresor del tumor. El gen antitumoral puede codificar, por ejemplo, la timidina cinasa (TK). Se administra a continuación al paciente una cantidad eficaz de un agente terapéutico, que en presencia del gen antitumoral es tóxico para la célula. En el caso específico de la timidina cinasa, el agente terapéutico es un metabolito de timidina cinasa tal como ganciclovir (GCV), 6-metoxipurina arabinonucleósido (araM) o uno de sus equivalentes operativos. Tanto el gen de timidina cinasa como el metabolito de timidina cinasa deben utilizarse simultáneamente al ser tóxicos para la célula huésped. Sin embargo, en su presencia, GCV se fosforila y se convierte en un inhibidor potente de síntesis de ADN mientras que araM se convierte en el anabolito citotóxico araATP. Pueden utilizarse también otros genes antitumorales en combinación con el correspondiente agente terapéutico para reducir la proliferación de las células tumorales. Dichas otras combinaciones del gen y del agente terapéutico son conocidos por los expertos en la materia. Otro ejemplo sería el vector de esta invención que expresa la enzima citosina desaminasa. Dicho vector se utilizaría junto con la administración del fármaco 5-fluorouracilo (Austin y Huber, 1993) o el gen Deo \Delta de E. coli descrito recientemente en comparación con 6-metil-purina-2'- desoxirribonucleósido (Sorscher et al. 1994).

Como en la utilización de los genes supresores del tumor descritos anteriormente, la utilización de otros genes antitumorales, ya sea solos o en combinación con el agente terapéutico apropiado proporciona un tratamiento para el crecimiento incontrolado de las células o de la proliferación característica de los tumores y cánceres. Así, esta invención proporciona una terapia para interrumpir el crecimiento celular incontrolado en el paciente aliviando de este modo los síntomas de la enfermedad o la caquexia presente en el paciente. El efecto de este tratamiento incluye, pero no se limita al tiempo de supervivencia prolongado del paciente, a la reducción de la masa tumoral o sobrecarga, a la apoptosis de las células tumorales o a la reducción del número de células tumorales circulantes. Los medios para cuantificar los efectos beneficiosos de esta terapia son bien conocidos por los expertos en la materia.

La invención proporciona un vector de expresión de adenovirus recombinante caracterizado por la deleción total del ADN adenovírico de la proteína IX y que tiene un gen extraño que codifica una proteína extraña, en el que la proteína extraña es un gen suicida o uno de sus equivalentes operativos. La TK del gen anticanceroso, descrita anteriormente, es un ejemplo de un gen suicida porque cuando se expresa, el producto génico es, o puede prepararse para que sea letal a la célula. Para TK, la letalidad se induce en presencia de GCV. El gen de TK procede del virus del herpes simple por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. El plásmido pMLBKTK en HB101 de E. coli (de ATCC nº 39369) es una fuente del gen de la timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV-1) para su utilización en esta invención. Sin embargo, existen también muchas otras fuentes.

El gen TK puede introducirse en la masa tumoral combinando el vector de expresión adenovírica con un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado. La introducción puede realizarse, por ejemplo, mediante inyección directa del adenovirus recombinante en la masa tumoral. Para el caso específico de un cáncer tal como el carcinoma hepatocelular (HCC), la inyección directa en la arteria hepática puede utilizarse para la administración porque en la mayoría de los HCC su circulación procede de esta arteria. Para controlar la proliferación del tumor, se induce la muerte celular tratando a los pacientes con un metabolito de TK tal como ganciclovir para conseguir la reducción de la masa tumoral. El metabolito TK puede administrarse, por ejemplo, por vía general, por inoculación local en el tumor o en el caso específico de HCC, por inyección en la arteria hepática. El metabolito TK se administra preferentemente por lo menos una vez al día pero puede aumentarse o disminuirse según la necesidad. El metabolito TK puede administrarse a la vez o después de la administración del vector que contiene TK. Los expertos en la materia conocen o pueden determinar la dosis y la duración que es terapéuticamente eficaz.

Un método de administración específica para el tumor de un gen supresor del tumor se realiza poniendo en contacto el tejido diana en un animal con una cantidad eficaz del vector de expresión adenovírico recombinante de esta invención. Se pretende que el gen codifique un agente antitumoral, tal como un gen operativo supresor del tumor o un gen suicida. "Poner en contacto" pretende abarcar cualquier método de administración para la transferencia eficaz del vector, tal como la inyección intratumoral.

Esta invención proporciona además la utilización del vector adenovírico de esta invención para preparar medicamentos destinados al tratamiento o la terapia de una enfermedad.

Experimento nº I

Para estas manipulaciones se utilizó como material de partida el plásmido pAd/MLP/p53/E1b-. Este plásmido se basa en el derivado pML2 de pBR322 (pBR322 se elimina para los pares de bases 1.140 a 2.490) y contiene las secuencias del adenovirus tipo 5 que se extienden desde el par de bases 1 al par de bases 5.788 excepto las que están eliminadas para los pares de bases 357 a 3.327 del adenovirus tipo 5. En el punto de la deleción 357/3.327 de Ad5 se inserta una unidad de transcripción que está comprendida por el activador tardío principal del adenovirus tipo 2, el ADNc principal del tripartito del adenovirus tipo 2 y el ADNc de p53 humano. Es un vector de sustitución de E1 típico eliminado para los genes E1a y E1b de Ad5 que contienen el gen de la proteína IX de Ad5 (para estudios de vectores de Adenovirus véase: Graham y Prevec (1992)). El ADN de Ad2 se adquirió en Gibco BRL. Endonucleasas de restricción y T4 ADN ligasa se adquirieron en New England Biolabs. Células competentes DH5\alpha de E. coli se adquirieron en Gibco BRL y células 293 se adquirieron en la American Type Culture Collection (ATCC). La resina Prep-A-Gene para la purificación del ADN se adquirió en BioRad. El medio de cultivo bacteriano LB se adquirió en Difco. Las columnas de purificación Qiagen del ADN se adquirieron en Qiagen, Inc. Se adquirió dI327 de Ad5 en R. J. Schneider, NYU. El kit para transfección de ADN MBS se adquirió en Stratagene.

Se digerió un (1) \mug de pAd/MLP/p53/E1b- con 20 unidades de cada una de las enzimas de restricción EcI 136II y NgoMI según las recomendaciones del fabricante. Se digerieron cinco (5) \mug de ADN de Ad2 con 20 unidades de cada una de las endonucleasas de restricción DraI y NgoMI según las recomendaciones del fabricante. Se cargaron las digestiones de restricción en bandas independientes de un gel de agarosa al 0,8% y se realizó la electroforesis a 100 voltios durante 2 horas. El fragmento de restricción de 4.268 bp de la muestra Pad/MLP/p53/E1b y el fragmento de 6.437 bp de la muestra Ad2 se aislaron del gel utilizando la resina de extracción Prep-A-Gene de ADN según las especificaciones del fabricante. Se mezclaron los fragmentos de restricción y se trataron con T4 ADN ligasa en un volumen total de 50 \mul a 16ºC durante 16 horas según las recomendaciones de fabricante. Después de la ligadura, se utilizaron 5 \mul de la reacción para transformar las células DH5\alpha de E. coli para resistencia a la ampicilina siguiendo el procedimiento del fabricante. Se utilizaron seis colonias bacterianas procedentes de este procedimiento para inocular 2 ml de cultivos independientes de medio de cultivo LB y se incubaron durante la noche a 37ºC con agitación. Se preparó ADN de cada cultivo bacteriano utilizando procedimientos normalizados (Sambrook et al. (1989)). Una cuarta parte del ADN del plásmido de cada cepa se digerió con 20 unidades de endonucleasa de restricción XhoI para identificar el recombinante correcto que contiene los fragmentos de restricción de XhoI de 3.627, 3.167, 2.466 y 1.445 pares de bases. Cinco de las seis cepas identificadas contenían el plásmido correcto. Una de éstas se utilizó a continuación para aislar 1 litro de cultivo del medio de cultivo LB para aislamiento de grandes cantidades de ADN del plásmido. Después de incubación durante la noche se aisló el ADN del plásmido del cultivo de 1 litro utilizando columnas Qiagen de purificación de ADN según las recomendaciones del fabricante. El plásmido resultante se denominó Pad/MLP/p53/PIX-. Las muestras de este plásmido se depositaron en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A., 12301, el 22 de octubre de 1993. El depósito se realizó bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el International Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure. Al depósito se le concedido el nº de registro 75576 de la ATCC.

Para construir un adenovirus recombinante, se trataron 10 \mug de Pad/MLP/p53/PIX- con 40 unidades de endonucleasa de restricción EcoRI para linealizar el plásmido. Se digerió ADN de dI327 de adenovirus tipo 5 (Thimmappaya (1982)) con endonucleasa de restricción CIaI y el fragmento grande (aproximadamente 33 pares de kilobases) se purificó por centrifugación en gradiente de sacarosa. Se aislaron diez (10) \mug de p53 tratado con EcoRI (Tabla I) de pGEM1-p53-B-T (suministrado gentilmente por el Dr. Wen Hwa Lee y se insertaron en el punto de clonación múltiple del vector de expresión pSP72 (Promega) utilizando procedimientos de clonación normalizados (Sambrook et al. (1989)). Se recuperó la inserción de p53 de este vector tras digestión con XhoI-BgIII y electroforesis en gel. Se insertó a continuación la secuencia de codificación de p53 en vectores de transferencia génica de adenovirus pNL3C o pNL3CMV (proporcionados gentilmente por el Dr. Robert Schneider) que contienen la repetición del terminal invertido en 5' de Ad5 y las señales de empaquetamiento víricas y el potenciador E1a del activador tardío principal Ad2 (MLP) o del activador del gen precoz inmediato al citomegalovirus humano (CMV), seguido del ADNc principal tripartito y la secuencia Ad 5 de 3.325 a 5.525 bp en un fondo de PML2. Estos nuevos montajes sustituyen a la zona E1 (360 a 3.325 bp) de Ad5 con p53 conducido por MLP de Ad2 (A/M/53) o el activador de CMV humano (A/C/53), ambos seguidos por el ADNc principal tripartito (véase la Figura 4). Las inserciones de p53 utilizan el punto de poliadenilación E1b aguas abajo restante. Se generaron recombinantes de p53 (A/M/N/53, A/C/N/53) dirigidos por MLP y CMV adicionales que presentaban una deleción adicional de 705 nucleótidos de secuencia de Ad 5 para eliminar la zona de codificación de la proteína IX (PIX). Como referencia, se generó un adenovirus recombinante a partir del plásmido PNL3C precursor con una inserción de p53 (A/M). Una segunda referencia consistió en un adenovirus recombinante que codifica el gen de beta-galactosidasa bajo el control del activador CMV (A/C/\beta-gal). Se linealizaron los plásmidos con Nru I o Eco RI y se cotransfectaron con un fragmento grande de los mutantes d1309 o d1327 de Ad 5 digeridos con Cla I (Jones y Shenk (1979)) utilizando el kit de transfección de Ca/PO_{4} (Stratagene). Se aislaron placas víricas y se identificaron los recombinantes tanto por análisis del digesto de restricción como por PCR utilizando cebadores específicos recombinantes contra la secuencia de ADNc principal tripartita con la secuencia de ADNc de p53 aguas abajo. Se purificó más el virus recombinante limitando la dilución y las partículas de virus se purificaron y se valoraron por métodos normalizados (Graham y van der Erb (1973); Graham y Prevec (1991)).

Detección de la proteína p53

Se infectaron las células Saos-2 o Hep 3B (5 \times 10^{5}) con los adenovirus recombinantes indicados durante un periodo de 24 horas a multiplicidades de infección (MOI) crecientes de unidades formadoras de placa de virus/célula. A continuación se lavaron las células una vez con PBS y se recogieron en tampón de lisis (Tris-Hcl 50 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, NP40 al 0,1%, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina y PMSF 1 mM). Se separaron proteínas celulares (aproximadamente 30 \mug) mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a nitrocelulosa. Se incubaron las membranas con anticuerpo Pab 1801 de \alpha-p53 (Novocastro) seguido de IgG anti-ratón de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante. La proteína p53 se observó por quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham) en película Kodak XAR-5.

Medición de la velocidad de síntesis del ADN

Se colocaron células (5 \times 10^{3}/pocillo) en placas (Costar) de valoración de 96 pocillos y se dejaron adherir toda la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se infectaron a continuación las células durante 24 horas con partículas de virus recombinante purificadas a las MOI que oscilan entre 0, 3 y 100 como se indica. Se cambiaron los medios 24 horas después de la infección, y se continuó la incubación durante un total de 72 horas. Se añadió ^{3}H-timidina (Amersham, 1 \muCi/pocillo) 18 horas antes de la recogida. Se recogieron las células en filtros de fibra de vidrio y se midieron los niveles de radioactividad incorporada en un contador beta de centelleo. La incorporación de ^{3}H-timidina se expresó como la media % (+/- SD) de la referencia del medio y se representó frente a la MOI.

Oncogenicidad en ratones lampiños

Se colocaron en placas en matraces T225 aproximadamente 2,4 \times 10^{8} células Saos-2, se trataron con tampón de suspensión (sacarosa al 1% en PBS) que contenía virus purificado A/M/N/53 o A/M a una MOI de 3 o 30. Después de una infección durante la noche, se inyectaron las células por vía subcutánea en los costados izquierdo y derecho de ratones lampiños atímicos BALB/c (4 ratones por grupo). Se inyectaron en un costado las células tratadas con A/M/N/53, mientras que el costado contralateral se inyectaron las células tratadas con A/M de referencia, sirviendo cada ratón como su referencia propia. Los animales que recibieron inyección bilateral de células tratadas con tampón sirvieron como referencias adicionales. Se midieron a continuación las dimensiones del tumor (longitud, anchura y altura) y los pesos corporales dos veces a la semana durante un periodo de 8 semanas. Se estimaron los volúmenes del tumor para cada animal suponiendo una geometría esférica con radio igual a la mitad de la media de las dimensiones del tumor medidas.

Análisis del ARN intratumoral

Se inyectaron por vía subcutánea ratones lampiños atímicos BALB/c (aproximadamente de 5 semanas de vida) con 1 \times 10^{7} células H69 de carcinoma pulmonar microcítico (SCLC) en sus costados derechos. Se dejaron evolucionar los tumores durante 32 días hasta que fueron de aproximadamente 25 a 50 mm^{3}. Los ratones recibieron inyecciones peritumorales de adenovirus recombinante A/C/53 o A/C/\beta-gal (2 \times 10^{9} unidades formadoras de placa (pfu)) en el espacio subcutáneo debajo de la masa tumoral. Se escindieron los tumores de los animales 2 y 7 días después del tratamiento con adenovirus y se enjuagaron con PBS. Se homogeneizaron las muestras de tumor, y se aisló el ARN total utilizando un kit TriReagent (Molecular Research Center, Inc.). Se aisló poliA ARN utilizando el sistema de aislamiento de ARNm PolyATract (Promega), y se utilizaron aproximadamente 10 ng para la determinación por RT-PCR de la expresión del ARNm de p53 (Wang et al. (1989)). Se diseñaron cebadores para ampliar la secuencia entre el ADNc principal tripartito del adenovirus y el ADNc de p53 aguas abajo, asegurándose que únicamente se ampliaría la p53 recombinante y no la endógena.

Terapia génica de p53 de tumores probados en ratones lampiños

Se inyectaron por vía subcutánea aproximadamente 1 \times 10^{7} células H69 de tumor (SCLC) en volúmenes de 200 \mul en ratones lampiños atímicos BALB/c hembra. Se dejaron desarrollar los tumores durante 2 semanas, en cuyo momento los animales se distribuyeron al azar por tamaño de tumor (N=5/grupo). Se administraron dos veces a la semana durante un total de 8 dosis/grupo inyecciones peritumorales de adenovirus A/M/N/53 o A/M de referencia (2 \times 10^{9} pfu/inyección) o tampón solo (sacarosa al 1% en PBS). Se midieron las dimensiones del tumor y los pesos corporales dos veces a la semana durante 7 semanas y se estimó el volumen del tumor como se describió anteriormente. A continuación se hizo un seguimiento de los animales para observar el efecto del tratamiento sobre la supervivencia de los ratones.

Resultados Construcción de adenovirus de p53 recombinante

Se construyeron adenovirus de p53 sustituyendo una parte de las zonas E1a y E1b del adenovirus tipo 5 con ADNc de p53 bajo el control del activador Ad2 MLP (A/M/53) o CMV (A/C/53) (esquematizado en la Figura 4). Esta sustitución de E1 comunica rigurosamente la capacidad de los adenovirus recombinante para replicarse, restringiendo su propagación a las células 293 que suministran productos génicos Ad 5 E1 en trans (Graham et al. (1977)). Después de la identificación del adenovirus recombinante de p53 tanto por el digesto de restricción como por análisis de PCR, se secuenció la secuencia completa del ADNc de p53 de uno de los adenovirus recombinantes (A/M/53) para verificar que estaba exenta de mutaciones. Después de esto, se utilizaron preparaciones purificadas de los recombinantes de p53 para infectar células HeLa para analizar la presencia de adenovirus con fenotipo natural. Las células HeLa, que no permiten la réplica del adenovirus con E1 eliminado, se infectaron con 1-4 \times 10^{9} unidades infecciosas de adenovirus recombinante, se cultivaron durante 3 semanas y se observó el aspecto del efecto citopático (CPE). Utilizando este análisis, no se detectó la réplica del adenovirus recombinante o la contaminación natural, fácilmente evidente por el CPE observado en las células de referencia infectadas con adenovirus natural a un nivel de sensibilidad de aproximadamente 1 en 10^{9}.

Expresión de la proteína p53 del adenovirus recombinante

Para determinar si los adenovirus recombinantes de p53 expresaban la proteína p53, se infectaron líneas celulares tumorales que no expresan la proteína p53 endógena. Las líneas celulares tumorales humanas Saos-2 (osteosarcoma) y Hep 3B (carcinoma hepatocelular) se infectaron durante 24 horas con los adenovirus A/M/53 o A/C/53 recombinantes de p53 a las MOI que oscilan entre 0,1 y 200 pfu/célula. El análisis Western de los lisados preparados a partir de las células infectadas demostró una expresión de la proteína p53 dependiente de la dosis en ambos tipos de células (Figura 5). Ambas líneas celulares expresaron niveles mayores de la proteína p53 tras la infección con A/C/53 que con A/M/53 (Figura 3). No se detectó proteína p53 en las células no infectadas. Las concentraciones de p53 natural endógena son normalmente muy bajas y casi indetectables por análisis Western de los extractos celulares (Bartek et al. (1991)). Es evidente sin embargo que las concentraciones de proteína p53 natural son fácilmente detectables después de la infección con A/M/53 o A/C/53 a las MOI inferiores (Figura 5), lo que sugiere que incluso dosis bajas de adenovirus recombinantes de p53 pueden producir concentraciones potencialmente eficaces de p53.

Cambios de morfología dependientes de p53

La reintroducción de p53 natural en la línea celular del osteosarcoma negativa a p53, Saos-2, produce un alargamiento característico y un aplastamiento de estas células normalmente en forma de huso (Chen et al. (1990)). Se infectaron células Saos-2 subconfluentes (1 \times 10^{5} células/10 cm de placa) a una MOI de 50 con el virus A/C/53 o el A/M de referencia y se incubaron a 37ºC durante 72 horas hasta que las placas de referencia sin infectar fueron confluentes. En este momento, el cambio morfológico esperado era evidente en la placa tratada con A/C/53 (Figura 6, panel C) pero no en las placas no infectadas (Figura 6, panel A) o en las placas infectadas con virus de referencia (Figura 6, panel B). Este efecto no era función de la densidad celular porque una placa de referencia sembrada inicialmente a densidad inferior conservaba la morfología normal a las 72 horas cuando su confluencia se aproximó a la de la placa tratada con A/C/53. Los resultados anteriores han demostrado un nivel elevado de expresión de la proteína p53 a una MOI de 50 en las células Saos-2 (Figura 5A) y estos resultados proporcionaron pruebas de que la proteína p53 expresada por estos adenovirus recombinantes era biológicamente activa.

Inhibición por p53 de la síntesis de ADN celular

Para probar más la actividad de los adenovirus recombinantes de p53, se analizó su capacidad para inhibir la proliferación de las células tumorales humanas medidas por absorción de ^{3}H-timidina. Se ha demostrado anteriormente que la introducción de p53 natural en las células que no expresan a p53 natural endógena puede detener las células en la transición G_{1}/S, lo que conduce a la inhibición de la absorción de la timidina marcada en el ADN recién sintetizado (Baker et al. (1990); Mercer et al. (1990); Diller et al. (1990)). Una variedad de líneas celulares tumorales con insuficiencia de p53 se infectaron con adenovirus recombinante A/M/N/53, A/C/N/53 o de referencia (A/M) que no expresa a p53. Se observó una fuerte inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de ADN tanto por los recombinantes A/M/N/53 como por A/C/N/53 en 7 de cada una de las 9 líneas celulares tumorales diferentes probadas (Figura 7). Ambos montajes fueron capaces de inhibir la síntesis de ADN en estas células tumorales humanas, a diferencia de si expresaban p53 mutante o no podían expresar la proteína p53. Se observó también en este ensayo, que el montaje A/C/N/53 era regularmente más potente que el A/M/N/53. En las células Saos-2 (osteosarcoma) y MDA-MB468 (cáncer de mama), casi se consiguió el 100% de inhibición de la síntesis de ADN con el montaje A/C/N/53 a una MOI tan baja como 10. A las dosis en las que la inhibición por el adenovirus de referencia en solamente 10 al 30%, se observó una reducción del 50 al 100% en la síntesis del ADN utilizando uno de los dos adenovirus recombinantes de p53. En cambio, no se observó ningún efecto específico en p53 significativo con cualquier montaje en comparación con el virus de referencia en las células G2 de HEP (línea celular de hepatocarcinoma que expresa a p53 natural endógena (Bressac et al. (1990)) ni en la línea celular leucémica K562 (p53 nula).

Oncogenicidad en ratones lampiños

En una prueba más severa de la función para los adenovirus recombinantes de p53, se infectaron células tumorales ex vivo y a continuación se inyectaron las células en ratones lampiños para evaluar la capacidad de los recombinantes para suprimir el crecimiento del tumor in vivo. Las células Saos-2 infectadas con virus A/M/N/53 o A/M de referencia a una MOI de 3 o 30, se inyectaron en los costados opuestos de ratones lampiños. Se midieron los tamaños de los tumores a continuación dos veces a la semana durante un periodo de 8 semanas. A la MOI de 30, no se observó crecimiento del tumor en los costados tratados con p53 en ninguno de los animales, mientras que los tumores tratados con la referencia continuaron creciendo (Figura 8). El aumento progresivo de los tumores tratados con el virus de referencia fue similar al observado en los animales de referencia tratados con el tampón. Una diferencia clara en el crecimiento del tumor entre el adenovirus de referencia y el recombinante p53 a la MOI de 3, aunque los tumores de 2 de cada 4 ratones tratados con p53 comenzó a mostrar algún crecimiento después de aproximadamente 6 semanas. Por este motivo, el adenovirus recombinante A/M/N/53 es capaz de mediar en la supresión del tumor específica de p53 en un medio in vivo.

Expresión in vivo de Ad/p53

Aunque el tratamiento ex vivo de las células cancerosas y la inyección posterior en animales proporcionó una prueba crítica de la supresión de un tumor, un experimento aplicable más clínicamente sirve para determinar y el adenovirus recombinante de p53 inyectado podría infectar y expresar a p53 en los tumores probados in vivo. Para estudiar esto, se inyectaron células H69 (SCLC, p53^{nulo}) por vía subcutánea en ratones lampiños, y se dejaron desarrollar los tumores durante 32 días. En ese momento, se inyectó una única inyección de 2 \times 10^{9} pfu de adenovirus A/C/53 o A/C/\beta-gal en el espacio peritumoral que rodea el tumor. Se escindieron a continuación los tumores el día 2 o el día 7 después de la inyección de adenovirus y se aisló poliA ARN de cada tumor. Se utilizó a continuación RT-PCR, utilizando cebadores específicos de p53 recombinante, para detectar el ARNm de p53 en los tumores tratados con p53 (Figura 9, bandas 1, 2, 4, 5). Ninguna señal de p53 fue evidente en los tumores escindidos de los animales tratados con \beta-gal (Figura 9, bandas 3 y 6). La ampliación con cebadores de actina sirvió como referencia para la reacción RT-PCR (Figura 9, bandas 7 a 9), mientras que un plásmido que contenía la secuencia de p53 recombinante sirvió como referencia positiva para la banda específica de p53 recombinante (Figura 9, banda 10). El experimento demuestra que un adenovirus recombinante de p53 puede dirigir específicamente la expresión del ARNm de p53 en los tumores probados tras una única inyección en el espacio peritumoral. También demuestra la persistencia vírica in vivo durante al menos una semana después de la infección con un adenovirus recombinante de p53.

Eficacia in vivo

Para estudiar la viabilidad de la terapia génica de tumores probados, se utilizó un modelo de ratón lampiño con tumor. Se inyectaron células H69 en el espacio subcutáneo sobre el costado derecho del ratón y se dejaron desarrollar los tumores durante 2 semanas. Los ratones recibieron a continuación inyecciones peritumorales de tampón o de virus recombinante dos veces a la semana durante un total de 8 dosis. En los ratones tratados con tampón o con virus A/M de referencia, los tumores continuaron creciendo rápidamente durante todo el tratamiento, mientras que los tratados con el virus A/M/N/53 crecieron a una velocidad muy reducida (Figura 10A). Tras el cese de las inyecciones, los tumores tratados con la referencia continuaron creciedo mientras que los tumores tratados con p53 se crecieron poco o no crecieron durante al menos una semana en ausencia de cualquier aporte adicional de p53 exógena (Figura 10A). Aunque los animales de referencia tratados con tampón solo habían acelerado el crecimiento del tumor en comparación con cualquier grupo tratado con virus, no se observó ninguna diferencia significativa en el peso corporal entre los tres grupos durante el periodo de tratamiento. La ulceración del tumor en algunos animales limitó la relevancia de las mediciones del tamaño del tumor después del día 42. Sin embargo, el control continuo de los animales para determinar el tiempo de supervivencia demostró una ventaja de la supervivencia para los animales tratados con p53 (Figura 10B). El último de los animales tratados con adenovirus de referencia murió el día 83, mientras que las referencias tratadas con tampón solo habían muerto todas el día 56. En cambio, los 5 animales tratados con el A/M/N/53 continuaron sobreviviendo (130 días tras la inoculación de las células) (Figura 10B). En conjunto, estos datos demuestran un efecto específico de p53 tanto en el crecimiento del tumor como en el tiempo de supervivencia en los animales con tumores insuficientes en p53 demostrados.

Vectores de adenovirus que expresan p53

Se construyeron vectores de adenovirus humano recombinante que son capaces de expresar altos niveles de la proteína p53 natural en función de la dosis. Cada vector contiene deleciones en las zonas E1a y E1b que hacen insuficiente la réplica del virus (Challberg y Nelly (1979); Horowitz, (1991)). De más significado es que estas deleciones incluyen las secuencias que codifican la proteína de E1b de 19 y 55 kd. Se ha publicado que la proteína de 19 kd está implicada en la inhibición de la apoptosis (White et al. (1992); Rao et al. (1992)), mientras que la proteína de 55 kd es capaz de unirse a la proteína p53 natural (Sarnow et al. (1982); Heuvel et al. (1990)). Eliminando estas secuencias adenovíricas, se eliminaron los inhibidores potenciales de la función de p53 mediante la unión directa a p53 o la inhibición potencial de la apoptosis mediada por p53. Se prepararon montajes adicionales que habían tenido la secuencia E1b en 3' restante, incluyendo toda la secuencia de codificación de la proteína IX, eliminada también. Aunque esto había sido descrito para reducir la capacidad del tamaño de empaquetamiento del adenovirus hasta aproximadamente 3 kb menos que el virus natural (Ghosh-Choudhury et al. (1987)), estos montajes están también eliminados de la zona E3 de modo que los montajes de A/M/N/53 y de A/C/N/53 están dentro de este intervalo de tamaños. Eliminando la zona pIX, las secuencias adenovíricas homólogas a los contenidos en las células 293 se reducen a aproximadamente 300 pares de bases, disminuyendo las probabilidades de regenerar adenovirus natural con replicación competente mediante recombinación. Los montajes que carecen de la secuencia de codificación pIX parecen tener igual eficacia que los que tienen pIX.

Eficacia de p53/adenovirus in vitro

De acuerdo con una dependencia acusada de la dosis para la expresión de la proteína p53 en las células infectadas, se demostró una inhibición específica de p53 dependiente de la dosis del crecimiento de las células tumorales. Se inhibió la división celular, y se demostró mediante la inhibición de la síntesis de ADN, en una amplia variedad de tipos de células tumorales conocidas porque carecen de la expresión de la proteína p53 natural. Bacchetti y Graham (1993) describieron recientemente la inhibición específica de p53 de la síntesis del ADN en la línea celular SKOV-3 del carcinoma de ovario por un adenovirus recombinante de p53 en experimentos similares. Además del carcinoma de ovario, se demostraron otras líneas celulares de tumor humano, representativas de cánceres humanos clínicamente importantes y que incluyen líneas que sobrexpresan la proteína p53 mutante, puede también inhibirse el crecimiento por los recombinantes de p53 de esta invención. A las MOI en las que el recombinante A/C/N/53 es del 90 al 100% eficaz en la inhibición de la síntesis del ADN en estos tipos de tumor, el adenovirus de referencia medió la supresión en menos del 20%.

Aunque Feinstein et al. (1992) describieron que la reintroducción de p53 natural podría inducir la diferenciación y aumentar la producción de células en G_{1} frente a S+G_{2} para las células K563 leucémicas, no se observó ningún efecto específico de p53 en esta línea. (Horvath y Weber (1988) han descrito que los linfocitos humanos de la sangre periférica no permiten apenas la infección del adenovirus. En experimentos independientes, el recombinante infectó significativamente las células K562 que no responden al tratamiento con adenovirus A/C/\beta-gal recombinante, mientras que otras líneas celulares, incluyendo la línea Hep G2 de referencia y las que presentan un fuerte efecto de p53, fueron fácilmente infectables. Por lo tanto, al menos parte de la variabilidad de la eficacia parecería ser debida a la variabilidad de la infección, aunque pueden estar implicados también otros factores.

Los resultados observados con el virus A/M/N/53 en la Figura 8 demuestran que la supresión completa es posible en un medio in vivo. La reanudación del crecimiento tumoral en 2 de cada 4 animales tratados con p53 a la MOI inferior más probablemente procedía de un pequeño porcentaje de células no infectadas inicialmente con el recombinante de p53 a esta dosis. La supresión completa observada con A/M/N/53 a la dosis mayor, sin embargo, demuestra que la capacidad de crecimiento del tumor para recuperarse puede resolverse.

Eficacia de p53/adenovirus in vivo

El trabajo presentado aquí y por otros grupos (Chen et al. (1990); Takahashi et al. (1992)) han demostrado que las células tumorales humanas que carecen de expresión de p53 natural pueden ser tratadas ex vivo con p53 y producen la supresión del crecimiento del tumor cuando las células tratadas se transfieren a un modelo animal. Los solicitantes presentan la primera prueba de terapia génica del supresor tumoral de un tumor probado in vivo, que produce tanto la supresión del crecimiento del tumor como el aumento del tiempo de supervivencia. En el sistema de los solicitantes, la administración a las células del tumor no se basó en la inyección directa en la masa tumoral. Más bien, se inyectó adenovirus recombinante de p53 en el espacio peritumoral y se detectó la expresión del ARNm de p53 dentro del tumor. p53 expresada por los recombinantes era operativa y suprimió de manera acusada el crecimiento del tumor en comparación con la de referencia, tumores tratados con adenovirus que no expresan a p53. Sin embargo, tanto los grupos con tumor tratados con p53 como con virus de referencia presentaban supresión del tumor en comparación con las referencias tratadas con tampón. Se ha demostrado que la expresión local del factor de necrosis tumoral (TNF), interferón (–\gamma), interleucina (IL)-2, IL-4 o IL-7 pueden conducir a la supresión temporal del tumor independiente de los linfocitos T en ratones lampiños (Hoch et al. (1992)). La exposición de los monocitos a viriones de adenovirus son también inductores débiles de IFN-\alpha/\beta (reseñado en Gooding y Wold (1990)). Por consiguiente, no es sorprendente que alguna supresión del tumor no se observase en las células tumorales Saos-2 tratadas con virus de referencia ex vivo descritas al principio. La supresión del tumor in vivo específica de p53 fue demostrada drásticamente por el control continuo de los animales en la Figura 10. El tiempo de supervivencia de los ratones tratados con p53 aumentó de forma significativa, en 5 de cada 5 animales todavía vivos más de 130 días después de la inoculación de las células en comparación con 0 de cada 5 animales tratados con la referencia de adenovirus. Los animales supervivientes presentan todavía tumores en desarrollo que pueden reflejar células no infectadas inicialmente con el adenovirus recombinante de p53. Los programas de dosificación superiores o más frecuentes pueden estudiar esto. Además, la interrupción del activador (Palmer et al. (1991)) o las mutaciones adicionales pueden haber vuelto a estas células resistentes al tratamiento con adenovirus recombinante de p53. Por ejemplo, las mutaciones en el gen WAF1 descrito recientemente, un gen inducido por p53 natural que inhibe posteriormente la evolución del ciclo celular en fase S (El-Deiry et al. (1993); Hunter (1993)) pudieron producir un tumor resistente a p53.

Experimento nº III

Este Ejemplo demuestra la utilización de genes suicidas y la expresión específica en el tejido de dichos genes en los métodos de terapia génica descritos en la presente memoria. Se seleccionó el carcinoma hepatocelular como diana debido a que es uno de los cánceres humanos más frecuentes que afectan al hombre, que producen unas 1.250.000 muertes estimadas al año en todo el mundo. La incidencia de este cáncer es muy alta en el sureste de Asia y África donde está asociado a la infección por hepatitis B y C y a la exposición a la aflatoxina. La cirugía es actualmente el único tratamiento que ofrece potencial para curar el HCC, aunque menos del 20% de los pacientes se consideran candidatos para la extirpación (Ravoet C. et al., 1993). Sin embargo, otros tumores aparte del carcinoma hepatocelular son igualmente aplicables a los métodos de reducción de su proliferación descritos en la presente memoria.

Líneas celulares

Todas las líneas celulares excepto la línea celular HLF se adquirieron en la American Type Tissue Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. Los números de registro de ATCC se indican entre paréntesis. Se utilizó la línea celular 293 (CRL 1573) de riñón embrionario humano para generar y propagar los adenovirus recombinantes descritos en la presente memoria. Se mantuvieron en medio DME que contiene suero de ternero enriquecido al 10% definido (Hyclone). Las líneas celulares Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065) y HLF del carcinoma hepatocelular se mantuvieron en medio DMF/F12 enriquecido con suero bovino fetal al 10%, como lo fueron las líneas celulares MDA-MB468 (HTB 132) y BT-549 (HTB 122) de carcinoma de mama. Se cultivaron células de hígado de Chang (CCL 13) en medio MEM enriquecido con suero bovino fetal al 10%. La línea celular HLF se obtuvo de los Drs. T. Morsaki y H. Kitsuki en la Kyushu University School of Medicine en Japón.

Construcción del virus recombinante

Dos vectores de expresión adenovíricos denominados en la presente memoria ACNTK y AANTK y desprovistos de la función de la proteína IX (representados en la Figura 11) son capaces de dirigir la expresión del gen suicida de TK en las células tumorales. Se construyó un tercer vector de expresión adenovírico denominado AANCAT para demostrar más la viabilidad de la expresión génica con direccionamiento específico para los tipos de células específicas que utilizan vectores adenovíricos. Estos montajes adenovíricos se ensamblaron como se representa en las Figuras 11 y 12 y son derivados de los descritos anteriormente para la expresión de los genes supresores del tumor.

Para la expresión del gen extraño, se han insertado casetes de expresión que utilizan el activador/potenciador precoz inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart, M. et al., 1985) o el activador potenciador de la fetoproteína alfa humana (AFP) (Watanable, K. et al., 1987; Nakabayashi, H. et al., 1989) para dirigir la transcripción del gen de TK o el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El activador potenciador de CMV es capaz de dirigir la expresión del gen consistente en una amplia variedad de tipos de células mientras que el montaje del potenciador/activador de AFP restringe la expresión a las células de carcinoma hepatocelular (HCC) que expresa AFP en aproximadamente el 70 al 80% de la población de HCC. En el montaje que utiliza el activador/potenciador de CMV, la secuencia principal tripartita del adenovirus tipo 2 se insertó también para potenciar la traducción del transcrito de TK (Berkner, K. L. y Sharp, 1985). Además de la deleción E1, ambos vectores de adenovirus son eliminados adicionalmente por 1,9 kilobases (kb) de ADN en la zona E3 vírica. El ADN eliminado en la zona E3 no es esencial para la propagación del virus y su deleción aumenta la capacidad de inserción del virus recombinante para el ADN extraño en una cantidad equivalente (1,9 kb) (Graham y Prevec, 1991).

Para demostrar la especificidad del activador/potenciador de AFP, se construyó también el virus AANCAT donde la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del gen marcador está bajo el control del potenciador/activador de AFP. En el montaje vírico ACNTK, la secuencia principal tripartita de Ad2 se colocó entre el activador/potenciador de CMV y el gen con TK. Se ha publicado que el principal tripartito aumenta la traducción de los genes unidos. La sustitución E1 comunica la capacidad de los virus recombinantes para replicar, restringir su propagación a las células 293 que suministran los productos génicos E1 de Ad5 en trans (Graham et al., 1977).

Vector adenovírico ACNTK: Se utilizó el plásmido pMLBKTK en HB101 de E. coli (de ATCC nº 39.369) como fuente del gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV-1). Se extrajo TK de este plásmido como un fragmento del gen de 1,7 kb con las enzimas de restricción Bgl II y Pvu II y se subclonó en las enzimas de restricción EcoR V y Bam HI compatibles del plásmido pSP72 (Promega) utilizando técnicas de clonación normalizadas (Sambrook et al., 1989). La inserción de TK se aisló a continuación como un fragmento de 1,7 kb de este vector por digestión con Xba I y Bgl II y se clonó en el plásmido pACN digerido con Xba I, BamHI (Wills et al. 1994). Veinte (20) \mug de este plásmido denominado pACNTK se linealizaron con Eco RI y se cotransfectaron en células 293 (ATCC CRL 1573) con 5 \mug de ACBGL digerido con Cla I (Wills et al., 1994 supra) utilizando el kit de transfección de CaPO_{4} (Stratagene, San Diego, California). Se aislaron las placas víricas y los recombinantes, denominados ACNTK, se identificaron por análisis con digesto de restricción de ADN aislado con Xho I y BsiWI. Los recombinantes positivos se purificaron más limitando la dilución y se ampliaron y valoraron por métodos normalizados (Graham y Prevec, 1991).

Vector adenovírico AANTK: Se clonaron el activador (AFP-P) y el potenciador (AFP-E) de \alpha-fetoproteína a partir de un ADN genómico humano (Clontech) utilizando la ampliación por PCR con cebadores que contienen secuencias de restricción en sus extremos. Los cebadores utilizados para aislar el AFP-E de 210 bp contenía la secuencia de restricción Nhe I en el cebador 5' y un enlazador Xha I, Xho I, Kpn I en el cebador 3'. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG-3'. Los cebadores utilizados para aislar el fragmento AFE de 1763 bp contenían una secuencia de restricción Not I en el cebador 5' y una secuencia Xba I en el cebador 3'. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGT GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TC-3'. La secuencia del cebador en 3' fue 5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3'. Para la ampliación por PCR, se desnaturalizó el ADN a 97ºC durante 7 minutos, seguido de 5 ciclos de ampliación a 97ºC, 1 minuto, 53ºC, 1 minuto, 72ºC, 2 minutos y una ampliación final a 72ºC, 10 minutos. El AFE ampliado se digerió con Not I y Xba I y se insertó en las secuencias Not I y Xba I de un vector del plásmido (pA/ITR/B) que contenía las secuencias 1 a 350 y 3.330 a 5.790 del adenovirus tipo 5 separadas por un polienlazador que contenía las secuencias Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Kpn I, Bam HI, Nco I, Sma I y Bgl II. Se digerió el AFP ampliado con Nhe I y Kpn I y se insertó en el montaje que contiene AFP-E descrito anteriormente que había sido digerido con Xba I y Kpn I. Este nuevo montaje se digerió más a continuación con Xba I y NgoMI para eliminar las secuencias adenovíricas 3.370 a 5.780, que se sustituyeron posteriormente con un fragmento de restricción Xba I, NgoMI del plásmido pACN que contenía los nucleótidos 4.021 a 10.457 de adenovirus tipo 2 para construir el plásmido pAAN que contiene tanto el potenciador como el activador de la \alpha-fetoproteína. Este montaje se digerió a continuación con Eco RI y Xba I para aislar un fragmento de 2,3 kb que contiene la repetición terminal invertida de Ad5, el AFP-E y el AFP-P que se ligó posteriormente con un fragmento de 8,55 kb de pACNTK digerido con Eco RI, Xba I descrito anteriormente para generar el pAANTK en el que el gen TK es dirigido por el potenciador y el activador de la \alpha-fetoproteína en un fondo de adenovirus. Este plásmido se linealizó a continuación con Eco RI y se cotransfectó con un fragmento grande de ALBGL digerido con Cla I como anteriormente y recombinantes, denominados AANTK, en el que se aislaron y purificaron como se describió anteriormente.

Vector adenovírico AANCAT: Se aisló el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del vector básico de pCAT (Promega Corporation) mediante un digesto Xba I, Bam HI. Este fragmento de 1,64 kb se ligó en pAAN digerido con Xba I, Bam HI (descrito anteriormente) para crear pAANCAT. Este plásmido se linealizó a continuación con Eco RI y se cotransfectó con el fragmento grande de rA/C/\beta-gal digerido con Cla I para crear AANCAT.

Expresión del gen indicador: expresión de \beta-galactosidasa

Se colocaron en placas a razón de 1 \times 10^{5} células/pocillo en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos (Costar) y se dejaron adherir durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se realizaron infecciones durante la noche de ACBGL a una multiplicidad de infección (MOI) de 30. Después de 24 horas, se fijaron las células con formaldehído al 3,7%, PBS y se tiñeron con 1 mg/ml de reactivo Xgal (USB). Se puntuaron los datos (+, ++, +++) estimando el porcentaje de células teñidas positivamente para cada MOI. [+=1-33%, ++=33-67% y +++=>67%]

Expresión del gen indicador: expresión de CAT

Se sembraron por triplicado dos (2) \times 10^{6} células (Hep G2, Hep 3B,HLF, Chang y MDA-MB468) en placas de 10 cm y se incubaron durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se infectó a continuación cada placa con AANCAT a una MOI=30 o 100 o no se infectaron y se dejaron incubar durante 3 días. Las células se trataron a continuación con tripsina y se lavaron con PBS y se volvieron a poner en suspensión en 100 \mul de Tris 0,25 M pH 7,8. Las muestras se congelaron y descongelaron 3 veces y se transfirió el sobrenadante a nuevos tubos y se incubaron a 60ºC durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron a continuación a 4ºC durante 5 minutos y en los sobrenadantes se analizó la concentración de proteínas utilizando un análisis Bradford (kit de análisis de proteínas de Bio-Rad). Se ajustaron las muestras a concentraciones de proteína iguales hasta un volumen final de 75 \mul utilizando Tris 0,25 M de acetil CoA 4 mM y 1 \mul de ^{14}C-cloranfenicol y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se añaden 500 \mul de acetato de etilo a cada muestra y se mezclan agitando, seguido de centrifugación durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se transfiere a continuación la fase superior a un nuevo tubo y se evapora el acetato de etilo por centrifugación a vacío. Los productos de reacción se redisuelven a continuación en 25 \mul de acetato de etilo y se colocan juntos en una placa de cromatografía en capa fina (TLC) y la placa se coloca a continuación en una cámara para TLC equilibrada previamente (cloroformo al 95%, metanol al 5%). Se deja el disolvente migrar a continuación a la parte superior de la placa, a continuación se seca la placa y se expone a una película de rayos X.

Proliferación celular: incorporación de ^{3}H-timidina

Se colocaron 5 \times 10^{3} células/pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Costar) y se dejaron incubar durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se diluyó en serie virus ACN, ACNTK o AATK en DMEM; FBS al 15%; se utilizó glutamina al 1% para transfectar las células a una multiplicidad de infección de 30 durante toda la noche en cuyos puntos se dosificó por triplicado ganciclovir (Cytovene) a intervalos log entre 0,001 y 100 mM (micromolar). Se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham) a cada pocillo 12 a 18 horas antes de la recogida. A las 72 horas después de la infección se recogieron las células en filtros de fibra de vidrio y se hizo el recuento de la ^{3}H-timidina incorporada utilizando centelleo líquido (TopCount, Packard). Los resultados se representan en porcentaje de proliferación de la referencia no tratada y se tabulan como dosis eficaz (ED_{50}±SD) para una reducción del 50 por ciento de proliferación sobre las re-
ferencias del medio. Se estimaron los valores ED_{50} ajustando una ecuación logística a los datos de respuesta a la dosis.

Citotoxicidad: liberación de LDH

Se colocaron en placas células (HLF, de HCC humano), se infectaron con ACN o ACNTK y se trataron con ganciclovir para el ensayo de proliferación. A las 72 horas después de la administración de ganciclovir, se centrifugaron las células, se eliminó el sobrenadante. Las concentraciones de lactato deshidrogenasa se midieron por colorimetría (Promega, Cytotox 96^{TM}). La liberación media (+/- S.D.) de LDH se representa frente a M.O.I.

Terapia in vivo

Se inyectaron por vía subcutánea células de carcinoma hepatocelular humanas (Hep 3B) en diez (10) ratones nu/nu atímicos hembra (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Cada animal recibió aproximadamente 1 \times 10^{7} células en el costado izquierdo. Se dejaron desarrollar los tumores durante 27 días antes de distrubuir al azar los ratones por tamaño del tumor. Se trató a los ratones con inyecciones intratumorales y peritumorales de ACNTK o del virus ACN de referencia (1 \times 10^{9} ui en 100 \mul) cada dos días durante un total de tres dosis. Comenzando 24 horas después de la dosis inicial de adenovirus, se dosificó por vía intraperitoneal a los ratones ganciclovir (100 mg/kg de Cytovene) al día durante un total de 10 días. Se controló el tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones dos veces a la semana. Se hicieron mediciones en los tumores en tres dimensiones utilizando calibradores vernier y se calcularon los volúmenes utilizando la fórmula 4/3 \pir^{3}, en la que r es la mitad de la dimensión media del tumor.

Resultados

Se utilizaron adenovirus recombinantes para infectar tres líneas celulares de HCC (HLF, Hep3B y Hep-G2). Se utilizaron como referencias una línea celular de hígado humana (Chang) y dos líneas celulares de cáncer de mama (MDAMB468 y BT549). Para demostrar la especificidad del activador/potenciador de AFP, se construyó el virus AANCAT. Se utilizó este virus para infectar las células que expresan (Hep 3B, HepG2) o no (HLE, Chang, MDAMB468) la alfa-fetoproteína (AFP) del marcador tumoral de HCC. Como se muestra en la Figura 13, AANCAT dirige la expresión del gen del marcador CAT solamente en aquellas células HCC que son capaces de expresar AFP (Figura 13).

Se evaluó la eficacia de ACNTK y AANTK para el tratamiento de HCC utilizando un ensayo de incorporación de ^{3}H-timidina para medir el efecto de la combinación de la expresión de HSV-TK y del tratamiento con ganciclovir en la proliferación celular. Se infectaron las líneas celulares con ACNTK o AANTK o virus ACN de referencia (Wills et al., 1994 supra), que no dirige la expresión de HSV-TK y a continuación se trataron con concentraciones crecientes de ganciclovir. Se evaluó el efecto de este tratamiento en función de las concentraciones crecientes de ganciclovir y se determinó la concentración de ganciclovir requerida para inhibir la ^{3}H-timidina incorporada por el 50% (ED_{50}). Además, se determinó una medición relativa de la transferencia y de la expresión del gen mediada por adenovirus de cada línea celular utilizando un virus de referencia que dirige la expresión de la beta-galactosidasa del gen marcador. Los datos presentados en la Figura 14 y en la Tabla 1 a continuación demuestran que el tratamiento de la combinación virus ACNTK/ganciclovir fue capaz de inhibir la proliferación celular en todas las líneas celulares examinadas en comparación con el adenovirus ACN de referencia en combinación con ganciclovir. En cambio, el vector vírico AANTK fue solamente eficaz en aquellas líneas celulares de HCC que se ha demostrado que expresan la \alpha- fetoproteína. Además, la combinación AANTK/GCV fue más eficaz cuando las células se colocaron en placas a altas densidades.

TABLA 1

Línea celular	aFP	Expresión de \beta-gal	ACN	ED50 ACNTK	AANTK
MDAMB468	-	+++	>100	2	>100
BT549	-	+++	>100	<0,3	>100
HLF	-	+++	>100	0,8	>100
CHANG	-	+++	>100	22	>100
HEP-3B	-	+	80	8	8
HEP-G2 BAJO	+	++	90	2	35
HEP-G2 ALTO	+	++	89	0,5	4

Se trataron por vía intratumoral y peritumoral ratones lampiños con tumores Hep3B (N=5/grupo) con dosis equivalentes de ACNTK o ACN de referencia. Veinticuatro horas después de la primera administración de adenovirus recombinante, se inició el tratamiento diario de ganciclovir en todos los ratones. Las dimensiones del tumor para cada animal se midieron dos veces a la semana con calibradores y los tamaños medios del tumor se representan en la Figura 16. El tamaño medio del tumor el día 58 fue más pequeño en los animales tratados con ACNTK pero la diferencia no alcanzó significancia estadística (p<0,09, prueba de la t para datos independientes). Estos datos apoyan un efecto específico de ACNTK en el crecimiento del tumor in vivo. No se detectaron diferencias significativas en el peso corporal medio entre los grupos.

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Claims (27)

1. Una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión de adenovirus recombinante, comprendiendo el vector un gen que codifica una proteína extraña y una deleción total de la secuencia de codificación de la proteína IX.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, que comprende además la deleción de una secuencia de ADN denominada adenovirus E1a y E1b.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, que comprende además la deleción de una secuencia de ADN en la zona 3 inicial y/o en la zona 4 inicial.

4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados en 3' con respecto a la deleción de la proteína IX y una molécula de ADN extraño que codifica una señal de poliadenilación.

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el adenovirus es un adenovirus del Grupo C seleccionado de un serotipo 1,2 5 o 6.

6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gen es una molécula de ADN de hasta 2,6 kilobases.

7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gen es una molécula de ADN de hasta 4,5 kilobases.

8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el gen codifica una proteína operativa, una proteína no operativa o uno de los fragmentos de la proteína.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que la proteína operativa es una proteína supresora del tumor.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que la proteína operativa es una proteína suicida.

11. Un kit para reducir la proliferación de células tumorales, comprendiendo dicho kit una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un agente terapéutico seleccionado del grupo consistente en ganciclovir, 6-metoxipurina arabinonucleósido, 5-fluorouracilo, 6-metil-purina-2'-desoxirribo-nucleósido, y sus combinaciones, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

12. Un vector de expresión de adenovirus recombinante que comprende un gen que codifica una proteína extraña y una deleción total de la secuencia de codificación de la proteína IX.

13. El vector de expresión de adenovirus recombinante de la reivindicación 12, que comprende además la deleción de una secuencia de ADN denominada adenovirus E1a y E1b.

14. El vector de expresión de adenovirus recombinante de la reivindicación 12 o 13, que comprende además la deleción de una secuencia de ADN en la zona 3 inicial y/o en la zona 4 inicial.

15. El vector de expresión del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende además una deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados en 3' con respecto a la deleción de la proteína IX y una molécula de ADN extraño que codifica una señal de poliadenilación.

16. El vector de expresión del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en la que el adenovirus es un adenovirus del Grupo C seleccionado de un serotipo 1,2 5 o 6.

17. El vector de expresión del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en la que el gen es una molécula de ADN de hasta 2,6 kilobases.

18. El vector de expresión del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en la que el gen es una molécula de ADN de hasta 4,5 kilobases.

19. El vector de expresión del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en la que el gen codifica una proteína operativa, una proteína no operativa o uno de los fragmentos de la proteína.

20. El vector de expresión del adenovirus recombinante de la reivindicación 19, en la que la proteína operativa es una proteína supresora del tumor.

\newpage

21. El vector de expresión del adenovirus recombinante de la reivindicación 19, en la que la proteína operativa es una proteína suicida.

22. La utilización del adenovirus recombinante de una cualquier de las reivindicaciones 20 a 21 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer, composición farmacéutica que comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

23. La utilización de la reivindicación 22, en la que el cáncer está asociado a una carencia de proteína endógena supresora del tumor.

24. La utilización de la reivindicación 23, en la que el cáncer es el cáncer pulmonar no microcítico, cáncer es el cáncer pulmonar microcítico, hepatocarcinoma, melanoma, retinoblastoma, tumor de mama, carcinoma colorrectal, leucemia, linfoma, tumor cerebral, crcinoma cervical, sarcoma, tumor de próstata, tumor de vejiga, tumor de los tejidos reticuloendoteliales, tumor de Wilms, astrocitoma, glioblastoma, neuroblastoma, carcinoma de ovario, osteosarcoma y cáncer renal.

25. La utilización del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir la proliferación de un tumor en un animal, composición farmacéutica que comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

26. La utilización del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 para la preparación de una composición farmacéutica destinada a reducir la proliferación de células tumorales en un paciente, en la que la composición farmacéutica comprende además una cantidad eficaz de un agente terapéutico seleccionado del grupo consistente en ganciclovir, arabinonucleósido de 6- metoxipurina, 5-fluorouracilo, 6-metil-purina-2'-desoxirribonucleósido, y sus combinaciones, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

27. La utilización de la reivindicación 26, en la que las células tumorales son el carcinoma hepatocelular.