ES2328585T3 - Vector de adenovirus recombinante y metodo de utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión de adenovirus recombinante, comprendiendo el vector un gen que codifica una proteína foránea y una deleción total de la secuencia codificante de la proteína IX, donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms, h-NUC y mitosina.
Description
Vector de adenovirus recombinante y método de
utilización.
Esta solicitud es una continuación de parte del
documento U.S. Núm. de Serie 08/233.777, presentado el 19 de Mayo
de 1994, que es una continuación de parte del documento U.S. Núm. de
Serie 08/142.669 presentado el 25 de Octubre de 1993.
La producción de adenovirus recombinantes útil
para la terapia génica requiere el uso de una línea celular capaz
de suministrar en trans los productos génicos de la región E1
viral que están suprimidos en estos virus recombinantes. En la
actualidad la única línea celular útil disponible es la línea
celular 293 descrita originalmente por Graham et al. en
1977. Las células 293 contienen aproximadamente el 12% de la
izquierda (4,3 kb) del genoma del adenovirus de tipo 5 (Aiello
(1979) y Spector (1983)).
Los vectores adenovirales que están siendo
sometidos a ensayo en la actualidad para las aplicaciones de terapia
génica tienen típicamente suprimido el ADN de Ad2 o Ad5 que se
extiende desde aproximadamente 400 pares de bases del extremo 5'
del genoma viral a aproximadamente 3,3 kb del extremo 5', para una
deleción de E1 total de 2,9 kb. Por lo tanto, existe una región
limitada de homología de aproximadamente 1 kb entre la secuencia de
ADN del virus recombinante y el ADN de Ad5 en la línea celular. Esta
homología define una región de recombinación potencial entre las
secuencias de adenovirus virales y celulares. Semejante
recombinación da como resultado un virus de tipo salvaje
fenotípicamente que porta la región E1 de Ad5 de las células 293.
Este evento de recombinación explica presumiblemente la frecuente
detección de adenovirus de tipo salvaje en las preparaciones de
virus recombinante y se ha demostrado directamente que es la causa
de la contaminación de tipo salvaje del virus recombinante basado
en Ad2 Ad2/CFTR-1 (Rich et al. (1993)).
Debido al alto grado de homología de secuencia
en el subgrupo de adenovirus de tipo C es probable que se produzca
semejante recombinación si el vector se basa en cualquier adenovirus
del grupo C (tipos 1, 2, 5, 6).
En una producción a pequeña escala de adenovirus
recombinantes, la generación de virus de tipo salvaje contaminante
se puede gestionar mediante un procedimiento de escrutinio que
descarte aquellas preparaciones de virus que se ha encontrado que
están contaminadas. Como la escala de producción del virus crece
hasta satisfacer la demanda esperada de agentes terapéuticos
genéticos, la probabilidad de que cualquier lote individual sea
contaminado con un virus de tipo salvaje también aumentará así como
la dificultad de proporcionar preparaciones recombinantes no
contaminadas.
Habrá más de un millón de nuevos casos de
diagnósticos de cáncer este año, y la mitad de esa cifra de muertes
relacionadas con cánceres (American Cancer Society, 1993). Las
mutaciones de p53 son la alteración genética más común asociada con
los cánceres humanos, existiendo en 50-60% de los
cánceres humanos (Hollstein et al. (1991); Bartek et
al. (1991); Levine (1993)). El objetivo de la terapia génica en
el tratamiento de los tumores carentes de p53, por ejemplo, es
restituir una copia funcional, normal del gen p53 de tipo salvaje
de manera que se restaure el control de la proliferación celular.
p53 juega un papel fundamental en el progreso del ciclo celular,
deteniendo el crecimiento de manera que se pueda producir la
reparación apoptosis en respuesta al deterioro del ADN. El p53 de
tipo salvaje ha sido identificado recientemente como un componente
necesario para la apoptosis inducida por radiación o tratamiento con
algunos agentes quimioterapéuticos (Lowe et al. (1993) A y
B). Debido a la elevada prevalencia de las mutaciones de p53 en los
tumores humanos, es posible que los tumores se hayan vuelto
refractarios a los tratamientos con quimioterapia y radiación debido
en parte a la carencia de p53 de tipo salvaje. Volviendo a
suministrar p53 funcional a estos tumores, es razonable que sean
susceptibles ahora de la apoptosis normalmente asociada con el
deterioro del ADN inducido por la radiación y la quimioterapia.
Uno de los puntos críticos en la terapia génica
satisfactoria de supresión de tumores es la capacidad para afectar
a una fracción significativa de las células cancerosas. El uso de
vectores retrovirales ha sido en gran parte explorado para este fin
en una variedad de modelos de tumor. Por ejemplo, para el
tratamiento de las malignidades hepáticas, se han empleado vectores
retrovirales con escaso éxito debido a que estos vectores no son
capaces de lograr el alto nivel de transferencia génica requerido
para la terapia génica in vivo (Huber, B.E. et al.,
1991; Caruso M. et al., 1993).
Para lograr una fuente más continua de
producción de virus, los investigadores han intentado superar el
problema asociado con el bajo nivel de transferencia génica
mediante inyección indirecta de líneas celulares de empaquetamiento
retrovirales a los tumores sólidos (Caruso, M. et al., 1993;
Ezzidine, Z.D. et al., 1991; Culver, K.W. et al.,
1992). Sin embargo, estos métodos no son satisfactorios para su uso
en pacientes humanos debido a que el método es dificultoso e induce
una respuesta inflamatoria contra la línea celular de
empaquetamiento en el paciente. Otra desventaja de los vectores
retrovirales es que requieren células en división para integrarse
eficazmente y expresar el gen recombinante de interés (Huber, B.E.
1991). La integración estable en un gen anfitrión esencial puede
conducir al desarrollo o la herencia de estados de enfermedad
patogénicos.
Los adenovirus recombinantes tienen claras
ventajas sobre los métodos retrovirales y de liberación de otros
genes (para una revisión, véase Siegfried (1993)). Nunca se ha
demostrado que los adenovirus induzcan tumores en los seres humanos
y se han utilizado con seguridad como vacunas vivas (Straus (1984)).
Se pueden producir adenovirus recombinantes carentes de replicación
remplazando la región E1 necesaria para la replicación por el gen
diana. El adenovirus no se integra en el genoma humano como
consecuencia normal de la infección, reduciendo de ese modo
enormemente el riesgo de mutagénesis insercional posible con los
retrovirus o los vectores virales adenoasociados (AAV). Esta
carencia de integración estable también conduce a una característica
de seguridad adicional ya que el efecto del gen transferido será
transitorio, puesto que el ADN extracromosómico se perderá
gradualmente con la continua división de las células normales. Se
pueden producir adenovirus recombinantes de elevado título,
estables a niveles no alcanzables con retrovirus o AAV, permitiendo
que se produzca suficiente material para tratar una gran población
de pacientes. Por otra parte, los vectores de adenovirus son
susceptibles de transferencia génica in vivo altamente
eficaz en una amplia gama de tipos de tejidos y células tumorales.
Por ejemplo, otros han demostrado que el reparto de genes mediado
por adenovirus tiene un fuerte potencial para la terapia génica
para enfermedades tales como la fibrosis quística (Rosenfeld et
al. (1992); Rich et al. (1993)) y la deficiencia de
\alpha_{1}-antitripsina (Lemarchand et
al. (1992)). Aunque también se están explorando en la
actualidad otras alternativas para el reparto génico, tales como los
complejos de liposomas catiónicos/ADN, ninguno hasta ahora parece
tan eficaz como el reparto de genes mediado por adenovirus.
Como con el tratamiento de los tumores carentes
de p53, el objetivo de la terapia génica para otros tumores
consiste en restituir el control de la proliferación celular. En el
caso de p53, la introducción de un gen funcional restituye el
control del ciclo celular permitiendo la muerte celular apoptótica
inducida por agentes terapéuticos. De un modo similar, la terapia
génica es igualmente aplicable a otros genes supresores de tumores
que se pueden utilizar solos o combinados con agentes terapéuticos
para controlar el progreso del ciclo celular de las células
tumorales y/o inducir la muerte celular. Por otra parte, los genes
que no codifican proteínas reguladoras del ciclo celular, pero
inducen directamente la muerte celular tales como los genes suicidas
o, los genes que son directamente tóxicos para la célula se pueden
utilizar en los protocolos de terapia génica para eliminar
directamente el progreso del ciclo celular de las células
tumorales.
Independientemente de qué gen se utilice para
restituir el control del progreso del ciclo celular, la razón
fundamental y la aplicabilidad práctica de este enfoque son
idénticas. Esto es, lograr eficacias elevadas de transferencia
génica para expresar cantidades terapéuticas del producto
recombinante. La elección de qué vector utilizar para permitir una
transferencia génica de elevada eficacia con un mínimo riesgo para
el paciente es por lo tanto importante para el nivel de éxito del
tratamiento de terapia génica.
De este modo, existe la necesidad de vectores y
métodos que proporcionen una eficacia de transferencia génica y una
expresión de proteínas de alto nivel que proporcionen tratamientos
de terapia génica seguros y eficaces. La presente invención
satisface esta necesidad y proporciona también las ventajas
relacionadas.
Esta invención proporciona un vector de
expresión de adenovirus recombinante caracterizado por una deleción
total del ADN de la proteína IX adenoviral y por tener un gen que
codifica una proteína foránea, donde la proteína foránea es una
proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en
p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms,
h-NUC y mitosina.
La Figura 1 muestra un vector adenoviral
recombinante de esta invención. Este constructo fue ensamblado como
se muestra en la Figura 1. El virus resultante porta una deleción 5'
de secuencias adenovirales que se extienden desde el nucleótido 356
al 4020 y elimina los genes E1a y E1b así como la secuencia
codificante de la proteína IX completa, dejando el sitio de
poliadenilación compartido por los genes E1b y pIX intacto para su
uso en la terminación de la transcripción de cualquier gen
deseado.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
de p110^{RB}.
La Figura 3 muestra una secuencia de ADN que
codifica una proteína supresora del tumor retinoblastoma.
La Figura 4 muestra un esquema de constructos de
p53 recombinante/adenovirus dentro del alcance de esta invención.
Los recombinantes de p53 se basan en Ad 5 y tienen la región E1 de
los nucleótidos 360-3325 sustituida por un ADNc de
p53 completo de 1,4 kb conducido por los promotores MLP de Ad 2
(A/M/53) o CMV humano (A/C/53) seguidos de un ADNc líder tripartito
de Ad 2. El A/M del virus de control tiene las mismas deleciones de
Ad 5 que el virus A/M/53 pero carece del inserto de ADNc de p53 de
1,4 kb. La secuencia de E1b restante (705 nucleótidos) ha sido
suprimida para crear la proteína IX con los constructos A/M/N/53 y
A/C/N/53 suprimidos. Estos constructos también tienen una deleción
XbaI de 1,9 kb en la región E3 del adenovirus de tipo 5.
Las Figuras 5A y 5B muestran la expresión de la
proteína p53 en células tumorales infectadas con A/M/53 y A/C/53.
Figura 5A) se infectaron células Saos-2
(osteosarcoma) a las multiplicidades de infección (MOI) indicadas
con el virus A/M/53 o A/C/53 purificado y se cosecharon 24 horas más
tarde. Se utilizó el anticuerpo de p53 pAb 1801 para teñir las
inmunotransferencias de las muestras cargadas con concentraciones
totales de proteína iguales. Se utilizaron concentraciones de
proteína iguales de extractos celulares de SW40, que expresaban al
alza la proteína p53 mutante, como marcador para el tamaño de p53.
"O" bajo el encabezamiento A/C/53 indica una infección
simulada, que contiene producto lisado de Saos-2 no
tratado. Figura 5B) se infectaron células Hep 3B (carcinoma
hepatocelular) con el virus A/M/53 o A/C/53 a la MOI indicada y se
analizaron como en el apartado A). La flecha indica la posición de
la proteína p53.
Las Figuras 6A a 6C muestran el cambio de
morfología de Saos-2 dependiente de p53. Las células
Saos-2 subconfluentes (1 x 10^{5} células/placa
de 10 cm) o no fueron infectadas (A), fueron infectadas a una MOI =
50 con (B) el virus A/M de control o con (C) el virus A/C/53. Las
células fueron fotografiadas 72 horas después de la infección.
La Figura 7 muestra la inhibición de la síntesis
de ADN dependiente de p53 en líneas celulares tumorales humanas
mediante A/M/N/53 y A/C/N/53. Se infectaron nueve líneas celulares
tumorales diferentes con adenovirus de control A/M
(-x-x-), o el virus A/M/N/53
(-\Delta-\Delta-) que expresaba p53, o A/C/N/53
(-O-O-) a una MOI creciente indicada. El tipo de
tumor y el estatus de p53 se indican para cada línea celular (wt =
tipo salvaje, nulo = proteína no expresada, mut = proteína mutante
expresada). Se midió la síntesis de ADN 72 horas después de la
infección como se describe más abajo en el Experimento Núm. II. Los
resultados son de las medidas por triplicado a cada dosis (media
+/- DT), y se trazan como el % de control del medio versus MOI. *
Las células H69 solamente fueron sometidas a ensayo con virus A/M y
A/M/N/53.
La Figura 8 muestra la tumorigenicidad de
células Saos-2 infectadas con p53 en ratones
carentes de sistema inmunitario. Las células Saos-2
fueron infectadas con el virus A/M de control o A/M/N/53 con p53
recombinante a una MOI = 30. Las células tratadas fueron inyectadas
subcutáneamente en los flancos de los ratones carentes de sistema
inmunitario, y las dimensiones del tumor fueron medidas (como se
describe en el Experimento Núm. II) dos veces por semana durante 8
semanas. Se trazaron los resultados como el tamaño del tumor versus
los días después de la implantación de las células tumorales tanto
para las células tratadas con A/M (-x-x-) de control
como con A/M/N/53 (-\Delta-\Delta-). Las barras
de error representan el tamaño medio del tumor =/- ETM para cada
grupo de 4 animales en cada momento puntual.
La Figura 9 es la expresión de ARN rAd/p53 en
tumores establecidos. Se inyectaron células H69 (SCLC)
subcutáneamente en ratones carentes de sistema inmunitario y se
dejó que desarrollaran tumores durante 32 días hasta alcanzar un
tamaño de aproximadamente 25-50 mm^{3}. Se
escogieron los ratones al azar y se les inyectaron peritumoralmente
2 x 10^{9} pfu de virus A/C/-gal de control o A/C/53. Los tumores
fueron extirpados a los 2 y 7 días de la inyección, y se preparó
ARN poliA a partir de cada muestra de tumor. Se llevó a cabo la
RT-PCR utilizando concentraciones de ARN iguales y
cebadores específicos para el mensaje de p53 recombinante. Se
realizó la amplificación por PCR durante 30 ciclos a 94ºC 1 min.,
55ºC 1,5 min., 72ºC 2 min., y un período de prolongación final de
10 min., a 72ºC en un ciclador térmico Omnigen (Hybaid). Los
cebadores de la PCR utilizados fueron un ADNc Líder Tripartito 5'
(5'-CGCCACC
GAGGGACCTGAGCGAGTC-3') y un cebador p53 3' (5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Las calles 1, 2, 4, y 5 son muestras tratadas con p53 extirpadas el día 2 o 7 según se indique. Las calles 3 y 6 son de tumores tratados con \beta-gal. Las calles 7,8, y 9 son réplicas de las calles 4,5, y 6 respectivamente, amplificadas con cebadores de actina para verificar una carga igual. La calle 10 es un control positivo que utiliza un plásmido que contiene el tripartito/p53.
GAGGGACCTGAGCGAGTC-3') y un cebador p53 3' (5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Las calles 1, 2, 4, y 5 son muestras tratadas con p53 extirpadas el día 2 o 7 según se indique. Las calles 3 y 6 son de tumores tratados con \beta-gal. Las calles 7,8, y 9 son réplicas de las calles 4,5, y 6 respectivamente, amplificadas con cebadores de actina para verificar una carga igual. La calle 10 es un control positivo que utiliza un plásmido que contiene el tripartito/p53.
Las Figuras 10A y 10B muestran la supresión del
tumor in vivo y el aumento del tiempo de supervivencia con
A/M/N/53. Se inyectaron células tumorales H69 (SCLC) subcutáneamente
en ratones carentes de sistema inmunitario y se dejó que se
desarrollaran durante 2 semanas. Se administraron inyecciones
peritumorales de tampón solo (- - -), adenovirus A/M de
control (-x-x-), o A/M/N/53
(-\Delta-\Delta), ambos virus (2 x 10^{9}
pfu/inyección) dos veces por semana durante un total de 8 dosis. Se
midieron las dimensiones del tumor dos veces por semana y se estimó
el volumen del tumor como se describe en el Experimento Núm. II. A)
Se trazó el tamaño del tumor para cada virus versus tiempo (días)
después de la inoculación de células H69. Las barras de error
indican el tamaño medio del tumor +/- ETM para cada grupo de 5
animales. Las flechas indican los días de las inyecciones con
virus. B) Se controló la supervivencia de los ratones y se trazó la
fracción de ratones supervivientes por grupo versus el tiempo post
inoculación de las células H69 tratadas con tampón solo
(- - - -), virus de control A/M
(\cdot\cdot\cdot \cdot\cdot\cdot \cdot\cdot\cdot)
o A/M/N/53 (--).
Las Figuras 11A a 11C muestran mapas de
construcciones de plásmidos recombinantes. Los plásmidos se
construyeron como se detalla más abajo. Las líneas en negrita de
los constructos indican los genes de interés mientras las
indicaciones en negrita indican los sitios de restricción utilizados
para generar los fragmentos que se van a ligar entre sí para formar
el plásmido subsiguiente como se indica mediante las flechas. En la
Figura 11A, se construyó el plásmido pACNTK subclonando el gen
HSV-TK a partir de pMLBKTK (ATCC Núm. 39369) en el
poliligador de un vector de clonación, seguido de aislamiento del
gen TK con los extremos deseados para la clonación en el vector
pACN. El vector contiene las secuencias adenovirales necesarias para
que se produzca la recombinación in vivo para formar
adenovirus recombinante (véase la Figura 12). En la Figura 11B, se
muestra la construcción del plásmido pAANTK comenzando por los
fragmentos amplificados por PCR que codifican las regiones
intensificadora de \alpha-fetoproteína
(AFP-E) y promotora (AFP-P)
subclonadas a través de diversas etapas en un plásmido final en el
que el intensificador y el promotor de AFP se encuentran aguas
arriba del gen HSV-TK seguido de las secuencias del
adenovirus de Tipo 2 necesarias para que se produzca la
recombinación in vivo para formar el adenovirus recombinante.
En la Figura 11C, se muestra la construcción del plásmido pAANCAT
comenzando por el aislamiento del gen de la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) de un plásmido disponible en el mercado y
la subclonación del mismo en el plásmido pAAN (véase más arriba),
generando el plásmido final pAANCAT donde el
intensificador/promotor de AFP dirige la transcripción del gen CAT
en un fondo de secuencia de adenovirus.
La Figura 12 es un mapa esquemático de
adenovirus recombinantes ACNTK, AANTK y AANCAT. Para construir
adenovirus recombinantes a partir de los plásmidos descritos en la
Figura 11, se linealizaron 4 partes (20 \mug) de plásmido pACNTK,
pAANTK, o pAANCAT con Eco R1 y se cotransfectaron con 1 parte (5
\mug) del fragmento grande de adenovirus recombinante digerido
con Cla 1 (rAC\beta-gal) que contenía una deleción
de la región E3 (Wills et al., 1994). En los virus
resultantes, los nucleótidos 360-4021 de Ad 5 son
remplazados por el promotor de CMV y el ADNc líder tripartito (TPL)
o por el intensificador y el promotor de la
\alpha-fetoproteína (AFP) que conducen la
expresión del gen TK o CAT de HSV-1 como se indica.
Los adenovirus recombinantes resultantes se denominan ACNTK, AANTK,
y AANCAT respectivamente.
La Figura 13 muestra la especificidad del
promotor de la expresión de CAT en los vectores adenovirales
recombinantes. Se infectaron dos (2) X 10^{6} de las líneas
celulares diseñadas a las MOI = 30 o 100 del adenovirus recombinante
AANCAT como se indica o se dejaron sin infectar (UN). Las células
Hep G2 y Hep 3B expresan la \alpha-fetoproteína
mientras las otras líneas celulares no lo hacen. Al cabo de tres
días, se recogieron las células, se ajustaron los volúmenes
extraídos a concentraciones totales de proteína iguales, y se midió
la actividad CAT como se describe en la sección Métodos, más abajo.
Un número igual de células no infectadas sirvió como controles
individuales para la actividad CAT de fondo, mientras el
cloranfenicol marcado con C^{14} (C^{14}- solo) y el extracto
de una línea celular estable (B21) que expresaba actividad CAT
sirvieron como controles negativo y positivo respectivamente. Se
indica el porcentaje de conversión de acetil CoA, demostrando que la
expresión de CAT está limitada a aquellas células que expresan la
\alpha-fetoproteína.
La Figura 14 muestra los efectos del tratamiento
con TK/GCV sobre líneas celulares de carcinoma hepatocelular y los
efectos de la especificidad del promotor. Se infectaron las líneas
celulares Hep-G2 (AFP positiva) y HLF (AFP
negativa) durante la noche con virus ACNTK [-\Delta-] AANTK
[-\ding{115}-], o control ACN [-\Box-] a una multiplicidad de
infección de 30 y con posterioridad se trataron con un única dosis
de ganciclovir a las concentraciones indicadas. Se evaluó la
proliferación celular añadiendo timidina-H^{3} a
las células aproximadamente 18 horas antes de la cosecha. Se midió
la incorporación de timidina-H^{3} al ácido
nucleico celular 72 horas después de la infección (Top Count,
Packard y se expresó como un porcentaje (media +/- D.T.) del
control no tratado. Los resultados muestran una inhibición de la
proliferación dependiente de la dosis no selectiva con el
constructo conducido por CMV, mientras TK conducido por AFP inhibe
selectivamente Hep-G2.
La Figura 15 muestra la citotoxicidad de ACNTK
más ganciclovir en HCC. Se infectaron células HLF a una MOI de 30
con ACNTK [-\bullet-] o el virus de control ACN [-\Box-] y se
trataron con ganciclovir a las dosis indicadas. Setenta y dos (72)
horas después del tratamiento con ganciclovir, se midió la cantidad
de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el sobrenadante celular
colorimétricamente y se trazó media +/- ETM) versus concentración
de ganciclovir para los dos grupos tratados con virus.
Las Figuras 16A y 16B muestran el efecto de
ACNTK más ganciclovir sobre tumores de carcinoma hepatocelular
(HCC) establecido en ratones carentes de sistema inmunitario. Se
inyectaron una (1) X 10^{7} células Hep 3B subcutáneamente en el
flanco de ratones hembra carentes de sistema inmunitario y se dejó
que crecieran durante 27 días. Después los ratones recibieron
inyecciones intratumorales y peritumorales de virus ACNTK
[-\bullet-] o control ACN [-\Box-] (1 X 10^{9} ui en un
volumen de 100 \mul) un día si y otro no durante un total de tres
dosis (indicado mediante flechas). Las inyecciones de ganciclovir
(100 mg/kg ip) comenzaron 24 horas después de la dosis de virus
inicial y continuaron durante un total de 10 días. En la Figura 6A,
los tamaños de los tumores se trazan para cada virus versus días
post infección (media +/- ETM). En la Figura 6B, el peso corporal
para cada grupo de animales tratado con virus se traza como la media
+/- ETM versus días post infección.
\vskip1.000000\baselineskip
Para reducir la frecuencia de contaminación con
el adenovirus de tipo salvaje, es deseable mejorar el virus o la
línea celular para reducir la probabilidad de recombinación. Por
ejemplo, se podría utilizar un adenovirus de un grupo con una baja
homología con los virus del grupo C para diseñar virus recombinantes
con poca propensión a la recombinación con las secuencias de Ad5 en
las células 293. Sin embargo, un método alternativo, más fácil para
reducir la recombinación entre las secuencias virales y celulares
consiste en incrementar el tamaño de la deleción en el virus
recombinante y reducir de ese modo el grado de secuencia compartida
entre éste y los genes de Ad5 en las células 293.
Las deleciones con una extensión de más de 3,5
kb desde el extremo 5' del genoma adenoviral afectan al gen para la
proteína IX adenoviral y no se consideraban deseables en los
vectores adenovirales (véase más abajo).
El gen de la proteína IX de los adenovirus
codifica un componente minoritario de la cápside adenoviral externa
que estabiliza el grupo de nueve hexonas que componen la mayoría de
las cápsides virales (Stewart (1993)). Basándose en el estudio de
los mutantes por deleción de adenovirus, se pensó inicialmente que
la proteína IX era un componente no esencial de los adenovirus,
aunque su ausencia estuviera asociada con una mayor labilidad
térmica que la observada con el virus de tipo salvaje (Colby y Shenk
(1981)). Más recientemente se descubrió que la proteína IX es
esencial para empaquetar el ADN viral completo en cápsides y que en
ausencia de proteína IX, solamente los genomas al menos 1 kb más
pequeños que el de tipo salvaje podían ser propagados como virus
recombinantes (Ghosh-Choudhury et al.
(1987)). Dada esta limitación de empaquetamiento, las deleciones de
la proteína IX no han sido consideradas deliberadamente en el diseño
de vectores adenovirales.
Por ejemplo, el vector adenoviral descrito por
Venkatesh L.K. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) Vol.
87, págs. 8746-8750) contiene una deleción en la
región E1a/E1b que se extiende desde un sitio de restricción PvuII
a un sitio de restricción 8g111, de manera que el gen que codifica
la proteína IX permanece intacto.
En esta solicitud, se hace referencia a libros
de texto convencionales de biología molecular que contienen
definiciones, métodos y medios para llevar a cabo técnicas básicas,
abarcadas por la presente invención. Véase por ejemplo, Sambrook
et al. (1989) y las diversas referencias allí citadas.
Al contrario de lo que se sabía en la técnica,
esta invención reivindica el uso de adenovirus recombinantes que
portan deleciones del gen de la proteína IX como medio para reducir
el riesgo de contaminación por adenovirus de tipo salvaje en
preparaciones de virus para su uso en aplicaciones de diagnóstico y
terapéuticas tales como la terapia génica. Según se utiliza en la
presente memoria, se pretende que el término "recombinante"
represente una progenie formada como resultado de la ingeniería
genética. Estas deleciones pueden separar de 500 a 700 pares de
bases adicionales de la secuencia de ADN que está presente en los
virus con E1 suprimida convencionales, y es asequible para la
recombinación con las secuencias de Ad5 integradas en las células
293. Los adenovirus recombinantes basados en cualquier virus del
grupo C, serotipo 1, 2, 5 y 6, están incluidos en esta invención.
También está incluido en esta invención un híbrido Ad2/Ad5 basado en
un virus recombinante que expresa el ADNc de p53 humano a partir
del promotor tardío principal del adenovirus de tipo 2. Este
constructo fue ensamblado como se muestra en la Figura 1. El virus
resultante porta una deleción 5' de secuencias adenovirales que se
extienden desde aproximadamente el nucleótido 357 al 4020 y elimina
los genes E1a y E1b así como la secuencia codificante de la
proteína IX completa, dejando el sitio de poliadenilación compartido
por los genes de E1b y la proteína IX intactos para su uso en la
terminación de la transcripción de cualquier gen deseado. En la
Figura 4 se muestra una realización separada. Alternativamente, la
deleción se puede extender de 30 a 40 pares de bases más sin
afectar al gen adyacente para la proteína IVa2, aunque en ese caso
se proporciona una señal de poliadenilación exógena para terminar
la transcripción de los genes insertados en el virus recombinante.
El virus inicial construido con esta deleción es fácilmente
propagado en las células 293 sin evidencia de contaminación viral
de tipo salvaje y dirige una expresión de p53 robusta desde la
unidad transcripcional insertada en el sitio de la deleción.
La capacidad del inserto de los virus
recombinantes que portan la deleción de la proteína IX descritos
antes es de aproximadamente 2,6 kb. Esta es suficiente para muchos
genes incluyendo el ADNc de p53. La capacidad del inserto se puede
incrementar introduciendo otras deleciones en la cadena principal
adenoviral, por ejemplo, deleciones dentro de las regiones
tempranas 3 o 4 (para una revisión véase: Graham y Prevec (1991)).
Por ejemplo, el uso de una cadena principal adenoviral que contiene
una deleción de 1,9 kb de una secuencia no esencial dentro de la
región temprana 3. Con esta deleción adicional, la capacidad del
inserto del vector aumenta a aproximadamente 4,5 kb,
suficientemente grande como para ADNc mucho mayores, incluyendo el
del gen supresor del tumor de retinoblastoma.
Un vector de expresión de adenovirus
recombinante caracterizado por una deleción total del ADN de la
proteína IX adenoviral y que tiene un gen que codifica una proteína
foránea, donde la proteína foránea es una proteína supresora de
tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb,
proteína WT1 del tumor de Wilm, h-NUC y mitosina.
Estos vectores son útiles para la producción recombinante segura de
polipéptidos y proteínas de diagnóstico y terapéuticos, y más
importantemente, para la introducción de genes en la terapia génica.
Se puede utilizar cualquier casete de expresión en los vectores de
esta invención. Una "casete de expresión" representa una
molécula de ADN que tiene un promotor/intensificador de la
transcripción tal como el promotor intensificador de CMV, etc., un
gen foráneo, y en algunas realizaciones definidas más abajo, una
señal de poliadenilación. Según se utiliza en la presente memoria,
se pretende que el término "gen foráneo" represente una
molécula de ADN no presente en la orientación y posición exactas
como molécula de ADN contraparte encontrada en el adenovirus de
tipo salvaje. El gen foráneo es una molécula de ADN de hasta 4,5
kilobases. "Vector de expresión" representa un vector que
produce la expresión de las secuencias de ADN insertadas cuando se
propaga en una célula anfitriona adecuada, esto es, la proteína o
polipéptido codificado por el ADN es sintetizado por el sistema del
anfitrión.
Los promotores inducibles también se pueden
utilizar en el vector adenoviral de esta invención. Estos promotores
iniciarán la transcripción solamente en presencia de una molécula
adicional. Los ejemplos de los promotores inducibles incluyen
aquellos obtenibles de un gen de interferón \beta, un gen de
choque térmico, un gen de metalotioneína o aquellos obtenibles a
partir de genes sensibles a hormonas esteroideas. La expresión
específica de los tejidos ha sido bien caracterizada en el campo de
la expresión génica y los promotores inducibles y específicos de
los tejidos tales como estos son muy bien conocidos en la técnica.
Estos genes se utilizan para regular la expresión del gen foráneo
después de haber sido introducido en la célula diana.
La presente invención también abarca un vector
de expresión de adenovirus recombinante, como se ha descrito antes,
que tiene deleciones menos extensas de la secuencia del gen de la
proteína IX que se extienden de 3500 pb a partir del extremo viral
5' a aproximadamente 4000 pb, en una realización. En una realización
separada, el vector de expresión de adenovirus recombinante puede
tener una deleción adicional de una secuencia de ADN no esencial en
la región temprana de adenovirus 3 y/o 4 y/o una deleción de las
secuencias de ADN denominadas E1a y E1b de adenovirus. En esta
realización, el gen foráneo es una molécula de ADN de un tamaño de
hasta 4,5 kilobases.
Una realización adicional tiene una deleción de
hasta cuarenta nucleótidos situados 3' con respecto a la deleción
de E1a y E1b y pIX y una molécula de ADN foráneo que codifica una
señal de poliadenilación insertada en el vector recombinante en una
posición relativa al gen foráneo para regular la expresión del gen
foráneo.
Para los fines de esta invención, el vector de
expresión de adenovirus recombinante puede derivar de un adenovirus
del grupo de tipo salvaje, serotipo 1, 2, 5 o 6.
En una realización, el vector de expresión de
adenovirus recombinante tiene un gen foráneo que codifica una
proteína supresora de tumores funcional, o un fragmento
biológicamente activo de la misma. Según se utiliza en la presente
memoria, el término "funcional" cuando se refiere a un gen
supresor de tumores, hace referencia a genes supresores de tumores
que codifican proteínas supresoras de tumores que inhiben
eficazmente el comportamiento de una célula como célula tumoral.
Los genes funcionales pueden incluir, por ejemplo, el tipo salvaje
de genes normales y las modificaciones de los genes normales que
conservan su capacidad para codificar proteínas supresoras de
tumores eficaces y otros genes anti-tumorales tales
como una proteína suicida condicional o una toxina.
De un modo similar, "no funcional" según se
utiliza en la presente memoria es sinónimo de "inactivado". Los
genes no funcionales o defectuosos pueden estar causados por una
variedad de eventos, incluyendo por ejemplo mutaciones puntuales,
deleciones, metilación y otros conocidos por los expertos en la
técnica.
Según se utiliza en la presente memoria, un
"fragmento activo" de un gen incluye porciones más pequeñas del
gen que conservan la capacidad de codificar proteínas que tienen
actividad supresora de tumores. p56^{RB}, descrito más
completamente más abajo, es un ejemplo de un fragmento activo de un
gen supresor de tumores funcional. Las modificaciones de los genes
supresores de tumores también están contempladas dentro del
significado de fragmento activo, tales como las adiciones,
deleciones o sustituciones, con tal que se conserve la actividad
funcional del gen no modificado.
Otro ejemplo de gen supresor de tumores es el
retinoblastoma (RB). Las secuencias de nucleótidos del ADNc de RB
completo y las secuencias de aminoácidos pronosticadas de la
proteína RB resultante (denominadas p110^{RB}) son mostradas por
Lee et al. (1987) y en la Figura 3. También es útil para
expresar la proteína supresora de tumores retinoblastoma la
molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en
la Figura 2 o que tiene la secuencia de ADN mostrada en la Figura
3. Asimismo es útil una versión truncada de p110^{RB}, denominada
p56^{RB}. Para la secuencia de p56^{RB}, véase Huang et
al. (1991). Se pueden utilizar genes supresores de tumores
adicionales en los vectores de esta invención. Estos pueden ser la
proteína p16 (Kamb et al. (1994)), la proteína p21, la
proteína WT1 del tumor de Wilm, la mitosina, h-NUC,
o la proteína DCC del carcinoma de colon. La mitosina es descrita
por X. Zhu y W-H Lee, Solicitud de los Estados
Unidos Núm. de Serie 08/141.239, presentada el 22 de Octubre de
1993, y una continuación en parte posterior de los mismos
inventores, número de declaración para la solicitud
P-CJ 1191, presentada el 24 de Octubre de 1994. De
un modo similar, h-NUC es descrita por
W-H Lee y P-L Chen, Solicitud de los
Estados Unidos Núm. de Serie 08/170.586, presentada el 20 de
Diciembre de 1993.
Como es sabido por los expertos en la técnica,
el término "proteína" representa un polímero lineal de
aminoácidos reunidos en una secuencia específica por medio de
enlaces peptídicos. Según se utiliza en la presente memoria, el
término "aminoácido" hace referencia a la forma
estereoisomérica D o L del aminoácido, a menos que se designe
específicamente de otro modo. También están incluidas las proteínas
equivalentes o los péptidos equivalentes que tienen, p. ej., la
actividad biológica de la proteína supresora de tumores de tipo
salvaje purificada. "Proteínas equivalentes" y "polipéptidos
equivalentes" hacen referencia a compuestos que se originan a
partir de la secuencia lineal de las proteínas o polipéptidos de
origen natural, pero que tienen sustituciones de aminoácidos que no
cambian su actividad biológica. Estos equivalentes pueden diferir de
las secuencias nativas mediante remplazo de uno o más aminoácidos
por aminoácidos relacionados, por ejemplo, aminoácidos similarmente
cargados, o sustitución o modificación de las cadenas laterales o
los grupos funcionales.
También están incluidos en la definición de
proteína supresora de tumores funcional cualquier proteína cuya
presencia reduce la tumorigenicidad, la malignidad o el fenotipo
hiperproliferativo de la célula anfitriona. Los ejemplos de las
proteínas supresoras de tumores de esta definición incluyen, pero no
están limitados a p110^{RB}, p56^{RB}, mitosina,
h-NUC y p53. Se pretende que "tumorigenicidad"
represente la capacidad para formar tumores o la capacidad de
ocasionar la formación de tumores y es sinónimo de crecimiento
neoplásico. Se pretende que "malignidad" describa una célula
tumorigénica que tiene la capacidad de formar metástasis y poner en
riesgo la vida del organismo anfitrión. Se pretende que "fenotipo
hiperproliferativo" describa una célula en crecimiento y
división a una velocidad más allá de las limitaciones de crecimiento
normales para ese tipo celular. También se pretende que
"neoplásico" incluya células que carecen de una proteína
supresora de tumores funcional endógena o la incapacidad de la
célula para expresar un ácido nucleico endógeno que codifique una
proteína supresora de tumores funcional.
Un ejemplo de un vector de esta invención es un
vector de expresión de adenovirus recombinante que tiene un gen
foráneo que codifica la proteína p53 o uno de sus fragmentos activos
es proporcionado por esta invención. La secuencia codificante del
gen p53 se muestra más abajo en la Tabla I.
Cualquiera de los vectores de expresión
descritos en la presente memoria es útil como composición para la
diagnosis o la terapia. Los vectores se pueden utilizar para
escrutar cuál de los muchos genes supresores de tumores podría ser
útil en la terapia génica. Por ejemplo, se puede recoger una muestra
de las células que se sospecha que son neoplásicas de un sujeto y
mamífero. Las células se pueden poner en contacto, con condiciones
adecuadas y con una cantidad eficaz de un vector recombinante de
esta invención que tenga insertado en él un gen foráneo que
codifique uno de los diversos genes supresores de tumores
funcionales. Se puede medir si la introducción de este gen
revertirá el fenotipo maligno mediante formación de colonias en agar
blando o formación de tumores en ratones carentes de sistema
inmunitario. Si se revierte el fenotipo maligno, se determina que
el gen foráneo es un candidato positivo para la terapia génica
acertada del sujeto o mamífero. Cuando se utilizan
farmacéuticamente, se pueden combinar con uno o más portadores
farmacéuticamente aceptables. Los portadores farmacéuticamente
aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones
acuosas tales como solución salina tamponada fisiológicamente u
otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol,
aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva) o ésteres orgánicos
inyectables. Se puede utilizar un portador farmacéuticamente
aceptable para administrar las presentes composiciones a una célula
in vitro o a un sujeto in vivo.
Un portador farmacéuticamente aceptable puede
contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por
ejemplo, para estabilizar la composición o para incrementar o
disminuir la absorción del agente. Un compuesto fisiológicamente
aceptable puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como
glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido
ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso
molecular u otros estabilizantes o excipientes. Otros compuestos
fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes
emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son
particularmente útiles para evitar el crecimiento o la acción de
los microorganismos. Los diversos conservantes son bien conocidos e
incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la
técnica sabrá que la elección de un portador farmacéuticamente
aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable,
depende, por ejemplo, de la ruta de administración del polipéptido
y de las características fisico-químicas concretas
del polipéptido específico. Por ejemplo, un compuesto
fisiológicamente aceptable tal como monoestearato de aluminio o
gelatina es particularmente útil como agente retardador, que
prolonga la velocidad de absorción de una composición farmacéutica
administrada a un sujeto. Se pueden encontrar ejemplos adicionales
de portadores, estabilizantes o coadyuvantes en Martin, Remington's
Pharm. Sci., 15ª Ed. (Mack Publ. Co., Easton, 1975). La composición
farmacéutica también se puede incorporar, si se desea, a liposomas,
microesferas u otras matrices poliméricas (Gregoriadis, Liposome
Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida 1984)). Los
liposomas, por ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros
lípidos, son portadores no tóxicos, fisiológicamente aceptables y
metabolizables que son relativamente simples de elaborar y
administrar.
Según se utiliza en la presente memoria,
"composición farmacéutica" hace referencia a cualquiera de las
composiciones de materia descritas en la presente memoria combinada
con uno o más de los portadores farmacéuticamente aceptables
anteriores. Las composiciones se pueden administrar después
terapéuticamente o profilácticamente. Se pueden poner en contacto
con la célula anfitriona in vivo, ex vivo, o in
vitro, en una cantidad eficaz. Los medios in vitro y
ex vivo para poner en contacto las células anfitrionas se
proporcionan más abajo. Cuando se ponen en práctica in vivo,
los métodos de administración de un fármaco que contiene un vector
de esta invención, son bien conocidos en la técnica e incluyen pero
no están limitados a, la administración oral,
intra-tumoral, intravenosa, intramuscular o
intraperitoneal. La administración se puede efectuar continuamente
o intermitentemente y variará con el sujeto y la condición que se
vaya a tratar, p. ej., en el caso de otras composiciones
terapéuticas (Landmann et al. (1992); Aulitzky et al.
(1991); Lantz et al. (1990); Supersaxo et al. (1988);
Demetri et al. (1989); y LeMaistre et al. (1991)).
Adicionalmente esta invención proporciona una
célula anfitriona procariótica o eucariótica transformada, por
ejemplo una célula animal o una célula de mamífero, que tiene
insertado un vector de expresión de adenovirus recombinante
descrito antes. Las células procarióticas adecuadas incluyen pero no
están limitadas a células bacterianas tales como células de E.
coli. Los métodos de transformación de células anfitrionas con
vectores retrovirales son conocidos en la técnica, véase Sambrook
et al. (1989) e incluyen, pero no están limitados a
transfección, electroporación, y microinyección.
Según se utiliza en toda esta solicitud, se
pretende que el término animal sea sinónimo de mamífero e incluya,
pero no esté limitado a bovino, porcino, felino, simio, canino,
equino, murino, ratas o seres humano. Las células anfitrionas
adicionales incluyen pero no están limitadas a cualquier célula
neoplásica o tumoral, tal como osteosarcoma, carcinoma ovárico,
carcinoma de mama, melanoma, hepatocarcinoma, cáncer de pulmón,
cáncer de cerebro, cáncer colorrectal, de células hematopoyéticas,
cáncer de próstata, carcinoma cervical, retinoblastoma, carcinoma
esofágico, cáncer de vejiga, neuroblastoma, o cáncer renal.
Adicionalmente, cualquier línea celular
eucariótica capaz de expresar E1a y E1b o E1a, E1b y pIX es un
anfitrión adecuado para este vector. En una realización, una célula
anfitriona eucariótica adecuada es la línea celular 293 asequible
de la Colección de Cultivos Tipo Americana, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland, EEUU. 20231.
Cualquiera de las células anfitrionas
transformadas descritas en la presente memoria es útil como
composición para la diagnosis o la terapia. Cuando se utilizan
farmacéuticamente, se pueden combinar con diversos portadores
farmacéuticamente aceptables. Los portadores farmacéuticamente
aceptables adecuados son bien conocidos por los expertos en la
técnica y son, por ejemplo, los descritos antes. Las composiciones
se pueden administrar después terapéuticamente o profilácticamente,
en cantidades eficaces, descritas con más detalle más abajo.
También se proporciona un método de
transformación de una célula anfitriona. Este método estipula poner
en contacto una célula anfitriona, esto es, una célula anfitriona
procariótica o eucariótica, con cualquiera de los vectores de
expresión descritos en la presente memoria y en condiciones
adecuadas. El contacto se puede efectuar in vitro, in vivo,
o ex vivo, utilizando métodos bien conocidos en la técnica
(Sambrook et al. (1989)) y utilizando cantidades eficaces de
los vectores de expresión. También se proporciona en esta invención
un método de producción de una proteína o polipéptido recombinante
haciendo crecer la célula anfitriona transformada en condiciones
adecuadas que favorezcan la transcripción y la traducción del gen
foráneo insertado. Los métodos de expresión recombinante en una
variedad de células anfitrionas, tales como células de mamífero,
levadura, insecto o bacterianas, son ampliamente conocidos,
incluyendo los descritos por Sambrook et al., supra.
El gen foráneo traducido se puede aislar después mediante métodos
convencionales, tales como la purificación en columna o la
purificación utilizando un anticuerpo anti-proteína.
También se pretende que la proteína o polipéptido aislado estén
dentro del alcance de esta invención. Según se utiliza en la
presente memoria, purificado o aislado significa sustancialmente
libre de proteínas o ácidos nucleicos nativos normalmente asociados
con la proteína o polipéptido en el entorno nativo o de la célula
anfitriona.
También son proporcionados por esta invención
los animales no humanos que tienen insertados los vectores de
expresión o las células anfitrionas transformadas de esta invención.
Estos animales "transgénicos" se elaboran utilizando métodos
bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo como se
describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.175.384 o
mediante técnicas de terapia ex vivo convencionales, como
describen Culver et al. (1991).
Como se muestra con detalle más abajo, los
adenovirus recombinantes que expresan una p53 de tipo salvaje
supresora de tumores, como se ha descrito antes, pueden inhibir
eficazmente la síntesis de ADN y suprimir el crecimiento de una
amplia gama de tipos celulares tumorales humanos, incluyendo dianas
clínicas. Además, los adenovirus recombinantes pueden expresar
genes de supresión de tumores tales como p53 en un tumor establecido
in vivo sin contar con la inyección directa en el tumor o el
tratamiento ex vivo previo de las células cancerosas. La p53
expresada es funcional y suprime eficazmente el crecimiento tumoral
in vivo y aumenta significativamente el tiempo de
supervivencia en un modelo de ratón carente de sistema inmunitario
de cáncer de pulmón humano.
De este modo, los vectores de esta invención son
particularmente adecuados para la terapia génica. Por consiguiente,
los métodos de terapia génica que utilizan estos vectores están
dentro del alcance de esta invención. El vector se purifica y
después se administra una cantidad eficaz in vivo o ex
vivo al sujeto. Los métodos de la terapia génica son bien
conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Larrick, J.W. y Burck,
K.L. (1991) y Kreigler, M. (1990). "Sujeto" representa
cualquier animal, mamífero, rata, murino, bovino, porcino, equino,
canino, felino o paciente humano. Cuando el gen foráneo codifica un
gen supresor de tumores u otra proteína
anti-tumoral, el vector es útil para tratar o
reducir las células hiperproliferativas en un sujeto, para inhibir
la proliferación tumoral en un sujeto o para aliviar una patología
afín concreta. Las células hiperproliferativas patológicas son
características de los siguientes estados de enfermedad, hiperplasia
tiroidea - Enfermedad de Grave, psoriasis, hipertrofia prostática
benigna, síndrome Li-Fraumeni incluyendo cáncer de
mama, sarcomas y otros neoplasmas, cáncer de vejiga, cáncer de
colon, cáncer de pulmón, diversas leucemias y linfomas. Los
ejemplos de las células hiperproliferativas no patológicas se
encuentran, por ejemplo, en las células epiteliales de los
conductos mamarios durante el desarrollo de la lactancia y también
en células asociadas con la reparación de heridas. Las células
hiperproliferativas patológicas muestran característicamente pérdida
de inhibición de contacto y un descenso de su capacidad para
adherirse selectivamente que implica un cambio en las propiedades
de la superficie de la célula y una interrupción adicional en la
comunicación intercelular. Estos cambios incluyen la estimulación
de la división y la capacidad para secretar enzimas
proteolíticas.
Se pretende que el término "tumorigenicidad
reducida" represente células tumorales que han sido convertidas
en células menos tumorigénicas o no tumorigénicas. Las células con
una tumorigenicidad reducida no forman tumores in vivo o
presentan un lapso de tiempo prolongado de semanas a meses antes de
la aparición de crecimiento tumoral in vivo y/o una masa
tumoral tridimensional de crecimiento más lento en comparación con
los tumores que tienen genes supresores de tumores totalmente
inactivados o no funcionales.
Según se utiliza en la presente memoria, se
pretende que el término "cantidad eficaz" represente la
cantidad de vector o proteína anti-cancerosa que
logra un resultado positivo sobre el control de la proliferación
celular. Por ejemplo, una dosis contiene de aproximadamente
10^{8} a aproximadamente 10^{13} unidades infecciosas. El curso
de tratamiento típico sería una de tales dosis al día a lo largo de
un período de cinco días. La cantidad eficaz variará con la
patología o la condición a tratar, el paciente y su estatus, y otros
factores bien conocidos por los expertos en la técnica. Las
cantidades eficaces son fácilmente determinadas por los expertos en
la técnica.
También está dentro del alcance de esta
invención el uso de los vectores de la invención en un método de
tratamiento del cáncer de vejiga en un sujeto.
Esta invención también proporciona el uso de los
vectores de la invención en un método para reducir la proliferación
de las células tumorales de vejiga en un sujeto.
Como en el uso de los genes supresores de
tumores descritos previamente, el uso de otros genes
anti-tumorales, ya sea solos o combinados con el
agente terapéutico apropiado, proporciona un tratamiento del
crecimiento o proliferación celular incontrolados característicos
de tumores y malignidades. De este modo, esta invención hace
referencia a una terapia para detener el crecimiento celular
incontrolado en el paciente con cáncer de vejiga, aliviando de ese
modo los síntomas de la enfermedad o la caquexia presentes en el
paciente. El efecto de este tratamiento incluye, pero no está
limitado a, prolongación del tiempo de supervivencia del paciente,
reducción de la masa o carga tumoral, apoptosis de las células
tumorales o reducción del número de células tumorales circulantes.
Los medios para cuantificar los efectos beneficiosos de esta terapia
son bien conocidos por los expertos en la técnica.
El método de liberación específica del tumor de
un gen supresor de tumores se completa poniendo en contacto el
tejido diana de un animal con una cantidad eficaz del vector de
expresión adenoviral recombinante de esta invención. El gen está
destinado a codificar un agente anti-tumoral, tal
como un gen supresor de tumores funcional. Se pretende que "poner
en contacto" abarque cualquier método de liberación para la
transferencia eficaz del vector, tal como la inyección
intratumoral.
El uso del vector adenoviral de esta invención
para preparar medicamentos para el tratamiento del cáncer de vejiga
o para la terapia del mismo es proporcionado adicionalmente por esta
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento núm.
I
Se utilizó el plásmido pAd/MLP/p53/E1b- como
material de partida para estas manipulaciones. Este plásmido se
basa en el derivado de pBR322 pML2 (pBR322 con los pares de bases
1140 a 2490 suprimidos) y contiene secuencias de adenovirus de tipo
5 que se extienden desde el par de bases 1 al par de bases 5788
excepto que se han suprimido los pares de bases 357 a 3327 del
adenovirus de tipo 5. En el sitio de la deleción 357/3327 de Ad5 se
inserta una unidad transcripcional que está comprendida por el
promotor tardío principal de adenovirus de tipo 2, el ADNc líder
tripartito del adenovirus de tipo 2 y el ADNc de p53 humano. Este es
un vector de sustitución de E1 típico con los genes E1a y E1b de
Ad5 suprimidos pero que contiene el gen de la proteína IX de Ad5
(para una revisión de los vectores de Adenovirus véase: Graham y
Prevec (1992)). El ADN de Ad2 se obtuvo de Gibco BRL. Las
endonucleasas de restricción y la ADN ligasa de T4 se obtuvieron de
New England Biolabs. Las células E. coli DH5\alpha
competentes se adquirieron de Gibco BRL y las células 293 se
obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC). La
resina de purificación de ADN
Prep-A-Gene se obtuvo de BioRad. El
medio de crecimiento bacteriano LB se obtuvo de Difco. Las columnas
de purificación de ADN Qiagen se obtuvieron de Qiagen, Inc. Ad5
d1327 se obtuvo de R.J. Schneider, NYU. El kit de transfección de
ADN MBS se adquirió de Stratagene.
Se digirió un (1) \mug de
pAd/MLP/p53/E1b- con 20 unidades de cada una de las enzimas de
restricción Ecl 136II y NgoMI de acuerdo con las recomendaciones
del fabricante. Se digirieron cinco (5) \mug de ADN de Ad2 con 20
unidades de cada una de las endonucleasas de restricción DraI y
NgoMI de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las
digestiones de restricción se cargaron en calles separadas de un gel
de agarosa al 0,8% y se sometieron a electroforesis a 100 voltios
durante 2 horas. El fragmento de restricción de 4268 pb de la
muestra de Pad/MLP/p53/E1b- y el fragmento de 6437 pb de la muestra
de Ad2 se aislaron del gel utilizando la resina de extracción de
ADN Prep-A-Gene de acuerdo con las
especificaciones del fabricante. Los fragmentos de restricción se
mezclaron y trataron con ADN ligasa de T4 en un volumen total de 50
\mul a 16ºC durante 16 horas de acuerdo con las recomendaciones
del fabricante. Después de la ligación se utilizaron 5 \mul de la
reacción para transformar las células de E. coli DH5\alpha
para la resistencia a la ampicilina siguiendo el procedimiento del
fabricante. Se utilizaron seis colonias bacterianas resultantes de
este procedimiento para inocular cultivos de 2 ml separados del
medio de crecimiento LB y se incubaron durante la noche a 37ºC con
sacudimiento. Se preparó el ADN a partir de cada cultivo bacteriano
utilizando procedimientos convencionales (Sambrook et al.
(1989)). Un cuarto del ADN plasmídico de cada producto aislado se
digirió con 20 unidades de la endonucleasa de restricción XhoI para
escrutar en busca del recombinante correcto que contenía los
fragmentos de restricción XhoI de 3627, 3167, 2466 y 1445 pares de
bases. Cinco de los seis productos aislados escrutados contenían el
plásmido correcto. Después se utilizó uno de estos para inocular un
cultivo de 1 litro de medio LB para el aislamiento de grandes
cantidades de ADN plasmídico. Después de la incubación durante la
noche el ADN plasmídico se aisló de un cultivo de 1 litro
utilizando columnas de purificación de ADN Qiagen de acuerdo con
las recomendaciones del fabricante. El plásmido resultante se
denominó Pad/MLP/p53/PIX-. Las muestras de este plásmido se
depositaron en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EEUU, 12301, el 22 de Octubre
de 1993. El depósito se realizó bajo las estipulaciones del Tratado
de Budapest sobre el Depósito Internacional de Microorganismos con
el Propósito del Procedimiento de Patentes. Al depósito se le
otorgó el Núm. de Acceso ATCC 75576.
Para construir un adenovirus recombinante, se
trataron 10 \mug de Pad/MLP/p53/PIX- con 40 unidades de la
endonucleasa de restricción EcoRI para linealizar el plásmido. Se
digirió el ADN del adenovirus de tipo 5 d1327 (Thimmappaya (1982))
con la endonucleasa de restricción ClaI y el fragmento grande
(aproximadamente 33 kilopares de bases) se purificó mediante
centrifugación en gradiente de sacarosa. Se mezclaron diez (10)
\mug de Pad/MLP/p53/E1b- tratado con EcoRI y 2,5 \mug de Ad5
d1327 tratado con ClaI y se utilizaron para transfectar
aproximadamente 10^{6} células 293 utilizando el kit de
transfección de mamífero MBS como recomienda el proveedor. Ocho (8)
días después de la transfección las células 293 se dividieron 1 a 3
en medio de nueva aportación y dos días después este adenovirus
indujo un efecto citopático evidente en las células transfectadas.
A los 13 días de la transfección se preparó ADN a partir de las
células infectadas utilizando procedimientos convencionales (Graham
y Prevec (1991)) y se analizó mediante digestión de restricción con
la endonucleasa de restricción XhoI. La expresión de p53 dirigida
por el virus fue verificada después de la infección de células de
osteosarcoma SaoS2 con producto lisado viral e inmunotransferencia
con anticuerpo monoclonal anti-p53 denominado 1801
(Novocasta Lab. Ltd., U.K.).
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento núm.
II
Se hicieron crecer adenovirus recombinantes y se
propagaron en la línea celular de riñón embrionario humano 293
(ATCC CRL 1573) mantenida en medio DME que contenía suero de ternera
fetal al 10% (Hyclone) definido, como suplemento. Se mantuvieron
las células Saos-2 en medio de Kaighn con un
suplemento de suero de ternera fetal al 15%. Se mantuvieron células
HeLa y Hep 3B en medio DME con un suplemento de suero de ternera
fetal al 10%. Todas las demás líneas celulares se hicieron crecer
en medio Kaighn con un suplemento de suero de ternera fetal al 10%.
Las células Saos-2 fueron amablemente cedidas por el
Dr. Eric Stanbridge. Todas las demás líneas celulares se obtuvieron
de la ATCC.
Para construir los virus Ad5/p53, se aisló un
fragmento HindIII-SmaI de 1,4 kb que contenía el
ADNc completo de p53 (Tabla I) a partir
pGEM1-p53-B-T
(amablemente proporcionado por el Dr. Wen Hwa Lee) y se insertó en
el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pSP72
(Promega) utilizando procedimientos de clonación convencionales
(Sambrook et al. (1989)). El inserto de p53 se recuperó a
partir de este vector después de la digestión con
XhoI-BglII y electroforesis en gel. La secuencia
codificante de p53 se insertó después en vectores de transferencia
génica de adenovirus pNL3C o pNL3CMV (amablemente proporcionados por
el Dr. Robert Schneider) que contienen la repetición terminal
invertida 5' de Ad5 y las señales de empaquetamiento virales y el
intensificador aguas arriba de E1a del promotor tardío principal de
Ad2 (MLP) o el promotor del gen temprano inmediato de
citomegalovirus humano (CMV), seguido del ADNc líder tripartito y
la secuencia de Ad5 de 3325-5525 pb en un fondo de
PML2. Estos nuevos constructos sustituyen a la región E1 (pb
360-3325) de Ad5 con p53 dirigido por MLP de Ad2
(A/M/53) o el promotor de CMV humano (A/C/53), ambos seguidos por
el ADNc líder tripartito (véase la Figura 4). Los insertos de p53
utilizan el sitio de poliadenilación de E1b aguas abajo restante.
Se generaron recombinantes de p53 conducidos por MLP y CMV
adicionales (A/M/N/53, A/C/N/53) que tenían una deleción de 705
nucleótidos adicional de la secuencia de Ad5 para eliminar la
región codificante de la proteína IX (PIX). Como control, se generó
un adenovirus recombinante a partir del plásmido pNL3C parental sin
un inserto de p53 (A/M). Un segundo control consistió en un
adenovirus recombinante que codificaba el gen de la
beta-galactosidasa bajo el control del promotor de
CMV (A/C/\beta-gal). Los plásmidos se linealizaron
con Nru I o Eco RI y se co-transfectaron con
mutantes d1309 o d1327 de Ad5 digerido con Cla I (Jones y Shenk
(1979)) utilizando un kit de transfección Ca/PO_{4} (Stratagene).
Las placas virales se aislaron y los recombinantes se identificaron
mediante análisis con enzimas de restricción y PCR utilizando
cebadores específicos recombinantes frente a la secuencia de ADNc
líder tripartita con la secuencia de ADNc de p53 aguas abajo. El
virus recombinante se purificó adicionalmente mediante dilución
limitante, y las partículas del virus se purificaron y se titularon
mediante métodos convencionales (Graham y van der Erb (1973);
Graham y Prevec (1991)).
Se infectaron células Saos-2 o
Hep 3B (5 x 10^{5}) con los adenovirus recombinantes indicados
durante un período de 24 horas a multiplicidades de infección
crecientes (MOI) de unidades de virus formadoras de placa/célula.
Después las células se lavaron una vez con PBS y se recogieron en
tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 250
Mm, NP40 al 0,1%, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 10 \mug/ml de aprotinina,
10 \mug/ml de leupeptina, y PMSF 1 mM). Se separaron las
proteínas celulares (aproximadamente 30 \mug) mediante
SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a nitrocelulosa.
Las membranas se incubaron con anticuerpo
\alpha-p53 PAb 1801 (Novocastro) seguido de IgG
anti-ratón de oveja conjugada con peroxidasa de
rábano picante. La proteína p53 se visualizó mediante
quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham) sobre una película Kodak
XAR-5.
Las células (5 x 10^{3}/pocillo) se cultivaron
en placa en placas de titulación de 96 pocillos (Costar) y se dejó
que se fijaran durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Después las
células se infectaron durante 24 horas con partículas de virus
recombinante purificadas a MOI que oscilaban de 0,3 a 100 según se
indica. Los medios se cambiaron 24 horas después de la infección, y
la incubación continuó durante un total de 72 horas. Se añadió
timidina-H^{3} (Amersham, 1 \muCi/pocillo) 18
horas antes de la cosecha. Las células se recogieron sobre filtros
de fibra de vidrio y se midieron los niveles de radiactividad en un
contador de centelleo beta. La incorporación de
timidina-H^{3} se expresó como el % de la media
(+/- DT) de control del medio y se trazó frente a la MOI.
Se trataron aproximadamente 2,4 x 10^{8}
células Saos-2, cultivadas en placa en matraces
T225, con tampón de suspensión (sacarosa al 1% en PBS) que contenía
virus purificado A/M/N/53 o A/M a una MOI de 3 o 30. Después de
infectar durante la noche, las células se inyectaron subcutáneamente
en los flancos izquierdo y derecho de ratones atímicos carentes de
sistema inmunitario BALB/c (4 ratones por grupo). En un flanco se
inyectaron las células tratadas con A/M/N/53, mientras en el flanco
contralateral se inyectaron las células tratadas con A/M de
control, sirviendo cada ratón como su propio control. Los animales
que recibieron la inyección bilateral de células tratadas con
tampón sirvieron como controles adicionales. Después se midieron las
dimensiones del tumor (longitud, anchura y altura) y los pesos
corporales dos veces por semana a lo largo de un período de 8
semanas. Se estimaron los volúmenes de los tumores para cada animal
suponiendo una geometría esférica con un radio igual a la mitad de
la media de las dimensiones tumorales medidas.
Se inyectaron subcutáneamente 1 x 10^{7}
células de carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) H69 en
ratones atímicos carentes de sistema inmunitario BALB/c
(aproximadamente 5 semanas de edad) en sus flancos derechos. Se
dejó que los tumores progresaran durante 32 días hasta que tuvieron
aproximadamente 25-50 mm^{3}. Los ratones
recibieron inyecciones peritumorales de adenovirus recombinante
A/C/53 o A/C/\beta-gal (2 x 10^{9} unidades
formadoras de placa (pfu)) en el espacio subcutáneo por debajo de la
masa tumoral. Los tumores se extirparon de los animales a los 2 y 7
días del tratamiento con adenovirus y se enjuagaron con PBS. Las
muestras tumorales se homogeneizaron, y se aisló el ARN total
utilizando un kit TriReagent (Molecular Research Center, Inc.). Se
aisló el ARN poliA utilizando el PolyATract mRNA Isolation System
(Promega), y se utilizaron aproximadamente 10 ng de muestra para la
determinación mediante RT-PCR de la expresión del
ARNm de p53 recombinante (Wang et al. (1989)). Se diseñaron
cebadores para amplificar la secuencia entre el ADNc líder
tripartito de adenovirus y el ADNc de p53 aguas abajo, asegurándose
de que solamente se podía amplificar el p53 recombinante, y no el
endógeno.
Se inyectaron subcutáneamente aproximadamente 1
x 10^{7} células tumorales H69 (SCLC) en volúmenes de 200 \mul
en ratones hembra atímicos carentes de sistema inmunitario BALB/c.
Se dejó que los tumores se desarrollaran durante 2 semanas, en cuyo
momento los animales se aleatorizaron por el tamaño del tumor
(N=5/grupo). Las inyecciones peritumorales de adenovirus A/M/N/53 o
A/M de control (2 x 10^{9} pfu/inyección) o tampón solo (sacarosa
en PBS al 1%) se administraron dos veces por semana durante un total
de 8 dosis/grupo. Se midieron las dimensiones de los tumores y los
pesos corporales dos veces por semana durante 7 semanas, y se estimó
el volumen del tumor como se ha descrito previamente. Después se
hizo un seguimiento de los animales para observar el efecto del
tratamiento sobre la supervivencia de los ratones.
Se construyeron adenovirus con p53 remplazando
una porción de la región E1a y E1b del adenovirus de Tipo 5 por
ADNc de p53 bajo el control del promotor MLp de Ad2 (A/M/53) o CMV
(A/C/53) (esquematizado en la Figura 4). Esta sustitución de E1
deteriora gravemente la capacidad de replicar de los adenovirus
recombinantes, restringiendo su propagación a las células 293 que
suministran productos génicos de E1 de Ad 5 en trans (Graham et
al. (1977)). Después de la identificación de adenovirus
recombinante con p53 mediante digestión con enzimas de restricción
y análisis PCR, se secuenció el ADNc de p53 completo a partir de uno
de los adenovirus recombinantes (A/M/53) para verificar que estaba
libre de mutaciones. Después de esto, se utilizaron las
preparaciones purificadas de los recombinantes con p53 para
infectar células HeLa para analizar la presencia de adenovirus de
tipo fenotípicamente salvaje. Las células HeLa, que no permiten la
replicación de adenovirus con E1 suprimida, se infectaron con
1-4 x 10^{9} unidades infecciosas de adenovirus
recombinante, se cultivaron durante 3 semanas, y se observaron en
cuanto a la aparición de efecto citopático (CPE). Utilizando este
análisis, no se detectó replicación de adenovirus recombinante o
contaminación de tipo salvaje, fácilmente evidente por el CPE
observado en las células de control infectadas con adenovirus de
tipo salvaje a un nivel de sensibilidad de aproximadamente 1 en
10^{9}.
Para determinar si los adenovirus con p53
recombinantes expresaban la proteína p53, se infectaron líneas
celulares tumorales que no expresaban la proteína p53 endógena. Las
líneas celulares tumorales humanas Saos-2
(osteosarcoma) y Hep 3B (carcinoma hepatocelular) se infectaron
durante 24 horas con los adenovirus recombinantes para p53 A/M/53 o
A/C/53 a MOI que oscilaban de 0,1 a 200 pfu/célula. El análisis
Western de los productos lisados preparados a partir de las células
infectadas demostraron una expresión de la proteína p53 dependiente
de la dosis en ambos tipos de células (Figura 5). Ambas líneas
celulares expresaron niveles de proteína p53 más elevados después
de la infección con A/C/53 que con A/M/53 (Figura 3). No se detectó
proteína p53 en células no infectadas. Los niveles de p53 de tipo
salvaje endógena son normalmente bastante bajos, y casi
indetectables mediante análisis Western de los extractos celulares
(Bartek et al. (1991)). Sin embargo está claro que los
niveles de proteína p53 de tipo salvaje son fácilmente detectables
después de la infección con A/M/53 o A/C/53 a MOI inferiores
(Figura 5), sugiriendo que incluso dosis bajas de adenovirus
recombinantes para p53 pueden producir niveles potencialmente
eficaces de p53.
La reintroducción de p53 de tipo salvaje en la
línea celular de osteosarcoma negativa para p53,
Saos-2, da como resultado un agrandamiento y
aplanamiento característicos de estas células normalmente con forma
de huso (Chen et al. (1990)). Las células
Saos-2 subconfluentes (1x10^{5} células/placa de
10 cm) se infectaron una MOI de 50 con el virus A/C/53 o A/M de
control, y se incubaron a 37ºC durante 72 horas hasta que las placas
de control no infectadas fueron confluentes. En este punto, el
cambio de morfología esperado fue evidente en la placa tratada con
A/C/53 (Figura 6, panel C) pero no en las placas no infectadas
(Figura 6, panel A) o infectadas con el virus de control (Figura 6,
panel B). Este efecto no era una función de la densidad celular
puesto que una placa de control sembrada inicialmente a una densidad
más baja conservó la morfología normal a las 72 horas cuando su
confluencia se aproximó a la de la placa tratada con A/C/53. Los
resultados previos han demostrado un elevado nivel de expresión de
la proteína p53 a una MOI de 50 en células Saos-2
(Figura 5A), y estos resultados proporcionaron la evidencia de que
la proteína p53 expresada por estos adenovirus recombinantes era
biológicamente activa.
Para someter a ensayo adicionalmente la
actividad de los adenovirus recombinantes para p53, se analizó su
capacidad para inhibir la proliferación de las células tumorales
humanas medida mediante la absorción de
timidina-H^{3}. Se ha demostrado previamente que
la introducción de p53 de tipo salvaje en células que no expresan
p53 de tipo salvaje endógena puede detener las células en la
transición G_{1}/S, conduciendo a la inhibición de la absorción
de timidina marcada en el ADN recién sintetizado (Baker et
al. (1990); Mercer et al. (1990); Diller et al.
(1990)). Se infectaron una variedad de líneas celulares tumorales
carentes de p53 con A/M/N/53, A/C/N/53 o un adenovirus recombinante
de control que no expresaba p53 (A/M). Se observó una fuerte
inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de ADN por los
recombinantes tanto A/M/N/53 como A/C/N/53 en 7 de las 9 líneas
celulares tumorales diferentes sometidas a ensayo (Figura 7). Ambos
constructos fueron capaces de inhibir la síntesis de ADN en estas
células tumorales humanas, con independiencia de si expresaban p53
mutante o no lograban expresar la proteína p53. También se encontró
que en este análisis, el constructo A/C/N/53 era sistemáticamente
más potente que A/M/N/53. En las células saos-2
(osteosarcoma) y MDA-MB468 (cáncer de mama), se
logró casi el 100% de inhibición de la síntesis de ADN con el
constructo A/C/N/53 a una MOI tan baja como 10. A las dosis en las
que la inhibición por el adenovirus de control era solamente del
10-30%, se observó una reducción del
50-100% en la síntesis de ADN utilizando cualquier
adenovirus recombinante para p53. En contraste, no se observó un
efecto específico de p53 significativo con ningún constructo en
comparación con el virus de control en células HEP G2 (línea
celular de hepatocarcinoma que expresa p53 de tipo salvaje
endógena, Bressac et al. (1990)), ni en la línea celular
leucémica K562 (p53 nula).
En un ensayo más riguroso de la función para
adenovirus recombinantes para p53, se infectaron las células
tumorales ex vivo y después se inyectaron las células en
ratones carentes de sistema inmunitario para evaluar la capacidad
de los recombinantes para suprimir el crecimiento tumoral in
vivo. Las células Saos-2 infectadas con virus
A/M/N/53 o control A/M a una MOI de 3 o 30, fueron inyectadas en
flancos opuestos de los ratones carentes de sistema inmunitario.
Después se midieron los tamaños de los tumores dos veces a la
semana a lo largo de un período de 8 semanas. A una MOI de 30, no se
observó crecimiento del tumor en los flancos tratados con p53 de
ninguno de los animales, mientras los tumores tratados con el
control continuaron creciendo (Figura 8). El progresivo
agrandamiento de los tumores tratados con el virus de control fue
similar al observado en los animales de control tratados con
tampón. Una clara diferencia en el crecimiento del tumor entre el
adenovirus de control y el recombinante para p53 a una MOI de 3,
aunque 2 de los 4 tumores de los ratones tratados con p53
comenzaron a mostrar cierto crecimiento después de aproximadamente 6
semanas. De este modo, el adenovirus recombinante A/M/N/53 es capaz
de mediar la supresión tumoral específica de p53 en un entorno
in vivo.
Aunque el tratamiento ex vivo de las
células cancerosas y su posterior inyección en los animales
proporcionó un ensayo crítico de supresión tumoral, un experimento
clínicamente más relevante consiste en determinar si el adenovirus
recombinante para p53 inyectado podía infectar y expresar p53 en
tumores establecidos in vivo. Para estudiar esto, se
inyectaron células H69 (SCLC, p53^{nula}) subcutáneamente en
ratones carentes de sistema inmunitario, y se dejó que los tumores
se desarrollaran durante 32 días. En este momento, se inyectó una
única inyección de 2 x 10^{9} pfu de adenovirus A/C/53 o
A/C/\beta-gal en el espacio peritumoral que
rodeaba el tumor. Después los tumores fueron extirpados el Día 2 o
el Día 7 después de la inyección del adenovirus, y se aisló el ARN
poliA de cada tumor. Luego se utilizó la RT-PCR,
empleando cebadores específicos de p53 recombinante, para detectar
el ARNm de p53 en los tumores tratados con p53 (Figura 9, calles
1,2,4,5). No hubo señal evidente de p53 de los tumores extirpados
de los animales tratados con \beta-gal (Figura 9,
calles 3 y 6). La amplificación con cebadores de actina sirvió como
control para la reacción de RT-PCR (Figura 9,
calles 7-9), mientras un plásmido que contenía la
secuencia de p53 recombinante sirvió como control positivo para la
banda específica de p53 recombinante (Figura 9, calle 10). Este
experimento demuestra que un adenovirus recombinante para p53 puede
dirigir específicamente la expresión del ARNm de p53 en tumores
establecidos después de una única inyección en el espacio
peritumoral. También demuestra la persistencia viral in vivo
durante al menos una semana después de la inyección con un
adenovirus recombinante para p53.
Para estudiar la fiabilidad de la terapia génica
de los tumores establecidos, se utilizó un modelo de ratón carente
de sistema inmunitario portador de tumor. Se inyectaron células H69
en el espacio subcutáneo del flanco derecho de los ratones, y se
dejó que los tumores crecieran durante 2 semanas. Después los
ratones recibieron inyecciones peritumorales de tampón o virus
recombinante dos veces a la semana durante un total de 8 dosis. En
los ratones tratados con tampón o virus A/M de control, los tumores
continuaron creciendo rápidamente durante todo el tratamiento,
mientras aquellos tratados con el virus A/M/N/53 crecieron a una
velocidad enormemente reducida (Figura 10A). Una vez que cesaron
las inyecciones, los tumores tratados con el control continuaron
creciendo mientras los tumores tratados con p53 mostraron un
crecimiento pequeño o nulo durante al menos una semana en ausencia
de cualquier suministro adicional de p53 exógena (Figura 10A).
Aunque los animales de control tratados con tampón solo tuvieron un
crecimiento acelerado del tumor en comparación con cualquier grupo
tratado con virus, no se encontró ninguna diferencia significativa
en el peso corporal entre los tres grupos durante el período de
tratamiento. La ulceración del tumor en algunos animales limitó la
relevancia de las medidas de los tamaños de los tumores después del
día 42. Sin embargo, el control continuo de los animales para
determinar el tiempo de supervivencia demostró una ventaja de
supervivencia para los animales tratados con p53 (Figura 10B). El
último de los animales tratados con adenovirus de control murió el
día 83, mientras los controles tratados con tampón solo habían
expirado todos el día 56. En contraste, los 5 animales tratados con
A/M/N/53 seguían vivos (día 130 después de la inoculación de las
células) (Figura 10B). Juntos, estos datos establecen un efecto
específico de p53 tanto sobre el crecimiento tumoral como sobre el
tiempo de supervivencia en animales con tumores carentes de p53
establecidos.
Se construyeron vectores de adenovirus humanos
recombinante que son capaces de expresar elevados niveles de
proteína p53 de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis.
Cada vector contiene deleciones en las regiones E1a y E1b que lo
convierten en deficiente para la replicación del virus. Cada vector
contiene deleciones en las regiones E1a y E1b que convierten al
virus en deficiente para la replicación (Challberg y Kelly (1979);
Horowitz, (1991)). Tiene una trascendencia adicional que estas
deleciones incluyan aquellas secuencias que codifican la proteína
de 19 y 55 kd de E1b. Se ha informado de que la proteína de 19 kd
está implicada en la inhibición de la apoptosis (White et
al. (1992); Rao et al. (1992)), mientras la proteína de
55 kd es capaz de unirse a la proteína p53 de tipo salvaje (Sarnow
et al. (1982); Heuvel et al. (1990)). Suprimiendo
estas secuencias adenovirales, se separaron inhibidores potenciales
de la función de p53 por medio de la unión directa a p53 o la
inhibición potencial de la apoptosis mediada por p53. Se elaboraron
constructos adicionales que tenían la secuencia de E1b 3' restante,
incluyendo toda la secuencia codificante de la proteína IX, también
suprimida. Aunque esto ha sido referido para reducir la capacidad
del tamaño de empaquetamiento de adenovirus a aproximadamente 3 kb
menos que el virus de tipo salvaje (Ghosh-Choudhury
et al. (1987)), estos constructos también son suprimidos en
la región E3 de manera que los constructos A/M/N/53 y A/C/N/53
están en este intervalo de tamaños. Suprimiendo la región pIX, se
reducen las secuencias adenovirales homólogas a las contenidas en
las células 293 a aproximadamente 300 pares de bases, disminuyendo
las oportunidades de regenerar el adenovirus de tipo salvaje, de
replicación competente por medio de la recombinación. Los
constructos que carecen de secuencia codificante de pIX parecen
tener una eficacia igual a aquellos con pIX.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una fuerte dependencia de la
dosis para la expresión de la proteína p53 en células infectadas,
se demostró una inhibición del crecimiento de las células tumorales
específica de p53, dependiente de la dosis. Se inhibió la división
celular, y se demostró mediante la inhibición de la síntesis de ADN,
en una amplia variedad de tipos de células tumorales conocidas por
carecer de expresión de la proteína p53 de tipo salvaje. Bacchetti
y Graham (1993) informaron recientemente de la inhibición específica
por p53 de la síntesis de ADN en la línea celular de carcinoma
ovárico SKOV-3 por un adenovirus recombinante para
p53 en experimentos similares. Además del carcinoma ovárico, se
demostró que en líneas celulares tumorales humanas adicionales,
representativas de cánceres humanos clínicamente importantes y que
incluían líneas que expresaban al alza la proteína p53 mutante,
también se podía inhibir el crecimiento por medio de los
recombinantes de p53 de esta invención. A las MOI en las que el
recombinante A/C/N/53 es eficaz en un 90-100% al
inhibir la síntesis de ADN en estos tipos de tumores, la supresión
mediada por el adenovirus de control es menor de 20%.
Aunque Feinstein et al. (1992) informaron
de que la re-introducción de p53 de tipo salvaje
podía inducir la diferenciación e incrementar la proporción de
células en G_{1} versus S+G_{2} para las células K562
leucémicas, no se encontró un efecto específico de p53 en esta
línea. Horvath y Weber (1988) han informado de que los linfocitos
de sangre periférica humana son muy poco permisivos a la infección
por adenovirus. En experimentos separados, el recombinante
infectaba significativamente las células K562 que no respondían con
adenovirus A/C/\beta-gal recombinante, mientras
otras líneas celulares, incluyendo la línea Hep G2 de control y
aquellas que mostraban un fuerte efecto de p53, fueron fácilmente
infectables. De este modo, al menos parte de la variabilidad de la
eficacia parecía deberse a la variabilidad de infección, aunque
también podían estar implicados otros factores.
Los resultados observados con el virus A/M/N/53
en la Figura 8 demuestran que la supresión completa es posible en
un entorno in vivo. La reanudación del crecimiento tumoral en
2 de los 4, animales tratados con p53 a la MOI más baja resultó muy
probablemente de un pequeño porcentaje de células no infectadas
inicialmente con el recombinante de p53 a esta dosis. La supresión
completa observada con A/M/N/53 a la dosis más alta, sin embargo,
demuestra que la capacidad de recuperación del crecimiento tumoral
puede ser superada.
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo presentado aquí y por otros grupos
(Chen et al. (1990); Takahashi et al. (1992)) ha
demostrado que las células tumorales humanas que carecen de
expresión de p53 de tipo salvaje pueden ser tratadas ex vivo
con p53 y producir la supresión del crecimiento tumoral cuando las
células tratadas son transferidas a un modelo animal. Los
solicitantes presentan la primera evidencia de terapia génica
supresora de tumores de un tumor establecido in vivo, dando
como resultado tanto la supresión del crecimiento tumoral como el
incremento del tiempo de supervivencia. En el sistema de los
solicitantes, la liberación para las células tumorales no dependía
de la inyección directa en la masa tumoral. En vez de eso, el
adenovirus recombinante para p53 fue inyectado en el espacio
peritumoral, y la expresión del ARNm de p53 fue detectada en el
tumor. La p53 expresada por los recombinantes era funcional y
suprimía fuertemente el crecimiento tumoral en comparación con el de
los tumores tratados con adenovirus que no expresaba p53, de
control. Sin embargo, los grupos de tumores tratados tanto con
virus con p53 como de control mostraron supresión de los tumores en
comparación con los controles tratados con tampón. Se ha demostrado
que la expresión local del factor de necrosis tumoral (TNF),
interferón-\gamma), la interleuquina
(IL)-2, IL-4 o IL-7
puede conducir a una supresión transitoria del tumor independiente
de las células T en ratones carentes de sistema inmunitario (Hoch
et al. (1992)). La exposición de monocitos a viriones de
adenovirus también es un débil inductor de
IFN-\alpha/\beta (revisado por Gooding y Wold
(1990)). Por lo tanto, no es sorprendente que se observara cierta
supresión tumoral en ratones carentes de sistema inmunitario
incluso con el adenovirus de control. Esta supresión tumoral mediada
por virus no se observó en las células tumorales
Saos-2 tratadas con el virus de control ex
vivo descritas antes. La supresión tumoral in vivo
específica de p53 fue espectacularmente demostrada por el control
continuado de los animales en la Figura 10. El tiempo de
supervivencia de los ratones tratados con p53 aumentó
significativamente, con 5 de los 5 animales todavía vivos más de
130 días después de la inoculación celular en comparación con 0 de
5 animales tratados con adenovirus de control. Los animales
supervivientes todavía muestran tumores en crecimiento que pueden
reflejar células no infectadas inicialmente con el adenovirus
recombinante para p53. Se pueden aplicar a esto programas de
dosificaciones más altas o más frecuentes. Además, el aislamiento
del promotor (Palmer et al. (1991)) o mutaciones adicionales
pueden volver resistentes estas células al tratamiento con
adenovirus recombinante para p53. Por ejemplo, las mutaciones en el
gen WAF1 recientemente descrito, un gen inducido por p53 de tipo
salvaje que inhibe con posterioridad el progreso del ciclo celular a
la fase S, (El-Deiry et al. (1993); Hunter
(1993)) podría dar como resultado un tumor resistente a p53.
\newpage
Experimento núm.
III
Este Ejemplo muestra el uso de genes suicidas y
la expresión específica de tejidos de tales genes en los métodos de
terapia génica descritos en la presente memoria. Se eligió el
carcinoma hepatocelular como diana debido a que es una de las
malignidades humanas más comunes que afectan a los hombres, causando
1.250.000 muertes estimadas por año en todo el mundo. La incidencia
de este cáncer es muy alta en el Sureste Asiático y África donde se
asocia con la infección por hepatitis B y C y la exposición a la
aflatoxina. Actualmente la cirugía es el único tratamiento que
ofrece el potencial de curar el HCC, aunque menos del 20% de los
pacientes se consideran candidatos para la resección (Ravoet C.
et al., 1993). No obstante, los tumores distintos del
carcinoma hepatocelular son igualmente aplicables a los métodos de
reducción de su proliferación descritos en la presente memoria.
Todas las líneas celulares excepto la línea
celular HLF fueron obtenidas de la Colección de Cultivos Tisulares
Tipo Americana (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. Los
números de acceso de la ATCC se indican entre paréntesis. La línea
de células de riñón embrionarias humanas 293 (CRL 1573) se utilizó
para generar y propagar los adenovirus recombinantes descritos en
la presente memoria. Se mantuvieron en medio DME con un suplemento
de suero de ternera definido al 10% (Hyclone). Las líneas de
carcinoma hepatocelular Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065), y HLF
se mantuvieron en medio DME/F12 con un suplemento de suero bovino
fetal al 10%, como lo fueron las líneas celulares de carcinoma de
mama MDA-MB468 (HTB 132) y BT-549
(HTB 122). Se hicieron crecer células de hígado de Chang (CCL 13)
en medio MEM con un suplemento de suero bovino fetal al 10%. La
línea celular HLF se obtuvo de los Drs. T. Morsaki y H. Kitsuki del
Kyushu University School of Medicine en Japón.
Dos vectores de expresión adenovirales
denominados en la presente memoria ACNTK y AANTK y desprovistos de
la función de la proteína IX (representados en la Figura 11) son
capaces de dirigir la expresión del gen suicida TK en las células
tumorales. Se construyó un tercer vector de expresión de adenovirus
denominado AANCAT para demostrar adicionalmente la viabilidad de
dirigir específicamente la expresión génica a tipos celulares
específicos utilizando vectores adenovirales. Estos constructos
adenovirales se ensamblaron como se representa en las Figuras 11 y
12 y son derivados de aquellos descritos previamente para la
expresión de genes supresores de tumores.
Para la expresión del gen foráneo, se han
insertado casetes de expresión que utilizan el
promotor/intensificador temprano inmediato de citomegalovirus
humano (CMV) (Boshart, M. et al., 1985) o el
intensificador/promotor de la alfa-fetoproteína
humana (AFP) (Watanable, K. et al., 1987; Nakabayashi, H.
et al., 1989) para dirigir la transcripción del gen TK o el
gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El intensificador
promotor de CMV es capaz de dirigir la expresión robusta del gen en
una amplia variedad de tipos celulares mientras el constructo
intensificador/promotor de la AFP restringe la expresión a las
células de carcinoma hepatocelular (HCC) que expresan la AFP en
aproximadamente el 70-80% de la población de
pacientes con HCC. En el constructo que utiliza el
promotor/intensificador de CMV, también se insertó la secuencia
líder tripartita del adenovirus de tipo 2 para intensificar la
traducción del transcrito TK (Berkner, K.L. y Sharp, 1985). Además
de la deleción de E1, en ambos vectores de adenovirus se han
suprimido adicionalmente 1,9 kilobases (kb) de ADN en la región E3
viral. El ADN suprimido en la región E3 no es esencial para la
propagación del virus y su deleción aumenta la capacidad de
inserción del virus recombinante para ADN foráneo en una cantidad
equivalente (1,9 kb) (Graham y Prevec, 1991).
Para demostrar la especificidad del
promotor/intensificador de la AFP, también se construyó el virus
AANCAT en el que el gen marcador cloranfenicol acetiltransferasa
(CAT) está bajo el control del intensificador/promotor de la AFP.
En el constructo viral ACNTK, la secuencia líder tripartita de Ad2
fue colocada entre el promotor/intensificador de CMV y el gen TK.
Se ha informado de que el líder tripartito intensifica la traducción
de los genes conectados. La sustitución de E1 perjudica la
capacidad de los virus recombinantes para replicar, restringiendo su
propagación a las células 293 que suministran los productos del gen
E1 de Ad5 en trans (Graham et al., 1977).
Vector Adenoviral ACNTK: Se utilizó el plásmido
pMLBKTK en E. coli HB101 (de la ATCC Núm. 39369) como fuente
del gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simplex
(HSV-1). TK fue separado por corte de este plásmido
en forma de un fragmento génico de 1,7 kb mediante digestión con las
enzimas de restricción Bgl II y Pvu II y subclonado en los sitios
de restricción Bam HI, EcoR V compatibles del plásmido pSP72
(Promega) utilizando técnicas de clonación convencionales (Sambrook
et al., 1989). El inserto de TK se aisló después en forma de
un fragmento de 1,7 kb de este vector mediante digestión con Xba I y
Bgl II y se clonó en el plásmido pACN digerido con Xba I, BamHI
(Wills et al. 1994). Se linealizaron veinte (20) \mug de
este plásmido denominado pACNTK con Eco RI y se cotransfectaron a
células 293 (ATCC CRL 1573) con 5 \mug de ACBGL digerido con Cla
I (Wills et al., 1994 supra) utilizando un kit de
transfección con CaPO_{4} (Stratagene, San Diego, California).
Las placas virales se aislaron y los recombinantes, denominados
ACNTK, fueron identificados mediante análisis digestión con enzimas
de restricción del ADN asilado con Xho I y BsiWI. Los recombinantes
positivos se purificaron adicionalmente mediante dilución limitante
y se expandieron y se titularon mediante métodos convencionales
(Graham y Prevec, 1991).
Vector Adenoviral AANTK: Se clonaron el promotor
de la \alpha-fetoproteína (AFP-P)
y el intensificador (AFP-E) a partir de un ADN
genómico humano (Clontech) utilizando la amplificación mediante PCR
con cebadores que contenían sitios de restricción en sus extremos.
Los cebadores utilizados para aislar el AFP-E de 210
pb contenían un sitio de restricción Nhe I en el cebador 5' y un
conector Xba I, Xho I, Kpn I en el cebador 3'. La secuencia del
cebador 5' fue 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC
T-3. La secuencia del cebador 5' fue
5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG
AAG-3'. Los cebadores utilizados para aislar el
fragmento AFE de 1763 pb contenían un sitio de restricción Not I en
el cebador 5' y un sitio Xba I en el cebador 3'. La secuencia del
cebador 5' fue 5'-CGT GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA
GGA TGT CTG TC-3'. La secuencia del cebador 3' fue
5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC
GCA-3'. Para la amplificación por PCR, el ADN fue
desnaturalizado a 97º durante 7 minutos, seguido de 5 ciclos de
amplificación a 97º, 1 minuto, 53º, 1 minuto, 72º, 2 minutos, y una
prolongación final a 72º, 10 minutos. La AFE amplificada fue
digerida con Not I y Xba I e insertada en los sitios Not I, Xba I
de un vector plasmídico (pA/ITR/B) que contenía las secuencias
1-350 y 3330-5790 del adenovirus de
tipo 5 separadas por un poliligador que contenía sitios Not I, Xho
I, Xba I, Hind III, Kpn I, Bam HI, Nco I, Sma I, y Bgl II. El
AFP-E amplificado fue digerido con Nhe I y Kpn I e
insertado en el constructo que contenía AFP-E
descrito antes que había sido digerido con Xba I y Kpn I. Este nuevo
constructo fue digerido adicionalmente después con Xba I y NgoMI
para separar las secuencias adenovirales 3330-5780,
que fueron sustituidas con posterioridad por un fragmento de
restricción Xba I, NgoMI del plásmido pACN que contenía los
nucleótidos 4021-10457 del adenovirus de tipo 2 para
construir el plásmido pAAN que contenía el intensificador y el
promotor de la \alpha-fetoproteína. Este
constructo fue digerido después con Eco RI y Xba I para aislar un
fragmento de 2,3 kb que contenía la repetición terminal invertida de
Ad5, el AFP-E y el AFP-P que fue
ligado con posterioridad al fragmento de 8,55 kb de pACNTK digerido
con Eco RI Xba I descrito antes donde el gen TK es dirigido por el
intensificador y el promotor de la
\alpha-fetoproteína en un fondo de adenovirus.
Este plásmido fue linealizado después con Eco RI y cotransfectado
con el fragmento grande de ALBGL digerido con Cla I como antes y
los recombinantes, denominados AANTK, fueron aislados y purificados
como se ha descrito antes.
Vector Adenoviral AANCAT: Se aisló el gen de la
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del pCAT-Basic
Vector (Promega Corporation) mediante digestión con Xba I, Bam HI.
Este fragmento de 1,64 kb se ligó en pAAN digerido con Xba I, Bam
HI (descrito antes) para crear pAANCAT. Después éste plásmido se
linealizó con Eco RI y se cotransfectó con el fragmento grande de
rA/C/\beta-gal digerido con Cla I para crear
AANCAT.
Las células se cultivaron en placa a 1 x
10^{5} células/pocillo en una placa para el cultivo de tejidos de
24 pocillos (Costar) y se dejó que se adhirieran durante la noche
(37ºC, CO_{2} al 7%). Las infecciones durante la noche de ACBGL
se realizaron a una multiplicidad de infección (MOI) de 30. Después
de 24 horas, las células se fijaron con formaldehído al 3,7%; PBS,
y se tiñeron con 1 mg/ml de reactivo Xgal (USB). Los datos se
puntuaron (+,++,+++) estimando el porcentaje de células teñidas
positivamente a cada MOI. [+=1-33%,
++=33-67% y +++=>67%].
Se sembraron dos (2) x 10^{6} células (Hep G2,
Hep 3B, HLF, Chang, y MDA-MB468) sobre placas de 10
cm por triplicado y se incubaron durante la noche (37ºC, CO_{2}
al 7%). Después se infectó cada placa con AANCAT a una MOI = 30 o
100 o no se infectó y se dejó incubando durante 3 días. Luego se
trataron con tripsina las células y se lavaron con PBS y se
resuspendieron en 100 \mul de Tris 0,25 M pH 7,8. Las muestras se
congelaron y se descongelaron 3 veces, y el sobrenadante se
transfirió a tubos nuevos y se incubaron a 60ºC durante 10 minutos.
Después las muestras se centrifugaron a 4ºC durante 5 minutos, y los
sobrenadantes se analizaron en cuanto a la concentración de
proteína utilizando un análisis Bradford (Kit de Análisis de
Proteínas Bio-Rad). Las muestras se ajustaron a
concentraciones de proteína iguales a un volumen final de 75 \mul
utilizando Tris 0,25 M, 25 \mul de acetil CoA 4 mM y 1 \mul de
Cloranfenicol-C^{14} y se incubaron durante la
noche a 37ºC. Se añadieron 500 \mul de acetato de etilo a cada
muestra y se mezclaron mediante vórtice, seguido de centrifugación
durante 5 minutos a la temperatura ambiente. La fase superior se
transfirió después a un tubo nuevo y el acetato de etilo se evaporó
mediante centrifugación a vacío. Los productos de reacción se
redisolvieron después en 25 \mul de acetato de etilo y se
aplicaron sobre una placa de cromatografía de capa fina (TLC) y
después la placa se colocó en una cámara para TLC
pre-equilibrada (cloroformo al 95%, metanol al 5%).
Se dejó que el disolvente migrara hasta la parte superior de la
placa, después la placa se secó y se expuso a película de rayos
X.
Se cultivaron en placa las células a 5 x
10^{3} células/pocillo en una placa de microtitulación de 96
pocillos (Costar) y se dejaron incubando durante la noche (37ºC,
CO_{2} al 7%). Se utilizó virus ACN, ACNTK o AATK diluido
seriadamente en DMEM; FBS al 15%; glutamina al 1% para transfectar
las células a una multiplicidad de infección de 30 durante la noche
en cuyo momento se administró una dosis de ganciclovir (Cytovene)
por triplicado a las células a intervalos log entre 0,001 y 100 mM
(micromolar). Se añadió 1 \muCi de
timidina-H^{3} (Amersham) a cada pocillo
12-18 horas antes de la cosecha. A las 72 horas de
la infección las células se recogieron sobre filtros de fibra de
vidrio y se contó la timidina-H^{3} incorporada
utilizando el centelleo en líquido (TopCount, Packard). Los
resultados se trazan como el porcentaje de proliferación del control
no tratado y se tabulan como la dosis eficaz (DE_{50} \pm DT)
para una reducción del 50 por ciento en la proliferación sobre los
controles de medio. Los valores DE_{50} se estimaron ajustando una
ecuación logística a los datos de
dosis-respuesta.
Las células (HLF, HCC humano) se cultivaron en
placa, se infectaron con ACN o ACNTK y se trataron con ganciclovir
como se describe para el análisis de proliferación. A las 72 horas
de la administración del ganciclovir, las células se centrifugaron,
el sobrenadante se eliminó. Los niveles de lactato deshidrogenasa se
midieron colorimétricamente (Promega, Cytotox 96®). La liberación
de LDH media (+/- D.T.) se traza versus M.O.I.
Se inyectaron subcutáneamente células de
carcinoma hepatocelular humano (Hep 3B) en diez (10) ratones hembra
nu/nu atímicos (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Cada animal
recibió aproximadamente 1 x 10^{7} células en el flanco
izquierdo. Se dejó que los tumores crecieran durante 27 días antes
de aleatorizar los ratones por el tamaño del tumor. Los ratones se
trataron con inyecciones intratumorales y peritumorales de ACNTK o
del virus de control ACN (1 x 10^{9} ui en 100 \mul) en días
alternos durante un total de tres dosis. Comenzando 24 horas
después de la dosis inicial de adenovirus, se administró
intraperitonealmente a los ratones ganciclovir (Cytovene 100 mg/kg)
diariamente durante un total de 10 días. Se controló el tamaño de
los tumores de los ratones y el peso corporal dos veces por semana.
Las medidas de los tumores se realizaron en tres dimensiones
utilizando calibres Vernier y se calcularon los volúmenes utilizando
la fórmula 4/3 \pi r^{3}, donde r es la mitad de la dimensión
tumoral media.
Se utilizaron los adenovirus recombinantes para
infectar tres líneas celulares de HCC (HLF, Hep3B y
Hep-G2). Se utilizaron una línea celular de hígado
humana (Chang) y dos líneas celulares de cáncer de mama como
controles (MDAMB468 y BT549). Para demostrar la especificidad del
promotor/intensificador de AFP, se construyó el virus AANCAT. Este
virus se utilizó para infectar células que expresan (Hep 3B, HepG2)
o no expresan (HLE, Chang, MDAMB468) la
alfa-fetoproteína (AFP) marcadora del tumor HCC.
Como se muestra en la Figura 13, AANCAT dirige la expresión del gen
marcador CAT solamente en aquellas células de HCC que son capaces de
expresar AFP (Figura 13).
Se evaluó la eficacia de ACNTK y AANTK para el
tratamiento del HCC utilizando un análisis de incorporación de
timidina-H^{3} para medir el efecto de la
combinación de la expresión de HSV-TK y el
tratamiento con ganciclovir sobre la proliferación celular. Las
líneas celulares se infectaron con ACNTK o AANTK o con el virus de
control ACN (Wills et al., 1994 supra), que no dirige
la expresión de HSV-TK, y después se trató con
concentraciones crecientes de ganciclovir. El efecto de este
tratamiento se evalúa como una función de las concentraciones
crecientes de ganciclovir, y se determinó la concentración de
ganciclovir requerida para inhibir la
timidina-H^{3} incorporada en un 50% (DE_{50}).
Adicionalmente, se determinó una medida relativa de la
transferencia génica mediada por adenovirus y la expresión de cada
línea celular utilizando un virus de control que dirige la
expresión del gen marcador de la beta-galactosidasa.
Los datos presentados en la Figura 14 y en la Tabla 1 más abajo
demuestran que el tratamiento combinado de virus ACNTK/ganciclovir
era capaz de inhibir la proliferación celular en todas las líneas
celulares examinadas en comparación con el adenovirus de control
ACN combinado con ganciclovir. En contraste, el vector viral AANTK
solamente era eficaz en aquellas líneas celulares de HCC que se ha
demostrado que expresan la \alpha-fetoproteína.
Además, la combinación AANTK/GCV era más eficaz cuando las células
se cultivaron en placa a grandes densidades.
Se trataron intratumoralmente y peritumoralmente
ratones carentes de sistema inmunitario que portaban tumores Hep3B
(N=5/grupo) con dosis equivalentes de ACNTK o control de ACN.
Veinticuatro horas después de la primera administración de
adenovirus recombinante, se inició el tratamiento diario con
ganciclovir en todos los ratones. Se midieron las dimensiones de
los tumores de cada animal dos veces por semana por medio de
calibres, y los tamaños medios de los tumores se trazan en la
Figura 16. El tamaño medio del tumor el día 58 fue más pequeño en
los animales tratados con ACNTK pero la diferencia no alcanzó una
trascendencia estadística (p<0,09, test de la t no emparejado).
Estos datos apoyan un efecto específico de ACNTK sobre el
crecimiento tumoral in vivo. No se detectaron diferencias
significativas en el peso corporal medio entre los grupos.
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Claims (16)
1. Una composición farmacéutica que comprende un
vector de expresión de adenovirus recombinante, comprendiendo el
vector un gen que codifica una proteína foránea y una deleción total
de la secuencia codificante de la proteína IX, donde la proteína
foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo
que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms,
h-NUC y mitosina.
2. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1, donde la proteína supresora de tumores es p53 o
p21.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente la deleción de
una secuencia de ADN denominada E1a y E1b de adenovirus.
4. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente la
deleción de una secuencia de ADN en la región temprana 3 y/o la
región temprana 4.
5. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente una
deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados 3' con respecto a la
deleción de la proteína IX y una molécula de ADN foráneo que
codifica una señal de poliadenilación.
6. La composición farmacéutica de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5, donde el adenovirus es un adenovirus
del Grupo C seleccionado entre el serotipo 1, 2, 5 o 6.
7. Un kit para reducir la proliferación de
células tumorales de vejiga, comprendiendo dicho kit una composición
farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un
agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en
ganciclovir, arabinonucleósido de 6-metoxipurina,
5-fluorouracilo,
6-metil-purino-2'-desoxirribonucleosido,
y sus combinaciones, y uno o más portadores farmacéuticamente
aceptables.
8. Un vector de expresión de adenovirus
recombinante que comprende un gen que codifica una proteína foránea
y una deleción total de la secuencia codificante de la proteína IX,
donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores
seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína
WT1 del tumor de Wilms, h-NUC y mitosina.
9. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de la reivindicación 8, donde la proteína supresora de
tumores es p53 o p21.
10. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de la reivindicación 8 o 9, que comprende
adicionalmente la deleción de una secuencia de ADN denominada E1a y
E1b de adenovirus.
11. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que
comprende adicionalmente la deleción de una secuencia de ADN en la
región temprana 3 y/o la región temprana 4.
12. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que
comprende adicionalmente una deleción de hasta cuarenta nucleótidos
situados en 3' con respecto a la deleción de la proteína IX y una
molécula de ADN foránea que codifica una señal de
poliadenilación.
13. El vector de expresión de adenovirus
recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde
el adenovirus es un adenovirus del Grupo C seleccionado entre el
serotipo 1, 2, 5 o 6.
14. El uso del adenovirus recombinante de una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de
una composición farmacéutica para tratar el cáncer de vejiga, cuya
composición farmacéutica comprende adicionalmente uno o más
portadores farmacéuticamente aceptables.
15. El uso del adenovirus recombinante de una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de
una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de un
tumor de vejiga en un animal, cuya composición farmacéutica
comprende adicionalmente uno o más portadores farmacéuticamente
aceptables.
16. El uso del adenovirus recombinante de una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de
una composición farmacéutica para reducir la proliferación de
células de tumor de vejiga en un sujeto, donde la composición
farmacéutica comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un
agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en
ganciclovir, arabinonucleósido de 6-metoxipurina,
5-fluorouracilo,
6-metilpurino-2'-desoxirribonucleosido,
y sus combinaciones, y uno o más portadores farmacéuticamente
aceptables.
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