JP2021533744A - 条件的活性化型結合タンパク質を共発現及び精製するための方法 - Google Patents

条件的活性化型結合タンパク質を共発現及び精製するための方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、条件的活性化型結合タンパク質、例えば、半ＣＯＢＲＡなどを共発現させて精製するための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月９日出願の米国仮特許出願第６２／７１６，７５５号に対する優先権を主張するものであり、その全体は明示的に参照により本明細書に組み込まれる。
コンパクトディスクで提出された「配列表」、表、またはコンピュータプログラム表付属書類への言及
１８３キロバイトのサイズを有する「１１８４５９−５００６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに収録された配列表は、本明細書と共にＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して電子的に提出されており、ｔｘｔファイルの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
個々の細胞または特定の細胞型を選択的に破壊することは多くの場合、様々な臨床環境において望ましいものである。例えば、健常細胞及び健常組織を可能な限りインタクトで損傷を受けていない状態に残しつつ腫瘍細胞を特異的に破壊することは、がん治療の主要な目的である。１つのこのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによるものである。
腫瘍関連抗原に対する優れた結合特異性及び親和性をもたらすインタクトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の使用は、がんの治療及び診断の領域にうまく応用されている。しかしながら、インタクトＭＡｂの大きなサイズ、その体内分布不良及び血液プールにおける長期持続性により、その臨床用途は限定的なものとなっている。例えば、インタクト抗体は、腫瘍領域内への特異的な集積を示し得る。体内分布試験では、腫瘍を精密に調査した際に、末梢領域における初期集積を伴う不均一な抗体分布が認められている。腫瘍壊死によって抗原分布が不均一となり間質圧が高くなることから、インタクト抗体構築物を腫瘍の中心部分に到達させることは不可能である。それに対し、より小さな抗体フラグメントは、速やかな腫瘍への局在化を示し、腫瘍内へとより深く浸透し、更に、血流から比較的速やかに取り除かれる。
親ＭＡｂの小結合ドメインに由来する一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）は、臨床用途において、インタクトＭＡｂと比較してより優れた体内分布を示し、より効率的に腫瘍細胞を標的とすることができる。一本鎖フラグメントを細菌から効率的に操作することもできるが、ほとんどの改変ｓｃＦｖは、一価構造を有しており、二価化合物が有する結合力を欠いていることから、その親ＭＡｂ（Ｃ（ｃ）、Ｄ）と比較して、低い腫瘍集積性、例えば、腫瘍細胞上における滞留時間の短さ、及び低い特異性を示す。
ｓｃＦｖの好ましい特性にもかかわらず、ある特定の特徴により、がん化学療法へのｓｃＦｖの全面的な臨床導入が制限されている。特に注目すべきなのは、疾患組織と健常組織の両方に共通する細胞表面受容体をこれらの薬剤が標的とすることによる、疾患組織と健常組織の間におけるｓｃＦｖの交差反応性である。向上した治療指数を有するｓｃＦｖは、これらの薬剤の臨床的有用性に大幅な進展をもたらすであろう。本発明は、このような向上したｓｃＦｖ、ならびにその製造方法及びその使用方法を提供する。本発明の向上したｓｃＦｖは、二量体化合物の形成による、単一ユニットにより示される結合力の欠如を克服する予想外な効果を有している。
一態様において、本明細書では、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、（ｉｉ）第１のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変軽鎖、を含む、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変重鎖、を含む、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含む単離細胞を提供し、
第１のポリペプチドの可変重鎖、及び上記第２のポリペプチドの可変軽鎖は、会合してＦｖを形成すると、ヒトＣＤ３と結合する。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する。一部の例では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のアミノ酸配列を含む。他の例では、上記第１のｓｄＡｂ及び上記第２のｓｄＡｂは異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは異なるヒトＴＴＡに結合する。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＢ７Ｈ３、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＦＯＬＲ１、からなる群から選択されるヒトＴＴＡと結合する。
本明細書に記載の本発明のいずれかの一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合する。ある特定の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合する。特定の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合する。他の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合する。
本明細書に記載の本発明のいずれかの一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥＧＦＲに結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＢ７Ｈ３に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂはヒトＦＯＬＲ１に結合し、第２のｓｄＡｂはヒトＥｐＣＡＭに結合する。
一部の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される。他の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、異なるプロテアーゼによって認識される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む、及び／または、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。別の様式では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含み、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。一部の例では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。一部の例では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドの可変重鎖は、図３９の配列番号１０２のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドの擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１０６、配列番号１１０、及び配列番号２０７からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変重鎖配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９のｉｖｈＣＤＲ１、ｉｖｈＣＤＲ２、及びｉｖｈＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。他の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１０３のｉｖｈＣＤＲ１、ｉｖｈＣＤＲ２、及びｉｖｈＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。一部の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０のｉｖｈＣＤＲ１、ｉｖｈＣＤＲ２、及びｉｖｈＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドの可変軽鎖は、図３８の配列番号９０のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドの擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９４、配列番号９８、及び配列番号２０３からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変軽鎖配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７のｉｖｌＣＤＲ１、ｉｖｌＣＤＲ２、及びｉｖｌＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。他の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１のｉｖｌＣＤＲ１、ｉｖｌＣＤＲ２、及びｉｖｌＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６のｉｖｌＣＤＲ１、ｉｖｌＣＤＲ２、及びｉｖｌＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６（配列番号５）、Ｐｒｏ３９（配列番号９）、Ｐｒｏ４１（配列番号１３）、Ｐｒｏ４３（配列番号１７）、Ｐｒｏ４５（配列番号２１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号２５）、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号７）、Ｐｒｏ４０（配列番号１１）、Ｐｒｏ４２（配列番号１５）、Ｐｒｏ４４（配列番号１９）、Ｐｒｏ４６（配列番号２３）、及びＰｒｏ３５３（配列番号２７）、からなる群から選択される。一部の実施形態では、上記第１のポリペプチド及び上記第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９（配列番号５及び配列番号７）、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０（配列番号９及び配列番号１１）、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２（配列番号１３及び配列番号１５）、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４（配列番号１７及び配列番号１９）、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６（配列番号２１及び配列番号２３）、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３（配列番号２５及び配列番号２７）、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターを用いて上記細胞に導入される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、実質的に等しい量の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、本明細書に記載の細胞に導入される。一部の例では、第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに対する比率（ポリヌクレオチド比率）は１：１である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに対する比率は１：１超である。ある特定の例では、第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに対する比率は１：１未満である。
本発明ではまた、本明細書で概要を示す第１のポリヌクレオチドのうちのいずれか１種を含む発現ベクターを提供する。同様に、本明細書で概要を示す第２のポリヌクレオチドのうちのいずれか１種を含む発現ベクターを提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で概要を示す第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを含む組成物を開示し、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターは、実質的に等しい量の上記第１のポリペプチド及び上記第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、第１の発現ベクターの第２の発現ベクターに対する比率は１：１である。他の実施形態では、第１の発現ベクターの第２の発現ベクターに対する比率は１：１超である。他の実施形態では、第１の発現ベクターの第２の発現ベクターに対する比率は１：１未満である。
一態様では、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むプロドラッグ組成物を単離するための方法を提供する。方法は、（１）第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを産生させて培地内に分泌させるのに好適な培養条件下で宿主細胞を培養すること、及び（２）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて培地から第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを精製することにより、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むプロドラッグ組成物を単離すること、を含み、宿主細胞は、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第１のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、を含む、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変重鎖、を含む、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列、
を含み、
第１のポリペプチドの可変重鎖、及び第２のポリペプチドの可変軽鎖は、会合してＦｖを形成すると、ヒトＣＤ３と結合する。
一部の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは別々に精製される。他の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは同時に精製される。
一部の実施形態では、精製することは、プロテインＡクロマトグラフィーの後にアフィニティークロマトグラフィーを実施することを更に含む。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物は、実質的に等しい量の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する。一部の例では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のアミノ酸配列を含む。他の例では、上記第１のｓｄＡｂ及び上記第２のｓｄＡｂは異なるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは異なるヒトＴＴＡに結合する。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び／または第２のｓｄＡｂは、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＢ７Ｈ３、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＦＯＬＲ１、からなる群から選択されるヒトＴＴＡと結合する。
一部の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される。ある特定の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、異なるプロテアーゼによって認識される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを含む、及び／または、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを含む。一部の例では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含み、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。一部の例では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。他の例では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドの可変重鎖は、図３９の配列番号１０２のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１０６、配列番号１１０、及び配列番号２０７からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変重鎖配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９のｉｖｈＣＤＲ１、ｉｖｈＣＤＲ２、及びｉｖｈＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。他の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１０３のｉｖｈＣＤＲ１、ｉｖｈＣＤＲ２、及びｉｖｈＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。一部の実施形態では、擬似可変重鎖は、図３９の配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０のｉｖｈＣＤＲ１、ｉｖｈＣＤＲ２、及びｉｖｈＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドの可変軽鎖は、図３８の配列番号９０のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９４、配列番号９８、及び配列番号２０３からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変軽鎖配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７のｉｖｌＣＤＲ１、ｉｖｌＣＤＲ２、及びｉｖｌＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。他の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１のｉｖｌＣＤＲ１、ｉｖｌＣＤＲ２、及びｉｖｌＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６のｉｖｌＣＤＲ１、ｉｖｌＣＤＲ２、及びｉｖｌＣＤＲ３配列をそれぞれ含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６（配列番号５）、Ｐｒｏ３９（配列番号９）、Ｐｒｏ４１（配列番号１３）、Ｐｒｏ４３（配列番号１７）、Ｐｒｏ４５（配列番号２１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号２５）、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号７）、Ｐｒｏ４０（配列番号１１）、Ｐｒｏ４２（配列番号１５）、Ｐｒｏ４４（配列番号１９）、Ｐｒｏ４６（配列番号２３）、及びＰｒｏ３５３（配列番号２７）、からなる群から選択される。一部の実施形態では、上記第１のポリペプチド及び上記第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９（配列番号５及び配列番号７）、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０（配列番号９及び配列番号１１）、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２（配列番号１３及び配列番号１５）、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４（配列番号１７及び配列番号１９）、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６（配列番号２１及び配列番号２３）、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３（配列番号２５及び配列番号２７）、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び上記第２のポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターを用いて宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、単一の発現ベクターを用いて宿主細胞に導入されている。
記載するプロドラッグ組成物のうちのいずれか１種を単離するための方法は、実質的に等しい量の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを更に含んでいてもよい。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び上記第２のポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターまたは単一の発現ベクターを用いて上記宿主細胞に導入される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、実質的に等しい量の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド比率は１：１である。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド比率は１：１超である。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド比率は１：１未満である。
本明細書では、本明細書で概要を示す方法のうちのいずれか１つに従い作製したプロドラッグ組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とするヒト対象においてそれを実施するための方法を提供する。
２０１８年９月６日出願のＷＯ２０１９／０５１１２２、２０１７年９月８日出願の米国仮出願第６２／５５５，９９９号、２０１８年９月６日出願のＷＯ２０１９／０５１１０２、２０１７年９月８日出願の米国仮出願第６２／５５５，９４３号、２０１７年１１月１５日出願の米国仮出願第６２／５８６，６２７号、２０１７年１１月１６日出願の米国仮出願第６２／５８７，３１８号、２０１７年３月８日出願のＷＯ２０１７／１５６１７８、２０１７年９月８日出願の米国仮出願第６２／５５５，９９９号（図、凡例、及び定義、ならびに列挙する全ての実施形態を含むその全体は明示的に参照により組み込まれる）、を参照されたい。
例示的な半ＣＯＢＲＡ構築物の概略図を表す。Ｐｒｏ１６構築物の構造は、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）抗ＥＧＦＲ１ ｓｄＡｂ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの活性可変重鎖ドメイン−開裂性リンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの擬似（不活性）可変軽鎖−半減期延長ドメイン（例えば、抗ＨＳＡ）を含む。Ｐｒｏ１９構築物の構造は、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）抗ＥＧＦＲ２ ｓｄＡｂ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの活性可変軽鎖−開裂性リンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの擬似可変重鎖−半減期延長ドメイン（例えば、抗ＨＳＡ）を含む。未開裂分子は、ＥＧＦＲに結合するが、ＣＤ３には結合せず、Ｔ細胞細胞傷害性アッセイにおいて活性ではない。開裂性リンカーのプロテアーゼ開裂部位を認識するプロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ）は、Ｐｒｏ１６半ＣＯＢＲＡ及びＰｒｏ１９半ＣＯＢＲＡを開裂させて、インタクトＶＨドメイン及びインタクトＶＬドメインが両方とも活性構築物の抗ＥＧＦＲ１／２ ｓｄＡｂを介してがん細胞につながった状態の、活性抗ＣＤ３ Ｆｖ分子を生成することができる。 例示的な半ＣＯＢＲＡ構築物の概略図を表す。一般的な半ＣＯＢＲＡ構築物を表す。Ｐｒｏ１構築物の構造は、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）抗ＴＴＡ１ ｓｄＡｂ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの活性可変重鎖ドメイン−開裂性リンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの擬似（不活性）可変軽鎖−半減期延長ドメイン（例えば、抗ＨＳＡ）を含む。Ｐｒｏ２構築物の構造は、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）抗ＴＴＡ２ ｓｄＡｂ−ドメインリンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの活性可変軽鎖−開裂性リンカー−抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの擬似可変重鎖−半減期延長ドメイン（例えば、抗ＨＳＡ）を含む。一部の例では、抗ＴＴＡ１及び抗ＴＴＡ２は同一の腫瘍抗原と結合する。他の例では、抗ＴＴＡ１及び抗ＴＴＡ２は異なる腫瘍抗原と結合する。 ＥＫ開裂が、相補的な半ＣＯＢＲＡＰｒｏ１６及びＰｒｏ１９と協同的にＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺傷を活性化させていることを示す。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 タンパク質分解開裂前後の共発現させた半ＣＯＢＲＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。一過的に共トランスフェクションしたｅｘｐｉ２９３細胞の集団から半ＣＯＢＲＡを共発現させてから、プロテインＡ精製カラムを用いて、得られた条件培地から共精製した。データは、一部の半ＣＯＢＲＡペア（例えば、Ｐｒｏ４５／Ｐｒｏ４６など）が等しく共発現しており、他の半ＣＯＢＲＡペア（例えば、Ｐｒｏ４３／Ｐｒｏ４４など）が等しく共発現していないことを示している。別の実験は、共トランスフェクションにおけるそれぞれの半ＣＯＢＲＡの発現ベクター比率を調節することにより、半ＣＯＢＲＡペアの等しい発現がもたらされることを示した。 Ａ及びＢは、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて測定した際に、Ｐｒｏ１６構築物及びＰｒｏ１９構築物の共発現及び共精製の主生成物が単量体半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ１９モノマー）に相当していることを示す。データは、Ｐｒｏ１６構築物及びＰｒｏ１９構築物の共発現及び共精製がタンパク質凝集を引き起こさないということを示している。 それぞれのモノマーの等モル混合物と比較した、共発現及び共精製したＰｒｏ１６及びＰｒｏ１９のＳＥＣ解析を示す。 Ａ及びＢは、Ｐｒｏ１６構築物が分析ＳＥＣでモノマーピークをもたらすことを示す。Ｂは、Ｐｒｏ１９モノマーと比較したＰｒｏ１６構築物の比較を示す。 Ａ及びＢは、分析ＳＥＣを用いて測定した際に、Ｐｒｏ３９構築物及びＰｒｏ４０構築物の共発現及び共精製の主生成物が単量体半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ１９モノマー）に相当していることを示す。 それぞれのモノマーの等モル混合物と比較した、共発現及び共精製したＰｒｏ３９構築物及びＰｒｏ４０構築物のＳＥＣ解析を示す。 Ａ及びＢは、分析ＳＥＣを用いて測定した際に、Ｐｒｏ４１構築物及びＰｒｏ４２構築物の共発現及び共精製の主生成物が単量体半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ１９モノマー）に相当していることを示す。 それぞれのモノマーの等モル混合物と比較した、共発現及び共精製したＰｒｏ４１構築物及びＰｒｏ４２構築物のＳＥＣ解析を示す。 Ａ及びＢは、分析ＳＥＣを用いて測定した際に、Ｐｒｏ４３構築物及びＰｒｏ４４構築物の共発現及び共精製の主生成物が単量体半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ１９モノマー）に相当していることを示す。 Ａ及びＢは、分析ＳＥＣを用いて測定した際に、Ｐｒｏ４５構築物及びＰｒｏ４６構築物の共発現及び共精製の主生成物が単量体半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ１９モノマー）に相当していることを示す。 共発現させた半ＣＯＢＲＡのＴＤＣＣアッセイを示す。Ｔ細胞殺傷アッセイは、共発現させた半ＣＯＢＲＡペアが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示す。開裂したＰｒｏ１６及びＰｒｏ１９のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 共発現させた半ＣＯＢＲＡのＴＤＣＣアッセイを示す。Ｔ細胞殺傷アッセイは、共発現させた半ＣＯＢＲＡペアが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示す。開裂したＰｒｏ３９及びＰｒｏ４０のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 共発現させた半ＣＯＢＲＡのＴＤＣＣアッセイを示す。Ｔ細胞殺傷アッセイは、共発現させた半ＣＯＢＲＡペアが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示す。開裂したＰｒｏ４１及びＰｒｏ４２のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 共発現させた半ＣＯＢＲＡのＴＤＣＣアッセイを示す。Ｔ細胞殺傷アッセイは、共発現させた半ＣＯＢＲＡペアが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示す。開裂したＰｒｏ４３及びＰｒｏ４４のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 共発現させた半ＣＯＢＲＡのＴＤＣＣアッセイを示す。Ｔ細胞殺傷アッセイは、共発現させた半ＣＯＢＲＡペアが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示す。開裂したＰｒｏ４５及びＰｒｏ４６のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 共発現させた半ＣＯＢＲＡのＴＤＣＣアッセイを示す。Ｔ細胞殺傷アッセイは、共発現させた半ＣＯＢＲＡペアが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示す。開裂したＰｒｏ５９及びＰｒｏ６０のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。 いくつかの好適なプロテアーゼ開裂部位を提供する。当業者が理解するように、これらの開裂性部位を開裂性リンカーとして使用することができる。一部の実施形態では、例えば、より多くのフレキシブル開裂性リンカーを必要とする場合、これら開裂部位のＮ末端側及びＣ末端側の一方またはその両方にある追加のアミノ酸（一般的には、グリシン及びセリン）があってもよい。 いくつかの好適なプロテアーゼ開裂部位を提供する。当業者が理解するように、これらの開裂性部位を開裂性リンカーとして使用することができる。一部の実施形態では、例えば、より多くのフレキシブル開裂性リンカーを必要とする場合、これら開裂部位のＮ末端側及びＣ末端側の一方またはその両方にある追加のアミノ酸（一般的には、グリシン及びセリン）があってもよい。 いくつかの好適なプロテアーゼ開裂部位を提供する。当業者が理解するように、これらの開裂性部位を開裂性リンカーとして使用することができる。一部の実施形態では、例えば、より多くのフレキシブル開裂性リンカーを必要とする場合、これら開裂部位のＮ末端側及びＣ末端側の一方またはその両方にある追加のアミノ酸（一般的には、グリシン及びセリン）があってもよい。 本明細書に記載の実施形態に用いるドメインリンカー配列などの例示的なリンカー配列を示す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ６のアミノ酸配列（配列番号１）及び核酸配列（配列番号２）を示す。Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ７のアミノ酸配列（配列番号３）及び核酸配列（配列番号４）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ１６のアミノ酸配列（配列番号５）及び核酸配列（配列番号６）を示す。Ｐｒｏ１６及びＰｒｏ１９は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ１９のアミノ酸配列（配列番号７）及び核酸配列（配列番号８）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３９のアミノ酸配列（配列番号９）及び核酸配列（配列番号１０）を示す。Ｐｒｏ３９及びＰｒｏ４０は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４０のアミノ酸配列（配列番号１１）及び核酸配列（配列番号１２）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４１のアミノ酸配列（配列番号１３）及び核酸配列（配列番号１４）を示す。Ｐｒｏ４１及びＰｒｏ４２は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４２のアミノ酸配列（配列番号１５）及び核酸配列（配列番号１６）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４３のアミノ酸配列（配列番号１７）及び核酸配列（配列番号１８）を示す。Ｐｒｏ４３及びＰｒｏ４４は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４４のアミノ酸配列（配列番号１９）及び核酸配列（配列番号２０）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４５のアミノ酸配列（配列番号２１）及び核酸配列（配列番号２２）を示す。Ｐｒｏ４５及びＰｒｏ４６は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ４６のアミノ酸配列（配列番号２３）及び核酸配列（配列番号２４）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３４９のアミノ酸配列（配列番号２５）及び核酸配列（配列番号２６）を示す。Ｐｒｏ３４９及びＰｒｏ３５３は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３５３のアミノ酸配列（配列番号２７）及び核酸配列（配列番号２８）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗Ｂ７Ｈ３半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３４８のアミノ酸配列（配列番号２９）及び核酸配列（配列番号３０）を示す。Ｐｒｏ３４８及びＰｒｏ３５２は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗Ｂ７Ｈ３半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３５２のアミノ酸配列（配列番号３１）及び核酸配列（配列番号３２）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３５０のアミノ酸配列（配列番号２３）及び核酸配列（配列番号３４）を示す。Ｐｒｏ３５０及びＰｒｏ３５４は半ＣＯＢＲＡペアを形成することができる。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 Ａ及びＢは例示的な抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡを示す。Ａ〜Ｂは、それぞれＰｒｏ３５４のアミノ酸配列（配列番号３５）及び核酸配列（配列番号３６）を示す。抗原結合ドメインについては、ＣＤＲを太字とし一重下線を付している。リンカーには二重下線を付している。開裂性リンカーをイタリック体とし二重下線を付している。スラッシュ（「／」）はドメイン分離記号を表す。 本発明の例示的なＴＴＡ ＡＢＤのアミノ酸配列、例えば、配列番号３７、４１、４５、及び５０の抗ＥＧＦＲ ｓｄＡｂなどを提供する。ＣＤＲは、太字として一重下線を付し、図に示す配列番号識別子に対応している。 本発明の例示的なＴＴＡ ＡＢＤのアミノ酸配列、例えば、配列番号５４、５８、及び６２の抗ＦＯＬＲ１ ｓｄＡｂなどを提供する。ＣＤＲは、太字として一重下線を付し、図に示す配列番号識別子に対応している。 本発明の例示的なＴＴＡ ＡＢＤのアミノ酸配列、例えば、配列番号６６及び６８の抗Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡｂ、ならびに配列番号７４及び７８の抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂなどを提供する。ＣＤＲは、太字として一重下線を付し、図に示す配列番号識別子に対応している。 本発明の例示的な抗ＨＳＡ結合ドメイン（半減期延長ドメイン）のアミノ酸配列、例えば、配列番号８２及び８６の抗ＨＳＡ結合ドメインなどを提供する。ＣＤＲは、太字として一重下線を付し、図に示す配列番号識別子に対応している。 本発明の例示的な活性抗ＣＤ３可変軽鎖ドメイン（例えば、αＣＤ３ ＶＬ、配列番号９０）及び例示的な不活性抗ＣＤ３可変軽鎖ドメイン（例えば、αＣＤ３ ＶＬｉ、配列番号９４；αＣＤ３ ＶＬｉ２、配列番号９８；及びαＣＤ３ ＶＬｉＧＬ、配列番号２０３）のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲは、太字として一重下線を付し、図に示す配列番号識別子に対応している。 本発明の例示的な活性抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン（例えば、αＣＤ３ ＶＨ、配列番号１０２）及び例示的な不活性抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン（例えば、αＣＤ３ ＶＨｉ、配列番号１０６；αＣＤ３ ＶＨｉ２、配列番号１１０；及びαＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４、配列番号２０７）のアミノ酸配列を提供する。ＣＤＲは、太字として一重下線を付し、図に示す配列番号識別子に対応している。 例示的な抗ＣＤ３ ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列を提供する。一実施形態では、リンカーは、配列番号１１４のアミノ酸配列を有する非開裂性リンカーである。異なる実施形態では、リンカーは配列番号１１５のアミノ酸配列を有する。 ２つのペアの半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２及びＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４）の構成要素を示す。表はまた、Ｅｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより個別に生成した際のそれぞれの半ＣＯＢＲＡの収率を提供する。 半ＣＯＢＲＡペアＰｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２及びＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４を用いたプラスミドＤＮＡ比率最適化実験から得られたデータを示す。黒色実線は、Ｈｉｓ６タグにより検出されたＰｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２を示す。灰色実線は、Ｓｔｒｅｐ２タグにより検出されたＰｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２を示す。黒色破線は、Ｓｔｒｅｐ２タグにより検出されたＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４を示す。灰色破線は、Ｈｉｓ６タグにより検出されたＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４を示す。 共発現させた半ＣＯＢＲＡにおける同様の生産性をもたらす、半ＣＯＢＲＡペアのそれぞれのメンバーの最適プラスミドＤＮＡ比率を示す。一部の例では、ペアＰｒｏ３４８及びＰｒｏ３５２の最適ＤＮＡ比率は２．５：７．５（Ｐｒｏ３４８：Ｐｒｏ３５２）である。一部の例では、ペアＰｒｏ３５０及びＰｒｏ３５４の最適ＤＮＡ比率は２：８（Ｐｒｏ３５０：Ｐｒｏ３５４）である。 半ＣＯＢＲＡのペアを発現する安定細胞株の生産性を示す。Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２を発現する４つの安定クローン（クローン１Ｅ９、１Ｆ４、３Ｂ９、及び４Ｂ１２）を評価した。Ｐｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４を発現する３つの安定クローン（クローン３Ｃ８、４Ｈ３、及び２Ｇ２）を評価した。異なる培養形態（例えば、９６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、及び懸濁培養液中など）においてクローンにより産生されたそれぞれのＰｒｏ構築物の量をＯｃｔｅｔ解析で測定した。 Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２またはＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４などの半ＣＯＢＲＡペアを発現する安定クローンのコロニースクリーニング実験の例示的なデータを示す。クローンＩＤ番号を示す。 Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２またはＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４などの半ＣＯＢＲＡペアを発現する安定クローンのコロニースクリーニング実験の例示的なデータを示す。Ｏｃｔｅｔ Ｈｉｓ１Ｋバイオセンサーを用いてＨｉｓタグ付きのＰｒｏ３５２及びＰｒｏ３５４を検出した際のデータを示す。 Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２またはＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４などの半ＣＯＢＲＡペアを発現する安定クローンのコロニースクリーニング実験の例示的なデータを示す。Ｏｃｔｅｔ ＳＡＸバイオセンサーを用いてＳｔｒｅｐ２タグ付きのＰｒｏ３４８及びＰｒｏ３５０を検出した際のデータを示す。 Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２安定細胞株の３つの上位クローン（クローン１Ｆ４、３Ｂ９、及び４Ｂ１２）ならびにＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４安定細胞株の３つの上位クローン（クローン３Ｃ８、４Ｈ３、及び２Ｇ２）のＯｃｔｅｔデータを示す。
Ｉ．導入
本発明は、治療用部分の作製に利用可能な組成物を作製するための方法に関する。具体的には、本発明の方法は、重要な生理学的標的、例えば、ＣＤ３及び腫瘍抗原などに結合する二重特異性抗体（抗体様機能性タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低下させる治療用タンパク質の作製を可能とする。多くの抗原結合タンパク質、例えば、抗体などは、重大なオフターゲット副作用を示す場合があることから、治療用分子の結合能を疾患組織近傍においてのみ有効化させてオフターゲット相互作用を回避する必要がある。それゆえ、本発明は、いくつかの機能性タンパク質ドメインを有する多価条件的有効化型（「ＭＣＥ」）タンパク質を作製するための方法に関する。一般的に、これらのドメインの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）と結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）であり、もう１つは、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に、ある特定の条件下で結合するＡＢＤである。加えて、ＭＣＥタンパク質はまた、１つまたは複数のプロテアーゼ開裂部位を含む。それはつまり、腫瘍環境に曝露されるまでＣＤ３結合ドメインが不活性である「プロドラッグ」様形態で、治療用分子が作製されるということである。腫瘍環境は高レベルのタンパク質分解活性を有しており、その結果、腫瘍環境内のプロテアーゼに曝露すると、プロドラッグは開裂して活性化状態となる。
この腫瘍環境における活性化は通常、本明細書において、ＭＣＥのＣＤ３ Ｆｖを本明細書で考察する不活性形態に制約し、ＣＤ３などのＴ細胞抗原を標的とする「擬似」可変重鎖ドメイン及び「擬似」可変軽鎖ドメインを含むタンパク質を用いることによって達成される。ＴＴＡがＭＣＥを腫瘍近傍へと向かわせると、その結果として、ＭＣＥがプロテアーゼに曝露されることになる。開裂が生じると、活性可変重鎖ドメイン及び活性軽鎖ドメインがその時点でペアをなして、ＣＤ３に対する１つまたは複数の活性ＡＢＤを形成することにより、Ｔ細胞を腫瘍へと動員して、治療をもたらすことができる。
しかしながら、単一のメカニズムに用いる２種のタンパク質の使用は、これらの分子を薬物として作製することにおいて問題を生じさせる。１つの解決策は、異なる半ＣＯＢＲＡをそれぞれが発現する２種の発現細胞株を作製することであり、その後、２種の半ＣＯＢＲＡを別々に発現させて別々に精製してから混合することにより、プロドラッグカクテルを作製することができる。あいにく、この解決策は、大用量の薬物カクテルを作製する上で、時間がかかりかつ費用のかかるプロセスである。別の解決策は、２種の半ＣＯＢＲＡを同一細胞内で共発現させてから、別々または共にのいずれかで、同一の条件培地からそれら半ＣＯＢＲＡを精製することである。
それゆえ、本発明は、ある特定の条件下でＣＤ３及び腫瘍抗原と結合することができる相補ペアの治療用分子を共発現させてから共精製するための方法に関する。本方法を用いて、相補ペアのタンパク質のそれぞれをほぼ等モル比率で作製してもよい。相補ペアの治療用分子を発現する安定細胞株もまた提供する。
本発明はまた、重要な生理学的標的、例えば、ＣＤ３及び腫瘍抗原などに結合する二重特異性抗体（抗体様機能性タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低下させることのできる治療用分子を作製するための方法に関する。多くの抗原結合タンパク質、例えば、抗体などは、重大なオフターゲット副作用を示す場合があることから、治療用分子の結合能を疾患組織近傍においてのみ有効化させてオフ腫瘍相互作用を回避する必要がある。それゆえ、本発明は、多くの機能性タンパク質ドメインを有する条件的有効化型タンパク質に関する。一般的に、これらのドメインの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）と結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）であり、もう１つは、ある特定の条件下、例えば、ＡＢＤの一部がＡＢＤの相補部分の近傍にあって抗ＣＤ３ Ｆｖ結合ドメインを形成するような場合に、ＣＤ３などのＴ細胞抗原と結合する、ＡＢＤの一部である。それはつまり、腫瘍環境に曝露されるまでＣＤ３結合ドメインが不活性である「プロドラッグ」様形態で、治療用分子が作製されるということである。腫瘍環境がプロテアーゼを過剰発現していることから、治療用分子のプロドラッグは開裂を受けて活性治療用分子を生成することになる。
本発明において、プロドラッグ（例えば、未開裂）形態、プロドラッグポリペプチドは、「擬似ＶＬドメイン」または「擬似ＶＨドメイン」を含む。相補プロドラッグ構築物の概略図を図１に示す。擬似可変重鎖ドメイン及び擬似可変軽鎖ドメインは、標準的なフレームワーク領域を含有しているが、「不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）」（「不活性（ｉｎｅｒｔ）」または「ダミー」）ＣＤＲを含有している。しかしながら、擬似ドメインの「不活性」ＣＤＲにより、結果として生じるＡＢＤはＣＤ３と結合せず、その結果、タンパク質分解的に不活性な組織におけるオフ腫瘍毒性が防止される。しかしながら、腫瘍内または腫瘍近接にあるプロテアーゼの存在下では、プロドラッグ構築物は、「真性」の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインが会合可能となるような状態で開裂することにより、有効なＣＤ３結合を誘発して、抗腫瘍効果をもたらす。
プロドラッグの活性化は、図１及び図２に概略的に示すように生じ得る。図１において、プロドラッグ構築物Ｐｒｏ１６は、活性ＶＨドメインと擬似ＶＬドメイン（ＶＬｉドメインとも呼ばれる）間に１つの開裂部位（例えば、ＦＬＡＧ部位）を有し、プロドラッグ構築物Ｐｒｏ１９は、擬似ＶＨドメイン（ＶＨｉドメインとも呼ばれる）と活性ＶＬドメインの間に１つの開裂部位（例えば、ＦＬＡＧ部位）を有する。ＥＫによりタンパク質分解開裂が生じると、Ｐｒｏ１６のＶＬｉドメイン及びＰｒｏ１９のＶＨｉドメインがそれらの対応するプロドラッグ構築物から放出されて、腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインをそれぞれが同様に有する、抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインの固有の自己会合によりＥＧＦＲ発現細胞の表面上に会合する２種の分子が離れることにより、腫瘍部位に対するＴ細胞の動員が可能となる。
ＩＩ．定義
本出願をより完全に理解することができるように、いくつかの定義を以下に記載する。このような定義は、文法上の等価物を包含することを意味する。
「ＣＯＢＲＡ（商標）」及び「条件的二重特異性リダイレクト活性化」という用語は、いくつかの機能性タンパク質ドメインを有する二重特異性条件的有効化型タンパク質のことを意味する。一部の実施形態では、機能性ドメインの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）と結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。ある特定の実施形態では、もう１つのドメインは、ある特定の条件下でＴ細胞抗原に結合するＡＢＤである。Ｔ細胞抗原としては、ＣＤ３が挙げられるがこれらに限定されない。「半ＣＯＢＲＡ（商標）」という用語は、標的発現細胞の表面上に凝集した際の固有の自己会合により半ＣＯＢＲＡの可変重鎖が別の半ＣＯＢＲＡ（商標）（相補的な半ＣＯＢＲＡ（商標））の可変軽鎖に会合可能となる場合にＴ細胞抗原と結合することができる、条件的有効化型タンパク質のことを意味する。
「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、本明細書で使用する場合、特定の所定の位置に存在し得る２０種の天然アミノ酸のうちの１種または任意の非天然類似体のことを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」とは、２０種の天然アミノ酸のうちの１種のことを意味する。「タンパク質」とは、本明細書において、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸のことを意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチド、が挙げられる。一般的には、天然アミノ酸のみを含むタンパク質が好ましいが、タンパク質は、天然アミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造物、すなわち、「類似体」、例えば、ペプトイド（例えば、Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照のこと）などで構成されていてもよい。それゆえ、「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、本明細書で使用する場合、天然アミノ酸と合成アミノ酸の両方のことを意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、及びノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸であるとみなされる。「アミノ酸」としてはまた、プロリン及びヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が挙げられる。側鎖は、（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のいずれかであってもよい。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）配置すなわちＬ配置である。非天然側鎖を使用する場合、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ分解を防止または遅延させるために、非アミノ酸置換基を使用してもよい。
「アミノ酸修飾」とは、本明細書において、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失、またはタンパク質に化学的に結合した部分に対する改変のことを意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変糖質またはＰＥＧ構造物であってもよい。分かりやすくするためだが、特に明記しない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡがコードするアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡにコドンを有する２０種のアミノ酸に対するものである。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は置換である。
「アミノ酸置換」または「置換」とは、本明細書において、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸に置き換えることを意味する。とりわけ、一部の実施形態では、置換は、生物内の天然ではないものまたは任意の生物のいずれかにおける、特定の位置の、天然ではないアミノ酸に対するものである。分かりやすくするためだが、核酸コード配列を変化させるように操作したが開始アミノ酸が変化しないタンパク質（例えば、宿主生物の発現レベルを上昇させるために、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（なおもアルギニンをコードする）に交換する）は、「アミノ酸置換」ではなく、それはすなわち、同一タンパク質をコードする新規遺伝子を作製したにもかかわらず、そのタンパク質が、タンパク質が始まる特定の位置に同一アミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、本明細書で使用する場合、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。
「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、本明細書で使用する場合、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸配列を除去することを意味する。
本発明のポリペプチドは、ＣＤ３及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）、例えば、本明細書で概要を示す標的細胞受容体などに特異的に結合する。「特異的結合」、または特定の抗原またはエピトープ「に特異的に結合する」もしくは「に特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合のことを意味する。特異的結合は、例えば、一般的には、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した、分子の結合を求めることにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合により測定することができる。
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対する少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤ（ＫＤとは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度のことを意味する）を有する抗体により示され得る。一般的に、抗原と特異的に結合する抗体は、対照分子と比較して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上の倍数より大きな、抗原またはエピトープに対するＫＤを有する。
同様に、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上の倍数より大きな、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａ（ＫＡまたはＫａとは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度のことを意味する）を有する抗体により示され得る。結合親和性は通常、当該技術分野において周知のとおり、ＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔを用いて測定される。
「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃ親またはＦｃ前駆体を含む）とは、本明細書で使用する場合、バリアントを作製するためにその後に修飾されるポリペプチドのことを意味する。親ポリペプチドは、天然ポリペプチド、または天然ポリペプチドのバリアントもしくは改変型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、または親ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を指し得る。それゆえ、「親Ｆｃポリペプチド」とは、本明細書で使用する場合、バリアントを作製するために修飾される未修飾Ｆｃポリペプチドのことを意味し、「親抗体」とは、本明細書で使用する場合、バリアント抗体を作製するために修飾される未修飾抗体のことを意味する。
「位置」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質の配列内の場所のことを意味する。順に、または確立された方式、例えば、抗体ナンバリング用のＥＵインデックスに従って、位置に番号を振ってもよい。
「標的抗原」とは、本明細書で使用する場合、任意の抗体の可変領域が特異的に結合する分子のことを意味する。標的抗原は、タンパク質、糖質、脂質、または他の化合物であってもよい。様々な好適で例示的な標的抗原が本明細書に記載される。
「標的細胞」とは、本明細書で使用する場合、標的抗原を発現する細胞のことを意味する。
「Ｆｖ」または「Ｆｖドメイン」もしくは「Ｆｖ領域」とは、本明細書で使用する場合、抗体、一般的には、ヒトＩｇＧ１抗体の、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことを意味する。Ｆｖドメインが活性なＶＨドメイン及びＶＬドメインを含有し、かつ制約条件的リンカーを有さない場合、そのＦｖドメインは通常、本明細書で考察する「抗原結合ドメイン」すなわち「ＡＢＤ」を形成する。以下で考察するように、Ｆｖドメインは、本発明において、いくつかの方法を用いて組織することができ、「活性」または「不活性」、例えば、ｓｃＦｖ形態、制約条件的Ｆｖ形態、擬似Ｆｖ形態などであってもよい。
「可変ドメイン」とは、本明細書において、カッパ免疫グロブリン遺伝子座、ラムダ免疫グロブリン遺伝子座、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成する、Ｖ．カッパ遺伝子、Ｖ．ラムダ遺伝子、及び／またはＶＨ遺伝子のいずれかが実質的にコードする１つまたは複数のＩｇドメインを含む、免疫グロブリンの領域のことを意味する。
それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、以下の順序、すなわちＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で並んだ、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）、及び４つの「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」で構成されている。それゆえ、ＶＨドメインは、構造ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を有し、ＶＬドメインは、構造ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。本明細書でより詳細に記載するとおり、ｖｈＦＲ領域及びｖｌＦＲ領域は自己会合してＦｖドメインを形成する。通常、本発明のプロドラッグ形態には、自己会合した際にＣＤＲが抗原結合ドメインを形成しない「擬似Ｆｖドメイン」が存在している。
超可変領域は、抗原結合特異性を付与するものであり、通常、軽鎖可変領域のおよそアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域のおよそ３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）あたりの、アミノ酸残基；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、及び／または、超可変ループ（例えば、軽鎖可変領域の残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域の残基２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３））を形成するアミノ酸残基；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、を包含する。本発明の具体的なＣＤＲについて以下で説明する。
当業者が理解するように、ＣＤＲの厳密なナンバリング及び配置は、個別のナンバリングシステムの間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖配列及び／または可変軽鎖配列の本開示が、会合する（固有の）ＣＤＲの本開示を含むということを理解すべきである。それゆえ、それぞれの可変重鎖領域の本開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、それぞれの可変軽鎖領域の本開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。
ＣＤＲナンバリングの有用な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。
Figure 2021533744
本明細書の全体にわたり、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）に言及する場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを一般的に使用し、Ｆｃ領域にはＥＵナンバリングシステム（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９１））を使用する。
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全なＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む。当業者が理解するように、ＣＤＲのそれぞれのセット、ＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲは、個別に及びセットとしての両方で、抗原に結合することができる。例えば、制約条件的Ｆｖドメインにおいて、ｖｈＣＤＲは、例えば、ＣＤ３に結合することができ、ｖｌＣＤＲはＣＤ３に結合することができるが、制約条件的形態において、ｖｈＣＤＲ及びｖｌＣＤＲはＣＤ３に結合することができない。
これらのＣＤＲはそれぞれ、より大きな可変軽鎖ドメインまたは可変重鎖ドメインの一部であってもよい。加えて、本明細書でより詳細に概要を示すとおり、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合、単一のポリペプチド鎖上にあってもよい。
ＣＤＲは、抗原結合部位、またはより具体的には、エピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている可変領域の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基のことを意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集合であり、通常、特定の構造特性に加えて特定の荷電特性を有する。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有していてもよい。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの主要抗原構成要素とも呼ばれる）、及び、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的に阻害されるアミノ酸残基（すなわち、そのアミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内にある）、を含んでもよい。
エピトープは立体配座または直鎖状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントに由来する、空間的に並べられたアミノ酸により生成される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基により生成されるエピトープである。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが後者に対しては失われないという点で区別することができる。
エピトープは通常、独特な空間立体配座で、少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５つ、または８〜１０のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体については、一方の抗体が、もう一方の抗体の標的抗原への結合を阻害する能力を示す単純なイムノアッセイ、例えば、「ビン化」により、検証することができる。以下で概要を示すとおり、本発明は、本明細書で列挙する抗原結合ドメイン及び抗体だけではなく、列挙した抗原結合ドメインが結合するエピトープとの結合において競合する抗原結合ドメイン及び抗体も含む。
本発明の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは「活性」または「不活性」であってもよい。
本明細書で使用する場合、「不活性ＶＨ」（「ＶＨｉ」）及び「不活性ＶＬ」（「ＶＬｉ」）とは、擬似Ｆｖドメインの構成要素のことを指し、「不活性ＶＨ」（「ＶＨｉ」）及び「不活性ＶＬ」（「ＶＬｉ」）は、それらの同種ＶＬパートナーまたは同種ＶＨパートナーとそれぞれペアをなす場合に、「活性」ＶＨまたは「活性」ＶＬが結合し得る抗原に特異的に結合しない、結果として生じるＶＨ／ＶＬペアを形成するが、抗原が類似ＶＬまたは類似ＶＨに結合する場合、その類似ＶＬまたは類似ＶＨは「不活性」ではない。例示的な「不活性ＶＨ」ドメイン及び「不活性ＶＬ」ドメインは、野生型ＶＨ配列または野生型ＶＬ配列の変異によって形成される。例示的な変異は、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の内部に存在する。例示的な変異は、ドメインリンカーをＣＤＲ２内に配置することにより、「不活性ＶＨ」ドメインまたは「不活性ＶＬ」ドメインを形成することを含む。それに対し、「活性ＶＨ」または「活性ＶＬ」は、その「活性」同種パートナー、すなわち、ＶＬまたはＶＨとそれぞれペアをなす場合に、その標的抗原に特異的に結合することができるＶＨまたはＶＬである。
それに対し、本明細書で使用する場合、「活性」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合することができるＣＤ３結合ドメインを指す。この用語は、２つのコンテキスト、すなわち（ａ）Ｆｖ結合ペアの単一のメンバー（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）（その同種パートナーとペアをなしてＣＤ３に特異的に結合することができる配列のもの）に言及する場合、及び（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することができる配列の同種のペア（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）、で使用される。例示的な「活性」ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ／ＶＬペアは、野生型配列または親配列である。
「ＣＤ−ｘ」は分化抗原群（ＣＤ）タンパク質を指す。例示的な実施形態では、ＣＤ−ｘは、本発明のポリペプチド構築物を投与した対象におけるＴ細胞を動員または活性化させる役割を有するそれらＣＤタンパク質から選択される。例示的な実施形態では、ＣＤ−ｘはＣＤ３である。
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関係において、標的分子（抗原）、例えば、それぞれＥＧＦＲ及びＣＤ３上の任意の標的エピトープまたは任意の標的部位に（特異的に）結合する／と相互作用する／を認識するドメインを特徴としている。標的抗原結合ドメイン（ＥＧＦＲを認識する）の構造及び機能、及び好ましくはまた、ＣＤ３結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能は、抗体、例えば、ｓｄＡｂを含む全長の抗体または完全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づいている。本発明によれば、標的抗原結合ドメインは通常、標的腫瘍抗原と結合する３つのＣＤＲの存在を特徴としている（対応する軽鎖ＣＤＲは存在しないが、当該技術分野においては一般的に、可変重鎖ドメインと呼ばれる）。代替的に、ＴＴＡに対するＡＢＤは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含んでいてもよい。ＣＤ３結合ドメインはまた、標的結合を可能とする少なくとも最低限の抗体の構造的要件を含んでいることが好ましい。より好ましくは、ＣＤ３結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。例示的な実施形態では、ファージディスプレイ法またはライブラリスクリーニング法を用いて、標的抗原及び／またはＣＤ３結合ドメインを作製することまたは得ることができることが想定されている。
「ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、本明細書で概要を示す機能を有するタンパク質配列のことを意味する。本発明のドメインとしては、腫瘍標的抗原結合ドメイン（ＴＴＡドメイン）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、リンカードメイン、及び半減期延長ドメイン、が挙げられる。
「ドメインリンカー」（「ＤＬ」）とは、本明細書において、本明細書で概要を示す２つのドメインを連結するアミノ酸配列のことを意味する。ドメインリンカーは、開裂性リンカー、制約条件的開裂性リンカー、非開裂性リンカー、制約条件的非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなど、であってもよい。
「開裂性リンカー」（「ＣＬ」）とは、本明細書において、本明細書で概要を示す疾患組織において、プロテアーゼ、好ましくはヒトプロテアーゼによって開裂され得るアミノ酸配列のことを意味する。開裂性リンカーは通常、少なくとも３アミノ酸長であり、必要なフレキシビリティに応じて、４から、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸が本発明において有用である。
「非開裂性リンカー」（「ＮＣＬ」）とは、本明細書において、通常の生理学的条件下においてヒトプロテアーゼによって開裂され得ないアミノ酸配列のことを意味する。
「制約条件的開裂性リンカー」（「ＣＣＬ」）とは、本明細書において、２つのドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在するようになる後、例えば、開裂後まで、２つのドメインが互いに有意に相互作用し得ないような状態で、本明細書で概要を示す２つのドメインを連結するプロテアーゼ開裂部位（本明細書で定義する）を含有する短いポリペプチドのことを意味する。ＣＣＬが本明細書で定義するＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結しているとき、そのＶＨ及びＶＬは、立体制約条件により、開裂前に分子内で自己会合して機能性Ｆｖを形成することができない。適切なプロテアーゼによって開裂すると、ＶＨ及びＶＬは、分子間で会合して活性抗原結合ドメインを形成することができる。通常、ＣＣＬは１０未満のアミノ酸長であり、９、８、７、６、５、及び４アミノ酸が本発明において有用である。一般的に、プロテアーゼ開裂部位は通常、図１４Ａ〜図１４Ｃに示すとおり、十分な特異性を付与するために少なくとも４以上のアミノ酸長である。
「制約条件的非開裂性リンカー」（「ＣＮＣＬ」）とは、本明細書において、２つのドメインが互いに有意に相互作用し得ず、かつ生理学的条件下においてヒトプロテアーゼによって有意に開裂されないような状態で、本明細書で概要を示す２つのドメインを連結する短いポリペプチドのことを意味する。
「制約条件的Ｆｖドメイン」とは、本明細書において、活性重鎖可変ドメイン及び活性軽鎖可変ドメインが分子内で相互作用して、ＣＤ３などの抗原と結合する活性Ｆｖを形成し得ないような状態で、本明細書で概要を示す制約条件的リンカーと共有結合で連結した活性可変重鎖ドメイン及び活性可変軽鎖ドメインを含むＦｖドメインのことを意味する。それゆえ、制約条件的Ｆｖドメインは、ｓｃＦｖに類似してはいるが、制約条件的リンカーの存在によって抗原に結合することができないドメインである。
「擬似Ｆｖドメイン」とは、本明細書において、ドメインリンカー（開裂性、制約条件的、非開裂性、非制約条件的などであってもよい）を用いて連結させた擬似または不活性の可変重鎖ドメイン及び擬似または不活性の可変軽鎖ドメインを含むドメインのことを意味する。擬似ＦｖドメインのＶＨｉドメイン及びＶＬｉドメインは、互いに会合した場合（ＶＨｉ／ＶＬｉ）、または活性ＶＨまたは活性ＶＬと会合した場合のいずれにおいても、ヒト抗原に結合しないため、ＶＨｉ／ＶＬｉ Ｆｖドメイン、ＶＨｉ／ＶＬ Ｆｖドメイン、及びＶＬｉ／ＶＨ Ｆｖドメインは、測定できるほどにはヒトタンパク質に結合せず、その結果、これらのドメインは人体において不活性である。
「一本鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」とは、本明細書において、本明細書で考察するｓｃＦｖリンカーを一般的に用いてｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成するための、共有結合で可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに結合した可変重鎖（ＶＨ）ドメインのことを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、いずれの配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）であってもよい。
「単一ドメインＦｖ」、「ｓｄＦｖ」、「単一ドメイン抗体」、または「ｓｄＡｂ」とは、本明細書において、一般的にラクダ科抗体技術に基づいて、３つのＣＤＲを有するに過ぎない抗原結合ドメインのことを意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：１１２９−３５（１９９４）、Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７４：２７７−３０２（２００１）、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８２：７７５−９７（２０１３）を参照されたい。
「プロテアーゼ開裂部位」は、プロテアーゼが認識して開裂するアミノ酸配列を指す。好適なプロテアーゼ開裂部位については以下で概要を示す。
本明細書で使用する場合、「プロテアーゼ開裂ドメイン」は、「プロテアーゼ開裂部位」、及び、個々のプロテアーゼ開裂部位間及びプロテアーゼ開裂部位（複数可）間の任意のリンカー、ならびに、本発明の構築物の他の機能性構成要素（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨｉ、ＶＬｉ、標的抗原結合ドメイン（複数可）、半減期延長ドメインなど）、を組み込んだペプチド配列を指す。
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」もしくは「Ｆｃドメイン」とは、本明細書で使用する場合、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン、及び場合によってはヒンジの一部を除いた抗体の定常領域を含むポリペプチドのことを意味するように使用される。それゆえ、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の残りの２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の残りの３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及び、これらのドメインのＮ末端側にあるフレキシブルヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭにおいて、ＦｃはＪ鎖を含んでいてもよい。ＩｇＧにおいて、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）、ならびに、Ｃγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）の間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）を含むものと定義される。
量、比率、レベルなどに関する「実質的に等しい」は、ほぼ等しい分量または等しい分量を指す。一部の実施形態では、実質的に等しい量は、２つの量の間の、１０％の差異またはそれ以下、例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の差異を指す。一部の実施形態では、実質的に等しい量は、２つの等しいまたは同一の量、比率、レベル、または分量を指す。一部の例では、実質的に等しい量のポリペプチドは、等しい量の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを指す。一部の例では、実質的に等しい比率のポリヌクレオチドは、等しい量の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを指す。
ＩＩＩ．実施形態の説明
Ａ．ポリペプチドペア及びプロドラッグ構築物
一部の実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ及び／または可変ドメイン（例えば、活性重鎖ドメインまたは擬似軽鎖）は、図１６Ａ、図１８Ａ、図２０Ａ、図２２Ａ、図２４Ａ、図２６Ａ、図２８Ａ、図３８、及び図３９に記載のＣＤＲ及び／または可変ドメインのいずれかである。一部の実施形態では、ポリペプチドのｓｄＡｂ（ＴＴＡ）は、図３４、図３５、及び図３６に記載のｓｄＡｂのうちのいずれか１種である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｐｒｏ６（配列番号２）、Ｐｒｏ１６（配列番号５）、Ｐｒｏ３９（配列番号９）、Ｐｒｏ４１（配列番号１３）、Ｐｒｏ４３（配列番号１７）、Ｐｒｏ４５（配列番号２１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号２５）、からなる群から選択されるいずれか１つの構造を有する。
一実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）の構造を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ及び／または可変ドメイン（例えば、擬似重鎖ドメインまたは活性軽鎖）は、図１７Ａ、図３８、及び図３９のＣＤＲ及び／または可変ドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドのｓｄＡｂ（ＴＴＡ）は、図３４、図３５、及び図３６に記載のｓｄＡｂのうちのいずれか１種である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドはＰｒｏ７（配列番号３）の構造を有する。
様々な実施形態では、ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＣＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ及び／または可変ドメイン（例えば、擬似重鎖ドメインまたは活性軽鎖）は、図１９Ａ、図２１Ａ、図２３Ａ、図２５Ａ、図２７Ａ、図２９Ａ、図３８、及び図３９に記載のＣＤＲ及び／または可変ドメインのいずれかである。一部の実施形態では、ポリペプチドのｓｄＡｂ（ＴＴＡ）は、図３４、図３５、及び図３６に記載のｓｄＡｂのうちのいずれか１種である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号７）、Ｐｒｏ４０（配列番号１１）、Ｐｒｏ４２（配列番号１５）、Ｐｒｏ４４（配列番号１９）、Ｐｒｏ４６（配列番号２３）、及びＰｒｏ３５３（配列番号２７）、からなる群から選択されるいずれか１つの構造を有する。
一実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチド、及び、ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）の構造を含む第２のポリペプチド、を含む、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）を提供する。一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図１６Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図１７Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。ある特定の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ６及びＰｒｏ７を含む。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の抗原に結合する。他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の、抗原のエピトープに結合する。更に他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる抗原と結合する。
一部の実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチド、及び、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＣＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を含む第２のポリペプチド、を含む、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）を提供する。他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の、抗原のエピトープに結合する。更に他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる抗原と結合する。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図１８Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図１９Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ１６及びＰｒｏ１９を含む。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図２０Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図２１Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。ある特定の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ３９及びＰｒｏ４０を含む。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図２２Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図２３Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。特定の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ４１及びＰｒｏ４２を含む。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図２４Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図２５Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ４３及びＰｒｏ４４を含む。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図２６Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図２７Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ４５及びＰｒｏ４６を含む。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）は、図２８Ａに示す構造を含む第１のポリペプチド、及び、図２９Ａに示す構造を含む第２のポリペプチド、を含む。ある特定の実施形態では、プロドラッグ組成物（またはプロドラッグ構築物）はＰｒｏ３４９及びＰｒｏ３５３を含む。
Ｂ．発現ベクター及び宿主細胞
一実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）の構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを提供する。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の抗原（ＴＴＡ）に結合する。他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の、抗原のエピトープに結合する。更に他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる抗原と結合する。
別の実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）の構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、宿主細胞を提供する。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の抗原に結合する。他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の、抗原のエピトープに結合する。更に他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる抗原と結合する。一実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチド、及び、ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）の構造を含む第２のポリペプチド、を発現する（産生または分泌する）細胞を提供する。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図１６Ａに示す配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図１７Ａに示す配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図１６Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図１７Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図１６Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図１７Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ６をコードする核酸配列（配列番号２）及び／またはＰｒｏ７をコードする核酸配列（配列番号４）を含む。
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、図１６Ａに示す配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図１７Ａに示す配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の例では、宿主細胞は、図１６Ｂに示す第１の核酸配列を含む第１の発現ベクター、及び、図１７Ｂに示す第２の核酸配列を含む第２の発現ベクター、を含む。一部の例では、宿主細胞は、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含む第１の発現ベクター、及び、配列番号４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含む第２の発現ベクター、を含む。一部の例では、宿主細胞は、Ｐｒｏ６をコードする核酸配列、例えば、配列番号２などを含む第１の発現ベクター、及び、Ｐｒｏ７をコードする核酸配列、例えば、配列番号４などを含む第２の発現ベクター、を含む。
一部の実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＣＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを提供する。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の抗原に結合する。他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の、抗原のエピトープに結合する。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる、抗原のエピトープに結合する。更に他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる抗原と結合する。
一部の態様において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＣＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、宿主細胞を提供する。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の抗原に結合する。他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂと同一の、抗原のエピトープに結合する。一部の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる、抗原のエピトープに結合する。更に他の例では、第１のポリペプチドのｓｄＡｂは、第２のポリペプチドのｓｄＡｂとは異なる抗原と結合する。一部の実施形態において、本明細書では、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を含む第１のポリペプチド、及び、ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＣＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を含む第２のポリペプチド、を発現する（産生または分泌する）細胞を提供する。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図１８Ａに示す配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図１９Ａに示す配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図１８Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図１９Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図１８Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図１９Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号８に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ１６をコードする核酸配列、例えば、配列番号６など、及び／または、Ｐｒｏ１９をコードする核酸配列、例えば、配列番号８など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図１８Ａに示す配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図１９Ａに示す配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図１８Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図１９Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図１８Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図１９Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号８に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ１６をコードする核酸配列、例えば、配列番号６など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ１９をコードする核酸配列、例えば、配列番号８など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２０Ａに示す配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２１Ａに示す配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２０Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２１Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図２０Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図２１Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１０に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ３９をコードする核酸配列、例えば、配列番号１０など、及び／または、Ｐｒｏ４０をコードする核酸配列、例えば、配列番号１２など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２０Ａに示す配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２１Ａに示す配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２０Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２１Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図２０Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図２１Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号１０に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ３９をコードする核酸配列、例えば、配列番号１０など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ４０をコードする核酸配列、例えば、配列番号１２など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２２Ａに示す配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２３Ａに示す配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２２Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２３Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図２２Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図２３Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号１６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ４１をコードする核酸配列、例えば、配列番号１４など、及び／または、Ｐｒｏ４２をコードする核酸配列、例えば、配列番号１６など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２２Ａに示す配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２３Ａに示す配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２２Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２３Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図２２Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図２３Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号１６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ４１をコードする核酸配列、例えば、配列番号１４など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ４２をコードする核酸配列、例えば、配列番号１６など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２４Ａに示す配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２５Ａに示す配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２４Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２５Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図２４Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図２５Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号２０に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ４３をコードする核酸配列、例えば、配列番号１８など、及び／または、Ｐｒｏ４４をコードする核酸配列、例えば、配列番号２０など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２４Ａに示す配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２５Ａに示す配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２４Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２５Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図２４Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図２５Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号２０に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ４３をコードする核酸配列、例えば、配列番号１８など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ４４をコードする核酸配列、例えば、配列番号２０など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２６Ａに示す配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２７Ａに示す配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２６Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２７Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図２６Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図２７Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号２２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号２４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ４５をコードする核酸配列、例えば、配列番号２２など、及び／または、Ｐｒｏ４６をコードする核酸配列、例えば、配列番号２４など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２６Ａに示す配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２７Ａに示す配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２６Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２７Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図２６Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図２７Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号２２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号２４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ４５をコードする核酸配列、例えば、配列番号２２など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ４６をコードする核酸配列、例えば、配列番号２４など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２８Ａに示す配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２９Ａに示す配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２８Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図２９Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図２８Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図２９Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号２６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号２８に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ３４９をコードする核酸配列、例えば、配列番号２６など、及び／または、Ｐｒｏ３５３をコードする核酸配列、例えば、配列番号２８など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図２８Ａに示す配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２９Ａに示す配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図２８Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図２９Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図２８Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図２９Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号２６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号２８に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ３４９をコードする核酸配列、例えば、配列番号２６など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ３５３をコードする核酸配列、例えば、配列番号２８など、を含む。
一部の態様では、本発明の細胞は、本明細書に記載のポリペプチドペアすなわち半ＣＯＢＲＡのうちのいずれか１つを発現する（産生または分泌する）。一部の実施形態では、細胞はＰｒｏ１６及びＰｒｏ１９を発現する（産生または分泌する）。ある特定の実施形態では、細胞はＰｒｏ３９及びＰｒｏ４０を発現する（産生または分泌する）。特定の実施形態では、細胞はＰｒｏ４１及びＰｒｏ４２を発現する（産生または分泌する）。一部の実施形態では、細胞はＰｒｏ４３及びＰｒｏ４４を発現する（産生または分泌する）。一部の実施形態では、細胞はＰｒｏ４５及びＰｒｏ４６を発現する（産生または分泌する）。ある特定の実施形態では、細胞はＰｒｏ３４９及びＰｒｏ３５３を発現する（産生または分泌する）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれもまた、半減期延長ドメインを含む。ある特定の例では、半減期延長ドメイン、例えば、抗ＨＳＡドメインなどは、擬似重鎖ドメイン、擬似軽鎖ドメイン、またはポリペプチドのＣ末端に位置している。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれもまた、精製に有用なタンパク質タグを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドのうちのいずれも、ヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、ストレプトアビジン（ＳｔｒｅｐＩＩ）タグ、そのフラグメント、またはそのバリアントを含む。
Ｃ．ポリペプチドペアを発現する安定細胞
本明細書に記載のＣＤ３及び１種または複数種の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する相補ペアのタンパク質は、相補ペアのそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内で共発現させて、それら相補ペアを共精製することによって作製することができる。一部の実施形態では、細胞は相補ペアのタンパク質を産生及び分泌する。一部の実施形態では、相補ペアのタンパク質の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、ほぼ等モル比率（例えば、約１：１の比率）で産生される。言い換えると、宿主細胞は、実質的に等しい（ほぼ等しいまたは等しい）量の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを産生する。他の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、等モルではない比率（例えば、約１：１の比率ではない）で産生される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、約１：１のポリヌクレオチド比率で宿主細胞に導入される。他の実施形態では、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量、及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は、１：１ではない比率、例えば、１：１超の比率または１：１未満の比率などで宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１ １０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、及び１：５０の比率からなる群から選択されるポリヌクレオチド比率で宿主細胞に導入される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ８：２、７：３、４：６、５：５、４：６、及び３：７の本明細書に記載の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び本明細書に記載の第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の本明細書に記載の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び本明細書に記載の第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、または配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、または配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号２を有するＰｒｏ６、配列番号５を有するＰｒｏ１６、配列番号９を有するＰｒｏ３９、配列番号１３を有するＰｒｏ４１、配列番号１７を有するＰｒｏ４３、配列番号２１を有するＰｒｏ４５、及び配列番号２５を有するＰｒｏ３４９、からなる群から選択され、第２のポリペプチドは、配列番号３を有するＰｒｏ７、配列番号７を有するＰｒｏ１９、配列番号１１を有するＰｒｏ４０、配列番号１５を有するＰｒｏ４２、配列番号１９を有するＰｒｏ４４、配列番号２３を有するＰｒｏ４６、及び配列番号２７を有するＰｒｏ３５３、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのペア（例えば、第１のポリペプチド／第２のポリペプチド）は、Ｐｒｏ６／Ｐｒｏ７、Ｐｒｏ１６／Ｐｒｏ１９、Ｐｒｏ３９／Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１／Ｐｒｏ４２、Ｐｒｏ４３／Ｐｒｏ４４、Ｐｒｏ４５／Ｐｒｏ４６、及びＰｒｏ３４９／Ｐｒｏ３５３、から選択される。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号１２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号１６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号２０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号２４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞に導入するポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号２６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号２８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
ＩＶ．本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、本明細書では一般的にドメインと呼ぶ、様々な様式で共に連結するいくつかの異なる構成要素を有する。ドメインのいくつかは、それぞれが標的抗原（例えば、ＴＴＡまたはＣＤ３）に結合する結合ドメインである。結合ドメインが２種以上の抗原に結合する場合、それら結合ドメインは本明細書において「多重特異性」と呼ばれ、例えば、本発明のプロドラッグ構築物はＴＴＡ及びＣＤ３に結合することにより「二重特異性」であってもよい。
本発明のタンパク質は、本明細書で概要を示す様々な様式で並べられたＣＤ３抗原結合ドメイン、腫瘍標的抗原結合ドメイン、半減期延長ドメイン、リンカーなどを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、第１のタンパク質が第１の腫瘍標的抗原ドメインを含み、第２のタンパク質が第２の腫瘍標的抗原ドメインを含んで、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインが同一の腫瘍標的抗原に結合するようになる。ある特定の例では、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインは、同一腫瘍標的抗原の異なるエピトープ、領域、または部分と結合する。一部の例では、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインは、異なる腫瘍標的抗原と結合する。
本発明のタンパク質は、細胞内で共発現させて、共精製して、ＣＤ３及び腫瘍標的抗原に結合可能な相補ペアのタンパク質を得ることによって作製することができる。一部の実施形態では、相補ペアのタンパク質のそれぞれは別々に精製される。一部の実施形態では、相補ペアのタンパク質のそれぞれは一度にまたは同時に精製される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、相補ペアのタンパク質の一方のタンパク質をコードする核酸配列、及び、相補ペアのタンパク質のもう一方のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞はこのような発現ベクターを含む。一部の例では、このような宿主細胞を培地内、好適な条件下で培養して、タンパク質を産生させてもよい。一部の実施形態では、宿主細胞を好適な条件下で培養して、本明細書に記載のタンパク質を培地内に分泌させてもよい。ある特定の実施形態では、分泌された本発明のタンパク質を含む培地を精製して、相補ペアのタンパク質のタンパク質を得る。有用な精製方法としては、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、ヘパリン結合、逆相クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＣＨＴクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど、が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｄ．ＣＤ３抗原結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合遺伝子複合体、ＭＨＣに関連して提示される）の認識が媒介となる。Ｔ細胞受容体複合体の一部としてのＣＤ３は、細胞表面上に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）鎖及びβ（ベータ）鎖、ならびにＣＤ−ζ（ゼータ）と会合して、全体でＴ細胞受容体複合体を構成する。例えば、ＣＤ３に結合するＦｖドメインによるＴ細胞上におけるＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の結合に類似しているがそのクローン固有特異性に依存しないＴ細胞活性化をもたらす。
しかしながら、当該技術分野において周知のとおり、ＣＤ３の活性化はいくつかの毒性副作用を引き起こすことから、本発明は、特異的なプロテアーゼが存在することにより本発明のプロドラッグポリペプチドが開裂して活性ＣＤ３結合ドメインがもたらされる腫瘍細胞の存在下でのみ、本発明のポリペプチドの有効なＣＤ３結合をもたらすことに関する。それゆえ、本発明において、抗ＣＤ３ ＦｖドメインのＣＤ３への結合は、ＣＤ３ ＦｖドメインのＣＤ３への結合を、プロテアーゼレベルが高い疾患細胞または組織の微小環境、例えば、本明細書に記載の腫瘍微小環境にのみ制限するプロテアーゼ開裂ドメインによって制御される。
それゆえ、本発明は、２セットのＶＨドメイン及びＶＬドメイン、活性セット（ＶＨ及びＶＬ）及び不活性セット（ＶＨｉ及びＶＬｉ）を提供し、４つ全てがプロドラッグ構築物（複数可）内に存在している。本構築物は、ＶＨ及びＶＬのセットが自己会合し得ず逆に不活性パートナーと会合するように、例えば、本明細書で示すＶＨｉ及びＶＬ、ならびにＶＬｉ及びＶＨとなるように作製されている。
本発明に有用な、当該技術分野において周知のいくつかの好適な活性ＣＤＲセット及び／またはＶＨドメイン及びＶＬドメインが存在する。例えば、ＣＤＲ及び／またはＶＨドメイン及びＶＬドメインは、周知の抗ＣＤ３抗体、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（ヌビオン）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ−６６またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、及びＷＴ−３１、などに由来している。
一部の実施形態では、活性ＶＬドメインに近接した場合にヒトＣＤ３に結合する活性Ｆｖドメインを形成するＶＨ配列が、図１６ＡにＰｒｏ６として、図１８ＡにＰｒｏ１６として、図２０ＡにＰｒｏ３９として、図２２ＡにＰｒｏ４１として、図２４ＡにＰｒｏ４３として、図２６ＡにＰｒｏ４５として、または図２８ＡにＰｒｏ３４９として、示される。図３９に示すとおり、活性ＶＨドメインのアミノ酸配列は配列番号１０２である。
一部の実施形態では、活性ＶＨドメインに近接した場合にヒトＣＤ３に結合する活性Ｆｖドメインを形成するＶＬ配列が、図１７ＡにＰｒｏ７として、図１９ＡにＰｒｏ１９として、図２１ＡにＰｒｏ４０として、図２３ＡにＰｒｏ４２として、図２５ＡにＰｒｏ４４として、図２７ＡにＰｒｏ４６として、または図２９ＡにＰｒｏ３５３として、示される。図３８に示すとおり、活性ＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号９０である。
不活性ＶＨｉドメイン及び不活性ＶＬｉドメインは、会合を可能とする「通常の」フレームワーク領域（ＦＲ）を含有しており、その結果、不活性可変ドメインが活性可変ドメインと会合してそのペアを不活性にする、例えば、ＣＤ３に結合できなくなるようにする。一実施形態では、ＶＨｉ及びＶＬｉは、不活性ドメインの一方または両方が相補構築物ペア内に存在する場合に、不活性Ｆｖドメインを形成する。一部の実施形態では、不活性ＶＬｉドメインのアミノ酸配列が、図１６ＡにＰｒｏ６として、図１８ＡにＰｒｏ１６として、図２０ＡにＰｒｏ３９として、図２２ＡにＰｒｏ４１として、図２４ＡにＰｒｏ４３として、図２６ＡにＰｒｏ４５として、及び図２８ＡにＰｒｏ３４９として、示される。一部の例では、図３８に示すとおり、不活性ＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号９４である。他の例では、図３８に示すとおり、不活性ＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号９８である。一部の実施形態では、不活性ＶＨｉドメインのアミノ酸配列は、図１７ＡにＰｒｏ７として、図１９ＡにＰｒｏ１９として、図２１ＡにＰｒｏ４０として、図２３ＡにＰｒｏ４２として、図２５ＡにＰｒｏ４４として、図２７ＡにＰｒｏ４６として、及び図２９ＡにＰｒｏ３５３として、示される。一部の例では、図３９に示すとおり、不活性ＶＨドメインのアミノ酸配列は配列番号１０６である。他の例では、図３９に示すとおり、不活性ＶＬドメインのアミノ酸配列は配列番号１１０である。
一部の実施形態では、不活性ＶＨｉドメインは、活性ＶＬドメインとペアをなした場合にそのペアとなったＶＨｉ−ＶＬドメインが標的抗原に結合できなくなるようにする、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸挿入、欠失、または置換）を含む。他の実施形態では、不活性ＶＬｉドメインは、活性ＶＨドメインとペアをなした場合にそのペアとなったＶＨ−ＶＬｉが標的抗原に結合できなくなるようにする、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸挿入、欠失、または置換）を含む。
当業者が理解するように、本発明に有用ないくつかの「不活性」可変ドメインが存在する。基本的には、たとえどのようなアミノ酸が可変領域のＣＤＲ位置にあったとしても、別の可変ドメインとの自己会合を可能とするヒトフレームワーク領域を有するあらゆる可変ドメインを使用することができる。分かりやすくするためだが、厳密には不活性可変ドメインは結合能を付与しないが、不活性ドメインはＣＤＲを含むと言われている。
一部の例では、開裂（分子を越えた、例えば、分子間のペア形成）前における分子内ＶＨｉ−ＶＬドメイン及びＶＨ−ＶＬｉドメインの形成を促すために、不活性ドメインを操作してプロドラッグ形態における選択的結合を促進させてもよい。例えば、Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３（８）：６６７−６７７（２０１０）（その全体、とりわけ、境界残基のアミノ酸置換について、参照により明示的に本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
一態様では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された際にＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。一態様では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された際にヒトＣＤ３に特異的に結合する２つまたはそれ以上のドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された際にＣＤ３εに特異的に結合する２つまたはそれ以上のドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された際にＣＤ３εに特異的に結合する２つまたはそれ以上のドメインを含む。
一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂部位は、第１のモノマー上の抗ＣＤ３活性ＶＨドメインと抗ＣＤ３不活性ＶＬドメインの間にあり、それらドメインが折り畳まれず、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合しないようにしている。一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂部位は、第２のモノマー上の抗ＣＤ３不活性ＶＨドメインと抗ＣＤ３活性ＶＬドメインの間にあり、それらドメインが折り畳まれず、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合しないようにしている。標的細胞に存在するプロテアーゼによってプロテアーゼ開裂部位が開裂すると、第１のモノマーの抗ＣＤ３活性ＶＨドメイン及び第２のモノマーの抗ＣＤ３活性ＶＬドメインは、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合可能となる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に対する強力なＣＤ３結合親和性を示すだけでなく、対応するカニクイザルＣＤ３タンパク質との良好な交差反応性もまた示す。一部の例では、ポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザル由来のＣＤ３と交差反応する。ある特定の例では、ＣＤ３に対するヒト：カニクイザルのＫＤ比率は５〜０．２である。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に結合する任意のドメインであってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体に由来するドメインが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、抗原結合タンパク質を最終的に使用する同一種からＣＤ３結合ドメインを誘導することが有利である。例えば、ヒトに使用する場合、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインに由来するヒト残基またはヒト化残基を、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインに含ませることが有利となり得る。
それゆえ、一態様では、抗原結合ドメインはヒト化結合ドメインまたはヒト結合ドメインを含む。一実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数（例えば、３つ全て）、及び／または、本明細書に記載のヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つまたは複数（例えば、３つ全て）を含み、例えば、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、１つまたは複数、例えば、３つ全てのＬＣ ＣＤＲ、及び１つまたは複数、例えば、３つ全てのＨＣ ＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化軽鎖可変領域またはヒト軽鎖可変領域を含み、そのＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域内にヒト軽鎖ＣＤＲまたは非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。ある特定の例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＤ３結合ドメインは、ヒト化されている、または完全にヒトである。一部の実施形態では、１つまたは複数の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＤ３結合ドメインはカニクイザルＣＤ３との交差反応性を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＣＤ３結合ドメインは本明細書で提供するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化重鎖可変領域またはヒト重鎖可変領域を含み、そのＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域内にヒト重鎖ＣＤＲまたは非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
一実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むＦｖである。一実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または３つの修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）ではあるが３０、２０、または１０以下の修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列、を含む、軽鎖可変領域、及び／または、本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または３つの修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）ではあるが３０、２０、または１０以下の修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列、を含む、重鎖可変領域、を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合している。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向、すなわち軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域のいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤの親和性を有する。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３εに対する、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤの親和性を有する。更なる実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性、すなわち、約１００ｎＭ以上の親和性を有する。
例えば、当該技術分野において周知のとおり、アッセイプレート上にコーティングされた、細菌細胞表面上に提示された、溶液中、などの、ＣＤ３への、抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインの結合能（一般的には、ＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔアッセイを用いる）により、ＣＤ３への結合親和性を測定してもよい。リガンド（例えば、ＣＤ３）または抗原結合タンパク質自体もしくはそのＣＤ３結合ドメインをビーズ、基材、細胞などに固定することにより、本開示の抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する結合活性をアッセイしてもよい。適切なバッファー及び結合パートナーに薬剤を加えて、任意の温度でしばらくの間培養してもよい。洗浄して非結合物質を除去した後、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨのバッファーなどを用いて結合タンパク質を剥離してから、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による解析を行ってもよい。
Ｅ．腫瘍標的抗原に対する抗原結合ドメイン
記載するＣＤ３ドメイン及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、１種または複数種の標的抗原、または単一の標的抗原上の１つまたは複数の領域に結合する少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つ、またはそれ以上のドメインを含む。例えば、対象の疾患特異的微小環境内または血液中において、本発明のポリペプチド構築物がプロテアーゼ開裂ドメインで開裂して、それぞれの標的抗原結合ドメインが標的細胞上の標的抗原に結合することにより、Ｔ細胞に結合するＣＤ３結合ドメインが活性化することが企図される。通常、ＴＴＡ結合ドメインはプロテアーゼ開裂前にその標的に結合することができるため、それらＴＴＡ結合ドメインは、標的細胞上でＴ細胞結合物質として活性化されるのを「待つ」ことができる。少なくとも１種の標的抗原が、疾患、障害、または症状に関与及び／または関係している。例示的な標的抗原としては、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病、に関係する標的抗原が挙げられる。一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。代替的に、一部の実施形態では、標的抗原は、病原体、例えば、ウイルスまたは細菌などに関係している。少なくとも１種の標的抗原はまた、健常組織に関係し得る。
一部の実施形態では、標的抗原は、細胞表面分子、例えば、タンパク質、脂質、または多糖などである。一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性組織細胞、の上にある。本明細書では、２種以上の標的抗原と結合すると、２つの不活性ＣＤ３結合ドメインが標的細胞の表面上に共局在化して活性ＣＤ３結合ドメインを形成することが企図される。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質内の不活性ＣＤ３結合ドメインを活性化させるための２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合力を向上させるための２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合力を向上させるための２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、同一の抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、異なる抗原結合ドメインを含む。例えば、疾患細胞または疾患組織、例えば、腫瘍細胞またはがん細胞において二重に発現していることが知られている２つの異なる抗原結合ドメインは、抗原結合タンパク質の標的に対する結合または選択性を向上させ得る。
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、その抗原結合ドメインは少なくとも１種の標的抗原に結合する。標的抗原は、一部の例では、疾患細胞または疾患組織、例えば、腫瘍細胞またはがん細胞の表面上に発現している。標的抗原としては、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃ−Ｍｅｔ、ＬｙＰＤ３、及びＣＥＡ、が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で開示するポリペプチド構築物はまた、疾患細胞上または疾患組織上に発現していることが知られている２種の異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質を含む。例示的な抗原結合ドメインのペアとしては、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／Ｂ７Ｈ３、ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ／ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３／ＦＯＬＲ１、及びＨＥＲ−２／ＨＥＲ−３、が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に記載のポリペプチド構築物の設計により、標的抗原に対する結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体に由来するドメインを含むがこれらに限定されない任意のタイプの結合ドメインであってもよいという点で、１種または複数種の標的抗原に対する結合ドメインがフレキシブルとなる。一部の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などである。他の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、抗体模倣体、例えば、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、及びモノボディ、などである。更なる実施形態では、１種または複数種の標的抗原に対する結合ドメインは、１種または複数種の標的抗原に結合または会合するリガンド、受容体ドメイン、レクチン、またはペプチド、である。
一部の実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、またはリガンド、を個別に含む。一部の実施形態では、標的抗原結合ドメインは細胞表面分子に特異的に結合する。一部の実施形態では、標的抗原結合ドメインは腫瘍抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ３、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＬｙＰＤ３、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１種から選択される抗原に特異的かつ個別に結合する。一部の実施形態では、標的抗原結合ドメインは２種の異なる抗原に特異的かつ個別に結合し、抗原のうちの少なくとも１種は、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｂ７Ｈ３、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、ＬｙＰＤ３、及びＦＯＬＲ１のうちの１種から選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂前のタンパク質は約１００ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂後のタンパク質は約２５〜約７５ｋＤａである。一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値超のサイズを有する。一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。一部の実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。一部の実施形態では、タンパク質は、同一標的抗原に対して、ＩｇＧと比較して高い組織浸透性を有する。一部の実施形態では、タンパク質は、同一標的抗原に対するＩｇＧと比較して、高い組織分布を有する。
一部の実施形態では、本発明のヒトＴＴＡは、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＢ７Ｈ３、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＦＯＬＲ１、からなる群から選択される。本明細書に記載のポリペプチドのうちのいずれも、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＢ７Ｈ３、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＦＯＬＲ１、からなる群から選択されるヒトＴＴＡに結合するｓｄＡｂを含んでいてもよい。
Ｆ．半減期延長
本発明のタンパク質は半減期延長ドメインを任意選択的に含む。このようなドメインは、限定されないが、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、低分子、及び当該技術分野において周知の他の半減期延長ドメインを含むことが企図される。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子量約６７ｋＤａ）は、血漿中における最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトにおいては約２０日間の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する役目を果たし、膠質血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中における主要な薬物輸送タンパク質として機能する。
アルブミンと非共有会合することにより、短命タンパク質の消失半減期が延長される。例えば、アルブミン結合ドメインをＦａｂフラグメントに組換え融合すると、マウス及びウサギにそれぞれ静脈内投与した際、Ｆａｂフラグメントを単独で投与した場合と比較して、２５倍及び５８倍低下したｉｎ ｖｉｖｏクリアランス、ならびに２６倍及び３７倍の半減期延長がもたらされた。別の例では、インスリンを脂肪酸でアシル化してアルブミンとの会合を促進させると、ウサギまたはブタに皮下注射した際に、延長効果が認められた。まとめると、これらの試験は、アルブミン結合と持続作用の間の関連性を示している。
一態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡに特異的に結合するドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、ＨＳＡに結合する任意のドメインであってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体に由来するドメインが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、ＨＳＡに特異的な、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び、ラクダ科由来ナノボディ、ペプチド、リガンド、または低分子の可変ドメイン（ＶＨＨ）などである。ある特定の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインはペプチドである。更なる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは低分子である。抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインが、一部の実施形態では、かなり小さく、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。ある特定の例では、ＨＳＡ結合ドメインは、それがペプチドまたは低分子である場合、５ｋＤ以下である。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、抗原結合タンパク質自体の薬力学及び薬物動態における変化をもたらす。上記のとおり、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはまた、薬力学的特性を変化させるが、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散における変化を含む。一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインを有さないタンパク質と比較して、向上した組織（腫瘍を含む）標的化、組織浸透、組織分布、組織内拡散、及び高い効果をもたらす。一実施形態では、治療方法において、少ない量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用することにより、副作用の低下、例えば、非腫瘍細胞傷害の低下などをもたらす。
更に、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡ結合ドメインの特徴としては、ＨＳＡ結合ドメインのＨＳＡに対する結合親和性が挙げられる。ＨＳＡ結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物を用いた特定の消失半減期を目標とするように選択してもよい。それゆえ、一部の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは高い結合親和性を有する。
他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは中程度の結合親和性を有する。更に他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは低いまたは最低限の結合親和性を有する。例示的な結合親和性としては、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（中程度）、及び１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度が挙げられる。上記のとおり、ＨＳＡに対する結合親和性は、周知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などを用いて測定される。
Ｇ．プロテアーゼ開裂部位
本発明のポリペプチド（例えば、タンパク質）組成物、とりわけプロドラッグ構築物は、本明細書で概要を示すとおり、通常は開裂性リンカー内に存在する、１つまたは複数のプロテアーゼ開裂部位を含む。
本明細書に記載するとおり、本発明のプロドラッグ構築物は、少なくとも１種のプロテアーゼによって開裂されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロテアーゼ開裂部位を含む。一部の例では、本明細書に記載のタンパク質は、少なくとも１種のプロテアーゼによって開裂される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。本明細書でより詳細に考察するとおり、プロドラッグ構築物において２つ以上のプロテアーゼ開裂部位を用いる場合、それらプロテアーゼ開裂部位は、同一（例えば、単一のプロテアーゼによって開裂される複数の部位）であっても異なって（２つまたはそれ以上の開裂部位が少なくとも２種の異なるプロテアーゼによって開裂される）いてもよい。当業者が理解するように、３つまたはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する構築物は、１つ、２つ、３つなどの部位を利用していてもよく、例えば、一部の構築物は、２種の異なるプロテアーゼなどに対する３つの部位を利用していてもよい。
プロテアーゼ開裂部位のアミノ酸配列は、標的とするプロテアーゼによって決まる。当該技術分野において周知のとおり、体内に存在し疾患状態に関係し得るいくつかのヒトプロテアーゼが存在している。
プロテアーゼは、一部の疾患細胞及び疾患組織、例えば、プロテアーゼが豊富な微小環境、すなわちプロテアーゼリッチ微小環境を生成する腫瘍細胞またはがん細胞によって分泌されていることが知られている。一部の例では、対象の血液は、プロテアーゼが豊富である。一部の例では、腫瘍を取り囲む細胞が、腫瘍微小環境へとプロテアーゼを分泌している。プロテアーゼを分泌する、腫瘍を取り囲む細胞としては、腫瘍性の間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、肥満細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔリンパ球、樹状細胞、間葉系幹細胞、多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一部の例では、プロテアーゼは対象の血液中に存在しており、例えば、アミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは細菌ペプチド内に存在している。標的細胞または標的組織のプロテアーゼリッチ微小環境を除き、抗原結合タンパク質がＴ細胞に結合しないことから、この特性により、抗原結合タンパク質などの標的化治療薬に追加の特異性を持たせることが可能となる。
プロテアーゼは、一部の例では、配列特異的な様式で、タンパク質を開裂するタンパク質である。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ）、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ＫＬＫ７、グランザイムＢ、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、ＸＡ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３）、Ｍｉｒ１−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、メプリン、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン−１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ−α）、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）、が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の好適なプロテアーゼ及びプロテアーゼ開裂配列については、図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１４Ｃに示す。
Ｖ．発現方法
本明細書では、細胞（例えば、宿主細胞）内で共発現させて、共精製して、ＣＤ３及び１種または複数種の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合可能な相補ペアのタンパク質を得ることによる、本発明のタンパク質を作製するための方法を提供する。一部の実施形態では、相補ペアのタンパク質（例えば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド）は、ほぼ等モル比率（例えば、約１：１の比率）で産生される。他の実施形態では、相補ペアのタンパク質（例えば、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド）は、等モルではない比率（例えば、約１：１の比率ではない）で産生される。言い換えると、本明細書に記載の方法を用いて、限定するわけではないが例えば、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１ １０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００などの、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの比率を得ることができる。
一部の実施形態では、ＴＴＡドメインを含む第１のポリペプチドを、同一のＴＴＡドメインを含む第２のポリペプチドに対してほぼ１：１の比率（約１：１の比率）で、細胞から精製することができる。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、実質的に同様のドメインリンカー、開裂性リンカー、半減期延長ドメイン、及びこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
他の実施形態では、ＴＴＡドメインを含む第１のポリペプチドを、異なるＴＴＡドメインを含む第２のポリペプチドに対して非等モル比率で、細胞から精製することができる。第１のポリペプチドのＴＴＡドメイン及び第２のポリペプチドのＴＴＡドメインは、異なる結合親和性を有していてもよい。一部の例では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、異なるドメインリンカー、開裂性リンカー、半減期延長ドメイン、及びこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
ポリペプチドをコードする特定量のポリヌクレオチド（または発現ベクター）を細胞内で発現させて、所望量のポリペプチドを得てもよい。一部の実施形態では、細胞に導入される（例えば、トランスフェクションされる、エレクトロポレーションされる、形質導入されるなど）、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量、及び第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は、同一である。例えば、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、約１：１のポリヌクレオチド比率で細胞に導入され得る。他の実施形態では、細胞に導入される、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量、及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は、異なる。例えば、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、限定するわけではないが例えば、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１ １０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０などのポリヌクレオチド比率で、細胞に導入され得る。
ポリペプチド用の発現ベクターは、所望の比率での細胞によるポリペプチドの産生を可能とする１種または複数種の構成要素（例えば、プロモーター、調節エレメント、エンハンサーなど）を含んでいてもよい。一部の例では、第１のポリペプチドの第１の発現ベクターは、第２のポリペプチドの第２の発現ベクターの発現レベルと比較して、ベクターの発現レベルを向上させる構成要素を含む。他の例では、第２のポリペプチドの第２の発現ベクターは、第１のポリペプチドの第１の発現ベクターの発現レベルと比較して、ベクターの発現レベルを向上させる構成要素を含む。ある特定の例では、第１のポリペプチドの第１の発現ベクターは、ベクターの発現レベルが第２のポリペプチドの第２の発現ベクターの発現レベルと同一となるような構成要素を含む。
一部の例では、本明細書に記載の核酸は、例えば、哺乳動物細胞内における、本開示の二重特異性条件的有効化型タンパク質の産生をもたらす。本開示の第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどに機能的に連結していてもよい。
好適なプロモーターエレメント及びエンハンサーエレメントは当該技術分野において周知である。細菌細胞内における発現用に好適なプロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ、及びｔｒｃが挙げられるがこれらに限定されない。真核細胞内における発現用に好適なプロモーターとしては、軽鎖及び／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターエレメント及びエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復配列内に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、及び当該技術分野において周知の様々な組織特異的プロモーター、が挙げられるがこれらに限定されない。
タンパク質、例えば、本明細書に記載のプロドラッグ構築物をコードする核酸配列またはヌクレオチド配列は、発現ベクター内及び／またはクローニングベクター内に存在していてもよい。タンパク質、例えば、プロドラッグ構築物が２種の別々のポリペプチドを含む場合、２種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、同一または別々のベクターにクローニングしてもよい。発現ベクターは、選択マーカー、複製起点、及び、ベクターの複製及び／または維持をもたらす他の機能性物質、を含んでいてもよい。好適な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
発現ベクターは通常、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすための、プロモーター配列の近傍に位置する好都合な制限部位を有している。発現宿主内において機能的な選択マーカーを存在させてもよい。好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５を参照のこと）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（ＷＯ９３／０９２３９）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照のこと）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照のこと）をベースとするウイルスベクター）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルスなどに由来するベクター）など、が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示は、タンパク質、例えば、本開示のプロドラッグ構築物を産生するように改変された哺乳動物細胞を提供する。当業者に周知の任意の方法、限定するわけではないが例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染などを用いて、本明細書に記載のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入してもよい。
好適な哺乳動物細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＥＫ２９３細胞、ｅｘｐｉ２９３細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ−７８、ジャーカット、ＨＬ−６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、宿主細胞または安定宿主細胞株は、細胞が産生及び分泌するポリペプチドの量に応じて選択される。宿主細胞または安定宿主細胞株は、本明細書に記載のプロドラッグ組成物を産生及び分泌することができる。一部の例では、好適な細胞は、等モル比率（例えば、約１：１の比率）の、本明細書に記載の第１のポリペプチドのうちのいずれか１種、及び本明細書に記載の第２のポリペプチドのうちのいずれか１種を産生し得る。他の実施形態では、好適な細胞は、非等モル比率（例えば、１：１とは異なる比率）の、第１のポリペプチドのうちのいずれか１種、及び第２のポリペプチドのうちのいずれか１種を産生する。
ＶＩ．本発明の有用な実施形態
一部の実施形態では、宿主細胞または安定宿主細胞株は、細胞が産生及び分泌するポリペプチドの量に応じて選択される。宿主細胞または安定宿主細胞株は、本明細書に記載のプロドラッグ組成物を産生及び分泌することができる。一部の例では、好適な細胞は、等モル比率（例えば、約１：１の比率）の、本明細書に記載の第１のポリペプチドのうちのいずれか１種、及び本明細書に記載の第２のポリペプチドのうちのいずれか１種を産生し得る。他の実施形態では、好適な細胞は、非等モル比率（例えば、１：１とは異なる比率）の、第１のポリペプチドのうちのいずれか１種、及び第２のポリペプチドのうちのいずれか１種を産生する。
一態様において、本明細書では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第１のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変軽鎖、を含む、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列、ならびに、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変重鎖、を含む、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列、を含む細胞を提供する。一部の例では、第１のポリペプチドの可変重鎖及び第２のポリペプチドの可変軽鎖は、会合してＦｖ（例えば、ペアとなったＶｈ−Ｖｌ）を形成すると、ヒトＣＤ３と結合することができる。
一部の実施形態では、可変重鎖はｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。ある特定の実施形態では、可変軽鎖はｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。特定の実施形態では、擬似可変重鎖はｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖はｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する。ある特定の例では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＥＧＦＲ（例えば、同一のＥＧＦＲ分子）に結合する。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一の配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは異なる配列を含む。
一部の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される。
様々な実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。他の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６（配列番号３）、Ｐｒｏ３９（配列番号５）、Ｐｒｏ４１（配列番号７）、Ｐｒｏ４３（配列番号９）、Ｐｒｏ４５（配列番号１１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号１３）、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号４）、Ｐｒｏ４０（配列番号６）、Ｐｒｏ４２（配列番号８）、Ｐｒｏ４４（配列番号１０）、Ｐｒｏ４６（配列番号１２）、及びＰｒｏ３５３（配列番号１４）、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列及び第２のポリヌクレオチド配列は、同一の発現ベクターを用いて細胞に導入されている。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列及び第２のポリヌクレオチド配列は、異なる発現ベクターを用いて細胞に導入されている。
別の態様において、本明細書では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むプロドラッグ組成物を単離するための方法を提供する。方法は、（１）好適な条件下で宿主細胞を培養すること（第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは産生されて培地内に分泌される）、及び（２）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて培地から第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを精製することにより、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むプロドラッグ組成物を単離すること、を含む。宿主細胞は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第１のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変軽鎖、を含む、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変重鎖、を含む、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含み、第１のポリペプチドの可変重鎖及び第２のポリペプチドの可変軽鎖は、会合してＦｖ（例えば、ペアとなったＶｈ−Ｖｌ）を形成すると、ヒトＣＤ３に結合することができる。
一部の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは別々に精製される。特定の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは同時に精製される。
一部の実施形態では、プロドラッグ組成物は、等モル比率の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む。他の実施形態では、プロドラッグ組成物は、約１：１ではない比率の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、精製工程は、プロテインＡクロマトグラフィー後にアフィニティークロマトグラフィーを実施することを更に含む。
一部の実施形態では、可変重鎖はｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。ある特定の実施形態では、可変軽鎖はｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。特定の実施形態では、擬似可変重鎖はｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を含む。一部の例では、擬似可変重鎖は、配列番号１０６、配列番号１１０、及び配列番号２０７、からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、擬似可変軽鎖はｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を含む。一部の例では、擬似可変軽鎖は、配列番号９４、配列番号９８、及び配列番号２０３、からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する。ある特定の例では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＥＧＦＲに結合する。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のアミノ酸配列（例えば、タンパク質配列）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。特定の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。
一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６（配列番号３）、Ｐｒｏ３９（配列番号５）、Ｐｒｏ４１（配列番号７）、Ｐｒｏ４３（配列番号９）、Ｐｒｏ４５（配列番号１１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号１３）、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号４）、Ｐｒｏ４０（配列番号６）、Ｐｒｏ４２（配列番号８）、Ｐｒｏ４４（配列番号１０）、Ｐｒｏ４６（配列番号１２）、及びＰｒｏ３５３（配列番号１４）、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３、からなる群から選択される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列及び第２のポリヌクレオチド配列は、同一の発現ベクターを用いて細胞に導入されている。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターを用いて細胞に導入されている。
一態様において、本明細書では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第１のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、（ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変軽鎖、を含む、アミノ酸配列、または、（ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、（ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び（ｖ）擬似可変重鎖、を含む、アミノ酸配列、を含むポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドの可変重鎖及びポリペプチドの可変軽鎖は、会合してＦｖを形成すると、ヒトＣＤ３と結合することができる。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する。ある特定の例では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のヒトＥＧＦＲに結合する。
一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは同一のアミノ酸配列（例えば、タンパク質配列）を含む。一部の実施形態では、第１のｓｄＡｂ及び第２のｓｄＡｂは異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のプロテアーゼ開裂部位及び第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される。
一部の実施形態では、可変重鎖を含むポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。様々な実施形態では、可変軽鎖を含むポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドはＰｒｏ３４９（配列番号１３）である。他の実施形態では、ポリペプチドは、Ｐｒｏ３５３（配列番号１４）からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｐｒｏ３４９（配列番号１３）は、Ｐｒｏ３５３（配列番号１４）とペアをなしている。
一部の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の可変重鎖、例えば、ＣＤ３と結合可能な可変重鎖を含む任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ある特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の可変軽鎖、例えば、ＣＤ３と結合可能な可変軽鎖を含む任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
一部の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の可変重鎖、例えば、ＣＤ３と結合可能な可変重鎖を含む任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。他の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の可変軽鎖、例えば、ＣＤ３と結合可能な可変軽鎖を含む任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、本明細書に記載の可変重鎖、例えば、可変軽鎖と会合することによりＣＤ３に結合可能となる可変重鎖を含む任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び、本明細書に記載の可変軽鎖、例えば、可変軽鎖と会合することによりＣＤ３と結合可能となる可変軽鎖を含む任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、を含む。特定の実施形態において、本明細書では、本発明の発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。一部の例では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。
一部の態様において、本明細書では、本明細書に記載の可変重鎖を含むポリペプチド、及び本明細書に記載の可変軽鎖を含むポリペプチド、を含むプロドラッグを提供し、可変重鎖及び可変軽鎖は、会合してＦｖ（例えば、ペアとなったＶｈ−Ｖｌ）を形成すると、ヒトＣＤ３と結合することができる。
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載の任意のプロドラッグ組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とするヒト対象においてそれを実施するための方法を提供する。
別の例示的な半ＣＯＢＲＡペアは、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＤＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を有する第１のポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を有する第２のポリペプチド、を含む。一部の実施形態では、ペアはＰｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２を含む。一部の実施形態では、ペアはＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４を含む。本発明の一部の実施形態では、単離細胞はＰｒｏ３４８及びＰｒｏ３５２を発現する（産生または分泌する）。ある特定の実施形態では、単離細胞はＰｒｏ３５０及びＰｒｏ３５４を発現する（産生または分泌する）。一部の実施形態では、宿主細胞は、図３０Ａに示す配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図３１Ａに示す配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図３０Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図３１Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図３０Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図３１Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号３０に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号３２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ３４８をコードする核酸配列、例えば、配列番号３０など、及び／または、Ｐｒｏ３５２をコードする核酸配列、例えば、配列番号３２など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図３０Ａに示す配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図３１Ａに示す配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図３０Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図３１Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図３０Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図３１Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号３０に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号３２に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ３４８をコードする核酸配列、例えば、配列番号３０など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ３５２をコードする核酸配列、例えば、配列番号３２など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図３２Ａに示す配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図３３Ａに示す配列番号３５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図３２Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び／または、図３３Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、を含む、発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、図３２Ｂに示す第１の核酸配列及び／または図３３Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号３４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列、及び／または、配列番号３６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する第２の核酸配列、を含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、Ｐｒｏ３５０をコードする核酸配列、例えば、配列番号３３など、及び／または、Ｐｒｏ３５４をコードする核酸配列、例えば、配列番号３６など、を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、図３２Ａに示す配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図３３Ａに示す配列番号３５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、図３２Ａに示す構造を含む第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、及び、図３３Ａに示す構造を含む第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の発現ベクターは図３２Ｂに示す第１の核酸配列を含み、第１の発現ベクターは図３３Ｂに示す第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、配列番号３４に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する第１の核酸配列を含み、第２の発現ベクターは、配列番号３６に対して少なくとも８５％の配列同一性、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する第２の核酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の発現ベクターは、Ｐｒｏ３５０をコードする核酸配列、例えば、配列番号３４など、を含み、第２の発現ベクターは、Ｐｒｏ３５４をコードする核酸配列、例えば、配列番号３６など、を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞にトランスフェクションするポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号３０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号３２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞にトランスフェクションするポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号３５に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド比率は、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３の第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドは、配列番号３４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、第２のポリヌクレオチドは、配列番号３６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
ＶＩＩ．実施例
Ａ．実施例１：半ＣＯＢＲＡペアを作製するための方法
半ＣＯＢＲＡは、プロテアーゼ活性化の後であっても個々の分子としてＴ細胞殺傷を誘導することができないが、２つの活性化された相補的な半ＣＯＢＲＡ分子は、標的発現細胞に対する強力なＴ細胞介在性細胞傷害を誘導することができる（図１及び図２）。このことは、２種のタンパク質分子の作製が必要となることから、これらの分子を薬物として作製することにおける問題を生じさせる。１つの解決策は、異なる半ＣＯＢＲＡをそれぞれが発現する２種の発現細胞株を作製することであり、その後、２種の半ＣＯＢＲＡを別々に発現させて別々に精製してから混合することにより、プロドラッグカクテルを作製することができる。あいにく、この解決策は、大用量の薬物カクテルを作製する上で、時間がかかりかつ費用のかかるプロセスである。
この問題に対する解決策は、２種の半ＣＯＢＲＡを同一細胞内で共発現させてから、別々または共にのいずれかで、同一の条件培地からそれら半ＣＯＢＲＡを精製することである。
図３は、一過的に共トランスフェクションしたｅｘｐｉ２９３細胞の集団から半ＣＯＢＲＡを共発現させてから、プロテインＡ精製カラムを用いて、得られた条件培地から共精製したことを示している。
相補ペアＰｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２、及びＰｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６について、共発現及び共精製法により、２種の半ＣＯＢＲＡのほぼ等モルの混合物を作製した。相補ペアＰｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９及びＰｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４については、２種の半ＣＯＢＲＡのうちの一方が、精製作製物中においてより豊富であった。
図４Ａ〜図１２Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定した際に、これら共発現／精製ロットの主生成物が単量体半ＣＯＢＲＡに相当していることを示している。結果は、共発現及び精製がタンパク質凝集を引き起こさなかったことを示している。Ｔ細胞殺傷アッセイ（図１３Ａ〜図１３Ｆ）において、共発現させた半ＣＯＢＲＡは、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡの濃度から、予測レベルの効力を示している。共発現させた半ＣＯＢＲＡはまた、良好なプロテアーゼ活性化を示した。
相補的な半ＣＯＢＲＡペアは、共トランスフェクション、単一ベクターからの共発現、または、２種の半ＣＯＢＲＡ発現ユニットのレトロウイルス共形質導入により、安定細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞及び２９３細胞を用いて作製することができる。高レベルの両タンパク質をほぼ等モル比率で発現する安定クローンを選択してもよい。本明細書で提供するデータは、本発明のタンパク質を細胞内で共発現させてから、プロテインＡカラムを用いて共精製することができるということを示している。
一部の実施形態では、相補的な半ＣＯＢＲＡペア、限定するわけではないが例えば、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３を、それぞれのモノマー上の識別用カルボキシ末端タグに基づいて更に精製して、それぞれの半ＣＯＢＲＡの純粋なロットを得てもよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて、プロテインＡカラムからの溶出液をその識別用カルボキシ末端タグにより更に精製してもよい。必要に応じ、精製試料を混合して等モルの混合物を得てもよい。
本明細書に記載の実験の目的は、共発現させた半ＣＯＢＲＡが２種の別々のタンパク質を生成するかどうかを試験することであった。インタクトな半ＣＯＢＲＡは同一の分子量を有しており、ＳＤＳ ＰＡＧＥで識別することはできなかった。しかし、プロテアーゼ感受性リンカーの開裂後、ＶＨ−ＶＬｉ構成の半ＣＯＢＲＡ及びＶＬ−ＶＨｉ構成の半ＣＯＢＲＡは、異なる分子量の消化産物を生成する。それゆえ、共発現させた半ＣＯＢＲＡ及び個々の半ＣＯＢＲＡのタンパク質分解反応を生じさせてから、タンパク質分解産物をＳＤＳ ＰＡＧＥで可視化した（図３）。
ＨＢＳ＋１０ｍＭ ＣａＣｌ２バッファーを用いて、試料の濃度を１００μｌ容量中の０．２ｍｇ／ｍｌに調節した。それぞれの試料にＣａＣｌ２を加えて１０ｍＭの終濃度とした。
以下の開裂プロテアーゼについての評価を行った。エンテロキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｐ８０７０Ｓ）、５．７μＭで用いたマトリプターゼＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９４６−ＳＥ−０１０）、１００ｎＭに希釈したトロンビン（Ｅｎｚｏ、ＢＭＬ−ＳＥ３６３−１０００）、製造業者のプロトコルに従って活性化させてから１００ｎＭに希釈したＭＭＰ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃９１１−ＭＰ−０１０）、及び、１３５ｎＭで用い、社内で発現及び精製してから、メプリン１Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃３２２０−ＺＮ−０１０）用のＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓプロトコルに従って活性化させた、カニクイザル由来のメプリン１Ｂ。
以下のとおりにタンパク質分解反応を生じさせた。
エンテロキナーゼを用いてＰｒｏ１６／１９、Ｐｒｏ１６、Ｐｒｏ１９を開裂させた。
ＭＭＰ９を用いてＰｒｏ３９／４０、Ｐｒｏ３９、Ｐｒｏ４０を開裂させた。
メプリン１Ｂを用いてＰｒｏ４１／４２、Ｐｒｏ４１、Ｐｒｏ４２を開裂させた。
マトリプターゼＳＴ１４を用いてＰｒｏ４３／４４、Ｐｒｏ４３、Ｐｒｏ４４を開裂させた。
トロンビンを用いてＰｒｏ４５／４６、Ｐｒｏ４５、Ｐｒｏ４６を開裂させた。
反応液を室温で一晩培養した。トリス−グリシン泳動バッファー中のＮｕＰＡＧＥ ＴＧ １０〜２０％ゲルを用いたＳＤＳ ＰＡＧＥ（非還元条件）により、試料の解析を行った。ゲルを２００Ｖで１時間ランした。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ解析（図３）により、半ＣＯＢＲＡがある程度のモル比率のばらつき（Ｐｒｏ３９／４０、Ｐｒｏ４１／４２、及びＰｒｏ４５／４６の共発現させた半ＣＯＢＲＡにおけるこの値はほぼ１：１である）で共発現していることが認められた。
分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、共発現及び共精製による産物を解析した。以下のパラメータを使用した。
機器：ダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ
カラム：Ｚｅｎｉｘ−Ｃ ＳＥＣ−３００カラム、７．８×３００ｍｍ、３μｍ粒径、３００Å孔径、Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ
移動相：０．２Ｍ Ｌ−アルギニン．ＨＣｌ＋０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／分 イソクラティック
カラム温度：３０℃
検出：２８０ｎｍの吸光
試料調製：無（無溶媒で注入）
試料容量：２５〜５０μＬ
ＳＥＣ解析の結果を図４Ａ〜図１２に記載する。
Ｔ細胞殺傷アッセイ（Ｔ細胞依存性細胞性細胞傷害アッセイすなわちＴＤＣＣ）を用いて、共発現させた半ＣＯＢＲＡの活性を評価した。結果は、共発現させた半ＣＯＢＲＡが、それぞれのペアにおいて低発現している方の半ＣＯＢＲＡと一致する予測レベルの力価を示すことを示した。図１３Ａは、開裂したＰｒｏ１６及びＰｒｏ１９のペアの結果を示している。図１３Ｂは、開裂したＰｒｏ３９及びＰｒｏ４０のペアの結果を示している。図１３Ｃは、開裂したＰｒｏ４１及びＰｒｏ４２のペアの結果を示している。図１３Ｄは、開裂したＰｒｏ４３及びＰｒｏ４４のペアの結果を示している。図１３Ｅは、開裂したＰｒｏ４５及びＰｒｏ４６のペアの結果を示している。図１３Ｆは、開裂したＰｒｏ５９及びＰｒｏ６０のペアの結果を示している。Ｐｒｏ５１はＴ細胞依存性細胞傷害用の陽性対照を表している。
Ｂ．実施例２：半ＣＯＢＲＡペアを共発現する安定細胞株の作製
本実施例では、相補的な半ＣＯＢＲＡのペアを共発現する細胞株を作製するための例示的な方法について説明する。
材料及び方法
全ての細胞培養培地、トランスフェクション試薬はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。トランスフェクション試薬はＥｘｐｉ２９３トランスフェクションキットに含まれていた。本試験に用いた増殖培地及び発現培地はＥｘｐｉ２９３発現培地であった。選択培地にはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が含まれていた。ＳＡＸ（高精度ストレプトアビジン）及びＨｉｓ１Ｋ（Ａｎｔｉ−Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ）を含むＯｃｔｅｔ解析用の全てのバイオセンサーはＦｏｒｔｅＢｉｏから入手した。
結果
共発現安定細胞株を作製するために用いる２つのペアの半ＣＯＢＲＡの概略図を図４１に示す。検出及び精製を容易とするために、半ＣＯＢＲＡペアに別様にタグ付けを行った。それぞれの試験ペアは、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＤＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌｉＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌｉＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌｉＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４の構造を有する第１のポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ｓｄＡｂ（ＴＴＡ）−ＤＬ−ｖ１ＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４−ＤＬ−ｖｈＦＲ１−ｖｈｉＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈｉＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈｉＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４の構造を有する第２のポリペプチド、を含む。試験した半ＣＯＢＲＡペアはＰｒｏ３４８＋Ｐｒｏ３５２及びＰｒｏ３５０＋Ｐｒｏ３５４であった。
配列番号２９で表されるＰｒｏ３４８は、Ｂ７Ｈ３と結合するｓｄＡｂ、抗ＨＳＡドメイン、及びＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。配列番号３１で表されるＰｒｏ３５２は、Ｂ７Ｈ３と結合するｓｄＡｂ、抗ＨＳＡドメイン、及びＨｉｓ６タグを含む。
配列番号３３で表されるＰｒｏ３５０は、ＥＧＦＲと結合するｓｄＡｂ、抗ＨＳＡドメイン、及びＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。配列番号３５で表されるＰｒｏ３５４は、ＥＧＦＲと結合するｓｄＡｂ、抗ＨＳＡドメイン、及びＨｉｓ６タグを含む。
図４１の表は、Ｅｘｐｉ２９３細胞から一過性トランスフェクションにより生成した際のそれぞれの半ＣＯＢＲＡの収率を示している。言い換えると、それぞれの半ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ３４８、Ｐｒｏ３５２、Ｐｒｏ３５０、及びＰｒｏ３５４）をＥｘｐｉ２９３細胞に別々にトランスフェクションした。それぞれの半ＣＯＢＲＡの異なる生産性は、共トランスフェクションに用いるプラスミドＤＮＡ濃度を最適化する必要があるということを示唆した。
図４２及び図４３は、プラスミドＤＮＡ比率最適化実験のデータを示している。目的は、共発現させた半ＣＯＢＲＡにおける同様の生産性をもたらし得る、それぞれのペアの最適ＤＮＡ比率を明らかにすることであった。
２．５ｍｌ／ウェルのＥｘｐｉ２９３細胞をＶＣＤ ２．９で、Ｅｘｐｉ２９３培地を入れた２４ディープウェルプレートに播種した。製造業者のプロトコルに従いＥｘｐｉ２９３トランスフェクションキットをトランスフェクションに使用した。共トランスフェクション用に試験したプラスミドＤＮＡ比率は、２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、及び７：３であった。全てのトランスフェクションを二重で行った。トランスフェクションの２０時間後にエンハンサーを加えた。トランスフェクションの５日後、Ｏｃｔｅｔ解析（Ｐｒｏ３４８及びＰｒｏ３５０用のＳＡＸバイオセンサー、ならびにＰｒｏ３５２及びＰｒｏ３５４用のＨｉｓ１Ｋ（抗６Ｈｉｓ））用に条件培地を回収した。
Ｐｒｏ３４８及びＰｒｏ３５２の最適比率は２．５：７．５であった。Ｐｒｏ３５０及びＰｒｏ３５４の最適比率は２：８であった。簡潔に説明すると、Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクションキットを使用して、Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２のプラスミドペアをＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、６ウェルプレートでＧ４１８選択を開始した。選択を完了させるのに２週間を要した。選択が完了すると、安定細胞株を作製するために細胞を９６ウエルプレートにソートした。Ｏｃｔｅｔ（抗Ｈｉｓ及びＳＡＸ）を用いてコロニーをスクリーニングした。ペアの両方の半ＣＯＢＲＡにおける同様の発現レベルを有する上位クローンを更なる試験用に選択した。それぞれのペアにおける最終クローンのうちの３つを同定して預けた。それぞれのステージ（一過性、安定プール、及び安定細胞株）における、共トランスフェクションした半ＣＯＢＲＡの発現レベルを異なるスケールで確認した（図４４を参照のこと）。
以下の方法に従い安定細胞株を作製した。細胞培養用に、加湿インキュベータ内の振盪フラスコ内のＥｘｐｉ２９３培地内に、Ｅｘｐｉ２９３細胞を０．３〜５×１０Ｅ６／ｍｌのＶＣＤで維持した。培養条件は、２２５ｒｐｍの振盪速度、３７℃、８％ＣＯ２であった。トランスフェクション後の細胞に同一の培養条件を使用したが、振盪速度はフラスコ／プレートのサイズに応じて変化させた。
製造業者のプロトコルに従いＥｘｐｉ２９３トランスフェクションキットを使用して、Ｐｒｏ３４８／Ｐｒｏ３５２（ＤＮＡ比率２．５：７．５）及びＰｒｏ３５０／Ｐｒｏ３５４（ＤＮＡ比率２：８）のプラスミドＤＮＡペアをＥｘｐｉ２９３細胞に共トランスフェクションした。簡潔に説明すると、３５０ｒｐｍのＭｉｘＭａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）振盪器上の２４ディープウェルプレートに、ウェルあたり２．９×１０Ｅ６／ｍｌ×２．５ｍｌで細胞を播種した。ＤＮＡ／Ｅｘｐｉ２９３フェクタミン／細胞の比率は１μｇ／３μｌ／１ｍｌであった。プラスミドＤＮＡ及びＥｘｐｉ２９３フェクタミンを１／２０の最終トランスフェクション容量で別々にＯｐｔｉＭＥＭ中に希釈してから混合し、室温で２０分培養してから、細胞に加えた。その後、上記の標準的な培養条件のインキュベータに細胞を戻した。
安定細胞株を作製するために、トランスフェクションの２日後、２×１０Ｅ６のトランスフェクト細胞を、選択培地を含むＴ７５に播種した。選択から回収した後、９６ウェルプレートに、１細胞／ウェルで細胞をソートした。残りの細胞を安定プール用の懸濁液に順応させた。２セットのＯｃｔｅｔ／バイオセンサー（Ｐｒｏ３４８及びＰｒｏ３５０用のＳＡＸ、ならびにＰｒｏ３５２及びＰｒｏ３５４用のＨｉｓ１Ｋ）を使用して、生存クローンを生産性でスクリーニングした。正規化に細胞のコンフルエント（ＩｎｃｕＣｙｔｅ）を使用した。共発現させた半ＣＯＢＲＡの同様の生産性を有する上位クローンを選択して、１２ウェルプレートに移した。
コロニースクリーニング用に、９６ウェルプレートに、ウェルあたり１細胞で、選択を生き延びた細胞を播種した。Ｏｃｔｅｔ解析用に、回収したコロニーの条件培地を２セットの９６ウェルプレートに移した。図４５Ａ〜図４５Ｃは、コロニースクリーニングの例示的なデータを示している。図４５ＡにはクローンＩＤを記載している。図４５Ｂは、Ｈｉｓ１Ｋバイオセンサーを用いてＨｉｓタグ付きのＰｒｏ３５２及びＰｒｏ３５４を検出した際のデータを示している。図４５Ｂは、ＳＡＸを用いてＳｔｒｅｐＩＩタグ付きのＰｒｏ３４８及びＰｒｏ３５０を検出した際のデータを示している。
細胞を懸濁培養液に順応させるため、細胞が９０％コンフルエントに到達したときに、選択培地をＥｘｐｉ２９３培地＋０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８に交換した。培地交換の１日後、同一培地を含む２４ディープウェルプレートに細胞を移してから、３５０ｒｐｍのＭｉｘＭａｔｅ上に置いた。増殖の全てのステージにおいて、共発現させた半ＣＯＢＲＡの生産性をモニターした。
２４ディープウェルプレートから条件培地を回収して、Ｏｃｔｅｔを用いて解析した。図４６は、両方の細胞株の３つの上位クローンの解析データを示している。
懸濁培養液に順応させた後、０．５×１０Ｅ６／ｍｌで細胞を播種した。播種の３日後、５％のＥｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂを細胞に供給した。Ｏｃｔｅｔ解析を行って容量生産性の概算を得るために、供給の４日後に条件培地を回収した。
要約すると、本実施例は、半ＣＯＢＲＡが実質的に等しい量で発現するような半ＣＯＢＲＡペアを作製するための例示的な方法について説明するものである。本試験において、宿主細胞にトランスフェクションしたそれぞれの半ＣＯＢＲＡのプラスミドＤＮＡ比率は１：１ではなかった。その代わりに、一方の半ＣＯＢＲＡをコードするプラスミドＤＮＡを、第２の半ＣＯＢＲＡをコードするプラスミドＤＮＡと比較して、より多くトランスフェクションした。
使用した方法、プロトコル、及びアッセイの更なる詳細な説明については、２０１８年９月６日出願のＷＯ２０１９／０５１１２２、２０１７年９月８日出願の米国仮出願第６２／５５５，９９９号、２０１８年９月６日出願のＷＯ２０１９／０５１１０２、２０１７年９月８日出願の米国仮出願第６２／５５５，９４３号、２０１７年１１月１５日出願の米国仮出願第６２／５８６，６２７号、２０１７年１１月１６日出願の米国仮出願第６２／５８７，３１８号、２０１７年３月８日出願のＷＯ２０１７／１５６１７８、２０１７年９月８日出願の米国仮出願第６２／５５５，９９９号（図、図面の詳細な説明、定義、実施形態の詳細な説明、及び実施例、ならびに列挙する全ての実施形態を含むその全体は明示的に参照により組み込まれる）、に見出すことができる。
列挙する全ての参照文献は、その全体が明示的に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の特定の実施形態について例示の目的で記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明を逸脱することなく、詳細における多数の変化形態を実施してもよいということを当業者は理解するであろう。

Claims (53)

  1. ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、
    ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、
    ｉｉ）第１のドメインリンカー、
    ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、
    ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、及び、
    ｖ）擬似可変軽鎖、
    を含む、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに、
    ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、
    ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、
    ｉｉ）第２のドメインリンカー、
    ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、
    ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び、
    ｖ）擬似可変重鎖、
    を含む、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
    を含む単離細胞であって、
    前記第１のポリペプチドの前記可変重鎖、及び前記第２のポリペプチドの前記可変軽鎖は、会合してＦｖを形成すると、ヒトＣＤ３と結合する、
    前記単離細胞。
  2. 前記第１のｓｄＡｂ及び前記第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する、請求項１に記載の単離細胞。
  3. 前記第１のｓｄＡｂ及び／または前記第２のｓｄＡｂは、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＢ７Ｈ３、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＦＯＬＲ１、からなる群から選択されるヒトＴＴＡと結合する、請求項１または請求項２に記載の単離細胞。
  4. 前記第１のｓｄＡｂ及び前記第２のｓｄＡｂは同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の単離細胞。
  5. 前記第１のｓｄＡｂ及び前記第２のｓｄＡｂは異なるアミノ酸配列を含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の単離細胞。
  6. 前記第１のプロテアーゼ開裂部位及び前記第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の単離細胞。
  7. 前記第１のプロテアーゼ開裂部位及び前記第２のプロテアーゼ開裂部位は、異なるプロテアーゼによって認識される、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の単離細胞。
  8. 前記第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む、及び／または、前記第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の単離細胞。
  9. 前記可変重鎖は、図３９の配列番号１０２のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３配列を含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の単離細胞。
  10. 前記可変軽鎖は、図３８の配列番号９０のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を含む、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の単離細胞。
  11. 前記擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１０６、配列番号１１０、及び配列番号２０７からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変重鎖配列を含む、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の単離細胞。
  12. 前記擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９４、配列番号９８、及び配列番号２０３からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変軽鎖配列を含む、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の単離細胞。
  13. 前記第１のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６（配列番号５）、Ｐｒｏ３９（配列番号９）、Ｐｒｏ４１（配列番号１３）、Ｐｒｏ４３（配列番号１７）、Ｐｒｏ４５（配列番号２１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号２５）、からなる群から選択される、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の単離細胞。
  14. 前記第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号７）、Ｐｒｏ４０（配列番号１１）、Ｐｒｏ４２（配列番号１５）、Ｐｒｏ４４（配列番号１９）、Ｐｒｏ４６（配列番号２３）、及びＰｒｏ３５３（配列番号２７）、からなる群から選択される、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の単離細胞。
  15. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３、からなる群から選択される、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の単離細胞。
  16. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターを用いて前記細胞に導入される、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の単離細胞。
  17. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、単一の発現ベクターを用いて前記細胞に導入される、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の単離細胞。
  18. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、実質的に等しい量の前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、前記細胞に導入される、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の単離細胞。
  19. 前記第１のポリヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに対する前記比率は１：１である、請求項１８に記載の単離細胞。
  20. 前記第１のポリヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに対する前記比率は１：１超である、請求項１８に記載の単離細胞。
  21. 前記第１のポリヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに対する前記比率は１：１未満である、請求項１８に記載の単離細胞。
  22. 請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の前記第１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  23. 請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の前記第２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  24. 請求項２２に記載の第１の発現ベクター及び請求項２３に記載の第２の発現ベクターを含む組成物であって、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターは、実質的に等しい量の前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、宿主細胞に導入される、前記組成物。
  25. 前記第１の発現ベクターの前記第２の発現ベクターに対する前記比率は１：１である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記第１の発現ベクターの前記第２の発現ベクターに対する前記比率は１：１超である、請求項２４に記載の組成物。
  27. 前記第１の発現ベクターの前記第２の発現ベクターに対する前記比率は１：１未満である、請求項２４に記載の組成物。
  28. 第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含むプロドラッグ組成物を単離するための方法であって、
    １）前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを産生させて培地内に分泌させるのに好適な培養条件下で宿主細胞を培養することであって、
    前記宿主細胞は、
    ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、
    ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１のｓｄＡｂ、
    ｉｉ）第１のドメインリンカー、
    ｉｉｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、
    ｉｖ）第１のプロテアーゼ開裂部位を含む第１の開裂性リンカー、及び、
    ｖ）擬似可変軽鎖、
    を含む、前記第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、及び、
    ｂ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、
    ｉ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２のｓｄＡｂ、
    ｉｉ）第２のドメインリンカー、
    ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖、
    ｉｖ）第２のプロテアーゼ開裂部位を含む第２の開裂性リンカー、及び、
    ｖ）擬似可変重鎖、
    を含む、前記第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列、
    を含み、
    前記第１のポリペプチドの前記可変重鎖、及び前記第２のポリペプチドの前記可変軽鎖は、会合してＦｖを形成すると、ヒトＣＤ３と結合する、
    前記培養すること、及び、
    ２）プロテインＡクロマトグラフィーを用いて前記培地から前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを精製することにより、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを含むプロドラッグ組成物を単離すること、
    を含む、前記方法。
  29. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは別々に精製される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは同時に精製される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記精製することは、前記プロテインＡクロマトグラフィー後にアフィニティークロマトグラフィーを実施することを更に含む、請求項２８から請求項３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記プロドラッグ組成物は、実質的に等しい量の前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを含む、請求項２８から請求項３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記第１のｓｄＡｂ及び前記第２のｓｄＡｂは同一のヒトＴＴＡに結合する、請求項２８から請求項３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第１のｓｄＡｂ及び／または前記第２のｓｄＡｂは、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＢ７Ｈ３、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＦＯＬＲ１、からなる群から選択されるヒトＴＴＡと結合する、請求項２８から請求項３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記第１のｓｄＡｂ及び前記第２のｓｄＡｂは同一のアミノ酸配列を含む、請求項２８から請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第１のｓｄＡｂ及び前記第２のｓｄＡｂは異なるアミノ酸配列を含む、請求項２８から請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記第１のプロテアーゼ開裂部位及び前記第２のプロテアーゼ開裂部位は、同一のプロテアーゼによって認識される、請求項２８から請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記第１のプロテアーゼ開裂部位及び前記第２のプロテアーゼ開裂部位は、異なるプロテアーゼによって認識される、請求項２８から請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記第１のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む、及び／または、前記第２のポリペプチドは、Ｃ末端に半減期延長ドメインを更に含む、請求項２８から請求項３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記可変重鎖は、図３９の配列番号１０２のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３配列を含む、請求項２８から請求項３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記可変軽鎖は、図３８の配列番号９０のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３配列を含む、請求項２８から請求項４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記擬似可変重鎖は、図３９の配列番号１０６、配列番号１１０、及び配列番号２０７からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変重鎖配列を含む、請求項２８から請求項４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記擬似可変軽鎖は、図３８の配列番号９４、配列番号９８、及び配列番号２０３からなる群から選択されるいずれか１つの擬似可変軽鎖配列を含む、請求項２８から請求項４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記第１のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６（配列番号５）、Ｐｒｏ３９（配列番号９）、Ｐｒｏ４１（配列番号１３）、Ｐｒｏ４３（配列番号１７）、Ｐｒｏ４５（配列番号２１）、及びＰｒｏ３４９（配列番号２５）、からなる群から選択される、請求項２８から請求項４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１９（配列番号７）、Ｐｒｏ４０（配列番号１１）、Ｐｒｏ４２（配列番号１５）、Ｐｒｏ４４（配列番号１９）、Ｐｒｏ４６（配列番号２３）、及びＰｒｏ３５３（配列番号２７）、からなる群から選択される、請求項２８から請求項４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは、Ｐｒｏ１６＋Ｐｒｏ１９、Ｐｒｏ３９＋Ｐｒｏ４０、Ｐｒｏ４１＋Ｐｒｏ４２、Ｐｒｏ４３＋Ｐｒｏ４４、Ｐｒｏ４５＋Ｐｒｏ４６、及びＰｒｏ３４９＋Ｐｒｏ３５３、からなる群から選択される、請求項２８から請求項４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターを用いて前記宿主細胞に導入される、請求項２８から請求項４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、単一の発現ベクターを用いて前記宿主細胞に導入されている、請求項２８から請求項４６のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、実質的に等しい量の前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを産生するポリヌクレオチド比率で、前記宿主細胞に導入される、請求項２８から請求項４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記第１のポリヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに対する前記ポリヌクレオチド比率は１：１である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記第１のポリヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに対する前記比率は１：１超である、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記第１のポリヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに対する前記比率は１：１未満である、請求項４９に記載の方法。
  53. 請求項２８から請求項５２のいずれか１項に記載の方法に従い作製した前記プロドラッグ組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とするヒト対象においてそれを実施するための方法。
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