JP2022524337A - 腫瘍抗原を標的とするｆｃ領域及び部分を含有する条件的に活性化された結合タンパク質 - Google Patents

腫瘍抗原を標的とするｆｃ領域及び部分を含有する条件的に活性化された結合タンパク質 Download PDF

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Abstract

タンパク質が腫瘍抗原を標的とするような、Ｆｃ領域を含有する条件的に活性化された結合タンパク質の組成物が、本明細書に提供される。また、そのような条件的に活性化された結合タンパク質を共発現及び精製するための方法も提供される。条件的に活性化された結合タンパク質を患者に投与することによって、がんを処置する方法もまた記載される。【選択図】図２１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月５日に出願された米国仮出願第６２／８１４，４５９号、２０１９年３月5日に出願された米国仮出願第６２／８１４，７４４号、２０１９年３月６日に出願された米国仮出願第６２／８１４，７４４号、及び２０１９年３月２９日に出願された米国仮出願第６２／８２６，５２３号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
コンパクトディスクで提出した「配列表」、表、またはコンピュータープログラムリスティング付録への参照。
ファイル名「１１８４５９－５００８－ＷＯ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含まれ、１０１キロバイトのサイズを有する配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書と電子的に提出され、ｔｘｔファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
個々の細胞または特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床環境において望ましい場合が多い。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しながら、健康な細胞及び組織を可能な限り無傷及び非損傷の状態で残すことが、がん療法の主要目的である。１つのそのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘発して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによる。
腫瘍関連抗原に優れた結合特異性及び親和性を提供する無傷モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の使用は、がん治療及び診断の分野でうまく適用されてきた。しかしながら、無傷ＭＡｂの大きいサイズ、それらの不十分な生体内分布、及び血液プール中の長い持続性は、無傷ＭＡｂの臨床用途を制限してきた。例えば、無傷抗体は、腫瘍範囲内の特定の蓄積を示し得る。生体内分布研究において、周辺領域内の一次蓄積を伴う不均質な抗体分布は、腫瘍を精密に調査するときに顕著である。腫瘍壊死、不均質な抗体分布、及び間質組織圧力の増大により、無傷抗体構築物で腫瘍の中心部分に到達することは不可能である。対照的に、より小さい抗体フラグメントは、迅速な腫瘍局在を示し、腫瘍内へとより深く浸透し、また血流から比較的迅速に除去される。
親ＭＡｂの小さい結合ドメインに由来する単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）は、臨床用途のための無傷ＭＡｂよりも優れた生体内分布を提供し、腫瘍細胞をより効率的に標的とすることができる。単鎖フラグメントは、細菌から効率的に操作され得るが、ほとんどの操作されたｓｃＦｖは、一価構造を有し、腫瘍蓄積の減少、例えば、腫瘍細胞上の短い滞留時間、及び二価化合物が経験するアビディティの欠如によるそれらの親ＭＡｂと比較した特異性を示す。
ＳｃＦｖの好ましい特性にもかかわらず、ある特定の特徴は、がん化学療法におけるＳｃＦｖの完全な臨床展開を妨げる。特に注目すべきは、罹患組織と健康組織との間のＳｃＦｖの交差反応性であり、これは、これらの薬剤が罹患組織及び健康組織の両方に共通の細胞表面受容体に標的化されることに起因する。改善された治療指数を有するｓｃＦｖは、これらの薬剤の臨床的有用性の顕著な進歩をもたらすであろう。本発明は、そのような改善されたｓｃＦｖならびにｓｃＦｖの製造及び使用方法を提供する。本発明の改良されたｓｃＦｖは、二量体化合物を形成することによって、単一の単位によって示されるアビディティの欠如を克服するという予想外の利点を有する。
一態様では、ホモ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）２つのモノマーであって、各々がＮ末端からＣ末端に、
ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｉｉｉ）拘束Ｆｖドメインであって、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメインと、
２）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインと、を含む、拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｖｉ）開裂性リンカーと、
ｖｉｉ）偽Ｆｖドメインであって、
１）偽可変軽ドメインと、
２）非開裂性リンカーと、
３）偽可変重ドメインと、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｖｉｉｉ）任意選択的な開裂性リンカーと、
ｉｘ）Ｆｃドメインと、を含む、２つのモノマーを含み、
可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、可変重ドメイン及び偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、可変軽ドメイン及び偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、ホモ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
ホモ二量体Ｆｃタンパク質のいくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは、第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重可変ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは、第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは、第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、偽可変重ドメインは、偽可変軽ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは、第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、偽可変重ドメインは、偽可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖（ＣＤ３ ＶＨまたはαＣＤ３ ＶＨ）は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬまたはαＣＤ３ ＶＬ）は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、配列番号１８６及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１８７～１８９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変軽鎖は、配列番号１７０及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１７１～１７３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉまたはαＣＤ３ ＶＨｉ）は、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ）は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、配列番号１９０及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９１～１９３及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、配列番号１７４及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、それぞれ配列番号１７５～１７７及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉ２またはαＣＤ３ ＶＨｉ２）は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ２またはαＣＤ３ ＶＬｉ２）は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉ２は、配列番号１９４及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９５～１９７及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、配列番号１７８及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、それぞれ配列番号１７９～１８１及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４またはαＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４）は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉＧＬまたはαＣＤ３ ＶＬｉＧＬ）は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、配列番号１９８及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、それぞれ配列番号１９９～２０１及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、配列番号１８２及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、それぞれ配列番号１８３～１８５及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、異なるＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、特定のＴＴＡに結合するｓｄＡＢＤは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、図１に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、第１の開裂性リンカー及び／または任意選択的な開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリン、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、任意選択的な開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、任意選択的な開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体Ｆｃタンパク質は、ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、開裂性リンカー、及びＦｃドメインを各々含む２つのモノマーを含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択されるＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ホモ二量体Ｆｃタンパク質は、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、またはＣＡ９を標的とするｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、開裂性リンカー、及びＦｃドメインを各々含む２つのモノマーを含む。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体Ｆｃタンパク質の各モノマーは、Ｐｒｏ５５６（配列番号３６）、Ｐｒｏ５８７（配列番号３８）、Ｐｒｏ５８８（配列番号３９）、及びＰｒｏ５８９（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ホモ二量体Ｆｃタンパク質は、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、開裂性リンカー、及びＦｃドメインを各々含む２つのモノマーを含む。いくつかの実施形態では、各モノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、各モノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３可変重ドメイン、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、各モノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、各モノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３可変重ドメイン、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、及びＦｃドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ホモ二量体Ｆｃタンパク質の各モノマーは、Ｐｒｏ５５７（配列番号３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ホモ二量体Ｆｃタンパク質は、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、非開裂性リンカー、及びＦｃドメインを各々含む２つのモノマーを含む。
ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の別の例示的な形式が、図１８Ａ～１８Ｃに提供される。別の態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）第１のＦｃドメインを含む第１のＦｃモノマーと、
（ｂ）第２のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｉｉｉ）拘束Ｆｖドメインであって、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメインと、
２）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインと、を含む、拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｖｉ）第１の開裂性リンカーと、
ｖｉｉ）偽Ｆｖドメインであって、
１）偽可変軽ドメインと、
２）非開裂性リンカーと、
３）偽可変重ドメインと、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｖｉｉｉ）任意選択的な第２の開裂性リンカーと、
ｉｘ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のＦｃモノマーと、を含み、
該第１のＦｃドメイン及び該第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、該可変重ドメイン及び該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、該拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、該可変重ドメイン及び該偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、該可変軽ドメイン及び該偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、可変重ドメインは、可変軽ドメインのＮ末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重可変ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、可変重ドメインのＮ末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、可変重ドメインのＮ末端にあり、偽可変重ドメインは、偽可変軽ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは、可変軽ドメインのＮ末端にあり、偽可変重ドメインは、偽可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖（ＣＤ３ ＶＨまたはαＣＤ３ ＶＨ）は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬまたはαＣＤ３ ＶＬ）は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、配列番号１８６及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１８７～１８９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変軽鎖は、配列番号１７０及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１７１～１７３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉまたはαＣＤ３ ＶＨｉ）は、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ）は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、配列番号１９０及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９１～１９３及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、配列番号１７４及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、それぞれ配列番号１７５～１７７及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉ２またはαＣＤ３ ＶＨｉ２）は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ２またはαＣＤ３ ＶＬｉ２）は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉ２は、配列番号１９４及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９５～１９７及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、配列番号１７８及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、それぞれ配列番号１７９～１８１及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４またはαＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４）は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉＧＬまたはαＣＤ３ ＶＬｉＧＬ）は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、配列番号１９８及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、それぞれ配列番号１９９～２０１及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、配列番号１８２及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、それぞれ配列番号１８３～１８５及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、異なるＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ（複数可）（例えば、第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ及び／または第２のＡＢＤ－ＴＴＡ）は、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の開裂性リンカー及び／または任意選択的な開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリン、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、任意選択的な開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、任意選択的な開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃモノマーは、ＣＨ３－ホールを含む空のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃモノマーは、ＣＨ３－ノブを含む空のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃモノマーは、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃモノマーは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のモノマーのＣ末端は、ヒスチジンタグまたはストレプトアビジンタグなどであるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃモノマーは、ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、第２のｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃモノマーのＦｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーのＣ末端は、ヒスチジンタグまたはストレプトアビジンタグなどであるが、これらに限定されないタグを含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質は、空のＦｃドメインを含む第１のモノマーを含み、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、第２のｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質は、空のＦｃドメインを含む第１のモノマーを含み、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、第２のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、第２のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３可変重ドメイン、第２のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３可変重ドメイン、第２のＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、及びＦｃドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３可変重ドメイン、第２のｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、ＣＤ３偽可変重ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変重ドメイン、ＣＤ３可変軽ドメイン、第２のｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、Ｎ末端からＣ末端に、第１のｓｄＡＢＤ、ＣＤ３可変軽ドメイン、ＣＤ３可変重ドメイン、第２のｓｄＡＢＤ、開裂性リンカー、ＣＤ３偽可変重ドメイン、ＣＤ３偽可変軽ドメイン、及びＦｃドメインを含む。場合によっては、ＥＧＦＲを標的とする第１及び／または第２のｓｄＡＢＤは、図１Ａに示されるように、配列番号５０、５４、５８、６２、及び６６に記載される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＦＯＬＲ１を標的とする第１及び／または第２のｓｄＡＢＤは、図１Ｂに示されるように、配列番号７０、７４、及び７８に記載される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ７Ｈ３を標的とする第１及び／または第２のｓｄＡＢＤは、図１Ｂ～図１Ｄに示されるように、配列番号８２、８６、９０、９４、９８、１０２、及び１０６に記載される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭを標的とする第１及び／または第２のｓｄＡＢＤは、図１Ｄ～図１Ｅに示されるように、配列番号１１０、１１４、１１８、及び１２２に記載される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｏｐ２を標的とする第１及び／または第２のｓｄＡＢＤは、図１Ｅ～図１Ｆに示されるように、配列番号１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、及び１４６に記載される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡ９を標的とする第１及び／または第２のｓｄＡＢＤは、図１Ｆ～図１Ｇに示されるように、配列番号１５０、１５４、１５８、及び１６２に記載される配列のうちのいずれか１つを含む。
場合によっては、第２のモノマーのＦｃドメインは、ＣＨ３－ノブを含む。場合によっては、第２のモノマーのＦｃドメインは、ＣＨ３－ホールを含む。場合によっては、非開裂性リンカーは、ＣＤ３可変軽ドメインとＣＤ３可変重ドメインとの間に位置する。場合によっては、非開裂性リンカーは、ＣＤ３偽可変軽ドメインとＣＤ３偽可変重ドメインとの間に位置する。
いくつかの実施形態では、第１のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ５７４または配列番号４１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ６８８または配列番号４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ５７５（配列番号４２）、またはＰｒｏ５７６（配列番号４３）、またはＰｒｏ５７７（開裂性リンカーを含まないＰｒｏ５７６に類似）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ６８９または配列番号４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ６９０または配列番号４９のアミノ酸配列を含む。空のＦｃ－ホール及びｓｄＡＢＤ－Ｆｃノブを含むそのようなヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の例示的なスキームが、図２１に提供される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５７４を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｐｒｏ５７７及びＰｒｏ５７４を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５７４を含む。
さらに別の態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）第１のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｉｉｉ）第１の拘束Ｆｖドメインであって、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと、
２）第１の拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインと、を含む、第１の拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｖｉ）第１の開裂性リンカーと、
ｖｉｉ）第１の偽Ｆｖドメインであって、
１）第１の偽可変軽ドメインと、
２）非開裂性リンカーと、
３）第１の偽可変重ドメインと、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、
ｖｉｉｉ）第１の任意選択的な開裂性リンカーと、
ｉｘ）第１のＦｃ－ホールドメインと、を含む、第１のＦｃモノマーと、
（ｂ）第２のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第３のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｉｉｉ）第２の拘束Ｆｖドメインであって、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第２の可変重ドメインと、
２）第２のＣＮＣＬと、
３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第２の可変軽ドメインと、を含む、第２の拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｖ）第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｖｉ）第２の開裂性リンカーと、
ｖｉｉ）第２の偽Ｆｖドメインであって、
１）第２の偽可変軽ドメインと、
２）非開裂性リンカーと、
３）第２の偽可変重ドメインと、を含む、第２の偽Ｆｖドメインと、
ｖｉｉｉ）第２の任意選択的な開裂性リンカーと、
ｉｘ）第２のＦｃ－ノブドメインと、を含む、第２のＦｃモノマーと、を含み、
該第１の可変重ドメイン及び該第１の可変軽ドメイン、ならびに該第２の可変重ドメイン及び該第２の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、該拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、該可変重ドメイン及び該偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、該可変軽ドメイン及び該偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは、第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重可変ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは、第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、偽可変軽ドメインは、偽可変重ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは、第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、偽可変重ドメインは、偽可変軽ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは、第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、偽可変重ドメインは、偽可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第２の可変重ドメインは、第２の可変軽ドメインのＮ末端にあり、第２の偽可変軽ドメインは、第２の偽可変重可変ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第２の可変軽ドメインは、第２の可変重ドメインのＮ末端にあり、第２の偽可変軽ドメインは、第２の偽可変重ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第２の可変軽ドメインは、第２の可変重ドメインのＮ末端にあり、第２の偽可変重ドメインは、第２の偽可変軽ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、第２の可変重ドメインは、第２の可変軽ドメインのＮ末端にあり、第２の偽可変重ドメインは、第２の偽可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖（ＣＤ３ ＶＨまたはαＣＤ３ ＶＨ）は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬまたはαＣＤ３ ＶＬ）は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、配列番号１８６及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１８７～１８９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変軽鎖は、配列番号１７０及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１７１～１７３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉまたはαＣＤ３ ＶＨｉ）は、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ）は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、配列番号１９０及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９１～１９３及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、配列番号１７４及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、それぞれ配列番号１７５～１７７及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉ２またはαＣＤ３ ＶＨｉ２）は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ２またはαＣＤ３ ＶＬｉ２）は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉ２は、配列番号１９４及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９５～１９７及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、配列番号１７８及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、それぞれ配列番号１７９～１８１及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４またはαＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４）は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉＧＬまたはαＣＤ３ ＶＬｉＧＬ）は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、配列番号１９８及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、それぞれ配列番号１９９～２０１及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、配列番号１８２及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、それぞれ配列番号１８３～１８５及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合し、かつ／または第３及び第４のｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、同じであり、かつ／または第３及び第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、異なり、かつ／または第３及び第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、異なる。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のｓｄＡＢＤは、異なるＴＴＡに結合する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ（複数可）は、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリン、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。いくつかの実施形態では、第１の開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、任意選択的な開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の任意選択的な開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリン、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。いくつかの実施形態では、第１の任意選択的な開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の任意選択的な開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の任意選択的な開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の任意選択的な開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ５８４（配列番号４４）、Ｐｒｏ５８５（配列番号４５）、及びＰｒｏ５８６（配列番号４６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ５７５（配列番号４２）またはＰｒｏ５７６（配列番号４３）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃモノマーは、Ｐｒｏ６８９（配列番号４８）のアミノ酸配列を含む。
一態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
（ａ）第１のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
ｉｉｉ）第１の拘束Ｆｖドメインであって、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと、
２）第１の拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインと、を含む、第１の拘束Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｖ）第１の開裂性リンカーと、
ｖｉ）第１のＦｃドメインと、を含む、第１のＦｃモノマーと、
（ｂ）第２のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１の偽Ｆｖドメインであって、
１）第１の偽可変軽ドメインと、
２）非開裂性リンカーと、
３）第１の偽可変重ドメインと、を含む、第１の偽Ｆｖドメインと、
ｉｉ）第２の拘束開裂性リンカーと、
ｉｉｉ）第２のＦｃドメインと、を含む、第２のＦｃモノマーと、を含み、
該第１のＦｃドメイン及び該第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、該可変重ドメイン及び該可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、該拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、該可変重ドメイン及び該偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、該可変軽ドメイン及び該偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメインは、Ｆｃ－ノブ修飾を含み、第２のＦｃドメインは、Ｆｃ－ホール修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメインは、Ｆｃ－ホール修飾を含み、第２のＦｃドメインは、Ｆｃ－ノブ修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖（ＣＤ３ ＶＨまたはαＣＤ３ ＶＨ）は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬまたはαＣＤ３ ＶＬ）は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、配列番号１８６及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１８７～１８９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変軽鎖は、配列番号１７０及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３可変重鎖は、それぞれ配列番号１７１～１７３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉまたはαＣＤ３ ＶＨｉ）は、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ）は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、配列番号１９０及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９１～１９３及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、配列番号１７４及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉは、それぞれ配列番号１７５～１７７及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉ２またはαＣＤ３ ＶＨｉ２）は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉ２またはαＣＤ３ ＶＬｉ２）は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉ２は、配列番号１９４及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉは、それぞれ配列番号１９５～１９７及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、配列番号１７８及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉ２は、それぞれ配列番号１７９～１８１及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、偽可変重ドメイン（ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４またはαＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４）は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、偽可変軽ドメイン（ＣＤ３ ＶＬｉＧＬまたはαＣＤ３ ＶＬｉＧＬ）は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、配列番号１９８及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４は、それぞれ配列番号１９９～２０１及び図２Ｂに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、配列番号１８２及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ ＶＬｉＧＬは、それぞれ配列番号１８３～１８５及び図２Ａに記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤは、異なるＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ（複数可）は、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、特定のＴＴＡに結合するｓｄＡＢＤは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５１、１５４、１５８、１６２、及び１６６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、図１に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、第１の開裂性リンカー及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリン、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の開裂性リンカーは、図３Ａ～３Ｄに示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の開裂性リンカーは、配列番号２１０～２８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
また、本明細書に記載のホモ二量体及びヘテロ二量体タンパク質を作製するための核酸組成物、発現ベクター、宿主細胞、及び方法が、本明細書に提供される。
また、本明細書に記載のホモ二量体タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つを投与することを含む、対象、例えば、ヒト対象におけるがんを治療するための方法が提供される。
本出願は、２０１７年３月８日に出願された国際公開特許出願第ＷＯ２０１７／１５６１７８号、２０１６年３月８日に出願された米国仮出願第６２／３０５，０９２号、２０１７年９月８日に出願された米国仮出願第６２／５５５，９４３号、２０１７年９月８日に出願された米国仮出願第６２／５５５，９９９号、２０１７年１１月１５日に出願された米国仮出願第６２／５８３，３２７号、及び２０１７年１１月１６日に出願された米国仮出願第６２／５８７，３１８号、２０１７年９月８日に出願された米国仮出願第６２／５５５，９９９号、２０１７年９月８日に出願された米国仮出願第６２／５５５，９４３号、ならびに２０１８年９月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９７９８号を参照し、それらの開示は、図面、図の説明文、及び定義、ならびにすべての列挙された実施形態を含むそれらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメイン及び抗ＨＳＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメイン及び抗ＨＳＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 本発明の多くの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖドメイン及び抗ＨＳＡ配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。 多くの好適なプロテアーゼ開裂部位、及び非開裂性リンカーまたはドメインリンカーを示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端の両方のいずれにある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。場合によっては、「／」は、リンカーの開裂部位を示す。 多くの好適なプロテアーゼ開裂部位、及び非開裂性リンカーまたはドメインリンカーを示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端の両方のいずれにある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。場合によっては、「／」は、リンカーの開裂部位を示す。 多くの好適なプロテアーゼ開裂部位、及び非開裂性リンカーまたはドメインリンカーを示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端の両方のいずれにある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。場合によっては、「／」は、リンカーの開裂部位を示す。 多くの好適なプロテアーゼ開裂部位、及び非開裂性リンカーまたはドメインリンカーを示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端の両方のいずれにある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。場合によっては、「／」は、リンカーの開裂部位を示す。 多くの好適なプロテアーゼ開裂部位、及び非開裂性リンカーまたはドメインリンカーを示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端の両方のいずれにある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。場合によっては、「／」は、リンカーの開裂部位を示す。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物１」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ３７＋Ｐｒｏ３６プロドラッグ構築物の概略図が示され、エンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂後に得られる二重特異性ポリペプチドが示されるが、本明細書に記載されるような他の開裂部位が使用され得る。二重特異性ポリペプチドは、ＥＧＦＲに結合するｓｄＡＢＤ及びＣＤ３に結合するＦｖドメインを含む。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図４は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、ＦｃドメインのＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物２」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ３８＋Ｐｒｏ３６プロドラッグ構築物の概略図が示され、この場合もやはり、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を使用するが、多くの実施形態は、他の開裂部位を利用する。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図５は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、ＦｃドメインのＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによる開裂時に低い条件付けを示したか、または条件付けの欠如を示したことを示す。図６Ａ中、Ｐｒｏ３６＋３７（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ３６＋３７開裂（正方形）を前処理した。図６Ｂ中、Ｐｒｏ３６＋３８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ３６＋３８開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによる開裂時に低い条件付けを示したか、または条件付けの欠如を示したことを示す。図６Ａ中、Ｐｒｏ３６＋３７（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ３６＋３７開裂（正方形）を前処理した。図６Ｂ中、Ｐｒｏ３６＋３８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ３６＋３８開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物３」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ６８＋Ｐｒｏ６７プロドラッグ構築物の概略図が示され、エンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂後に得られる二重特異性ポリペプチドが示され、この場合もやはり、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を使用するが、多くの実施形態は、他の開裂部位を利用する。二重特異性ポリペプチドは、ＥＧＦＲに結合するｓｄＡＢＤ及びＣＤ３に結合するＦｖドメインを含む。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図７は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、ＦｃドメインのＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物４」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ６９＋Ｐｒｏ７０プロドラッグ構築物の概略図が示され、この場合もやはり、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を使用するが、多くの実施形態は、他の開裂部位を利用する。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図８は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物５」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ７１＋Ｐｒｏ６７プロドラッグ構築物の概略図が示され、この場合もやはり、ＥＫのＦｌａｇ開裂部位を使用するが、多くの実施形態は、他の開裂部位を利用する。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図９は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付けを示したが、高い活性を欠いていたことを示す。図１０Ａ中、Ｐｒｏ６７＋６８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６７＋６８開裂（正方形）を前処理した。図１０Ｂ中、Ｐｒｏ６９＋７０（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６９＋７０開裂（正方形）を前処理した。図１０Ｃ中、Ｐｒｏ６７＋７１（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６７＋７１開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付けを示したが、高い活性を欠いていたことを示す。図１０Ａ中、Ｐｒｏ６７＋６８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６７＋６８開裂（正方形）を前処理した。図１０Ｂ中、Ｐｒｏ６９＋７０（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６９＋７０開裂（正方形）を前処理した。図１０Ｃ中、Ｐｒｏ６７＋７１（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６７＋７１開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 本明細書に記載のいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付けを示したが、高い活性を欠いていたことを示す。図１０Ａ中、Ｐｒｏ６７＋６８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６７＋６８開裂（正方形）を前処理した。図１０Ｂ中、Ｐｒｏ６９＋７０（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６９＋７０開裂（正方形）を前処理した。図１０Ｃ中、Ｐｒｏ６７＋７１（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ６７＋７１開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物６」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ２１９＋Ｐｒｏ２１８プロドラッグ構築物の概略図が示され、ＭＭＰ９プロテアーゼ開裂部位を使用するが、本明細書に記載される他の部位も使用され得る。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図１１は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 Ｆｃホール／ノブ領域を含む「構築物７」形式の条件的に活性化された結合ポリペプチドの例示的な実施形態を示す。Ｐｒｏ２１７＋Ｐｒｏ２１８プロドラッグ構築物の概略図が示され、ＭＭＰ９プロテアーゼ開裂部位を使用するが、本明細書に記載される他の部位も使用され得る。ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９などであるが、これらに限定されない他の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するｓｄＡＢＤが、他の実施形態で使用され得ることに留意されたい。加えて、図１２は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の精製を促進するために使用した、モノマータンパク質のＣ末端における２つの異なるタンパク質「タグ」の使用を示すが、当業者によって理解されるように、これらは、除去され得る。 本明細書に記載の例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付け及び高い効力を示したことを示す。図１３Ａ中、Ｐｒｏ２１７＋２１８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ２１７＋２１８開裂（正方形）を前処理した。図１３Ｂ中、Ｐｒｏ２１８＋２１９（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ２１８＋２１９開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 本明細書に記載の例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付け及び高い効力を示したことを示す。図１３Ａ中、Ｐｒｏ２１７＋２１８（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ２１７＋２１８開裂（正方形）を前処理した。図１３Ｂ中、Ｐｒｏ２１８＋２１９（丸）をＥＫプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ２１８＋２１９開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ２１４は、完全長陰性対照（塗りつぶされていない正方形）であり、Ｐｒｏ ５１（三角形）は、活性のためにプロテアーゼ開裂を必要としない陽性対照である。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 本発明の例示的な配列を示す。リンカーは下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。スラッシュ（「／」）は、ドメインセパレーターを示す。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｈｉｓ）１０、及びＳｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）ＩＩタグなどのＣ末端タグは、太字であるが、本明細書で概説されるように、使用される精製スキームに応じて任意選択的である。したがって、Ｃ末端タグを除外する図１４の配列が本明細書の説明に含まれる。 追加のＰｒｏ２１９構築物（図１５Ａ）ならびに追加のＰｒｏ２１７構築物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）を示す。 追加のＰｒｏ２１９構築物（図１５Ａ）ならびに追加のＰｒｏ２１７構築物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）を示す。 追加のＰｒｏ２１９構築物（図１５Ａ）ならびに追加のＰｒｏ２１７構築物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）を示す。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。 Ｐｒｏ５５６、Ｐｒｏ５５７、Ｐｒｏ５８７、Ｐｒｏ５８８、及びＰｒｏ５８９などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃドメインがホモ二量体を形成するような、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質を作製するために使用される。 Ｐｒｏ５５６、Ｐｒｏ５５７、Ｐｒｏ５８７、Ｐｒｏ５８８、及びＰｒｏ５８９などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃドメインがホモ二量体を形成するような、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質を作製するために使用される。 Ｐｒｏ５５６、Ｐｒｏ５５７、Ｐｒｏ５８７、Ｐｒｏ５８８、及びＰｒｏ５８９などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃドメインがホモ二量体を形成するような、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質を作製するために使用される。 Ｐｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５、Ｐｒｏ５７６、Ｐｒｏ５８４、Ｐｒｏ５８５、及びＰｒｏ５８６などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体を作製するために使用される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８４、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８５、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８６、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８４、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８５、ならびにＰｒｏ５７６及びＰｒｏ５８６からなる群から選択される対を含む。 Ｐｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５、Ｐｒｏ５７６、Ｐｒｏ５８４、Ｐｒｏ５８５、及びＰｒｏ５８６などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体を作製するために使用される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８４、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８５、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８６、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８４、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８５、ならびにＰｒｏ５７６及びＰｒｏ５８６からなる群から選択される対を含む。 Ｐｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５、Ｐｒｏ５７６、Ｐｒｏ５８４、Ｐｒｏ５８５、及びＰｒｏ５８６などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは、太字で下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、下線が引かれ、開裂性リンカーは、単一／二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体を作製するために使用される。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８４、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８５、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８６、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８４、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８５、ならびにＰｒｏ５７６及びＰｒｏ５８６からなる群から選択される対を含む。 本明細書に記載のいくつかの例示的なホモ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付け及び活性を示したことを示す。図１９中、Ｐｒｏ５５６（丸）をプロテアーゼで前処理しなかったが、Ｐｒｏ５５６開裂（正方形）を前処理した。Ｐｒｏ５５７は、偽ＦｖドメインのＮ末端に非開裂性リンカーを含有する（黒い三角形）。Ｐｒｏ１８６（ダイヤモンド）は、ホモ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物ではない。Ｎ末端からＣ末端へのＰｒｏ１８６は、ａ）ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｂ）拘束Ｆｖドメイン、ｃ）ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｄ）開裂性リンカー、ｅ）偽Ｆｖドメイン、及びｆ）ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡを含む。 Ｐｒｏ６８８、Ｐｒｏ６８９、及びＰｒｏ６９０などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、二重下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体を作製するために使用される。 Ｐｒｏ６８８、Ｐｒｏ６８９、及びＰｒｏ６９０などの本発明の追加の配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。「／」は、ドメインの交点を示し、ドメインリンカーは、二重下線が引かれ、開裂性リンカーは、二重下線が引かれ、イタリック体である。構築物の多くは、使用に応じて任意選択的であるヒスチジンタグを含む。例示的な実施形態では、提供される配列は、Ｆｃ融合ヘテロ二量体を作製するために使用される。 Ｐｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５、及びＰｒｏ５７７などの本発明のＴＴＡ結合ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の例示的なスキームを示す。 Ｐｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５、及びＰｒｏ５７７などの本発明のＥＧＦＲ結合ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の効力を示す。 養子Ｔ細胞移入マウスモデルにおける、Ｐｒｏ５７４、Ｐｒｏ５７５、及びＰｒｏ５７７などの本発明のＥＧＦＲ結合ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の抗腫瘍応答を示す。
Ｉ．導入
本発明は、ＣＤ３及び腫瘍抗原などの重要な生理学的標的に結合する二重特異性抗体（抗体様機能タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低減する方法に関する。抗体などの多くの抗原結合タンパク質は、有意な「オフ標的／オフ腫瘍」副作用を有する可能性があり、したがって、罹患組織の近くの治療用分子の結合能力のみを活性化して、オフ標的相互作用を回避する必要性がある。したがって、本発明は、多くの機能タンパク質ドメインを有する多価の条件的に有効な（「ＭＣＥ」）タンパク質に関する。一般に、これらのドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。別のドメインは、ある特定の条件下で、例えば、ＡＢＤの一部分がＡＢＤの相補的部分に近接しているときに、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に結合して、抗ＣＤ３ Ｆｖ結合ドメインを形成するＡＢＤである。つまり、治療用分子は、ＣＤ３結合ドメインが腫瘍環境に曝露されるまで不活性である「プロドラッグ」様形式で作製される。この条件付けを達成するために、本発明は、本明細書に記載され、図に示されるように、形式に応じて、いくつかの異なる方法で「偽」または「不活性」または「非活性」可変ドメインを利用する。これらは、本明細書において「ｉＶＨ」及び「ｉＶＬ」ドメインと称される。
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３結合ドメイン（「ＣＤ３ Ｆｖ」）は、拘束形式であり、従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーは、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる。いくつかの実施形態では、プロドラッグ（例えば、未開裂）形式において、プロドラッグポリペプチドはまた、「偽Ｆｖドメイン」も含む。偽Ｆｖドメインは、標準フレームワーク領域であるが、「非活性」もしくは「ダミー」ＣＤＲ（非活性可変重ドメイン）を有する可変重ドメイン、標準フレームワーク領域であるが、「非活性」もしくは「ダミー」ＣＤＲ（非活性可変軽ドメイン）を有する可変軽ドメイン、または両方を含むことができる。したがって、拘束Ｆｖドメインは、各々のフレームワーク領域の親和性により偽Ｆｖドメインに結合する。しかしながら、偽ドメインの「非活性」ＣＤＲにより、得られるＡＢＤは、ＣＤ３に結合せず、したがってオフ標的毒性を防止する。しかしながら、腫瘍内またはその近くにあるプロテアーゼの存在下で、プロドラッグ構築物は、「真の」可変重ドメイン及び可変軽ドメインが会合することを可能にするように開裂され、したがって、活性ＣＤ３結合及び得られる腫瘍有効性を引き起こす。
他の実施形態では、プロドラッグ形式において、プロドラッグポリペプチドは、２つの偽Ｆｖドメイン及び各偽Ｆｖドメインに連結されたＦｃドメインを含む。第１の偽Ｆｖドメインは、不活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含み得、第２の偽Ｆｖドメインは、活性可変重ドメイン及び不活性可変軽ドメインを含み得る。プロドラッグ形式のＡＢＤは、タンパク質分解的に不活性な組織においてＣＤ３に結合しない。それにもかかわらず、腫瘍内またはその近くで、プロテアーゼは、プロドラッグ構築物を開裂することができ、これにより、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインは、ＣＤ３に会合及び結合し、それによって標的腫瘍細胞傷害性を誘発する。
したがって、本明細書に提供されるプロドラッグ構築物は、「ノブイントゥホール」（「ＫＩＨ」）立体配座を形成するヘテロ二量体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。ノブイントゥホール概念の詳細な説明は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及び同第７，１８６，０７６号、ならびにＲｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１９９６，９（７）：６１７－６２１、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９７，２７０（１）：２６－３５、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６：６７７－６８１、及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２４（１－２）：７－１５で見ることができる。簡単に述べると、ノブは、より小さいアミノ酸側鎖をより大きいもの（例えば、Ｔ３６６Ｗ）と置き換えることによって、第１のＩｇＧ Ｆｃ鎖のＣＨ３ドメイン界面において作られ得、ホールは、より大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えば、Ｙ４０７Ｖ）と置き換えることによって、第２のＩｇＧ Ｆｃ鎖のＣＨ３界面において並列位置で作られ得る。好適なＫＩＨ変異体は、以下に記載される。したがって、本明細書において、「ノブ置換（複数可）」を有するＣＨ３ドメインは、「ＣＨ３－ノブ」と称され、「ホール置換（複数可）」を有するＣＨ３ドメインは、本明細書において「ＣＨ３－ホール」と称され、一般用語は、当業者によって理解されるように、Ｆｃ二量体のどちらの「側面」が「ホール変異体」を含有し、どちらが「ノブ変異体」を含有するかが決定的ではなく、変化し得るため、両方を網羅するために「ＣＨ３－ＫＩＨ」である。
本明細書で考察されるように、本発明で使用される様々な立体配座及び形式が存在する。プロドラッグ構築物の立体配座は、プロドラッグ活性化が、図２１に示される形式及び図１７Ａ～１７Ｃに提供される配列のように、いくつかの一般的な方法で起こり得るような、多種多様な立体配座をとることができる。追加の有用な形式は、図１に「構築物１」として、図２に「構築物２」として、図４に「構築物３」として、図５に「構築物４」として、図６に「構築物５」として、図８に「構築物６」として、及び図９にＷＯ２０１９／０５１１２２の「構築物７」として示される。これらの構築物は、概して、非活性結合ドメインの適切な開裂前会合を可能にするために、ヘテロ二量体Ｆｃ構造を形成するＦｃドメインに依存する。
「構築物１」の実施形態では、プロドラッグ構築物は、ＣＨ２－ＣＨ３－ホールポリペプチド、第１の偽Ｆｖドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む第１のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２－ＣＨ３－ノブポリペプチド、第２の偽Ｆｖドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む第２のＦｃポリペプチドとを含む。偽Ｆｖドメインは、腫瘍環境に曝露されるまで不活性であるＣＤ３結合ドメイン（Ｆｖ）を指す。この実施形態では、偽Ｆｖドメインは、活性可変重ドメイン（活性ＶＨ）及び不活性可変軽ドメイン（不活性ＶＬ）を含む。他の実施形態では、偽Ｆｖドメインは、活性可変軽ドメイン（活性ＶＬ）及び不活性可変重ドメイン（不活性ＶＨ）を含む。加えて、当業者によって理解されるように、「構築物１」の偽Ｆｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端に、いずれかの方向で、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る（例えば、図１の「構築物１」において、偽Ｆｖドメインは、ＶＨ－リンカー－ＶＬとして示されるが、これは、切り替えられ得る）。
「構築物１」のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結された第２の抗原結合ドメインに連結された不活性ＶＨドメインに、開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＬドメインに、ドメインリンカーを介して連結された第１のＴＴＡに対する抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結された不活性ＶＬドメインに、開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＨドメインに、ドメインリンカーを介して連結された第２のＴＴＡに対する抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。腫瘍部位またはその付近での第１のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーの開裂及び第２のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーの開裂時に、第１のＦｃポリペプチドの活性ＶＬ及び第２のＦｃポリペプチドの活性ＶＨは、活性ＣＤ３結合に会合し、それを引き起こすことができる。活性ＶＨ及びＶＬドメインの固有の自己集合に加えて、各ドメインは、腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインに連結される。したがって、プロテアーゼ開裂産物は、腫瘍細胞に結合し、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じ腫瘍抗原である。他の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる腫瘍抗原である。
場合によっては、「構築物１」のプロドラッグ構築物は、２つの開裂部位を有し、１つは、第１のＦｃポリペプチドの活性可変軽鎖と不活性可変重鎖との間にあり、２つ目は、第２のＦｃポリペプチドの活性可変重鎖と不活性可変軽鎖との間にある。いくつかの実施形態では、２つの開裂部位は、同じプロテアーゼによって認識及び開裂される。したがって、２つの開裂部位は、同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有し得る。他の実施形態では、２つの開裂部位は、異なるプロテアーゼによって認識及び開裂される。したがって、２つの開裂部位は、異なるアミノ酸配列を有し得る。
「構築物２」のいくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド、活性可変軽鎖（活性ＶＬ）及び不活性可変重鎖（不活性ＶＨ）を含む第１の偽Ｆｖドメイン、ならびに標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む第１のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド、活性可変重鎖（活性ＶＨ）及び不活性可変軽鎖（不活性ＶＬ）を含む第２の偽Ｆｖドメイン、ならびに標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。
「構築物２」のいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドにドメインリンカーを介して連結された不活性ＶＨドメインに、開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＬドメインに、ドメインリンカーを介して連結された第１のＴＴＡに対する抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドにドメインリンカーを介して連結された不活性ＶＬドメインに、開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＨドメインに、ドメインリンカーを介して連結された第２のＴＴＡに対する抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。腫瘍部位またはその付近での第１のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーの開裂及び第２のＦｃポリペプチドの開裂性リンカーの開裂時に、第１のＦｃポリペプチドの活性ＶＬ及び第２のＦｃポリペプチドの活性ＶＨは、活性ＣＤ３結合に会合し、それを引き起こすことができる。活性ＶＨ及びＶＬドメインの固有の自己集合に加えて、各ドメインは、腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインに連結される。したがって、プロテアーゼ開裂産物は、腫瘍細胞に結合し、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じ腫瘍抗原である。他の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる腫瘍抗原である。
「構築物３」のプロドラッグは、「構築物２」に類似しているが、第１のＦｃポリペプチドの不活性ＶＨドメインとＣＨ３－ホールポリペプチドとの間のドメインリンカー、及び第２のＦｃポリペプチドの不活性ＶＬドメインとＣＨ３－ノブポリペプチドとの間のドメインリンカーを欠いている。
ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む第１のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド、第１の偽Ｆｖドメイン、第２の偽Ｆｖドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第２の抗原結合ドメイン、及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第３の抗原結合ドメインを含む第２のＦｃポリペプチドとを含む、プロドラッグ構築物（例えば、「構築物４」）も本明細書に提供される。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原である。第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。第１及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。第１及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。第２及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。
「構築物４」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）不活性ＶＨドメインに開裂性リンカーを介して連結された活性ＶＬドメインに、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第３の抗原結合ドメインに、開裂性リンカーを介して連結されたＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結された不活性ＶＬドメインに、開裂性リンカーを介して付着した活性ＶＨドメインに、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第２の抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。
「構築物５」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）不活性ＶＨドメインに開裂性リンカーを介して連結された活性ＶＬドメインに、ドメインリンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインに、開裂性リンカーを介して連結されたＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結された不活性ＶＬドメインに、開裂性リンカーを介して連結された活性ＶＨドメインに、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第３の抗原結合ドメインを含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の実施形態では、第１、第２、及び／または第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原である。第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。第１及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。第１及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。第２及び第３の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。第２及び第３の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。
ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド、ならびに標準フレームワーク領域及び「非活性」または「ダミー」ＣＤＲを有する可変重ドメイン及び可変軽ドメインを含む第１の偽Ｆｖドメインを含む第１のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、及び拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）のＣＤ３結合ドメインを含む第２のＦｃポリペプチドとを含む、プロドラッグ構築物（例えば、「構築物６」）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、拘束活性Ｆｖドメインは、開裂性リンカーを介してＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに共有結合され、第１の偽Ｆｖドメインは、開裂性リンカーを介してＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに共有結合される。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、同じプロテアーゼによって認識され得る。他の実施形態では、開裂性リンカーは、異なるプロテアーゼによって認識され得る。
「構築物６」の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーを介して連結された拘束活性Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含み、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーまたは非開裂性リンカーを介して連結された偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。
「構築物６」と類似している別のプロドラッグ構築物（例えば、「構築物７」）が、本明細書に提供される。構築物７の例示的な実施形態は、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、及び拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）のＣＤ３結合ドメインを含む、第２のＦｃポリペプチドと、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチド及び第１の偽Ｆｖドメインを含む第１のＦｃポリペプチドと、を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。場合によっては、第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。
「構築物７」の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに開裂性リンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインに、ドメインリンカーを介して連結された拘束活性Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含み、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに開裂性または非開裂性リンカーを介して連結された偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）を含む。場合によっては、第１のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ホールを含有し、第２のＦｃポリペプチドは、ＣＨ３－ノブを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＨ２－ＣＨ３－ノブポリペプチドに隣接する開裂性リンカーは、ＣＨ２－ＣＨ３－ホールポリペプチドに隣接する同じ開裂性リンカーである。他の実施形態では、開裂性リンカーは、異なる。
ホモ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物（例えば、「構築物８」）が、本明細書に提供される。構築物８の例示的な実施形態は、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）の第１のＣＤ３結合ドメイン、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、第１の偽Ｆｖドメイン、及びＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを含む第１のＦｃポリペプチドと、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第３の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）の第２のＣＤ３結合ドメイン、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第４の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、第２の偽Ｆｖドメイン、及び第２のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。場合によっては、第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。場合によっては、第３及び第４の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第３及び第４の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。場合によっては、第１、第２、第３、及び／または第４の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。
「構築物８」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドに連結された第１の偽ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）に、開裂性リンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインに連結された第１の拘束活性ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドに連結された第２の偽ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）に、開裂性リンカーを介して連結された第４の抗原結合ドメインに連結された第２の拘束活性ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第３の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、同じである。
別のヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物（例えば、「構築物９」）が、本明細書に提供される。構築物９の例示的な実施形態は、ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドを含む第１のＦｃポリペプチドと、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）の第１のＣＤ３結合ドメイン、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、第１の偽Ｆｖドメイン、及びＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドを含む第２のＦｃポリペプチドとを含む。場合によっては、第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ホールドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ノブドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ノブドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ホールドメインを含む。
「構築物９」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）は、ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＣＨ２－ＣＨ３－ＫＩＨポリペプチドに連結された偽ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）に、開裂性リンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインに連結された拘束活性ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含む。
二量体Ｆｃプロドラッグ構築物（例えば、「構築物１０」またはホモ二量体Ｆｃ構築物）が、本明細書に提供される。構築物１０の例示的な実施形態は、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）の第１のＣＤ３結合ドメイン、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、第１の偽Ｆｖドメイン、及び第１のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを含む第１のＦｃポリペプチドと、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第３の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、拘束形式（従来Ｆｖを形成する可変重ドメインと可変軽ドメインとの間のリンカーが、２つのドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎる）の第２のＣＤ３結合ドメイン、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合することができる第４の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、第２の偽Ｆｖドメイン、及び第２のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドを含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。場合によっては、第１及び第２の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。場合によっては、第３及び第４の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第３及び第４の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。場合によっては、第１、第２、第３、及び／または第４の抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合することができる。他の場合では、第１、第２、第３、及び／または第４の抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原に結合することができる。
「構築物１０」の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）第１のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドに連結された第１の偽ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）に、開裂性リンカーを介して連結された第２の抗原結合ドメインに連結された第１の拘束活性ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第１の抗原結合ドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端に）第２のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドに連結された第２の偽ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変軽ドメイン、または不活性可変軽ドメインに非開裂性リンカーを介して連結された不活性可変重ドメイン）に、開裂性リンカーを介して連結された第４の抗原結合ドメインに連結された第２の拘束活性ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性可変軽鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変重鎖、または活性可変重鎖に拘束非開裂性リンカーを介して連結された活性可変軽鎖）に、ドメインリンカーを介して連結されたＴＴＡに対する第３の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドに隣接する開裂性リンカーは、第２のＣＨ２－ＣＨ３ポリペプチドに隣接する同じ開裂性リンカーである。他の実施形態では、開裂性リンカーは、異なる。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ホールドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ノブドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ノブドメインを含み、第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ－ホールドメインを含む。
ＩＩ．定義
本出願がより完全に理解され得るために、いくつかの定義が以下に記載される。そのような定義は、文法的等価物を包含するよう意図される。
「ＣＯＢＲＡ（商標）」及び「条件付き二重特異性再方向付け活性化」という用語は、多くの機能タンパク質ドメインを有する二重特異性の条件的に有効なタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、機能ドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。ある特定の実施形態では、別のドメインは、ある特定の条件下でＴ細胞抗原に結合するＡＢＤである。Ｔ細胞抗原としては、ＣＤ３が挙げられるが、これに限定されない。「半ＣＯＢＲＡ（商標）」という用語は、標的発現細胞の表面上に集中したときの固有の自己集合により、半ＣＯＢＲＡの可変重鎖が別の半ＣＯＢＲＡ（商標）（相補的半ＣＯＢＲＡ（商標））の可変軽鎖に会合することができる場合に、Ｔ細胞抗原に結合することができる、条件的に有効なタンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、特定の定義された位置に存在し得る２０個の天然に存在するアミノ酸または任意の非天然類似体のうちの１つを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」は、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。本明細書の「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。
本明細書の「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、及び／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に付着した、改変した炭水化物またはＰＥＧ構造であり得る。明確にするために、特に断りのない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対してである。本明細書の好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
本明細書の「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の、異なるアミノ酸配列による置き換えを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置において天然に存在しない、その生物内または任意の生物内のいずれかに天然に存在しないアミノ酸に対してである。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（なおもアルギニンをコードする）に交換して宿主生物発現レベルを増大させる）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、つまり、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の生成にもかかわらず、タンパク質が、それが出発した特定の位置における同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の付加を意味する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の除去を意味する。
本発明のポリペプチドは、本明細書で概説されるように、ＣＤ３に特異的に結合し、標的細胞受容体などの標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）を標的とする。抗原またはエピトープへの「特異的結合」またはそれ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定され得る。
特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、少なくとも１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、またはそれ以上の抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤは、特定の抗原－抗体相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比較して、対照分子に対して２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上であるＫＤを有する。
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上の抗原またはエピトープのＫＡまたはＫａを有する抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は概して、当該技術分野において既知であるようなＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔを使用して測定される。
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃ親または前駆体を含む）とは、後に修飾されて変異体を生成するポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書で使用される場合、「親Ｆｃポリペプチド」とは、修飾されて変異体、概して、本明細書に定義されるヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを生成する未修飾Ｆｃポリペプチドを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、修飾されて変異体抗体を生成する未修飾抗体を意味する。
本明細書で使用される場合、「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立された形式、例えば、抗体ナンバリングのためのＥＵインデックスに従って番号付けされ得る。
本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。幅広い好適な例示的な標的抗原が本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、標的抗原を発現させる細胞を意味する。
本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」または「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」とは、概して抗体からの抗原結合ドメインのＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖドメインは、通常、それらが活性ＶＨ及びＶＬドメインを含有する場合、本明細書で考察される「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」を形成する（場合によっては、Ｆｖは、以下で考察されるように拘束リンカーを含有するが、Ｆｖドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、ｓｃＦｖ形式、拘束Ｆｖ形式、偽Ｆｖ形式などで「活性」または「不活性」であり得る）。本発明では、場合によっては、Ｆｖドメインが、図８及び９に示されるように、単一のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインで構成されるが、分子内ＡＢＤが形成され得ないように拘束リンカーを有することが理解されるべきである。これらの実施形態では、２つの活性ＡＢＤが形成されるのは開裂後である。場合によっては、Ｆｖドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインで構成され、そのうちの１つは非活性であり、これにより、開裂後にのみ分子間ＡＢＤが形成される。
本明細書の「可変ドメイン」とは、それぞれカッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶκ、Ｖλ、及び／またはＶＨ遺伝子のうちのいずれかによって実質的にコードされた１つ以上のＩｇドメインを含む、免疫グロブリンの領域を意味する。各ＶＨ及びＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に次の順序で配置される、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つの「フレームワーク領域」または「ＦＲ」からなる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。したがって、ＶＨドメインは、構造ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を有し、ＶＬドメインは、構造ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。本明細書においてより十分に記載されるように、ｖｈＦＲ領域及びｖｌＦＲ領域は自己集合して、Ｆｖドメインを形成する。一般に、本発明のプロドラッグ形式では、ＶＨ及びＶＬドメインが自己会合することができない「拘束Ｆｖドメイン」、ならびにＣＤＲが自己会合したときに機能的（活性）抗原結合ドメインを形成しない「偽Ｆｖドメイン」が存在する。
超可変領域は、抗原結合特異性を与え、概して、軽鎖可変領域内のおよそアミノ酸残基２４－３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９－９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の約３１－３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を示す）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５－１０２（ＨＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、及び／または軽鎖可変領域内の超可変ループ（例えば、残基２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１－９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５３－５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６－１０１（ＨＣＤＲ３）を形成する残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）のアミノ酸残基を包含する。本発明の特定のＣＤＲは、以下に記載される。
当業者によって理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付け及び配置は、異なるナンバリングシステムによって異なり得る。しかしながら、可変重及び／または可変軽配列の開示が、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。
ＣＤＲ番号付けの有用な比較は、以下の通りであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照されたい。
表１
Figure 2022524337000002
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは概して、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１－１０７及び重鎖可変領域の残基１－１１３）を指すときに使用され、Ｆｃ領域に対してはＥＵナンバリングシステムが使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記を参照（１９９１））。
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽ＣＤＲ及び３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む。当業者によって理解されるように、ＣＤＲの各セット、ＶＨ及びＶＬ ＣＤＲは、両方が個々に、かつセットとして抗原に結合することができる。例えば、拘束Ｆｖドメインにおいて、ｖｈＣＤＲは、例えばＣＤ３に結合することができ、ｖｌＣＤＲは、ＣＤ３に結合することができるが、拘束された形式では、それらはＣＤ３に結合することができない。
これらのＣＤＲは、丁寧に、より大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であり得る。加えて、本明細書においてより十分に概説されるように、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
ＣＤＲは、抗原結合部位、より具体的には、エピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして既知の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特定の構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。単一の抗原が２つ以上のエピトープを有し得る。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成成分とも呼ばれる）、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基を含んでもよく、換言すれば、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。立体配座及び非立体配座エピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で区別され得る。
エピトープは典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３つ、通常は少なくとも５つまたは８～１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫測定法、例えば「ビニング」で検証され得る。以下で概説されるように、本発明は、本明細書の列挙される抗原結合ドメイン及び抗体だけではなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されたエピトープとの結合を競合するものも含む。
本発明の可変重及び可変軽ドメインは、「活性」または「不活性」であり得る。
本明細書で使用される場合、「不活性ＶＨ」（「ｉＶＨ」）及び「不活性ＶＬ」（「ｉＶＬ」）は、それらの同種ＶＬまたはＶＨパートナーとそれぞれが対になったときに、「不活性」ではない類似ＶＬまたはＶＨに結合すれば、「活性」ＶＨまたは「活性」ＶＬが結合するであろう抗原に特異的に結合しない得られるＶＨ／ＶＬ対を形成する、偽Ｆｖドメインの構成成分を指す。例示的な「不活性ＶＨ」及び「不活性ＶＬ」ドメインは、野生型ＶＨまたはＶＬ配列の突然変異によって形成される。例示的な突然変異は、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３内である。例示的な突然変異は、ＣＤＲ２内にドメインリンカーを配置し、それにより「不活性ＶＨ」または「不活性ＶＬ」ドメインを形成することを含む。対照的に、「活性ＶＨ」（ａＶＨ）また「活性ＶＬ」（ａＶＬ）は、その「活性」同種パートナー、すなわちＶＬまたはＶＨと対になると、その標的抗原に特異的に結合することが可能であるものである。
対照的に、本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合することが可能であるＣＤ３結合ドメインを指す。この用語は、２つの文脈、（ａ）その同種パートナーと対になり、ＣＤ３に特異的に結合することが可能である、Ｆｖ結合対の単一メンバー（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）を指す場合、及び（ｂ）ＣＤ３に特異的に結合することが可能な配列の同種の対（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）で使用される。例示的な「活性」ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ／ＶＬ対は、野生型または親配列である。
「ＣＤ－ｘ」は、分化クラスター（ＣＤ）タンパク質を指す。例示的な実施形態では、ＣＤ－ｘは、本発明のポリペプチド構築物が投与された対象におけるＴ細胞の動員または活性化に関与するＣＤタンパク質から選択される。例示的な実施形態では、ＣＤ－ｘは、ＣＤ３である。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、例えば、ＥＧＦＲ及びＣＤ３のそれぞれに（特異的に）結合する／それと相互作用する／それを認識するドメインを特徴付ける。標的抗原結合ドメイン（ＥＧＦＲを認識する）の構造及び機能、また好ましくはＣＤ３結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能は、抗体、例えば、ｓｄＡＢＤを含む完全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明によると、標的抗原結合ドメインは概して、標的腫瘍抗原に結合する３つのＣＤＲの存在によって特徴付けられる（概して、当該技術分野において可変重ドメインと称されるが、対応する軽鎖ＣＤＲは、存在しない）。あるいは、ＴＴＡに対するＡＢＤは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含むことができる。ＣＤ３結合ドメインは好ましくは、標的結合を可能にする抗体の少なくとも最小の構造要件も含む。より好ましくは、ＣＤ３結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。例示的な実施形態では、標的抗原及び／またはＣＤ３結合ドメインが、ファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング方法によって産生されるか、または取得可能であることが想定される。
本明細書で使用される場合、「ドメイン」とは、本明細書で概説されるように、機能を有するタンパク質配列を意味する。本発明のドメインは、腫瘍標的抗原結合ドメイン（ＴＴＡドメイン）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、リンカードメイン、及び半減期延長ドメインを含む。
本明細書の「ドメインリンカー」とは、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合するアミノ酸配列を意味する。ドメインリンカーは、開裂性リンカー、拘束開裂性リンカー、非開裂性リンカー、拘束非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなどであり得る。
本明細書の「ヒンジリンカー」とは、本明細書で概説されるような、あるドメインをＦｃドメインのヒンジ領域を結合するアミノ酸配列を意味する。ヒンジリンカーは、開裂性リンカー、拘束開裂性リンカー、非開裂性リンカー、拘束非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなどであり得る。
本明細書の「開裂性リンカー」（「ＣＬ」）とは、本明細書で概説されるように、プロテアーゼ、好ましくは罹患組織におけるヒトプロテアーゼによって開裂され得るアミノ酸配列を意味する。開裂性リンカーは概して、少なくとも３アミノ酸長であり、必要な柔軟性に応じて、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のアミノ酸が本発明で使用される。
本明細書の「非開裂性リンカー」（「ＮＣＬ」）とは、正常な生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって開裂することができないアミノ酸配列を意味する。
本明細書の「開裂性拘束リンカー」または「拘束開裂性リンカー」（「ＣＣＬ」）とは、２つのドメインが、それらが異なるポリペプチド鎖上に存在するまで、例えば、開裂後まで互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合するプロテアーゼ開裂部位（本明細書で定義されるような）を含有する、短いポリペプチドを意味する。ＣＣＬが本明細書で定義されるようなＶＨ及びＶＬドメインと結合する場合、ＶＨ及びＶＬは、分子内での立体障害により、開裂前に自己集合して機能的Ｆｖを形成することができない。関連するプロテアーゼによって開裂すると、ＶＨ及びＶＬは集合して、分子間で活性抗原結合ドメインを形成することができる。一般に、ＣＣＬは、１０アミノ酸長未満であり、９、８、７、６、５、及び４つのアミノ酸が本発明で使用される。一般に、プロテアーゼ開裂部位は概して、図１１Ａ、図１１Ｂ、及び図１１Ｃに示されるように、十分な特異性を与えるために少なくとも４＋アミノ酸長である。
本明細書の「非開裂性拘束リンカー」（「ＮＣＣＬ」）または「拘束非開裂性リンカー」（「ＣＮＣＬ」）とは、２つのドメインが互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合し、生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって有意に開裂されない、短いポリペプチドを意味する。
本明細書の「拘束Ｆｖドメイン」とは、活性重及び軽可変ドメインが分子内で相互作用して、ＣＤ３などの抗原に結合する活性Ｆｖを形成することができない方法で、本明細書で概説されるような拘束リンカーと共有結合した、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含むＦｖドメインを意味する。したがって、拘束Ｆｖドメインは、ｓｃＦｖと同様であるが、拘束リンカーの存在により抗原に結合することが可能ではないものである。
本明細書の「偽Ｆｖドメイン」とは、ドメインリンカー（開裂性、拘束、非開裂性、非拘束などであり得る）を使用して連結された、（ｉ）偽もしくは不活性可変重ドメイン及び偽もしくは不活性可変軽ドメイン、（ｉｉ）偽もしくは不活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメイン、または（ｉｉｉ）活性可変重ドメイン及び偽もしくは不活性可変軽ドメインを含むドメインを意味する。偽ＦｖドメインのＶＨｉ及びＶＬｉドメインは、互いと会合したとき（ＶＨｉ／ＶＬｉ）、または活性ＶＨまたはＶＬと会合したときのいずれかにおいてヒト抗原に結合せず、したがって、ＶＨｉ／ＶＬｉ、ＶＨｉ／ＶＬ、及びＶＬｉ／ＶＨ Ｆｖドメインは、ヒトタンパク質にはっきりと結合せず、これにより、これらのドメインは、ヒト体内で非活性である。
本明細書の「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、概して本明細書で考察されるようなｓｃＦｖリンカーを使用して可変軽（ＶＬ）ドメインに共有結合されて、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重（ＶＨ）ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端配向のいずれかであり得る（ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ）。
本明細書の「単一ドメインＦｖ」、「ｓｄＦｖ」、「単一ドメイン抗体」、または「ｓｄＡＢＤ」とは、概してラクダ抗体技術に基づき、３つのＣＤＲのみを有する抗原結合ドメインを意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：１１２９－３５（１９９４）、Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７４：２７７－３０２（２００１）、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８２：７７５－９７（２０１３）を参照されたい。
「プロテアーゼ開裂部位」とは、プロテアーゼによって認識及び開裂されるアミノ酸配列を指す。好適なプロテアーゼ開裂部位は、以下で概説される。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ開裂ドメイン」は、「プロテアーゼ開裂部位」、ならびに個々のプロテアーゼ開裂部位間、及びプロテアーゼ開裂部位（複数可）と本発明の構築物の他の機能的構成成分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨｉ、ＶＬｉ、標的抗原結合ドメイン（複数可）、半減期延長ドメインなど）との間の任意のリンカーを組み込むペプチド配列を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。ＩｇＧについて、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（ＣＨ２及びＣＨ３）、ならびに任意選択的に、Ｃγ１（ＣＨ１）とＣγ２（ＣＨ２）との間のヒンジ領域の全部または一部を含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けにおいて、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２３１～４４７を含み、ヒンジは、２１６～２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義は、アミノ酸２３１～４４７（ＣＨ２－ＣＨ３）または２１６～４４７（ヒンジドメイン－ＣＨ２－ＣＨ３）の両方を含む。
ＩＩＩ．本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、様々な方法で一緒に連結された、本明細書において概してドメインと称される多くの異なる構成成分を有する。ドメインのうちのいくつかは、各々が標的抗原（例えば、ＴＴＡまたは例えば、ＣＤ３）に結合する結合ドメインである。それらが２つ以上の抗原に結合するため、それらは、本明細書において「多重特異性」と称され、例えば、本発明のプロドラッグ構築物は、図１に示されるように、ＴＴＡ及びＣＤ３に結合し得、したがって、「二重特異性」である。本発明のタンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第１の抗原結合ドメインがＥＧＦＲに結合し、第２の抗原結合ドメインがＥｐＣＡＭに結合し、抗ＣＤ３結合ドメインが存在する場合、これは、「三重特異性」分子である。
本発明のタンパク質は、腫瘍標的抗原結合ドメイン、半減期延長ドメイン、リンカーなど、本明細書で概説されるような様々な方法で配置されたＣＤ３抗原結合ドメインを含むことができる。
いくつかの実施形態では、第１の腫瘍標的抗原結合ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原結合ドメインが、同じ腫瘍標的抗原に結合するように、第１のタンパク質は、第１の腫瘍標的抗原結合ドメインを含み、第２のタンパク質は、第２の腫瘍標的抗原結合ドメインを含む。ある特定の場合では、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインは、同じ腫瘍標的抗原の異なるエピトープ、領域、または部分に結合する。場合によっては、第１の腫瘍標的抗原ドメイン及び第２の腫瘍標的抗原ドメインは、異なる腫瘍標的抗原に結合する。
本発明のタンパク質は、細胞内での共発現及び共精製によって産生されて、ＣＤ３及び腫瘍標的抗原に結合することができる相補的なタンパク質対を得ることができる。いくつかの実施形態では、相補的なタンパク質対の各々は、別々に精製される。いくつかの実施形態では、相補的なタンパク質対の各々は、同時にまたは付随して精製される。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、相補的なタンパク質対の１つのタンパク質をコードする核酸配列と、相補的なタンパク質対のもう一方のタンパク質をコードする核酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、そのような発現ベクターを含む。場合によっては、そのような宿主細胞を培養培地において好適な条件下で培養して、タンパク質を産生することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のタンパク質を培養培地に分泌するのに好適な条件下で培養される。ある特定の実施形態では、本発明の分泌タンパク質を含む培養培地を精製して、相補的なタンパク質対のタンパク質を得る。有用な精製方法には、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、ヘパリン結合、逆相クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＣＨＴクロマトグラフィー親和性クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどが含まれるが、これらに限定されない。
Ａ．ＣＤ３抗原結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合遺伝子複合体、ＭＨＣにおいて提示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面上に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含む、タンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）及びβ（ベータ）鎖ならびにＣＤ－ζ（ゼータ）すべてと会合して、Ｔ細胞受容体複合体を含む。ＣＤ３に結合するＦｖドメインなどによるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化をもたらす。
しかしながら、当該技術分野において既知であるように、ＣＤ３活性化は、多くの毒性副作用を引き起こす可能性があり、したがって、本発明は、後に本発明のプロドラッグポリペプチドを開裂して活性ＣＤ３結合ドメインを提供する特定のプロテアーゼが見つかる、腫瘍細胞の存在下でのみ、本発明のポリペプチドの活性ＣＤ３結合を提供することに関する。したがって、本発明において、抗ＣＤ３ ＦｖドメインのＣＤ３への結合は、高いレベルのプロテアーゼを有する罹患細胞または組織の微小環境においてのみ、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍微小環境において、ＣＤ３ ＦｖドメインのＣＤ３への結合を制限するプロテアーゼ開裂ドメインによって調節される。
したがって、本発明は、ＶＨ及びＶＬドメインの２つのセット、活性セット（ＶＨ及びＶＬ）ならびに不活性セット（ＶＨｉ及びＶＬｉ）を提供し、４つすべてが、プロドラッグ構築物（複数可）中に存在する。構築物は、ＶＨ及びＶＬセットが自己会合することができず、むしろ不活性パートナー、例えば、本明細書に示されるようなＶＨｉ及びＶＬならびにＶＬｉ及びＶＨと会合するように形式設定される。
本発明で使用される、当該技術分野において既知である多くの好適な活性ＣＤＲセット、及び／またはＶＨ及びＶＬドメインが存在する。例えば、ＣＤＲ及び／またはＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ－６６またはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、及びＷＴ－３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する活性Ｆｖドメインを形成するＶＨ及びＶＬ配列は、ＣＤ３ ＶＨ（配列番号１８６）及びＣＤ３ ＶＬ（配列番号１７０）として図２Ａ～２Ｂに示される。
不活性ＶＨｉ及びＶＬｉドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域（ＦＲ）を含有し、これにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、ＣＤ３に結合できないようにする。一実施形態では、不活性ドメインの一方または両方が相補的構築物対で存在するときに、不活性Ｆｖドメインを形成するＶＨｉ及びＶＬｉ。一実施形態では、不活性ドメインの一方または両方が存在するときに不活性Ｆｖドメインを形成するＶＨｉ及びＶＬｉが、ＶＨｉ（配列番号１９０）及びＶＬｉ（配列番号１７４）として図２Ａ～２Ｂに示される。一実施形態では、不活性ドメインの一方または両方が存在するときに不活性Ｆｖドメインを形成するＶＨｉ２及びＶＬｉ２が、ＶＨｉ２（配列番号１９４）及びＶＬｉ２（配列番号１７８）として図２Ａ～２Ｂに示される。一実施形態では、不活性ドメインの一方または両方が存在するときに不活性Ｆｖドメインを形成するＶＨＧＬ４及びＶＬｉＧＬが、ＶＨｉＧＬ４（配列番号１９８）及びＶＬｉＧＬ（配列番号１８２）として図２Ａ～２Ｂに示される。
いくつかの実施形態では、不活性ＶＨｉドメインは、活性ＶＬドメインと対になったときに、その対になったＶＨｉ－ＶＬドメインが標的抗原に結合することができない状態にする１つ以上の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸挿入、欠失、または置換）を含む。他の実施形態では、不活性ＶＬｉドメインは、活性ＶＨドメインと対になったときに、その対になったＶＨ－ＶＬｉが標的抗原に結合することができない状態にする１つ以上の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、またはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば、アミノ酸挿入、欠失、または置換）を含む。
当業者によって理解されるように、本発明で使用される多くの「不活性」可変ドメインが存在する。基本的に、どんなアミノ酸が可変領域内のＣＤＲ位置にあろうと、別の可変ドメインとの自己集合を可能にするヒトフレームワーク領域を有する任意の可変ドメインが使用され得る。明確にするために、不活性ドメインは、ＣＤＲを含むと言われているが、技術的に、不活性可変ドメインは結合能力を与えない。
場合によっては、不活性ドメインは、プロドラッグ形式で選択的結合を促進して、開裂前の分子内ＶＨｉ－ＶＬ及びＶＨ－ＶＬｉドメインの形成を（例えば、分子間対形成よりも）促すように操作され得る。例えば、参照によりその全体が、特に界面残基アミノ酸置換に関して本明細書に明示的に組み込まれるＩｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３（８）：６６７－６７７（２０１０）を参照されたい。
一態様では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されるとＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。一態様では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されるとヒトＣＤ３に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されるとＣＤ３εに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化されるとＣＤ３εに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂部位は、第１のモノマー上の抗ＣＤ３活性ＶＨドメインと不活性ＶＬドメインとの間にあり、それらをＴ細胞上のＣＤ３へのフォールディング及び結合から防ぐ。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂部位は、第２のモノマー上の抗ＣＤ３不活性ＶＨドメインと活性ＶＬドメインとの間にあり、それらをＴ細胞上のＣＤ３へのフォールディング及び結合から防ぐ。いったんプロテアーゼ開裂部位が標的細胞に存在するプロテアーゼによって開裂されると、第１のモノマーの抗ＣＤ３活性ＶＨドメイン及び第２のモノマーの抗ＣＤ３活性ＶＬドメインは、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との強力なＣＤ３結合親和性を示すだけではなく、個々のカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。場合によっては、ポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。ある特定の場合では、ＣＤ３に対するヒト：カニクイザＫＤ比率は、５～０．２である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが挙げられるが、これらに限定されない、ＣＤ３に結合する任意のドメインであり得る。場合によっては、ＣＤ３結合ドメインが、抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて使用するために、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化またはヒト結合ドメインを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つすべての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、及び／または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つすべての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、例えば、１つ以上の、例えば３つすべてのＬＣ ＣＤＲ及び１つ以上の、例えば３つすべてのＨＣ ＣＤＲを含むヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。ある特定の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、λ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、κ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインが、ヒト化または完全ヒトである。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルＣＤ３との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
一実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むＦｖである。一実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３つの修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）であるが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域、及び／あるいは本明細書に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３つの修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）であるが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換、挿入、及び欠失）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向、軽鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－軽鎖可変領域のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤでの、ＣＤ３発現細胞上でのＣＤ３への親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤでのＣＤ３εへの親和性を有する。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性、すなわち、約１００ｎＭ以上を有する。
ＣＤ３への結合親和性は、例えば、当該技術分野において既知であるように、概してＢｉａｃｏｒｅまたはＯｃｔｅｔアッセイを使用して、抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインがアッセイプレート上でコーティングされた、微生物細胞表面上に提示された、溶液中などのＣＤ３に結合する能力によって決定され得る。ＣＤ３に対する本開示の抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインの結合活性は、リガンド（例えば、ヒトＣＤ３）または抗原結合タンパク質自体もしくはそのＣＤ３結合ドメインをビーズ、基質、細胞などに固定化することによってアッセイされ得る。薬剤は、適切な緩衝液中で添加され得、結合パートナーは、所与の温度で一定期間インキュベートされ得る。未結合材料を除去するための洗浄後、結合タンパク質は、例えば、高いｐＨのＳＤＳ緩衝液などで放出され、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析され得る。
Ｂ．腫瘍標的抗原に対する抗原結合ドメイン
記載されるＣＤ３及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、１つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する少なくとも１つもしくは少なくとも２つ、またはそれ以上のドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりＣＤ３結合ドメインをＴ細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、ＴＴＡ結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、Ｔ細胞誘導として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも１つの標的抗原が、疾患、障害、または状態に関与及び／または関連している。例示的な標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病に関連したものを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体に関連している。少なくとも１つの標的抗原はまた、健康な組織に向けられ得る。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質、またはポリサッカライドなどの細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性細胞上にある。２つ以上の標的抗原に結合すると、２つの不活性ＣＤ３結合ドメインが共局在化され、標的細胞の表面上に活性ＣＤ３結合ドメインを形成することが、本明細書において企図される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質内の不活性ＣＤ３結合ドメインを活性化するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合の強度を増強するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合の強度を増強するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、同じ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、異なる抗原結合ドメインを含む。例えば、罹患細胞または組織、例えば、腫瘍またはがん細胞において二重に発現されることが知られている２つの異なる抗原結合ドメインは、標的に対する抗原結合タンパク質の結合または選択性を増強することができる。
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの標的抗原に結合する。標的抗原は、場合によっては、罹患細胞または組織、例えば、腫瘍またはがん細胞の表面上に発現される。標的抗原としては、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ－３）、ｃ－Ｍｅｔ、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９またはＣＡＩＸ）、及び腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ２）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される構築物の１つ、２つ、またはそれ以上の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９に結合する。
本明細書に開示されるポリペプチド構築物はまた、罹患細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質を含む。抗原結合ドメインの例示的な対としては、ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１、ＥＧＦＲ／Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ／ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ／ＢＣＭＡ、ＦＯＬＲ１／Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２／ＥＧＦＲ、Ｔｒｏｐ２／ＥＰＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２／Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２／ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２／ＣＡ９、ＣＡ９／ＥＧＦＲ、ＣＡ９／ＥＰＣＡＭ、ＣＡ９／Ｂ７Ｈ３、ＣＡ９／ＦＯＬＲ１などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のポリペプチド構築物の設計は、標的抗原への結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの結合ドメインであり得るという点で、１つ以上の標的抗原への結合ドメインが柔軟であることを可能にする。いくつかの実施形態では、標的抗原への結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びラクダ由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、標的抗原への結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、抗体模倣物、例えば、アンチカルリン、アフィン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィティン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディである。さらなる実施形態では、１つ以上の標的抗原への結合ドメインは、１つ以上の標的抗原に結合またはそれと会合するリガンド、受容体ドメイン、レクチン、またはペプチドである。
いくつかの実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは、独立して、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、または標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＬｙＰＤ３、ＣＡ９、ＣＥＡ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、及びＴｒｏｐ２のうちの少なくとも１つから選択される抗原に特異的に、かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、２つの異なる抗原に特異的に、かつ独立して結合し、抗原のうちの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＬｙＰＤ３、ＣＥＡ ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９のうちの１つから選択される。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９のうちの少なくとも１つから選択される抗原に特異的に、かつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、２つの異なる抗原に特異的に、かつ独立して結合し、抗原のうちの少なくとも１つは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９のうちの１つから選択される。
多くの実施形態では、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に対する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、ラクダ単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢＤ）に基づく単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）である。ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、従来の抗体と同じようなフレームワーク領域ならびに３つのＣＤＲを有するが、いずれの重鎖定常ドメインも有しない。ＣＤ３に結合しない不活性Ｆｖの形成をもたらす分子内フォールディングは、より少ないＶＨ及びＶＬドメインではあまり複雑ではないため、これらのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは概して、ＴＴＡに結合するｓｃＦｖよりも好ましい。これらのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、それらが結合する標的によって標識され得、例えば、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、ヒトＥＧＦＲに結合するｓｄＡＢＤであるなどである。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５０に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ１として示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５０に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ１として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５０に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ１として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５４に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５４に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５４に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５８に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ１として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５８に記載されるかまたは図１Ａ中にヒト化抗ＥＧＦＲ１として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号５８に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ１として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号６２に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２ａ ｓｄＡｂとして示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号６２に記載されるかまたは図１Ａ中にヒト化抗ＥＧＦＲ２ａとして示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。様々な実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号６２に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２ａとして示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号６６に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２ｄとして示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号６６に記載されるかまたは図１Ａ中にヒト化抗ＥＧＦＲ２ｄとして示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。様々な実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合し、配列番号６６に記載されるかまたは図１Ａ中に抗ＥＧＦＲ２ｄとして示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７０に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ７７－２として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７０に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ７７－２として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７０に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ７７－２として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７４に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ５９．３として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７４に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ５９．３として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７４に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ５９．３として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７８に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ２２－４として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７８に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ２２－４として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１に結合し、配列番号７８に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗ＦＯＬＲ１ ｈ２２－４として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号８２に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号８２に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号８２に記載されるかまたは図１Ｂ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号８６に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号８６に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号８６に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、Ｂ７Ｈ３に結合するＡＢＤは、Ｎ結合型グリコシル化部位を除去するように修飾される。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、Ｎ５７Ｑ、Ｎ５７Ｅ、Ｎ５７Ｄ、Ｓ５９Ａ、及びＳ５９Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を含む、親抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２ ｓｄＡＢ（配列番号８６）の抗Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡｂ変異体を含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９０に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｑ）として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９０に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｑ）として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９０に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｑ）として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９４に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｅ）として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９４に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｅ）として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９４に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｅ）として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９８に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｄ）として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９８に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｄ）として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号９８に記載されるかまたは図１Ｃ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｄ）として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号１０２に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ａ）として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号１０２に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ａ）として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号１０２に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ａ）として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号１０６に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ｙ）として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号１０６に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ｙ）として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｂ７Ｈ３に結合し、配列番号１０６に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ｙ）として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１０に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈ１３として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１０に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈ１３として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１０に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈ１３として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、未開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂは、未開裂及び開裂ＥｐＣＡＭに結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１４に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈ２３として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１４に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈ２３として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１４に記載されるかまたは図１Ｄ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈ２３として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、未開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂは、未開裂及び開裂ＥｐＣＡＭに結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１８に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６５として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１８に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６５として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１１８に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６５として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、未開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂは、未開裂及び開裂ＥｐＣＡＭに結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１２２に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６６として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１２２に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６６として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに結合し、配列番号１２２に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６６として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、未開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質は、開裂ＥｐＣＡＭに結合する抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂは、未開裂及び開裂ＥｐＣＡＭに結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１２６に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５５７として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１２６に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５５７として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１２６に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５５７として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３０に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５６５として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３０に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５６５として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３０に記載されるかまたは図１Ｅ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５６５として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３４に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７５として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３４に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７５として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３４に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７５として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３８に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７８として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３８に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７８として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１３８に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７８として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１４２に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６０９として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１４２に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６０９として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１４２に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６０９として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１４６に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６１９として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１４６に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６１９として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｔｒｏｐ２に結合し、配列番号１４６に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６１９として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５０に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４５６として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５０に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４５６として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５０に記載されるかまたは図１Ｆ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４５６として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５４に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４７６として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５４に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４７６として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５４に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４７６として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５８に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４０７として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５８に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４０７として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１５８に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４０７として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１６２に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４４５として示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１６２に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４４５として示されるアミノ酸配列のヒト化型を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＡ９に結合し、配列番号１６２に記載されるかまたは図１Ｇ中に抗ＣＡ９ ｈＶＩＢ４４５として示される配列のＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂前のタンパク質は、約１００ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂後のタンパク質は、約２５～約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を超えるサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織浸透を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織分布を有する。
Ｃ．半減期延長
本発明のタンパク質は、任意選択的に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃ領域、小分子、及び当該技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
１．Ｆｃ領域
本発明のタンパク質は、抗体のＦｃ領域を、本明細書で概説されるような追加の構成成分と組み合わせるＦｃドメイン融合タンパク質を含み、これには、ＴＴＡに対するＡＢＤ、及びＦｖドメイン、概して、本明細書で概説されるような偽ドメインが含まれる。
本明細書に記載されるヘテロ二量体Ｆｃタンパク質のノブインホール形式は、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利に働く「立体的影響」を生み出すアミノ酸置換（複数可）を指す。場合によっては、ノブインホール形式は、ジスルフィド結合または荷電アミノ酸置換の対と組み合わせて、ヘテロ二量体形成にさらに有利に働くことができる。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質は、Ｆｃ領域内のノブまたはホールのいずれかを含むＦｃアームを含む。換言すれば、第１の単量体Ｆｃアームは、ノブを含み、第２の単量体Ｆｃアームは、ホールを含む。「構築物６」または「構築物７」の実施形態では、活性Ｆｖドメイン（例えば、抗ＣＤ３可変重鎖及び可変軽鎖）を含有する単量体Ｆｃアームは、ＣＨ３ノブを含み、偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性可変重鎖及び不活性可変軽鎖）を含有する単量体Ｆｃアームは、ＣＨ３ホールを含むが、これは、逆にすることもできる。他の実施形態では、活性Ｆｖドメインを含有する単量体Ｆｃアームは、ＣＨ３ホールを含み、偽Ｆｖドメインを含有する単量体Ｆｃアームは、ＣＨ３ノブを含む。
ノブ形成のためのアミノ酸残基は、概して、天然に存在するアミノ酸残基であり、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、アミノ酸残基は、トリプトファン及びチロシンである。一実施形態では、ノブ形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなどの小さい側鎖体積を有する。ノブを形成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、またはＦ４０５Ｗ置換が挙げられるが、これらに限定されない。
穴を形成するためのアミノ酸残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ホール形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きい側鎖体積を有する。ホールを生成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｔ、及びＹ４０７Ｖ置換が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ノブは、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、ホールは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換を含む。
一般に、本明細書で使用するための好ましいＦｃドメインは、ヒトＩｇＧドメインであり、概して、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかである。場合によっては、例えば、エフェクター機能が望ましくない場合、ＩｇＧ４が使用され、場合によっては、Ｓ２２８Ｐ変異体がアーム交換を防止するため、ヒンジドメイン内にこれを含有する。
ヘテロ二量体化を促進する当該技術分野において既知のＦｃ領域に対する他の修飾もまた、本出願によって企図及び包含されることが理解される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の形式のＦｃ領域は、ヒスチジンタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６））、ストレプトアビジンタグ（例えば、ｓｔｒｅｐ－ｔａｇもしくはＳｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ）、またはＦｃのＣ末端におけるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグなどであるが、これらに限定されないタグを含む。
加えて、Ｆｃドメインは、当該技術分野において既知であるように、エフェクター機能または半減期を改変するための追加のアミノ酸修飾を含有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の形式のＦｃ領域は、図１７Ａ～１８Ｃ及び図２０Ａ～２０Ｂに示される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号３６（Ｐｒｏ５５６）、配列番号３７（Ｐｒｏ５５７）、配列番号３８（Ｐｒｏ５８７）、配列番号３９（Ｐｒｏ５８８）、配列番号４０（Ｐｒｏ５８９）、配列番号４１（Ｐｒｏ５７４）、配列番号４２（Ｐｒｏ５７５）、配列番号４３（Ｐｒｏ５７６）、配列番号４４（Ｐｒｏ５８４）、配列番号４５（Ｐｒｏ５８５）、配列番号４６（Ｐｒｏ５８６）、配列番号４７（Ｐｒｏ６８８）、配列番号４８（Ｐｒｏ６８９）、及び配列番号４９（Ｐｒｏ６９０）で提供される。
２．ヒト血清アルブミン結合ドメイン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子質量約６７ｋＤａ）は、約５０ｍｇ／ｍＬ（６００μＭ）で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約２０日間の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役割を果たす。
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命タンパク質の消失半減期を延長する。例えば、Ｆａｂフラグメントへのアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、Ｆａｂフラグメント単独の投与と比較して、マウス及びウサギのそれぞれに静脈内投与されたときに、２５～５８倍の低減されたインビボクリアランス及び２６～３７倍の半減期延長をもたらした。別の例では、インスリンが脂肪酸でアシル化されてアルブミンとの会合を促進する場合、ウサギまたはブタに皮下注射されたときに持続的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続性作用との間のつながりを実証した。
一態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが挙げられるが、これらに限定されない、ＨＳＡに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）、例えば、ＨＳＡに特異的なラクダ由来ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び可変ドメイン（ＶＨＨ）である。ある特定の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢＤ）に由来し、単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）を含み、すなわち、ｓｄＡＢＤは、従来の抗体のＦｖにおける標準的な６つのＣＤＲではなく、３つのＣＤＲを含有する単一可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、ペプチドである。さらなる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、小分子である。抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインが、かなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。ある特定の場合では、ＨＳＡ結合ドメインは、それがペプチドまたは小分子である場合、５ｋＤ以下である。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、抗原結合タンパク質自体の改変した薬力学及び薬物動態を提供する。上記の通り、半減期延長ドメインは、消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはまた、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の改変を含む、薬理学的特性を改変させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインなしのタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散、及び増強した有効性を提供する。一実施形態では、治療法は、低減した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の低減などの副作用の低減をもたらす。
さらに、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡ結合ドメインの特徴は、ＨＳＡに対するＨＳＡ結合ドメインの結合親和性を含む。ＨＳＡ結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特定の消失半減期を標的とするように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、高い結合親和性を有する。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ～１００ｎＭ（中）、及び１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度を含む。上記の通り、ＨＳＡへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
Ｄ．プロテアーゼ開裂部位
本発明のポリペプチド（例えば、タンパク質）組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
本明細書に記載されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、少なくとも１つのプロテアーゼによって開裂されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロテアーゼ開裂部位を含む。場合によっては、本明細書に記載のタンパク質は、少なくとも１つのプロテアーゼによって開裂される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。本明細書でより十分に考察されるように、２つ以上のプロテアーゼ開裂部位がプロドラッグ構築で使用される場合、それらは同じであっても（例えば、単一プロテアーゼによって開裂される複数の部位）、異なっていてもよい（２つ以上の開裂部位が少なくとも２つの異なるプロテアーゼによって開裂される）。当業者によって理解されるように、３つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する構築物は、１、２、３個などを利用することができ、例えば、いくつかの構築物は、２つの異なるプロテアーゼに対して３つの部位などを利用することができる。
プロテアーゼ開裂部位のアミノ酸配列は、標的とされるプロテアーゼに依存する。当該技術分野において既知であるように、体内で見つかり、疾患状態に関連し得る多くのヒトプロテアーゼが存在する。
プロテアーゼは、いくつかの罹患細胞及び組織、例えば腫瘍またはがん細胞によって分泌され、プロテアーゼが豊富である微小環境またはプロテアーゼに富んだ微小環境を作り出すことが既知である。場合によっては、対象の血液は、プロテアーゼが豊富である。場合によっては、腫瘍を包囲する細胞が、プロテアーゼを腫瘍微小環境中に分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を包囲する細胞としては、腫瘍間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、間葉系幹細胞多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、プロテアーゼ、例えば、微生物ペプチドで見られるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは、対象の血液中に存在する。この特徴は、標的細胞または組織のプロテアーゼに富んだ微小環境を除いて、Ｔ細胞が抗原結合タンパク質によって結合されないため、抗原結合タンパク質などの標的化治療薬がさらなる特異性を有することを可能にする。
プロテアーゼは、場合によっては、配列特異的な方法でタンパク質を開裂するタンパク質である。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ（例えば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｅ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＳ）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ＫＬＫ７、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第ＸＡ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニジン、ブロメライン、カルパイン、Ｃａｓｐａｓｅｓ（例えば、Ｃａｓｐａｓｅ－３）、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、メプリン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの好適なプロテアーゼ及びプロテアーゼ開裂配列が、配列番号２１０～２８１として記載され、図３Ａ～３Ｄに示される。
Ｅ．リンカー
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは、同様に柔軟性または非柔軟性（例えば、立体障害）を含む機能性、ならびに原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
本発明は、２つ以上のドメインを結合するために使用される「ドメインリンカー」を提供する（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨまたはＶＬに対する標的腫瘍抗原結合ドメイン（ＴＴＡＢＤ、本明細書において「αＴＴＡ」（「抗ＴＴＡ」に対して）と称されるときもある）、別の構成成分に対する半減期延長ドメインなど）。ドメインリンカーは、例えば、非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、開裂性リンカー（「ＣＬ」）、開裂性及び拘束リンカー（ＣＣＬ）、ならびに非開裂性及び拘束リンカー（ＮＣＣＬ）であり得る。いくつかの実施形態では、拘束リンカーは、２つのドメインが互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合し、生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって有意に開裂されない、１０個未満のアミノ酸（例えば、９、８、７、６、５、または４つのアミノ酸）の短いポリペプチドである。一般に、プロテアーゼ開裂部位は概して、図３Ａ～３Ｄ、１４Ａ～１４Ｇ、１６Ａ～Ｇ、１７Ａ～１７Ｃ、１８Ａ～１８Ｃ、及び２０Ａ～２０Ｂに示されるように、十分な特異性を与えるために少なくとも４＋アミノ酸長である。
１．非開裂性リンカー
一実施形態では、ドメインリンカーは、非開裂性リンカー（ＮＣＬ）である。この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインを通して、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチド中のドメインに連結するのに好適な内部の非開裂性リンカーの例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１６７）、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号１６８）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（配列番号１６９）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２８４）が挙げられるが、これらに限定されず、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。当業者によって認識される任意の非開裂性ドメインリンカーが、本明細書に記載のホモ二量体及びヘテロ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎ、「拘束非開裂性リンカー」または「ＣＮＣＬ」である。例えば、Ｐｒｏ２１９及びＰｒｏ２１７において、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＶＨ及びＶＬが活性抗原結合ドメインに分子内で自己集合することを可能にしない８アミノ酸（「８ｍｅｒ」）によって分離され、むしろ、腫瘍プロテアーゼによる開裂まで、Ｐｒｏ２１８での分子内集合が代わりに起こる。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２）である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１６７、１６８、１６９、２８２、２８３、及び２８４からなる群から選択される配列のうちのいずれか１つを含む。
２．開裂性リンカー
本明細書のプロドラッグ構築物のすべては、少なくとも１つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性（ＣＬ）であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」（「ＰＣＤ」）と称されるときもある。この実施形態では、ＣＬは、本明細書で概説されるように、かつ図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ、ならびに対応する配列表に示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、ＣＬは、プロテアーゼ開裂部位飲みを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、ＣＬのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方にさらに数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に１、２、３、４、または５～８つのアミノ酸が存在し得る。
ＩＶ．発現方法
本発明は、本発明のヘテロ二量体タンパク質の２つのモノマー、ならびに発現ベクター及び宿主細胞をコードする核酸を提供する。当業者によって理解されるように、１つまたは２つの発現ベクターのいずれかが作製され得る。すなわち、第１のモノマーをコードする第１の核酸及び第２のモノマーをコードする第２の核酸が、単一発現ベクターまたは２つの発現ベクターに入れられ得る。次いで、発現ベクター（複数可）が宿主細胞に入れられ、これらは、２つのモノマーが発現されるように増殖する。場合によっては、これは概して好ましくないが、各モノマーは、別個の宿主細胞内で産生され、次いで、発現産物を組み合わされて、本発明のヘテロ二量体プロドラッグタンパク質を形成することができる。
しかしながら、ほとんどの実施形態は、２つのモノマーの共発現の使用に依存する。すなわち、細胞（例えば、宿主細胞）内で共発現し、共精製して、第１の単量体Ｆｃポリペプチド及び第２の単量体Ｆｃポリペプチドを得ることよって、本発明のタンパク質を産生するための方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、相補的なタンパク質対（例えば、第１の単量体Ｆｃポリペプチド及び第２の単量体Ｆｃポリペプチド）は、約等モル比（例えば、約１：１の比率）で産生される。他の実施形態では、相補的なタンパク質対（例えば、第１の単量体Ｆｃポリペプチド及び第２の単量体Ｆｃポリペプチド）は、等モルではない比率（例えば、約１：１の比率ではない）で産生される。換言すれば、本明細書に記載の方法は、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００などであるが、これらに限定されない第１のポリペプチド対第２のポリペプチドの比率を得るために使用され得る。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または発現ベクター）の特定の量が細胞内で発現されて、所望の量のポリペプチドを産生することができる。いくつかの実施形態では、第１の単量体Ｆｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量、及び細胞に導入（例えば、トランスフェクト、電気穿孔、形質導入など）される第２の単量体Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は、同じである。例えば、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、約１：１の比率で細胞に導入され得る。他の実施形態では、第１の単量体Ｆｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド（または第１の発現ベクター）の量、及び細胞に導入される第２の単量体Ｆｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド（または発現ベクター）の量は、異なる。例えば、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０などであるが、これらに限定されない比率で細胞に導入され得る。
ポリペプチドの発現ベクターは、細胞による所望の比率でのポリペプチドの産生を可能にする１つ以上の構成成分（例えば、プロモーター、制御因子、エンハンサーなど）を含み得る。場合によっては、第１の単量体Ｆｃポリペプチドの第１の発現ベクターは、第２のポリペプチドの第２の発現ベクターの発現レベルと比較して、ベクターの発現レベルを増加させる構成成分を含む。他の場合において、第２の単量体Ｆｃポリペプチドの第２の発現ベクターは、第１の単量体Ｆｃポリペプチドの第１の発現ベクターの発現レベルと比較して、ベクターの発現レベルを増加させる構成成分を含む。特定の場合において、第１の単量体Ｆｃポリペプチドの第１の発現ベクターは、ベクターの発現レベルが、第２の単量体Ｆｃポリペプチドの第２の発現ベクターの発現レベルと同じであるような構成成分を含む。
場合によっては、本明細書に記載の核酸は、例えば、哺乳動物細胞内での、本開示の二重特異性の条件的に有効なタンパク質の産生を提供する。本開示の第１及び／または第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写調節因子、例えばプロモーター、及びエンハンサーなどに作動可能に連結され得る。
好適なプロモーター及びエンハンサー要素は、当該技術分野において既知である。細菌細胞内での発現について、好適なプロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、及びｔｒｃが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞内での発現について、好適なプロモーターとしては、軽鎖及び／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサー要素、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスからの長い末端反復に存在するプロモーター、ＥＦ－１ａ、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ならびに様々な当技術分野において既知の組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質、例えば、本明細書に記載のプロドラッグ構築物をコードする核酸またはヌクレオチド配列は、発現ベクター及び／またはクローニングベクター中に存在し得る。タンパク質、例えば、プロドラッグ構築物が２つの別個のポリペプチドを含む場合、２つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別個のベクター中でクローニングされ得る。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、ならびにベクターの複製及び／または維持を提供する他の特徴を含むことができる。好適な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
発現ベクターは概して、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主内で作動する選択可能なマーカーが存在し得る。好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスに基づくウイルスベクター、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ ９４／１２６４９、ＷＯ ９３／０３７６９、ＷＯ ９３／１９１９１、ＷＯ ９４／２８９３８、ＷＯ ９５／１１９８４、及びＷＯ ９５／００６５５を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７）を参照されたい）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照されたい）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスに由来するベクター）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、タンパク質、例えば、本開示のプロドラッグ構築物を産生するように修飾される哺乳動物細胞を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、トランスフェクション、電気穿孔、ウイルス感染などであるが、これらに限定されない当業者に既知の任意の方法を使用して哺乳動物細胞に導入され得る。
好適な哺乳動物細胞としては、一次細胞及び不死化細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが挙げられる。好適な哺乳動物細胞株としては、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＥＫ２９３細胞、ｅｘｐｉ２９３細胞、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ－７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。標的タンパク質をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。
細菌中のポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉ中の抗体フラグメントの発現について記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）。発現後、Ｆｃ融合タンパク質は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株を含む、糸状菌または酵母などの真核微生物は、好適なクローニングまたは発現宿主である。例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００４，２２：１４０９－１４１４、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００６，２４：２１０－２１５を参照されたい。
植物細胞培養物もまた、宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号を参照されたい。
グリコシル化タンパク質の発現に好適な宿主細胞もまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が特定されている。
いくつかの実施形態では、宿主細胞または安定した宿主細胞株は、細胞によって産生及び分泌されるポリペプチドの量に従って選択される。宿主細胞または安定した宿主細胞株は、本明細書に記載のプロドラッグ組成物を産生及び分泌することができる。場合によっては、好適な細胞は、等モル比（例えば、約１：１の比率）の、本明細書に記載の第１のポリペプチドのうちのいずれか１つ及び第２のポリペプチドのうちのいずれか１つを産生し得る。他の実施形態では、好適な細胞は、非等モル比（例えば、１：１とは異なる比率）の、第１の単量体Ｆｃポリペプチドのうちのいずれか１つ及び第２の単量体Ｆｃポリペプチドのうちのいずれか１つを産生する。
Ｖ．本発明の例示的な形式
当業者によって理解されるように、プロドラッグ組成物を形成する２つのモノマーを含むヘテロ二量体タンパク質組成物は、多様な形式をとることができる。重要なことは、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインが各々、開裂後にｓｄＡＢＤ－ＴＴＡに関連付けられて終わることである。すなわち、概して、１つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、非開裂性ドメインリンカーを介して活性可変重ドメインに連結され、１つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、非開裂性ドメインリンカーを介して活性可変軽ドメインに連結される。これにより、活性ＣＤ３ ＡＢＤが腫瘍細胞表面上で形成され得ることが確実になる。いったん開裂が生じ、不活性ＶＨ及びＶＬが解離すると、ａＶＨ及びａＶＬが分子間会合して、１つ以上の活性ＣＤ３ ＡＢＤを形成する。
本明細書で提供される構築物及び形式のすべてについて、例えば、すべて図１３に示されるような、多くの異なる構成成分、例えば、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、開裂部位、ａＶＨ及びａＶＬドメイン、ｉＶＨ及びｉＶＬドメイン、ならびにＦｃドメインは、各形式において「混合及び適合」され得る。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－ＧＦＰに対する抗原結合ドメイン－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図４を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－ＧＦＰに対する抗原結合ドメイン－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどであるが、これらに限定されないタグを含むが、これは概して、患者に投与される実際のプロドラッグ分子には使用されない。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ホール形式を有するＣＨ２－ＣＨ３を含むｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ）－ＮＣＬ－活性ＶＬ－ＣＬ－ＶＨｉ－ｓｄＡＢＤ－ＮＣＬ－Ｆｃ領域を含む第１の単量体Ｆｃと、ノブ形式を有するＣＨ２－ＣＨ３を含むｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ）－ＮＣＬ－活性ＶＨ－ＣＬ－ＶＬｉ－ＮＣＬ－Ｆｃ領域を含む第２の単量体Ｆｃとを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１４Ａに示されるように、Ｐｒｏ３７（配列番号２）及びＰｒｏ３６（配列番号１）を含む。Ｐｒｏ３７のアミノ酸配列が、図１４Ａに示される。Ｐｒｏ３７のアミノ酸配列が、図１４Ａに示される。
また、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図５を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図５に示されるように、Ｐｒｏ３８及びＰｒｏ３６を含む。Ｐｒｏ３６のアミノ酸配列が、図１４Ａに示される。Ｐｒｏ３８のアミノ酸配列が、図１４Ｂに示される。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図７を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１４Ａ～１４Ｂに示されるように、Ｐｒｏ６８（配列番号５）及びＰｒｏ６７（配列番号４）を含む。Ｐｒｏ６８は、Ｐｒｏ３７に類似しているが、ＧＦＰに結合するｓｄＡＢＤ、またはＣＨ２ドメインに付着したドメインリンカーを含まない。Ｐｒｏ６７は、Ｐｒｏ３６に類似しているが、ＣＨ２ドメインに付着したドメインリンカーを含まない。Ｐｒｏ６８のアミノ酸配列が、図１４Ｃに示される。Ｐｒｏ６７のアミノ酸配列が、図１４Ｂに示される。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃノブ－開裂性リンカー－ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）を含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図８を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－Ｆｃホールを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃノブ－開裂性リンカー－ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）を含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１４Ｃ～１４Ｄに示されるように、Ｐｒｏ６９（配列番号６）及びＰｒｏ７０（配列番号７）を含む。Ｐｒｏ７０は、Ｃ末端に付着したＰｒｏ９構築物を有するＰｒｏ６７に類似している。Ｐｒｏ６９のアミノ酸配列が、図１４Ｃに示される。Ｐｒｏ７０のアミノ酸配列が、図１４Ｄに示される。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカーＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）を含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図９を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカーＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）を含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃノブを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１４Ｂ及び図１４Ｄに示されるように、Ｐｒｏ７１（配列番号８）及びＰｒｏ６７（配列番号４）を含む。Ｐｒｏ７１は、Ｃ末端に付着したＰｒｏ９構築物を有するＰｒｏ６９に類似している。Ｐｒｏ６７は、ＣＨ２ドメインに付着したドメインリンカーのないＰｒｏ３６に類似している。Ｐｒｏ７１のアミノ酸配列が、図１４Ｄに示される。Ｐｒｏ６７のアミノ酸配列が、図１４Ｂに示される。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－開裂性リンカー－Ｆｃノブを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃホールを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図１１を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン）－開裂性リンカー－Ｆｃノブを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－開裂性リンカー－Ｆｃホールを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１１に示されるように、Ｐｒｏ２１９（配列番号９または１６）及びＰｒｏ２１８（配列番号１１）を含む。Ｐｒｏ２１８のアミノ酸配列が、図１４Ｅに示される。Ｐｒｏ２１９のアミノ酸配列が、図１４Ｅに示される。いくつかの実施形態では、第１の単量体Ｆｃ構成成分は、図１５Ａ及び図１６Ａ～１６Ｃならびに配列番号１６～２１に示されるように、Ｐｒｏ２１９、Ｐｒｏ２１９ｂ、Ｐｒｏ２１９ｃ、Ｐｒｏ２１９ｄ、Ｐｒｏ２１９ｅ、及びＰｒｏ２１９ｆに提供されるものなどであるが、これらに限定されないＡＢＤを含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－Ｆｃノブを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃホールを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（図１２を参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－Ｆｃノブを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチド、及び（Ｎ末端からＣ末端に）抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－開裂性リンカー－Ｆｃホールを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチド。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、図１２に示されるように、Ｐｒｏ２１７（配列番号９または２２）及びＰｒｏ２１８（配列番号１０）を含む。Ｐｒｏ２１８のアミノ酸配列が、図１４Ｅに示される。Ｐｒｏ２１７のアミノ酸配列が、図１４Ｅに示される。いくつかの実施形態では、第１の単量体Ｆｃ構成成分は、図１５Ｂ～１５Ｃ及び図１６Ｃ～１６Ｇならびに配列番号２２～３５に示されるように、Ｐｒｏ２１７、Ｐｒｏ２１７ｂ、Ｐｒｏ２１７ｃ、Ｐｒｏ２１７ｄ、Ｐｒｏ２１７ｅ、Ｐｒｏ２１７ｆ、Ｐｒｏ２１７ｇ、Ｐｒｏ２１７ｈ、Ｐｒｏ２１７ｉ、Ｐｒｏ２１７ｊ、Ｐｒｏ２１７ｋ、Ｐｒｏ２１７ｌ、Ｐｒｏ２１７ｍ、及びＰｒｏ２１７ｎに提供されるものなどであるが、これらに限定されないＡＢＤを含む。
ヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物のＴＴＡに対するＡＢＤは、ＴＴＡに結合する単一ドメイン抗体であり得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢＤ）は、ＥＧＦＲに対するｓｄＡＢＤ、ＥｐＣＡＭに対するｓｄＡＢＤ、別の標的腫瘍抗原に対するｓｄＡＢＤである。ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質のいくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤは、同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤは、同じＴＴＡに結合する。他の実施形態では、第１の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤは、異なるＴＴＡに結合する。他の場合において、第１の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤ及び第２の単量体ＦｃのｓｄＡＢＤは、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、図１Ａ～１Ｇの配列番号５０～１６９に記載される任意のｓｄＡＢＤのＣＤＲ及び／または可変ドメインを有する。
ＣＤ３結合ドメインのいくつかの実施形態では、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＣＤ３ ＶＨ及びＣＤ３ ＶＬの配列を有し、ＶＨｉ及びＶＬｉは、図２Ａ～２ＢのＣＤ３ ＶＨｉ及びＣＤ３ ＶＬｉの配列を有する。ＣＤ３結合ドメインのいくつかの実施形態では、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＣＤ３ ＶＨ及びＣＤ３ ＶＬの配列を有し、ＶＨｉ及びＶＬｉは、図２Ａ～２ＢのＣＤ３ ＶＨｉ２及びＣＤ３ ＶＬｉ２の配列を有する。ＣＤ３結合ドメインのいくつかの実施形態では、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＣＤ３ ＶＨ及びＣＤ３ ＶＬの配列を有し、ＶＨｉ及びＶＬｉは、図２Ａ～２ＢのＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４及びＣＤ３ ＶＬｉＧＬの配列を有する。場合によっては、第１の単量体Ｆｃタンパク質の偽Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＬ－リンカー－ＶＨｉまたはＶＨｉ－リンカー－ＶＬのいずれかの、開裂性リンカーを使用して連結されたＶＬ及びＶＨｉを含むことができる。いくつかの実施形態では、偽Ｆｖドメインは、ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４－ＣＬ－ｖｈｉＦＲ１－ｖｈｉＣＤＲ１－ｖｈｉＦＲ２－ｖｈｉＣＤＲ２－ｖｈｉＦＲ３－ｖｈｉＣＤＲ３－ｖｈｉＦＲ４の構造（Ｎ末端からＣ末端に）を有する。他の場合において、偽Ｆｖドメインは、ｖｈｉＦＲ１－ｖｈｉＣＤＲ１－ｖｈｉＦＲ２－ｖｈｉＣＤＲ２－ｖｈｉＦＲ３－ｖｈｉＣＤＲ３－ｖｈｉＦＲ４－ＣＬ－ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４の構造（Ｎ末端からＣ末端に）を有する。いくつかの実施形態では、第２の単量体Ｆｃタンパク質の偽Ｆｖドメインは、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬｉまたはＶＬｉ－リンカー－ＶＨのいずれかの、開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬｉを含むことができる。場合によっては、偽Ｆｖドメインは、ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＬ－ｖｌｉＦＲ１－ｖｌｉＣＤＲ１－ｖｌｉＦＲ２－ｖｌｉＣＤＲ２－ｖｌｉＦＲ３－ｖｌｉＣＤＲ３－ｖｌｉＦＲ４の構造（Ｎ末端からＣ末端に）を有する。他の場合において、偽Ｆｖドメインは、ｖｌｉＦＲ１－ｖｌｉＣＤＲ１－ｖｌｉＦＲ２－ｖｌｉＣＤＲ２－ｖｌｉＦＲ３－ｖｌｉＣＤＲ３－ｖｌｉＦＲ４－ＣＬ－ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４の構造（Ｎ末端からＣ末端に）を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、拘束リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る）を使用して供給結合された活性ＶＨドメイン及び活性ＶＬドメインを含む、拘束Ｆｖドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でＶＨとＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束Ｆｖドメインは、可変ドメイン内に含有された６つのＣＤＲのセットを含み、ＶＨのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合し、ＶＬのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合するが、プロドラッグ形式（例えば、未開裂）では、ＶＨ及びＶＬは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができない。
拘束Ｆｖドメインは、活性ＶＨ及び活性ＶＬ（ＶＨａ及びＶＬａ）、または不活性ＶＨ及びＶＬ（ＶＨｉ及びＶＬｉ）を含むことができる。当業者によって理解されるように、拘束活性Ｆｖドメイン中のＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。本明細書で概説されるように、拘束活性Ｆｖドメインは、Ｐｒｏ２１９またはＰｒｏ２１７として示されるものなどの場合、非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬを含むことができる。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＣＬ－ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４の構造（Ｎ末端からＣ末端に）を有する。この実施形態では、ＣＤＲ及び／または可変ドメインは、それぞれ配列番号１８６及び１７０として提供される活性ＣＤ３ ＶＨ及び活性ＣＤ３ＶＬのものである。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドと、を含む、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（Ｐｒｏ５５６など、図１７Ａを参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５５６及びＰｒｏ５５６を含む。Ｐｒｏ５５６のアミノ酸配列が、図１７Ａに示される。図１９に示されるデータは、ホモ二量体Ｐｒｏ５５６構築物の条件付け及び活性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ホモ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－非開裂性リンカー（ＮＣＬ－１５）－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－非開裂性リンカー（ＮＣＬ－１５）－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドと、を含む、非開裂性ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（Ｐｒｏ５５７など、図１７Ａを参照されたい）が、本明細書に提供される。そのようなホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、非開裂性対照として作用し得る。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５５７及びＰｒｏ５５７を含む。Ｐｒｏ５５７のアミノ酸配列が、図１７Ａに示される。ホモ二量体Ｐｒｏ５５７プロドラッグ構築物は、プロテアーゼによって開裂されない。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ホモ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドと、を含む、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（Ｐｒｏ５８７など、図１７Ｂを参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５８７及びＰｒｏ５８７を含む。Ｐｒｏ５８７のアミノ酸配列が、図１７Ｂに示される。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ホモ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドと、を含む、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（Ｐｒｏ５８８など、図１７Ｂを参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５８８及びＰｒｏ５８８を含む。Ｐｒｏ５８８のアミノ酸配列が、図１７Ｂに示される。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ホモ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃドメインを含む第１の単量体Ｆｃポリペプチドと、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン）－Ｆｃドメインを含む第２の単量体Ｆｃポリペプチドと、を含む、ホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質（Ｐｒｏ５８９など、図１７Ｃを参照されたい）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、そのようなホモ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５８９及びＰｒｏ５８９を含む。Ｐｒｏ５８９のアミノ酸配列が、図１７Ｃに示される。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ホモ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ドメインリンカー（ヒンジリンカー）－Ｆｃホールドメインを含む第１の単量体Ｆｃホールポリペプチド（例えば、Ｐｒｏ５７４など、図１８Ａを参照されたい）と、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン、または活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメインのいずれか）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン、または不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメインのいずれか）－Ｆｃノブドメインを含む第２の単量体Ｆｃホールポリペプチド（例えば、Ｐｒｏ５７５など、図１８Ａを参照されたい）と、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７４の第１の単量体Ｆｃ－ホールポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５またはＰｒｏ５７６の第２の単量体Ｆｃ－ノブポリペプチドを含む。Ｐｒｏ５７４のアミノ酸配列が、図１８Ａに示される。Ｐｒｏ５７５のアミノ酸配列が、図１８Ａに示される。Ｐｒｏ５７６のアミノ酸配列が、図１８Ｂに示される。Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５７６のアミノ酸配列は、同一である。いくつかの実施形態では、Ｐｒｏ５７５をコードする核酸配列は、Ｐｒｏ５７６をコードする核酸配列とは異なる。いくつかの実施形態では、Ｐｒｏ５７５をコードする核酸配列は、Ｐｒｏ５７６をコードする核酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメイン）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメイン）－Ｆｃノブドメインを含む第１の単量体Ｆｃ－ノブポリペプチド（例えば、Ｐｒｏ５７５など、図１８Ａ、及びＰｒｏ５７６など、図１８Ｂを参照されたい）と、（Ｎ末端からＣ末端に）ＴＴＡに対するＡＢＤ－ドメインリンカー－拘束抗ＣＤ３ Ｆｖドメイン（例えば、活性ＶＬドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＨドメイン、または活性ＶＨドメイン－非開裂性拘束リンカー（ＮＣＣＬ）－活性ＶＬドメインのいずれか）－ＴＴＡに対するＡＢＤ－開裂性リンカー－抗ＣＤ３偽Ｆｖドメイン（例えば、不活性ＶＨドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＬドメイン、または不活性ＶＬドメイン－非開裂性リンカー－不活性ＶＨドメインのいずれか）－Ｆｃホールドメインを含む第２の単量体Ｆｃ－ホールポリペプチドと、を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第２の単量体ＦｃポリペプチドのＣ末端は、（Ｈｉｓ）１０タグまたはＳｔｒｅｐ－ＩＩタグなどのタグが挙げられるが、これらに限定されないタグを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５またはＰｒｏ５７６の第１の単量体Ｆｃ－ノブポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５８４、Ｐｒｏ５８５、及びＰｒｏ５８６からなる群から選択される第２の単量体Ｆｃ－ホールポリペプチドを含む。Ｐｒｏ５７５のアミノ酸配列が、図１８Ａに示される。Ｐｒｏ５７６のアミノ酸配列が、図１８Ｂに示される。Ｐｒｏ５８４のアミノ酸配列が、図１８Ｂに示される。Ｐｒｏ５８５のアミノ酸配列が、図１８Ｃに示される。Ｐｒｏ５８６のアミノ酸配列が、図１８Ｃに示される。いくつかの実施形態では、ＴＴＡに対するＡＢＤのいずれかが、ヘテロ二量体Ｆｃタンパク質で使用され得る。一実施形態では、ｓｄＡＢＤは、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５７４を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８４を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８５を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７５及びＰｒｏ５８６を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５７４を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８４を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８５を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合プロドラッグタンパク質は、Ｐｒｏ５７６及びＰｒｏ５８６を含む。
ＶＩ．本発明の追加の実施形態
一態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、（ａ）第１のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）ドメインリンカー、（ｉｉｉ）拘束Ｆｖドメインであって、（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）拘束非開裂性リンカー、ならびに（３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインを含む拘束Ｆｖドメイン、（ｉｖ）第１の開裂性リンカー、ならびに（ｖ）第１のＦｃドメインを含む第１のモノマーと、（ｂ）第２のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）偽Ｆｖドメインであって、（１）偽可変重ドメイン、（２）非開裂性リンカー、及び（３）偽可変軽ドメインを含む偽Ｆｖドメイン、（ｉｉ）第２の開裂性リンカー、及び（ｉｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２のモノマーと、を含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、拘束Ｆｖドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下で、ヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、第１の開裂性リンカーのＮ末端で第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメインをさらに含む。
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を含む。
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。ある特定の場合において、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を含む。
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じである。ある特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
様々な実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ２１７及びＰｒｏ２１８、Ｐｒｏ２１９及びＰｒｏ２１８、配列番号９及び１０、または配列番号１０及び１１のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、（ａ）第１のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第１のドメインリンカー、（ｉｉｉ）第１の偽Ｆｖドメインであって、（１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、（２）第１の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変重ドメインを含む第１の偽Ｆｖドメイン、ならびに（ｉｖ）第１のＦｃドメインを含む第１のモノマーと、（ｂ）第２のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）第２の偽Ｆｖドメインであって、（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）第２の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変軽ドメインを含む第２の偽Ｆｖドメイン、ならびに（ｉｖ）第１のＦｃドメインを含む第２のモノマーとを含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、第１の偽Ｆｖドメインの可変軽ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの可変重ドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下で、ヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
ある特定の実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーをさらに含む。様々な実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーを含み、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーを含む。
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を含む。
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を含む。
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じである。ある特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ３６及びＰｒｏ３７、Ｐｒｏ３６及びＰｒｏ３８、Ｐｒｏ６７及びＰｒｏ６８、配列番号１及び２、配列番号１及び３、または配列番号４及び５のアミノ酸配列を含む。
本発明のさらに別の態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、（ａ）第１のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメイン、及び（ｉｉ）第１のＦｃドメインを含む第１のモノマーと、（ｂ）第２のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）ドメインリンカー、（ｉｉｉ）第１の偽Ｆｖドメインであって、（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）第１の開裂性リンカー、及び（３）偽可変軽ドメイン含む第１の偽Ｆｖドメイン、（ｉｖ）第２のＦｃドメイン、（ｖ）第２の開裂性リンカー、（ｖｉ）第３の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第３の抗原結合ドメイン、ならびに（ｖｉｉ）第２の偽Ｆｖドメインであって、（１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、（２）第３の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変重ドメインを含む第２の偽Ｆｖドメインを含む第２のモノマーとを含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、第１の偽Ｆｖドメインの可変重ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの可変軽ドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下で、ヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
ある特定の実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーをさらに含む。様々な実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーを含み、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーを含む。
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を含む
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。様々な場合において、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を含む。
ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、偽重ドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、偽軽ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じである。ある特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡ、第２のＴＴＡ、及び／または第３のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。場合によっては、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９から選択される。他の場合において、第１のＴＴＡは、ＥｐＣＡＭである。場合によっては、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９から選択される。他の場合において、第２のＴＴＡは、ＥｐＣＡＭである。ある特定の場合において、第３のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９から選択される。
ある特定の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第２のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ、第２のＴＴＡ、及び第３のＴＴＡは、同じである。特定の実施形態では、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第２のＴＴＡ及び第３のＴＴＡ、または第１のＴＴＡ、第２のＴＴＡ、及び第３のＴＴＡは、異なる。
様々な実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、第３の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。他の実施形態では、第１、第２、及び／または第３の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ６９及びＰｒｏ７０または配列番号６及び７のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、（ａ）第１のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第１のＦｃドメイン、（ｉｉｉ）第１の開裂性リンカー、（ｉｖ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメイン、（ｖ）第１のドメインリンカー、ならびに（ｖｉ）第１の偽Ｆｖドメインであって、（１）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメイン、（２）第２の開裂性リンカー、（３）偽可変重ドメインを含む第１の偽Ｆｖドメインを含む第１のモノマーと、（ｂ）第２のモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）第２の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第２の抗原結合ドメイン、（ｉｉ）第２のドメインリンカー、（ｉｉｉ）第２の偽Ｆｖドメインであって、（１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、（２）第３の開裂性リンカー、ならびに（３）偽可変軽ドメインを含む第２の偽Ｆｖドメイン、ならびに（ｉｖ）第２のＦｃドメインを含む第２のモノマーとを含み、第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、第１の偽Ｆｖドメインの可変軽ドメイン及び第２の偽Ｆｖドメインの可変重ドメインが、開裂性リンカーにおける開裂の非存在下で、ヒトＣＤ３に結合しない、ヘテロ二量体タンパク質組成物が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーをさらに含む。様々な実施形態では、第１のモノマーは、第１のＦｃドメインのＮ末端に第１のヒンジリンカーを含み、第２のモノマーは、第２のＦｃドメインのＮ末端に第２のヒンジリンカーを含む。
ある特定の実施形態では、可変重鎖は、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、可変重ドメインは、ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を含む。
いくつかの実施形態では、可変軽ドメインは、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む。様々な場合において、可変軽ドメインは、ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を含む。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。他の実施形態では、第２のＴＴＡは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される。特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、同じである。ある特定の場合において、第１のＴＴＡ及び第２のＴＴＡは、異なる。
いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、ＭＭＰ９の開裂部位を含有する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の開裂性リンカーは、メプリンの開裂部位を含有する。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、Ｐｒｏ６７及びＰｒｏ７１または配列番号４及び８のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つの第１のモノマーをコードする核酸が、本明細書に提供される。本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つの第２のモノマーをコードする核酸も提供される。加えて、第１のモノマーをコードする核酸を含む発現ベクター、第２のモノマーをコードする核酸を含む発現ベクター、または第１のモノマーをコードする核酸及び第２のモノマーをコードする核酸を含む発現ベクターが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される発現ベクターのうちのいずれか１つを含む宿主細胞が、本明細書に提供される。
本発明の一態様では、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つを作製する方法が提供される。方法は、本明細書に記載の宿主細胞を、ヘテロ二量体タンパク質を発現する条件下で培養することと、ヘテロ二量体タンパク質を回収することとを含む。
本発明の一態様では、本発明のヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれか１つを患者に投与することを含む、がんを治療する方法が提供される。
本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物は、同種プロテアーゼによる開裂の非存在下でプロドラッグ組成物と称され得る。
別の態様では、本明細書に記載の任意のプロドラッグ組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とするヒト対象においてそれを行う方法が、本明細書に提供される。
ＶＩＩ．実施例
Ａ．実施例１：プロ構築物の構築及び精製
トランスフェクション
各構築物対を、別個の発現ベクター（ｐｃｄｎａ３．４誘導体）から発現した。半ＣＯＢＲＡの対をコードした等量のプラスミドＤＮＡを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ×２５’）及び濾過（０．２ｕＭフィルタ）によって、トランスフェクションの５日後に採取した。タンパク質発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。構築物を精製し、最終緩衝液組成物は、２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース、ｐＨ７であった。最終調製物を－８０℃で保存した。
プロテアーゼ開裂
ＥＫ
組み換えヒトエンテロキナーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１５８５－ＳＥ－０１０）を使用して、本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグタンパク質を開裂した。組み換えプロテアーゼを製造業者の手順に従って活性化し、約１００ｍＭのストック濃度で調製した。
試験試料（Ｐｒｏ３６＋３７、Ｐｒｏ３６＋３８、Ｐｒｏ６７＋６８、Ｐｒｏ６９＋７０、Ｐｒｏ６７＋７１、Ｐｒｏ２１７＋２１８、及びＰｒｏ２１８＋２１９）を、塩化カルシウム（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２）とともにＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に緩衝液交換し、１０ｎＭの最終濃度で適切なプロテアーゼとともに一晩室温でインキュベートした。開裂をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
ＭＭＰ－９
ＭＭＰ９の活性化：組み換えヒトＭＭＰ９を以下のプロトコルに従って活性化した。組み換えヒトＭＭＰ－９（Ｒ＆Ｄ ＃９１１－ＭＰ－０１０）は、０．４４ｍｇ／ｍＬ（４．７ｕＭ）であった。酢酸ｐ－アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ Ｂｒｉｊ－３５であった。
－ｒｈＭＭＰ９をアッセイ緩衝液で約１００ｕｇ／ｍＬに希釈する（２５ｕＬのｈＭＭＰ９＋７５ｕＬのアッセイ緩衝液）
－ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックからの酢酸ｐ－アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を、１ｍＭ（１ｕＬ～１００ｕＬ）の最終濃度になるように添加する。
－３７℃で２４時間インキュベートする
－ＭＭＰ９を１０ｎｇ／ｕＬに希釈する（９００ｕＬのアッセイ緩衝液を１００ｕＬの活性化溶液に添加する）
活性化ｒｈＭＭＰ９の濃度は、約１００ｎＭである。
ＴＤＣＣアッセイのための構築物の開裂
構築物を開裂するために、製剤緩衝液（２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ－アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース）中１ｍｇ／ｍＬの濃度（１０．５ｕＭ）の１００ｕＬのタンパク質試料に、最大１０ｍＭのＣａＣｌ２を供給した。活性化ｒｈＭＭＰ９を２０～３５ｎＭの濃度になるまで添加した。試料を室温で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。開裂の完全性を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（１０～２０％ ＴＧ、ＴＧ泳動用緩衝液、２００ｖ、１時間）を使用して検証した。試料を典型的には９８％開裂した。
Ｂ．実施例２：活性化ヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグタンパク質の効力を試験するためのＴ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）アッセイ
ホタルルシフェラーゼ形質導入ＨＴ－２９細胞を約８０％密集度まで成長させ、Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＰＢＳ－Ｃａ－Ｍｇ中０．４８ｍＭのＥＤＴＡ）で分離した。細胞を遠心分離し、ＴＤＣＣ培地（ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びβ－メルカプトエタノールを有するＲＰＭＩ １６４０中の５％熱失活ＦＢＳ）中に再懸濁した。精製したヒトＰａｎ－Ｔ細胞を解凍、遠心分離、及びＴＤＣＣ培地中に再懸濁した。
ＨＴ－２９＿Ｌｕｃ細胞及びＴ細胞の共培養を３８４ウェル細胞培養プレートに添加した。次いで、連続希釈したＣＯＢＲＡを共培養に添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、等体積のＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、２０分間インキュベートした。プレートを０．１秒／ウェルの曝露時間でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎにおいて読み取った。全発光を記録し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７で分析した。
上記のアッセイを使用して、活性化（開裂）ヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグタンパク質がＴ細胞に関与し、標的陽性腫瘍細胞に細胞溶解を向けるときに誘発される特異的細胞傷害性の割合を試験した。
図３Ａ及び図３Ｂは、Ｐｒｏ３６＋３７及びＰｒｏ３６＋３８などのいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによる開裂時に低い条件付けを示したか、または条件付けの欠如を示したことを示す。
図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃは、Ｐｒｏ６７＋６８及びＰｒｏ６９＋７０などのいくつかの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付けを示したが、高い活性を欠いていたことを示す。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、Ｐｒｏ２１７＋２１８及びＰｒｏ２１８＋２１９などの例示的なヘテロ二量体Ｆｃプロドラッグ構築物が、ＴＤＣＣアッセイにおいて同種プロテアーゼによって開裂されたときに条件付け及び高い効力を示したことを示す。
本明細書に記載のプロドラッグ構築物は、融合タンパク質と同等の方法でプロテアーゼ開裂時にＥＧＦＲ誘発がん細胞死滅に対する単一ドメイン抗体を含有し、ＥＧＦＲに対する単一ドメイン抗体及び抗ＣＤ３ Ｆｖドメインを含む。
Ｃ．実施例３：養子Ｔ細胞移入モデル
ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に腫瘍細胞株を皮下移植した。ヒトＴ細胞を、陰性選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介してｌｅｕｋｏｐａｋから単離し、Ｔ細胞増殖／活性化ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を利用したＧ－Ｒｅｘ技術（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）を利用して増殖した。いったん腫瘍成長が確立されると、マウスを腫瘍体積に基づいて無作為化し、増殖したヒトＴ細胞を静脈内に移植し、試験試料を指示されたとおりに投与した。腫瘍体積を、キャリパー測定によって評価した。
使用した試験試料は、Ｐｒｏ５７４及びＰｒｏ５７５、ならびにＰｒｏ５７４及びＰｒｏ５７７であった（例えば、図２１を参照されたい）。ＣＯＢＲＡノブ－ホールＦｃタンパク質は、図２２に示されるように強力であった。ＭＭＰ９開裂ノブＰｒｏ ５７５と組み合わせた場合のＰｒｏ５７４（空のホール）は、Ｐｒｏ５７７と組み合わせたＰｒｏ５７４（ＮＣＬノブ対照）と比較して、強力であった。
Ｐｒｏ５７４／Ｐｒｏ５７５のヘテロ二量体Ｆｃタンパク質の投与は、養子Ｔ細胞移入モデルのＰｒｏ５７４／５７７（ＮＣＬ対照）と比較して、抗腫瘍応答を示した。
引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の特定の実施形態は、例示目的で上述されているが、詳細の多数の変形が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく行われ得ることが当業者によって理解されるであろう。

Claims (72)

  1. ホモ二量体タンパク質組成物であって、
    ａ）２つのモノマーであって、各々がＮ末端からＣ末端に、
    ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
    ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｉｉｉ）拘束Ｆｖドメインであって、
    １）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメインと、
    ２）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
    ３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインと、を含む、前記拘束Ｆｖドメインと、
    ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
    ｖｉ）開裂性リンカーと、
    ｖｉｉ）偽Ｆｖドメインであって、
    １）偽可変軽ドメインと、
    ２）非開裂性リンカーと、
    ３）偽可変重ドメインと、を含む、前記偽Ｆｖドメインと、
    ｖｉｉｉ）任意選択的な開裂性リンカーと、
    ｉｘ）Ｆｃドメインと、を含む、前記２つのモノマーを含み、
    前記可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記可変重ドメイン及び前記偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記可変軽ドメイン及び前記偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記ホモ二量体タンパク質組成物。
  2. 第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変軽ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項１に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  3. 前記第１の可変軽ドメインが、第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変軽ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項１に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  4. 前記第１の可変軽ドメインが、第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項１に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  5. 第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項１に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  6. 可変重鎖が、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、前記可変軽ドメインが、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  7. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  8. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  9. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  10. 前記ＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  11. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤが、同じＴＴＡに結合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  12. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤが、異なるＴＴＡに結合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  13. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、同じである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  14. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、異なる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  15. 前記ｓｄＡＢＤ（複数可）が、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  16. 第１の開裂性リンカー及び／または前記任意選択的な開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項１～１５のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  17. 各モノマーが、Ｐｒｏ５５６（配列番号３６）、Ｐｒｏ５８７（配列番号３８）、Ｐｒｏ５８８（配列番号３９）、及びＰｒｏ５８９（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のモノマーをコードする核酸を含む、核酸組成物。
  19. 請求項１８に記載の核酸を含む、発現ベクター組成物。
  20. 請求項１９に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
  21. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質を作製する方法であって、請求項２０に記載の宿主細胞を、前記ホモ二量体タンパク質を発現する条件下で培養することと、ヘテロ二量体タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
  22. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質を投与することを含む、がんを治療する方法。
  23. ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
    （ａ）第１のＦｃドメインを含む第１のＦｃモノマーと、
    （ｂ）第２のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
    ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
    ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｉｉｉ）拘束Ｆｖドメインであって、
    １）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメインと、
    ２）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
    ３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインと、を含む、前記拘束Ｆｖドメインと、
    ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
    ｖｉ）第１の開裂性リンカーと、
    ｖｉｉ）偽Ｆｖドメインであって、
    １）偽可変軽ドメインと、
    ２）非開裂性リンカーと、
    ３）偽可変重ドメインと、を含む、前記偽Ｆｖドメインと、
    ｖｉｉｉ）任意選択的な第２の開裂性リンカーと、
    ｉｘ）第２のＦｃドメインと、を含む、前記第２のＦｃモノマーと、を含み、
    前記第１のＦｃドメイン及び前記第２のＦｃドメインが、ノブインホール修飾を含み、前記可変重ドメイン及び前記可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記可変重ドメイン及び前記偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記可変軽ドメイン及び前記偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記ヘテロ二量体タンパク質組成物。
  24. 前記可変重ドメインが、前記可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変軽ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項２３に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  25. 前記可変重ドメインが、前記可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項２３に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  26. 前記可変軽ドメインが、前記可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変軽ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項２３に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  27. 前記可変軽ドメインが、前記可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項２３に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  28. 前記第１のＦｃドメインが、Ｆｃ－ホールドメインを含み、前記第２のＦｃドメインが、Ｆｃ－ノブドメインを含む、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  29. 可変重鎖が、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、前記可変軽ドメインが、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む、請求項２３～２８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  30. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  31. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  32. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  33. 前記ＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される、請求項２３～３２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  34. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤが、同じＴＴＡに結合する、請求項２３～３３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  35. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤが、異なるＴＴＡに結合する、請求項２３～３３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  36. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、同じである、請求項２３～３４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  37. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、異なる、請求項２３～３５のいずれか一項に記載のホモ二量体タンパク質組成物。
  38. 前記ｓｄＡＢＤ（複数可）が、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される、請求項２３～３７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  39. 前記開裂性リンカー及び／または前記任意選択的な開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項２３～３８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  40. 前記第１のＦｃモノマーが、Ｐｒｏ５７４（配列番号４１）及びＰｒｏ６８８（配列番号４７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３～３９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  41. 前記第２のＦｃモノマーが、Ｐｒｏ５７５（配列番号４２）、Ｐｒｏ５７６（配列番号４３）、及びＰｒｏ６８９（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３～４０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  42. Ｐｒｏ５７４＋Ｐｒｏ５７５、Ｐｒｏ５７４＋Ｐｒｏ５７６、Ｐｒｏ６８８＋Ｐｒｏ６８９、Ｐｒｏ５７４＋Ｐｒｏ６８９、Ｐｒｏ６８８＋Ｐｒｏ５７５、及びＰｒｏ６８８＋Ｐｒｏ５７６からなる群から選択されるヘテロ二量体タンパク質対のうちのいずれか１つを含む、請求項２３～４１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  43. （ａ）請求項２３～４２のいずれか一項に記載の第１のＦｃモノマーをコードする第１の核酸、及び／または（ｂ）請求項２３～４２のいずれか一項に記載の第２のＦｃモノマーをコードする第２の核酸を含む、核酸組成物。
  44. 請求項４３に記載の第１の核酸及び／または請求項４３に記載の第２の核酸を含む、発現ベクター組成物。
  45. 請求項４４に記載の発現ベクター組成物を含む、請求項２３～４１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物を発現するための宿主細胞。
  46. ヘテロ二量体タンパク質を作製する方法であって、請求項４５に記載の宿主細胞を、前記ヘテロ二量体タンパク質を発現する条件下で培養することと、前記ヘテロ二量体タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
  47. 請求項２３～４２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を投与することを含む、がんを治療する方法。
  48. ヘテロ二量体タンパク質組成物であって、
    （ａ）第１のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
    ｉ）第１の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
    ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｉｉｉ）第１の拘束Ｆｖドメインであって、
    １）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと、
    ２）第１の拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と、
    ３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインと、を含む、前記第１の拘束Ｆｖドメインと、
    ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｖ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
    ｖｉ）第１の開裂性リンカーと、
    ｖｉｉ）第１の偽Ｆｖドメインであって、
    １）第１の偽可変軽ドメインと、
    ２）非開裂性リンカーと、
    ３）第１の偽可変重ドメインと、を含む、前記第１の偽Ｆｖドメインと、
    ｖｉｉｉ）第１の任意選択的な開裂性リンカーと、
    ｉｘ）第１のＦｃ－ホールドメインと、を含む、前記第１のＦｃモノマーと、
    （ｂ）第２のＦｃモノマーであって、Ｎ末端からＣ末端に、
    ｉ）第３のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
    ｉｉ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｉｉｉ）第２の拘束Ｆｖドメインであって、
    １）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第２の可変重ドメインと、
    ２）第２のＣＮＣＬと、
    ３）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第２の可変軽ドメインと、を含む、前記第２の拘束Ｆｖドメインと、
    ｉｖ）任意選択的なドメインリンカーと、
    ｖ）第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
    ｖｉ）第２の開裂性リンカーと、
    ｖｉｉ）第２の偽Ｆｖドメインであって、
    １）第２の偽可変軽ドメインと、
    ２）非開裂性リンカーと、
    ３）第２の偽可変重ドメインと、を含む、前記第２の偽Ｆｖドメインと、
    ｖｉｉｉ）第２の任意選択的な開裂性リンカーと、
    ｉｘ）第２のＦｃ－ノブドメインと、を含む、前記第２のＦｃモノマーと、を含み、
    前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメイン、ならびに前記第２の可変重ドメイン及び前記第２の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記可変重ドメイン及び前記偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記可変軽ドメイン及び前記偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記ヘテロ二量体タンパク質組成物。
  49. 前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記第１の偽可変軽ドメインが、前記第１の偽可変重ドメインのＮ末端にあり、かつ／または前記第２の可変重ドメインが、前記第２の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記第２の偽可変軽ドメインが、前記第２の偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項４８に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  50. 前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記第１の偽可変軽ドメインが、前記第１の偽可変重ドメインのＮ末端にあり、かつ／または前記第２の可変軽ドメインが、前記第２の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記第２の偽可変軽ドメインが、第２の第１の偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項４８に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  51. 前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記第１の偽可変重ドメインが、前記第１の偽可変軽ドメインのＮ末端にあり、かつ／または前記第２の可変重ドメインが、前記第２の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記第２の偽可変重ドメインが、前記第２の偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項４８に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  52. 前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記第１の偽可変重ドメインが、前記第１の偽可変軽ドメインのＮ末端にあり、かつ／または前記第２の可変軽ドメインが、前記第２の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記第２の偽可変重ドメインが、前記第２の偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項４８に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  53. 可変重鎖が、配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、前記可変軽ドメインが、配列番号１７０のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  54. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９０のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  55. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  56. 前記偽可変重ドメインが、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、前記偽可変軽ドメインが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、請求項４８～５３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  57. 前記ＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、及びＣＡ９からなる群から選択される、請求項４８～５６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  58. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤが、同じＴＴＡに結合し、かつ／または前記第３及び前記第４のｓｄＡＢＤが、同じＴＴＡに結合する、請求項４８～５７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  59. 前記第１、前記第２、前記第３、及び前記第４のｓｄＡＢＤが、同じＴＴＡに結合する、請求項４８～５８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  60. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、同じであり、かつ／または前記第３及び前記第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、同じである、請求項４８～５９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  61. 前記第１及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、異なり、かつ／または前記第３及び前記第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが、異なる、請求項４８～５９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  62. 前記第１、前記第２、前記第３、及び前記第４のｓｄＡＢＤが、異なるＴＴＡに結合する、請求項４８～５７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  63. 前記ｓｄＡＢＤ（複数可）が、配列番号５０、５４、５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、及び１６６からなる群から選択される、請求項４８～６２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  64. 前記第１及び／または前記第２の開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項４８～６３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  65. 前記第１及び／または前記第２の任意選択的な開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項４８～６４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  66. 前記第１のＦｃモノマーが、Ｐｒｏ５８４（配列番号４４）、Ｐｒｏ５８５（配列番号４５）、及びＰｒｏ５８６（配列番号４６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４８～６５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  67. 前記第２のＦｃモノマーが、Ｐｒｏ５７５（配列番号４１２またはＰｒｏ５７６（配列番号４３）のアミノ酸配列を含む、請求項４８～６６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物。
  68. （ａ）請求項４８～６７のいずれかに記載の第１のモノマーをコードする第１の核酸、及び／または（ｂ）請求項４８～６７のいずれか一項に記載の第２のモノマーをコードする第２の核酸を含む、核酸組成物。
  69. 請求項６８に記載の第１の核酸及び／または請求項６８に記載の第２の核酸を含む、発現ベクター組成物。
  70. 請求項６９に記載の発現ベクター組成物を含む、請求項４７～６７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質組成物を発現するための宿主細胞。
  71. 請求項４８～６７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を作製する方法であって、請求項７０に記載の宿主細胞を、前記ヘテロ二量体タンパク質を発現する条件下で培養することと、前記ヘテロ二量体タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
  72. 請求項４８～６７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質を投与することを含む、がんを治療する方法。
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