CN117597145A - 使用约束性条件激活的结合蛋白的治疗方法 - Google Patents

使用约束性条件激活的结合蛋白的治疗方法 Download PDF

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CN117597145A
CN117597145A CN202280027408.0A CN202280027408A CN117597145A CN 117597145 A CN117597145 A CN 117597145A CN 202280027408 A CN202280027408 A CN 202280027408A CN 117597145 A CN117597145 A CN 117597145A
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C·梅
R·B·迪布瑞吉
M·维诺格拉多沃娃
A·潘沙尔
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明涉及条件性双特异性重导向的激活构建体或COBRA，其以活性前药格式施用。在暴露于肿瘤蛋白酶后，所述构建体被裂解并激活以使得其可结合两种肿瘤靶抗原(TTA)以及CD3，因此将表达CD3的T细胞募集至肿瘤中，从而实现治疗。

Description

使用约束性条件激活的结合蛋白的治疗方法
I.相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月6日提交的美国临时专利申请序列号63/171,556和2022年1月7日提交的美国临时专利申请序列号63/297,662的优先权，其公开内容出于所有目的特此以引用的方式整体并入。
II.参考“序列表”、表格或提交于光盘上的计算机程序列表附录。
包含在命名为“118459-5016-WO_ST25.txt”的文件中且大小为984千字节的序列表已特此以电子方式提交，并且所述txt文件的内容特此以引用的方式整体并入。
III.发明背景
多种临床环境中常常需要选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，癌症疗法的主要目标为特异性地破坏肿瘤细胞，同时使健康细胞和组织尽可能地保持完整且不受损坏。一种此类方法是通过诱导针对肿瘤的免疫反应以使诸如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫效应细胞攻击并破坏肿瘤细胞。
为肿瘤相关抗原提供优异的结合特异性和亲和力的完整的单克隆抗体(mAb)的使用已成功应用于癌症疗法和诊断领域。然而，完整mAb的较大尺寸、其较差的生物分布、低效力和血池中的长持久性约束了其临床应用。例如，完整抗体可在肿瘤区域内表现出特异性积聚。在生物分布研究中，当精确研究肿瘤时，注意到在周边区域中存在具有初级积聚的不均匀的抗体分布。由于肿瘤坏死、不均匀的抗原分布和增加之间质组织压力，完整的抗体构建体不可能到达肿瘤的中央部分。相比之下，较小的抗体片段显示出快速的肿瘤定位，更深地渗透至肿瘤中，并且还从血流中相对快速地去除。
然而，包括scFv和其他构建体的许多抗体显示出“在靶/脱肿瘤”效应，其中分子在非肿瘤细胞上具有活性，导致副作用，其中一些可能具有毒性。
已有效用于治疗血癌的一种免疫疗法形式利用针对肿瘤细胞和存在于T细胞上的CD3抗原两者均具有特异性的双特异性抗体。衔接T细胞的双特异性抗体具有两个不同的结合位点，一个特异性地靶向肿瘤细胞的表面上的抗原并且另一个结合T细胞的表面上的激活性受体。此类型的第一治疗性分子(称为双特异性T细胞衔接子)已经证实在体外和体内引导针对特异性靶细胞的细胞毒性T细胞反应中极其有效。参见例如Jitschin R.等人,JImmunother.Cancer,6:116(2018)；Huehls AM等人,Immunol Cell Biol.,93:290-96(2015)；Fu M.等人,Front.Immunol.,10:1396(2019)；和Dreier T.等人,J Immunol.,(170):4397-402(2003)。当所选的靶抗原仅表达于肿瘤细胞和非必需正常细胞上时，此策略已产生极有效的治疗性分子，如贝林妥欧单抗(blinatumomab)，其靶向某些B细胞白血病(和正常B细胞)的表面上的CD19抗原。参见例如Wu J.等人,J.Hematol.Oncol.,8:104(2015)；Goebeler ME等人,Leuk.Lymphoma,57:1021-32(2016)；和Bargou R.等人,Science,321:974-77(2008)。
然而，将此策略应用于治疗实体肿瘤更具挑战性，因为大多数实体肿瘤抗原还表达于必需的正常细胞上。参见例如Zhang S.等人,Clin.Cancer Res.4:2669-76(1998)；Silver DA等人,Clin.Cancer Res.3:81-85(1997)；Parkhurst MR等人,Mole.Ther.,19:620-26(2011)；Palmer DC等人,P.N.A.S.U.S.A 105:8061-66(2008)；和Cheever MA等人,Clin.Cancer Res.,15:5323-37(2009)。使此问题更复杂的是，由于间质压力高和治疗剂进入肿瘤的渗透性较差而需要向具有实体肿瘤的患者递送更高的剂量水平。参见例如Thurber GM等人,Adv.Drug Deliv.Rev.,60:1421-34(2008)；Minchinton和Tannock,Nat.Rev.Cancer,6:583-92(2006)；和Jain RK,Cancer Res.,50:814s-9s(1990)。
因此，如果治疗剂还靶向针对表达实体肿瘤抗原的正常细胞的细胞毒性T细胞反应，则可能在具有癌症的患者中不能递送有效的剂量。解决此问题的策略已包括设计可在肿瘤微环境(TME)中选择性激活的双特异性T细胞衔接前药。TME的若干生理特征使其与大多数正常组织不同。例如，肿瘤中的错乱型组织生长可导致具有较低胞外pH的缺氧环境。参见例如Webb BA等人,Nat.Rev.Cancer,11:671-77(2011)；Stubbs M.等人,Mol.Med.Today,6:15-19(2000)；Pillai SR等人,Cancer,38:205-22(2019)；Muz B.等人,Hypoxia,3:83-92(2015)；Moulder和Rockwell,Cancer Metastasis Rev.,5:313 -41(1987)；和Engin K.等人,Int.J.Hyperther.,11:211-16(1995)。另外，肿瘤中的快速细胞分裂通常与增加的胞外基质重塑和增加的蛋白质水解相关。参见例如Rakashanda S.等人,Biotechnol.Mole.Biol.Rev.,7:90-101(2012)；和DeClerck YA等人,Am.J.Pathol.,164:1131-39(2004)。
由于基因表达失调，肿瘤还频繁共表达并不在正常组织上共表达的细胞表面抗原。为利用TME的这些特征，抗体已被工程化为优选在低pH下结合或仅在低氧条件下激活的适体存在的情况下结合。参见例如Zhou F.等人,J.Am.Chem.Soc.,141:18421-27(2019)；Sharp L.等人,Cancer Res.,79:2708(2019)；和Chang C.等人,Cancer Res.,79:356(2019)。其他研究小组已使用经由蛋白酶可裂解接头连接的遮罩阻断抗体结合位点中的一者或两者或采用蛋白结构域互补和布林逻辑闸控(Boolean logic gating)以确保仅在存在两种不同肿瘤抗原的情况下的双特异性激活来设计蛋白酶激活的双特异性T细胞衔接子。参见例如Minogue E.等人,Blood,134:2653(2019)；Boustany LM等人,Mole.CancerTher.,17:A164-A(2018)；和Ellerman D.等人,Methods,154:102-17(2019)。
IV.发明内容
因此，本领域中需要用于治疗实体肿瘤的改进的双特异性癌症免疫疗法。具体地说，本领域中需要具有降低脱靶毒性的双特异性免疫疗法。在其他方面中，本发明涉及在存在肿瘤蛋白酶的情况下选择性激活的新型构建体和用于使用此类构建体治疗实体癌症的方法。
本发明提供用于治疗癌症的多种不同蛋白质组合物。因此，在一个方面中，本发明提供“格式2”蛋白质，其从N端至C端包含：结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；b)第一结构域接头；c)包含以下的约束性Fv结构域：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重链结构域；ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻链结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解接头(CL)；g)包含以下的约束性假Fv结构域：i)第一假轻链可变结构域；ii)不可裂解接头(NCL)；和iii)第一假重链可变结构域；h)第三结构域接头；和i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；其中所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3，但所述约束性Fv结构域不结合CD3；所述第一可变重链结构域与所述第一假可变轻链结构域进行分子内缔合以形成非活性Fv；并且所述第一可变轻链结构域与所述第一假可变重链结构域进行分子内缔合以形成非活性Fv。
在另一方面中，本发明提供“格式1”蛋白质，其从N端至C端包含：a)第一sdABD-TTA；b)第一结构域接头；c)包含以下的约束性Fv结构域：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重链结构域；ii)约束性可裂解接头(CCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻链结构域；d)第二结构域接头；e)第二sdABD-TTA；f)可裂解接头(CL)；g)包含以下的约束性假Fv结构域：i)第一假轻链可变结构域；ii)不可裂解接头(NCL)；和iii)第一假重链可变结构域；h)第三结构域接头；和i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD；其中所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3，但所述约束性Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重链结构域与所述第一假可变轻链结构域进行分子内缔合以形成非活性Fv；并且其中所述第一可变轻链结构域与所述第一假可变重链结构域进行分子内缔合以形成非活性Fv。
在另一个方面中，本发明提供“格式4”蛋白质，其从N端至C端包含：a)结合至人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)(sdABD-TTA)；b)第一结构域接头；c)包含以下的约束性Fv结构域：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重链结构域；ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和iii)包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻链结构域；d)可裂解接头(CL)；e)结合至人血清白蛋白的第二sdABD；f)结构域接头；g)包含以下的约束性假Fv结构域：i)第一假轻链可变结构域；ii)不可裂解接头(NCL)；和iii)第一假重链可变结构域；其中所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3，但所述约束性Fv结构域不结合CD3；其中所述第一可变重链结构域与所述第一假可变轻链结构域进行分子内缔合以形成非活性Fv；并且其中所述第一可变轻链结构域与所述第一假可变重链结构域进行分子内缔合以形成非活性Fv。
在上文列出的格式1、格式2和格式4蛋白质的另一方面中，所述第一可变重链结构域是所述第一可变轻链结构域的N端并且所述假轻链可变结构域是所述假可变重链结构域的N端。
在上文列出的格式1、格式2和格式4蛋白质的另一方面中，所述第一可变重链结构域是所述第一可变轻链结构域的N端并且所述假可变重链结构域是所述假可变轻链结构域的N端。
在上文列出的格式1、格式2和格式4蛋白质的另一方面中，所述第一可变轻链结构域是所述第一可变重链结构域的N端并且所述假轻链可变结构域是所述假可变重链结构域的N端。
在上文列出的格式1、格式2和格式4蛋白质的另一方面中，所述第一可变轻链结构域是所述第一可变重链结构域的N端并且所述假可变重链结构域是所述假可变轻链结构域的N端。
在另一个方面中，本发明提供格式1和2蛋白质，其中所述第一和所述第二TTA相同。
在另一方面中，本发明提供格式1和2蛋白质，其中所述第一和所述第二TTA不同。
在另一方面中，本发明提供格式1、2和4蛋白质，其中所述第一和所述第二TTA选自EGFR、EpCAM、FOLR1和B7H3。这些序列可选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41。
在另一方面中，本发明提供格式1、2和4蛋白质，其中所述半衰期延长结构域具有SEQ ID NO:45。
在另一个方面中，本发明提供格式1、2和4蛋白质，其中所述可裂解接头通过选自由以下组成的组的人蛋白酶裂解：MMP2、MMP9、穿膜肽酶(Meprin)A、穿膜肽酶B、组织蛋白酶S、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、颗粒酶B、uPA、激肽释放酶(Kallekriein)7、基质蛋白酶(matriptase)和凝血酶。
在另一方面中，本发明提供选自由以下组成的组的蛋白质：Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro311、Pro312、Pro313、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430和Pro431。
在另一个方面中，本发明提供编码如本文所述的格式1、格式2或格式4蛋白质的核酸以及包含编码所述蛋白质的核酸的表达载体和宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供制备本发明的蛋白质的方法和治疗有需要的患者的方法。
在另一个方面中，本发明提供包含“格式3A”前药蛋白对的组合物，其包含：a)从N端至C端包含以下的第一蛋白质：i)第一sdABD-TTA；ii)第一结构域接头；iii)从N端至C端包含以下的假Fv结构域：1)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；2)可裂解接头；和3)包含iVLCDR1、iVLCDR2和iVLCDR3的第一假可变轻链结构域；iv)第二结构域接头；v)sdABD-HSA；a)从N端至C端包含以下的第一第二蛋白质：i)结合至人肿瘤靶抗原的第三sdABD；ii)第三结构域接头；iii)从N端至C端包含以下的假Fv结构域：1)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链；2)可裂解接头；和3)包含iVHCDR1、iVHCDR2和iVHCDR3的第一假可变重链结构域；iv)第四结构域接头；v)sdABD-HSA；其中所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域在缔合时能够结合人CD3；其中所述第一可变重链结构域与所述第一假可变轻链结构域进行分子间缔合以形成非活性Fv；其中所述第一可变轻链结构域与所述第一假可变重链结构域进行分子间缔合以形成非活性Fv；并且其中所述第一和第三sdABD选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41。
在另一方面中，本发明提供包含“格式3B”前药蛋白对的组合物，其包含a)从N端至C端包含以下的第一蛋白质：i)第一sdABD-TTA；ii)第一结构域接头；iii)第二sdABD-TTA；iv)第二结构域接头；iii)从N端至C端包含以下的假Fv结构域：1)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的可变重链；2)可裂解接头；和3)包含iVLCDR1、iVLCDR2和iVLCDR3的第一假可变轻链结构域；iv)第三结构域接头；和v)sdABD-HSA；a)从N端至C端包含以下的第一第二蛋白质：i)第三sdABD-TTA；ii)第四结构域接头；iii)第四sdABD-TTA；iv)第五结构域接头；iii)从N端至C端包含以下的假Fv结构域：1)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的可变轻链；2)可裂解接头；和3)包含iVHCDR1、iVHCDR2和iVHCDR3的第一假可变重链结构域；iv)第六结构域接头；v)sdABD-HSA；其中所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域能够在缔合时结合人CD3；其中所述第一可变重链结构域与所述第一假可变轻链结构域进行分子间缔合以形成非活性Fv；并且其中所述第一可变轻链结构域与所述第一假可变重链结构域进行分子间缔合以形成非活性Fv。
在另一个方面中，格式3A和格式3B蛋白质具有sdABD-HSA，其具有SEQ ID NO:45。
在另一方面中，格式3A和格式3B蛋白质具有结合至选自EGFR、EpCAM、FOLR1和B7H3的TTA的sdABD-TTA。sdABD-TTA可选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:33；SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41。
在另一方面中，本发明提供包含编码前药对的第一蛋白质成员的第一核酸和编码所述对的第二蛋白质成员的第二核酸的核酸组合物以及含有所述核酸的表达载体和宿主细胞。
V.附图说明
图1描绘了本发明的“格式1”类型的蛋白酶激活，在本文中称为“约束性可裂解构建体”或“cc构建体”。在此实施方案中，代表性构建体是Pro140：存在用于两个TTA的ABD(如在图1中所描绘，这些TTA均相同，但如本文所述其可不同)。裂解后，前药构建体分裂成三种组分，一种含有经由结构域接头连接至αCD3的活性VH的α-TTA结构域，第二种含有经由结构域接头连接至αCD3的活性VL的α-TTA结构域，并且“剩余”片段包括连接至非活性VH和VL的半衰期延长结构域。两个活性可变结构域然后自由缔合以形成功能性抗CD3结合结构域。应注意，在“格式1”实施方案中，所得活性组分是三价的：存在与CD3的单价结合和与TTA的二价结合，产生双特异性结合蛋白，但在一些情况下此三价物可以是具有与CD3的单价结合、与第一TTA的单价结合和与第二TTA的单价结合的三特异性物。图1还示出了作为半衰期延长结构域的抗人血清白蛋白(HSA)结构域，在许多实施方案中，sdABD如本文所定义但如本文所讨论，这是任选的和/或可被其他半衰期延长结构域替换；另外，半衰期延长结构域还可以是构建体的N端或内部。图1还具有呈特定顺序例如从N端至C端的具有Fv的VH和VL以及具有假Fv的iVH和iVL，VH-接头-VL(和iVL-接头-iVH)，但如本领域技术人员应理解，这些顺序可进行逆转(VL-接头-VH和iVH-接头-iVL)。可选地，这些Fv中的一个可在一个取向上而另一个在另一取向上，但此处所示的取向上的蛋白质的表达意外地高于其他取向。
图2描绘了本发明的“格式2”类型的蛋白酶激活，在本文中称为“约束性不可裂解构建体”或“CNCL构建体”，有时在本文中还称为如本文所讨论的“二聚化构建体”。这些构建体不会如本文所讨论那样异构化。在裂解后，两种前药构建体分裂成四种组分，两个半衰期延长结构域(在此情况下针对HSA的sdABD)连接至两个假结构域(取决于接头的长度和失活性突变，其可能或可能不自我缔合)，并且两个活性部分自组装成含有四个抗TTA结构域(可全部相同或两个是相同的，并且另外两个是不同的)的二聚体活性部分。应注意，在“格式2”实施方案中，所得活性组分是六价的：存在与CD3的二价结合和与TTA的四价结合，产生双特异性结合蛋白，但在一些情况下此六价物可以是具有与CD3的二价结合、与第一TTA的二价结合和与第二TTA的二价结合的三特异性物。图2还示出了作为半衰期延长结构域的抗人血清白蛋白(HSA)结构域，在许多实施方案中，sdABD如本文所定义但如本文所讨论，这是任选的和/或可被其他半衰期延长结构域替换；另外，半衰期延长结构域还可以是构建体的N端或内部。图2还具有呈特定顺序例如从N端至C端的具有Fv的VH和VL以及具有假Fv的iVH和iVL，VH-接头-VL(和iVL-接头-iVH)，但如本领域技术人员应理解，这些顺序可进行逆转(VL-接头-VH和iVH-接头-iVL)。可选地，这些Fv中的一个可在一个取向上而另一个在另一取向上，但此处所示的取向上的蛋白质的表达意外地高于其他取向。
图3A至图3B描绘“格式3”类型的构建体，有时还称为如本文所概述的“半构建体”或“hemi-COBRATM”，因为这些构建体是一起构成如本文进一步讨论的MCE治疗剂的两种不同的多肽链。在此实施方案中，构建体成对递送并进行预裂解分子内自组装，产生非活性抗CD3 Fv结构域。在裂解后，释放惰性可变结构域，并且两个活性可变结构域然后进行分子间组装以形成活性抗CD3结合结构域。两个sdABD-TTA与肿瘤细胞表面上的对应受体结合，并且通过蛋白酶来进行裂解。这允许分子间组装，因为分子以物理方式保持在适当位置，有利于活性抗CD3结构域的组装。在此实施方案中，如上文对于格式1和2，可变结构域的N端至C端顺序还可进行逆转或混合。此外，sdABD(HSA)可位于每个半构建体的N端或C端处。Pro16在C端处具有sdABD(HSA)并且Pro17在N端处具有sdABD(HSA)(参见Pro19，SEQ ID NO:XX，在C端处具有sdABD(HSA))。图3A示出了每个半构建体具有单个sdABD-TTA结构域的格式3构建体，并且图3B示出了每个半构建体具有两个sdABD-TTA的格式3构建体，呈“双重靶向”或“异源靶向”格式。应注意，图3B使用FOLR1和EGFR作为两种TTA，但还可使用如本文所概述的其他组合。
图4描绘了类似于“格式2”构建体但仅具有单个sdABD-TTA的“格式4”类型的构建体。所述图示出了针对EGFR的sdABD-TTA，但如本领域技术人员所理解，还可使用其他TTA。裂解后，前药构建体分裂成两种组分，一种半衰期延长结构域(在此情况下针对HSA的sdABD)连接至假Fv，并且一种活性部分在存在来自不同裂解分子的第二活性部分的情况下自组装成含有两个抗TTA结构域的二聚体活性部分。应注意，在“格式4”实施方案中，所得活性组分是四价的：存在与CD3的二价结合和与TTA的二价结合，产生双特异性结合蛋白。图4还示出了作为半衰期延长结构域的抗人血清白蛋白(HSA)结构域，在许多实施方案中，sdABD(1/2)如本文所定义但如本文所讨论，这是任选的和/或可被其他半衰期延长结构域替换；另外，半衰期延长结构域还可以是构建体的N端或内部。图4还具有呈特定顺序例如从N端至C端的具有Fv的VH和VL以及具有假Fv的iVH和iVL，VH-接头-VL(和iVL-接头-iVH)，但如本领域技术人员所理解，这些顺序可进行逆转(VL-接头-VH和iVH-接头-iVL)。可选地，这些Fv中的一个可在一个取向上而另一个在另一取向上，但此处所示的取向上的蛋白质的表达意外地高于其他取向。
图5A至图5G描绘了本发明的多个序列。对于抗原结合结构域，CDR加有下划线。如本文中所更全面地概述，这些结构域可在本发明中以广泛多种构型组装，包括“格式1”、“格式2”、“格式3”和“格式4”取向。值得注意地，SEQ ID NO:90被MMP9的裂解稍快于SEQ ID NO:75和76，并且SEQ ID NO:91的裂解慢于SEQ ID NO:75和76。
图6A至图6B描绘了多个合适的蛋白酶裂解位点。如本领域技术人员所理解，这些裂解位点可用作可裂解接头。在一些实施方案中，例如当需要更挠性的可裂解接头时，可存在额外氨基酸(通常是甘胺酸和丝胺酸)，其位于这些裂解位点的N端和C端中的一者或两者处。
图7A至图7D描绘了与“格式3”或“hemi-COBRATM”结构相关的一些数据。这表明，格式3构建体被蛋白酶(在此情况下EK蛋白酶，但可使用本文中所概述并且在图5和图6中所描绘的任何蛋白酶裂解位点)裂解后，可共操作地结合至CD3，并产生CD3结合位点，如通过夹心FACS分析所示。
图8A至图8D示出了蛋白酶裂解可与互补的hemi-COBRATM对共操作地激活EGFR+靶细胞的T细胞杀伤。图8A和图8B示出了独立的但用不同浓度的蛋白酶裂解的构建体不影响靶细胞活力。然而，图8C示出了在蛋白酶存在的情况下组合靶细胞活力显著降低。图8D示出了一般机制。
图9示出了在测试格式1构建体的功效的测定中使用的一些非靶标对照。
图10A至图10F示出了活性CD3结合结构域的产生依赖于两个“臂”例如sdABD-TTA结构域的靶标结合，其中一者在所述两个构建体中的每一者上。如实施例中所描述进行TDCC测定。
图11示出了合适的hemi-COBRATM对的示意图。“Mep”代表穿膜肽酶蛋白酶裂解位点，“His-6”是本文更全面讨论的标签，ST14是基质蛋白酶蛋白酶裂解位点，并且“Thb”是凝血酶蛋白酶裂解位点。
图12A至图12C示出了与图11的构建体相关的TDCC数据。图12A示出了添加预裂解的hemi-COBRA对产生对OvCAR8细胞的功效，图12B示出了添加预裂解的hemi-COBRA对产生对HCT116细胞的功效，并且图12C示出了添加预裂解的hemi-COBRA对产生对LoVo细胞的功效，所述细胞均为癌细胞系。
图13A至图13B示出了MMP9接头在体内是稳定的。经由尾静脉以0.5mg/kg的剂量向NSG小鼠施用单次静脉内推注剂量的Pro40(MMP9可裂解)、Pro74(不可裂解)。在具有25mM柠檬酸、75mM L-精氨酸、75mM NaCl和4％蔗糖pH 7.0的媒介物中制备每种化合物的剂量溶液。在预选时间从每只动物收集两份血液样品，一份在研究开始通过眼眶采血或颌下腺采血收集，并且另一份在终端时间点通过心脏穿刺收集。血液收集的时间点为0.083、1、6、24、72和168h。使用K2 EDTA管由每个单独的血液样品制备血浆。浓度使用MSD测定用对抗HSAsdABD具有特异性的MAb来确定并用EGFR胞外结构域来检测。
图14描绘了图15中所描绘的实验中使用的格式3Ahemi-COBRATM构建体的示意图。Pro51是阳性对照，因为其“始终存在”，因为其形成活性抗CD3 Fv。Pro98是阴性对照，因为其sdABD针对不通过肿瘤表达的鸡蛋溶菌酶(hen egg lysozyme)。Pro77和Pro53是使用针对EGFR的sdABD和MMP9裂解位点的前药格式3A对。Pro74和Pro72是阴性对照格式3A对，因为其不具有裂解位点。
图15示出了格式1构建体使用用实施例中的方案植入至小鼠中的两种不同肿瘤细胞系使体内肿瘤消退。hemi-COBRA构建体(Pro77和Pro53)的抗肿瘤活性依赖于包含抗EGFRsdABD和MMP9可裂解接头以及活性抗CD3 Fv。
图16示出了下一代格式(一种具有裂解位点于其间的两个假Fv结构域的全长构建体)的示意图，如在US2018/0134789中一般描述，其特此以引用的方式并入。然而，如下图所示，此第一代全长构建体不显示出很好的条件性，因为其可异构化以形成活性和非活性构建体。
图17示出了格式3A构建体对实际上显示出比Pro100第一代全长构建体好的条件性。
图18描绘了在图19中测试的额外第一代全长构建体。
图19示出了第一代构建体甚至在未裂解格式中显示出高活性，例如较差的条件性。
图20示出了第一代全长构建体在分析型SEC上显示出两个单体峰。
图21示出了非裂解活性的原因的示意图，其为全长第一代构建体异构化以形成两个构形，其中一个是非活性的，因为未形成活性抗CD3 Fv(“二价scFv”)，并且另一个在不存在蛋白酶的情况下是活性“单链双抗体”类型的构形。参见PEDS23(8):667-677(2010)。
图22示出了通过第一代单链构建体在37℃下运行2天的TDCC测定的结果。结果表明未裂解构建体显示出强杀伤。这些结果使得产生格式1构建体。
图23A至图23G示出了本发明中使用的格式1构建体。如本领域技术人员所理解和本文中所描述，这些构建体描绘有sdABD-EGFR靶向部分，但可使用针对其他TTA的sdABD。
图24示出了格式1构建体(在此情况下Pro140)形成在37℃下稳定的单异构体。
图25描绘了格式1构建体在未裂解格式中具有与人CD3的极低结合，如通过Octet测定所测量。顶线是Pro120，中间线是Pro51(阳性对照)，并且底线是Pro140，其在4℃或37℃下保持3天。
图26类似地描绘了格式1构建体在未裂解形式中具有极低的TDCC活性。
图27描绘了用于体内测试的使用sdABD-EGFR作为靶向部分和MMP9裂解位点的特异性格式1构建体Pro140。
图28A至图28B示出了使用格式1构建体的肿瘤消退。
图29描绘了由于约束性Fv中的裂解位点，可产生若干不同的片段：部分裂解的片段和完全裂解的片段。意外地，部分裂解的格式比完全裂解的格式更具有活性，从而使得产生格式2。
图30示出了多个格式2示意图，所有这些都使用sdABD-EGFR靶向结构域，但如本文所概述和序列中所列举，可使用针对其他TTA的sdABD。Pro51和Pro201是阳性对照(呈活性“半”构型)，并且Pro214是全长阴性对照，因为不存在裂解位点。
图31示出了使用穿膜肽酶裂解位点的格式2构建体Pro187的TDCC活性。在TDCC测定中，在添加预裂解Pro187时的活性比添加未裂解Pro187时的活性高1200倍。预裂解Pro187展示出介于阳性对照Pro51与Pro201之间的活性。未裂解Pro187展示出与不含有蛋白酶可裂解接头的Pro214类似的活性。
图32示出了使用n MMP9裂解位点的格式2构建体Pro186的TDCC活性。在TDCC测定中，在添加预裂解Pro186时的活性比添加未裂解Pro186时的活性高18倍。预裂解Pro186展示出介于阳性对照Pro51与Pro201之间的活性。未裂解Pro186展示出比不含有蛋白酶可裂解接头的Pro214更具活性。
图33描绘了Pro186构建体结合至具有不同水平的EGFR受体的细胞，其中CHO细胞不在细胞表面上表达EGFR。Pro186在类似COBRA浓度下使表达不同水平的EGFR的细胞饱和化。
图34示出了图35的体内研究中使用的格式2构建体的示意图，所有这些都使用sdABD-EGFR靶向结构域。
图35示出了格式2构建体Pro186在两种浓度下均高度有效，并且比在较低浓度下的格式1构建体Pro140好。
图36描绘了多个基于Pro186但具有不同蛋白酶裂解位点的格式2构建体。虽然所有这些构建体均将sdABD-EGFR用于两个靶向结构域，但可使用针对不同TTA的其他sdABD，并且其可以是相同或不同的。即可进行同源靶向(均将sdABD靶向相同TTA)或异源靶向(一个sdABD靶向第一TTA，并且另一个靶向不同TTA)。
图37描绘了改变Fv结构域之间的接头长度的不同格式2构建体的示意图。这些构建体显示出使用MMP9裂解位点，但其他裂解位点可如本文所概述来使用。类似地，虽然所有这些构建体均将sdABD-EGFR用于两个靶向结构域，但可使用针对不同TTA的其他sdABD，并且其可以是相同或不同的。
图38示出了假Fv的接头长度可变化，例如活性Fv(“短活性”)之间具有短接头并且假Fv(“长非活性”)之间具有较长接头的格式2构建体表现出与“短活性”和“短非活性”类似的活性。因此，COBRA构建体的条件性不依赖于活性和非活性的约束性scFv接头两者被约束；只要其中一者受到约束，则单链双抗体折叠似乎比二价scFv折叠更有利。
图39示出了活性Fv的接头长度可变化，例如具有“长活性”和“短非活性”的格式2构建体表现得类似于“短活性”和“短非活性”构建体。因此，COBRA构建体的条件性不依赖于活性和非活性的约束性scFv接头两者被约束；只要其中一者受到约束，则单链双抗体折叠似乎比二价scFv折叠更有利。
图40A至图40C示出了多个不同构建体的示意图。除了在假Fv中具有长接头(16聚体)之外，Pro188是与Pro140类似的格式1构建体。除了在假Fv结构域中具有长接头(16聚体)之外，Pro189和Pro190(格式2构建体)与Pro186和Pro187类似。Pro191和Pro192(另外格式2构建体)类似于Pro189和Pro190，除了其在sdABD(1/2)上游具有额外裂解位点。Pro193(格式4)具有单EGFR靶向结构域、重排以呈反向顺序的iVH和iVL，以及sdABD(1/2)上游的额外裂解位点。Pro195是类似于Pro186的格式2构建体，其具有结合至相同的TTA、EGFR但结合至不同表位的靶向结构域。Pro196、Pro197和Pro198是具有重排可变结构域的格式2构建体。
图41描绘了针对人FOLR1的不同sdABD克隆显示出差异性杀伤的事实。将结合至人FOLR1的Pro22型构建体(具有FLAG序列而非NCL的Pro51)与针对多个细胞系家族的Pro22-EGFR构建体进行比较。
图42描绘了四个sdABD-FOLR1构建体的示意图，其包括使用用sdABD-EGFR2(具有两个分子进行分子间缔合以形成针对CD3的两种活性Fv)的Pro201阳性对照和两个格式2测试物品(使用h77.2sdABD的Pro311和使用h59.3 sdABD的Pro312)以及两个阴性对照(使用h77.2 sdABD的Pro299和使用h59.3 sdABD的Pro303)。
图43描绘了用于体内设计FOLR/MMP9的格式2构建体的示意图。
图44示出了体内Pro312构建体的功效并展示出MMP9可裂解接头对于抗肿瘤活性必不可少。
图45描绘了使用针对人B7H3的sdABD(sdABD-B7H3)的一些格式的示意图，其包括阳性对照Pro244(使用sdABD-B7H3(hF7)(具有两个分子进行分子间缔合以形成两个针对CD3的活性Fv)和两个格式2测试物品(格式2构建体Pro225和缺乏裂解位点的阴性对照Pro295)。
图46示出了Pro225具有与对照Pro295相比较大的条件性。
图47示出了使用穿膜肽酶接头的格式2构建体Pro373显示出与Pro295相比较大的条件性。
图48描绘了多个sdABD-B7H3(使用hF12序列)构建体，其显示出使用sdABD-EGFR的Pro51阳性对照、使用sdABD-hF12 B7H3的Pro244阳性对照、测试构建体Pro226和不具有裂解位点的阴性对照Pro296。
图49示出了TDCC测定中的Pro226构建体的良好条件性。
图50示出了针对人EpCAM的sdABD的人源化。
图51示出了多种格式的示意图：Pro22hVIB13和Pro205是阳性对照，Pro199是格式2构建体并且Pro175是阴性对照。
图52示出了sdABD-EpCAM构建体的TDCC活性，其显示出良好的条件性。
图53A至图53B示出了sdABD-EpCAM Pro199构建体的TDCC活性，其在HT29和LoVo细胞模型中显示是良好的条件性。
图54A至图54B示出了sdABD-EpCAM Pro200构建体的TDCC活性，其在HT29和LoVo细胞模型中显示是良好的条件性。
图55示出了与具有双EpCAM sdABD的Pro199相比的使用两种不同sdABD-TTA(一种针对EGFR(sdABD-EGFR)并且另一种针对EpCAM(sdABD-EpCAM))的Pro255的示意图。这些构建体有时在本文中称为“异源靶向”构建体，在此情况下为格式2构建体。
图56示出了具有MMP9裂解位点的Pro255双重靶向分子显示出良好的条件性。
图57A至图57D示出了三种不同细胞类型上的实验结果。首先，用类似表达水平的EpCAM、EGFR和EpCAM+EGFR(数据未示出)产生Raji转染子。然后使用每种细胞类型在TDCC测定中测试靶向EpCAM和EGFR的Pro255。图57A示出了不表达任一受体的亲本Raji系。图57B示出了对EpCAM系的条件性。图57C示出了对EGRF系的条件性。图57D示出了对EpCAM/EGFR系的条件性。
图58描绘了格式4构建体Pro258的示意图。
图59A至图59B示出了Pro258在FBS和人血清中具有条件性。由于培养物中的MMP9活性，低估了MMP9接头的条件性。有趣的是，Pro51 TDCC活性受HSA结合抑制，而Pro258TDCC活性在HSA存在的情况下与Pro51 TDCC活性相似。最后，在存在HSA的情况下，Pro258条件性在某种程度上增强6倍。
图60A至图60C示出了通过其他MMP对MMP9底物的裂解。
图61A至图61B示出了一些示例性构建体及其格式。
图62A至图62U示出了本发明的多个序列，但许多额外的序列还发现于序列表中。CDR加有下划线并加粗，接头加双下划线(并且可裂解接头用斜体并加双下划线)，并且结构域分隔由“/”表示。所有His6标签均是任选的，因为其可用于降低人的免疫原性以及成为纯化标签。
VI.具体实施方式
A.引言
本发明涉及降低结合至诸如CD3和肿瘤抗原的重要生理学靶标的双特异性抗体(包括抗体样功能蛋白)的毒性和副作用的方法。诸如抗体的许多抗原结合蛋白可具有显著的脱靶副作用，并且因此仅需要激活疾病组织附近的治疗分子的结合能力以避免脱靶相互作用。因此，本发明涉及具有多个功能蛋白结构域的多价条件性有效的(“MCE”)蛋白质。一般而言，这些结构域中的一个是将结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)，并且另一个是将在特定条件下结合诸如CD3的T细胞抗原的ABD。另外，MCE蛋白还包括一个或多个蛋白酶裂解位点。即治疗分子以类“前药”格式制备，其中CD3结合结构域是非活性的直至暴露于肿瘤环境。肿瘤环境含有蛋白酶以使得在暴露于蛋白酶后，前药被裂解并变得具有活性。
这在本文中通常通过使用包含“假”可变重链结构域和针对诸如CD3的T细胞抗原的“假”可变轻链结构域的蛋白质来实现，所述蛋白质将MCE的CD3 Fv抑制(restrain)成如本文中所讨论的非活性格式。由于TTA将MCE靶向肿瘤附近，因此MCE暴露于蛋白酶。在裂解后，活性可变重链结构域和活性轻链结构域现在能够配对以形成一种或多种针对CD3的活性ABD，并且因此将T细胞募集至肿瘤，从而实现治疗。
一般而言，CD3结合结构域(“Fv”)呈约束性格式，其中传统上形成Fv的活性可变重链结构域与活性可变轻链结构域之间的接头太短而不允许两个活性可变结构域彼此结合；这称为“约束性接头”；这些可受到约束并且可裂解(CCL，如格式1中所使用)或受到约束并且不可裂解(CNCL，如格式2中所使用)。相反，在前药(例如未裂解)格式中，前药多肽还包含“假Fv结构域”。假Fv结构域包含具有标准框架区但具有“惰性”或“非活性”CDR的可变重和轻链结构域。假Fv结构域还在非活性可变重链结构域与非活性可变轻链结构域之间具有约束性接头。因为Fv结构域和假Fv结构域由于空间约束而不能自组装，所以存在由于各自框架区的亲和力而使aVL与iVH和aVH与iVL配对的分子内组装。然而，由于假结构域的“惰性”CDR，所以所得ABD不会结合CD3，因此防止脱靶毒性。然而，在存在肿瘤内或肿瘤附近的蛋白酶的情况下，前药构建体被裂解以使得假Fv结构域从表面释放，并且因此允许“真”可变重链结构域和可变轻链结构域进行分子间缔合(例如两个裂解构建体聚集在一起)，从而触发活性CD3结合和所得肿瘤功效。这些构建体在本文中一般称为条件性双特异性重导向激活(COnditional Bispecific Redirected Activation)构建体或“COBRATM”。通过本文的条件性实验显示出分子内组装的稳定性，由此在不存在蛋白酶的情况下，未裂解构建体不具有活性(例如未形成活性CD3结合结构域)。
有趣的是，为了易于描述，虽然这些构建体在本文中均称为“约束性”，但额外的工作显示，即使Fv结构域中的一个不受约束，分子内组装还是有利的，例如所述结构域中的一个可具有较长的柔性接头。即如图37、图38和图39中所示，如果仅Fv结构域中的一个(具有活性VL和VH的结构域或假Fv结构域)受到约束，则分子内组装仍然进行(例如未裂解构建体在不存在蛋白酶裂解的情况下是非活性的)。然而，在当前系统中，当两个接头均受约束时，蛋白质具有更好的表达。然而，如本领域技术人员所理解，本文的格式1、格式2或格式4构建体中的任一构建体可具有这些具有“非约束性”或“柔性”接头的Fv结构域中的一个。为了易于参考，构建体示出有两个呈约束性格式的Fv结构域。
本发明的构建体和格式是WO2017/156178中所描述的发明的变异，所述专利特此以引用的方式整体明确地并入。如图21中所示，先前构建体由于单多肽中存在两组VH和VL结构域而能够进行异构化，从而形成二价scFv和单链双抗体。即使在纯化每种同工型后，二价构建体仍可达成与双抗体同工型的平衡。由于单链双抗体在不存在蛋白酶裂解的情况下能够结合至CD3，所以构建体的利用减少。
为了解决此问题，本发明提供四种独立类型的构建体来完成此条件性激活。前药激活可以四种一般方式中的一种发生，如各图中一般所示。在图1中，示出了“格式1”机制。在此实施方案中，前药构建体具有两个裂解位点：一个位于约束性Fv的VH结构与VL结构域之间，因此释放两个可变结构域以进行缔合，并且第二个位于从前药构建体释放假Fv结构域的位点，留下两个由于可变重链结构域和可变轻链结构域的固有自组装而缔合的分子，每个分子还具有针对肿瘤抗原的抗原结合结构域，因此允许T细胞募集至肿瘤部位。
在一个替代实施方案中，前药构建体示于图2“格式2”机制中。在此实施方案中，活性可变重链与活性轻链之间的域接头受到约束但不为可裂解接头(“CNCL”)。在前药格式中，约束性假Fv结构域的非活性VH和VL与约束性Fv结构域的VH和VL缔合以使得不存在CD3结合。然而，一旦在肿瘤环境中发生裂解，两种不同的激活蛋白质(各自包含活性可变重链结构域和轻链结构域)进行缔合以形成两个抗CD3结合结构域。
除了上面所讨论的“单链蛋白”COBRA格式之外，其中所有组分均含于单氨基酸序列上，还存在依赖于两种成对起作用的蛋白质“hemi-COBRA”的构建体，如图3中所示。在此实施方案中，每种蛋白质具有被蛋白酶裂解位点分隔的一个活性可变结构域和一个惰性可变结构域。每个分子含有TTA结合结构域以使得当所述分子结合至TTA并暴露于肿瘤蛋白酶时，惰性结构域发生裂解，并且两个活性可变结构域自组装以形成抗CD3结合结构域。
此外，本发明还提供“格式4”构建体，如图4中所描绘。这些构建体与“格式2”设计类似，不同之处在于使用针对TTA的单ABD以使得在裂解后，两种前药分子现在形成含有两个活性抗CD3结构域的四价双特异性构建体，如下文进一步所描述。
因此，本发明的格式和构建体可用于治疗疾病。
B.定义
为了可更完全地理解本申请，下文阐述若干定义。此类定义意在涵盖语法等效物。
如本文所使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20种天然存在的氨基酸中的一种或可存在于特定的规定位置处的任何非天然类似物。在许多实施方案中，“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸中的一种。本文中的“蛋白质”意指至少两种共价连接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。
本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或化学连接至蛋白质的部分的改变。例如，修饰可以是连接至蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰始终是由DNA编码的氨基酸，例如DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。本文中的优选氨基酸修饰是取代。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用不同氨基酸替换在亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。具体地说，在一些实施方案中，取代是特定位置处并非天然存在，即生物体内或任何生物体中并非天然存在的氨基酸。为清楚起见，已被工程化为改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生编码相同蛋白质的新基因，但如果蛋白质在其起始的特定位置处具有相同的氨基酸，则其不是氨基酸取代。
如本文中所使用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。
如本文中所使用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中的特定位置处去除氨基酸序列。
如本文所概述，本发明的多肽特异性结合至CD3和靶肿瘤抗原(TTA)，诸如靶细胞受体。“特异性结合”特定抗原或表位或“特异性结合至”特定抗原或表位或对特定抗原或表位“具有特异性”意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量，所述对照分子一般是具有不具结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定。
特定抗原或表位的特异性结合可例如通过针对抗原或表位的KD为以下的抗体来表现：至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更高，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体相对于抗原或表位应具有比对照分子大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的KD。
此外，针对特定抗原或表位的特异性结合可例如通过针对抗原或表位的KA或Ka相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的抗体来表现，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。一般使用本领域已知的Biacore测定或Octet来测量结合亲和力。
如本文中所使用，“亲本多肽”或“前体多肽”(包括Fc亲本或前体)意指随后被修饰以产生变体的多肽。所述亲本多肽可以是天然存在的多肽或天然存在的多肽的变异或工程化型式。亲本多肽可指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码其的氨基酸序列。因此，如本文中所使用，“亲本Fc多肽”意指经修饰以产生变体的未修饰Fc多肽，并且如本文中所使用，“亲本抗体”意指被修饰以产生变体抗体的未修饰抗体。
如本文中所使用，“位置”意指蛋白质的序列中的位置。位置可按顺序编号或根据建立的格式编号，例如用于抗体编号的EU索引。
如本文中所使用，“靶抗原”意指通过给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化学化合物。本文描述一系列合适的示例性靶抗原。
如本文中所使用，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。一般而言，出于本发明的目的，靶细胞是表达TTA的肿瘤细胞或表达CD3抗原的T细胞。
如本文中所使用，“Fv”或“Fv结构域”或“Fv区”意指包含一般来自抗体的抗原结合结构域的VL和VH结构的多肽。如果Fv结构域含有活性VH和VL结构域，则其通常形成如本文所讨论的“抗原结合结构域”或“ABD”(但在一些情况下，使用含有约束性接头的Fv以使得在裂解之前不形成活性ABD)。如下文所讨论，Fv结构域可在本发明中以多种方式组织，并且可以是“活性的”或“非活性的”，诸如呈scFv格式、约束性Fv格式、假Fv格式等。应理解在本发明中，在一些情况下，Fv结构域由诸如图1和图2中所示的单多肽链上的VH和VL结构域构成但具有约束性接头以使得不能形成分子内ABD。在这些实施方案中，在裂解后才形成两个活性ABD。在一些情况下，Fv结构域由VH和VL结构域构成，其中一个是惰性的，从而使得仅在裂解后形成分子间ABD。如下文所讨论，Fv结构域可在本发明中以多种方式组织，并且可以是“活性的”或“非活性的”，诸如呈scFv格式、约束性Fv格式、假Fv格式等。另外，如本文所讨论，含有VH和VL的Fv结构域可以是/形成ABD，并且不含有VH和VL结构域的其他ABD可使用sdABD来形成。
本文中的“可变结构域”意指包括一个或多个基本上由分别构成κ、λ和/或重链免疫球蛋白遗传基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因编码的Ig结构域的免疫球蛋白区。在一些情况下，可使用单可变结构域，诸如sdFv(在本文中还称为sdABD)。
在利用可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域的实施方案中，每个VH和VL由按以下顺序从氨基端至羧基端排列的三个高变区(“互补决定区”、“CDR”)和四个“框架区”或“FR”构成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此，VH结构具有结构vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4，并且VL结构域具有结构vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。如本文更全面地描述，vhFR区和vlFR区自组装以形成Fv结构域。一般而言，在本发明的前药格式中，存在“约束性Fv结构域”，其中VH和VL结构域不能自缔合，并且存在“假Fv结构域”，因为在自缔合时CDR不形成抗原结合结构域。
高变区赋予抗原结合特异性，并且一般涵盖轻链可变区中的约氨基酸残基24至34(LCDR1；“L表示轻链”)、50至56(LCDR2)和89至97(LCDR3)的氨基酸残基和重链可变区中的约31至35B(HCDR1；“H表示重链”)、50至65(HCDR2)和95至102(HCDR3)周围的氨基酸残基；Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如，轻链可变区中的残基26至32(LCDR1)、50至52(LCDR2)和91至96(LCDR3)和重链可变区中的26至32(HCDR1)、53至55(HCDR2)和96至101(HCDR3))；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下文描述了本发明的特异性CDR。
如本领域技术人员所理解，CDR的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。然而，应理解，可变重序列和/或可变轻序列的公开内容包括相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重链区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻链区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。
CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003)：
表1
在整个本说明书中，当提及可变结构域中的残基(大约轻链可变区中的残基1至107和重链可变区中的残基1至113)时，一般使用Kabat编号系统并且针对Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人,同上(1991))。
本发明提供大量不同的CDR组。在此情况下，抗CD3组分的上下文中的“完整CDR组”包含三个可变轻CDR和三个可变重CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。如本领域技术人员所理解，每个CDR组(VH和VL CDR)可单独地和作为一个组结合至抗原。例如，在约束性Fv结构域中，vhCDR可结合例如至CD3，并且vlCDR可结合至CD3，但在约束性格式中其不能结合至CD3。
在诸如本文通常用于结合至靶肿瘤抗原(TTA)的单结构域ABD(“sdABD”)的上下文中，CDR组只有三个CDR；这些结构域有时在本领域中还称为“VHH”结构域。
这些CDR可分别是较大的可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文更全面地概述，在scFv序列的情况下，取决于本文中的部分的格式和构型，可变重链结构域和可变轻链结构域可在单独多肽链上或在单多肽链上。
CDR有助于形成抗原结合，或更具体地说，形成表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子分组并且通常具有特定结构特征以及特定电荷特征。单一抗原可具有多于一个表位。
表位可包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和其他不直接参与结合的氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖区内。
表位可以是构象或线性的。构象表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可能在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者而非后者的结合消失。
表位通常包含呈独特空间构象的至少3个并且更通常至少5个或8至10个氨基酸。识别相同表位的抗体可在简单的免疫测定中验证，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原的结合的能力，例如“分组(binning)”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包含竞争与由所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的那些抗原结合结构域和抗体。
本发明的可变重链结构域和可变轻链结构域可以是“活性的”或“非活性的”。
如本文所使用，“非活性VH”(“iVH”)和“非活性VL”(“iVL”)是指假Fv结构域的组分，其在分别与其同源VL或VH伴侣配对时形成所得VH/VL对，所述VH/VL对不特异性结合至将与“活性”VH或“活性”VL结合的抗原，则其结合至不是“非活性的”类似VL或VH。示例性“非活性VH”和“非活性VL”结构域是通过如下文更全面概述的野生型VH或VL序列的突变来形成的。示例性突变在VH或VL的CDR1、CDR2或CDR3内。示例性突变包括将结构域接头置于CDR2内，由此形成“非活性VH”或“非活性VL”结构域。相反，“活性VH”或“活性VL”在分别与其“活性”同源伴侣(即VL或VH)配对后能够特异性结合至其靶抗原。因此，应理解假Fv可以是VH/iVL对、iVH/VL对或iVH/iVL对。
相反，如本文所使用，术语“活性”是指能够特异性结合至CD-3的CD-3结合结构域。此术语在两种情况下使用：(a)当提及Fv结合对的单个成员(即VH或VL)时，其具有能够与其同源伴侣配对并特异性结合至CD-3的序列；和(b)具有能够特异性结合至CD-3的序列的同源物对(即VH和VL)。示例性“活性”VH、VL或VH/VL对是野生型或亲本序列。
“CD-x”是指分化簇(CD)蛋白。在示例性实施方案中，CD-x选自那些在施用本发明的多肽构建体的受试者中的T细胞募集或激活中具有重要作用的CD蛋白。在一个示例性实施方案中，CD-x是CD3，其序列示于图5。
结合本发明，术语“结合结构域”表征与例如EGFR和CD-3的靶分子(抗原)上的给定表位或给定靶位点分别进行(特异性)结合/相互作用/识别的结构域。靶抗原结合结构域(识别EGFR)的结构和功能和优选CD-3结合结构域(识别CD3)的结构和/或功能基于例如包括sdABD的全长或完整免疫球蛋白分子的抗体的结构和/或功能。根据本发明，靶抗原结合结构域的特征一般在于存在结合靶肿瘤抗原的三个CDR(本领域中一般称为可变重链结构域，但不存在对应的轻链CDR)。可选地，针对TTA的ABD可包含三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。CD-3结合结构域优选还至少包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。更优选地，CD-3结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想在示例性实施方案中，靶抗原和/或CD-3结合结构域由噬菌体展示或文库筛选方法产生或获得。
如本文中所使用，“结构域”意指具有如本文所概述的功能的蛋白质序列。本发明的结构域包括肿瘤靶抗原结合结构域(TTA结构域)、可变重链结构域、可变轻链结构域、接头结构域和半衰期延长结构域。
在本文中，“结构域接头”意指接合两个结构域的氨基酸序列，如本文所概述。结构域接头可以是可裂解接头、约束性可裂解接头、不可裂解接头、约束性不可裂解接头、scFv接头等。
本文中的“可裂解接头”(“CL”)意指可被蛋白酶，优选疾病组织中的人蛋白酶裂解的氨基酸序列，如本文所概述。可裂解接头一般长度为至少3个氨基酸，其中取决于所需柔性4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸均可用于本发明中。多个可裂解接头序列见于图6和图5中。
本文中的“不可裂解接头”(“NCL”)意指在正常生理条件下不能被人蛋白酶裂解的氨基酸序列。
本文中的“约束性可裂解接头”(“CCL”)意指含有蛋白酶裂解位点(如本文所定义)的短多肽，所述蛋白酶裂解位点以使得两个结构域不能彼此显著地相互作用直至其滞留于不同多肽链上之后(例如在裂解之后)的方式来接合如本文所概述的两个结构域。当CCL接合如本文所定义的VH和VL结构域时，由于以分子内方式进行空间约束，所以VH和VL不能在裂解之前自组装以形成功能性Fv(但其可以分子间方式组装成假Fv结构域)。在被相关蛋白酶裂解后，VH和VL可以分子间方式组装以形成活性抗原结合结构域。一般而言，CCL的长度小于10个氨基酸，其中9、8、7、6、5和4个氨基酸可用于本发明中。一般而言，蛋白酶裂解位点的长度一般为至少4+个氨基酸以赋予足够的特异性，如在图6中所示。
本文中的“约束性不可裂解接头”(“CNCL”)意指以使得两个结构域不能彼此显著地相互作用并使得其在生理条件下不会被人蛋白酶显著裂解的方式来接合如本文所概述的两个结构域的短多肽。
本文中的“约束性Fv结构域”意指包含活性可变重链结构域和活性可变轻链结构域的Fv结构域，其以使得活性重链可变结构域和轻链可变结构域不能进行分子内相互作用以形成将结合诸如CD3的抗原的活性Fv的方式与本文所概述的约束性接头共价连接。因此，约束性Fv结构域是类似于scFv但由于存在约束性接头而不能结合抗原的结构域(但其可与惰性可变结构域进行分子间组装以形成假Fv结构域)。
本文中的“假Fv结构域”意指包括使用结构域接头(其可以是可裂解、约束性、不可裂解、非约束性的等)连接的假或非活性可变重链结构域或假或非活性可变轻链结构域或两者的结构域。假Fv结构域的iVH和iVL结构域在彼此缔合时(iVH/iVL)或在与活性VH或VL缔合时不与人抗原结合；因此，iVH/iVL、iVH/VL和iVL/VH Fv结构域不明显地与人蛋白质结合，从而使得这些结构域在人体中是惰性的。
本文中的“单链Fv”或“scFv”意指一般使用如本文所讨论的结构域接头共价连接至可变轻(VL)结构域以形成scFv或scFv结构域的可变重(VH)结构域。scFv结构域可处于从N端至C端的任一取向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
本文中的“单结构域Fv”、“sdFv”或“sdABD”意指一般基于骆驼抗体技术仅具有三个CDR的抗原结合结构域。参见：Protein Engineering9(7):1129-35(1994)；Rev MolBiotech 74:277-302(2001)；Ann Rev Biochem 82:775-97(2013)。如本文所概述，存在本文所使用的两种一般类型的sdABD：结合至TTA并如此注释(对于通用术语为sdABD-TTA，或对于结合至EGFR的sdABD为sdABD-EGFR，对于结合至FOLR1的sdABD为sdABD-FOLR1等)的sdABD和结合至HSA的sdABD(“sdABD-HSA”或“sdABD(1/2)”)。
“蛋白酶裂解位点”是指由蛋白酶识别并裂解的氨基酸序列。合适的蛋白酶裂解位点概述于下文中并且示于图5和图6中。
如本文所使用，“蛋白酶裂解结构域”是指掺入“蛋白酶裂解位点”和个别蛋白酶裂解位点之间的任何接头以及蛋白酶裂解位点与本发明构建体的其他功能组分之间的任何接头的肽序列(例如VH、VL、iVH、iVL、靶抗原结合结构域、半衰期延长结构域等)。如本文所概述，蛋白酶裂解结构域在必要时还可包括额外的氨基酸例如以赋予柔性。
术语“COBRATM”和“条件性双特异性重导向激活”是指具有多个功能蛋白结构域的双特异性条件性有效蛋白质。在一些实施方案中，功能结构域之一是结合靶肿瘤抗原(TTA)的抗原结合结构域(ABD)。在某些实施方案中，另一个结构域是在特定条件下结合至T细胞抗原的ABD。T细胞抗原包括但不限于CD3。术语“hemi-COBRATM”是指当由于在靶表达细胞的表面上浓缩时进行先天性自组装，hemi-COBRA的可变重链可缔合至另一hemi-COBRATM(互补性hemi-COBRATM)的可变轻链时可结合T细胞抗原的条件性有效蛋白质。
VII.本发明的融合蛋白
本发明的融合蛋白具有以多种方式连接在一起的多种不同组分，在本文中一般称为结构域。一些结构域是各自结合至靶抗原(例如TTA或CD3)的结合结构域。当其结合至多于一种抗原时，其在本文中称为“多特异性的”；例如，本发明的前药构建体可结合至TTA和CD3，并且因此是“双特异性的”。蛋白质还可具有更高的特异性；例如，如果第一αTTA与EGFR结合，第二αTTA与EpCAM结合并且存在抗CD3结合结构域，则这将是“三特异性分子”。类似地，向此构建体中添加抗HSA结合结构域将是“四特异性的”，如图3B中所示。
如本领域技术人员所理解，本发明的蛋白质可具有不同的价态并且是多特异性的。即，本发明的蛋白质可结合具有多于一个结合位点的靶标；例如，Pro140对于EGFR是二价的。
本发明的蛋白质可包括以如本文所概述的多种方式排列的CD3抗原结合结构域、肿瘤靶抗原结合结构域、半衰期延长结构域、接头等。
A.CD3抗原结合结构域
T细胞的反应的特异性由通过T细胞受体复合物识别抗原(展示于主要组织相容性复合物MHC的上下文中)来介导。作为T细胞受体复合物的一部分，CD3是蛋白质复合物，其包括存在于细胞表面处的CD3γ(伽玛(gamma))链、CD3δ(德耳塔(delta))链、两个CD3e(伊普西隆(epsilon))链和两个CD3ζ(泽塔(zeta))链。CD3分子与T细胞受体(TCR)的α(阿尔法(alpha)链和β(贝塔(beta))链缔合以构成TCR复合物。诸如通过结合至CD3的Fv结构域进行的T细胞上的CD3集群引起类似于T细胞受体的衔接但不依赖于其克隆-典型的特异性的T细胞激活。
然而，如本领域中已知，CD3激活可导致多种毒副作用，并且因此本发明针对仅在肿瘤细胞存在的情况下提供本发明的多肽的活性CD3结合，其中发现特异性蛋白酶，然后裂解本发明的前药多肽以提供活性CD3结合结构域。因此，在本发明中，抗CD-3Fv结构域与CD-3的结合通过蛋白酶裂解结构域调节，所述蛋白酶裂解结构域仅在具有高量蛋白酶的病变细胞或组织的微环境中，例如在本文所描述的肿瘤微环境中限制CD-3Fv结构域与CD-3的结合。
因此，本发明提供两组VH和VL结构域，活性组(VH和VL)和非活性组(iVH和iVL)，其中四组全部存在于前药构建体中。对构建体进行格式化以使得VH和VL组不能自缔合，而与例如如本文所示的iVH和VL以及iVL和VH的非活性伴侣缔合。
1.活性抗CD3可变重链结构域和可变轻链结构域
存在许多本领域已知并且可用于本发明的合适的活性CDR组和/或VH和VL结构域。例如，CDR和/或VH和VL结构域衍生自已知的抗CD-3抗体，诸如例如莫罗单抗-CD-3(muromonab-CD-3)(OKT3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)(TRX4)、替利珠单抗(teplizumab)(MGA031)、维西珠单抗(visilizumab)(Nuvion)、SP34或I2C、TR-66或X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1和WT-31。
在一个实施方案中，形成结合至人CD3的活性Fv结构域的VH和VL序列分别示于图5中。如本文所示，这些活性VH(“aVH”)和活性VL(“aVL”)结构域可以不同构型和格式1、2、3和4来使用。
2.非活性抗CD3可变重链结构域和可变轻链结构域
非活性iVH和iVL结构域含有允许缔合的“规律”框架区(FR)以使得非活性可变结构域将与活性可变结构域缔合，使所述对变为非活性的，例如不能结合CD3。
如本领域技术人员所理解，存在许多可用于本发明中的“非活性”可变结构域。基本上，无论可变区中的CDR位置中的氨基酸是何种氨基酸，可使用具有允许与另一可变结构域自组装的人框架区的任何可变结构域。为清楚起见，据说非活性结构域包括CDR，尽管在技术上非活性可变结构域不赋予结合能力。
如本领域所理解，一般直接产生非活性VH或VL结构域并且可以多种方式进行。在一些实施方案中，非活性可变结构域的产生通常通过改变活性Fv的一个或多个CDR来进行，其包含改变活性可变结构域的三个CDR中的一个或多个。这可通过在一个或多个CDR中的功能上重要的残基处进行一个或多个氨基酸取代，用无规序列替换一些或所有CDR残基，用标签或flag序列替换一个或多个CDR，和/或将CDR和/或可变区与来自无关抗体的CDR和/或可变区(例如一个针对不同生物体的蛋白质的CDR和/或可变区)交换来完成。
在一些情况下，可仅改变可变区中的一个CDR以使其变为非活性的，但其他实施方案括改变一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在一些情况下，非活性结构域可被工程化为促进前药格式中的选择性结合以促进在裂解之前形成分子内iVH-VL和VH-iVL结构域(例如经由分子间对形成)。参见例如Igawa等人,Protein Eng.Des.Selection 23(8):667-677(2010)，所述文献特此以引用的方式整体并入并且特别针对界面残基氨基酸取代。
在某些实施方案中，本文所描述的多肽构建体的CD-3结合结构域不仅表现出与人CD-3的强CD-3结合亲和力，而且还显示出与相应食蟹猕猴CD-3蛋白的极佳交叉反应性。在一些情况下，多肽构建体的CD-3结合结构域可与来自食蟹猕猴的CD-3交叉反应。在某些情况下，关于CD-3的人:猕猴KD比率在5与0.2之间。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域可以是结合至CD-3的任何结构域，其包括但不限于来自单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体的结构域。在一些情况下，CD-3结合结构域衍生自最终将使用抗原结合蛋白的相同物种是有益的。例如，对于人使用，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域包含来自抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基可能是有益的。
因此，在一个方面中，抗原结合结构域包括人源化或人结合结构域。在一个实施方案中，人源化或人抗CD-3结合结构域包含本文所述的人源化或人抗CD-3结合结构域的一个或多个(例如所有三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人源化或人抗CD-3结合结构域的一个或多个(例如所有三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区域2(HC CDR2)和的重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个(例如所有三个)LC CDR和一个或多个(例如所有三个)HC CDR的人源化或人抗CD-3结合结构域。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD-3结合结构域包含对CD-3具有特异性的人源化或人轻链可变区，其中对CD-3具有特异性的轻链可变区包含人轻链框架区中的人或非人轻链CDR。在某些情况下，轻链框架区是λ(兰木达(lambda))轻链框架。在其他情况下，轻链框架区是κ(卡帕(kappa))轻链框架。
在一些实施方案中，一个或多个CD-3结合结构域是人源化或全长人的。在一些实施方案中，一个或多个激活CD-3结合结构域针对CD-3表达细胞上的CD-3的KD结合为1000nM或更低。在一些实施方案中，一个或多个激活CD-3结合结构域针对CD-3表达细胞上的CD-3的KD结合为100nM或更低。在一些实施方案中，一个或多个激活CD-3结合结构域针对CD-3表达细胞上的CD-3的KD结合为10nM或更低。在一些实施方案中，一个或多个CD-3结合结构域与食蟹猕猴CD-3具有交叉反应性。在一些实施方案中，一个或多个CD-3结合结构域包含本文所提供的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人源化或人抗CD-3结合结构域包含对CD-3具有特异性的人源化或人重链可变区，其中对CD-3具有特异性的重链可变区包含人重链框架区中的人或非人重链CDR。
在一个实施方案中，抗CD-3结合结构域是包含具有本文所提供的氨基酸序列的轻链和重链的Fv。在一个实施方案中，抗CD-3结合结构域包含：轻链可变区，其包含具有本文所提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有本文所提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95％至99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗CD-3结合结构域是scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区经由scFv接头与包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区连接。scFv的轻链可变区和重链可变区可处于例如以下任何取向：轻链可变区-scFv接头-重链可变区或重链可变区-scFv接头-轻链可变区。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域对CD-3表达细胞上的CD-3具有亲和力，并且KD为1000nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或0.5nM或更低。在一些实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域对CD-3ε具有亲和力，并且KD为1000nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、20nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、1nM或更低或0.5nM或更低。在其他实施方案中，抗原结合蛋白的CD-3结合结构域对CD-3具有低亲和力，即约100nM或更高。
结合CD-3的亲和力可如本领域所知一般使用Biacore或Octet测定例如通过抗原结合蛋白本身或其CD-3结合结构域结合至(涂布于测定盘；展示于微生物细胞表面上；在溶液中等的)CD-3的能力来确定。可通过将配体(例如CD-3)或抗原结合蛋白本身或其CD-3结合结构域固化至珠子、底物、细胞等来测定本公开的抗原结合蛋白本身或其CD-3结合结构域与CD-3的结合活性。可在适当的缓冲液中添加剂，并且在给定温度下将结合伴侣孵育一段时间。在洗涤以去除未结合物质后，可用例如SDS、具有高pH的缓冲液等来释放结合蛋白质，并且例如通过表面等离子共振(SPR)来进行分析。
在许多实施方案中，优选的活性和惰性结合结构域是示于图5中的那些结构域。
B.针对肿瘤靶抗原的抗原结合结构域
除了所描述的CD3和半衰期延长结构域之外，本文所描述的多肽构建体还包含结合至一种或多种靶抗原或单一靶抗原上的一个或多个区的靶结构域。本文涵盖本发明的多肽构建体例如在疾病特异性微环境中或在受试者的血液中在蛋白酶裂解结构域处被裂解，并且每个靶抗原结合结构域将与靶细胞上的靶抗原结合，从而激活CD3结合结构域以结合T细胞。一般而言，TTA结合结构域可在蛋白酶裂解之前与其靶标结合，因此其可“等待”靶细胞被激活为T细胞衔接子。至少一种靶抗原参与疾病、病症或疾患和/或与疾病、病症或疾患相关。示例性靶抗原包括那些与增生性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫性病症、自身免疫疾病、传染性疾病、病毒性疾病、过敏反应、寄生反应、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病相关的那些抗原。在一些实施方案中，靶抗原是表达于肿瘤细胞上的肿瘤抗原。可选地在一些实施方案中，靶抗原与诸如病毒或细菌的病原体相关。至少一种靶抗原还可针对健康组织。
在一些实施方案中，靶抗原是细胞表面分子，诸如蛋白质，脂质或多糖。在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、受损红血细胞、动脉斑块细胞或纤维化组织细胞。
本发明的优选实施方案利用sdABD作为靶向结构域。这些结构域优于scFv ABD，因为将其他VH和VL结构域添加至本发明的构建体中可能使假Fv结构域的形成复杂化。
在一些实施方案中，本发明的前药构建体利用单一TTA结合结构域，诸如通常图3A中所描绘呈sdABD-TTA对形式，和图4中所描述呈“格式4”构型形式。图4示出了使用单抗EGFR ABD，但可使用其他TTA结合结构域。
在一些实施方案中，特别是在格式1和格式2构建体中，本发明的前药构建体利用再次优选地呈sdABD-TTA格式的两种TTA ABD。当使用双重靶向结构域时，其可结合至相同TTA的相同表位。例如，如本文所讨论，本文中的多种构建体利用两个相同的靶向结构域。在一些实施方案中，可使用结合至相同TTA的不同表位的两个靶向结构域，例如，如图5中所示，结合至人EGFR上的不同表位的两个EGFR sdABD。在一些实施方案中，两个靶向结构域结合至不同TTA，参见例如图55。
本文涵盖的多肽构建体包括至少一个抗原结合结构域，其中抗原结合结构域结合至至少一种靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性结合至细胞表面分子。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性结合至肿瘤抗原。在一些实施方案中，靶抗原结合结构域特异性地且独立地结合至选自以下中至少一种的肿瘤靶抗原(“TTA”)：EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、LyPD3、B7H3、CEA和FOLR1。
本发明特别使用如图5中所示的针对人EGFR的sdABD。
本发明中使用的额外实施方案是如图5中所示的针对人FOLR1的sdABD。
本发明中使用的其他实施方案是如图5中所示的针对人B7H3的sdABD。
本发明中使用的额外实施方案是如图5中所示的针对人EpCAM的sdABD。
在一些实施方案中，蛋白酶裂解结构域裂解之前的蛋白质小于约100kDa。在一些实施方案中，蛋白酶裂解结构域裂解之后的蛋白质为约25至约75kDa。在一些实施方案中，蛋白酶裂解之前的蛋白质的尺寸大于肾首过清除阈值(renal threshold for first-passclearance)。在一些实施方案中，蛋白酶裂解之前的蛋白质的消除半衰期为至少约50小时。在一些实施方案中，蛋白酶裂解之前的蛋白质的消除半衰期为至少约100小时。在一些实施方案中，与针对相同靶抗原的IgG相比，蛋白质具有增加的组织渗透。在一些实施方案中，与针对相同靶抗原的IgG相比，蛋白质具有增加的组织分布。
C.半衰期延长结构域
本发明的MCE蛋白质(另外在本文中也称为“COBRATM”蛋白质或构建体)任选地包括半衰期延长结构域。预期此类结构域包括但不限于HSA结合结构域、Fc结构域、小分子和本领域已知的其他半衰期延长结构域。
人血清白蛋白(HSA)(分子质量约67kDa)是以约50mg/ml(600uM)存在于血浆中的最丰富的蛋白质，并且在人体内的半衰期为约20天。HSA用于维持血浆pH，有助于胶体血压，充当许多代谢物和脂肪酸的载剂，并且充当血浆中的主要药物转运蛋白。
与白蛋白的非共价缔合延长了短寿命蛋白质的消除半衰期。例如，当分别静脉内施用至小鼠和兔子时，白蛋白结合结构域与Fab片段的重组融合导致与单独施用Fab片段相比体内清除率降低25倍和58倍，并且半衰期延长26倍和37倍。在另一实例中，当用脂肪酸酰化胰岛素以促进与白蛋白的缔合时，在兔子或猪中皮下注射时观察到长期效应。总之，这些研究证明了白蛋白结合与延长作用之间的关联。
在一个方面中，本文所描述的抗原结合蛋白包括半衰期延长结构域，例如特异性结合至HSA的域。在其他实施方案中，HSA结合结构域是肽。在其他实施方案中，HSA结合结构域是小分子。预期抗原结合蛋白的HSA结合结构域相当小并且在一些实施方案中不超过25kD，不超过20kD，不超过15kD，或不超过10kD。在某些情况下，如果HSA结合结构域是肽或小分子，则其为5kD或更小。
在许多实施方案中，半衰期延长结构域是来自结合至HSA的单结构域抗体的单结构域抗原结合结构域。此结构域在本文中一般称为针对人HSA的“sdABD”(sdABD-HSA)或者“sdABD(1/2)”以将这些结合结构域与针对TTA的sdABD区分开。特别有用的sdABD(1/2)示于图5中。
抗原结合蛋白的半衰期延长结构域提供抗原结合蛋白本身的改变药效动力学和药物动力学。如上所述，半衰期延长结构域延长了消除半衰期。半衰期延长结构域还改变药效学性质，包括改变抗原结合蛋白的组织分布、渗透和扩散。在一些实施方案中，与不具有半衰期延长结合结构域的蛋白质相比，半衰期延长结构域提供改善的组织(包括肿瘤)靶向、组织渗透、组织分布、组织内扩散和增强的功效。在一个实施方案中，治疗方法有效且高效地利用减少量的抗原结合蛋白，导致副作用减少，诸如降低的非肿瘤细胞细胞毒性。
此外，例如HSA结合结构域的半衰期延长结构域的特征包括HSA结合结构域对HSA的结合亲和力。可选择所述HSA结合结构域的亲和力以便在特定多肽构建体中靶向特定的消除半衰期。因此，在一些实施方案中，HSA结合结构域具有高结合亲和力。在其他实施方案中，HSA结合结构域具有中等结合亲和力。在其他实施方案中，HSA结合结构域具有低或边际结合亲和力。示例性结合亲和力包括在10nM或更低(高)、在10nM与100nM之间(中等)和高于100nM(低)下的KD浓度。如上所述，通过诸如表面等离子共振(SPR)的已知方法测定与HSA的结合亲和力。
D.蛋白酶裂解位点
本发明的蛋白质组合物并且特别是前药构建体包括一个或多个蛋白酶裂解位点，通常驻留于可裂解接头中，如本文所概述。
如本文所述，本发明的前药构建体包括至少一个蛋白酶裂解位点，其包含被至少一种蛋白酶裂解的氨基酸序列。在一些情况下，本文所描述的MCE蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个被至少一种蛋白酶裂解的蛋白酶裂解位点。如本文所更全面地讨论，当在前药构建中使用多于一个蛋白酶裂解位点时，其可以是相同的(例如被单一蛋白酶裂解的多个位点)或不同的(被至少两种不同蛋白酶裂解的两个或更多个裂解位点)。如本领域技术人员所理解，含有三个或更多个蛋白酶裂解位点的构建体可利用一个、两个、三个位点等；例如一些构建体可利用三个位点以用于两种不同的蛋白酶等。
蛋白酶裂解位点的氨基酸序列将取决于所靶向的蛋白酶。如本领域已知，存在多种在体内发现并且可能与疾病状态相关的人蛋白酶。
已知蛋白酶由一些病变细胞和组织例如肿瘤或癌细胞分泌，产生富含蛋白酶的微环境(a microenvironment that is rich in proteases/aprotease-richmicroenvironment)。在一些情况下，受试者的血液富含蛋白酶。在一些情况下，肿瘤周围的细胞将蛋白酶分泌至肿瘤微环境中。肿瘤分泌蛋白酶周围的细胞包括但不限于肿瘤基质细胞、肌成纤维细胞、血细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、细胞毒性T淋巴细胞、树突状细胞、间充质干细胞、多形核细胞和其他细胞。在一些情况下，蛋白酶存在于受试者的血液中，例如靶向微生物肽中发现的氨基酸序列的蛋白酶。此特征允许靶向治疗剂(诸如抗原结合蛋白)具有额外的特异性，因为除了所靶向细胞或组织的富含蛋白酶的微环境外，T细胞不会与抗原结合蛋白结合。
在一些情况下，蛋白酶是以序列特异性方式裂解蛋白质的蛋白质。蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶、血清蛋白酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S)、激肽释放酶、hK1、hK10、hK15、KLK7、颗粒酶B、纤维蛋白溶酶、胶原蛋白酶、IV型胶原蛋白酶、基质溶素、因子XA、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶-3)、Mir1-CP、木瓜蛋白酶、HIV-1蛋白酶、HSV蛋白酶、CMV蛋白酶、凝乳酶、肾素、胃蛋白酶、基质蛋白酶、豆荚蛋白酶(legumain)、半胱氨酸蛋白酶(plasmepsin)、猪笼草蛋白酶、金属外肽酶、金属内肽酶、基质金属蛋白酶(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、穿膜肽酶、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、肠激酶、前列腺特异性抗原(PSA、hK3)、白细胞介素-1β转化酶、凝血酶、FAP(FAP-α)、二肽基肽酶和二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26)。
一些合适的蛋白酶和蛋白酶裂解序列示于图5和图6中。
E.接头
如本文所讨论，本发明的不同结构域一般使用氨基酸接头连接在一起，所述氨基酸接头还可赋予功能性，包括柔性或不柔性(例如空间约束)以及使用原位蛋白酶裂解的能力。这些接头可以多种方式分类。
本发明提供“结构域接头”，其用于接合两个或更多个结构域(例如VH和VL，针对VH或VL的靶肿瘤抗原结合结构域(TTABD，有时在本文中也称为“αTTA”(即“抗TTA”))、针对另一组分的半衰期延长结构域等)。例如，结构域接头可以是不可裂解的(NCL)、可裂解的(“CL”)、约束性且可裂解的(CCL)以及约束性且不可裂解的(CNCL)。
1.不可裂解接头
在一些实施方案中，结构域接头是不可裂解的。一般而言，这些结构域接头可以是两种类型中的一种：不可裂解且柔性，其允许构建体中的接头的“上游”和“下游”组分以特定方式进行分子内自组装；或不可裂解且约束性，其中被接头分隔的两个组分不能进行分子内自组装。然而，应注意，在后一种情况下，虽然被不可裂解约束性接头分隔的双组分结构域不进行分子内自组装，但其他分子内组分将自组装以形成假Fv结构域。
(i)不可裂解但柔性接头
在此实施方案中，接头用于一般通过不被患者中的原位蛋白酶裂解的较长的柔性结构域接合各结构域以保存所述结构域的功能。适于连接本发明多肽中的结构域的内部不可裂解接头的实例包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n或(GGGGS)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，接头的长度可为约15个氨基酸。
(ii)不可裂解且约束性接头
在一些情况下，接头不含有裂解位点并且还太短而不允许被接头分隔的蛋白质结构域进行分子内自组装，并且是“约束性不可裂解接头”或“CNCL”。例如，在Pro186中，活性VH和活性VL被不允许VH和VL自组装成活性抗原结合结构域的8个氨基酸(“8聚体”)分隔。在一些实施方案中，接头仍是柔性的；例如(GGGS)n，其中n＝2。在其他实施方案中，尽管一般不太优选，但可使用更刚性的接头，诸如包含脯氨酸或大体积氨基酸的接头。
2.可裂解接头
本文中的所有前药构建体均包含至少一个可裂解接头。因此，在一个实施方案中，结构域接头是可裂解的(CL)，在本文中有时称为“蛋白酶裂解结构域”(“PCD”)。在此实施方案中，CL含有蛋白酶裂解位点，如本文中所概述并且如图5和图6中所描绘。在一些情况下，CL仅含有蛋白酶裂解位点。任选地，取决于裂解识别位点的长度，在CL的N端或C端中任一者或两者处可存在额外的少数连接氨基酸；例如，在裂解位点的N端和C端中任一者或两者上可存在1、2、3、4或5个氨基酸。因此，可裂解接头还可以是约束性(例如8聚体)或柔性的。
在本发明中受到特别关注的是MMP9可裂解接头和穿膜肽酶可裂解接头，特别是MMP9约束性可裂解接头和穿膜肽酶约束性可裂解接头。
VIII.本发明的结构域
本发明为本发明的前药多肽提供多种不同的格式。本发明提供约束性Fv结构域和约束性假Fv结构域。另外，本发明提供多价条件性有效的(“MCE”)蛋白质，其含有两个Fv结构域但是非异构化构建体。如本文所概述，这些结构域可以是非异构化可裂解格式或非异构化不可裂解格式，但每个构建体含有至少一个蛋白酶裂解结构域。
重要地，当这些结构域(Fv结构域和假Fv结构域)在本文中称为“约束性”时，意指如上文所讨论并且示于图37、图38和图39中，仅这些结构域之一需要受到约束，但一般而言，当两个接头均受到约束时，蛋白质具有更好的表达。
本领域技术人员应理解，对于格式1、2和4，本发明的约束性和假Fv结构域的N端至C端顺序存在四种可能性(未示出接头)：aVH-aVL和iVL-iVH、aVH-aVL和iVH-iVL、aVL-aVH和iVL-iVH、aVL-aVH和iVH-iVL。四种可能性全部已经过测试并且四种可能性全部有活性，但第一顺序aVH-aVL和iVL-iVH显示出比其他三者更好的表达。因此，虽然本文中的描述一般以此aVH-aVL和iVL-iVH格式示出，但本文的所有公开内容还包括用于这些结构域的其他顺序。
应注意一般而言，本发明的全长构建体的N端至C端顺序基于aVH-aVL和iVL-iVH取向。
另外，本领域已知在人体内可能存在源自特定ABD的C端序列的免疫原性。因此，一般而言，特别是当构建体的C端终止于sdABD时(例如，许多构建体的sdABD-HSA结构域)，可使用组氨酸标签(His6或His10)。出于纯化原因，本文中的许多或大多数序列使用His6 C端标签产生，但这些序列还可用于降低人体内的免疫原性，如Holland等人,DOI 10.1007/s10875-013-9915-0和WO2013/024059所示。
A.约束性Fv结构域
本发明提供包含使用约束性接头(如本文所概述，其可以是可裂解的(格式1和3)或不可裂解的(格式2和4))共价连接的活性VH和活性VL结构域的约束性Fv结构域。约束性接头在不存在裂解的情况下防止aVH与aVL之间的分子内缔合。因此，约束性Fv结构域一般包含可变结构域内含有的一组六个CDR，其中VH的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3结合人CD-3并且VL的vlCDR1、vCDR2和vlCDR3结合人CD-3，但在前药格式(例如未裂解)中，VH和VL不能进行空间上地缔合以形成活性结合结构域，实际上偏好与假Fv进行分子内配对。
约束性Fv结构域可包含如本文所述的活性VH和活性VL(aVH和aVL)或非活性VH和VL(iVH和iVL，在此情况下其为约束性假Fv结构域)或其组合。
如本领域技术人员所理解，约束性Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
如本文中所概述，针对格式1构建体，约束性Fv结构域可包括使用可裂解接头连接的VH和VL，在诸如图5和图6中所示的那些情况下。在此实施方案中，约束性Fv结构域具有结构(N端至C端)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。一般而言，约束性Fv结构域含有活性VH和VL结构域(例如当缔合时能够结合CD3)，并且因此具有结构(N端至C端)vhFR1-avhCDR1-vhFR2-avhCDR2-vhF R3-avhCDR3-vhFR4-CCL-vlFR1-avlCDR1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avl CDR3-vlFR4。
如本文所概述，对于格式2构建体，约束性Fv结构域可包含使用不可裂解接头连接的VH和VL。在此实施方案中，约束性Fv结构域具有结构(N端至C端)vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhC DR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4。一般而言，约束性Fv结构域含有活性VH和VL结构域(例如当缔合时能够结合CD3)，并且因此具有结构(N端至C端)vhFR1-avh CDR1-vhFR2-avhCDR2-vhFR3-avhCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-avlCD R1-vlFR2-avlCDR2-vlFR3-avlCDR3-vlFR4。
本发明特别使用有具有SEQ ID NO:61的aVH、具有SEQ ID NO:49的aVL和具有SEQID NO:74的结构域接头的约束性不可裂解Fv结构域。
B.约束性假Fv结构域
本发明提供约束性假Fv结构域，其包含使用约束性接头(如本文所概述，其可以是可裂解或不可裂解的)共价连接的非活性或假iVH和iVL结构域。约束性接头在不存在裂解的情况下防止iVH与iVL之间的分子内缔合。因此，约束性假Fv结构域一般包含具有框架区的iVH和iVL，所述框架区允许iVH和iVL的缔合(当呈非约束性格式时)，但所得假Fv结构域不结合至人蛋白质。iVH结构可与aVL结构域组合，并且iVL结构域可与aVH结构组合，但所得结构不与CD3结合。
约束性假Fv结构域包含非活性VH和VL(iVH和iVL)。
如本领域技术人员所理解，约束性假Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
如本文所概述，约束性假Fv结构域可包含使用如格式1、2和4中所示的不可裂解接头或用如格式3所示的可裂解接头连接的iVH和iVL。
一般而言，约束性Fv结构域含有惰性VH和VL结构域(例如当缔合时能够结合CD3)，并且因此具有结构(N端至C端)vhFR1-ivlCDR1-vhFR2-ivlCDR2-vhFR3-ivlCDR3-vhFR4-CNCL-vlFR1-ivhCDR1-vlFR2-ivhCDR2-vlFR3-ivhCDR3-vlFR4。
本发明特别使用有具有SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:69的iVH、具有SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:57的iVL和具有SEQ ID NO:74的结构域接头的约束性不可裂解假Fv结构域。
IX.本发明的格式
如本文所讨论，本发明的前药构建体可采用多种不同的格式，包括具有双TTA结合结构域的可裂解格式、具有双TTA结合结构域的不可裂解格式(其中任一者可具有相同的TTA结合结构域或不同的结合结构域)和具有单靶向结构域的不可裂解格式。
A.具有双重靶向的可裂解格式
本发明提供图1中的“格式1”类型的非异构化可裂解格式。在此实施方案中，约束性Fv结构域包括使用约束性可裂解接头连接的VH和VL结构域并且约束性假Fv结构域使用约束性不可裂解接头。为易于讨论，这些结构域在本文中称为“约束性”，但如上文所讨论并且示于图37、图38和图39中，仅这些结构域之一需要受到约束，但一般而言，当两个接头均受到约束时，蛋白质具有更好的表达。
格式1(以及其他格式)中的所有构建体还具有被人肿瘤蛋白酶裂解的可裂解接头(CL)。
本发明提供前药蛋白，其从N端至C端包含(sdABD-TTA1)-结构域接头-约束性Fv结构域-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-约束性假Fv结域-结构域接头-sdABD-HSA。
如本领域技术人员所理解，约束性Fv结构域或约束性假Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-NCL-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH和iVL具有示于图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至相同的TTA，所述TTA可以是EGFR、EpCAM、FOLR1或B7H3，其序列描绘于图5中。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至不同的TTA。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和EpCAM，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至B7H3和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药构建体包含sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CCL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD(1/2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至相同的TTA，所述TTA可以是EGFR、FOLR1、B7H3或EpCAM，其序列描绘于图5中，并且CCL和CL选自被MMP9或穿膜肽酶裂解的接头，并且sdABD(1/2)具有SEQ ID NO:45。
在格式1中，优选的结构域接头是SEQ ID NO:74(其还充当优选的约束性不可裂解接头)。
在格式1中，优选构建体是Pro140和Pro140b。
B.不可裂解格式
如图2中所示，本发明提供非异构化不可裂解格式。在此实施方案中，应理解，“不可裂解的”仅应用于约束性Fv结构域的键联，因为在前药构建体中存在激活性裂解位点。在此实施方案中，约束性Fv结构域包含使用约束性不可裂解接头连接的VH和VL结构域并且约束性假Fv结构域使用约束性不可裂解接头。
如本领域技术人员所理解，约束性Fv结构域或约束性假Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
本发明提供前药蛋白，其从N端至C端包含(sdABD-TTA1)-结构域接头-约束性Fv结构域-结构域接头-(sdABD-TTA2)-可裂解接头-约束性假Fv结构域-结构域接头-sdABD-HSA。
如本领域技术人员所理解，约束性Fv结构域或约束性假Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVH-CNCL-iVL-结构域接头-sdABD-HSA。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TT A1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iV L-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aV L、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至相同的TTA，所述TTA可以是EGFR、EpCAM、FOL R1或B7H3，其序列描绘于图5中。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TT A1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iV L-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aV L、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至不同的TTA。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TT A1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iV L-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aV L、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和EpCAM，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TT A1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iV L-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aV L、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TT A1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iV L-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aV L、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EGFR和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TT A1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iV L-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和FOLR1，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至EpCAM和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至FOLR1和B7H3，并且sdABD-TTA具有图5中的序列。
在一些实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA1)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-结构域接头-(sdABD-TTA2)-CL-iVL-CNCL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，两个靶向结构域结合至相同的TTA，所述TTA可以是EGFR、FOLR1、B7H3或EpCAM，其序列描绘于图5中，并且CCL和CL选自被MMP9或穿膜肽酶裂解的接头，并且sdABD(1/2)具有SEQ ID NO:45。
在格式2中，优选的结构域接头是SEQ ID NO:74(其还充当优选的约束性不可裂解接头)。
在格式2中，具有特定用途的实施方案包括但不限于Pro186、Pro225、Pro226、Pro233、Pro311、Pro312、Pro313、Pro495、Pro246、Pro254、Pro255、Pro256、Pro420、Pro421、Pro432、Pro479、Pro480、Pro187、Pro221、Pro222、Pro223、Pro224、Pro393、Pro394、Pro395、Pro396、Pro429、Pro430和Pro431。
C.单TTA构建体
如图4中所示，本发明的组合物中还包含类似于格式2构建体但无第二TTA ABD的“格式4”构建体。在此实施方案中，应理解，“不可裂解的”仅应用于约束性Fv结构域的键联，因为在前药构建体中存在激活性裂解位点。在此实施方案中，约束性Fv结构域包含使用约束性不可裂解接头连接的VH和VL结构域并且约束性假Fv结构域使用约束性不可裂解接头。
如本领域技术人员所理解，约束性Fv结构域或约束性假Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
本发明提供前药蛋白，其从N端至C端包含sdABD(TTA)-结构域接头-约束性Fv结构域-可裂解接头-sdABD-HSA-约束性假Fv结构域。(应注意，对于此格式的所有构建体，sdABD-HSA一般不具有His6标签，但其可包含在内)。
如本领域技术人员所理解，约束性Fv结构域或约束性假Fv结构域中的VH和VL的顺序可以是(N端至C端)VH-接头-VL或VL-接头-VH。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVL-CNCL-iVH。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVH-CNCL-iVL。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVH-CNCL-iVL。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVL-CNCL-aVH-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVL-CNCL-iVH。
因此，在一个实施方案中，前药蛋白从N端至C端包含：(sdABD-TTA)-结构域接头-aVH-CNCL-aVL-CL-(sdABD-HSA)-结构域接头-iVL-CNCL-iVH。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL具有示于图5中的序列。在此实施方案中，靶向结构域结合至TTA，所述TTA可以是EGFR、EpCAM、FOLR1或B7H3，其序列描绘于图5中。
在格式4中，优选的结构域接头是SEQ ID NO:74(其还充当优选的约束性不可裂解接头)。
在格式4中，优选sdABD-HAS是具有SEQ ID NO:45的sdABD-HSA。
D.两种蛋白质组合物
在一些实施方案中，本发明的组合物包含在不存在裂解的情况下进行分子内缔合以形成假Fv的两种不同分子，有时称为“hemi-COBRATM”或“半构建体”。在蛋白酶存在的情况下，裂解位点受到裂解，释放出惰性可变结构域，并且蛋白质对随后形成针对CD3的活性抗原结合结构域，如在图3中大体所描绘。
在半构建体的设计中重要的是，活性可变结构域和sdABD-TTA在裂解后保持在一起，从而使得两个裂解部分通过肿瘤表面上的肿瘤抗原受体保持在一起，并且然后可形成活性抗CD3结合结构域。
存在两种不同的一般格式3构建体，其中所述对的每个成员具有单sdABD-TTA(图3A)的那些和具有两种各自针对不同TTA的不同sdABD-TTA的那些(图3B)。
1.具有单TTA结合结构域的Hemi-COBRATM构建体(格式3A)
在一些实施方案中，第一hemi-COBRATM从N端至C端具有sdABD(TTA1)-结构域接头-aVH-CL-iVL-结构域接头-sdABD(1/2)，并且第二hemi-COBRATM具有sdABD(1/2)-结构域接头-iVH-CL-aVL-结构域接头-sdABD(TTA2)。在此实施方案中，aVH、aVL、iVH、iVL和sdABD(1/2)具有示于图5中的序列，并且sdABD-TTAa结合至人EGFR、EpCAM、FOLR1和/或B7H3，并且具有图5中描绘的序列。
2.具有双TTA ABD的Hemi-COBRATM构建体
在一些实施方案中，成对前药构建体可具有两个sdABD-TTA结合结构域/构建体，如在图3B中所示。在此实施方案中，所述对的第一成员从N端至C端包含sdABD-TTA1-结构域接头-sdABD-TTA2-结构域接头-aVH-CL-iVL-结构域接头-sdABD(HAS)，并且第二成员从N端至C端包含sdABD-TTA1-结构域接头-sdABD-TTA2-aVL-CL-iVH-结构域接头-sdABD-HSA。
所述对的每个成员上的两个sdABD-TTA是不同的，但一般而言，两个成员(hemi-COBRATM)均具有相同的两个sdABD-TTA，例如两者均具有EGFR和FOLR1或EGFR和B7H3等。
在一些实施方案中，两个sdABD-TTA均在选自图5中示出的sdABD-TTA。
X.制备本发明的组合物的方法
本发明的前药组合物如本领域技术人员一般所理解并如下文所概述来制备。
本发明提供编码本发明的前药组合物的核酸组合物。如本领域技术人员所理解，核酸组合物将取决于前药多肽的格式。因此，例如，当所述格式需要两种氨基酸序列时，诸如“格式3”构建体，可将两种核酸序列掺入一个或多个表达载体中以用于表达。类似地，作为单多肽的前药构建体(格式1、2和4)在单表达载体中需要单核酸以用于生产。
如本领域所知，编码本发明的组分的核酸可如本领域已知并取决于用于产生本发明的前药组合物的宿主细胞来掺入表达载体中。一般而言，核酸可与任何数目的调节元件(启动子、复制起源、可选择标志物、核糖体结合位点、诱导物等)可操作地连接。表达载体可以是染色体外载体或整合载体。
然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域众所周知的任何数目的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，并且哺乳动物细胞(例如CHO细胞、293细胞)可用于许多实施方案中。
如本领域所众所周知，通过培养包含表达载体的宿主细胞来制备本发明的前药组合物。一旦产生，则进行传统的抗体纯化步骤，包括蛋白质A亲和力色谱步骤和/或离子交换色谱步骤。
XI.本发明的前药组合物的制剂和用于治疗癌症的方法
根据本发明使用的前药组合物的制剂通过以下方式制备以用于储存：将具有所需纯度的前药(在格式1、2和4的情况下为单一蛋白质并且在格式3的情况下为两种蛋白质)与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(如Remington的Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编)混合呈冻干制剂或水溶液形式。
根据已知方法，诸如以推注形式或通过连续输注的静脉内施用在一段时间内将本发明的前药组合物施用于受试者。
本发明的前药组合物适用于治疗癌症。在一个示例性实施方案中，癌症是实体癌症。在多种实施方案中，癌症选自可切除和不可切除的癌症。在一些实施方案中，癌症选自可切除和不可切除的晚期局部癌症。在一些实施方案中，癌症选自可切除和不可切除的转移性癌症。
因此，在一个方面中，本公开提供一种用于通过向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的多肽前药来治疗所述患者的实体癌症的方法。在一些实施方案中，多肽从N端至C端包含：a)结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，b)第一结构域接头，c)包含以下的约束性Fv结构域：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重链结构域、ii)约束性不可裂解接头(CNCL)和包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻链结构域，其中CNCL位于第一可变重链结构域与第一可变轻链结构域之间并防止第一可变重链结构域与第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv，d)第二结构域接头，e)结合至第二人TTA的第二sdABD，f)可裂解接头(CL)，g)包含以下的假Fv结构域：i)第一假可变轻链结构域、ii)不可裂解接头(NCL)和iii)第一假可变重链结构域，h)第三结构域接头和i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD。第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3。当CL是完整的时，多肽不结合CD3。
在多种实施方案中，癌症是头颈癌，例如鳞状细胞癌。在一个示例性实施方案中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌。在一个示例性实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是结直肠瘤。
在一个示例性实施方案中，施用本发明化合物的受试者患有在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法(例如，抗PD1疗法)治疗期间或之后进展的非小细胞肺癌。在一些实施方案中，施用本发明化合物的受试者患有具有EGFR突变或ALK重排的非小细胞肺癌。在一些实施方案中，除用基于铂的化学疗法治疗之外，此癌症在可行的EGFR或ALK靶向疗法之后进展。
在癌症是头颈部鳞状细胞癌的一个示例性实施方案中，施用本发明化合物的受试者的癌症在用抗PDx(例如，抗PD1疗法)(除非不适合，例如患者的化学疗法失败和PD-L1CPS<1)和用于转移性或复发性疾病的基于铂的化学疗法(除非基于铂的化学疗法不适合/不耐受)治疗期间或之后进展。
在一个示例性实施方案中，施用本发明化合物的受试者的前列腺癌已进展或已得到遏制。在一些实施方案中，通过经由血液测试和/或正电子发射断层成像(PET)扫描测量前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺特异性膜抗原(PSMA)的水平来评定前列腺癌进展或遏制。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少16周、至少17周、至少18周、至少19周、至少20周、至少25周、至少30周、至少35周、至少40周、至少45周、至少50周、至少55周或至少60周时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月或至少15个月时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗约6个月时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，PSA的水平相比于治疗开始之前或治疗开始时的其初始水平降低约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多，并且在治疗之后，PSA的水平降低50％、约50％，或50％或更多持续至多约6个月或超过6个月。在一些实施方案中，成功的治疗基于骨转移的消失或减少来测量。在一些实施方案中，通过PET扫描测定可检测转移的减少、转移的大小稳定性和/或转移的大小增加。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来测量：肿瘤大小相比于治疗开始之前或治疗开始时的其初始大小减小至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％(参见附录A中的示例性细节)。
在一些实施方案中，施用本发明化合物的受试者的前列腺癌在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法(例如，抗PD1疗法)治疗期间或之后进展。
在一些实施方案中，本发明的化合物与其他癌症疗法(诸如但不限于放射)组合共施用于患者。
在多种实施方案中，向其中癌症是结直肠癌的受试者施用本发明的化合物：
(a)K-Ras WT：在基于伊立替康(irinotecan)和奥沙利铂(oxaliplatin)两者的化学疗法期间或之后进展或不适合于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法的受试者和对于包括抗EGFR抗体的至少1种先前全身性疗法为复发性或难治性的受试者；
(b)K-Ras突变体：在基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法期间或之后进展或不适合于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法的受试者。
在多种实施方案中，受试者的ECOG体能状态为≤1。
在多种实施方案中，受试者患有根据RECIST v1.1标准可测量并由CT和/或MRI记录的疾病。
在一个示例性实施方案中，受试者在施用本发明的化合物之前已接受免疫检查点疗法，并且检查点抑制剂免疫相关的毒性消退至级别≤1或基线。
在一个示例性实施方案中，受试者患有已进行治疗的有症状的中枢神经系统转移，无症状持续≥14天，并且未进行同步治疗或不患有并发性软脑膜疾病/脊髓压迫。
如本领域技术人员将理解，剂量的选择在具有治疗癌症经验的医师的能力范围内。在一个示例性实施方案中，向受试者施用剂量为约0.3μg/kg至约30μg/kg的本发明的化合物。在一个示例性实施方案中，本发明的化合物向受试者施用约每周一次。
如本领域技术人员将理解，治疗的持续时间在具有治疗癌症经验的医师的能力范围内。
如本领域技术人员将理解，配制本发明的化合物的媒介物可以是任何有用的安全无毒性的药学上可接受的制剂。在一个示例性实施方案中，化合物在0.9mg/ml氯化钠的等渗无菌水溶液中。
A.用EGFR COBRA治疗癌症
在一些实施方案中，本公开提供一种用于通过向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的具有至少一个抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药来治疗所述患者的实体癌症的方法。在一些实施方案中，多肽从N端至C端包含：a)结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)，EGFR的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，b)第一结构域接头，c)包含以下的约束性Fv结构域：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重链结构域、ii)约束性不可裂解接头(CNCL)和包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻链结构域，其中CNCL位于第一可变重链结构域与第一可变轻链结构域之间并防止第一可变重链结构域与第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv，d)第二结构域接头，e)结合至第二人TTA的第二sdABD，f)可裂解接头(CL)，g)包含以下的假Fv结构域：i)第一假可变轻链结构域、ii)不可裂解接头(NCL)和iii)第一假可变重链结构域，h)第三结构域接头和i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD。第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3。当CL是完整的时，多肽不结合CD3。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ IDNO:143(Pro140)、SEQ ID NO:144(Pro140b)、SEQ ID NO:185(Pro141)、SEQ ID NO:199(Pro176)、SEQ ID NO:208(Pro188)、SEQ ID NO:200(Pro178)、SEQ ID NO:201(Pro179)、SEQ ID NO:202(Pro180)、SEQ ID NO:203(Pro181)、SEQ ID NO:204(Pro182)、SEQ ID NO:205(Pro183)、SEQ ID NO:206(Pro184)、SEQ ID NO:207(Pro185)、SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:146(Pro187)、SEQ ID NO:189(Pro189)、SEQ ID NO:2(Pro190)、SEQID NO:191(Pro191)、SEQ ID NO:212(Pro192)、SEQ ID NO:214(Pro195)、SEQ ID NO:215(Pro196)、SEQ ID NO:216(Pro197)、SEQ ID NO:217(Pro198)、SEQ ID NO:165(SEQ ID NO:221)、SEQ ID NO:166(Pro222)、SEQ ID NO:167(Pro223)、SEQ ID NO:168(Pro224)、SEQ IDNO:149(Pro233)、SEQ ID NO:226(Pro247)、SEQ ID NO:227(Pro248)、SEQ ID NO:228(Pro249)、SEQ ID NO:299(Pro250)、SEQ ID NO:230(Pro251)、SEQ ID NO:231(Pro252)、SEQ ID NO:232(Pro253)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ IDNO:169(Pro254)、SEQ ID NO:170(Pro255)、SEQ ID NO:154(Pro256)、SEQ ID NO:233(Pro261)、SEQ ID NO:171(Pro262)、SEQ ID NO:234(Pro294)、SEQ ID NO:250(Pro345)、SEQ ID NO:259(Pro375)、SEQ ID NO:260(Pro376)、SEQ ID NO:157(Pro393)、SEQ ID NO:158(Pro394)、SEQ ID NO:159(Pro395)、SEQ ID NO:160(Pro396)、SEQ ID NO:263(Pro412)、SEQ ID NO:264(Pro413)、SEQ ID NO:265(Pro414)、SEQ ID NO:265(Pro415)、SEQ ID NO:266(Pro416)、SEQ ID NO:267(Pro417)、SEQ ID NO:269(Pro418)、SEQ ID NO:272(Pro429)、SEQ ID NO:162(Pro430)和SEQ ID NO:163(Pro431)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ IDNO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:145(Pro186)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:145(Pro186)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:145(Pro186)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:145(Pro186)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:145(Pro186)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:145(Pro186)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:145(Pro186)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:149(Pro233)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:149(Pro233)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:149(Pro233)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:149(Pro233)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:149(Pro233)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:149(Pro233)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:149(Pro233)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:149(Pro233)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:153(Pro246)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:153(Pro246)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:153(Pro246)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:153(Pro246)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:153(Pro246)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:153(Pro246)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:153(Pro246)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:153(Pro246)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:169(Pro254)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:169(Pro254)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:169(Pro254)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:169(Pro254)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:169(Pro254)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:169(Pro254)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:169(Pro254)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:169(Pro254)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:232(Pro253)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:232(Pro253)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:232(Pro253)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:232(Pro253)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:232(Pro253)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:232(Pro253)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:232(Pro253)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:232(Pro253)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:234(Pro294)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:234(Pro294)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:234(Pro294)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:234(Pro294)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:234(Pro294)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:234(Pro294)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:234(Pro294)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:234(Pro294)。
在多种实施方案中，癌症是头颈癌，例如鳞状细胞癌。在一个示例性实施方案中，癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌。在一个示例性实施方案中，癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，癌症是结直肠瘤。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药来治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述方法包括通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药来治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述方法包括通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药来治疗前列腺癌。在一些实施方案中，所述方法包括通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药来治疗结直肠癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ IDNO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro186(SEQ ID NO:145)治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗肺癌，例如非小细胞肺癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ IDNO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro186(SEQ ID NO:145)治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗前列腺癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗前列腺癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro186(SEQID NO:145)治疗前列腺癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗结直肠癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗结直肠癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro186(SEQID NO:145)治疗结直肠癌。
在一个示例性实施方案中，向患有非小细胞肺癌的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的非小细胞肺癌在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法(例如，抗PD1疗法)治疗期间或之后进展。在一些实施方案中，受试者患有具有EGFR突变或ALK重排的非小细胞肺癌。在一些实施方案中，除用基于铂的化学疗法治疗之外，此癌症在可行的EGFR或ALK靶向疗法之后进展。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ IDNO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:145(Pro186)。
在一个示例性实施方案中，向患有头颈部鳞状细胞癌的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的头颈部鳞状细胞癌在用抗PDx(例如，抗PD1疗法)和用于转移性或复发性疾病的基于铂的化学疗法治疗期间或之后进展。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一个示例性实施方案中，向受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的前列腺癌已进展或已得到遏制停滞。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，通过经由血液测试和/或正电子发射断层成像(PET)扫描测量前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺特异性膜抗原(PSMA)的水平来评定前列腺癌进展或遏制。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少16周、至少17周、至少18周、至少19周、至少20周、至少25周、至少30周、至少35周、至少40周、至少45周、至少50周、至少55周或至少60周时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月或至少15个月时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗约6个月时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，PSA的水平相比于治疗开始之前或治疗开始时的其初始水平降低约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多，并且在治疗之后，PSA的水平降低50％、约50％，或50％或更多持续至多约6个月或超过6个月。在一些实施方案中，成功的治疗基于骨转移的消失或减少来测量。在一些实施方案中，通过PET扫描测定可检测转移的减少、转移的大小稳定性和/或转移的大小增加。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来测量：肿瘤大小相比于治疗开始之前或治疗开始时的其初始大小减小至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％。
在一个示例性实施方案中，向患有前列腺癌的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的前列腺癌在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法(例如，抗PD1疗法)治疗期间或之后进展。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药与其他癌症疗法(诸如但不限于放射)组合共施用于患者。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ IDNO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:145(Pro186)。
在多种实施方案中，向具有野生型K-Ras基因型的患有结直肠癌的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有野生型K-Ras基因型的受试者在化学疗法(例如基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法)期间或之后进展。在一些实施方案中，具有野生型K-Ras基因型的受试者不适合于基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法。在一些实施方案中，具有野生型K-Ras基因型的受试者对于包括抗EGFR抗体的至少1种先前全身性疗法为复发性或难治性的。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:145(Pro186)。
在多种实施方案中，向具有突变K-Ras基因型的患有结直肠癌的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有突变K-Ras基因型的受试者在化学疗法(例如基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法)期间或之后进展。在一些实施方案中，具有突变K-Ras基因型的受试者不适合于基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ IDNO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，向ECOG体能状态不超过1的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，向ECOG体能状态不超过0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，向患有根据RECIST v1.1标准可测量并由CT和/或MRI记录的疾病的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ IDNO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，向在施用之前已接受免疫检查点疗法的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，在施用之前已接受免疫检查点疗法的受试者的检查点抑制剂免疫相关毒性消退至级别≤1或基线。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ IDNO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
在一些实施方案中，向患有有症状的中枢神经系统转移的受试者施用具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的有症状的中枢神经系统转移已得到治疗，并且已无症状持续至少14天，并且未进行同步治疗或不患有并发性软脑膜疾病/脊髓压迫。在一些实施方案中，受试者已无症状持续至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、128、19、20、21、28、35、42、49天或更多天。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。在一些实施方案中，具有抗EGFR单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:145(Pro186)。
如本领域技术人员将理解，剂量的选择在具有治疗癌症经验的医师的能力范围内。在一个示例性实施方案中，向受试者施用剂量为约0.3μg/kg至约30μg/kg的本发明的化合物。在一个示例性实施方案中，本发明的化合物向受试者施用约每周一次。
如本领域技术人员将理解，治疗的持续时间在具有治疗癌症经验的医师的能力范围内。
如本领域技术人员将理解，配制本发明的化合物的媒介物可以是任何有用的安全无毒性的药学上可接受的制剂。在一个示例性实施方案中，化合物在0.9mg/ml氯化钠的等渗无菌水溶液中。
B.用B7H3 COBRA治疗癌症
在一些实施方案中，本公开提供一种用于通过向有需要的患者施用治疗有效量的如本文所述的具有至少一个抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药来治疗所述患者的实体癌症的方法。在一些实施方案中，多肽从N端至C端包含：a)结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)，B7H3的第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，b)第一结构域接头，c)包含以下的约束性Fv结构域：i)包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的第一可变重链结构域、ii)约束性不可裂解接头(CNCL)和包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的第一可变轻链结构域，其中CNCL位于第一可变重链结构域与第一可变轻链结构域之间并防止第一可变重链结构域与第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv，d)第二结构域接头，e)结合至第二人TTA的第二sdABD，f)可裂解接头(CL)，g)包含以下的假Fv结构域：i)第一假可变轻链结构域、ii)不可裂解接头(NCL)和iii)第一假可变重链结构域，h)第三结构域接头和i)结合至人血清白蛋白的第三sdABD。第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3。当CL是完整的时，多肽不结合CD3。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ IDNO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:147(Pro225)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:147(Pro225)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:147(Pro225)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:147(Pro225)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:147(Pro225)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:147(Pro225)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:147(Pro225)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:148(Pro226)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:148(Pro226)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:148(Pro226)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:148(Pro226)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:148(Pro226)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:148(Pro226)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:148(Pro226)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:148(Pro226)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:173(Pro359)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:173(Pro359)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:173(Pro359)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:173(Pro359)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:173(Pro359)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:173(Pro359)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:173(Pro359)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:173(Pro359)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:257(Pro373)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:257(Pro373)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:257(Pro373)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:257(Pro373)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:257(Pro373)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:257(Pro373)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:257(Pro373)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:257(Pro373)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:258(Pro374)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:258(Pro374)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:258(Pro374)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:258(Pro374)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:258(Pro374)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:258(Pro374)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:258(Pro374)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:258(Pro374)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:181(Pro479)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:181(Pro479)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:181(Pro479)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:181(Pro479)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:181(Pro479)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:181(Pro479)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:181(Pro479)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:181(Pro479)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:182(Pro480)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:182(Pro480)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:182(Pro480)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:182(Pro480)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:182(Pro480)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:182(Pro480)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:182(Pro480)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:182(Pro480)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQID NO:183(Pro495)至少95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:183(Pro495)至少96％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:183(Pro495)至少97％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:183(Pro495)至少98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:183(Pro495)至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含与SEQ ID NO:183(Pro495)至少99.5％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过25个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过20个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过15个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过10个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过5个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过4个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过3个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不超过2个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药包含相对于SEQ ID NO:183(Pro495)具有不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ IDNO:183(Pro495)。
在多种实施方案中，癌症是头颈癌，例如鳞状细胞癌，通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一个示例性实施方案中癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌，通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一个示例性实施方案中，癌症是前列腺癌，通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，癌症是结直肠瘤，通过向患者施用治疗有效量的如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ IDNO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro225(SEQ IDNO:147)治疗头颈癌，例如鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗肺癌，例如非小细胞肺癌，所述多肽前药选自SEQ IDNO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro225(SEQ ID NO:147)治疗肺癌，例如非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗前列腺癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗前列腺癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro225(SEQ ID NO:147)治疗前列腺癌。
在一些实施方案中，所述方法包括用如本文所述的具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗结直肠癌。在一些实施方案中，所述方法包括用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药治疗结直肠癌，所述多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，所述方法包括用Pro225(SEQ ID NO:147)治疗结直肠癌。
在一个示例性实施方案中，向患有非小细胞肺癌的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的非小细胞肺癌在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法(例如抗PD1疗法)治疗期间或之后进展。在一些实施方案中，受试者患有具有B7H3突变或ALK重排的非小细胞肺癌。在一些实施方案中，除用基于铂的化学疗法治疗之外，此癌症在可行的B7H3或ALK靶向疗法之后进展。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ IDNO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一个示例性实施方案中，向受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的头颈部鳞状细胞癌在用抗PDx(例如抗PD1疗法)和用于转移性或复发性疾病的基于铂的化学疗法治疗期间或之后进展。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一个示例性实施方案中，向患有前列腺癌的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的前列腺癌已进展或已得到遏制。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ IDNO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，通过经由血液测试和/或正电子发射断层成像(PET)扫描测量前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺特异性膜抗原(PSMA)的水平来评定前列腺癌进展或遏制。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少16周、至少17周、至少18周、至少19周、至少20周、至少25周、至少30周、至少35周、至少40周、至少45周、至少50周、至少55周或至少60周时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月或至少15个月时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：当向患者施用治疗约6个月时，PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多。在一些实施方案中，PSA的水平相比于治疗开始之前或治疗开始时的其初始水平降低约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来评定：PSA的水平相比于其初始水平降低50％、约50％，或50％或更多，并且在治疗之后，PSA的水平降低50％、约50％，或50％或更多持续至多约6个月或超过6个月。在一些实施方案中，成功的治疗基于骨转移的消失或减少来测量。在一些实施方案中，通过PET扫描测定可检测转移的减少、转移的大小稳定性和/或转移的大小增加。在一些实施方案中，成功的治疗基于以下来测量：肿瘤大小相比于治疗开始之前或治疗开始时的其初始大小减小至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％。
在一个示例性实施方案中，向患有前列腺癌的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的前列腺癌在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法(例如抗PD1疗法)治疗期间或之后进展。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药与其他癌症疗法(诸如但不限于放射)组合共施用于患者。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ IDNO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在多种实施方案中，向具有野生型K-Ras基因型的患有结直肠癌的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有野生型K-Ras基因型的受试者在化学疗法(例如基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法)期间或之后进展。在一些实施方案中，具有野生型K-Ras基因型的受试者不适合于基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法。在一些实施方案中，具有野生型K-Ras基因型的受试者对于包括抗B7H3抗体的至少1种先前全身性疗法为复发性或难治性的。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在多种实施方案中，向具有突变K-Ras基因型的患有结直肠癌的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有突变K-Ras基因型的受试者在化学疗法(例如基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法)期间或之后进展。在一些实施方案中，具有突变K-Ras基因型的受试者不适合于基于伊立替康和/或奥沙利铂的化学疗法。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ IDNO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，向ECOG体能状态不超过1的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，向ECOG体能状态不超过0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，向患有根据RECIST v1.1标准可测量并由CT和/或MRI记录的疾病的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ IDNO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，向在施用之前已接受免疫检查点疗法的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药。在一些实施方案中，在施用之前已接受免疫检查点疗法的受试者的检查点抑制剂免疫相关毒性消退至级别≤1或基线。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ IDNO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
在一些实施方案中，向患有有症状的中枢神经系统转移的受试者施用具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药，所述受试者的有症状的中枢神经系统转移已得到治疗，并且已无症状持续至少14天，并且未进行同步治疗或不患有并发性软脑膜疾病/脊髓压迫。在一些实施方案中，受试者已无症状持续至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、128、19、20、21、28、35、42、49天或更多天。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药选自SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。在一些实施方案中，具有抗B7H3单结构域抗原结合结构域的多肽前药是SEQ ID NO:147(Pro225)。
如本领域技术人员将理解，剂量的选择在具有治疗癌症经验的医师的能力范围内。在一个示例性实施方案中，向受试者施用剂量为约0.3μg/kg至约30μg/kg的本发明的化合物。在一个示例性实施方案中，本发明的化合物向受试者施用约每周一次。
如本领域技术人员将理解，治疗的持续时间在具有治疗癌症经验的医师的能力范围内。
如本领域技术人员将理解，配制本发明的化合物的媒介物可以是任何有用的安全无毒性的药学上可接受的制剂。在一个示例性实施方案中，化合物在0.9mg/ml氯化钠的等渗无菌水溶液中。
XII.实施例
A.实施例1：Pro构建体构建和纯化
转染
由单独的表达载体(pcdna3.4衍生物)表达每种蛋白质(例如用于格式1、2和4的单一蛋白质)或构建体对(格式3)。将编码一对hemi-cobra或单链构建体的等量质粒DNA混合并按照制造商的转染方案转染至Expi293细胞中。转染后5天内通过离心(6000rpm×25')和过滤(0.2uM过滤器)收获条件培养基。通过SDS-PAGE确认蛋白质表达。纯化构建体，并且最终缓冲液组成为：25mM柠檬酸盐、75mM精氨酸、75mM NaCl、4％蔗糖，pH 7。将最终制备物储存在-80℃下。
MMP9的激活
根据以下方案激活重组人(rh)MMP9。重组人MMP-9(R&D#911-MP-010)为0.44mg/ml(4.7uM)。在DMSO中以100mM的储备浓度制备对氨基苯汞乙酸盐(APMA)(Sigma)。测定缓冲液为50mM Tris pH 7.5、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05％ Brij-35。
-用测定缓冲液将rhMMP9稀释至约100ug/ml(25ul hMMP9+75uL测定缓冲液)
-添加来自DMSO中的100mM储备液中的对氨基苯汞乙酸盐(APMA)达到最终浓度为1mM(1uL至100uL)
-在37℃下孵育24小时
-将MMP9稀释至10ng/ul(向100ul激活溶液中添加900ul测定缓冲液)
激活rhMMP9的浓度为约100nM。
用于TDCC测定的构建体的裂解
为裂解构建体，向制剂缓冲液(25mM柠檬酸、75mM L-精氨酸、75mM NaCl、4％蔗糖)中的1mg/ml浓度(10.5uM)的100ul蛋白质样品中供应高达10mM的CaCl2。添加激活rhMMP9达到浓度为20至35nM。将样品在室温下孵育过夜(16至20小时)。使用SDS PAGE(10％至20％TG，TG运行缓冲液，200v，1小时)验证裂解的完成度。样品典型地裂解98％。
B.实施例2：T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定
使萤火虫荧光素酶转导的HT-29细胞生长至约80％汇合并用Versene(0.48mMEDTA在PBS-Ca-Mg中)脱离。将细胞离心并重悬于TDCC培养基(5％热灭活FBS在含有HEPES、GlutaMax、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇的RPMI 1640中)中。将纯化的人泛T细胞解冻、离心并重悬于TDCC培养基中。
将HT-29_Luc细胞和T细胞的共培养物添加至384孔细胞培养盘中。然后将连续稀释的COBRA添加至共培养物中并在37℃下孵育48小时。最后，将相等体积的SteadyGlo荧光素酶测定试剂添加至培养盘中并孵育20分钟。在0.1s/孔的暴露时间下在Perkin ElmerEnvision上对培养盘进行读数。记录总发光并在GraphPad Prism 7上对数据进行分析。
C.实施例3：体内过继性T细胞转移功效模型的一般方案设计
这些方案用于许多图式实验中。在NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(The Jackson Laboratory，目录号005557)的右侧腹皮下植入(SC)肿瘤细胞并允许其生长直至达到平均体积为约200mm3的已建立肿瘤。同时将人T细胞在具有来自T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza，目录号04-418Q，5％人血清，1％青霉素/链霉素、0.01mM2-巯基乙醇)中培养约10天，并且补充有重组人IL-2蛋白质。协调小鼠中的肿瘤生长和人T细胞激活/扩增以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后向每只小鼠静脉注射(IV)2.5×106个所培养的人T细胞并施用第一剂量的COBRA或对照分子。小鼠每3天给药一次持续7个剂量(第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天和第18天)，并且然后再跟踪2至3周直至肿瘤体积达到>2000mm3或研究终止。每3天测量一次肿瘤体积。
D.实施例4：EGFR/MMP9 Hemi-COBRA对Pro77和Pro53的体内活性。
在NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(The Jackson Laboratory，目录号005557)的右侧腹皮下植入5×106个LoVo细胞或5×106个HT29细胞并允许其生长直至肿瘤建立。同时将人T细胞在具有来自T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza，目录号04-418Q，5％人血清，1％青霉素/链霉素、0.01mM 2-巯基乙醇)中培养10天，并且补充有重组人IL-2蛋白质。协调小鼠中的肿瘤生长和人T细胞激活/扩增以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后向每只小鼠静脉注射(IV)2.5×106个所培养的人T细胞并施用第一剂量的COBRA或对照分子。小鼠每3天给药一次持续7个剂量(第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天和第18天)，并且然后跟踪直至肿瘤体积达到>2000mm3或研究终止。各组接受0.2mg/kg(mpk)抗EGFR×CD3阳性对照Pro51双特异性抗体(bsAb)、0.5mpk阴性对照抗鸡蛋溶菌酶(HEL)×CD3 bsAb Pro98、含有MMP9可裂解接头的抗EGFR hemi-COBRA对Pro77和Pro53各0.5mpk或含有不可裂解(NCL)接头的抗EGFRhemi-COBRA对Pro74和Pro72各0.5mpk。每3天测量一次肿瘤体积。
E.实施例5：EGFR/MMP9 COBRA Pro140的体内活性。
在NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(The Jackson Laboratory，目录号005557)的右侧腹皮下植入5×106个LoVo细胞或5×106个HT29细胞并允许其生长直至肿瘤建立。同时将人T细胞在具有来自T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza，目录号04-418Q，5％人血清，1％青霉素/链霉素、0.01mM 2-巯基乙醇)中培养10天，并且补充有重组人IL-2蛋白质。协调小鼠中的肿瘤生长和人T细胞激活/扩增以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后向每只小鼠静脉注射(IV)2.5×106个所培养的人T细胞并施用第一剂量的COBRA或对照分子。小鼠每3天给药一次持续7个剂量(第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天和第18天)，并且然后跟踪直至肿瘤体积达到>2000mm3或研究终止。各组接受0.2mpk抗EGFR×CD3阳性对照Pro51双特异性抗体(bsAb)、0.5mpk阴性对照抗鸡蛋溶菌酶(HEL)×CD3 bsAb Pro98或0.5mpk含有MMP9可裂解接头的抗EGFR COBRA Pro140。每3天测量一次肿瘤体积。
F.实施例6：EGFR/MMP9 COBRA Pro186的体内活性。
在NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(The Jackson Laboratory，目录号005557)的右侧腹皮下植入5×106个HT29细胞并允许其生长直至肿瘤建立。同时将人T细胞在具有来自T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi目录号130-091-441)的MACSiBead的G-Rex100M透气烧瓶(Wilson Wolf目录号81100S)中的T细胞培养基(X-VIVO 15[Lonza，目录号04-418Q，5％人血清，1％青霉素/链霉素、0.01mM 2-巯基乙醇)中培养10天，并且补充有重组人IL-2蛋白质。协调小鼠中的肿瘤生长和人T细胞激活/扩增以使得在研究的第0天，基于肿瘤大小将小鼠随机分组(N＝6)；然后向每只小鼠静脉注射(IV)2.5×106个所培养的人T细胞并施用第一剂量的COBRA或对照分子。小鼠每3天给药一次持续7个剂量(第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天和第18天)，并且然后跟踪直至肿瘤体积达到>2000mm3或研究终止。各组接受0.1mg/kg(mpk)抗EGFR×CD3阳性对照Pro51双特异性抗体(bsAb)、0.3mpk的含有不可裂解(NCL)对照接头的抗EGFR COBRA Pro214、0.1或0.3mpk含有MMP9可裂解接头的抗EGFR COBRA Pro140，或0.1或0.3mpk含有MMP9可裂解接头的抗EGFR COBRAPro186。每3天测量一次肿瘤体积。
G.实施例7：抗EGFR序列的成功人源化
结果如下所示。
这些结果显示EGFR结合结构域的人源化是成功的，并且当两个结合位点处于分子上时存在针对靶EGFR的强亲合力。
H.实施例8：EpCAM sdABD的成功人源化
结果如下所示。
这些结果显示EpCAM结合结构域的人源化是成功的。
I.实施例9：EGFR COBRA Pro186在患有晚期癌症的患者中的剂量递增和扩展研究。
此研究的目的是评估EGFR COBRA Pro186(SEQ ID NO:145)在患有不可切除的局部晚期或转移性癌症的患者中的安全性、耐受性、药代动力学(PK)、药效动力学和初步抗肿瘤活性。研究将表征Pro186的安全性、剂量限制性毒性(DLT)和最大耐受/推荐的2期剂量(MTD/RP2D)。剂量递增将以1+3并且然后以3+3设计在患有晚期实体肿瘤的患者中进行。一旦确定MTD/RP2D，就将入组队列扩展阶段以进一步表征在患有头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌或结直肠瘤的患者中的安全性和初始抗肿瘤活性。
大约68名参与者将入组研究。研究将按照初始1+3方案，接着3+3方案以鉴定推荐的II期剂量(RP2D)/最大耐受剂量(MDT)。简言之，在3+3方案中，在施用逐渐增加的剂量水平的三名患者队列中进行试验。当至少2或三名患者经历剂量限制性毒性(DTL)时，终止递增。MDT被确定为不超过1/6的患者经历DTL时的最高可能剂量。因此，将向患有组织学上证实的认为表达EGFR的不可切除的局部晚期或转移性实体癌症的患者施用逐渐增加量的Pro186。
一旦测定RP2D，就将进行队列扩展以进一步表征Pro186在患者中的安全性和初始抗肿瘤活性，所述患者患有：(i)在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法治疗期间或之后进展的非小细胞肺癌(NSCLC)，除用基于铂的化学疗法治疗之外，具有EGFR突变或ALK重排的NSCLC在可行的EGFR或ALK靶向疗法之后必须进展，(ii)在用抗PDx(除非不适合，例如患者的化学疗法失败并且PD-L1 CPS<1)和用于转移性或复发性疾病的基于铂的化学疗法(除非基于铂的化学疗法不适合/不耐受)治疗期间或之后进展的头颈部鳞状细胞癌，和(iii)以下患者的结直肠癌：(a)在基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法期间或之后病情出现进展，或不适合于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法，并且对于包括抗EGFR抗体的至少1种先前全身性疗法为复发性或难治性的K-Ras野生型患者，或(b)携带K-Ras突变并且在基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法期间或之后病情出现进展，或不适合于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法的患者。
研究的纳入标准要求患者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态≤1并且患有根据RECIST v1.1标准可测量并由CT和/或MRI记录的疾病。患者必须允许获取现有存档肿瘤样品(无论是块还是未染色的载玻片)。患者需要同意配对的肿瘤活检：一次在筛选期中并且一次在第一个治疗周期期间。患者还必须具有可接受的实验室参数和充足的器官储备。纳入标准还包括在入组之前先前已接受免疫检查点疗法的患者的检查点抑制剂免疫相关毒性必须消退至级别≤1或基线。患者的有症状的中枢神经系统转移必须已得到治疗，无症状持续≥14天，并且必须未进行同步治疗或不患有并发性软脑膜疾病/脊髓压迫。
预期参与者将使用以下标准来排除：具有已知自身免疫疾病病史的患者(某些例外)、具有临床上显著心血管/血管疾病的患者、具有临床上显著炎性胃肠道病症的患者、具有临床上显著肺损害的患者、在第一研究剂量日的8周内有大手术或创伤性损伤的患者、手术或损伤的伤口未愈合的患者、从第一研究剂量日起<2周内用放射疗法治疗的患者，和从第一研究剂量日起≥4周内有尚未消退的炎性过程的患者。
研究的主要结果测量指标将包括基于体征、症状、身体检查结果和/或实验室结果，从Pro186施用的时间至治疗结束或Pro186的最后一次剂量后28天中的治疗期出现的不良事件的发生率。研究的次要结果测量指标还将包括通过血浆浓度测量的Pro186施用的药代动力学。次要结果测量指标还将包括通过针对血浆抗Pro186抗体的测试测量的试验开始后长达54周的Pro186的免疫原性。研究的次要结果测量指标还将包括使用常规实体肿瘤的反应评估标准1.1版(RECIST v1.1)和修订的RECIST v1.1两者评定的试验开始后长达54周的放射性抗肿瘤活性。
预期试验将表明，Pro186在患有以下的患者中具有抗肿瘤活性：(i)在用基于铂的化学疗法和抗PDx疗法治疗期间或之后进展的非小细胞肺癌(NSCLC)，除用基于铂的化学疗法治疗之外，具有EGFR突变或ALK重排的NSCLC在可行的EGFR或ALK靶向疗法之后必须进展，(ii)在用抗PDx(除非不适合，例如患者的化学疗法失败并且PD-L1 CPS<1)和用于转移性或复发性疾病的基于铂的化学疗法(除非基于铂的化学疗法不适合/不耐受)治疗期间或之后进展的头颈部鳞状细胞癌，和(iii)以下患者的结直肠癌：(a)在基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法期间或之后病情出现进展，或不适合于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法，并且对于包括抗EGFR抗体的至少1种先前全身性疗法为复发性或难治性的K-Ras野生型患者，或(b)携带K-Ras突变并且在基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法期间或之后病情出现进展，或不适合于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法的患者。还预期试验将表明Pro186相比于先前测试的抗CD3双特异性免疫疗法具有较低毒性。
J.实施例10：B7H3 COBRA Pro225在患有不可切除的局部晚期或转移性癌症的患者中的剂量递增和扩展研究
此研究的目的是评估B7H3 COBRA Pro225在患有对标准疗法失败或不耐受的不可切除的局部晚期或转移性癌症的参与者中的安全性和耐受性。所述研究由剂量递增阶段组成以确定Pro225用于队列扩展阶段的推荐剂量。队列扩展阶段将进一步定义Pro225的安全性和初始功效。
大约186名至少18岁的参与者将入组研究。所述研究的纳入标准要求患者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态≤1并且患有根据RECIST v1.1标准可测量并由CT和/或MRI记录的疾病，除了患有仅骨转移的PC的参与者。将在患有组织学上或病理学上确认的不可切除的局部晚期或转移性癌症的参与者中实施剂量递增并且将使用贝叶斯最优区间(BOIN)设计。剂量递增阶段将用于确定推荐的II期剂量(RP2D)，其不高于根据BOIN设计观察到的最大耐受剂量(MDT)。
如果参与者具有组织学上证实的不可切除的局部晚期或转移性恶性瘤，则其将有资格进入研究的队列扩展阶段。简言之，患者将用Pro225治疗长达14个治疗周期，最多总共56个剂量的Pro225。每个治疗周期将为28天。参与者将用Pro225治疗直至发生疾病进展、不可接受的毒性或退出研究。其癌症将由其医生根据常见临床实践来治疗。在研究药物的最后一次剂量之后，每12周将随访一次参与者的生存期持续至少52周。
预期参与者将使用以下标准排除：具有已知自身免疫疾病的病史、在第一剂量的Pro225之前的8周内有大手术或创伤性损伤、手术或损伤的伤口未愈合、具有至少2级的持续或活性感染、在筛选时或在C1D1剂量前评定期间在无氧气设备辅助(room air)下血氧饱和度大于92％、第一剂量的研究药物之前的≥4周内有尚未消退的炎性过程。排除患有慢性轻度炎性过程(诸如放射性肺炎)的参与者，而不考虑其持续时间、在开始研究药物前4周内接种任何活病毒疫苗或2周内接种其他疫苗的参与者。允许每年的灭活流感疫苗接种，并且已知对本文中的Pro225或任何赋形剂过敏的参与者。
研究的主要结果测量指标将包括从Pro225施用时间至大约37个月的治疗期出现的不良事件的发生率。研究的主要结果测量指标还将包括从初始Pro225施用时间至第1周期第28天的剂量限制性毒性(DLT)的发生率。研究的主要结果测量指标还将包括确定从Pro225施用时间至大约37个月的Pro225的最大耐受剂量(MTD)，选择作为毒性率的等渗估计值最接近30％的目标毒性率的剂量。
研究的次要结果测量指标将包括：
·从Pro225施用时间至大约37个月，基于修订的实体肿瘤反应评估标准1.1版(mRECIST 1.1)，具有确认的整体反应率(ORR)的参与者的百分比。
·从Pro225施用时间至大约37个月，基于mRECIST 1.1的反应持续时间(DOR)。
·从第一剂量开始至疾病进展或死亡(无论哪个先出现)，长达大约37个月的无进展生存期(PFS)。
·从开始第一剂量的研究药物至死亡，长达大约37个月的总生存期(OS)。
·从基线至6个月，达到6个月前列腺特异性抗原(PSA)减少≥50％的前列腺癌(PC)参与者的百分比。
·第1周期第1天：0(剂量前)至48小时，第8天、第15天：0至6小时，第22天：0至1小时；第2周期第1天、第8天、第15天、第22天：0至1小时；第3周期第1天：0至4小时；第8天、第15天、第22天：0至1小时；第5周期第1天：0至剂量后1小时(每个周期＝28天)的Pro225的最大观察血浆浓度(Cmax)。将报告Pro225的Cmax。
·第1周期第1天：0(剂量前)至48小时，第8天、第15天：0至6小时，第22天：0至1小时；第2周期第1天、第8天、第15天、第22天：0至1小时；第3周期第1天：0至4小时；第8天、第15天、第22天：0至1小时；第5周期第1天：0至剂量后1小时(每个周期＝28天)的Pro225的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)。将报告Pro225的AUC。
·第1周期第1天：0(剂量前)至48小时，第8天、第15天：0至6小时，第22天：0至1小时；第2周期第1天、第8天、第15天、第22天：0至1小时；第3周期第1天：0至4小时；第8天、第15天、第22天：0至1小时；第5周期第1天：0至剂量后1小时(每个周期＝28天)的Pro225达到最大观察血浆浓度的时间(tmax)。将报告Pro225的tmax。
·第1周期第1天：0(剂量前)至48小时，第8天、第15天：0至6小时，第22天：0至1小时；第2周期第1天、第8天、第15天、第22天：0至1小时；第3周期第1天：0至4小时；第8天、第15天、第22天：0至1小时；第5周期第1天：0至剂量后1小时(每个周期＝28天)的Pro225的终末处置阶段半衰期(t1/2)。将报告Pro225的t1/2。
·第1周期第1天：0(剂量前)至48小时，第8天、第15天：0至6小时，第22天：0至1小时；第2周期第1天、第8天、第15天、第22天：0至1小时；第3周期第1天：0至4小时；第8天、第15天、第22天：0至1小时；第5周期第1天：0至剂量后1小时(每个周期＝28天)的Pro225的总清除率(CL)。将报告Pro225的CL。
·第1周期第1天：0(剂量前)至48小时，第8天、第15天：0至6小时，第22天：0至1小时；第2周期第1天、第8天、第15天、第22天：0至1小时；第3周期第1天：0至4小时；第8天、第15天、第22天：0至1小时；第5周期第1天：0至剂量后1小时(每个周期＝28天)的Pro225的静脉内施用后的稳态分布容积(Vss)。将报告Pro225的VSS。
·从第1周期至第5周期：剂量前(每个周期＝28天)，产生针对Pro225的细胞因子的参与者的百分比。将报告产生针对Pro225的细胞因子的参与者的百分比。
·从第1周期至第5周期：剂量前(每个周期＝28天)，产生针对Pro225的阳性诱导抗药抗体(ADA)的参与者的百分比。将报告产生针对Pro225的阳性诱导ADA的参与者的百分比。
预期试验将表明Pro225在至少患有前列腺癌的患者中具有抗肿瘤活性。还预期试验将表明Pro225相比于先前测试的抗CD3双特异性免疫疗法具有较低毒性。

Claims (76)

1.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的多肽，所述多肽从N端至C端包含：
a)第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)；
b)第一结构域接头；
c)约束性Fv结构域，其包含：
i)第一可变重链结构域，其包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；
ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和
iii)第一可变轻链结构域，其包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其中所述CNCL位于所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域之间并防止所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv；
d)第二结构域接头；
e)第二sdABD，其结合至第二人TTA；
f)可裂解接头(CL)；
g)假Fv结构域，其包含：
i)第一假可变轻链结构域；
ii)不可裂解接头(NCL)；和
iii)第一假可变重链结构域；
h)第三结构域接头；和
i)第三sdABD，其结合至人血清白蛋白；
其中：
所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3；并且
当所述CL是完整的时，所述多肽不结合CD3。
2.一种用于治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的多肽，所述多肽从N端至C端包含：
a)第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其结合至人血清白蛋白；
b)第一结构域接头；
c)假Fv结构域，其包含：
i)第一假可变轻链结构域；
ii)不可裂解接头(NCL)；和
iii)第一假可变重链结构域；
d)可裂解接头(CL)；
e)第二sdABD，其结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)；
f)第二结构域接头；
g)约束性Fv结构域，其包含：
i)第二可变重链结构域，其包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；
ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和
iii)第一可变轻链结构域，其包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其中所述CNCL位于所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域之间并防止所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv；
h)第三结构域接头；
i)第三第二sdABD，其结合至第二人TTA；
其中：
所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3；并且
当所述CL是完整的时，所述多肽不结合CD3。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症是不可切除的癌症。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述癌症是头颈癌。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述癌症是鳞状细胞癌。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述鳞状细胞癌在用基于铂的化学治疗剂和检查点抑制剂的组合疗法期间或之后进展。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或其抗原结合片段。
10.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述非小细胞肺癌在用基于铂的化学治疗剂和检查点抑制剂的组合疗法期间或之后进展。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或其抗原结合片段。
14.如权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述非小细胞肺癌携带EGFR突变。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症在用EGFR靶向疗法治疗期间或之后进展。
16.如权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述非小细胞肺癌携带ALK重排。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症在用ALK靶向疗法治疗期间或之后进展。
18.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述结直肠癌在用基于铂的化学治疗剂和检查点抑制剂的组合疗法期间或之后进展。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或其抗原结合片段。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述结直肠癌不携带K-Ras突变。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述结直肠癌在基于伊立替康或奥沙利铂的化学疗法的组合期间或之后进展并且所述患者已复发或难以用包括EGFR靶向疗法的至少一种先前全身性疗法治疗。
23.如权利要求21所述的方法，其中：
所述患者不适用于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法；并且
所述患者已复发或难以用包括EGFR靶向疗法的至少一种先前全身性疗法治疗。
24.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述结直肠癌携带K-Ras突变。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述结直肠癌在基于伊立替康或奥沙利铂的化学疗法期间或之后进展。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述患者不适用于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法。
27.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述前列腺癌在基于铂的化学疗法期间或之后进展。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述前列腺癌在抗PDx疗法期间或之后进展。
30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述治疗的功效通过经由血液测试和/或正电子发射断层成像(PET)扫描测量前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺特异性膜抗原(PSMA)的水平来评定。
31.如权利要求28所述的方法，其中在包括跨越至少最小时间阈值施用所述多肽的治疗方案之后，所述患者的所述PSA或PSMA水平降低至少一个阈值量指示成功治疗。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述患者具有至少1级的ECOG体能状态。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述患者患有根据RECIST v1.1标准可测量并由CT和/或MRI记录的疾病。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述患者先前已治疗有症状的中枢神经系统转移。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述患者不患有并发性软脑膜疾病。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述第一和所述第二TTA相同。
37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述第一和所述第二TTA不同。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述第一和所述第二人TTA选自EGFR和B7H3。
39.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述第一和所述第二sdABD-TTA选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:41。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述半衰期延长结构域具有SEQ IDNO:45。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述可裂解接头通过选自由以下组成的组的人蛋白酶裂解：MMP2、MMP9、穿膜肽酶A、穿膜肽酶B、组织蛋白酶S、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、颗粒酶B、uPA、激肽释放酶7、基质蛋白酶和凝血酶。
42.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:143(Pro140)、SEQ ID NO:144(Pro140b)、SEQ ID NO:185(Pro141)、SEQ ID NO:199(Pro176)、SEQ ID NO:208(Pro188)、SEQ ID NO:200(Pro178)、SEQ ID NO:201(Pro179)、SEQ ID NO:202(Pro180)、SEQ ID NO:203(Pro181)、SEQ ID NO:204(Pro182)、SEQ ID NO:205(Pro183)、SEQ ID NO:206(Pro184)、SEQ ID NO:207(Pro185)、SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:146(Pro187)、SEQ ID NO:189(Pro189)、SEQ ID NO:2(Pro190)、SEQ ID NO:191(Pro191)、SEQ ID NO:212(Pro192)、SEQ ID NO:214(Pro195)、SEQ ID NO:215(Pro196)、SEQ ID NO:216(Pro197)、SEQ ID NO:217(Pro198)、SEQ ID NO:165(SEQ ID NO:221)、SEQ ID NO:166(Pro222)、SEQ ID NO:167(Pro223)、SEQID NO:168(Pro224)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:226(Pro247)、SEQ ID NO:227(Pro248)、SEQ ID NO:228(Pro249)、SEQ ID NO:299(Pro250)、SEQ ID NO:230(Pro251)、SEQ ID NO:231(Pro252)、SEQ ID NO:232(Pro253)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:170(Pro255)、SEQ ID NO:154(Pro256)、SEQ ID NO:233(Pro261)、SEQ ID NO:171(Pro262)、SEQ ID NO:234(Pro294)、SEQ ID NO:250(Pro345)、SEQ ID NO:259(Pro375)、SEQ ID NO:260(Pro376)、SEQ ID NO:157(Pro393)、SEQ ID NO:158(Pro394)、SEQ ID NO:159(Pro395)、SEQ ID NO:160(Pro396)、SEQ ID NO:263(Pro412)、SEQ ID NO:264(Pro413)、SEQ ID NO:265(Pro414)、SEQ ID NO:265(Pro415)、SEQ ID NO:266(Pro416)、SEQ ID NO:267(Pro417)、SEQ ID NO:269(Pro418)、SEQ ID NO:272(Pro429)、SEQ ID NO:162(Pro430)和SEQ ID NO:163(Pro431)。
43.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:145(Pro186)的氨基酸序列。
44.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:149(Pro233)的氨基酸序列。
45.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:153(Pro246)的氨基酸序列。
46.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:169(Pro254)的氨基酸序列。
47.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:232(Pro253)的氨基酸序列。
48.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:234(Pro294)的氨基酸序列。
49.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ ID NO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。
50.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:147(Pro225)的氨基酸序列。
51.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:148(Pro226)的氨基酸序列。
52.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:173(Pro359)的氨基酸序列。
53.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:257(Pro373)的氨基酸序列。
54.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:258(Pro374)的氨基酸序列。
55.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:181(Pro479)的氨基酸序列。
56.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:182(Pro480)的氨基酸序列。
57.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:183(Pro495)的氨基酸序列。
58.一种用于治疗有需要的患者的结直肠癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的多肽，所述多肽从N端至C端包含：
a)第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)；
b)第一结构域接头；
c)约束性Fv结构域，其包含：
i)第一可变重链结构域，其包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；
ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和
iii)第一可变轻链结构域，其包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其中所述CNCL位于所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域之间并防止所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv；
d)第二结构域接头；
e)第二sdABD，其结合至第二人TTA；
f)可裂解接头(CL)；
g)假Fv结构域，其包含：
i)第一假可变轻链结构域；
ii)不可裂解接头(NCL)；和
iii)第一假可变重链结构域；
h)第三结构域接头；和
i)第三sdABD，其结合至人血清白蛋白；
其中：
所述第一人TTA和所述第二人TTA中的至少一个是EGFR；
所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3；并且
当所述CL是完整的时，所述多肽不结合CD3。
59.一种用于治疗有需要的患者的结直肠癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的多肽，所述多肽从N端至C端包含：
a)第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其结合至人血清白蛋白；
b)第一结构域接头；
c)假Fv结构域，其包含：
i)第一假可变轻链结构域；
ii)不可裂解接头(NCL)；和
iii)第一假可变重链结构域；
d)可裂解接头(CL)；
e)第二sdABD，其结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)；
f)第二结构域接头；
g)约束性Fv结构域，其包含：
i)第二可变重链结构域，其包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；
ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和
iii)第一可变轻链结构域，其包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其中所述CNCL位于所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域之间并防止所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv；
h)第三结构域接头；
i)第三第二sdABD，其结合至第二人TTA；
其中：
所述第一人TTA和所述第二人TTA中的至少一个是EGFR；
所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3；并且
当所述CL是完整的时，所述多肽不结合CD3。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:143(Pro140)、SEQ ID NO:144(Pro140b)、SEQ ID NO:185(Pro141)、SEQID NO:199(Pro176)、SEQ ID NO:208(Pro188)、SEQ ID NO:200(Pro178)、SEQ ID NO:201(Pro179)、SEQ ID NO:202(Pro180)、SEQ ID NO:203(Pro181)、SEQ ID NO:204(Pro182)、SEQ ID NO:205(Pro183)、SEQ ID NO:206(Pro184)、SEQ ID NO:207(Pro185)、SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:146(Pro187)、SEQ ID NO:189(Pro189)、SEQ ID NO:2(Pro190)、SEQ ID NO:191(Pro191)、SEQ ID NO:212(Pro192)、SEQ ID NO:214(Pro195)、SEQ ID NO:215(Pro196)、SEQ ID NO:216(Pro197)、SEQ ID NO:217(Pro198)、SEQ ID NO:165(SEQ IDNO:221)、SEQ ID NO:166(Pro222)、SEQ ID NO:167(Pro223)、SEQ ID NO:168(Pro224)、SEQID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:226(Pro247)、SEQ ID NO:227(Pro248)、SEQ ID NO:228(Pro249)、SEQ ID NO:299(Pro250)、SEQ ID NO:230(Pro251)、SEQ ID NO:231(Pro252)、SEQ ID NO:232(Pro253)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ ID NO:169(Pro254)、SEQ ID NO:170(Pro255)、SEQ ID NO:154(Pro256)、SEQ ID NO:233(Pro261)、SEQ ID NO:171(Pro262)、SEQ ID NO:234(Pro294)、SEQ ID NO:250(Pro345)、SEQ ID NO:259(Pro375)、SEQ ID NO:260(Pro376)、SEQ ID NO:157(Pro393)、SEQ ID NO:158(Pro394)、SEQ ID NO:159(Pro395)、SEQ ID NO:160(Pro396)、SEQ ID NO:263(Pro412)、SEQ ID NO:264(Pro413)、SEQ ID NO:265(Pro414)、SEQ ID NO:265(Pro415)、SEQ ID NO:266(Pro416)、SEQ ID NO:267(Pro417)、SEQ ID NO:269(Pro418)、SEQ ID NO:272(Pro429)、SEQ ID NO:162(Pro430)和SEQ ID NO:163(Pro431)。
61.如权利要求58或59所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:145(Pro186)、SEQ ID NO:149(Pro233)、SEQ ID NO:153(Pro246)、SEQ IDNO:169(Pro254)、SEQ ID NO:232(Pro253)和SEQ ID NO:234(Pro294)。
62.如权利要求58或59所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:145(Pro186)的氨基酸序列。
63.如权利要求58至62中任一项所述的方法，其中所述结直肠癌在用基于铂的化学治疗剂和检查点抑制剂的组合疗法期间或之后进展。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或其抗原结合片段。
65.如权利要求58至64中任一项所述的方法，其中所述结直肠癌不携带K-Ras突变。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述结直肠癌在基于伊立替康或奥沙利铂的化学疗法的组合期间或之后进展并且所述患者已复发或难以用包括EGFR靶向疗法的至少一种先前全身性疗法治疗。
67.如权利要求65所述的方法，其中：
所述患者不适用于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法；并且
所述患者已复发或难以用包括EGFR靶向疗法的至少一种先前全身性疗法治疗。
68.如权利要求58至64中任一项所述的方法，其中所述结直肠癌携带K-Ras突变。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述结直肠癌在基于伊立替康或奥沙利铂的化学疗法期间或之后进展。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述患者不适用于基于伊立替康和奥沙利铂两者的化学疗法。
71.一种用于治疗有需要的患者的头颈部鳞状细胞癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的多肽，所述多肽从N端至C端包含：
a)第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)；
b)第一结构域接头；
c)约束性Fv结构域，其包含：
i)第一可变重链结构域，其包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；
ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和
iii)第一可变轻链结构域，其包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其中所述CNCL位于所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域之间并防止所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv；
d)第二结构域接头；
e)第二sdABD，其结合至第二人TTA；
f)可裂解接头(CL)；
g)假Fv结构域，其包含：
i)第一假可变轻链结构域；
ii)不可裂解接头(NCL)；和
iii)第一假可变重链结构域；
h)第三结构域接头；和
i)第三sdABD，其结合至人血清白蛋白；
其中：
所述第一人TTA和所述第二人TTA中的至少一个是B7H3；
所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3；并且
当所述CL是完整的时，所述多肽不结合CD3。
72.一种用于治疗有需要的患者的头颈部鳞状细胞癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的多肽，所述多肽从N端至C端包含：
a)第一单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其结合至人血清白蛋白；
b)第一结构域接头；
c)假Fv结构域，其包含：
i)第一假可变轻链结构域；
ii)不可裂解接头(NCL)；和
iii)第一假可变重链结构域；
d)可裂解接头(CL)；
e)第二sdABD，其结合至第一人肿瘤靶抗原(TTA)；
f)第二结构域接头；
g)约束性Fv结构域，其包含：
i)第二可变重链结构域，其包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；
ii)约束性不可裂解接头(CNCL)；和
iii)第一可变轻链结构域，其包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其中所述CNCL位于所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域之间并防止所述第一可变重链结构域与所述第一可变轻链结构域相互作用形成能够结合CD3的活性Fv；
h)第三结构域接头；
i)第三第二sdABD，其结合至第二人TTA；
其中：
所述第一人TTA和所述第二人TTA中的至少一个是B7H3；
所述第一可变重链结构域和所述第一可变轻链结构域能够结合人CD3但所述约束性Fv结构域不结合CD3；并且
当所述CL是完整的时，所述多肽不结合CD3。
73.如权利要求71或72所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:147(Pro225)、SEQ ID NO:148(Pro226)、SEQ ID NO:173(Pro359)、SEQ IDNO:257(Pro373)、SEQ ID NO:258(Pro374)、SEQ ID NO:181(Pro479)、SEQ ID NO:182(Pro480)和SEQ ID NO:183(Pro495)。
74.如权利要求71或72所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:147(Pro225)的氨基酸序列。
75.如权利要求71至74中任一项所述的方法，其中所述鳞状细胞癌在用基于铂的化学治疗剂和检查点抑制剂的组合疗法期间或之后进展。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或其抗原结合片段。
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