TW202039542A - 多聚體ｔ細胞調節多肽及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供T細胞調節多聚體多肽，其包含免疫調節多肽且包含抗原決定基呈遞之韋爾姆斯氏瘤(Wilms tumor)肽。T細胞調節多聚體多肽可用於調節T細胞之活性且可用於調節個體中之免疫反應。
Description
本發明涉及一種多聚體T細胞調節多肽及其使用方法，特別是指一種可用於調節T細胞之活性且可用於調節個體中之免疫反應之多聚體T細胞調節多肽及其使用方法。
適應性免疫反應涉及存在於T細胞表面上之T細胞受體(TCR)與抗原呈遞細胞(APC)表面上非共價呈遞之小肽抗原藉由主要組織相容性複合物(MHC；亦在人類中稱為人類白血球抗原(HLA)複合物)進行的接合。此接合表示免疫系統之靶向機制且為T細胞調節(活化或抑制)及效應物功能之必需分子相互作用。在抗原決定基特異性細胞靶向之後，通過使APC上所見之共刺激蛋白與T細胞上之對應物共刺激蛋白接合來激活經靶向之T細胞。驅動T細胞特異性及活化或抑制需要兩種信號，即抗原決定基/TCR結合及APC共刺激蛋白與T細胞共刺激蛋白之接合。TCR對於給定抗原決定基具有特異性；然而，共刺激蛋白並非抗原決定基特異性的且相反通常在全部T細胞上或大T細胞子集上表現。
本發明提供T細胞調節多聚體多肽(TMMP)，其包含免疫調節多肽且包含抗原決定基呈遞韋爾姆斯氏瘤(Wilms tumor)肽。T細胞調節多聚體多肽可用於調節T細胞之活性且可用於調節個體中之免疫反應。
圖1A-1F為本發明之各種TMMP的示意性描繪。
圖2A-2F為本發明之各種經二硫鍵連接之TMMP的示意性描繪。
圖3A-3E提供WT-1多肽之胺基酸序列。圖3A-3E之序列分別列出於SEQ ID NO：399-403中。
圖4A-4E提供本發明之TMMP的示範性多肽鏈的胺基酸序列。圖4A-4E之示範性多肽鏈的序列分別列出於SEQ ID NO：405-409中。抗原決定基序列列出如下：圖4D：CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)；圖4E：CYTWNQMNL(SEQ ID NO：267)。
圖5A-5G提供免疫球蛋白Fc多肽之胺基酸序列。圖5A-5G之序列分別列出於SEQ ID NO：410-421中。
圖6提供來自以下項之β-2微球蛋白(β2M)前驅物(亦即，包括前導序列)的多重胺基酸序列比對：智人(Homo sapiens)(NP_004039.1；SEQ ID NO：19)、黑猩猩(Pan troglodytes)(NP_001009066.1；SEQ ID NO：19)、恆河獼猴(Macaca mulatta)(NP_001040602.1；SEQ ID NO：20)、歐洲牛(Bos taurus)(NP_776318.1；SEQ ID NO：21)及小家鼠(Mus musculus)(NP_033865.2；SEQ ID NO：22)。胺基酸1-20為信號肽。
圖7A-7C提供對偶基因A*0101(SEQ ID NO：23)、A*1101(SEQ ID NO：24)、A*2402(SEQ ID NO：25)及A*3303(SEQ ID NO：26)(圖7A)之全長人類HLA重鏈的胺基酸序列；對偶基因B*0702(SEQ ID NO：27)(圖7B)之全長人類HLA重鏈的胺基酸序列；以及全長人類HLA-C重鏈(SEQ ID NO：28)(圖7C)的胺基酸序列。
圖8提供十一種無前導序列、跨膜結構域及細胞內結構域之成熟I類MHC
重鏈胺基酸序列的比對。頂部至底部：SEQ ID NO：41-51。
圖9A-9B提供HLA-A重鏈胺基酸序列(圖9A；分別為SEQ ID NO：198-206)及共有序列(圖9B；SEQ ID NO：29)之比對。
圖10A-10B提供HLA-B重鏈胺基酸序列(圖10A；分別為SEQ ID NO：207-213)及共有序列(圖10B；SEQ ID NO：30)之比對。
圖11A-11B提供HLA-C重鏈胺基酸序列(圖11A；分別為SEQ ID NO：214-222)及共有序列(圖11B；SEQ ID NO：31)之比對。
圖12提供HLA-E、HLA-F及HLA-G重鏈(分別為SEQ ID NO：32-34)中各者之共有胺基酸序列。各種胺基酸(aa)位置係指示為依次編號之「X」殘基；胺基酸84、139及236之位置加雙下劃線。
圖13提供HLA-A(SEQ ID NO：35)、HLA-B(SEQ ID NO：36)、HLA-C(SEQ ID NO：37)、HLA-E(SEQ ID NO：38)、HLA-F(SEQ ID NO：39)及HLA-G(SEQ ID NO：40)之共有胺基酸序列的比對。
圖14A-14I提供本發明之經雙二硫鍵連接之TMMP的多肽鏈的胺基酸序列。圖14A-14I之多肽鏈的序列分別列出於SEQ ID NO：422-430中。抗原決定基序列列出如下：圖14B：VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)；圖14C：RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)；圖14F：VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)；圖14G：RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)；圖14H：YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)；圖14I：YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)。
圖15描繪本發明之含有WT1(37-45)抗原決定基的TMMP之表現及穩定性資料。
圖16描繪本發明之含有WT1(126-134)抗原決定基的TMMP之表現及穩定性資料。
圖17A-17D提供本發明之經雙二硫鍵連接之TMMP的示意性描繪。
圖18A-18C提供本發明之經二硫鍵連接之TMMP的構型之實例的示意性描繪。
圖19提供免疫調節多肽於本發明之TMMP中的位置之實例的示意性描繪。
圖20A-20R提供本發明之TMMP的示範性多肽鏈的胺基酸序列。圖20A-20R之示範性多肽鏈的序列分別列出於SEQ ID NO：431-448中。抗原決定基序列列出如下：圖20H：CYTWNQMNL(SEQ ID NO：262)；圖20I：CYTWNQMNL(SEQ ID NO：262)；圖20J：CYTWNQMNL(SEQ ID NO：262)；圖20K：CYTWNQMNL(SEQ ID NO：262)；圖20L：CYTWNQMNL(SEQ ID NO：262)；圖20M：NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)；圖20N：NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)；圖20O：NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)；圖20P：NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)；圖20Q：NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)；圖20R：NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)。
圖21描繪含有WT1肽抗原決定基及HLA-A*02重鏈之TMMP對抗原特異性CD8+ T細胞擴增之作用。
圖22描繪在10日促發培養後的8日再刺激培養過程中含有WT1肽抗原決定基之TMMP對來自總PBMC之WT1-特異性CD8+ T細胞之擴增的作用。
圖23描繪由以具有G2C或R12C/G2C構架的含有WT1 37-45之TMMP擴增的WT1-特異性CD8+ T細胞進行之TNF-§及IFN-γ產生。
圖24描繪由以具有R12C/G2C構架的含有WT1 126-134之TMMP擴增的WT1-特異性CD8+ T細胞進行之TNF-§及IFN-γ產生。
圖25描繪二硫鍵對經IL-2驅動之免疫細胞活化的作用。
圖26描繪與普留淨(proleukine)相比，含有變異體IL-2作為免疫調節多肽之TMMP對CGLL-2增殖的作用。
圖27描繪「1715+2380」TMPP與各種Fc受體之結合。
本申請案主張2018年12月19日提交之美國臨時專利申請案第62/782,167號及2019年3月6日提交之美國臨時專利申請案第62/814,684號之優先權，該等申請案之揭示內容以全文引用方式併入本文。
定義
如本文中可互換使用之術語「多核苷酸」及「核酸」係指具有任何長度之核苷酸的聚合物形式，亦即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。因此，此術語包括但不限於單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體、或包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、化學或生物化學修飾、非天然或衍生化核苷酸鹼基之聚合物。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指具有任何長度之胺基酸的聚合物形式，其可包括編碼及非編碼胺基酸、化學或生物化學修飾或衍生化之胺基酸、及具有經修飾肽主鏈之多肽。
多核苷酸或多肽與另一個多核苷酸或多肽具有一定百分比之「序列一致性」意指在比對時在比較兩個序列時鹼基或胺基酸之百分比相同且處於相同相對位置中。序列一致性可以許多不同方式判定。為了判定序列一致性，可使用各種便利方法及在全球資訊網之網址上可獲得之計算機程式(例如BLAS T、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)來比對序列，該等網址包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/。參見，例如Altschul等人(1990),J.Mol.Bioi.215：403-10。
術語「保守胺基酸取代」係指在蛋白質中具有類似側鏈之胺基酸殘基的可互換性。例如，具有脂族側鏈之胺基酸組由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、
白胺酸及異白胺酸組成；具有脂族羥基側鏈之胺基酸組由絲胺酸及蘇胺酸組成；具有含醯胺側鏈之胺基酸組由天冬醯胺及谷醯胺組成；具有芳族側鏈之胺基酸組由苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸組成；具有鹼性側鏈之胺基酸組由離胺酸、精胺酸及組胺酸組成；具有酸性側鏈之胺基酸組由麩胺酸及天冬胺酸組成；且具有含硫側鏈之胺基酸組由半胱胺酸及甲硫胺酸組成。示範性保守胺基酸取代基為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸-甘胺酸、及天冬醯胺-麩醯胺。
如本文所用，術語「免疫學突觸」或「免疫突觸」通常係指適應性免疫反應之兩個相互作用免疫細胞之間的自然界面，包括例如抗原呈遞細胞(APC)或靶細胞與效應細胞例如淋巴細胞、效應T細胞、自然殺手細胞及其類似物之間的界面。APC與T細胞之間的免疫學突觸通常藉由T細胞抗原受體與主要組織相容性複合物分子之間的相互作用來起始，例如，如Bromley等人，Annu Rev Immunol.2001；19：375-96中所述，該文獻之揭露內容以全文引用方式併入本文。
「T細胞」包括所有類型的表現CD3之免疫細胞，包括T-輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T-細胞(CD8+細胞)、T-調節性細胞(Treg)及NK-T細胞。
如本文所用，術語「免疫調節多肽」(亦稱為「共刺激多肽」)包括在抗原呈遞細胞(APC)(例如，樹突狀細胞、B細胞及其類似物)上之多肽，其特異性結合T細胞上之同源共免疫調節多肽，從而提供一個信號，除了藉由例如TCR/CD3複合物與以肽裝載之主要組織相容性複合物(MHC)多肽之結合提供的主要信號之外，該信號亦介導T細胞反應，包括但不限於增殖、活化、分化及其類似反應。免疫調節多肽可包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、Fas配位體(FasL)、誘導性共刺激配位體(ICOS-L)、細胞內黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、
MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配位體受體之激動劑或抗體、以及與B7-H3特異性結合之配位體。
如上文所述，「免疫調節多肽」(在本文中亦稱為「MOD」)特異性結合T細胞上之同源共免疫調節多肽。
本發明之TMMP的「免疫調節結構域」(「MOD」)結合可存在於靶T細胞上之同源共免疫調節多肽。
如本文所用，「異源」意指核苷酸或多肽分別不可見於天然核酸或蛋白質中。
如本文所用，「重組」意指特定核酸(DNA或RNA)為選殖、限制、聚合酶鏈反應(PCR)及/或連接步驟之各種組合的產物，該等組合產生具有與見於自然系統中的內源性核酸可區分之結構性編碼或非編碼序列的構築體。編碼多肽之DNA序列可由cDNA片段或一系列合成寡核苷酸組裝以提供合成核酸，該合成核酸能夠自細胞或無細胞轉錄及轉譯系統中所含之重組轉錄單元表現。
術語「重組表現載體」或「DNA構築體」在本文中可互換使用以指代包含載體及至少一個插入物之DNA分子。重組表現載體通常出於表現及/或繁殖插入物之目的或出於構築其他重組核苷酸序列之目的而生成。插入物可以可操作地連接或不連接至啟動子序列且可以可操作地連接或不連接至DNA調節序列。
如本文所用，術語「親和力」係指兩種試劑(例如抗體與抗原)之可逆結合的平衡常數且表示為解離常數(KD)。親和力可比抗體對不相關胺基酸序列之親和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或大至少1,000倍或更多倍。抗體對靶
蛋白之親和力可為例如約100奈莫耳(nM)至約0.1nM、約100nM至約1皮莫耳(pM)、約100nM至約1飛莫耳(femtomolar)(fM)或更大。如本文所用，術語「親合力」係指兩種或兩種以上試劑之複合物在稀釋後對解離之抵抗。術語「免疫反應性」及「優先結合」在本文中關於抗體及/或抗原結合片段可互換使用。
如本文所用，術語「結合」(例如關於TMMP與T細胞上之多肽(例如T細胞受體)之結合)係指兩個分子之間的非共價相互作用。非共價結合係指兩個分子之間由於例如靜電、疏水性、離子及/或氫鍵相互作用(包括諸如鹽橋及水橋之相互作用)而直接締合。非共價結合相互作用之特徵通常在於解離常數(KD)小於10-6M、小於10-7M、小於10-8M、小於10-9M、小於10-10M、小於10-11M、小於10-12M、小於10-13M、小於10-14M或小於10-15M。「親和力」係指非共價結合強度，結合親和力的增加與較低KD相關聯。「特異性結合」通常係指以至少約10-7M或更大，例如5x 10-7M、10-8M、5 x 10-8M、10-9M、及更大親和力結合。「非特異性結合」通常係指以小於約10-7M之親和力結合(例如，配位體與除了其指定結合位點或受體以外的部分之結合)(例如以10-6M、10-5M、10-4M之親和力結合)。然而，在一些情況下，例如TCR與肽/MHC複合物之間的結合，「特異性結合」可在1μM至100μM或100μM至1mM範圍內。如本文所用，「共價結合」或「共價鍵」係指兩個不同分子之間的一或多個共價化學結合之形成。
術語「治療(treatment/treating)」及其類似詞語在本文中用於通常意指獲得所要藥理學及/或生理學作用。該作用可在完全或部分預防疾病或其症狀方面為預防性的，且/或可在疾病及/或因疾病引起之不良效應的部分或完全治癒方面為治療性的。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物中疾病或症狀之任何治療，且包括：(a)預防疾病或症狀出現於可能傾向於獲得該疾病或症狀但尚未診斷為患有該疾病之受試者中；(b)抑制疾病或症狀，亦即阻止其發展；及/或(c)緩解疾
病，亦即引起疾病消退。治療劑可在疾病或損傷發作之前、期間或之後投與。尤其關注正在發展的疾病之治療，其中該治療使患者之不希望有的臨床症狀穩定或減輕。此類治療理想地在患病組織中的功能完全喪失之前進行。目標療法將理想地在疾病之有症狀階段期間且在一些情況下在疾病之有症狀階段之後投與。
術語「個體(individual)」、「受試者(subject)」、「宿主(host)」及「患者(patient)」在本文中可互換使用且係指需要診斷、處理或治療之任何哺乳動物受試者。哺乳動物包括例如人類、非人靈長類動物、齧齒動物(例如大鼠；小鼠)、兔類動物(例如兔)、有蹄類動物(例如奶牛、綿羊、豬、馬、山羊及類似動物)等。
在進一步描述本發明之前，應瞭解本發明不限於所述特定實施例，因此所述實施例當然可變化。亦應理解，本文所用之術語僅係為了描述具體實施例，並不旨在限制，因為本發明之範疇僅受所附申請專利範圍之限制。
當提供數值範圍時，應瞭解在彼範圍之上限與下限之間的直至下限之十分之一單位之各間插值(除非上下文另外明確規定)以及在彼陳述之範圍內之任何其他陳述值或間插值皆涵蓋在本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍中，且亦涵蓋在本發明內，屬於陳述之範圍內之任何明確排除之界限。在所陳述範圍包括界限之一者或兩者時，排除彼等包括之界限之任一者或兩者的範圍亦可包括在本發明內。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有熟習本發明所屬技術者通常理解的相同含義。雖然類似於或等效於本文所述之彼等的任何方法及材料亦可用於實踐或測試本發明，但現在描述較佳方法及材料。本文提及之所有出版物皆以引用的方式併入本文中以揭露及描述與出版物引用之內容關聯之方法及/或材料。
必須注意的是，除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請
專利範圍中所用，單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「T細胞調節多聚體多肽」包括複數個此類多肽且提及「免疫調節多肽」包括提及一或多種免疫調節多肽及其為熟習此項技術者所知之等效物等。應進一步注意申請專利範圍可經起草以排除任何視情況選用之要素。因此，此陳述意欲充當與敘述申請專利範圍要素關聯使用諸如「唯一」、「僅」及其類似術語之排除性術語或使用「否定性」限制的前提基礎。
應瞭解，為明確起見在單獨實施例之情形下描述之本發明之某些特徵亦可於單一實施例中組合提供。相反，為簡潔起見在單一實施例之情形下描述之本發明之各種特徵亦可單獨或以任何適合子組合提供。本發明所涉及之實施例的全部組合明確由本發明包括，且就如同各個及每個組合個別地及明確地在本文中揭露一般來揭露於本文中。此外，各種實施例及其要素之所有子組合亦由本發明明確包括，且就如同各個及每個此子組合個別地及明確地在本文中揭露一般來揭露於本文中。
本文論述之出版物僅因其揭露內容在本申請案之申請日期之前而加以提供。本文中沒有內容應解釋為承認本發明由於先前發明而無權先於此出版物。此外，提供之公開日期可不同於可能需要獨立確認之實際公開日期。
本發明提供T細胞調節多聚體多肽，其包含免疫調節多肽且包含抗原決定基呈遞韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)肽。TMMP適用於調節T細胞之活性且可用於調節個體中之免疫反應。
T細胞調節多聚體多肽
本發明提供一種T細胞調節多聚體多肽(TMMP)，其包含：a)第一多肽；及b)第二多肽，其中該TMMP包含抗原決定基；第一主要組織相容性複合物(MHC)多肽；第二MHC多肽；一或多種免疫調節多肽；以及視情況選用之免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架。本發明提供一種TMMP，其中該TMMP為異
二聚體，其包含：a)包含第一MHC多肽之第一多肽；及b)包含第二MHC多肽之第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含抗原決定基(例如，呈遞抗原決定基之肽)；其中該第一多肽及/或該第二多肽包含一或多種可以相同或不同的免疫調節多肽；及視情況選用之Ig Fc多肽或非Ig支架。本發明之TMMP在本文中亦稱為「本發明之多聚體多肽」或「synTac」。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的肽抗原決定基為WT-1肽。
本發明提供一種TMMP，其包含異二聚體多肽，該多肽包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽；以及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含至少一種(亦即一或多種)免疫調節多肽。視情況，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽或非Ig支架。該一或多種免疫調節多肽中之至少一者為呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力比相應野生型免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽之親和力有所減小的變異體免疫調節多肽。存在於本發明之TMMP中的抗原決定基以如下親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)：至少100μM(例如至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)。本發明之TMMP結合至第一T細胞之親和力比TMMP結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中第一T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽及以至少100μM之親和力結合抗原決定基的TCR，且其中第二T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽但在其表面上不表現以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)之親和力結合抗原決定基的TCR。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的肽抗原決定基為WT-1肽。
本發明提供一種TMMP，其中該TMMP為：
A)異二聚體，其包含：a)包含第一MHC多肽之第一多肽；及b)包含第二MHC多肽之第二多肽，其中該第一多肽或該第二多肽包含抗原決定基(例如，將抗原
決定基呈遞至T細胞之肽)；其中第一多肽及/或第二多肽包含一或多種可以相同或不同的免疫調節多肽，且其中該一或多種免疫調節多肽中之至少一者可為野生型免疫調節多肽或野生型免疫調節多肽之變異體，其中該變異體免疫調節多肽與相應野生型免疫調節多肽之胺基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代；且其中該第一多肽或該第二多肽視情況包含Ig Fc多肽或非Ig支架；或
B)異二聚體，其包含：a)包含第一MHC多肽之第一多肽；及b)包含第二MHC多肽之第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含抗原決定基；其中該第一多肽及/或該第二多肽包含一或多種可以相同或不同的免疫調節多肽，其中該一或多種免疫調節多肽中之至少一者為野生型免疫調節多肽之變異體，其中該變異體免疫調節多肽與相應野生型免疫調節多肽之胺基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代，其中該一或多個免疫調節結構域中之至少一者為變異體免疫調節多肽，其呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽之親和力相比有所減小，且其中抗原決定基以至少10-7M之親和力結合至T細胞上之TCR，使得：i)該TMMP多肽結合至第一T細胞之親和力比TMMP結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中第一T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽及以至少10-7M之親和力結合抗原決定基的TCR，且其中第二T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽，但在其表面上不表現以至少10-7M之親和力結合抗原決定基的TCR；且/或ii)當藉由生物層干涉術量測時，對照TMMP與同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽變異體之TMMP與同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率範圍為1.5：1至106：1，其中該對照包含野生型免疫調節多肽；且其中該變異體免疫調節多肽與相應野生
型免疫調節多肽之胺基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代；且其中該第一多肽或該第二多肽視情況包含Ig Fc多肽或非Ig支架；或
C)異二聚體，其包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況選用之免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架，其中該TMMP包含一或多個可以相同或不同的免疫調節結構域，其中該一或多個免疫調節結構域中之至少一者：A)在第一多肽之C端；B)在第二多肽之N端；C)在第二多肽之C端；或D)在第一多肽之C端且在第二多肽之N端，且其中該一或多個免疫調節結構域中之至少一者可為野生型免疫調節多肽或野生型免疫調節多肽之變異體，其中該變異體免疫調節多肽與相應野生型免疫調節多肽之胺基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代；且視情況其中該一或多個免疫調節結構域中之至少一者為變異體免疫調節多肽，其呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽之親和力相比有所減小，且其中抗原決定基以至少10-7M之親和力結合至T細胞上之TCR，使得：i)該TMMP結合至第一T細胞之親和力比TMMP結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中第一T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽及以至少10-7M之親和力結合抗原決定基的TCR，且其中第二T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽，但在其表面上不表現以至少10-7M之親和力結合抗原決定基的TCR；且/或ii)當藉由生物層干涉術量測時，對照TMMP與同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽變異體之TMMP與同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率範圍為1.5：1至106：1，其中該對照包含野生型免疫調節多肽；且其中該變異體免疫調節多肽與
相應野生型免疫調節多肽之胺基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的肽抗原決定基為WT-1肽。
本發明提供一種TMMP，其包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況選用之Ig Fc多肽或非Ig支架。本發明之TMMP包含一或多種免疫調節多肽，其中該一或多種免疫調節多肽中之至少一者：A)在第一多肽之C端；B)在第二多肽之N端；C)在第二多肽之C端；或D)在第一多肽之C端且在第二多肽之N端。該一或多種免疫調節多肽中之至少一者為呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽之親和力相比有所減小的變異體免疫調節多肽。存在於本發明之TMMP中的抗原決定基以如下親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)：至少100μM(例如至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)。本發明之TMMP結合至第一T細胞之親和力比TMMP結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中第一T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽及以至少100μM之親和力結合抗原決定基的TCR，且其中第二T細胞在其表面上表現同源共免疫調節多肽但在其表面上不表現以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)之親和力結合抗原決定基的TCR。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的抗原決定基結合至T細胞上之TCR的親和力為約10-4M至約5 x 10-4M、約5 x 10-4M至約10-5M、約10-5M至5 x 10-5M、約5 x 10-5M至10-6M、約10-6M至約5 x 10-6M、約5 x 10-6M至約10-7M、約10-7M至約5 x 10-7M、約5 x 10-7M至約10-8M、或約10-8M至約10-9M。換言之，在一些情況，存在於本發明之TMMP中的抗原決定基結
合至T細胞上之TCR的親和力為約1nM至約5nM、約5nM至約10nM、約10nM至約50nM、約50nM至約100nM、約0.1μM至約0.5μM、約0.5μM至約1μM、約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、約75μM至約100μM。
存在於本發明之TMMP中的免疫調節多肽結合至其同源共免疫調節多肽之親和力比相應野生型免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽之親和力小至少10%、小至少15%、小至少20%、小至少25%、小至少30%、小至少35%、小至少40%、小至少45%、小至少50%、小至少55%、小至少60%、小至少65%、小至少70%、小至少75%、小至少80%、小至少85%、小至少90%、小至少95%、或小大於95%。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽具有之結合親和力為1nM至100nM或100nM至100μM。舉例而言，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽具有之結合親和力為約1nM至約5nM、約5nM至約10nM、約10nM至約50nM、約50nM至約100nM。
免疫調節多肽對其同源共免疫調節多肽之減小的親和力與抗原決定
基對TCR之親和力的組合提供了本發明之TMMP的提高的選擇性。舉例而言，本發明之TMMP與結合至第二T細胞相比選擇性地結合至第一T細胞，該第一T細胞呈現出：i)對存在於TMMP中之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽，該第二T細胞呈現出：i)對除了存在於TMMP中之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽。舉例而言，本發明之TMMP結合至第一T細胞之親和力比其結合第二T細胞之親和力高至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或大於100倍。
在一些情況下，本發明之TMMP當向有需要之個體投與時誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應。換言之，在一些情況下，本發明之TMMP當向有需要之個體投與時藉由調節第一T細胞之活性來誘導抗原決定基特異性T細胞反應，該第一T細胞呈現出：i)對存在於TMMP中之抗原決定基具有特異性之TCR；ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽；且藉由調節第二T細胞之活性來誘導抗原決定基非特異性T細胞反應，該第二T細胞呈現出：i)對除了存在於TMMP中之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、或至少100：1。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為約2：1至約5：1、約5：1至約10：1、約10：1至約15：1、約15：1至約20：1、約20：1至約25：1、約25：1至約50：1、或約50：1至約100：1、或大於
100：1。「調節T細胞之活性」可包括以下各項中之一或多者：i)激活細胞毒性(例如CD8+)T細胞；ii)誘導細胞毒性(例如CD8+)T細胞之細胞毒性活性；iii)誘導細胞毒性(例如CD8+)T細胞對細胞毒素(例如穿孔蛋白；顆粒酶；粒溶蛋白)之產生及釋放；iv)抑制自體反應性T細胞之活性；及其類似效應。
免疫調節多肽對其同源共免疫調節多肽之減小的親和力與抗原決定基對TCR之親和力的組合提供了本發明之TMMP的提高的選擇性。因此，舉例而言，本發明之TMMP與其結合至第二T細胞之親合力相比以更高親合力結合至第一T細胞，該第一T細胞呈現出：i)對存在於TMMP中之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽，該第二T細胞呈現出：i)對除了存在於TMMP中之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽。
免疫調節多肽與其同源共免疫調節多肽之間的結合親和力可藉由生物層干涉術(BLI)，使用經純化之免疫調節多肽及經純化之同源共免疫調節多肽來判定。TMMP與其同源共免疫調節多肽之間的結合親和力可藉由BLI，使用經純化之TMMP及同源共免疫調節多肽來判定。BLI方法為熟習此項技術者熟知。參見，例如Lad等人.(2015)J.Biomol.Screen.20(4)：498-507；以及Shah及Duncan(2014)J.Vis.Exp.18：e51383。
BLI檢定可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)儀器或如下類似儀器進行。TMMP(例如，本發明之TMMP；對照TMMP(其中對照TMMP包含野生型免疫調節多肽))經固定於不溶性支撐物(「生物感測器」)。經固定之TMMP為「靶標」。固定可藉由將捕獲抗體固定至不溶性支撐物上來實現，其中捕獲抗體固定TMMP。例如，固定可藉由將抗Fc(例如，抗人類IgG Fc)抗體固定至不溶性支撐物上來實現，其中經固定之抗Fc抗體結合至且固定TMMP(其中TMMP包
含IgFc多肽)。共免疫調節多肽以若干種不同濃度施加於經固定之TMMP，且記錄儀器之反應。檢定在包含25mM HEPES pH 6.8、5%聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1%牛血清白蛋白及0.02% Tween 20非離子清潔劑之液體介質中進行。共免疫調節多肽與經固定之TMMP之結合在30℃下進行。作為結合親和力之陽性對照，可使用抗I類MHC單株抗體。例如，可使用抗HLA I類單株抗體W6/32(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)編號HB-95；Parham等人(1979)J.Immunol.123：342)，其具有7nM之KD。標準曲線可使用抗I類MHC單株抗體之連續稀釋液來生成。共免疫調節多肽或抗I類MHCmAb為「分析物」。BLI分析自以下兩個表面反射之白光的干涉圖型：i)經固定之多肽(「靶標」)；及ii)內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子(「分析物」；例如，共免疫調節多肽；抗HLA抗體)之數目的變化引起干涉圖型之偏移；干涉圖型中之此偏移可即時量測。描述靶標/分析物相互作用之親和力的兩個動力學術語為締合常數(k a)及解離常數(k d)。該兩個術語之比率(k d/a)產生親和力常數KD。
BLI檢定在多孔板中進行。為了操作該檢定，限定板佈局，限定檢定步驟，且在Octet Data Acquisition軟體中指派生物感測器。使生物感測器組件水合。將經水合之生物感測器組件及檢定板在Octet儀器上平衡10分鐘。一旦採集資料，即將所採集資料加載至Octet Data Analysis軟體中。在處理窗口中藉由指定參考減法、y軸對準、步間校正及Savitzky-Golay濾波之方法來處理資料。在分析窗口中藉由指定分析(締合及解離)、選擇曲線擬合模型(1：1)、擬合方法(全域)及目標窗口(以秒計)之步驟來分析資料。評價擬合品質。若在3倍範圍內，則對各資料追蹤(分析物濃度)之KD值取平均值。KD誤差值應處於親和力常數值之約一個數量級之內；R2值應高於0.95。參見，例如Abdiche等人(2008)J.Anal.Biochem.377：209。
除非本文另外說明，否則本發明之TMMP對同源共免疫調節多肽之
親和力或對照TMMP(其中對照TMMP包含野生型免疫調節多肽)對同源共免疫調節多肽之親和力使用如上文所述之BLI判定。
在一些情況下，i)對照TMMP(其中對照包含野生型免疫調節多肽)與同源共免疫調節多肽之結合親和力同ii)本發明之包含野生型免疫調節多肽變異體之TMMP與同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率當藉由BLI(如上文所述)量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。在一些情況下，i)對照TMMP(其中對照包含野生型免疫調節多肽)與同源共免疫調節多肽之結合親和力同ii)本發明之包含野生型免疫調節多肽變異體之TMMP與同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率當藉由BLI量測時範圍在1.5：1至106：1內，例如1.5：1至10：1、10：1至50：1、50：1至102：1、102：1至103：1、103：1至104：1、104：1至105：1、或105：1至106：1。
作為實例，在對照TMMP包含野生型IL-2多肽時，且在本發明之TMMP包含變異體IL-2多肽(相對於野生型IL-2多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與IL-2受體(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與IL-2受體之結合親和力的比率當藉由BLI量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。在一些情況下，在對照TMMP包含野生型IL-2多肽時，且在本發明之TMMP包含變異體IL-2多肽(相對於野生型IL-2多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與IL-2受體(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與IL-2受體之結合親和力的比率當藉由BLI
量測時範圍在1.5：1至106：1內，例如1.5：1至10：1、10：1至50：1、50：1至102：1、102：1至103：1、103：1至104：1、104：1至105：1、或105：1至106：1。
作為另一實例，在對照TMMP包含野生型PD-L1多肽時，且在本發明之TMMP包含變異體PD-L1多肽(相對於野生型PD-L1多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與PD-1多肽(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與PD-1多肽之結合親和力的比率當藉由BLI量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。
作為另一實例，在對照TMMP包含野生型CD80多肽時，且在本發明之TMMP包含變異體CD80多肽(相對於野生型CD80多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與CTLA4多肽(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與CTLA4多肽之結合親和力的比率當藉由BLI量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。
作為另一實例，在對照TMMP包含野生型CD80多肽時，且在本發明之TMMP包含變異體CD80多肽(相對於野生型CD80多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與CD28多肽(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與CD28多肽之結合親和力的比率當藉由BLI量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。
作為另一實例，在對照TMMP包含野生型4-1BBL多肽時，且在本
發明之TMMP包含變異體4-1BBL多肽(相對於野生型4-1BBL多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與4-1BB多肽(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與4-1BB多肽之結合親和力的比率當藉由BLI量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。
作為另一實例，在對照TMMP包含野生型CD86多肽時，且在本發明之TMMP包含變異體CD86多肽(相對於野生型CD86多肽之胺基酸序列包含1至10個胺基酸取代)作為免疫調節多肽時，i)對照TMMP與CD28多肽(亦即，同源共免疫調節多肽)之結合親和力同ii)本發明之TMMP與CD28多肽之結合親和力的比率當藉由BLI量測時為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。
本發明之TMMP與靶標T細胞之結合親和力可以下列方式量測：A)使本發明之TMMP與在其表面上表現以下各物之靶標T細胞接觸：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至抗原決定基之T細胞受體，其中TMMP包含抗原決定基標籤，使得TMMP結合至靶標T細胞；B)使靶標T細胞結合之TMMP與結合至抗原決定基標籤的經螢光標記之結合劑(例如，經螢光標記之抗體)接觸，從而生成TMMP/靶標T細胞/結合劑複合物；C)使用流動式細胞測量術量測TMMP/靶標T細胞/結合劑複合物之平均螢光強度(MFI)。抗原決定基標籤可為例如FLAG標籤、凝集素標籤、c-myc標籤、聚(組胺酸)標籤等。在TMMP文庫成員之濃度範圍上量測的MFI提供親和力之量度。在TMMP文庫成員之濃度範圍上量測的MFI提供TMMP之半最大有效濃度
(EC50)。在一些情況下，本發明之TMMP對於靶標T細胞之EC50係在nM範圍內；且TMMP對於對照T細胞(其中對照T細胞在其表面上表現：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)並未結合至TMMP中存在之抗原決定基的T細胞受體)之EC50係在μM範圍內。在一些情況下，本發明之TMMP對於對照T細胞之EC50同TMMP對於靶標T細胞之EC50的比率為至少1.5：1、至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、至少100：1、至少500：1、至少102：1、至少5 x 102：1、至少103：1、至少5 x 103：1、至少104：1、至少105：1、或至少106：1。本發明之TMMP對於對照T細胞之EC50同TMMP對於靶標T細胞之EC50的比率為對TMMP之選擇性的表述。
在一些情況下，當如前述段落中所述進行量測時，與TMMP文庫成員與包含以下各物之對照T細胞之結合相比，本發明之TMMP呈現出與靶標T細胞之選擇性結合：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至除了TMMP文庫成員中存在之抗原決定基以外的抗原決定基之T細胞受體。
二聚化TMMP
本發明之TMMP可經二聚化；亦即，本發明提供包含本發明之TMMP之二聚體的多聚體多肽。因此，本發明提供一種TMMP，其包含：A)第一異二聚體，該第一異二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)肽抗原決定基；及ii)第一主要組織相容性複合物(MHC)多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽，其中該第一異二聚體包含一或多種免疫調節多肽；及B)第二異二聚體，該第二異二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽，其中該第二異二聚體包含一或多種免疫調節多肽，且其中該第一異二聚體與該第二異二聚體彼此共價連接。在一些情況下，兩個TMMP之胺基酸序列彼此相
同。在一些情況下，第一異二聚體與第二異二聚體經由第一異二聚體之第二多肽的C端區域及第二異二聚體之第二多肽的C端區域彼此共價連接。在一些情況下，第一異二聚體與第二異二聚體經由第一異二聚體之第二多肽的C端胺基酸及第二異二聚體之第二多肽的C端區域彼此共價連接；例如，在一些情況下，第一異二聚體之第二多肽的C端胺基酸及第二異二聚體之第二多肽的C端區域直接或經由連接子彼此連接。連接子可為肽連接子。肽連接子可具有之長度為1個胺基酸至200個胺基酸(例如，1個胺基酸(aa)至5 aa、5 aa至10 aa、10 aa至25 aa、25 aa至50 aa、50 aa至100 aa、100 aa至150 aa、或150 aa至200 aa)。在一些情況下，第一異二聚體之肽抗原決定基與第二異二聚體之肽抗原決定基包含相同胺基酸序列。在一些情況下，第一異二聚體及第二異二聚體之第一MHC多肽為I類MHCβ2-微球蛋白，且其中第一異二聚體及第二異二聚體之第二MHC多肽為I類MHC重鏈。在一些情況下，第一異二聚體之免疫調節多肽與第二異二聚體之免疫調節多肽包含相同胺基酸序列。在一些情況下，第一異二聚體之免疫調節多肽及第二異二聚體之免疫調節多肽為與相應親本野生型免疫調節多肽相比包含1至10個胺基酸取代之變異體免疫調節多肽，且其中該1至10個胺基酸取代導致變異體免疫調節多肽與同源共免疫調節多肽之親和力結合減小。在一些情況下，第一異二聚體之免疫調節多肽及第二異二聚體之免疫調節多肽各自獨立地選自由以下組成之群：IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、JAG1(CD339)、TGFβ、CD70及ICAM。下文描述適合的MHC多肽、免疫調節多肽及肽抗原決定基之實例。
MHC多肽
如上文所述，本發明之TMMP包括MHC多肽。出於本發明之目的，術語「主要組織相容性複合物(MHC)多肽」旨在包括不同物種之MHC多肽，包括人類MHC(亦稱為人類白血球抗原(HLA))多肽、齧齒動物(例如，小鼠、大鼠
等)MHC多肽、及其他哺乳動物物種之MHC多肽(例如，兔類動物、非人靈長類動物、犬科動物、貓科動物、有蹄類動物(例如，馬、牛、綿羊、山羊等)、及其類似動物。術語「MHC多肽」旨在包括I類MHC多肽(例如，β-2微球蛋白及I類MHC重鏈)。
在一些情況下，第一MHC多肽為I類MHCβ2M(β2M)多肽，且第二MHC多肽為I類MHC重鏈(H鏈)(「MHC-H」))。在其他情況下，第一MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；且第二MHC多肽為β2M多肽。在一些情況下，β2M及MHC-H鏈均為人類來源；亦即，MHC-H鏈為HLA重鏈或其變異體。除非另外明確說明，否則本發明之TMMP不包括I類MHC重鏈之膜錨定結構域(跨膜結構域)或足以將所得TMMP錨定至表現其之細胞(例如，真核細胞，諸如哺乳動物細胞)的I類MHC重鏈之一部分。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈不包括與天然I類MHC重鏈締合之信號肽、跨膜結構域或細胞內結構域(細胞質尾部)。因此，例如，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈僅包括I類MHC重鏈之α1、α2、及α3域。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈具有之長度為約270個胺基酸(aa)至約290 aa。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈具有之長度為270 aa、271 aa、272 aa、273 aa、274 aa、275 aa、276 aa、277 aa、278 aa、279 aa、280 aa、281 aa、282 aa、283 aa、284 aa、285 aa、286 aa、287 aa、288 aa、289 aa或290 aa。
在一些情況下，TMMP之MHC多肽為人類MHC多肽，其中人類MHC多肽亦稱為「人類白血球抗原」(「HLA」)多肽。在一些情況下，TMMP之MHC多肽為I類HLA多肽，例如，β2-微球蛋白多肽或I類HLA重鏈多肽。I類HLA重鏈多肽包括HLA-A重鏈多肽、HLA-B重鏈多肽、HLA-C重鏈多肽、HLA-E重鏈多肽、HLA-F重鏈多肽及HLA-G重鏈多肽。
I類MHC重鏈
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈多肽包含與圖7-13中描繪之任何人類HLA重鏈多肽之全部或部分胺基酸序列(例如，50、75、100、150、200、或250個連續胺基酸)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，I類MHC重鏈具有之長度為270 aa、271 aa、272 aa、273 aa、274 aa、275 aa、276 aa、277 aa、278 aa、279 aa、280 aa、281 aa、282 aa、283 aa、284 aa、285 aa、286 aa、287 aa、288 aa、289 aa或290 aa。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈多肽包含圖7-13中描繪之任一胺基酸序列的1-30、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代(除了指示為在重鏈共有序列中可變之彼等位置)。在一些情況下，I類MHC重鏈不包括跨膜結構域或細胞質域。作為一實例，本發明之TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與圖7A、7B及7C中任一者描繪之人類HLA-A重鏈多肽的胺基酸25-300(缺乏全部或實質上全部前導序列、跨膜序列及細胞質序列)或胺基酸25-365(缺乏前導序列)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
圖7A、7B及7C提供人類白血球抗原(HLA)I類重鏈多肽之胺基酸序列。將信號序列胺基酸1-24加粗且加下劃線。圖7A條目：3A.1為HLA-A重鏈(HLA-A*01：01：01：01或A*0101)(NCBI登錄NP_001229687.1)SEQ ID NO：23；條目3A.2來自HLA-A*1101 SEQ ID NO：24；條目3A.3來自HLA-A*2402 SEQ ID NO：25且條目3A.4來自HLA-A*3303 SEQ ID NO：26。圖7B提供序列HLA-B*07：02：01(HLA-B*0702)NCBI GenBank登錄NP_005505.2(亦參見GenBank登錄AUV50118.1.)。圖7C提供序列HLA-C*0701(GenBank登錄
NP_001229971.1)(HLA-C*07：01：01：01或HLA-Cw*070101，HLA-Cw*07參見GenBank登錄CAO78194.1)。
圖8提供十一種無前導序列或跨膜結構域或細胞內結構域之成熟I類MHC重鏈胺基酸序列的比對。所比對序列為人類HLA-A、HLA-B及HLA-C、小鼠H2K蛋白序列、三種HLA-A變異體(var.1、var.2C及var.2CP)、以及3種人類HLA-A變異體(HLA-A*1101；HLA-A*2402；及HLA-A*3303)。在比對中指出位置(成熟蛋白之84及139)，其中半胱胺酸殘基可經引入(例如，藉由取代)以用於形成二硫鍵以使MHC H鏈-β2M複合物穩定。比對中亦展示位置236(成熟多肽之位置)，其可由半胱胺酸殘基取代，從而可與β2M形成鏈間二硫鍵(例如，在aa 12處)。箭頭出現於彼等位置各自之上方且將殘基加粗。比對(var.2c)中所示之第七HLA-A序列展示以C殘基在位置84、139及236處取代之變異體2的序列。框側翼殘基84、139及236展示在五個殘基之彼等六組之任一側上的五個胺基酸之群，該六組表示為aac1(對於「胺基酸簇1」)、aac2(對於「胺基酸簇2」)、aac3(對於「胺基酸簇3」)、aac4(對於「胺基酸簇4」)、aac5(對於「胺基酸簇5」)及aac6(對於「胺基酸簇6」)，該等殘基可經獨立地選自以下之1至5個胺基酸置換：(i)任何天然存在之胺基酸或(ii)或除脯胺酸或甘胺酸以外的任何天然存在之胺基酸。
關於圖8，在一些情況下：i)aac1(胺基酸簇1)可為胺基酸序列GTLRG(SEQ ID NO：287)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，L經I、V、A或F置換)之序列；ii)aac2(胺基酸簇2)可為胺基酸序列YNQSE(SEQ ID NO：288)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N經Q置換，Q經N置換，且/或E經D置換)之序列；iii)aac3(胺基酸簇3)可為胺基酸序列TAADM(SEQ ID NO：289)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，T經S置換，A經G置換，D經E置換，且/或M
經L、V或I置換)之序列；iv)aac4(胺基酸簇4)可為胺基酸序列AQTTK(SEQ ID NO：290)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，A經G置換，Q經N置換，或T經S置換，且/或K經R或Q置換)之序列；v)aac5(胺基酸簇5)可為胺基酸序列VETRP(SEQ ID NO：291)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，V經I或L置換，E經D置換，T經S置換，且/或R經K置換)之序列；且/或vi)aac6(胺基酸簇6)可為胺基酸序列GDGTF(SEQ ID NO：292)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，D經E置換，T經S置換，或F經L、W或Y置換)之序列。
圖9-11提供成熟HLA I類重鏈胺基酸序列(無前導序列或跨膜結構域或細胞內結構域)之比對。圖9A中經比對之胺基酸序列為以下對偶基因之HLA-AI類重鏈：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303及A*3401。圖10A中經比對之胺基酸序列為以下對偶基因之HLA-B I類重鏈：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601及B*5301。圖11A中經比對之胺基酸序列為以下對偶基因之HLA-C I類重鏈：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0801及C*1502。在比對中指出位置(成熟蛋白之84及139)，其中半胱胺酸殘基可經引入(例如，藉由取代)以用於形成二硫鍵以使HLAH鏈-β2M複合物穩定。比對中亦展示位置236(成熟多肽之位置)，其可由半胱胺酸殘基取代，從而可與β2M形成鏈間二硫鍵(例如，在aa 12處)。框側翼殘基84、139及236展示在五個殘基之彼等六組之任一側上的五個胺基酸之群，該六組表示為aac1(對於「胺基酸簇1」)、aac2(對於「胺基酸簇2」)、aac3(對於「胺基酸簇3」)、aac4(對於「胺基酸簇4」)、aac5(對於「胺基酸簇5」)及aac6(對於「胺基酸簇6」)，該等殘基可經獨立地選自以下之1至5個胺基酸置換：(i)任何天然存在之胺基酸或(ii)或除脯胺酸或甘胺酸以外的任何天然存在之胺基酸。
圖9A、10A及11A分別提供成熟HLA-A、HLA-B及HLA-C I類重鏈之胺基酸序列的比對。提供成熟蛋白之細胞外部分(無前導序列或跨膜結構域或細胞內結構域)之序列。如圖8所述，亦展示aa殘基84、139及236以及其側翼殘基(aac1至aac6)之位置，該等殘基可經獨立地選自以下之1至5個胺基酸置換：(i)任何天然存在之胺基酸或(ii)除了脯胺酸或甘胺酸以外的任何天然存在之胺基酸。圖9B、10B及11B提供分別在圖9A、10A及11A中所提供之HLA-A、HLA-B及HLA-C序列之共有胺基酸序列。共有序列將可變胺基酸位置展示為依次編號之「X」殘基且將胺基酸84、139及236之位置加雙下劃線。
關於圖9A，在一些情況下：i)aac1(胺基酸簇1)可為胺基酸序列GTLRG(SEQ ID NO：287)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，L經I、V、A或F置換)之序列；ii)aac2(胺基酸簇2)可為胺基酸序列YNQSE(SEQ ID NO：288)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N經Q置換，Q經N置換，且/或E經D置換)之序列；iii)aac3(胺基酸簇3)可為胺基酸序列TAADM(SEQ ID NO：289)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，T經S置換，A經G置換，D經E置換，且/或M經L、V或I置換)之序列；iv)aac4(胺基酸簇4)可為胺基酸序列AQTTK(SEQ ID NO：290)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，A經G置換，Q經N置換，或T經S置換，且或K經R或Q置換)之序列；v)aac5(胺基酸簇5)可為胺基酸序列VETRP(SEQ ID NO：291)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，V經I或L置換，E經D置換，T經S置換，且/或R經K置換)之序列；且/或vi)aac6(胺基酸簇6)可為胺基酸序列GDGTF(SEQ ID NO：292)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，D經E置換，T經S置換，或F經L、W或Y置換)之序列。
關於圖10A，在一些情況下：i)aac1(胺基酸簇1)可為胺基酸序列
RNLRG(SEQ ID NO：293)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N經T或I置換；且/或L經A置換；且/或第二R經L置換；且/或G經R置換)之序列；ii)aac2(胺基酸簇2)可為胺基酸序列YNQSE(SEQ ID NO：288)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N經Q置換，Q經N置換，且/或E經D置換)之序列；iii)aac3(胺基酸簇3)可為胺基酸序列TAADT(SEQ ID NO：294)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，第一T經S置換；且/或A經G置換；且/或D經E置換；且/或第二T經S置換)之序列；iv)aac4(胺基酸簇4)可為胺基酸序列AQITQ(SEQ ID NO：295)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，A經G置換；且/或第一Q經N置換；且/或I經L或V置換；且/或T經S置換；且/或第二Q經N置換)之序列；v)aac5(胺基酸簇5)可為胺基酸序列VETRP(SEQ ID NO：291)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，V經I或L置換，E經D置換，T經S置換，且/或R經K置換)之序列；且/或vi)aac6(胺基酸簇6)可為胺基酸序列GDRTF(SEQ ID NO：296)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，D經E置換；且/或T經S置換；且/或R經K或H置換；且/或F經L、W或Y置換)之序列。
關於圖11A，在一些情況下：i)aac1(胺基酸簇1)可為胺基酸序列RNLRG(SEQ ID NO：293)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N經K置換；且/或L經A或I置換；且/或第二R經H置換；且/或G經T或S置換)之序列；ii)aac2(胺基酸簇2)可為胺基酸序列YNQSE(SEQ ID NO：288)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，N經Q置換，Q經N置換，且/或E經D置換)之序列；iii)aac3(胺基酸簇3)可為胺基酸序列TAADT(SEQ ID NO：294)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，第一T經S置換；且/或A經G置換；且/或D經E置換；且/
或第二T經S置換)之序列；iv)aac4(胺基酸簇4)可為胺基酸序列AQITQ(SEQ ID NO：295)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，A經G置換；且/或第一Q經N置換；且/或I經L置換；且/或第二Q經N或K置換)之序列；v)aac5(胺基酸簇5)可為胺基酸序列VETRP(SEQ ID NO：291)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，V經I或L置換，E經D置換，T經S置換，且/或R經K或H置換)之序列；且/或vi)aac6(胺基酸簇6)可為胺基酸序列GDGTF(SEQ ID NO：292)或有一或兩個胺基酸缺失或經其他天然存在之胺基酸取代(例如，D經E置換；且/或T經S置換；且/或F經L、W或Y置換)之序列。
HLA-A
在一些情況下，本發明之TMMP包含HLA-A重鏈多肽。可併入本發明之TMMP中的HLA-A重鏈肽序列或其部分包括但不限於以下對偶基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303及A*3401，其在無全部或實質上全部圖9A中之前導序列、跨膜序列及細胞質序列的情況下比對。彼等對偶基因中之任一者可包含在位置84、139及/或236(如圖9A所示)之一或多者處的選自以下之突變：在位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；在位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；在位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。另外，亦可採用與彼等HLA-A對偶基因之序列之全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)或100%胺基酸序列一致性之HLA-A序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含HLA-A重鏈多肽，其包含以
下HLA-A共有胺基酸序列：
作為一實例，TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與以下人類HLA-A重鏈胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
在一些情況下，適用於包含在本發明之TMMP中的HLA-A重鏈多肽包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：297)。此HLA-A重鏈多肽亦稱為「HLA-A*0201」或簡稱為「HLA-A02」。在一些情況下，C端Pro不包括在本發明之TMMP中。舉例而言，在一些情況下，適用於包含在本發明之TMMP中的HLA-A02多肽包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：449)。
HLA-A(Y84A；A236C)
在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含Y84A及A236C取代。舉例而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-A重鏈(Y84A；A236C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
在一些情況下，適用於包含在本發明之TMMP中的HLA-A重鏈多肽為包含以下胺基酸序列之HLA-A02(Y84A；A236C)多肽：
在一些情況下，適用於包含在本發明之TMMP中的HLA-A重鏈多肽為包含以下胺基酸序列之HLA-A02(Y84A；A236C)多肽：
HLA-A(Y84C；A139C)
在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含Y84C及A139C取代。舉例而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-A重鏈(Y84C；A139C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-A11(HLA-A*1101)
作為一個非限制性實例，TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與以下人類HLA-A11重鏈胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-A11(Y84A；A236C)
作為一個非限制性實例，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽為包含Y84A及A236C取代之HLA-A11對偶基因。舉例而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-A A11重鏈(Y84A；A236C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：301)，其中胺基酸84為Ala且胺基酸236為Cys。在一些情況下，Cys-236與包含R12C取代之變異體β2M多肽之Cys-12形成鏈間二硫鍵。
HLA-A24(HLA-A*2402)
作為一個非限制性實例，本發明之TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與以下人類HLA-A24重鏈胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：302)。此類I類MHC重鏈在亞洲人群中可為突出的，該亞洲人群包括亞洲人種之個體
群體。在一些情況下，胺基酸84為Ala。在一些情況下，胺基酸84為Cys。在一些情況下，胺基酸236為Cys。在一些情況下，胺基酸84為Ala且胺基酸236為Cys。在一些情況下，胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A33(HLA-A*3303)
作為一個非限制性實例，本發明之TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與以下人類HLA-A33重鏈胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：303)。
此類I類MHC重鏈在亞洲人群中可為突出的，該亞洲人群包括亞洲人種之個體群體。在一些情況下，胺基酸84為Ala。在一些情況下，胺基酸84為Cys。在一些情況下，胺基酸236為Cys。在一些情況下，胺基酸84為Ala且胺基酸236為Cys。在一些情況下，胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-B
在一些情況下，本發明之TMMP包含HLA-B重鏈多肽。可併入本發明之TMMP中的HLA-B重鏈肽序列或其部分包括但不限於以下對偶基因：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601及B*5301，其在無全部或實質上全部圖10A中之前導序列、跨膜序列及細胞質序列的情況下比對。彼等對偶基因中之任一者可包含在位置84、139及/或236(如圖10A所示)之一或
多者處的選自以下之突變：在位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；在位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；在位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。另外，亦可採用包含與彼等HLA-B對偶基因之全部或一部分序列(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的HLA-B多肽(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含HLA-B重鏈多肽，其包含以下HLA-B共有胺基酸序列：
作為一實例，本發明之TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與以下人類HLA-B重鏈胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B(Y84A；A236C)
作為一個非限制性實例，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽為包含Y84A及A236C取代之HLA-B多肽。舉例而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-B重鏈(Y84A；A236C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：305)，其中胺基酸84為Ala且胺基酸236為Cys。在一些情況下，Cys-236與包含R12C取代之變異體β2M多肽之Cys-12形成鏈間二硫鍵。
HLA-B(Y84C；A139C)
在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含Y84C及A139C取代。舉例
而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-B重鏈(Y84C；A139C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*0702
作為一實例，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈多肽包含圖10A中之HLA-B*0702(SEQ ID NO：207)的胺基酸序列或與該序列之全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一些情況下，在本發明之TMMP之HLA-B重鏈多肽與圖8中之經序列標記之HLA-B或圖10A中之經標記之「B*0702具有小於100%一致性時，其可包含在位置84、139及/或236中之一或多者處的選自以下之突變：在位置84處酪胺酸至丙胺酸之取代(Y84A)；在位置84處酪胺酸至半胱胺酸之取代(Y84C)；在位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。在一些情況下，本發明之TMMP之HLA-B重鏈多肽包含Y84A及A236C取代。在一些情況下，本發明之TMMP之HLA-B*0702重鏈多肽包含Y84C及A139C取代。
在一些情況下，本發明之TMMP之HLA-B重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C取代。
HLA-C
在一些情況下，本發明之TMMP包含HLA-C重鏈多肽。可併入本發明之TMMP中的HLA-C重鏈多肽或其部分包括但不限於以下對偶基因：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0801及C*1502，其在無全部或實質上全部圖11A中之前導序列、跨膜序列及細胞質序列的情況下比對。彼等對偶基因中之任一者可包含在位置84、139及/或236(如圖11A所示)中之一或多者處的選自以下之突變：在位置84處酪胺酸至丙胺酸之取代(Y84A)；在位置84處酪胺酸至半胱胺酸之取代(Y84C)；在位置139處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A139C)；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。另外，亦可採用包含與彼等HLA-C對偶基因之全部或一部分序列(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的HLA-C多肽(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含HLA-C重鏈多肽，其包含以下HLA-C共有胺基酸序列：
作為一實例，本發明之TMMP之I類MHC重鏈多肽可包含與以下人類HLA-C重鏈胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C(Y84A；A236C)
作為一個非限制性實例，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽為包含Y84A及A236C取代之HLA-C多肽。舉例而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-C重鏈(Y84A；A236C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：308)，其中胺基酸84為Ala且胺基酸236為Cys。在一些情況下，Cys-236與包含R12C取代之變異體β2M多肽之Cys-12形成鏈間二硫鍵。
HLA-C(Y84C；A139C)
在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含Y84C及A139C取代。舉例而言，在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與以下人類HLA-C重鏈(Y84C；A139C)胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0701
在一些情況下，本發明之TMMP之I類MHC重鏈多肽包含圖11A中之HLA-C*0701的胺基酸序列(圖8中之經標記之HLA-C)或與該序列之全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)或100%
胺基酸序列一致性之胺基酸序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一些情況下，在本發明之TMMP之HLA-C重鏈多肽與圖11A中之經序列標記之HLA-C*0701具有小於100%一致性時，其可包含在位置84、139及/或236中之一或多者處的選自以下之突變：在位置84處酪胺酸至丙胺酸之取代(Y84A)；在位置84處酪胺酸至半胱胺酸之取代(Y84C)；在位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。在一些情況下，本發明之TMMP之HLA-C重鏈多肽包含Y84A及A236C取代。在一些情況下，T-細胞-MMP或其抗原決定基偶聯物之HLA-C*0701重鏈多肽包含Y84C及A139C取代。在一些情況下，本發明之TMMP之HLA-C重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C取代。
非經典HLA-E、HLA-F及HLA-GI類MHC重鏈
在一些情況下，本發明之TMMP包含非經典I類MHC重鏈多肽。可併入本發明之TMMP中的非經典HLA重鏈多肽或其部分包括但不限於HLA-E、HLA-F及HLA-G對偶基因之彼等。HLA-E、HLA-F及HLA-G重鏈多肽之胺基酸序列(以及HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因)可見於全球資訊網hla.alleles.org/nomenclature/index.html、歐洲生物信息研究所(www(dot)ebi(dot)ac(dot)uk，該研究所為歐洲分子生物學實驗室(EMBL)之一部分)、及美國國家生物技術信息中心(www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov)。
適合的HLA-E對偶基因之非限制性實例包括但不限於HLA-E*0101(HLA-E*01：01：01：01)、HLA-E*01：03(HLA-E*01：03：01：01)、HLA-E*01：04、HLA-E*01：05、HLA-E*01：06、HLA-E*01：07、HLA-E*01：09及HLA-E*01：10。適合的HLA-F對偶基因之非限制性實例包括但不限於HLA-F*0101(HLA-F*01：01：01：01)、HLA-F*01：02、HLA-F*01：03(HLA-F*01：03：01：01)、HLA-F*01：04、HLA-F*01：05及HLA-F*01：06。適合的HLA-G對偶基因之非限
制性實例包括但不限於HLA-G*0101(HLA-G*01：01：01：01)、HLA-G*01：02、HLA-G*01：03(HLA-G*01：03：01：01)、HLA-G*01：04(HLA-G*01：04：01：01)、HLA-G*01：06、HLA-G*01：07、HLA-G*01：08、HLA-G*01：09：HLA-G*01：10、HLA-G*01：10、HLA-G*01：11、HLA-G*01：12、HLA-G*01：14、HLA-G*01：15、HLA-G*01：16、HLA-G*01：17、HLA-G*01：18：HLA-G*01：19、HLA-G*01：20及HLA-G*01：22。無前導序列、跨膜序列及細胞質序列中之全部或實質上全部之彼等HLA E、HLA-F及HLA-G對偶基因之共有序列提供於圖12中，且將其與圖13中之上文提及的HLA-A、HLA-B及HLA-C對偶基因之共有序列進行比對。
圖12提供HLA-E、HLA-F及HLA-G中各者之共有序列，其中可變aa位置指示為依次編號之「X」殘基且aa 84、139及236之位置加雙下劃線。
圖13提供在圖9-13中給出之HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F及HLA-G之共有胺基酸序列的比對。各序列中之可變殘基經列出為「X」，其中序列編號已移除。如圖8所示，指示aa84、139及236及其側翼之五胺基酸簇之位置，該五胺基酸簇可經獨立地選自以下之1至5個胺基酸置換：(i)任何天然存在之胺基酸或(ii)除了脯胺酸或甘胺酸以外的任何天然存在之胺基酸。
上文提及之HLA-E、HLA-F及/或HLA-G對偶基因中之任一者可包含如圖13所示之共有序列在位置84、139及/或236中之一或多者處的取代。在一些情況下，該等取代可選自：位置84酪胺酸至丙胺酸(Y84A)或半胱胺酸(Y84C)，或在HLA-F情況下，為R84A或R84C取代；位置139丙胺酸至半胱胺酸(A139C)，或在HLA-F情況下，為V139C；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。另外，亦可採用與圖13所列之共有序列中任一者之全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%)或100%
胺基酸序列一致性之HLA-E、HLA-F及/或HLA-G序列(例如，除了其中列出之可變殘基的變化以外，該等序列亦可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。
小鼠H2K
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的I類MHC重鏈多肽包含小鼠H2K(SEQ ID NO：45)(圖8中之小鼠H2K)的胺基酸序列或與該序列之全部或一部分(例如，50、75、100、150、200或250個連續胺基酸)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、或25-30個胺基酸插入、缺失及/或取代)。在一些情況下，在本發明之TMMP之小鼠H2K重鏈多肽與圖8中之經序列標記之小鼠H2K具有小於100%一致性時，其可包含在位置84、139及/或236中之一或多者處的選自以下之突變：在位置84處酪胺酸至丙胺酸(Y84A)；在位置84處酪胺酸至半胱胺酸(Y84C)；在位置139處丙胺酸至半胱胺酸(A139C)；及在位置236處丙胺酸至半胱胺酸之取代(A236C)。在一些情況下，本發明之TMMP之小鼠H2K重鏈多肽包含Y84A及A236C取代。在一些情況下，本發明之TMMP之小鼠H2K重鏈多肽包含Y84C及A139C取代。在一些情況下，本發明之TMMP之小鼠H2K重鏈多肽包含Y84C、A139C及A236C取代。
示範性組合
以下表1呈現可併入本發明之TMMP中的I類MHC重鏈序列修飾之各種組合。
β-2微球蛋白
本發明之TMMP之β2-微球蛋白(β2M)多肽可為人類β2M多肽、非人靈長類動物β2M多肽、鼠類β2M多肽及類似物。在一些情況下，β2M多肽包
含與圖6中描繪之β2M多肽胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，β2M多肽包含與圖6中描繪之β2M胺基酸序列之胺基酸21至119具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在一些情況下，適合的β2M多肽包含以下胺基酸序列：IQRTPKIQVY SCHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO：311)；且HLA I類重鏈多肽包含以下胺基酸序列：
在一些情況下，MHC多肽相對於參考MHC多肽(其中參考MHC多肽可為野生型MHC多肽)包含單一胺基酸取代，其中單一胺基酸取代以半胱胺
酸(Cys)殘基取代一胺基酸。此等半胱胺酸殘基當存在於本發明之TMMP之第一多肽的MHC多肽中時，可以與存在於本發明之TMMP之第二多肽鏈中的半胱胺酸殘基形成二硫鍵。
在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽中的第一MHC多肽及/或本發明之TMMP之第二多肽中的第二MHC多肽包括胺基酸取代以用半胱胺酸取代胺基酸，其中第一MHC多肽中之經取代半胱胺酸與第二MHC多肽中之半胱胺酸形成二硫鍵，其中第一MHC多肽中之半胱胺酸與第二MHC多肽中之經取代半胱胺酸形成二硫鍵，或其中第一MHC多肽中之經取代半胱胺酸與第二MHC多肽中之經取代半胱胺酸形成二硫鍵。
舉例而言，在一些情況下，HLA β2-微球蛋白及HLA I類重鏈中之以下殘基對之一經半胱胺酸取代(其中殘基編號為成熟多肽之彼等)：1)β2M殘基12，HLA I類重鏈殘基236；2)β2M殘基12，HLA I類重鏈殘基237；3)β2M殘基8，HLA I類重鏈殘基234；4)β2M殘基10，HLA I類重鏈殘基235；5)β2M殘基24，HLA I類重鏈殘基236；6)β2M殘基28，HLA I類重鏈殘基232；7)β2M殘基98，HLA I類重鏈殘基192；8)β2M殘基99，HLA I類重鏈殘基234；9)β2M殘基3，HLA I類重鏈殘基120；10)β2M殘基31，HLA I類重鏈殘基96；11)β2M殘基53，HLA I類重鏈殘基35；12)β2M殘基60，HLA I類重鏈殘基96；13)β2M殘基60，HLA I類重鏈殘基122；14)β2M殘基63，HLA I類重鏈殘基27；15)β2M殘基Arg3，HLA I類重鏈殘基Gly120；16)β2M殘基His31，HLA I類重鏈殘基Gln96；17)β2M殘基Asp53，HLA I類重鏈殘基Arg35；18)β2M殘基Trp60，HLA I類重鏈殘基Gln96；19)β2M殘基Trp60，HLA I類重鏈殘基Asp122；20)β2M殘基Tyr63，HLA I類重鏈殘基Tyr27；21)β2M殘基Lys6，HLA I類重鏈殘基Glu232；22)β2M殘基Gln8，HLA I類重鏈殘基Arg234；23)β2M殘基Tyr10，HLA I類重鏈殘基Pro235；24)β2M殘基Ser11，HLA I類重鏈殘基Gln242；25)
β2M殘基Asn24，HLA I類重鏈殘基Ala236；26)β2M殘基Ser28，HLA I類重鏈殘基Gllu232；27)β2M殘基Asp98，HLA I類重鏈殘基His192；及28)β2M殘基Met99，HLA I類重鏈殘基Arg234。MHC/HLA I類重鏈之胺基酸編號係參考成熟MHC/HLA I類重鏈，無信號肽。舉例而言，在一些情況下，成熟HLA-A胺基酸序列之殘基236經Cys取代。在一些情況下，成熟HLA-B胺基酸序列之殘基236經Cys取代。在一些情況下，成熟HLA-C胺基酸序列之殘基236經Cys取代。在一些情況下，圖6中描繪之胺基酸序列的殘基32(對應於成熟β2M之Arg-12)經Cys取代。
在一些情況下，β2M多肽包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：310)。在一些情況下，β2M多肽包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：311)。
在一些情況下，HLA I類重鏈多肽包含以下胺基酸序列：
在一些情況下，HLA I類重鏈多肽包含以下胺基酸序列：
在一些情況下，HLA I類重鏈多肽包含以下胺基酸序列：
在一些情況下，β2M多肽包含以下胺基酸序列：IQRTPKIQVY S C HPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLIYYTEF TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM(SEQ ID NO：311)；且本發明之TMMP之HLA I類重鏈多肽包含以下胺基酸序列：
在一些情況下，β2M多肽包含以下胺基酸序列：IQRTPKIQVYS C HPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDL
SFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID NO：314)。
在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽通過以下各物彼此經二硫鍵連接：i)存在於連接第一多肽鏈中之肽抗原決定基與β2M多肽之連接子中的Cys殘基；及ii)存在於第二多肽鏈中之I類MHC重鏈中的Cys殘基。在一些情況下，存在於I類MHC重鏈中之Cys殘基為作為Y84C取代引入之Cys。在一些情況下，連接第一多肽鏈中之肽抗原決定基與β2M多肽之連接子為GCGGS(G4S)n(SEQ ID No：315)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9。舉例而言，在一些情況下，連接子包含胺基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：316)。作為另一實例，連接子包含胺基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：317)。本發明之TMMP之經二硫鍵連接的第一多肽與第二多肽之實例示意性描繪於圖2A-2F中。
經多個二硫鍵鍵合之TMMP
在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽藉由至少兩個二硫鍵(亦即，兩個鏈間二硫鍵)彼此連接。此類經多個二硫鍵連接之TMMP之實例示意性描繪於圖17A及17B以及圖18A-18C中。另外，在本發明之TMMP包含IgFc多肽時，異二聚體TMMP可經二聚化，使得二硫鍵連接兩個異二聚體TMMP中之IgFc多肽。此種排列示意性描繪於圖17C及17D中，其中二硫鍵由虛線表示。除非另外說明，否則在此部分中的經多個二硫鍵連接之TMMPP中所述之至少兩個二硫鍵並非指代連接經二聚化TMMP中之IgFc多肽的二硫鍵。
如上文所述，在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽藉由至少兩個二硫鍵(亦即，兩個鏈間二硫鍵)彼此連接。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽藉由2個鏈間二硫鍵彼此連接。作為另一實例，在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽藉由3
個鏈間二硫鍵彼此連接。作為另一實例，在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽藉由4個鏈間二硫鍵彼此連接。
在一些情況下，在本發明之TMMP之第一多肽中的肽抗原決定基藉由包含Cys之連接子連接至β2M多肽時，至少兩個二硫鍵中之至少一者連接該連接子中之Cys與第二多肽之I類MHC重鏈中之Cys。在一些情況下，在本發明之TMMP之第一多肽中的肽抗原決定基藉由連接子連接至I類MHC重鏈多肽時，至少兩個二硫鍵中之至少一者連接該連接子中之Cys與存在於第二多肽之β2M多肽中之Cys。
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比呈現出增加的穩定性。在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比呈現出增加的活體外穩定性。舉例而言，在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比呈現出至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少50%、至少2倍、至少5倍或至少10倍更大之活體外穩定性。
本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比是否呈現出增加的活體外穩定性，可藉由隨時間且/或在指定條件下且/或在TMMP純化期間量測存在於樣品中的經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之量來判定。
舉例而言，在一些情況下，當TMMP在37℃下保存一段時間(例如，約1週至約2週、約2週至約4週、或約4週至約2個月之時間段)時，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比呈現出至少5%、至少10%、至少15%、
至少20%、至少25%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或至少10倍更大之活體外穩定性。例如，在一些情況下，在37℃下在活體外保存本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)達28日之後剩餘的經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之量與在37℃下在活體外保存對照TMMP(包括存在於經多個二硫鍵連接之TMMP中的至少兩個二硫鍵中僅一者之TMMP)達28日之後剩餘的經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之量相比係至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或至少10倍更多。
作為一實例，包含如圖14A及14B中所描繪之多肽1715及2380的經雙二硫鍵連接之TMMP與包含多肽2405及2380之TMMP相比呈現出更大的活體外穩定性，其中多肽2405描繪於圖14D中，其中此類TMMP包含僅一個二硫鍵聯，其中單一二硫鍵在以下各物之間形成：i)在抗原決定基與β2M之間的G2C連接子之Cys；與ii)藉由I類MHC重鏈中之Y84C取代提供之Cys。作為另一實例，包含如圖14A及14B中所描繪之多肽1715及2380的經雙二硫鍵連接之TMMP與包含多肽1380及2380之TMMP相比呈現出更大的活體外穩定性，其中多肽1380描繪於圖14E中，其中此類TMMP包含僅一個二硫鍵聯，其中單一二硫鍵在以下各物之間形成：i)藉由β2M多肽中之R12C取代提供之Cys；與ii)藉由I類MHC重鏈中之A236C取代提供之Cys。
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比呈現出增加的活體內穩定性。舉例而言，在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP與包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP相比呈現出至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少50%、至少2倍、至少5倍、或至少10倍更大之活體內穩定性。
在一些情況下，在本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中存在兩個二硫鍵使得經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之產生與在TMMP為包括該至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP時產生的經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之量相比有所增加。舉例而言，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)可在活體外細胞培養之哺乳動物細胞中產生，其中哺乳動物細胞在液體細胞培養基中培養。TMMP可分泌至細胞培養基中。細胞可裂解，從而生成細胞裂解物，且TMMP可存在於細胞裂解物中。TMMP可自細胞培養基及/或細胞裂解物中純化。舉例而言，在TMMP包含IgG1 Fc多肽時，細胞培養基及/或細胞裂解物可與經固定之蛋白A接觸(例如，細胞培養基及/或細胞裂解物可施用至蛋白A管柱，其中蛋白A固定於珠粒上)。存在於細胞培養基及/或細胞裂解物中之TMMP結合至經固定之蛋白A。在洗滌管柱以移除未結合之材料後，使結合之TMMP溶離，從而生成蛋白A溶離物。存在於蛋白A溶離物中的經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之量與在TMMP為包括存在於經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中之至少兩個二硫鍵中僅一者之對照TMMP時存在於蛋白A溶離物中的經二硫鍵連接之異二聚體TMMP之量相比至少0.5%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%更多。在一些情況下，溶離物中為非聚集之經二硫鍵連接之異二聚體TMMP的總TMMP蛋白之百分比為至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。蛋白A溶離物可經受尺寸排阻層析(SEC)及/或一或多個其他額外純化步驟。
在一些情況下，本發明之T細胞調節多聚體多肽包含至少一種異二聚體，其包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT1肽抗原決定基，其中該WT1肽之長度為至少4個胺基酸(例如，4個胺基酸至25個胺基酸；例如WT1
肽具有之長度為4、5、6、7、8、9、10-15、15-20、或20-25個胺基酸)；及ii)第一MHC多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽，及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含免疫調節多肽，且其中該異二聚體在第一多肽與第二多肽之間包含2個二硫鍵(亦即，該異二聚體包含：i)連接第一多肽與第二多肽之第一二硫鍵；及ii)連接第一多肽與第二多肽之第二二硫鍵)。換言之，第一多肽包含之第一Cys殘基與第二多肽中之第一Cys殘基形成二硫鍵(第一二硫鍵)；且第一多肽包含之第二Cys殘基與第二多肽中之第二Cys殘基形成二硫鍵(第二二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基；ii)肽連接子；及iii)β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含I類MHC重鏈多肽，其中該第一多肽及該第二多肽中之一者或二者包含至少一種免疫調節多肽，其中該TMMP包含：a)以下各物之間的第一二硫鍵聯：i)存在於肽抗原決定基與β2M多肽之間的連接子中之Cys；與ii)引入至I類MHC重鏈多肽中之第一Cys；及b)第一多肽與第二多肽之間的至少一個第二二硫鍵聯，其中該至少一個第二二硫鍵聯係在以下各物之間：i)第一多肽中在存在於連接子中之Cys之C端的Cys；與ii)第二多肽中在引入至I類MHC重鏈多肽中之第一Cys之C端的Cys。
在一些情況下，在本發明之TMMP之第一多肽或第二多肽中的第一二硫鍵形成Cys殘基與第二二硫鍵形成Cys殘基彼此間隔約10個胺基酸至約200個胺基酸。例如，在一些情況下，在TMMP之第一多肽或第二多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基與第二二硫鍵形成Cys殘基間隔約10個胺基酸(aa)至約15 aa、約15 aa至約20 aa、約20 aa至約25 aa、約25 aa至約30 aa、約30 aa至約40 aa、約40 aa至約50 aa、約50 aa至約60 aa、約60 aa至約70 aa、約70 aa至約80 aa、約80 aa至約90 aa、約90 aa至約100 aa、約100 aa至約110 aa、約
110 aa至約120 aa、約120 aa至約130 aa、約130 aa至約140 aa、約140 aa至約150 aa、約150 aa至約160 aa、約160 aa至約170 aa、約170 aa至約180 aa、約180 aa至約190 aa、或約190 aa至約200 aa。
作為一實例，在一些情況下，在本發明之TMMP之第一多肽中的第一二硫鍵形成Cys殘基與第二二硫鍵形成Cys殘基彼此間隔約10個胺基酸至約80個胺基酸殘基。舉例而言，在一些情況下，第一多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第一多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的約10個胺基酸至約80個胺基酸(例如，約10個胺基酸(aa)至約15 aa、約15 aa至約20 aa、約20 aa至約25 aa、約25 aa至約30 aa、約30 aa至約40 aa、約40 aa至約50 aa、約50 aa至約60 aa、約60 aa至約70 aa、或約70 aa至約80 aa)處。在一些情況下，第一多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第一多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa、20 aa、21 aa、22 aa、23 aa、24 aa或25 aa處。在一些情況下，第一多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第一多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的15 aa處。在一些情況下，第一多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第一多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的20 aa處。在一些情況下，第一多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第一多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的25 aa處。
在一些情況下，在本發明之TMMP之第二多肽中的第一二硫鍵形成Cys殘基與第二二硫鍵形成Cys殘基彼此間隔約140個胺基酸至約160個胺基酸。舉例而言，在一些情況下，第二多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第二多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的約140個胺基酸至約160個胺基酸處。在一些情況下，第二多肽中之第二二硫鍵形成Cys殘基在第二多肽中之第一二硫鍵形成Cys殘基之C端的140個胺基酸(aa)、141 aa、142 aa、143 aa、144 aa、145 aa、146 aa、147 aa、148 aa、149 aa、150 aa、151 aa、152 aa、153 aa、
154 aa、155 aa、156 aa、157 aa、158 aa、159 aa或160 aa處。
本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)可包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4個胺基酸至約25個胺基酸之WT1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中該第一多肽包含介於WT1肽與第一MHC多肽之間的肽連接子，其中該肽連接子包含Cys殘基，且其中該第一MHC多肽為包含引入Cys殘基之胺基酸取代的β2M多肽；b)及第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽，其中該第二MHC多肽為I類重鏈，其包含基於HLA-A*0201(圖9A中描繪)之胺基酸編號或在另一種I類重鏈對偶基因中之相應位置處的Y84C取代及A236C取代，其中該TMMP包含介於肽連接子中之Cys殘基與I類重鏈之胺基酸位置84或另一種I類重鏈對偶基因之相應位置處的Cys殘基之間的二硫鍵，且其中該TMMP包含介於β2M多肽中引入之Cys殘基與I類重鏈之胺基酸位置236或另一種I類重鏈對偶基因之相應位置處的Cys之間的二硫鍵；及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或第二多肽包含該至少一種免疫調節多肽。實例示意性地描繪於圖17A及圖17B中。
在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO：318)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：319)，其中n為1至10之整數。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：398)，其中n為1。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：320)，其中n為2。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：321)，其中n為3。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：322)，其中n為4。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：323)，其中n為5。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ IDNO：324)，其中n為6。在一些情況下，肽連接子包
含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：325)，其中n為7。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：326)，其中n為8。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：327)，其中n為9。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：328)，其中n為10。
在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(SEQ ID NO：329)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：330)，其中n為1至10之整數。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：331)，其中n為1。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：332)，其中n為2。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：333)，其中n為3。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：334)，其中n為4。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：335)，其中n為5。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：336)，其中n為6。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：337)，其中n為7。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：338)，其中n為8。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：339)，其中n為9。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：340)，其中n為10。
以下為包含基於HLA-A*0201(圖9A中描繪)之胺基酸編號或在另一種I類重鏈對偶基因之相應位置處之Y84C取代及A236C取代的I類MHC重鏈之非限制性實例。
HLA-A
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4個胺基酸至約25個胺基酸之WT1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中該第一多肽包含介於WT1肽與第一MHC多肽之間的肽連接子，其中該肽連接子包含Cys殘基，且其中該第一MHC多肽為包含引入Cys殘基之胺基酸取代的β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含HLA-A I類MHC重鏈，該重鏈包含與以下胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：341)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys；及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該至少一種免疫調節多肽。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO：318)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：319)，其中n為1至10之整數。在一些情況下，β2M多肽包含R12C取代。舉例而言，β2M多肽可包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：314)，其中胺基酸12為Cys。該至少一種免疫調節多肽可為對靶標T細胞發揮活化/刺激作用或對靶標T細胞發
揮抑制/抑制性(suppressing/inhibitory)作用的多肽。舉例而言，該至少一種免疫調節多肽可為細胞介素(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽及類似物；且包括全部家族成員，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80及CD86亦分別稱為B7-1及B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受體多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽或CX3CL1多肽。該等免疫調節多肽可為野生型多肽或野生型多肽之變異體。在一些情況下，免疫調節多肽為活化(「刺激」)免疫調節多肽；例如，免疫調節多肽可對T細胞產生活化/刺激效應。活化免疫調節多肽之實例包括例如CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、CD70、ICOS-L、CD40、ICAM(CD54)、IL2、IL7、IL12、IL15、IL17、IL21、IL27、IL23、GITRL、TGFβ及淋巴毒素β受體。在一些情況下，免疫調節多肽為抑制(「抑制性」)免疫調節多肽；例如，免疫調節多肽可對T細胞產生抑制/抑制性效應。抑制性免疫調節多肽之實例包括例如PD-1H、PD-L1、PD-L2、TGFβ、FasL、HVEM、半乳糖凝集素-9、ILT3及ILT4。視情形而定，TGFβ多肽可產生活化/刺激效應或抑制/抑制性效應。
在一些情況下，該至少一種免疫調節多肽為親和力減小之變異體，如本文別處所述。在一些情況下，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽。
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二
硫鍵連接之TMMP)包含HLA-A I類重鏈多肽。在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與圖9A中描繪之HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401胺基酸序列具有至少95%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，其中HLA-A重鏈多肽包含Y84C及A236C取代。
HLA-A*0101(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*0101(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-A*0201(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*0201(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：341)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A*0202(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*0202(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：341)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A*1101(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*1101(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：344)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A*2301(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*2301(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：345)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A*2402(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*2402(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：346)，其中胺基
酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A*2407(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*2407(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：347)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-A*3303(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*3303(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-A*3401(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-A重鏈多肽包含與以下HLA-A*3401(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：349)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys。
HLA-B
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT1肽(例如，具有4個胺基酸至約25個胺基酸之WT1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中該第一多肽包含介於WT1肽與第一MHC多肽之間的肽連接子，其中該肽連接子包含Cys殘基，且其中該第一MHC多肽為包含引入Cys殘基之胺基酸取代的β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含HLA-B I類MHC重鏈，該重鏈包含與以下胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：350)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys；及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該至少一個免疫調節多肽。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO：318)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：342)，其中n為1至10之整數。在一些情況下，β2M多肽包含R12C取代。舉例而言，β2M多肽可包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：314)，其中胺基酸12為Cys。該至少一種免疫調節多肽可為對靶標T細胞發揮活化/刺激作用或對靶標T細胞發揮抑制/抑制性(suppressing/inhibitory)作用的多肽。舉例而言，該至少一種免疫調節多肽可為細胞介素(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽及類似物；且包括全部家族成員，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80及CD86亦分別稱為B7-1及B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受體多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽或CX3CL1多肽。該等免疫調節多肽可為野生型多肽或野生型多肽之變異體。在一些情況下，免疫調節多肽為活
化(「刺激」)免疫調節多肽；例如，免疫調節多肽可對T細胞產生活化/刺激效應。活化免疫調節多肽之實例包括例如CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、CD70、ICOS-L、CD40、ICAM(CD54)、IL2、IL7、IL12、IL15、IL17、IL21、IL27、IL23、GITRL、TGFβ及淋巴毒素β受體。在一些情況下，免疫調節多肽為抑制(「抑制性」)免疫調節多肽；例如，免疫調節多肽可對T細胞產生抑制/抑制性效應。抑制性免疫調節多肽之實例包括例如PD-1H、PD-L1、PD-L2、TGFβ、FasL、HVEM、半乳糖凝集素-9、ILT3及ILT4。視情形而定，TGFβ多肽可產生活化/刺激效應或抑制/抑制性效應。
在一些情況下，該至少一種免疫調節多肽為親和力減小之變異體，如本文別處所述。在一些情況下，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽。
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)包含HLA-B I類重鏈多肽。在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與圖10A中描繪之HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301胺基酸序列具有至少95%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，其中HLA-B重鏈多肽包含Y84C及A236C取代。
HLA-B*0702(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*0702(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*0801(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*0801(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*1502(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*1502(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*3802(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*3802(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*4001(Y84C；A2346C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*4001(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*4601(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*4601(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-B*5301(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-B重鏈多肽包含與以下HLA-B*5301(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT-1肽(例如，具有4個胺基酸至約25個胺基酸之1 WT-1肽)；及ii)第一MHC多肽，其中該第一多肽包含介於WT-1肽與第一MHC多肽之間的肽連接子，其中該肽連接子包含Cys殘基，且其中該第一MHC多肽為包含引入Cys殘基之胺基酸取代的β2M多肽；及b)第二多肽，其包含HLA-C I類MHC重鏈，該重鏈包含與以下胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
(SEQ ID NO：357)，其中胺基酸84為Cys且胺基酸236為Cys；及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該至少一種免疫調節多肽。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO：318)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：342)，其中n為1至10之整數。在一些情況下，β2M多肽包含R12C取代。舉例而言，
β2M多肽可包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID NO：314)，其中胺基酸12為Cys。該至少一種免疫調節多肽可為對靶標T細胞發揮活化/刺激作用或對靶標T細胞發揮抑制/抑制性(suppressing/inhibitory)作用的多肽。舉例而言，該至少一種免疫調節多肽可為細胞介素(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽及類似物；且包括全部家族成員，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80及CD86亦分別稱為B7-1及B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受體多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽或CX3CL1多肽。該等免疫調節多肽可為野生型多肽或野生型多肽之變異體。在一些情況下，免疫調節多肽為活化(「刺激」)免疫調節多肽；例如，免疫調節多肽可對T細胞產生活化/刺激效應。活化免疫調節多肽之實例包括例如CD80、CD86、4-1BBL、OX40L、CD70、ICOS-L、CD40、ICAM(CD54)、IL2、IL7、IL12、IL15、IL17、IL21、IL27、IL23、GITRL、TGFβ及淋巴毒素β受體。在一些情況下，免疫調節多肽為抑制(「抑制性」)免疫調節多肽；例如，免疫調節多肽可對T細胞產生抑制/抑制性效應。抑制性免疫調節多肽之實例包括例如PD-1H、PD-L1、PD-L2、TGFβ、F
asL、HVEM、半乳糖凝集素-9、ILT3及ILT4。視情形而定，TGFβ多肽可產生活化/刺激效應或抑制/抑制性效應。
在一些情況下，該至少一種免疫調節多肽為親和力減小之變異體，如本文別處所述。在一些情況下，第一多肽或第二多肽包含Ig Fc多肽。
在一些情況下，本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)包含HLA-CI類重鏈多肽。在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與圖11A中描繪之HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502胺基酸序列具有至少95%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，其中HLA-C重鏈多肽包含Y84C及A236C取代。
HLA-C*01：02(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*01：02(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0303(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*03：03(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0304(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*03：04(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0401(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*04：01(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0602(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*06：02(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0701(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*07：01(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0702(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*07：02(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*0801(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*08：01(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
HLA-C*1502(Y84C；A236C)
在一些情況下，存在於本發明之經多個二硫鍵連接之TMMP(例如，經雙二硫鍵連接之TMMP)中的HLA-C重鏈多肽包含與以下HLA-C*15：02(Y84C；A236C)胺基酸序列具有至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
支架多肽
TMMP可包含Fc多肽或可包含另一種適合的支架多肽。
適合的支架多肽包括基於抗體之支架多肽及非基於抗體之支架。非基於抗體之支架包括例如白蛋白、XTEN(延長重組)多肽、運鐵蛋白、Fc受體多肽、彈性蛋白樣多肽(參見，例如Hassouneh等人(2012)Methods Enzymol.502：215；例如，包含五肽重複單元(Val-Pro-Gly-X-Gly；SEQ ID NO：59)之多肽，其中X為除了脯胺酸以外的任何胺基酸)、白蛋白結合多肽、絲樣多肽(參見，例如Valluzzi等人(2002)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.357：165)，絲-彈性蛋白-樣多肽(SELP；參見，例如Megeed等人(2002)Adv Drug Deliv Rev.54：1075)及類似物。適合的XTEN多肽包括例如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO 2007/103515、US 2010/0189682及US 2009/0092582中揭露之彼等；亦參見Schellenberger等人(2009)Nat Biotechnol.27：1186)。適合的白蛋白多肽包括例如人類血清白蛋白。
適合的支架多肽在一些情況下將為半衰期延長之多肽。因此，在一些情況下，與缺乏支架多肽之對照TMMP相比，適合的支架多肽增加TMMP之活體內半衰期(例如，血清半衰期)。舉例而言，在一些情況下，與缺乏支架多肽之對照TMMP相比，支架多肽使TMMP之活體內半衰期(例如，血清半衰期)增加了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍、或大於100倍。作為一實例，在一些情況下，與缺乏Fc多肽之對照TMMP相比，Fc多肽使TMMP之活體內半衰期(例如，血清半衰期)增加了至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍、或大於100倍。
Fc多肽
在一些情況下，本發明之TMMP之第一多肽鏈及/或第二多肽鏈包含Fc多肽。本發明之TMMP之Fc多肽可為人類IgG1 Fc、人類IgG2 Fc、人類IgG3 Fc、人類IgG4 Fc等。在一些情況下，Fc多肽包含與圖5A-5G中描繪之Fc區的胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，Fc區包含與圖5A中描繪之人類IgG1 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，Fc區包含與圖5A中描繪之人類IgG1 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；且包含N77取代；例如，Fc多肽包含N77A取代。在一些情況下，Fc多肽包含與圖5A中描繪之人類IgG2 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖5A中描繪之人類IgG2 Fc多肽的胺基酸99-325具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖5A中描繪之人類IgG3 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖5A中描繪之人類IgG3 Fc多肽的胺基酸19-246具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖5B中描繪之人
類IgM Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖5B中描繪之人類IgM Fc多肽的胺基酸1-276具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖5C中描繪之人類IgA Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；例如，Fc多肽包含與圖5C中描繪之人類IgA Fc多肽的胺基酸1-234具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在一些情況下，Fc多肽包含與圖5C中描繪之人類IgG4 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，Fc多肽包含與圖5C中描繪之人類IgG4 Fc多肽的胺基酸100至327具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在一些情況下，IgG4 Fc多肽包含以下胺基酸序列：
在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基
酸序列(人類IgG1 Fc)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，例外之處為以除天冬醯胺以外之胺基酸進行之N297取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之N77)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5C中描繪之胺基酸序列(包含N297A取代之人類IgG1 Fc，該取代為圖5A中描繪之胺基酸序列之N77)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，例外之處為以除白胺酸以外之胺基酸進行之L234取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之L14)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，例外之處為以除白胺酸以外之胺基酸進行之L235取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之L15)。
在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5E中描繪之胺基酸序列。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5F中描繪之胺基酸序列。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5G中描繪之胺基酸序列(包含L234A取代及L235A取代之人類IgG1 Fc，該等取代對應於圖5G中描繪之胺基酸序列之位置14及15)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，例外之處為以除脯胺酸以外之胺基酸進行之P331取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之P111)；在一些情況下，該取代為P331S取代。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，例外之處為以除白胺酸以外之胺基酸進行之L234及L235取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之L14及L15)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5A中描繪之胺基酸序列(人類IgG1 Fc)，例外之處為以除白胺酸以外之胺基酸進行之L234及L235取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之L14及L15)及以除脯胺酸以外之胺基酸進行之P331取代(圖5A中描繪之胺基酸序列之P111)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽包含圖5E中描繪
之胺基酸序列(包含L234F、L235E及P331S取代(對應於圖5E中描繪之胺基酸序列之胺基酸位置14、15及111)的人類IgG1 Fc)。在一些情況下，存在於TMMP中之Fc多肽為包含L234A及L235A取代(以Ala對圖5A中描繪之胺基酸序列的L14及L15進行之取代)之IgG1 Fc多肽，如圖5G所描繪。
連接子
本發明之TMMP可包括一或多個連接子，其中該一或多個連接子介於以下一或多者之間：i)I類MHC多肽及Ig Fc多肽，其中此連接子在本文中稱為「L1」；ii)免疫調節多肽及I類MHC多肽，其中此連接子在本文中稱為「L2」；iii)第一免疫調節多肽及第二免疫調節多肽，其中此連接子在本文中稱為「L3」；iv)肽抗原(「抗原決定基」)及I類MHC多肽；v)I類MHC多肽及二聚化多肽(例如，二聚化對之第一成員或第二成員)；以及vi)二聚化多肽(例如，二聚化對之第一成員或第二成員)及IgFc多肽。
適合的連接子(亦稱為「間隔子」)可容易選擇且可具有許多適合長度中之任一者，諸如1個胺基酸至25個胺基酸、3個胺基酸至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸。適合的連接子長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸。在一些情況下，連接子具有之長度為25個胺基酸至50個胺基酸，例如長度為25至30、30至35、35至40、40至45、或45至50個胺基酸。
示範性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：366)及(GGGS)n(SEQ ID NO：367)，其中n為至少一之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、及此項技術中已知之其他可撓性連接子。可使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly及Ser皆相
對未結構化，且因此可充當組分之間的中性系鏈。可使用甘胺酸聚合物；甘胺酸甚至比丙胺酸顯著更易進入phi-psi空間，且比具有更長側鏈之殘基受限少得多(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示範性連接子可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：368)、GGSGG(SEQ ID NO：369)、GSGSG(SEQ ID NO：370)、GSGGG(SEQ ID NO：371)、GGGSG(SEQ ID NO：372)、GSSSG(SEQ ID NO：373)及其類似序列。示範性連接子可包括例如Gly(Ser4)n(SEQ ID NO：374)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GSSSS)n(SEQ ID NO：375)，其中n為4。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GSSSS)n(SEQ ID NO：376)，其中n為5。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：377)，其中n為1。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：378)，其中n為2。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：379)，其中n為3。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：380)，其中n為4。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：381)，其中n為5。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：382)，其中n為6。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：383)，其中n為7，在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：384)，其中n為8，在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：385)，其中n為9，在一些情況下，連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：386)，其中n為10。在一些情況下，連接子包含胺基酸序列AAAGG(SEQ ID NO：387)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP之第一多肽中的連接子多肽所包括的半胱胺酸殘基可與存在於本發明之TMMP之第二多肽中的半胱胺酸殘基形成二硫鍵。在一些情況下，舉例而言，適合的連接子包含胺基酸序列G C GGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：317)。作為另一實例，適合的連接子可包含
胺基酸序列GCGGS(G4S)n(SEQ ID NO：315)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9。舉例而言，在一些情況下，連接子包含胺基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：316)。作為另一實例，連接子包含胺基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：317)。
抗原決定基
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的抗原決定基(呈遞一或多個抗原決定基之肽)為WT-1肽，例如，連同MHC一起向TCR呈遞抗原決定基之WT-1肽。WT-1同功型之胺基酸序列呈現於圖3A-3E中。呈遞一或多個抗原決定基之WT-1肽在本文中稱為「WT-1肽」或「WT-1抗原決定基」。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基可為與圖3A-3E中任一者描繪之WT-1胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的4至25個連續胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10-15 aa、15-20 aa、或20-25 aa)之肽。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基可為與圖3A中描繪之WT-1胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的4至25個連續胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10-15 aa、15-20 aa、或20-25 aa)之肽。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基可為與圖3B中描繪之WT-1胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的4至25個連續胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10-15 aa、15-20 aa、或20-25 aa)之肽。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基可為與圖3C中描繪之WT-1胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的4至25個連續胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、
10-15 aa、15-20 aa、或20-25 aa)之肽。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基可為與圖3D中描繪之WT-1胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的4至25個連續胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10-15 aa、15-20 aa、或20-25 aa)之肽。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基可為與圖3E中描繪之WT-1胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列的4至25個連續胺基酸(例如，4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10-15 aa、15-20 aa、或20-25 aa)之肽。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為6個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為7個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為8個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為9個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為10個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為11個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為6個胺基酸至25個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為6個胺基酸至20個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為7個胺基酸至25個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為7個胺基酸至20個胺基酸。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基之長度為至少4個胺基酸，長度為至少6個胺基酸，或長度為至少7個胺基酸。
存在於本發明之TMMP中的抗原決定基可具有之長度為約4個胺基酸至約25個胺基酸，例如，抗原決定基可具有之長度為4個胺基酸(aa)至10 aa、
10 aa至15 aa、15 aa至20 aa、或20 aa至25 aa。舉例而言，存在於本發明之TMMP中的抗原決定基可具有之長度為4個胺基酸(aa)、5 aa、6 aa、7、aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa、20 aa、21 aa、22 aa、23 aa、24 aa或25 aa。在一些情況下，存在於TMMP中之抗原決定基具有之長度為5個胺基酸至10個胺基酸，例如5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa或10 aa。
存在於本發明之TMMP中的WT-1抗原決定基為T細胞特異性結合之肽，亦即，抗原決定基由WT-1抗原決定基特異性T細胞特異性結合。抗原決定基特異性T細胞結合具有參考胺基酸序列之抗原決定基，但實質上不結合與參考胺基酸序列不同之抗原決定基。舉例而言，抗原決定基特異性T細胞結合具有參考胺基酸序列之抗原決定基，且結合與參考胺基酸序列不同之抗原決定基，若有的話，則其親和力小於10-6M、小於10-5M或小於10-4M。抗原決定基特異性T細胞可結合對其具有特異性之抗原決定基，其親和力為至少10-7M、至少10-8M、至少10-9M或至少10-10M。
適於包含在本發明之TMMP中的WT-1肽之實例包括但不限於CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO：223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO：225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO：227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO：229)、MTWNLMN LGATLKGV(SEQ ID NO：230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：232)、MNLGATLK(SEQ ID NO：233)、MTWNYMNLGATLKGV(SEQ ID NO：234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：238)、GYLRNPTA
C(SEQ ID NO：239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO：240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO：241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO：242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO：243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO：244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO：245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO：246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO：247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO：248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO：249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO：250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO：252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO：253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO：254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO：255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO：257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)；RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)；CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)；CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)；NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)；YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)；SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)；CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)；及NQMNLGATL(SEQ ID NO：267)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1肽為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1肽為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1肽呈遞HLA-A*2402限制性抗原決定基。呈遞HLA-A*2402限制性抗原決定基之WT-1肽包括例如CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)；NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)(WT-1 239-247；Q240Y)；CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)(WT-1 235-243)；CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)(WT-1 235-243)；NQMNLGATL(SEQ ID NO：267)(WT-1 239-247)；及NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)(WT-1 239-247；Q240L)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的WT-1肽呈遞
HLA-A*0201限制性抗原決定基。呈遞HLA-A*0201限制性抗原決定基之WT-1肽包括例如VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)(WT-1 37-45)；RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)(WT-1 126-134)；YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)(WT-1 126-134；R126Y)；SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)(WT-1 187-195)；及NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)(WT-1 239-247；Q240L)。
HLA/肽結合檢定
給定肽(例如，WT-1肽)是否結合I類HLA(包含HLA重鏈及β2M多肽)及在結合至HLA複合物時是否可有效呈遞抗原決定基至TCR可使用許多熟知方法中之任一者來判定。檢定包括結合檢定及T細胞活化檢定。
基於細胞之結合檢定
作為一實例，基於細胞之肽誘導穩定性檢定可用於判定肽-HLA I類結合。在此檢定中，允許目標肽結合至TAP缺陷型細胞，亦即具有與抗原加工(TAP)機構相關之缺陷型轉運蛋白且因此具有更少表面I類分子之細胞。此類細胞包括例如人類T2細胞株(T2(174 x CEM.T2；美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號CRL-1992)。Henderson等人(1992)Science 255：1264。在未將胞質肽缺陷型TAP介導轉運至內質網中之情況下，經組裝之I類複合物為結構上不穩定的，且在細胞表面上僅瞬時保留。然而，當T2細胞與能夠結合I類之外源肽一起溫育時，表面肽-HLA I類複合物為穩定的且可藉由流動式細胞測量術，使用例如pan抗I類單株抗體來偵測。藉由添加肽使細胞表面上之肽-HLA複合物具有穩定性及隨之而來的延長之壽命，由此驗證了其身份。分析可使用流動式細胞測量術進行，例如其中pan-HLA I類抗體包含螢光標記。肽與HLA H鏈之各種對偶基因形式之結合可藉由遺傳修飾T2細胞以表現目標對偶基因HLA H鏈來進行測試。
以下為T2檢定評定肽與HLA A*0201之結合的用途之非限制性實
例。將T2細胞在細胞培養基中洗滌，且濃縮至106個細胞/ml。將目標肽在細胞培養基中製備且連續稀釋，從而提供濃度200μM、100μM、20μM及2μM。將細胞與各肽稀釋液1：1混合以得到200μL最終體積及100μM、50μM、10μM及1μM最終肽濃度。HLA A*0201結合肽、GILGFVFTL(SEQ ID NO：395)及非-HLA A*0201-限制性肽、HPVGEADYF(SEQ ID NO：396)(HLA-B*3501)分別作為陽性對照及陰性對照包括在內。將細胞/肽混合物保持在37℃ 5% CO2下十分鐘；接著在室溫下溫育隔夜。隨後將細胞在37℃下溫育2小時且用經螢光標記之抗人類HLA抗體染色。接著將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次且使用流動式細胞測量術分析。使用抗-HLA抗體染色之平均螢光強度(MFI)量測結合強度。
生物化學結合檢定
可在無細胞之活體外檢定系統中對HLA多肽(HLA重鏈多肽與β2M多肽之複合物)與目標肽之結合進行測試。舉例而言，使經標記之參考肽(例如，經螢光標記)結合至HLA多肽(HLA重鏈多肽與β2M多肽之複合物)，以形成HLA-參考肽複合物。對目標測試肽置換來自HLA-參考肽複合物的經標記之參考肽之能力進行測試。相對結合親和力經計算為置換所結合之參考肽所需的測試肽之量。參見，例如van der Burg等人(1995)Human Immunol.44：189。
作為另一實例，目標肽可與HLA分子(HLA重鏈與β2M多肽之複合物)一起溫育，且可以免疫檢定形式量測HLA/肽複合物之穩定性。將目標肽穩定化HLA分子之能力與呈遞已知T細胞抗原決定基之對照肽的能力相比較。穩定性之偵測係基於使用抗HLA抗體所偵測之HLA/肽複合物的天然構象之存在或不存在。參見，例如Westrop等人(2009)J.Immunol.Methods 341：76；Steinitz等人(2012)Blood 119：4073；及美國專利第9,205,144號。
T細胞活化檢定
給定肽是否結合I類HLA(包含HLA重鏈及β2M多肽)及在結合至
HLA複合物時是否可有效呈遞抗原決定基至TCR可藉由評定T細胞對肽-HLA複合物之反應來判定。可量測之T細胞反應包括例如干擾素-γ(IFNγ)產生、細胞毒性活性及其類似反應。
ELISPOT檢定
適合的檢定包括例如酶聯免疫斑點(ELISPOT)檢定。在此檢定中，在呈遞目標肽與HLA I類之複合物的抗原呈遞細胞(APC)之後量測CD8+ T細胞之IFNγ產生。將IFNγ之抗體固定在多孔板之孔上。將APC添加至孔中，且將其與目標肽一起溫育一段時間，使得該肽結合APC表面上之HLA I類。將對該肽具有特異性之CD8+ T細胞添加至孔中，且將該板溫育約24小時。接著洗滌該等孔，且使用可偵測標記之抗IFNγ抗體偵測結合至經固定之抗IFNγ抗體之任何IFNγ。可使用比色檢定。舉例而言，可偵測標記之抗IFNγ抗體可為生物素標記之抗IFNγ抗體，其可使用例如偶聯至鹼性磷酸酶之鏈親和素來偵測。添加BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基藍四唑鎓)溶液，以使檢定顯色。IFNγ分泌T細胞之存在藉由色斑來鑑定。陰性對照包括未與該肽接觸之APC。可使用表現各種HLA H鏈對偶基因之APC來判定目標肽是否有效結合至包含特定HLA H鏈之HLA I類分子。
細胞毒性檢定
給定肽是否結合至特定HLA I類H鏈及在結合至包含H鏈之HLA I類複合物時是否可有效呈遞抗原決定基至TCR亦可使用細胞毒性檢定來判定。細胞毒性檢定涉及將靶細胞與細胞毒性CD8+ T細胞一起溫育。靶細胞在其表面上展示出包含目標肽之肽/HLA I類複合物及包含有待測試之HLA H鏈之HLA I類分子。靶細胞可經放射性標記，例如經51Cr放射性標記。靶細胞是否有效呈遞抗原決定基至細胞毒性CD8+ T細胞上之TCR，從而由CD8+ T細胞誘導針對靶細胞之細胞毒性活性，係藉由量測51Cr自裂解之靶細胞之釋放來判定。特異
性細胞毒性可經計算為肽存在下細胞毒性活性之量減去肽不存在下細胞毒性活性之量。
用肽-HLA四聚體偵測抗原特異性T細胞
作為另一實例，使用螢光或重金屬標籤生成肽-HLA複合物之多聚體(例如，四聚體)。接著可使用多聚體經由流動式細胞測量術(FACS)或質量細胞計數(CyTOF)鑑別及定量特異性T細胞。抗原決定基特異性T細胞之偵測提供肽結合之HLA分子能夠結合至抗原特異性T細胞子集上之特異性TCR的直接證據。參見，例如Klenerman等人(2002)Nature Reviews Immunol.2：263。
免疫調節多肽
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的免疫調節多肽為野生型免疫調節多肽。在其他情況下，存在於本發明之TMMP中的免疫調節多肽為對共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對共免疫調節多肽之親和力相比有所減小的變異體免疫調節多肽。呈現出對共免疫調節結構域之減小親和力的適合的免疫調節結構域可具有與野生型免疫調節結構域相比之1個胺基酸(aa)至20 aa差異。舉例而言，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽之胺基酸序列與相應野生型免疫調節多肽相差1 aa、2 aa、3 aa、4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa或10 aa。作為另一實例，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽的胺基酸序列與相應野生型免疫調節多肽相差11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa或20 aa。作為一實例，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括單一胺基酸取代。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參
考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括2個胺基酸取代(例如，不多於2個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括3個胺基酸取代(例如，不多於3個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括4個胺基酸取代(例如，不多於4個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括5個胺基酸取代(例如，不多於5個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括6個胺基酸取代(例如，不多於6個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括7個胺基酸取代(例如，不多於7個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括8個胺基酸取代(例如，不多於8個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括9個胺基酸取代(例如，不多於9個胺基酸取代)。在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括10個胺基酸取代(例如，不多於10個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括11個胺基酸取代(例如，不多於11個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括12個胺基酸取代(例如，不多於12個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括13個胺基酸取代(例如，不多於13個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括14個胺基酸取代(例如，不多於14個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括15個胺基酸取代(例如，不多於15個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括16個胺基酸取代(例如，不多於16個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括17個胺基酸取代(例如，不多於17個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括18個胺基酸取代(例如，不多於18個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括19個胺基酸取代(例如，不多於19個胺基酸取代)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽與相應參考(例如野生型)免疫調節多肽相比包括20個胺基酸取代(例如，不多於20個胺基酸取代)。
如上文所討論，適於包含在本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽呈現出的對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽之親和力相比有所減小。
免疫調節多肽與同源共免疫調節多肽之示範性對包括但不限於：
a)4-1BBL(免疫調節多肽)與4-1BB(同源共免疫調節多肽)；
b)PD-L1(免疫調節多肽)與PD1(同源共免疫調節多肽)；
c)IL-2(免疫調節多肽)與IL-2受體(同源共免疫調節多肽)；
d)CD80(免疫調節多肽)與CD86(同源共免疫調節多肽)；
e)CD86(免疫調節多肽)與CD28(同源共免疫調節多肽)；
f)OX40L(CD252)(免疫調節多肽)與OX40(CD134)(同源共免疫調節多肽)；
g)Fas配位體(免疫調節多肽)與Fas(同源共免疫調節多肽)；
h)ICOS-L(免疫調節多肽)與ICOS(同源共免疫調節多肽)；
i)ICAM(免疫調節多肽)與LFA-1(同源共免疫調節多肽)；
j)CD30L(免疫調節多肽)與CD30(同源共免疫調節多肽)；
k)CD40(免疫調節多肽)與CD40L(同源共免疫調節多肽)；
l)CD83(免疫調節多肽)與CD83L(同源共免疫調節多肽)；
m)HVEM(CD270)(免疫調節多肽)與CD160(同源共免疫調節多肽)；
n)JAG1(CD339)(免疫調節多肽)與Notch(同源共免疫調節多肽)；
o)JAG1(免疫調節多肽)與CD46(同源共免疫調節多肽)；
p)CD80(免疫調節多肽)與CTLA4(同源共免疫調節多肽)；
q)CD86(免疫調節多肽)與CTLA4(同源共免疫調節多肽)；及
r)CD70(免疫調節多肽)與CD27(同源共免疫調節多肽)。
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽具有之結合親和力為100nM至100μM。舉例而言，在一
些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽對同源共免疫調節多肽具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽呈現出對同源共免疫調節多肽之減小的親和力。類似地，本發明之包含變異體免疫調節多肽之TMMP呈現出對同源共免疫調節多肽之減小的親和力。因此，舉例而言，本發明之包含變異體免疫調節多肽之TMMP對同源共免疫調節多肽具有之結合親和力為100nM至100μM。舉例而言，在一些情況下，本發明之包含變異體免疫調節多肽之TMMP對同源共免疫調節多肽具有以下結合親和力：約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
如圖19示意性示出，免疫調節多肽(亦即，一或多種免疫調節多肽)可存在於本發明之TMMP的多個位置中之任一者處。圖19描繪變異體IL-2多肽之兩個副本之位置；然而，免疫調節多肽可為如本文所述之多種免疫調節多肽中之任一者。如圖19所描繪，免疫調節多肽可：1)在I類MHC重鏈之N端；
2)在I類MHC重鏈之C端及Ig Fc多肽之N端；換言之，介於I類MHC重鏈與Ig Fc多肽之間；3)在Ig Fc多肽之C端；4)在肽抗原決定基之N端；或5)在β2M多肽之C端。
PD-L1變異體
作為一非限制性實例，在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽為變異體PD-L1多肽。野生型PD-L1結合至PD1。
野生型人類PD-L1多肽可包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：1)。
野生型人類PD-L1胞外結構域可包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：2)。
野生型PD-1多肽可包含以下胺基酸序列：
(SEQ ID NO：3)。在一些情況下，在本發明之TMMP包含變異體PD-L1多肽時，「同源共免疫調節多肽」為包含胺基酸序列SEQ ID NO：3之PD-1多肽。
在一些情況下，變異體PD-L1多肽呈現出與PD-1(例如，包含SEQ ID NO：3中列出之胺基酸序列的PD-1多肽)之結合親和力與包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之胺基酸序列的PD-L1多肽之結合親和力相比有所減小。舉例而言，在一些情況下，本發明之變異體PD-L1多肽結合PD-1(例如，包含SEQ ID NO：3中列出之胺基酸序列的PD-1多肽)之結合親和力比包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之胺基酸序列的PD-L1多肽之結合親和力小至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、小至少50%、小至少55%、小至少60%、小至少65%、小至少70%、小至少75%、小至少80%、小至少85%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下，變異體PD-L1多肽對PD-1具有之結合親和力為1nM至1mM。在一些情況下，本發明之變異體PD-L1多肽對PD-1具有之結合親和力為100nM至100μM。作為另一實例，在一些情況下，變異體PD-L1多肽對PD1(例如，包含SEQ ID NO：3中列出之胺基酸序列的PD1多肽)具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2
中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有2個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有3個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有4個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有5個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有6個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有7個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有8個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有9個胺基酸取代。在一些情況下，變異體PD-L1多肽與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中列出之PD-L1胺基酸序列相比具有10個胺基酸取代。
適合的PD-L1變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
適合的PD-L1變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
適合的PD-L1變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
CD80變異體
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽為變異體CD80多肽。野生型CD80結合至CD28。野生型CD80亦結合至CD86。
人類CD80之胞外結構域之野生型胺基酸序列可為如下：
野生型CD28胺基酸序列可為如下：
(SEQ ID NO：5)。在一些情況下，在本發明之TMMP包含變異體CD80多肽時，「同源共免疫調節多肽」為包含胺基酸序列SEQ ID NO：5之CD28多肽。
野生型CD28胺基酸序列可為如下：
(SEQ ID NO：6)
野生型CD28胺基酸序列可為如下：
(SEQ ID NO：7)。
在一些情況下，變異體CD80多肽表現出對CD28之結合親和力與包含SEQ ID NO：4中列出之胺基酸序列之CD80多肽對CD28之結合親和力相比有所減小。舉例而言，在一些情況下，變異體CD80多肽結合CD28之結合親和力比包含SEQ ID NO：4中列出之胺基酸序列的CD80多肽對CD28(例如，包含SEQ ID NO：5、6或7中之一者列出之胺基酸序列的CD28多肽)之結合親和力小至少
10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、小至少50%、小至少55%、小至少60%、小至少65%、小至少70%、小至少75%、小至少80%、小至少85%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下，變異體CD80多肽對CD28具有之結合親和力為100nM至100μM。作為另一實例，在一些情況下，本發明之變異體CD80多肽對CD28(例如，包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中列出之胺基酸序列的CD28多肽)具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有2個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有3個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有4個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有5個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有6個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有7個胺基酸取代。在一些情況下，變
異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有8個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有9個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD80多肽與SEQ ID NO：4中列出之CD80胺基酸序列相比具有10個胺基酸取代。
適合的CD80變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
CD86變異體
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽為變異體CD86多肽。野生型CD86結合至CD28。在一些情況下，在本發明之TMMP包含變異體CD86多肽時，「同源共免疫調節多肽」為包含胺基酸序列SEQ ID NO：5之CD28多肽。
野生型人類CD86之全胞外結構域之胺基酸序列可為如下：
野生型人類CD86之IgV結構域之胺基酸序列可為如下：
在一些情況下，變異體CD86多肽呈現出對CD28之結合親和力與包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中列出之胺基酸序列之CD86多肽對CD28之結合親和力相比有所減小。舉例而言，在一些情況下，變異體CD86多肽結合CD28之結合親和力比包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9中列出之胺基酸序列的CD86多肽對CD28(例如，包含SEQ ID NO：5、6或7中之一者列出之胺基酸序列的CD28多肽)之結合親和力小至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、小至少50%、小至少55%、小至少60%、小至少65%、小至少70%、小至少75%、小至少80%、小至少85%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下，變異體CD86多肽對CD28具有之結合親和力為100nM至100μM。作為另一實例，在一些情況下，本發明之變異體CD86多肽對CD28(例如，包含SEQ ID NO：5、6或7中之一者列出之胺基酸序列的CD28多肽)具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86
胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有2個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有3個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有4個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有5個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有6個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有7個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有8個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有9個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：8中列出之CD86胺基酸序列相比具有10個胺基酸取代。
在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有2個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有3個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有4個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有5個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有6個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID
NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有7個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有8個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有9個胺基酸取代。在一些情況下，變異體CD86多肽與SEQ ID NO：9中列出之CD86胺基酸序列相比具有10個胺基酸取代。
適合的CD86變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
4-1BBL變異體
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽為變異體4-1BBL多肽。野生型4-1BBL結合至4-1BB(CD137)。
野生型4-1BBL胺基酸序列可為如下：
(SEQ ID NO：10)。
在一些情況下，變異體4-1BBL多肽為人類4-1BBL之腫瘤壞死因子(TNF)同源結構域(THD)的變異體。
人類4-1BBL之THD的野生型胺基酸序列可為例如如下SEQ ID NO：11-13中之一者：
野生型4-1BB胺基酸序列可為如下：
(SEQ ID NO：14)。在一些情況下，在本發明之TMMP包含變異體4-1BBL多肽時，「同源共免疫調節多肽」為包含胺基酸序列SEQ ID NO：14之4-1BB多肽。
在一些情況下，變異體4-1BBL多肽呈現出對4-1BB之結合親和力與包含SEQ ID NO：10-13中之一者列出之胺基酸序列之4-1BBL多肽之結合親和力相比有所減小。舉例而言，在一些情況下，當在相同條件下測定時，本發明之變異體4-1BBL多肽結合4-1BB之結合親和力比包含SEQ ID NO：10-13中之一
者列出之胺基酸序列的4-1BBL多肽對4-1BB多肽(例如，包含SEQ ID NO：14中列出之胺基酸序列的4-1BB多肽)之結合親和力小至少10%、小至少15%、小至少20%、小至少25%、小至少30%、小至少35%、小至少40%、小至少45%、小至少50%、小至少55%、小至少60%、小至少65%、小至少70%、小至少75%、小至少80%、小至少85%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下，變異體4-1BBL多肽對4-1BB具有之結合親和力為100nM至100μM。作為另一實例，在一些情況下，變異體4-1BBL多肽對4-1BB(例如，包含SEQ ID NO：14中列出之胺基酸序列的4-1BB多肽)具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有2個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有3個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有4個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相
比具有5個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有6個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有7個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有8個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有9個胺基酸取代。在一些情況下，變異體4-1BBL多肽與SEQ ID NO：10-13中之一者列出之4-1BBL胺基酸序列相比具有10個胺基酸取代。
適合的4-1BBL變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
IL-2變異體
在一些情況下，存在於本發明之TMMP中的變異體免疫調節多肽為變異體IL-2多肽。野生型IL-2結合至IL-2受體(IL-2R)，亦即包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ之異三聚體多肽。
野生型IL-2胺基酸序列可為如下：
(SEQ ID NO：15)。
野生型IL2結合至細胞表面上之IL2受體(IL2R)。在一些情況下，IL2受體為包含α鏈(IL-2Rα；亦稱為CD25)、β鏈(IL-2Rβ；亦稱為CD122：及γ鏈(IL-2Rγ；亦稱為CD132)之異三聚體多肽。人類IL-2Rα、IL2Rβ及IL-2Rγ之胺基酸序列可為如下。
人類IL-2Rα：
(SEQ ID NO：16)。
人類IL-2Rβ：
(SEQ ID NO：17)。
人類IL-2Rγ：
(SEQ ID NO：18)。
在一些情況下，在本發明之TMMP包含變異體IL-2多肽時，「同源共免疫調節多肽」為包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：16、17及18之多肽的IL-2R。
在一些情況下，變異體IL-2多肽呈現出對IL-2R之結合親和力與包含SEQ ID NO：15中列出之胺基酸序列之IL-2多肽之結合親和力相比有所減小。舉例而言，在一些情況下，當在相同條件下測定時，變異體IL-2多肽結合IL-2R之結合親和力比包含SEQ ID NO：15中列出之胺基酸序列的IL-2多肽對IL-2R多肽(例如，包含有包含SEQ ID NO：16-18中列出之胺基酸序列之多肽的IL-2R)之結合親和力小至少10%、小至少15%、小至少20%、小至少25%、小至少30%、小至少35%、小至少40%、小至少45%、小至少50%、小至少55%、小至少60%、
小至少65%、小至少70%、小至少75%、小至少80%、小至少85%、小至少90%、小至少95%或小大於95%。
在一些情況下，變異體IL-2多肽對IL-2R具有之結合親和力為100nM至100μM。作為另一實例，在一些情況下，變異體IL-2多肽對IL-2R(例如，包含有包含SEQ ID NO：16-18中列出之胺基酸序列之多肽的IL-2R)具有之結合親和力為約100nM至150nM、約150nM至約200nM、約200nM至約250nM、約250nM至約300nM、約300nM至約350nM、約350nM至約400nM、約400nM至約500nM、約500nM至約600nM、約600nM至約700nM、約700nM至約800nM、約800nM至約900nM、約900nM至約1μM至約1μM至約5μM、約5μM至約10μM、約10μM至約15μM、約15μM至約20μM、約20μM至約25μM、約25μM至約50μM、約50μM至約75μM、或約75μM至約100μM。
在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有單一胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有2至10個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有2個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有3個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有4個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有5個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有6個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有7個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有8個胺基酸取代。在一
些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有9個胺基酸取代。在一些情況下，變異體IL-2多肽與SEQ ID NO：15中列出之IL-2胺基酸序列相比具有10個胺基酸取代。
適合的IL-2變異體包括一種多肽，其包含與以下胺基酸序列中之任一者具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列一致性之胺基酸序列：
額外多肽
除了上文所述之彼等多肽之外，本發明之TMMP之多肽亦可包括一或多種多肽。適合的額外多肽包括抗原決定基標籤及親和力結構域。該一或多
種額外多肽可包括在TMMP之多肽鏈之N端、在TMMP之多肽鏈之C端、或在TMMP之多肽鏈內部。
抗原決定基標籤
適合的抗原決定基標籤包括但不限於血球凝集素(HA；例如，YPYDVPDYA(SEQ ID NO：271)；FLAG(例如，DYKDDDDK(SEQ ID NO：272)；c-myc(例如，EQKLISEEDL；SEQ ID NO：273)及類似物。
親和力結構域
親和力結構域包括可與結合配偶體，諸如固定在固體支撐物上可用於鑑別或純化之結合配偶體相互作用之肽序列。編碼多個連續單一胺基酸諸如組胺酸之DNA序列當融合至經表現之蛋白時可用於藉由與樹脂管柱諸如鎳瓊脂糖之高親和力結合來一步純化重組蛋白。示範性親和力結構域包括His5(HHHHH)(SEQ ID NO：271)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO：275)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO：276)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：277)、StrepTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：278)、血球凝集素例如HATag(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：279)、麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、硫氧化還原蛋白、纖維素結合結構域、RYIRS(SEQ ID NO：280)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO：281)、甲殼素結合結構域、S-肽、T7肽、SH2域、C端RNA標籤、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO：282)、金屬結合結構域，例如鋅結合結構域或鈣結合結構域，諸如來自鈣結合蛋白之彼等，例如鈣調蛋白、肌鈣蛋白C、鈣調磷酸酶B、肌凝蛋白輕鏈、恢復蛋白、S-調控蛋白、視錐蛋白、VILIP、神經鈣蛋白、海馬鈣結合蛋白、神經元鈣傳感蛋白(frequenin)、鈣牽蛋白(caltractin)、鈣蛋白酶次單元、S100蛋白、小清蛋白、鈣結合蛋白D9K、鈣結合蛋白D28K、及鈣網膜蛋白、內含肽、生物素、鏈親和素、MyoD、Id、白胺酸拉鍊序列、及麥芽糖結合蛋白。
藥物偶聯物
本發明之TMMP之多肽鏈可包含連接(例如，共價附接)至多肽鏈之小分子藥物。舉例而言，在本發明之TMMP包含Fc多肽時，Fc多肽可包含共價連接之小分子藥物。在一些情況下，小分子藥物為癌症化學治療劑，例如細胞毒性劑。本發明之TMMP之多肽鏈可包含連接(例如，共價附接)至多肽鏈之細胞毒性劑。舉例而言，在本發明之TMMP包含Fc多肽時，Fc多肽可包含共價連接之細胞毒性劑。細胞毒性劑包括前藥。
藥物(例如，癌症化學治療劑)可直接或間接連接至本發明之TMMP的多肽鏈。舉例而言，在本發明之TMMP包含Fc多肽時，藥物(例如，癌症化學治療劑)可直接或間接連接至Fc多肽。直接鍵聯可涉及直接鍵聯至胺基酸側鏈。間接鍵聯可為經由連接子之鍵聯。藥物(例如，癌症化學治療劑)可經由硫醚鍵、醯胺鍵、胺基甲酸酯鍵、二硫鍵或醚鍵來連接至本發明之TMMP之多肽鏈(例如，Fc多肽)。
連接子包括可裂解連接子及不可裂解連接子。在一些情況下，連接子為蛋白酶可裂解之連接子。適合的連接子包括例如肽(例如，長度為2至10個胺基酸；例如，長度為2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)、烷基鏈、聚(乙二醇)、二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。適合的連接子之非限制性實例為：i)N-琥珀醯亞胺基-[(N-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-順丁烯二醯亞胺)；ii)4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)；4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(磺基-SPDB)；4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)；N-琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯)(LC-SMCC)；κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷酸N-琥珀醯亞胺酯(KMUA)；γ-順丁烯二醯亞胺丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)；ε-順丁烯二醯亞胺基己酸N-
羥基琥珀醯亞胺酯(EMCS)；m-順丁烯二醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)；N-(α-順丁烯二醯亞胺基乙醯氧基)-琥珀醯亞胺酯(AMAS)；琥珀醯亞胺基-6-(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺)己酸酯(SMPH)；4-(p-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SMPB)；N-(p-順丁烯二醯亞胺基苯基)異氰酸酯(PMPI)；4(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(SPP)；N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)；6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)；順丁烯二醯亞胺基丙醯基(MP)；對胺基苯甲氧基羰基(PAB)；4-(順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SMCC)；N-琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯)，SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC)；3-順丁烯二醯亞胺基丙酸N-琥珀醯亞胺酯(BMPS)；碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)；溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA)；及3-(溴乙醯胺基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBAP)。
多肽(例如，Fc多肽)可經交聯試劑修飾，以引入1-10個反應基團，該等交聯試劑諸如4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、磺基-SMCC、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、磺基-MBS或琥珀醯亞胺基-碘乙酸酯，如文獻中所述。接著使經修飾之Fc多肽與含硫醇之細胞毒性劑反應以產生偶聯物。
舉例而言，在本發明之TMMP包含Fc多肽時，包含Fc多肽之多肽鏈可具有式(A)-(L)-(C)，其中(A)為包含Fc多肽之多肽鏈；其中(L)若存在，則為連接子；且其中(C)為細胞毒性劑。(L)若存在，則將(A)連接至(C)。在一些情況下，包含Fc多肽之多肽鏈可包含多於一種細胞毒性劑(例如，2、3、4或5種或多於5種細胞毒性劑)。
適合的藥物包括例如雷帕黴素。適合的藥物包括例如類視色素，諸如全反式視黃酸(ATRA)；維生素D3；維生素D3類似物；及其類似物。如上文所述，在一些情況下，藥物為細胞毒性劑。細胞毒性劑為此項技術中已知的。
適合的細胞毒性劑可為導致細胞死亡、或誘導細胞死亡、或以某種方式降低細胞活力之任何化合物，且包括例如美登木素及美登木素類似物、苯二氮呯、類紫杉醇、CC-1065及CC-1065類似物、倍癌黴素(duocarmycin)及倍癌黴素類似物、烯二炔諸如卡奇黴素(calicheamicin)、尾海兔素及尾海兔素類似物(包括澳瑞他汀(auristatin))、茅屋黴素(tomaymycin)衍生物、細黴素(leptomycin)衍生物、胺甲喋呤、順鉑、卡鉑、道諾黴素、阿黴素、長春新鹼、長春鹼、美法侖、絲裂黴素C、氮芥苯丁酸及N-嗎啉基阿黴素。
例如，在一些情況下，細胞毒性劑為抑制真核細胞中之微管形成的化合物。此類試劑包括例如美登木素、苯二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、倍癌黴素、倍癌黴素類似物、卡奇黴素、尾海兔素、尾海兔素類似物、澳瑞他汀、茅屋黴素、及細黴素、或前述任一者之前藥。美登木素化合物包括例如N(2')-脫乙醯基-N(2')-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)；N(2')-脫乙醯基-N(2')-(4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3)；及N(2')-脫乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。苯二氮呯包括例如吲哚啉幷苯二氮呯及噁唑啶并并苯二氮呯。
細胞毒性劑包括紫杉醇；細胞遲緩素B；短桿菌肽D；溴化乙錠；依米丁；絲裂黴素；依託泊苷；替尼泊苷；長春新鹼；長春花鹼；秋水仙鹼；多柔比星；道諾黴素；二羥基炭疽菌素二酮；美登素或其類似物或衍生物；澳瑞他汀或其功能肽類似物或衍生物；尾海兔素10或15或其類似物；依立替康或其類似物；米托蒽醌；光神黴素；放線菌素D；1-去氫睾酮；糖皮質激素；普魯卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛爾；嘌呤黴素；卡奇黴素或其類似物或衍生物；抗代謝物；6-巰嘌呤；6-硫鳥嘌呤；阿糖胞苷；氟達拉濱；5-氟尿嘧啶；達卡巴嗪；羥基脲；天冬醯胺酶；吉西他濱；克拉屈濱；烷基化劑；鉑衍生物；倍癌黴素A；倍癌黴素SA；拉奇黴素(rachelmycin，CC-1065)或其類似物或衍生
物；抗生素；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯二氮呯(PDB)；白喉毒素；蓖麻毒素；霍亂毒素；志賀樣毒素；LT毒素；C3毒素；志賀毒素；百日咳毒素；破傷風毒素；大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制劑；假單胞菌外毒素；alorin；皂素；莫迪素(modeccin)；gelanin；相思子毒素(abrin)A鏈；莫迪素A鏈；α-帚麴菌素；油桐(Aleurites fordii)蛋白；石竹素(dianthin)蛋白；美洲商陸(Phytolacca americana)蛋白；苦瓜(momordica charantia)抑制劑；麻瘋樹毒蛋白(curcin)；巴豆毒素；肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑；白樹毒素(gelonin)；絲裂吉菌素(mitogellin)；局限麯菌素(restrictocin)；酚黴素(phenomycin)；伊諾黴素(enomycin)毒素；核糖核酸酶(RNA酶)；DNA酶I；葡萄球菌腸毒素A；美洲商陸抗病毒蛋白；白喉毒素；及假單胞菌外毒素。
示範性TMMP
本發明之TMMP包含至少一種異二聚體，其包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT-1肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽；及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含免疫調節多肽。因此，在一些情況下，本發明之TMMP包含至少一種異二聚體，其包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT-1肽抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽。在其他情況下，本發明之TMMP包含至少一種異二聚體，其包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT-1肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)至少一種免疫調節多肽。在一些情況下，本發明之TMMP包含至少一種異二聚體，其包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)WT-1肽抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)至少一種免疫調節多肽。在一些情況下，該至少一種免疫調節多肽
為野生型免疫調節多肽。在其他情況下，該至少一種免疫調節多肽為呈現出與共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對共免疫調節多肽之親和力相比有所減小的變異體免疫調節多肽。在一些情況下，本發明之TMMP包含兩種免疫調節多肽，其中該兩種免疫調節多肽具有相同胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)WT-1肽抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽。在一些情況下，第一MHC多肽為β2M多肽；且第二MHC多肽為HLA重鏈多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為HLA-A24多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為具有A236C取代之HLA-A24多肽。在一些情況下，第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)WT-1肽抗原決定基；ii)第一MHC多肽；及iii)兩種免疫調節多肽，其中該兩種免疫調節多肽具有相同胺基酸序列。在一些情況下，Ig Fc多肽為人類IgG1 Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。在一些情況下，第一多肽與第二多肽兩者彼此間以二硫鍵連接。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16A及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16T及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，肽連接子介於以下中之一或多者之間：i)第二MHC多肽與Ig Fc多肽；ii)抗原決定基與第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽與免疫調節多肽；及(當TMMP在第一多肽鏈上包含兩種免疫調節多肽時)iv)介於兩種免疫調節多肽之間。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列AAAGG(SEQ ID NO：283)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：284)，其中n為1至10之整數(例如，其中n為2、3或4)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：286)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)WT-1肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；ii)第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽。在一些情況下，第一MHC多肽為β2M多肽；且第二MHC多肽為HLA重鏈多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為HLA-A24多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為具有A236C取代之HLA-A24多肽。在一些情況下，第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)兩種免疫調節多肽，其中該兩種免疫調節多肽具有相同胺基酸序列；ii)第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為人類IgG1 Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。在一些情況下，第一多肽與第二多肽兩者彼此間以二硫鍵連接。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16A及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16T及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，肽連接子介於以下中之一或多者之間：i)第二MHC多肽與Ig Fc多肽；ii)抗原決定基與第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽與免疫調節多肽；及(當TMMP在第二多肽鏈上包含兩種免疫調節多肽時)iv)介於兩種免疫調節多肽之間。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列AAAGG(SEQ ID NO：283)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：284)，其中n為1至10之整數(例如，其中n為2、3或4)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：286)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)WT-1肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽。在一些情況下，第一MHC多肽為β2M多
肽；且第二MHC多肽為HLA重鏈多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為HLA-A24多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為具有A236C取代之HLA-A24多肽。在一些情況下，第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)兩種免疫調節多肽，其中該兩種免疫調節多肽具有相同胺基酸序列。在一些情況下，Ig Fc多肽為人類IgG1 Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。在一些情況下，第一多肽與第二多肽兩者彼此間以二硫鍵連接。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16A及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16T及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，肽連接子介於以下中之一或多者之間：i)第二MHC多肽與Ig Fc多肽；ii)抗原決定基與第一MHC多肽；iii)Ig Fc多肽與免疫調節多肽；及(當TMMP在第二多肽鏈上包含兩種免疫調節多肽時)iv)介於該兩種免疫調節多肽之間。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列AAAGG(SEQ ID NO：283)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：284)，其中n為1至10之整數(例如，其中n為2、3或4)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：286)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)WT-1肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；ii)第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽。在一些情況下，第一MHC多肽為β2M多肽；且第二MHC多肽為HLA重鏈多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為HLA-A24多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為具有A236C取代之HLA-A24多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為人類IgG1 Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。在一些情況下，第一多肽與第
二多肽兩者彼此間以二硫鍵連接。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16A及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16T及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：286)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；ii)WT-1肽抗原決定基；及iii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽。在一些情況下，第一MHC多肽為β2M多肽；且第二MHC多肽為HLA重鏈多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為HLA-A24多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為具有A236C取代之HLA-A24多肽。在一些情況下，第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)兩種免疫調節多肽，其中該兩種免疫調節多肽具有相同胺基酸序列；ii)WT-1肽抗原決定基；及iii)第一MHC多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為人類IgG1 Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。在一些情況下，第一多肽與第二多肽兩者彼此間以二硫鍵連接。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16A及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16T及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，肽連接子介於以下中之一或多者之間：i)第二MHC多肽與Ig Fc多肽；ii)抗原決定基與第一MHC多肽；iii)免疫調節多肽與抗原決定基；及(當TMMP在第一多肽鏈上包含兩種免疫調節多肽時)iv)介於兩種免疫調節多肽之間。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列AAAGG(SEQ ID NO：283)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：284)，其中n為1至10之整數(例如，其中n為2、3或4)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在
一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：286)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)WT-1肽抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；ii)至少一種免疫調節多肽；及iii)Ig Fc多肽。在一些情況下，第一MHC多肽為β2M多肽；且第二MHC多肽為HLA重鏈多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為HLA-A24多肽。在一些情況下，HLA重鏈多肽為具有A236C取代之HLA-A24多肽。在一些情況下，第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)第二MHC多肽；ii)兩種免疫調節多肽，其中該兩種免疫調節多肽具有相同胺基酸序列；及iii)Ig Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為人類IgG1 Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽為包含L234A及L235A取代之IgG1 Fc多肽。在一些情況下，第一多肽與第二多肽兩者彼此間以二硫鍵連接。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16A及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，免疫調節多肽為包含H16T及F42A取代之變異體IL-2多肽。在一些情況下，肽連接子介於以下中之一或多者之間：i)第二MHC多肽與免疫調節多肽；ii)免疫調節多肽與Ig Fc多肽；iii)抗原決定基與第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽與免疫調節多肽；及(當TMMP在第二多肽鏈上包含兩種免疫調節多肽時)iv)介於該兩種免疫調節多肽之間。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列AAAGG(SEQ ID NO：283)。在一些情況下，肽連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：284)，其中n為1至10之整數(例如，其中n為2、3或4)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)。在一些情況下，WT-1肽抗原決定基為CYTWNQMNL(SEQ ID NO：286)。
如上文所述且如圖19示意性示出，免疫調節多肽(亦即，一或多種免疫調節多肽)可存在於本發明之TMMP的多個位置中之任一者處。圖19描繪
變異體IL-2多肽之兩個副本之位置；然而，免疫調節多肽可為如本文所述之多種免疫調節多肽中之任一者。如圖19所描繪，免疫調節多肽可：1)在I類MHC重鏈之N端(位置1)；2)在I類MHC重鏈之C端及Ig Fc多肽之N端；換言之，介於I類MHC重鏈與Ig Fc多肽之間(位置2)；3)在Ig Fc多肽之C端(位置3)；4)在肽抗原決定基之N端(位置4)；或5)在β2M多肽之C端(位置5)。「位置1」係指免疫調節多肽在與I類MHC重鏈相同之多肽鏈上且在I類MHC重鏈之N端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)一或多種免疫調節多肽；及ii)I類MHC重鏈多肽。「位置2」係指免疫調節多肽在與I類MHC重鏈相同之多肽鏈上且在I類MHC重鏈之C端而非多肽鏈之C端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)I類MHC重鏈多肽；ii)一或多種免疫調節多肽；及iii)Ig Fc多肽。「位置3」係指免疫調節多肽在與I類MHC重鏈相同之多肽鏈上且在多肽鏈之C端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)I類MHC重鏈多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)一或多種免疫調節多肽。「位置4」係指免疫調節多肽在與β2M多肽相同之多肽鏈上且在肽抗原決定基及β2M多肽之N端的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)一或多種免疫調節多肽；ii)肽抗原決定基(例如，WT-1肽)；及iii)β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含I類MHC重鏈多肽(例如，第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)I類MHC重鏈多肽；及ii)Ig Fc多肽。「位置5」係指
免疫調節多肽在與β2M多肽相同之多肽鏈上且在β2M多肽之C端(例如，多肽鏈之C端)的位置；例如，其中TMMP包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基(例如，WT-1肽)；及ii)β2M多肽；及iii)一或多種免疫調節多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含I類MHC重鏈多肽(例如，第二多肽，該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)I類MHC重鏈多肽；及ii)Ig Fc多肽。
另外，如上文所討論且如圖18A-18C示意性描繪，本發明之TMMP之第一多肽鏈及第二多肽鏈可由一或多個二硫鍵連接。舉例而言，本發明之TMMMP可包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含具有R12C取代之β2M多肽；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含具有A236C取代之I類MHC重鏈多肽，使得二硫鍵在第一多肽鏈中β2M多肽之位置12處的Cys與第二多肽鏈中I類MHC重鏈多肽之位置236處的Cys之間形成。作為另一實例，本發明之TMMMP可包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基；ii)肽連接子，該肽連接子包含GCGG(G4S)n(SEQ ID NO：393)序列，其中n為1、2或3；及iii)β2M多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含具有Y84C取代之I類MHC重鏈多肽，使得二硫鍵在第一多肽鏈之肽連接子中的Cys與第二多肽鏈之I類MHC重鏈多肽之位置84處的Cys之間形成。在其他實例中，本發明之TMMP可包含：a)第一多肽，該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)肽抗原決定基；ii)肽連接子，該肽連接子包含GCGG(G4S)n(SEQ ID NO：393)序列，其中n為1、2或3；及iii)β2M多肽，該多肽具有R12C取代；及b)第二多肽，該第二多肽包含具有Y84C取代及A236C取代之I類MHC重鏈多肽，使得：i)第一二硫鍵在第一多肽鏈之肽連接子中的Cys與第二多肽鏈之I類MHC重鏈多肽之位置84處的Cys之間形成；且ii)第二二硫鍵在第一多肽鏈之β2M多肽之位置12處的Cys與第二多肽鏈之I類MHC重鏈多肽之位置236處的Cys
之間形成。為簡明起見，第一二硫鍵稱為「G2C/Y84C」；且第二二硫鍵稱為「R12C/A236C」。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵而無R12C/A236C二硫鍵；b)R12C/A236C二硫鍵而無G2C/Y84C二硫鍵；或c)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵。
本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵而無R12C/A236C二硫鍵；及b)在位置1處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵而無R12C/A236C二硫鍵；及b)在位置2處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵而無R12C/A236C二硫鍵；及b)在位置3處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵而無R12C/A236C二硫鍵；及b)在位置4處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵而無R12C/A236C二硫鍵；及b)在位置5處之至少一種免疫調節多肽。
本發明之TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫鍵而無G2C/Y84C二硫鍵；及在位置1處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫鍵而無G2C/Y84C二硫鍵；及b)在位置2處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫鍵而無G2C/Y84C二硫鍵；及b)在位置3處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫鍵而無G2C/Y84C二硫鍵；及b)在位置4處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)R12C/A236C二硫鍵而無G2C/Y84C二硫鍵；及b)在位置5處之至少一種免疫調節多肽。
本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵；及b)及在位置1處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵；及b)及在位置2處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵；
及b)及在位置3處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵；及b)及在位置4處之至少一種免疫調節多肽。本發明之TMMP可包括：a)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵；及b)及在位置5處之至少一種免疫調節多肽。
本發明之TMMP之第一多肽鏈及第二多肽鏈的胺基酸序列之非限制性實例提供於圖4A-4K及圖20A-20R中。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4D所描繪之指示為「2752」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖4C所描繪之指示為「3159」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4E所描繪之指示為「2753」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖4C所描繪之指示為「3159」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4D所描繪之指示為「2752」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖4B所描繪之指示為「2750」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4E所描繪之指示為「2753」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖4B所描繪之指示為「2750」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置1處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4D所描繪之指示為「2752」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第
二多肽鏈包含如圖4A所描繪之指示為「3158」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4E所描繪之指示為「2753」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖4A所描繪之指示為「3158」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14B所描繪之指示為「2380」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖14A所描繪之指示為「1715」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14B所描繪之指示為「2381」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖14A所描繪之指示為「1715」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14B所描繪之指示為「2380」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖14D所描繪之指示為「2405」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14B所描繪之指示為「2381」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖14D所描繪之指示為「2405」的胺基酸序列。在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14F所描繪之指示為「2762」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖14D所描繪之指示為「2405」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14B所描繪之指示為「2380」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖14E所描繪之指示為「1380」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖14B所描繪之指示為「2381」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該
第二多肽鏈包含如圖14E所描繪之指示為「1380」的胺基酸序列。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20A所描繪之指示為「3592」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20H所描繪之指示為「3188」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置1處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵兩者。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20B所描繪之指示為「3425」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20H所描繪之指示為「3188」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵兩者。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20C所描繪之指示為「3196」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20I所描繪之指示為「3604」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置5處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵兩者。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20D所描繪之指示為「2764」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20J所描繪之指示為「3603」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置5處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20E所描繪之指示為「3593」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20K所描繪之指示為「3192」的胺基酸序列。此種TMMP
包含：a)如圖19描繪之在位置1處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20F所描繪之指示為「3426」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20K所描繪之指示為「3192」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20G所描繪之指示為「3197」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20L所描繪之指示為「3605」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置5處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20A所描繪之指示為「3592」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20M所描繪之指示為「3529」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置1處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵兩者。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20B所描繪之指示為「3425」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20M所描繪之指示為「3529」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵兩者：且亦包含WT1 239-247(Q240Y)抗原決定基。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20C所描繪之指示為「3196」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該
第二多肽鏈包含如圖20N所描繪之指示為「3709」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵及R12C/A236C二硫鍵兩者。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4B所描繪之指示為「2750」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20O所描繪之指示為「3528」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置1處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4C所描繪之指示為「3159」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20O所描繪之指示為「3528」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20D所描繪之指示為「2764」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20P所描繪之指示為「3708」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置5處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20E所描繪之指示為「3593」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20Q所描繪之指示為「3530」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置1處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽
鏈包含如圖20F所描繪之指示為「3426」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20Q所描繪之指示為「3530」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20G所描繪之指示為「3197」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20R所描繪之指示為「3710」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置5處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20F所描繪之指示為「3426」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20M所描繪之指示為「3529」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)；且亦包括WT1 239-247(Q240Y)抗原決定基。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20B所描繪之指示為「3425」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20O所描繪之指示為「3528」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)；且亦包括WT1 239-247(Q240Y)抗原決定基。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖20B所描繪之指示為「3425」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20Q所描繪之指示為「3530」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)G2C/Y84C二硫鍵(而非R12C/A236C二硫鍵)；且亦包括WT1 239-247(Q240Y)抗原決定基。
在一些情況下，本發明之TMMP包含：a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含如圖4C所描繪之指示為「3159」的胺基酸序列；及b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含如圖20H所描繪之指示為「3188」的胺基酸序列。此種TMMP包含：a)如圖19描繪之在位置3處的免疫調節多肽；及b)R12C/A236C二硫鍵(而非G2C/Y84C二硫鍵)；且亦包括WT1 235-243(M236Y)抗原決定基。
生成多聚體T細胞調節多肽之方法
本發明提供一種獲得包含一或多種變異體免疫調節多肽之TMMP的方法，該一或多種變異體免疫調節多肽呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應親本野生型免疫調節多肽對共免疫調節多肽之親和力相比更低，該方法包括：A)生成包含複數個成員之TMMP文庫，其中各成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)抗原決定基；及ii)第一主要MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況選用之Ig Fc多肽或非Ig支架，其中各成員在第一多肽、第二多肽、或第一多肽及第二多肽兩者上包含不同變異體免疫調節多肽；B)判定該文庫之各成員對同源共免疫調節多肽之親和力；以及C)選擇呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力有所減小的成員。在一些情況下，親和力係藉由生物層干涉術(BLI)，使用經純化之TMMP文庫成員及同源共免疫調節多肽來判定。BLI方法為熟習此項技術者所熟知。BLI檢定係上文所述。參見，例如Lad等人(2015)J.Biomol.Screen.20(4)：498-507；以及Shah及Duncan(2014)J.Vis.Exp.18：e51383。
本發明提供一種獲得呈現出與T細胞之選擇性結合的TMMP的方法，該方法包括：A)生成包含複數個成員之TMMP文庫，其中各成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況選用之免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架，其中各成員在第一多肽、第二多肽、或第一多肽及第二多肽
兩者上包含不同變異體免疫調節多肽，其中該變異體免疫調節多肽之胺基酸序列與親本野生型免疫調節多肽相差1個胺基酸至10個胺基酸；B)使TMMP文庫成員與在其表面上表現以下各物之靶標T細胞接觸：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至抗原決定基之T細胞受體，其中該TMMP文庫成員包含抗原決定基標籤，使得TMMP文庫成員結合至靶標T細胞；C)使結合至靶標T細胞之TMMP文庫成員與結合至抗原決定基標籤的經螢光標記之結合劑接觸，從而生成TMMP文庫成員/靶標T細胞/結合劑複合物；D)使用流動式細胞測量術量測TMMP文庫成員/靶標T細胞/結合劑複合物之平均螢光強度(MFI)，其中在TMMP文庫成員之濃度範圍上量測之MFI提供親和力及表觀親合力之量度；以及E)選擇TMMP文庫成員，與TMMP文庫成員與對照T細胞之結合相比，該TMMP文庫成員選擇性結合靶標T細胞，該對照T細胞包含i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至除了存在於TMMP文庫成員中之抗原決定基以外的抗原決定基之T細胞受體。在一些情況下，將經鑑別為選擇性結合至靶標T細胞之TMMP文庫成員自該文庫中分離。
在一些情況下，親本野生型免疫調節多肽及同源免疫調節多肽對係選自：IL-2與IL-2受體；4-1BBL與4-1BB；PD-L1與PD-1；CD70與CD27；TGFβ與TGFβ受體；CD80與CD28；CD86與CD28；
OX40L與OX40；FasL與Fas；ICOS-L與ICOS；ICAM與LFA-1；JAG1與Notch；JAG1與CD46；CD80與CTLA4；及CD86與CTLA4。
本發明提供一種獲得包含一或多種變異體免疫調節多肽之TMMP的方法，該變異體免疫調節多肽呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應親本野生型免疫調節多肽對共免疫調節多肽之親和力相比有所減小，該方法包括自包含複數個成員之TMMP文庫中選擇呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力有所減小之成員，其中該複數個成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況選用之Ig Fc多肽或非Ig支架，其中該文庫之成員包含存在於第一多肽、第二多肽、或第一多肽及第二多肽兩者中之複數個變異體免疫調節多肽。在一些情況下，選擇步驟包含使用生物層干涉術判定TMMP文庫成員與同源共免疫調節多肽之間的結合親和力。在一些情況下，TMMP係如上文所述。
在一些情況下，該方法進一步包含：a)使經選擇之TMMP文庫成員與在其表面上表現以下各物之靶標T細胞接觸：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至抗原決定基之T細胞受體，其中TMMP文庫成員包含抗原決定基標籤，使得該TMMP文庫成員結合至靶標T細胞；b)使結合至靶標T細胞的經選擇之TMMP文庫成員與結合至抗原決定基標籤的經螢
光標記之結合劑接觸，從而生成經選擇之TMMP文庫成員/靶標T細胞/結合劑複合物；以及c)使用流動式細胞測量術量測經選擇之TMMP文庫成員/靶標T細胞/結合劑複合物之平均螢光強度(MFI)，其中在經選擇之TMMP文庫成員之濃度範圍上量測之MFI提供親和力及表觀親合力之量度。與TMMP文庫成員與包含以下之對照T細胞之結合相比，選擇性結合靶標T細胞之經選擇之TMMP文庫成員經鑑別為選擇性結合至靶標T細胞：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至除了TMMP文庫成員中存在之抗原決定基以外的抗原決定基的T細胞受體。在一些情況下，結合劑為對抗原決定基標籤具有特異性之抗體。在一些情況下，變異體免疫調節多肽與相應親本野生型免疫調節多肽相比包含1至20個胺基酸取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代)。在一些情況下，TMMP包含兩種變異體免疫調節多肽。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽包含相同胺基酸序列。在一些情況下，第一多肽包含該兩種變異體免疫調節多肽中之一者且其中第二多肽包含該兩種變異體免疫調節多肽中之第二者。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽處於TMMP之相同多肽鏈上。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽處於TMMP之第一多肽上。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽處於TMMP之第二多肽上。
在一些情況下，該方法進一步包含自文庫中分離經選擇之TMMP文庫成員。在一些情況下，該方法進一步包含提供包含編碼經選擇之TMMP文庫成員之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，該核酸存在於重組表現載體中。在一些情況下，核苷酸序列可操作連接至在真核細胞中起作用之轉錄控制元件。在一些情況下，該方法進一步包含將核酸引入真核宿主細胞中及在液體培養基中培養細胞以在細胞中合成所編碼的經選擇之TMMP文庫成員。在一些情況下，該方法進一步包含自細胞或自包含該細胞之液體培養基中分離所合成的經
選擇之TMMP文庫成員。在一些情況下，所選擇之TMMP文庫成員包含Ig Fc多肽。在一些情況下，該方法進一步包含將藥物偶聯至Ig Fc多肽。在一些情況下，藥物為選自以下之細胞毒性劑：美登木素、苯二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、倍癌黴素、倍癌黴素類似物、卡奇黴素、尾海兔素、尾海兔素類似物、澳瑞他汀、茅屋黴素、及細黴素、或前述任一者之前藥。在一些情況下，藥物為類視色素。在一些情況下，親本野生型免疫調節多肽及同源免疫調節多肽係選自：IL-2及IL-2受體；4-1BBL及4-1BB；PD-L1及PD-1；CD70及CD27；TGFβ及TGFβ受體；CD80及CD28；CD86及CD28；OX40L及OX40；FasL及Fas；ICOS-L及ICOS；ICAM及LFA-1；JAG1及Notch；JAG1及CD46；CD80及CTLA4；以及CD86及CTLA4。
本發明提供一種獲得包含一或多種變異體免疫調節多肽之TMMP的方法，該一或多種變異體免疫調節多肽呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應親本野生型免疫調節多肽對共免疫調節多肽之親和力相比有所減小，該方法包括：A)提供包含複數個成員之TMMP文庫，其中該複數個成員包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)抗原決定基；及ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽；及ii)視情況選用之Ig Fc多肽或非Ig支架，其中該文庫之成員包含存在於第一多肽、第二多肽、或第一多肽及第二多肽兩者中之複數個變異體免疫調節多肽；以及B)自文庫中選擇呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力有所減小的成員。在一些情況下，選擇步驟包含使用生物層干涉術判定TMMP文庫成員與同源共免疫調節多肽之間的結合親和力。在一些情況下，TMMP係如上文所述。
在一些情況下，該方法進一步包含：a)使經選擇之TMMP文庫成員與在其表面上表現以下各物之靶標T細胞接觸：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至抗原決定基之T細胞受體，其中TMMP文
庫成員包含抗原決定基標籤，使得該TMMP文庫成員結合至靶標T細胞；b)使結合至靶標T細胞的經選擇之TMMP文庫成員與結合至抗原決定基標籤的經螢光標記之結合劑接觸，從而生成經選擇之TMMP文庫成員/靶標T細胞/結合劑複合物；以及c)使用流動式細胞測量術量測經選擇之TMMP文庫成員/靶標T細胞/結合劑複合物之平均螢光強度(MFI)，其中在經選擇之TMMP文庫成員之濃度範圍上量測之MFI提供親和力及表觀親合力之量度。同TMMP文庫成員與包含以下之對照T細胞之結合相比，選擇性結合靶標T細胞之經選擇之TMMP文庫成員經鑑別為選擇性結合至靶標T細胞：i)結合親本野生型免疫調節多肽之同源共免疫調節多肽；及ii)結合至除了TMMP文庫成員中存在之抗原決定基以外的抗原決定基的T細胞受體。在一些情況下，結合劑為對抗原決定基標籤具有特異性之抗體。在一些情況下，變異體免疫調節多肽與相應親本野生型免疫調節多肽相比包含1至20個胺基酸取代(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代)。在一些情況下，TMMP包含兩種變異體免疫調節多肽。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽包含相同胺基酸序列。在一些情況下，第一多肽包含該兩種變異體免疫調節多肽中之一者且其中第二多肽包含該兩種變異體免疫調節多肽中之第二者。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽處於TMMP之相同多肽鏈上。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽處於TMMP之第一多肽上。在一些情況下，該兩種變異體免疫調節多肽處於TMMP之第二多肽上。
在一些情況下，該方法進一步包含自文庫中分離經選擇之TMMP文庫成員。在一些情況下，該方法進一步包含提供包含編碼經選擇之TMMP文庫成員之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，該核酸存在於重組表現載體中。在一些情況下，核苷酸序列可操作連接至在真核細胞中起作用之轉錄控制元件。在一些情況下，該方法進一步包含將核酸引入真核宿主細胞中及在液體培養基
中培養細胞以在細胞中合成所編碼的經選擇之TMMP文庫成員。在一些情況下，該方法進一步包含自細胞或自包含該細胞之液體培養基中分離所合成的經選擇之TMMP文庫成員。在一些情況下，所選擇之TMMP文庫成員包含Ig Fc多肽。在一些情況下，該方法進一步包含將藥物偶聯至Ig Fc多肽。在一些情況下，藥物為選自以下之細胞毒性劑：美登木素、苯二氮呯、類紫杉醇、CC-1065、倍癌黴素、倍癌黴素類似物、卡奇黴素、尾海兔素、尾海兔素類似物、澳瑞他汀、茅屋黴素、及細黴素、或前述任一者之前藥。在一些情況下，藥物為類視色素。在一些情況下，親本野生型免疫調節多肽及同源免疫調節多肽係選自IL-2及IL-2受體；4-1BBL及4-1BB；PD-L1及PD-1；TGFβ及TGFβ受體；CD80及CD28；CD86及CD28；OX40L及OX40；FasL及Fas；ICOS-L及ICOS；CD70及CD27；ICAM及LFA-1；JAG1及Notch；JAG1及CD46；CD80及CTLA4；以及CD86及CTLA4。
核酸
本發明提供一種核酸，其包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列。本發明提供一種核酸，其包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列。
本發明提供包含編碼本發明之TMMP之核苷酸序列的核酸。在一些情況下，本發明之TMMP之個別多肽鏈係在單獨的核酸中編碼。在一些情況下，本發明之TMMP之全部多肽鏈均在單一核酸中編碼。在一些情況下，第一核酸包含編碼本發明之TMMP之第一多肽的核苷酸序列；且第二核酸包含編碼本發明之TMMP之第二多肽的核苷酸序列。在一些情況下，單一核酸包含編碼本發明之TMMP之第一多肽及本發明之TMMP之第二多肽的核苷酸序列。
編碼多聚體多肽之個別多肽鏈的單獨核酸
本發明提供包含編碼本發明之TMMP之核苷酸序列的核酸。如上文所述，在一些情況下，本發明之TMMP之個別多肽鏈係在單獨的核酸中編碼。
在一些情況下，編碼本發明之TMMP之單獨多肽鏈的核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件，例如啟動子，諸如在真核細胞中起作用之啟動子，其中該啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。
本發明提供第一核酸及第二核酸，其中第一核酸包含編碼本發明之TMMP之第一多肽的核苷酸序列，其中第一多肽以自N端至C端之次序包含：a)抗原決定基(例如，T細胞抗原決定基)；b)第一MHC多肽；及c)免疫調節多肽(例如，如上文所述之親和力減小的變異體)；且其中第二核酸包含編碼本發明之TMMP之第二多肽的核苷酸序列，其中第二多肽以自N端至C端之次序包含：a)第二MHC多肽；及b)Ig Fc多肽。適合的T細胞抗原決定基、MHC多肽、免疫調節多肽及Ig Fc多肽如上文所述。在一些情況下，編碼第一多肽及第二多肽之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下，轉錄控制元件為在真核細胞中起作用之啟動子。在一些情況下，核酸存在於單獨的表現載體中。
本發明提供第一核酸及第二核酸，其中第一核酸包含編碼本發明之TMMP之第一多肽的核苷酸序列，其中第一多肽以自N端至C端之次序包含：a)抗原決定基(例如，T細胞抗原決定基)；及b)第一MHC多肽；且其中第二核酸包含編碼本發明之TMMP之第二多肽的核苷酸序列，其中第二多肽以自N端至C端之次序包含：a)免疫調節多肽(例如，如上文所述之親和力減小的變異體)；b)第二MHC多肽；及c)Ig Fc多肽。適合的T細胞抗原決定基、MHC多肽、免疫調節多肽及Ig Fc多肽如上文所述。在一些情況下，編碼第一多肽及第二多肽之核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下，轉錄控制元件為在真核細胞中起作用之啟動子。在一些情況下，核酸存在於單獨的表現載體中。
編碼存在於多聚體多肽中之兩種或兩種以上多肽的核酸
本發明提供一種核酸，其包含至少編碼本發明之TMMP之第一多肽及第二多肽的核苷酸序列。在一些情況下，在本發明之TMMP包括第一多肽、
第二多肽及第三多肽時，核酸包括編碼第一多肽、第二多肽及第三多肽之核苷酸序列。在一些情況下，編碼本發明之TMMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列包括插入編碼第一多肽之核苷酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的蛋白水解可裂解之連接子。在一些情況下，編碼本發明之TMMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列包括插入編碼第一多肽之核苷酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)。在一些情況下，編碼本發明之TMMP之第一多肽及第二多肽之核苷酸序列包括插入編碼第一多肽之核苷酸序列與編碼第二多肽之核苷酸序列之間的核糖體跳躍信號(或順式作用水解酶元件，CHYSEL(SEQ ID NO：394))。核酸之實例在下文中描述，在蛋白水解可裂解之連接子提供於編碼本發明之TMMP之第一多肽與第二多肽的核苷酸序列之間；在該等實施例之任一者中，IRES或核糖體跳躍信號可用於代替編碼蛋白水解可裂解之連接子的核苷酸序列。
在一些情況下，第一核酸(例如，重組表現載體、mRNA、病毒RNA等)包含編碼本發明之TMMP之第一多肽鏈的核苷酸序列；且第二核酸(例如，重組表現載體、mRNA、病毒RNA等)包含編碼本發明之TMMP之第二多肽鏈的核苷酸序列。在一些情況下，編碼第一多肽之核苷酸序列及編碼第二多肽之第二核苷酸序列各自可操作地連接至轉錄控制元件，例如啟動子，諸如在真核細胞中起作用之啟動子，其中該啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。
本發明提供一種核酸，該核酸包含編碼重組多肽之核苷酸序列，其中該重組多肽以自N端至C端之次序包含：a)抗原決定基(例如，T細胞抗原決定基)；b)第一MHC多肽；c)免疫調節多肽(例如，如上文所述之親和力減小的變異體)；d)蛋白水解可裂解之連接子；e)第二MHC多肽；及f)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。本發明提供一種核酸，該核酸包含編碼重組多肽之核苷酸序列，其中該重組多肽以自N端至C端之次序包含：a)第一前導肽；b)抗原決定基；c)第一
MHC多肽；d)免疫調節多肽(例如，如上文所述之親和力減小的變異體)；e)蛋白水解可裂解之連接子；f)第二前導肽；g)第二MHC多肽；及h)Ig Fc多肽。本發明提供一種核酸，該核酸包含編碼重組多肽之核苷酸序列，其中該重組多肽以自N端至C端之次序包含：a)抗原決定基；b)第一MHC多肽；c)蛋白水解可裂解之連接子；d)免疫調節多肽(例如，如上文所述之親和力減小的變異體)；e)第二MHC多肽；及f)Ig Fc多肽。在一些情況下，第一前導肽及第二前導肽為β2-M前導肽。在一些情況下，核苷酸序列可操作地連接至轉錄控制元件。在一些情況下，轉錄控制元件為在真核細胞中起作用之啟動子。
適合的MHC多肽四上文所述。在一些情況下，第一MHC多肽為β2-微球蛋白多肽；且其中第二MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。在一些情況下，β2-微球蛋白多肽包含與圖6中描繪之β2M胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，I類MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K或HLA-L重鏈。在一些情況下，I類MHC重鏈多肽包含與圖3A-3C中任一者所描繪之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
適合的Fc多肽係上文所述。在一些情況下，Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。在一些情況下，Ig Fc多肽包含與圖5A-5G中描繪之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
適合的免疫調節多肽係上文所述。
適合的蛋白水解可裂解之連接子係上文所述。在一些情況下，蛋白水解可裂解之連接子包含選自以下之胺基酸序列：a)LEVLFQGP(SEQ ID NO：388)；b)ENLYTQS(SEQ ID NO：389)；c)DDDDK(SEQ ID NO：390)；d)LVPR(SEQ ID NO：391)；及e)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：392)。
在一些情況下，介於抗原決定基與第一MHC多肽之間的連接子包含第一Cys殘基，且第二MHC多肽包含提供第二Cys殘基之胺基酸取代，使得第一Cys殘基及第二Cys殘基提供連接子與第二MHC多肽之間的二硫鍵聯。在一些情況下，第一MHC多肽包含提供第一Cys殘基之胺基酸取代，且第二MHC多肽包含提供第二Cys殘基之胺基酸取代，使得第一Cys殘基及第二Cys殘基提供第一MHC多肽與第二MHC多肽之間的二硫鍵聯。
重組表現載體
本發明提供包含本發明之核酸的重組表現載體。在一些情況下，重組表現載體為非病毒載體。在一些情況下，重組表現載體為病毒構築體，例如重組腺相關病毒構築體(參見，例如美國專利第7,078,387號)、重組腺病毒構築體、重組慢病毒構築體、重組逆轉錄病毒構築體、非整合病毒載體等。
適合的表現載體包括但不限於病毒載體(例如，基於以下之病毒載體：牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見，例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543 2549,1994；Borras等人，Gene Ther 6：515 524,1999；Li及Davidson,PNAS 92：7700 7704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5：1088 1097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)；腺相關病毒(參見，例如Ali等人，Hum Gene Ther 9：8186,1998,Flannery等人，PNAS 94：6916 6921,1997；Bennett等人，Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4：683 690,1997,Rolling等人，Hum Gene Ther 10：641 648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5：591 594,1996；Srivastava in WO 93/09239,Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165；以及Flotte等人，PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；單純皰疹病毒；人類免疫缺陷病毒(參見，例如Miyoshi等人，PNAS 94：10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73：7812 7816,1999)；逆轉錄病毒載體(例如，鼠類
白血病病毒、脾壞死病毒、及源自逆轉錄病毒諸如勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、慢病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒之載體)；及其類似物。
大量適合的表現載體為熟習此項技術者所知，且許多表現載體為市售的。以下載體作為實例提供；對於真核宿主細胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG及pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可使用任何其他載體，只要其與宿主細胞相容。
視所利用之宿主/載體系統而定，在表現載體中可使用許多適合的轉錄及轉譯控制元件中之任一者，包括組成型及誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等(參見，例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153：516-544)。
在一些情況下，編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列可操作地連接至控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。轉錄控制元件可在真核細胞例如哺乳動物細胞；或原核細胞(例如細菌或古細菌細胞)中起作用。在一些情況下，編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列可操作地連接至允許編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列在原核細胞及真核細胞中表現之多個控制元件。
適合的真核細胞啟動子(在真核細胞中起作用之啟動子)之非限制性實例包括來自以下之彼等啟動子：巨細胞病毒(CMV)即刻早期、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期及晚期SV40、來自逆轉錄病毒之長末端重複序列(LTR)、及小鼠金屬硫蛋白-I。適當載體及啟動子之選擇正處於一般熟習此項技術者之水準內。表現載體亦可含有用於轉譯起始之核糖體結合位點及轉錄終止子。表現載體亦可包括用於擴增表現之適當序列。
遺傳修飾之宿主細胞
本發明提供一種遺傳修飾之宿主細胞，其中該宿主細胞經本發明之
核酸遺傳修飾。
適合的宿主細胞包括真核細胞，諸如酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。在一些情況下，宿主細胞為哺乳動物細胞株之細胞。適合的哺乳動物細胞株包括人類細胞株、非人靈長類動物細胞株、齧齒動物(例如小鼠、大鼠)細胞株等。適合的哺乳動物細胞株包括但不限於HeLa細胞(例如，美國典型培養物保藏中心(ATCC)號CCL-2)、CHO細胞(例如，ATCC號CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例如，ATCC號CRL-1573)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如，ATCC號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如，ATCC號CCL10)、PC12細胞(ATCC號CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC號CRL1651)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC號CCLI.3)、人類胚胎腎(HEK)細胞(ATCC號CRL1573)、HLHepG2細胞及其類似物。
在一些情況下，宿主細胞為已經遺傳修飾使得其並未合成內源性MHC β2-M之哺乳動物細胞。
在一些情況下，宿主細胞為已經遺傳修飾使得其並未合成內源性I類MHC重鏈之哺乳動物細胞。在一些情況下，宿主細胞為已經遺傳修飾使得其並未合成內源性MHC β2-M且使得其並未合成內源性I類MHC重鏈之哺乳動物細胞。
組成物
本發明提供包含本發明之TMMP(synTac)的組成物，包括醫藥組成物。本發明提供包含本發明之TMMP的組成物，包括醫藥組成物。本發明提供包含本發明之核酸或重組表現載體的組成物，包括醫藥組成物。
包含多聚體多肽之組成物
除了本發明之TMMP以外，本發明之組成物亦可包含以下中之一或多者：鹽，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；緩衝劑，例如Tris緩衝液、
N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、N-參[羥乙基]甲基-3-胺基丙烷磺酸(TAPS)等；增溶劑；清潔劑，例如非離子性清潔劑，諸如Tween-20等；蛋白酶抑制劑；甘油；及其類似物。
組成物可包含醫藥學上可接受之賦形劑，多種賦形劑為此項技術中已知的且不必在本文中詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已充分描述於多個出版物中，包括例如「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」，第19版(1995)或最新版本，Mack Publishing Co；A.Gennaro(2000)"Remington：The Science and Practice of Pharmacy"，第20版，Lippincott,Williams,& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人編，第7版，Lippincott,Williams,& Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人編，第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
醫藥組成物可包含本發明之TMMP及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，本醫藥組成物將適用於向受試者投與，例如將為無菌的。例如，在一些情況下，本醫藥組成物將適用於向人類受試者投與，例如其中組成物為無菌的且不含可偵測之熱原及/或其他毒素。
蛋白質組成物可包含其他組分，諸如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽及其類似物。組成物可含有接近生理條件所需之醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、毒性調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、鹽酸鹽、硫酸鹽、溶劑合物(例如，混合型離子鹽、水、有機物)、水合物(例如，水)及其類似物。
舉例而言，組成物可包括水溶液、粉末形式、顆粒、錠劑、丸劑、栓劑、膠囊劑、懸浮劑、噴霧劑及其類似物。組成物可根據下文所述之各種投
與途徑調配。
在本發明之TMMP作為可注射物(例如，皮下、腹膜內、肌肉內及/或靜脈內)直接投與至組織中時，調配物可以即用劑型或以非水性形式(例如，可重構之保存穩定的粉末)或水性形式(諸如，由醫藥學上可接受之載劑及賦形劑構成之液體)提供。亦可提供含蛋白質之調配物以便在投與後延長TMMP之血清半衰期。舉例而言，TMMP可提供於脂質體調配物中，製備為膠體，或使用用於延長血清半衰期之其他習知技術。多種方法可用於製備脂質體，如例如Szoka等人1980 Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467，美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中所述。製劑亦可以受控釋放或緩慢釋放形式提供。
適用於非經腸投與之調配物之其他實例包括等張無菌注射溶液、抗氧化劑、抑菌劑、及使調配物與預定接受者之血液等張的溶質、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。舉例而言，本醫藥組成物可存在於容器，例如無菌容器，諸如注射器中。調配物可於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿及小瓶)中提供，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，其僅需要在臨使用前添加無菌液體賦形劑，例如注射用水。臨時注射溶液及懸浮液可自無菌散劑、顆粒及錠劑製備。
本發明之TMMP在調配物中之濃度可廣泛變化(例如，自小於約0.1重量%(通常為或至少約2重量%)至多達20重量%至50重量%或更大)且通常將主要基於流體體積、黏度、及基於患者之因素，根據所選之特定投與模式及患者需求而選擇。
本發明提供包含本發明之組成物(例如液體組成物)之容器。容器可為例如注射器、安瓿及其類似物。在一些情況下，容器為無菌的。在一些情況下，容器及組成物二者均為無菌的。
本發明提供包含本發明之TMMP的組成物，包括醫藥組成物。組成
物可包含：a)本發明之TMMP；及b)如上文所述之賦形劑。在一些情況下，賦形劑為醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些情況下，本發明之TMMP存在於液體組成物中。因此，本發明提供包含本發明之TMMP的組成物(例如液體組成物，包括醫藥組成物)。在一些情況下，本發明之組成物包含：a)本發明之TMMP；及b)鹽水(例如，0.9% NaCl)。在一些情況下，組成物為無菌的。在一些情況下，組成物適用於向人類受試者投與，例如其中組成物為無菌的且不含可偵測之熱原及/或其他毒素。因此，本發明提供一種組成物，其包含：a)本發明之TMMP；及b)鹽水(例如，0.9% NaCl)，其中該組成物為無菌的且不含可偵測之熱原及/或其他毒素。
包含核酸或重組表現載體之組成物
本發明提供包含本發明之核酸或重組表現載體的組成物，例如醫藥組成物。多種醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中已知且不必在本文中詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已充分描述於多個出版物中，包括例如A.Gennaro(2000)"Remington：The Science and Practice of Pharmacy"，第20版，Lippincott,Williams,& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人編，第7版，Lippincott,Williams,& Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人編，第3版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
本發明之組成物可包括：a)一或多種核酸或一或多種重組表現載體，其包含編碼TMMP之核苷酸序列；及b)以下中之一或多者：緩衝劑、界面活性劑、抗氧化劑、親水性聚合物、糊精、螯合劑、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、抑菌劑、潤濕劑及防腐劑。適合的緩衝劑包括但不限於(諸如N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸(BES)、雙(2-羥乙基)胺基-參(羥甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N'3-丙烷磺酸(EPPS或HEPPS)、甘胺醯甘胺酸、N-2-羥乙基哌
嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)、碳酸氫鈉、3-(N-參(羥甲基)-甲基-胺基)-2-羥基-丙烷磺酸)TAPSO、(N-參(羥甲基)甲基-2-胺基乙烷磺酸(TES)、N-參(羥甲基)甲基-甘胺酸(Tricine)、參(羥甲基)-胺基甲烷(Tris)等)。適合的鹽包括例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等。
本發明之醫藥調配物可包括約0.001%至約90%(w/w)之量的本發明之核酸或重組表現載體。在調配物之以下描述中，「本核酸或重組表現載體」應理解為包括本發明之核酸或重組表現載體。舉例而言，在一些情況下，本調配物包含本發明之核酸或重組表現載體。
本核酸或重組表現載體可與其他化合物或化合物混合物摻合，以其他化合物或化合物混合物包封，與其他化合物或化合物混合物偶聯，或以其他方式與其他化合物或化合物混合物締合；此類化合物可包括例如脂質體或受體靶向分子。本核酸或重組表現載體可與幫助攝取、分佈及/或吸收之一或多種組分一起組合於調配物中。
本核酸或重組表現載體組成物可經調配成許多可能劑型中之任一者，諸如但不限於錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。本核酸或重組表現載體組成物亦可經調配成水性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液黏度之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
包含本核酸或重組表現載體之調配物可為脂質體調配物。如本文所用，術語「脂質體」意指由以一個或多個球形雙層排列之兩親性脂質構成的囊泡。脂質體為單層或多層囊泡，其具有由親脂性材料形成之膜及含有待遞送之組成物的水性內腔。陽性脂質體為帶正電脂質體，其可與帶負電DNA分子相互作用以形成穩定複合物。咸信pH敏感性或帶負電之脂質體截留DNA，而非與
其複合。陽離子及非陽離子脂質體皆可用於遞送本核酸或重組表現載體。
脂質體亦包括「空間上穩定之」脂質體，如本文所用，該術語係指包含一或多種特化脂質之脂質體，該特化脂質當併入脂質體中時導致其循環壽命相對於缺乏此類特化脂質之脂質體有所增加。空間上穩定之脂質體之實例為如下之彼等，其中脂質體之囊泡形成脂質之一部分包含一或多種醣脂或以一或多種親水性聚合物諸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。脂質體及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，其以全文引用方式併入本文。
本發明之調配物及組成物亦可包括界面活性劑。界面活性劑於藥物產品、調配物及乳液中之用途為此項技術中所熟知。界面活性劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
在一實施例中，包括各種滲透增強劑以實現核酸之有效遞送。除了幫助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜以外，滲透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透性。滲透增強劑可經分類為屬五大類別之一者，亦即界面活性劑、脂肪酸、膽鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑。滲透增強劑及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，其以全文引用方式併入本文。
用於經口投與之組成物及調配物包括散劑或顆粒、微粒、奈米微粒、水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、小藥囊、錠劑或微型錠劑。可期望增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。適合的口服調配物包含如下之彼等，其中本反義核酸與滲透增強劑界面活性劑及螯合劑中之一或多者一起投與。適合的界面活性劑包括但不限於脂肪酸及/或其酯或鹽、膽酸及/或其鹽。適合的膽酸/鹽及脂肪酸及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中。滲透增強劑，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽組合之組合亦為適合的。示範性適合組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他滲透增強劑包括但不限於聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-十六烷基醚。適合的滲透增強劑亦包括丙
二醇、二甲亞碸、三乙醇胺、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、2-吡咯啶酮及其衍生物、四氫糠醇及AZONETM。
調節T細胞活性之方法
本發明提供一種選擇性調節抗原決定基特異性T細胞之活性的方法，該方法包括使T細胞與本發明之TMMP接觸，其中使T細胞與本發明之TMMP接觸選擇性調節抗原決定基特異性T細胞之活性。在一些情況下，該接觸在活體外發生。在一些情況下，該接觸在活體內發生。在一些情況下，該接觸離體發生。
在一些情況下，例如，在靶標T細胞為CD8+ T細胞時，TMMP包含I類MHC多肽(例如，β2-微球蛋白及I類MHC重鏈)。
在本發明之TMMP包括作為活化多肽之免疫調節多肽時，T細胞與TMMP之接觸激活抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對存在於癌細胞上之抗原決定基有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與TMMP之接觸提高T細胞對癌細胞之細胞毒性活性。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對存在於癌細胞上之抗原決定基有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與TMMP之接觸增加抗原決定基特異性T細胞之數目。
在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對存在於病毒感染細胞上之抗原決定基有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與TMMP之接觸提高T細胞對病毒感染細胞之細胞毒性活性。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對存在於病毒感染細胞上之抗原決定基有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與TMMP之接觸增加抗原決定基特異性T細胞之數目。
在本發明之TMMP包括作為抑制性多肽之免疫調節多肽時，T細胞與TMMP之接觸抑制抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，抗原決定基特
異性T細胞為對存在於自體抗原上之抗原決定基有特異性之自體反應性T細胞，且該接觸減少自體反應性T細胞之數目。
本發明提供一種調節個體中之免疫反應的方法，該方法包括向該個體投與有效量的本發明之TMMP。投與TMMP誘導抗原決定基特異性T細胞反應(例如，WT-1抗原決定基特異性T-細胞反應)及抗原決定基非特異性T細胞反應，其中抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少5：1。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少10：1。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少25：1。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少50：1。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少100：1。在一些情況下，個體為人類。在一些情況下，該調節增加對癌細胞(例如表現WT-1之癌細胞)之細胞毒性T細胞反應。在一些情況下，該投與為靜脈內、皮下、肌肉內、全身性、淋巴管內、治療部位遠端、局部、或治療部位處或附近之投與。
本發明提供一種選擇性遞送共刺激(亦即，免疫調節)多肽至靶標T細胞之方法，該方法包括使混合T細胞群與本發明之TMMP接觸，其中該混合T細胞群包含靶標T細胞及非靶標T細胞，其中靶標T細胞對存在於TMMP內之抗原決定基有特異性(例如，其中靶標T細胞對存在於TMMP內之WT-1抗原決定基有特異性)，且其中該接觸步驟遞送存在於TMMP內之一或多種共刺激多肽(免疫調節多肽)至靶標T細胞。在一些情況下，該T細胞群在活體外。在一些情況下，該T細胞群在個體活體內。在一些情況下，該方法包括向個體投與TMMP。在一些情況下，T細胞為細胞毒性T細胞。在一些情況下，混合T細胞
群為自個體獲得之活體外混合T細胞群，且接觸步驟導致靶標T細胞之活化及/或增殖，從而生成經活化及/或增殖之靶標T細胞群；在該等情況之一些下，該方法進一步包含向個體投與經活化及/或增殖之靶標T細胞群。
本發明提供一種偵測自個體獲得之混合T細胞群中結合目標抗原決定基(例如，WT-1抗原決定基)之靶標T細胞之存在的方法，該方法包括：a)使混合T細胞群與本發明之TMMP在活體外接觸，其中TMMP包含目標抗原決定基(例如，WT-1抗原決定基)；及b)偵測T細胞響應於該接觸之活化及/或增殖，其中經活化及/或增殖之T細胞指示靶標T細胞之存在。
治療方法
本發明提供一種治療個體之方法，該方法包括向個體投與有效治療個體之量的本發明之TMMP或一或多種編碼TMMP之核酸。亦提供本發明之TMMP，其係用於治療人類或動物體之方法中。在一些情況下，本發明之治療方法包括向有需要之個體投與包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列之一或多種重組表現載體。在一些情況下，本發明之治療方法包括向有需要之個體投與包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列之一或多種mRNA分子。在一些情況下，本發明之治療方法包括向有需要之個體投與本發明之TMMP。可治療之病狀包括例如如下文所述之癌症及自體免疫病症。
在一些情況下，本發明之TMMP當向有需要之個體投與時誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應。換言之，在一些情況下，本發明之TMMP當向有需要之個體投與時藉由調節第一T細胞之活性來誘導抗原決定基特異性T細胞反應，該第一T細胞呈現出：i)對存在於TMMP中之抗原決定基有特異性之TCR；ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽；且藉由調節第二T細胞之活性來誘導抗原決定基非特異性T細胞反應，該第二T細胞呈現出：i)對除了存在於TMMP中之抗原決定基以外
的抗原決定基有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1、至少5：1、至少10：1、至少15：1、至少20：1、至少25：1、至少50：1、或至少100：1。抗原決定基特異性T細胞反應與抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為約2：1至約5：1、約5：1至約10：1、約10：1至約15：1、約15：1至約20：1、約20：1至約25：1、約25：1至約50：1、或約50：1至約100：1、或大於100：1。「調節T細胞之活性」可包括以下各項中之一或多者：i)激活細胞毒性(例如CD8+)T細胞；ii)誘導細胞毒性(例如CD8+)T細胞之細胞毒性活性；iii)誘導細胞毒性(例如CD8+)T細胞對細胞毒素(例如穿孔蛋白；顆粒酶；粒溶蛋白)之產生及釋放；iv)抑制自體反應性T細胞之活性；及其類似效應。
免疫調節多肽對其同源共免疫調節多肽之減小的親和力與抗原決定基對TCR之親和力的組合提供了本發明之TMMP的提高的選擇性。因此，舉例而言，本發明之TMMP與其結合至第二T細胞之親合力相比以更高親合力結合至第一T細胞，該第一T細胞呈現出：i)對存在於TMMP中之抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽，該第二T細胞呈現出：i)對除了存在於TMMP中之抗原決定基以外的抗原決定基具有特異性之TCR；及ii)結合至存在於TMMP中之免疫調節多肽的共免疫調節多肽。
本發明提供一種選擇性調節個體中抗原決定基特異性T細胞之活性的方法，該方法包括向該個體投與有效量的本發明之TMMP或一或多種包含編碼TMMP之核苷酸序列的核酸(例如，表現載體；mRNA；等)，其中TMMP選擇性調節個體中抗原決定基特異性T細胞之活性。選擇性調節抗原決定基特異性T細胞之活性可治療個體之疾病或病症。因此，本發明提供一種治療方法，其包含向有需要之個體投與有效量的本發明之TMMP。
在一些情況下，免疫調節多肽(「MOD」)為活化多肽，且TMMP激活抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，抗原決定基為癌症相關抗原決定基，且TMMP提高對於癌症相關抗原決定基有特異性之T細胞之活性。在一些情況下，MOD為活化多肽，且TMMP激活WT-1抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，T細胞為T輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、或NK-T-細胞。在一些情況下，抗原決定基為WT-1抗原決定基，且TMMP提高對表現WT-1抗原決定基之癌細胞有特異性之T細胞(例如，T輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、及/或NK-T-細胞)之活性。CD4+ T細胞之活化可包括增加CD4+ T細胞之增殖及/或誘導或增加由CD4+ T細胞釋放之細胞介素。NK-T細胞及/或CD8+細胞之活化可包括：增加NK-T-細胞及/或CD8+細胞之增殖；及/或誘導由NK-T-細胞及/或CD8+細胞釋放細胞介素諸如干擾素γ。在一些情況下，本發明之TMMP減少調節性T(Treg)細胞之增殖及/或活性。Treg為FoxP3+、CD4+ T細胞。在一些情況下，例如，在本發明之TMMP包含抑制性免疫調節多肽(例如，PD-L1、FasL及其類似物)時，TMMP減少Treg之增殖及/或活性。
在一些情況下，免疫調節多肽為活化多肽，且TMMP激活抗原決定基特異性T細胞。在一些情況下，抗原決定基為癌症相關抗原決定基，且TMMP提高對於癌症相關抗原決定基有特異性之T細胞之活性。
在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向患有表現WT-1之癌症的個體投與TMMP。表現WT1之癌症包括白血病、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮癌、甲狀腺癌、肝癌、腎癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肉瘤、肝細胞癌、韋爾姆斯氏瘤、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生異常症候群(MDS)、非小細胞肺癌(NSCLC)、骨髓瘤、胰臟癌、結腸直腸癌、間皮瘤、軟組織肉瘤、神經胚細胞
瘤及腎胚細胞瘤。
在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之急性骨髓性白血病(AML)。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之骨髓瘤。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之卵巢癌。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之胰臟癌。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之非小細胞肺癌(NSCLC)。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之結腸直腸癌(CRC)。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之乳癌。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之韋爾姆斯氏瘤。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之間皮瘤。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之軟組織肉瘤。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之神經胚細胞瘤。在本發明之TMMP包含WT-1肽抗原決定基時，可向有需要之個體投與TMMP以治療個體之腎胚細胞瘤。
本發明提供一種治療個體之癌症的方法，該方法包括向該個體投與有效量的本發明之TMMP或一或多種包含編碼TMMP之核苷酸序列的核酸(例如，表現載體；mRNA；等)，其中TMMP包含作為癌症抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中TMMP包含刺激性免疫調節多肽。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中癌細胞之數目之量。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為
以下之量：當以一或多個劑量向有需要之個體投與時，與在投與TMMP之前或在未以TMMP投與時個體中癌細胞之數目相比使個體中癌細胞之數目減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中癌細胞之數目至不可偵測水準之量。
在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中之腫瘤質量之量。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為以下之量：當以一或多個劑量向有需要之個體(患有腫瘤之個體)投與時，與在投與TMMP之前或在未以TMMP投與時個體中之腫瘤質量相比使個體中之腫瘤質量減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體(患有腫瘤之個體)投與時減小個體中之腫瘤體積之量。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為以下之量：當以一或多個劑量向有需要之個體(患有腫瘤之個體)投與時，與在投與TMMP之前或在未以TMMP投與時個體中之腫瘤體積相比使個體中之腫瘤體積減小至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時增加個體之存活時間之量。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為以下之量：當以一或多個劑量向有需要之個體投與時，與在未以TMMP投與時個體之預期存活時間相比使個體之存活時間增加至少1個月、至少2個月、至少3個月、3個月至6個月、6個月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或
大於10年。
在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對存在於病毒感染細胞上之抗原決定基有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與TMMP之接觸提高T細胞對病毒感染細胞之細胞毒性活性。在一些情況下，抗原決定基特異性T細胞為對存在於病毒感染細胞上之抗原決定基有特異性之T細胞，且抗原決定基特異性T細胞與TMMP之接觸增加抗原決定基特異性T細胞之數目。
因此，本發明提供一種治療個體之病毒感染的方法，該方法包括向該個體投與有效量的本發明之TMMP或一或多種包含編碼TMMP之核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含作為病毒抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中TMMP包含刺激性免疫調節多肽。在一些情況下，TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中病毒感染細胞之數目之量。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為以下之量：當以一或多個劑量向有需要之個體投與時，與在投與TMMP之前或在未以TMMP投與時個體中病毒感染細胞之數目相比使個體中病毒感染細胞之數目減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中病毒感染細胞之數目至不可偵測水準之量。
因此，本發明提供一種治療個體之感染的方法，該方法包括向該個體投與有效量的本發明之TMMP或一或多種包含編碼TMMP之核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含作為病原體相關抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中TMMP包含刺激性免疫調節多肽。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中病原體之數目之量。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為以下之量：當以一或
多個劑量向有需要之個體投與時，與在投與TMMP之前或在未以TMMP投與時個體中病原體之數目相比使個體中病原體之數目減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中病原體之數目至不可偵測水準之量。病原體包括病毒、細菌、原蟲及其類似物。
在一些情況下，免疫調節多肽為抑制性多肽，且TMMP抑制抗原決定基特異性T細胞之活性。在一些情況下，抗原決定基為自體抗原決定基，且TMMP選擇性抑制對自體抗原決定基有特異性之T細胞的活性。
本發明提供一種治療個體之自體免疫病症的方法，該方法包括向該個體投與有效量的本發明之TMMP或一或多種包含編碼TMMP之核苷酸序列的核酸，其中TMMP包含作為自體抗原決定基之T細胞抗原決定基，且其中TMMP包含抑制性免疫調節多肽。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為以下之量：當以一或多個劑量向有需要之個體投與時，與在投與TMMP之前或在未以TMMP投與時個體中自體反應性T細胞之數目相比使個體中自體反應性T細胞之數目減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在一些情況下，TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減少個體中Th2細胞介素之產生的量。在一些情況下，本發明之TMMP之「有效量」為當以一或多個劑量向有需要之個體投與時減輕個體中的一或多種與自體免疫疾病相關之症狀的量。
如上文所述，在一些情況下，在進行本治療方法時，作為TMMP本身向有需要之個體投與本發明之TMMP。在其他情況下，在進行本治療方法時，向有需要之個體投與一或多種包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列之核酸。
因此，在其他情況下，向有需要之個體投與本發明之一或多種核酸，例如，本發明之一或多種重組表現載體。
調配物
適合的調配物係上文所述，其中適合的調配物包括醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合的調配物包含：a)本發明之TMMP；及b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合的調配物包含：a)包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列之核酸；及b)醫藥學上可接受之賦形劑；在一些情況下，核酸為mRNA。在一些情況下，適合的調配物包含：a)第一核酸，該第一核酸包含編碼本發明之TMMP之第一多肽的核苷酸序列；b)第二核酸，該第二核酸包含編碼本發明之TMMP之第二多肽的核苷酸序列；及c)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合的調配物包含：a)包含編碼本發明之TMMP的核苷酸序列之重組表現載體；及b)醫藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，適合的調配物包含：a)第一重組表現載體，其包含編碼本發明之TMMP之第一多肽的核苷酸序列；b)第二重組表現載體，其包含編碼本發明之TMMP之第二多肽的核苷酸序列；及c)醫藥學上可接受之賦形劑。
適合的醫藥學上可接受之賦形劑係上文所述。
劑量
適合的劑量可由主治醫師或其他合格醫務人員基於各種臨床因素來判定。如醫學技術中所熟知，用於任一患者之劑量視許多因素而定，包括患者之體型、身體表面積、年齡、待投與之特定多肽或核酸、患者之性別、投與時間及途徑、一般健康狀況、及同時投與之其他藥物。本發明之TMMP可投與之量介於1ng/kg體重與20mg/kg體重/劑量之間，例如在0.1mg/kg體重至10mg/kg體重之間，例如在0.5mg/kg體重至5mg/kg體重之間；然而，設想低於或高於此示範性範圍之劑量，特別是考慮到上述因素。若方案為連續輸注，則其亦可
處於1μg至10mg/kg體重/min之範圍內。本發明之TMMP可投與之量為約1mg/kg體重至50mg/kg體重，例如約1mg/kg體重至約5mg/kg體重、約5mg/kg體重至約10mg/kg體重、約10mg/kg體重至約15mg/kg體重、約15mg/kg體重至約20mg/kg體重、約20mg/kg體重至約25mg/kg體重、約25mg/kg體重至約30mg/kg體重、約30mg/kg體重至約35mg/kg體重、約35mg/kg體重至約40mg/kg體重、或約40mg/kg體重至約50mg/kg體重。
在一些情況下，本發明之TMMP之適合劑量為0.01μg至100g/kg體重、0.1μg至10g/kg體重、1μg至1g/kg體重、10μg至100mg/kg體重、100μg至10mg/kg體重、或100μg至1mg/kg體重。一般熟習此項技術者可容易基於所量測之滯留時間及所投與之藥劑在體液或組織中之濃度來估計給藥之重複率。在成功治療之後，可能期望使患者經歷維持療法以預防疾病狀態之復發，其中本發明之TMMP的經投與之維持劑量的範圍為0.01μg至100g/kg體重、0.1μg至10g/kg體重、1μg至1g/kg體重、10μg至100mg/kg體重、100μg至10mg/kg體重、或100μg至1mg/kg體重。
熟習此項技術者將易於瞭解，劑量水準可隨特定TMMP、症狀嚴重程度及受試者對副作用之易感性而變化。給定化合物之較佳劑量可容易由熟習此項技術者藉由多種方式判定。
在一些情況下，投與多個劑量的本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體之投與頻率可根據多種因素中之任一者而變化，該等因素為例如症狀之嚴重性等。舉例而言，在一些情況下，本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體每月一次、每月兩次、每月三次、每隔一週一次(qow)、每週一次(qw)、每週兩次(biw)、每週三次(tiw)、每週四次、每週五次、每週六次、每隔一天一次(qod)、每日一次(qd)、每日兩次(qid)、或每日三次(tid)投與。
本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體的投與持續時間，例如投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體的時間段，可根據多種因素中之任一者而變化，該等因素為例如患者反應等。舉例而言，本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體可投與之時間段的範圍為約一日至約一週、約兩週至約四週、約一個月至約兩個月、約兩個月至約四個月、約四個月至約六個月、約六個月至約八個月、約八個月至約1年、約1年至約2年、或約2年至約4年、或更長時間。
投與途徑
活性劑(本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體)係使用任何可用之方法及適用於藥物遞送之途徑(包括活體內及離體方法以及全身性及局部投與途徑)向個體投與。
習知及醫藥學上可接受之投與途徑包括腫瘤內、腫瘤周圍、肌肉內、淋巴管內、氣管內、顱內、皮下、皮內、局部施用、靜脈內、動脈內、經直腸、經鼻、經口、以及其他經腸及非經腸投與途徑。投與途徑在需要時可經組合或根據TMMP及/或所要效果而調整。本發明之TMMP或本發明之核酸或重組表現載體可以單一劑量或以多個劑量投與。
在一些情況下，靜脈內投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。在一些情況下，肌肉內投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。在一些情況下，淋巴管內投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。在一些情況下，局部投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。在一些情況下，腫瘤內投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。在一些情況下，腫瘤周圍投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。在一些情況下，顱內投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明
之重組表現載體。在一些情況下，皮下投與本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體。
在一些情況下，靜脈內投與本發明之TMMP。在一些情況下，肌肉內投與本發明之TMMP。在一些情況下，局部投與本發明之TMMP。在一些情況下，腫瘤內投與本發明之TMMP。在一些情況下，腫瘤周圍投與本發明之TMMP。在一些情況下，顱內投與本發明之TMMP。在一些情況下，皮下投與TMMP。在一些情況下，淋巴管內投與本發明之TMMP。
本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體可使用任何可用之習知方法及適用於遞送習知藥物之途徑(包括全身性或局部途徑)向宿主投與。一般而言，預期用於本發明之方法中的投與途徑包括但不一定限於經腸、非經腸及吸入途徑。
除了吸入投與以外的非經腸投與途徑包括但不一定限於局部、經皮、皮下、肌肉內、眼眶內、囊內、脊柱內、胸骨內、腫瘤內、淋巴管內、腫瘤周圍及靜脈內途徑，亦即除通過消化道以外的任何投與途徑。可進行非經腸投與以實現本發明之TMMP、本發明之核酸、或本發明之重組表現載體的全身性或局部遞送。在需要全身性遞送時，遞送通常涉及醫藥製劑之侵襲性或全身性吸附性局部或黏膜投與。
組合療法
在一些情況下，本發明之用於治療個體之癌症的方法包括：a)投與本發明之TMMP；及b)投與至少一種額外治療劑或治療性治療。適合的額外治療劑包括但不限於小分子癌症化學治療劑及免疫檢查點抑制劑。適合的額外治療性治療包括例如輻射、手術(例如，手術切除腫瘤)及其類似操作。
本發明之治療方法可包含共投與本發明之TMMP及至少一種額外治療劑。「共投與」意指向個體投與本發明之TMMP及至少一種額外治療劑兩者，
但不一定在同一時間投與，以便實現治療作用，該治療作用為已投與TMMP及至少一種額外治療劑之結果。TMMP及至少一種額外治療劑之投與可為實質上同時的，例如，可在投與至少一種額外治療劑之約1分鐘至約24小時內(例如，在約1分鐘內、在約5分鐘內、在約15分鐘內、在約30分鐘內、在約1小時內、在約4小時內、在約8小時內、在約12小時內、或在約24小時內)向個體投與TMMP。在一些情況下，向正經歷使用至少一種額外治療劑之治療或已經歷使用至少一種額外治療劑之治療的個體投與本發明之TMMP。TMMP之投與可在不同時間且/或以不同頻率發生。
作為一實例，本發明之治療方法可包含共投與本發明之TMMP及免疫檢查點抑制劑，諸如對免疫檢查點有特異性之抗體。「共投與」意指向個體投與本發明之TMMP及免疫檢查點抑制劑(例如，對免疫檢查點多肽有特異性之抗體)兩者，但不一定在同一時間投與，以便實現治療作用，該治療作用為已投與TMMP及免疫檢查點抑制劑(例如，對免疫檢查點多肽有特異性之抗體)之結果。TMMP及免疫檢查點抑制劑(例如，對免疫檢查點多肽有特異性之抗體)之投與可為實質上同時的，例如，可在投與免疫檢查點抑制劑(例如，對免疫檢查點多肽有特異性之抗體)之約1分鐘至約24小時內(例如，在約1分鐘內、在約5分鐘內、在約15分鐘內、在約30分鐘內、在約1小時內、在約4小時內、在約8小時內、在約12小時內、或在約24小時內)向個體投與TMMP。在一些情況下，向正經歷使用免疫檢查點抑制劑(例如，對免疫檢查點多肽有特異性之抗體)之治療或已經歷使用該免疫檢查點抑制劑之治療的個體投與本發明之TMMP。TMMP及免疫檢查點抑制劑(例如，對免疫檢查點多肽有特異性之抗體)之投與可在不同時間且/或以不同頻率發生。
示範性免疫檢查點抑制劑包括靶向以下免疫檢查點多肽之抑制劑：諸如CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、
JAK、PI3K δ、PI3K γ、TAM、精胺酸酶、CD137(亦稱為4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。在一些情況下，免疫檢查點多肽為選自以下之刺激性檢查點分子：CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR、CD122及CD137。在一些情況下，免疫檢查點多肽為選自以下之抑制性檢查點分子：A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM3、CD96、TIGIT及VISTA。
在一些情況下，免疫檢查點抑制劑為對免疫檢查點多肽有特異性之抗體。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體為單株抗體。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體經人源化或去人源化，使得抗體實質上未在人類中引發免疫反應。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體為人源化單株抗體。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體為去人源化單株抗體。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體為全人類單株抗體。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體抑制免疫檢查點多肽與免疫檢查點多肽之配位體的結合。在一些情況下，抗免疫檢查點抗體抑制免疫檢查點多肽與免疫檢查點多肽之受體的結合。
適合的抗免疫檢查點抗體包括但不限於納武單抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、派姆單抗(pembrolizumab)(Merck)、披地單抗(pidilizumab)(Curetech)、AMP-224(GlaxoSmithKline/Amplimmune)、MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Medarex,Inc./Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(Medimmune/AstraZeneca)、阿維魯單抗(arelumab)(Merck Serono)、伊匹珠單抗(ipilimumab)(YERVOY,(Bristol-Myers Squibb)、曲利木單抗(tremelimumab)(Pfizer)、披地單抗(CureTech,Ltd.)、IMP321(Immutep S.A.)、MGA271(Macrogenics)、BMS-986016(Bristol-Meyers Squibb)、利魯單抗(lirilumab)(Bristol-Myers Squibb)、烏瑞魯單抗(urelumab)(Bristol-Meyers Squibb)、
PF-05082566(Pfizer)、IPH2101(Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb)、MEDI-6469(MedImmune/AZ)、CP-870,893(Genentech)、莫木利珠單抗(Mogarmulizumab)(Kyowa Hakko Kirin)、瓦利魯單抗(Varlilumab)(CelIDex Therapeutics)、阿維單抗(Avelumab)(EMD Serono)、加利昔單抗(Galiximab)(Biogen Idec)、AMP-514(Amplimmune/AZ)、AUNP 12(Aurigene及Pierre Fabre)、伊多莫德(Indoximod)(NewLink Genetics)、NLG-919(NewLink Genetics)、INCB024360(Incyte)；KN035；及其組合。舉例而言，在一些情況下，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體。適合的抗PD-1抗體包括例如納武單抗、派姆單抗(亦稱為MK-3475)、披地單抗、SHR-1210、PDR001及AMP-224。在一些情況下，抗PD-1單株抗體為納武單抗、派姆單抗或PDR001。適合的抗PD1抗體描述於美國專利公佈第2017/0044259號中。關於披地單抗，參見，例如Rosenblatt等人(2011)J.Immunother.34：409-18。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑為抗CTLA-4抗體。在一些情況下，抗CTLA-4抗體為伊匹珠單抗或曲利木單抗。關於曲利木單抗，參見，例如Ribas等人(2013)J.Clin.Oncol.31：616-22。在一些情況下，免疫檢查點抑制劑為抗PD-L1抗體。在一些情況下，抗PD-L1單株抗體為BMS-935559、MEDI4736、MPDL3280A(亦稱為RG7446)、KN035或MSB0010718C。在一些實施例中，抗PD-L1單株抗體為MPDL3280A(阿特珠單抗)或MEDI4736(德瓦魯單抗)。關於德瓦魯單抗，參見，例如WO 2011/066389。關於阿特珠單抗，參見，例如美國專利第8,217,149號。
適於治療之受試者
適於以本發明之方法進行治療之受試者包括患有癌症之個體，包括已經診斷為患有癌症之個體、已對癌症進行治療但未能響應於該治療之個體、及已對癌症進行治療且最初響應於該治療但隨後變成該治療難治之個體。適於以本發明之方法進行治療之受試者包括患有感染(例如，病原體諸如細菌、病毒、
原蟲等之感染)之個體，包括已經診斷為患有感染之個體及已對感染進行治療但未能響應於該治療之個體。適於以本發明之方法進行治療之受試者包括患有細菌感染之個體，包括已經診斷為患有細菌感染之個體及已對細菌感染進行治療但未能響應於該治療之個體。適於以本發明之方法進行治療之受試者包括患有病毒感染之個體，包括已經診斷為患有病毒感染之個體及已對病毒感染進行治療但未能響應於該治療之個體。適於以本發明之方法進行治療之受試者包括患有自體免疫疾病之個體，包括已經診斷為患有自體免疫疾病之個體及已對自體免疫疾病進行治療但未能響應於該治療之個體。
本發明之非限制性態樣之實例
態樣組A
上文所述之本發明主題之態樣(包括實施例)單獨或在與一或多個其他態樣或實施例組合時可為有益的。不限於以上描述，下文提供本發明之編號1-95的某些非限制性態樣。如熟習此項技術者在閱讀本發明之後將顯而易知，可使用個別編號之態樣中之各者或將其與前述或以下個別編號之態樣中之任一者組合。此旨在提供全部此等態樣組合之支持且不限於下文明確提供之態樣之組合：
態樣1.一種T細胞調節多聚體多肽，其包含：至少一種異二聚體，該異二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)肽抗原決定基；及ii)第一主要組織相容性複合物(MHC)多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽；及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該免疫調節多肽。
態樣2.如態樣1之T細胞調節多聚體多肽，其中一或多個免疫調節結構域中之至少一者為變異體免疫調節多肽，其呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對該同源共免疫調節多肽之親和力相比有
所減小，且其中該抗原決定基以至少10-7M之親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)，使得：i)該T細胞調節多聚體多肽結合至第一T細胞之親和力比該T細胞調節多聚體多肽結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中該第一T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽及以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR，且其中該第二T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽，但在其表面上不表現以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR；且/或ii)當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽與同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽變異體之該T細胞調節多聚體多肽與該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率範圍為1.5：1至106：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
態樣3.如態樣2之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)該T細胞調節多聚體多肽結合至該第一T細胞之親和力比其結合該第二T細胞之親和力高至少50%、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或b)該變異體免疫調節多肽結合該共免疫調節多肽之親和力為約10-4M至約10-7M、約10-4M至約10-6M、約10-4M至約10-5M；且/或c)其中當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽與同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽之變異體的該T細胞調節多聚體多肽與該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率為至少10：1、至少50：1、至少102：1或至少103：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
態樣4.如態樣1-3中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一多肽或該第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
態樣5.如態樣4之T細胞調節多聚體多肽，其中該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽。
態樣6.如態樣5之T細胞調節多聚體多肽，其中IgG1 Fc多肽包含
選自以下之一或多個胺基酸取代：N297A、L234A、L235A、L234F、L235E及P331S。
態樣7.如態樣1-6中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中：a1)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；ii)該第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；且b2)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該第二MHC多肽；及ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或a2)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b2)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；ii)該第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽；或a3)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b3)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；或a4)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b4)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該第二MHC多肽；及ii)至少一種免疫調節多肽；或a5)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b5)第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；及ii)該第二MHC多肽；或a6)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；ii)該第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；且b6)該第二多肽包含：i)該第二MHC多肽。
態樣8.如態樣1-7中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一多肽包含介於該WT-1抗原決定基與該第一MHC多肽之間的肽連接子且/或其中該第二多肽包含介於該免疫調節多肽與該第二MHC多肽之間的肽連接子。
態樣9.如態樣8之T細胞調節多聚體多肽，其中該肽連接子包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：284)，其中n為1至10之整數。
態樣10.如態樣1-9中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2-微球蛋白多肽；且其中該第二MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。
態樣11.如態樣1-10中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽係選自由以下組成之群：細胞介素(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽及其類似物；且包括全部家族成員，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80及CD86亦分別稱為B7-1及B7-2)、CD40多肽、CD70多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受體多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、及其組合。
態樣12.如態樣1-11中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽為IL-2多肽。
態樣13.如態樣1-12中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含至少兩種免疫調節多肽，且其中該等免疫調節多肽中之至少兩者為相同的。
態樣14.如態樣13之T細胞調節多聚體多肽，其中該兩種或更多種免疫調節多肽係串聯在一起。
態樣15.如態樣1-14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一多肽與該第二多肽彼此共價連接。
態樣16.如態樣15之T細胞調節多聚體多肽，其中該共價鍵係經由二硫鍵。
態樣17.如態樣1-16中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽或介於該抗原決定基與該第一MHC多肽之間的連接子包含提供第一Cys殘基之胺基酸取代，其中該第二MHC多肽包含提供第二Cys殘基之胺基酸取代，且其中該二硫鍵聯係在該第一Cys殘基與該第二Cys殘基之間。
態樣18.如態樣1-17中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基具有之長度為約4個胺基酸至約25個胺基酸。
態樣19.如態樣1-18中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO：223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO：225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO：227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO：229)、MTWNLMNLGATIKGV(SEQ ID NO：230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：232)、MNLGATLK(SEQ ID NO：233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO：234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO：239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO：240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO：241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO：242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO：243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO：244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO：245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO：246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO：247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO：248)、QFPNHSFKHED
PM(SEQ ID NO：249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO：250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO：252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO：253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO：254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO：255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO：257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)、CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)及NQMNLGATL(SEQ ID NO：267)。
態樣20.如態樣1-18中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽包含胺基酸序列CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)或CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)。
態樣21.如態樣1-20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽或該第二MHC多肽包含：a)與圖9A中描繪屬於SEQ ID NO：198之HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或b)與圖10A中描繪屬於SEQ ID NO：207之HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或c)與圖11A中描繪屬於SEQ ID NO：214之HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣22.如態樣1-20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第
一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*2402多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣23.如態樣1-20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽為HLA-A*1101多肽。
態樣24.如態樣1-20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*3303多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣25.如態樣1-20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*0201多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣26.如態樣21-25中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該MHC重鏈多肽包含在位置236處之Cys。
態樣27.如態樣21-26中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該β2M多肽包含在位置12處之Cys。
態樣28.如態樣1-27中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該免疫調節多肽為包含以下之變異體IL-2多肽：i)H16A取代及F42A取代；或ii)H16T取代及F42A取代。
態樣29.如態樣4-28中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含第一異二聚體及第二異二聚體，且其中該第一異二聚體與該第二異二聚體藉由介於該第一異二聚體與該第二異二聚體之Ig Fc多肽之間的一或多個二硫鍵來共價結合。
態樣30.一種核酸，其包含編碼根據態樣1-28中任一項之第一多肽或第二多肽的核苷酸序列，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個免疫調節結構域。
態樣31.一種表現載體，其包含如態樣30之核酸。
態樣32.一種選擇性調節對於韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)抗原決定基具有特異性之T細胞之活性的方法，該方法包括使該T細胞與根據態樣1-29中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該接觸選擇性調節該WT-1抗原決定基特異性T細胞之活性。
態樣22.一種治療患有癌症之患者的方法，該方法包括向該患者投與有效量的包含根據態樣1-29中任一項之T細胞調節多聚體多肽之醫藥組成物。
態樣34.如態樣33之方法，其中該癌症為肝細胞癌、胰臟癌、胃癌、結腸直腸癌、肝胚細胞瘤或卵巢卵黃囊瘤。
態樣35.如態樣33或態樣34之方法，其中該投與係肌肉內投與。
態樣36.如態樣33或態樣34之方法，其中該投與係靜脈內投與。
態樣37.一種調節個體之免疫反應的方法，該方法包括向該個體投與有效量的如態樣1-29中任一項之T細胞調節多聚體多肽(TMMP)，其中該投與誘導抗原決定基特異性T細胞反應(例如，對於存在於該TMMP中之該WT-1抗原決定基有特異性之T細胞反應)及抗原決定基非特異性T細胞反應，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1。
態樣38 如態樣37之方法，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少5：1。
態樣39.如態樣37之方法，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少10：1。
態樣40.如態樣37之方法，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少25：1。
態樣41.如態樣37之方法，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與
該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少50：1。
態樣42.如態樣37之方法，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少100：1。
態樣43.如態樣37-42中任一項之方法，其中該個體為人類。
態樣44.如態樣37-43中任一項之方法，其中該調節包含增強對癌細胞(例如表現WT-1之癌細胞)之細胞毒性T細胞反應。
態樣45.如態樣37-44中任一項之方法，其中該投與為靜脈內、皮下、肌肉內、全身性、淋巴管內、治療部位遠端、局部、或治療部位處或附近之投與。
態樣46.如態樣37-45中任一項之方法，其中該抗原決定基非特異性T細胞反應小於由包含相應野生型免疫調節多肽之對照T細胞調節多聚體多肽誘導之抗原決定基非特異性T細胞反應。
態樣47.一種選擇性遞送共刺激(亦即，免疫調節)多肽至靶標T細胞之方法，該方法包括使混合T細胞群與如態樣1-29中任一項之T細胞調節多聚體多肽(TMMP)接觸，其中該混合T細胞群包含該靶標T細胞及非靶標T細胞，其中該靶標T細胞對存在於該TMMP內之該抗原決定基有特異性(例如，其中該靶標T細胞對存在於該TMMP內之該WT-1抗原決定基有特異性)，且其中該接觸遞送存在於該TMMP內之該一或多種共刺激多肽至該靶標T細胞。
態樣48.如態樣47之方法，其中該T細胞群在活體外。
態樣49.如態樣47之方法，其中該T細胞群在個體活體內。
態樣50.如態樣49之方法，其包含向該個體投與該多聚體多肽。
態樣51.如態樣47-50中任一項之方法，其中該靶標T細胞為細胞毒性T細胞。
態樣52.如態樣47之方法，其中該混合T細胞群為自個體獲得之活 體外混合T細胞群，且其中該接觸導致該靶標T細胞之活化及/或增殖，從而生成經活化及/或增殖之靶標T細胞群。
態樣53.如態樣52之方法，其進一步包括向該個體投與該經活化及/或增殖之靶標T細胞群。
態樣54.一種偵測自個體獲得之混合T細胞群中結合目標WT-1抗原決定基之靶標T細胞之存在的方法，該方法包括：a)使該混合T細胞群與如態樣1-29中任一項之T細胞調節多聚體多肽(TMMP)在活體外接觸，其中該TMMP包含目標WT-1抗原決定基；及b)偵測T細胞響應於該接觸之活化及/或增殖，其中經活化及/或增殖之T細胞指示靶標T細胞之存在。
態樣55.一種T細胞調節多聚體多肽，其包含：至少一種異二聚體，該異二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)肽抗原決定基，其中該WT-1肽具有之長度為約4個胺基酸至約25個胺基酸；及ii)第一主要組織相容性複合物(MHC)I類多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二I類MHC多肽，及c)至少一種免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該免疫調節多肽，且其中該第一多肽與該第二多肽經由至少2個二硫鍵彼此共價連接。
態樣56.如態樣55之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽中之至少一者為變異體免疫調節多肽，其呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對該同源共免疫調節多肽之親和力相比有所減小，且其中該抗原決定基以至少10-7M之親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)，使得：i)該T細胞調節多聚體多肽結合至第一T細胞之親和力比該T細胞調節多聚體多肽結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中該第一T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽及以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR，且其中該第二T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽，
但在其表面上不表現以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR；且/或ii)當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽與同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽變異體之該T細胞調節多聚體多肽與該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率範圍為1.5：1至106：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
態樣57.如態樣56之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)該T細胞調節多聚體多肽結合至該第一T細胞之親和力比其結合該第二T細胞之親和力高至少50%、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或b)該變異體免疫調節多肽結合該共免疫調節多肽之親和力為約10-4M至約10-7M、約10-4M至約10-6M、約10-4M至約10-5M；且/或c)其中當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽與同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽變異體之該T細胞調節多聚體多肽與該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率為至少10：1、至少50：1、至少102：1或至少103：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
態樣58.如態樣55-57中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一多肽或該第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
態樣59.如態樣58之T細胞調節多聚體多肽，其中該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽。
態樣60.如態樣58之T細胞調節多聚體多肽，其中該Ig Fc多肽為IgG4 Fc多肽。
態樣61.如態樣59之T細胞調節多聚體多肽，其中IgG1 Fc多肽包含選自以下之一或多個胺基酸取代：N297A、L234A、L235A、L234F、L235E及P331S。
態樣62.如態樣55-61中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中
a1)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；
ii)該第一I類MHC多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽；且
b1)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該第二I類MHC多肽；及
ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或
a2)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一I類MHC多肽；且
b2)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)至少一種免疫調節多肽；
ii)該第二I類MHC多肽；及
iii)Ig Fc多肽；或
a3)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一I類MHC多肽；且
b3)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該第二I類MHC多肽；及
ii)Ig Fc多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽；或
a4)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一I類MHC多肽；且
b4)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該第二I類MHC多肽；及
ii)至少一種免疫調節多肽；或
a5)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一I類MHC多肽；且
b5)第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)至少一種免疫調節多肽；及
ii)該第二I類MHC多肽；或
a6)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；
ii)該第一I類MHC多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽；且
b6)該第二多肽包含：
i)該第二I類MHC多肽。
態樣63.如態樣55-62中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2-微球蛋白多肽；且其中該第二MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。
態樣64.如態樣55-63中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽係選自由以下組成之群：細胞介素(例如，IL2多肽、IL7多肽、IL12多肽、IL15多肽、IL17多肽、IL21多肽、IL27多肽、IL-23多肽、TGFβ多肽及其類似物；且包括全部家族成員，例如IL17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-17E)、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽(CD80及CD86亦分別稱為B7-1及B7-2)、CD40多肽、CD70
多肽、JAG1(CD339)多肽、ICAM(CD540多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、PD-L2多肽、PD-1H(VISTA)多肽、ICOS-L(CD275)多肽、GITRL多肽、HVEM多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、半乳糖凝集素-9多肽、CD83多肽、CD30L多肽、HLA-G多肽、MICA多肽、MICB多肽、HVEM(CD270)多肽、淋巴毒素β受體多肽、3/TR6多肽、ILT3多肽、ILT4多肽、CXCL10多肽、CXCL9多肽、CXCL11多肽、CXCL13多肽、及CX3CL1多肽、及其組合。
態樣65.如態樣55-63中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽為IL-2多肽。
態樣66.如態樣55-65中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含至少兩種免疫調節多肽，且其中該等免疫調節多肽中之至少兩者為相同的。
態樣67.如態樣66之T細胞調節多聚體多肽，其中該兩種或更多種免疫調節多肽係串聯在一起。
態樣68.如態樣55-67中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)第一二硫鍵係在以下各物之間：i)存在於該WT-1肽抗原決定基與該第一I類MHC多肽之間的連接子中之Cys，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由Y84C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；且b)第二二硫鍵係在以下各物之間：i)經由R12C取代引入該β2M多肽中之Cys殘基；與ii)經由A236C取代引入該I類MHC重鏈多肽中之Cys殘基。
態樣69.如態樣68之T細胞調節多聚體多肽，其中該連接子包含胺基酸序列GCGGS(SEQ ID NO：318)。
態樣70.如態樣69之T細胞調節多聚體多肽，其中該連接子包含胺
基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO：342)，其中n為1至10之整數。
態樣71.如態樣55-70中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基具有之長度為約4個胺基酸至約15個胺基酸。
態樣72.如態樣55-71中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO：223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO：225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO：227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO：229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO：230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：232)、MNLGATLK(SEQ ID NO：233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO：234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO：239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO：240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO：241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO：242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO：243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO：244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO：245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO：246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO：247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO：248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO：249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO：250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO：252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO：253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO：254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO：255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO：257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、VLDFAPPGA(SEQ ID
NO：259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)、CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)及NQMNLGATL(SEQ ID NO：267)。
態樣73.如態樣55-71中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽包含胺基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)或RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)。
態樣74.如態樣55-73中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一I類MHC多肽或該第二I類MHC多肽包含：a)與圖9A中描繪之HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；b)與圖10A中描繪之HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或c)與圖11A中描繪之HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣75.如態樣55-74中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*2402多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣76.如態樣55-74中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽為HLA-A*1101多肽。
態樣77.如態樣55-74中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*3303多肽具
有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣78.如態樣55-74中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*0201多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣79.如態樣55-78中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽為包含以下之變異體IL-2多肽：i)H16A取代及F42A取代；或ii)H16T取代及F42A取代。
態樣80.如態樣55-79中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含第一異二聚體及第二異二聚體。
態樣81.一種核酸，其包含編碼根據態樣55-80中任一項之第一多肽或第二多肽的核苷酸序列，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個免疫調節結構域。
態樣82.一種表現載體，其包含如態樣81之核酸。
態樣83.一種選擇性調節對於韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)抗原決定基具有特異性之T細胞之活性的方法，該方法包括使該T細胞與根據態樣55-80中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該接觸選擇性調節該WT-1抗原決定基特異性T細胞之活性。
態樣84.一種治療患有癌症之患者的方法，該方法包括向該患者投與有效量的包含根據態樣55-80中任一項之T細胞調節多聚體多肽之醫藥組成物。
態樣85.如態樣84之方法，其中該癌症表現WT-1蛋白。
態樣86.如態樣84或態樣85之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、韋爾姆斯氏瘤、間皮瘤、軟組織肉瘤、神經胚細胞瘤或腎胚細胞瘤。
態樣87.如態樣84-86中任一項之方法，其中該投與係肌肉內投與。
態樣88.如態樣84-86中任一項之方法，其中該投與係靜脈內投與。
態樣89.如態樣84-88中任一項之方法，其進一步包括向該個體投與一或多種檢查點抑制劑。
態樣90.如態樣89之方法，其中該檢查點抑制劑為結合至選自由以下組成之群之多肽的抗體：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3K δ、PI3K γ、TAM、精胺酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
態樣91.如態樣90之方法，其中該檢查點抑制劑為對PD-1、PD-L1或CTLA4有特異性之抗體。
態樣92.如態樣89之方法，其中該一或多種檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：納武單抗、派姆單抗、披地單抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿維魯單抗、伊匹珠單抗、曲利木單抗、披地單抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利魯單抗、烏瑞魯單抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠單抗、瓦利魯單抗、阿維單抗、加利昔單抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035、及其組合。
態樣93.一種調節個體之免疫反應的方法，該方法包括向該個體投與有效量的如態樣55-80中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該投與誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應，其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1。
態樣94.一種選擇性遞送免疫調節多肽至靶標T細胞之方法，該方法包括使混合T細胞群與如態樣55-80中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該混合T細胞群包含該靶標T細胞及非靶標T細胞，其中該靶標T細胞對
存在於該T細胞調節多聚體多肽內之該WT-1抗原決定基具有特異性，且其中該接觸遞送存在於該T細胞調節多聚體多肽內之該一或多種免疫調節多肽至該靶標T細胞。
態樣95.一種偵測自個體獲得之混合T細胞群中結合韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)抗原決定基之靶標T細胞之存在的方法，該方法包括：a)使該混合T細胞群與如態樣55-80中任一項之T細胞調節多聚體多肽在活體外接觸，其中該T細胞調節多聚體多肽包含該WT-1抗原決定基；及b)偵測T細胞響應於該接觸之活化及/或增殖，其中經活化及/或增殖之T細胞指示該靶標T細胞之存在。
態樣組B
上文所述之本發明主題之態樣(包括實施例)單獨或在與一或多個其他態樣或實施例組合時可為有益的。不限於以上描述，下文提供本發明之編號1-36的某些非限制性態樣。如熟習此項技術者在閱讀本發明之後將顯而易知，可使用個別編號之態樣中之各者或將其與前述或以下個別編號之態樣中之任一者組合。此旨在提供全部此等態樣組合之支持且不限於下文明確提供之態樣之組合：
態樣1.一種T細胞調節多聚體多肽，其包含：至少一種異二聚體，該異二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)肽抗原決定基，其中該WT-1肽之長度為至少4個胺基酸；及ii)第一I類主要組織相容性複合物(MHC)多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二I類MHC多肽，及c)至少一種活化免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該免疫調節多肽，且其中該WT-1肽抗原決定基包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO：223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO：225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：
226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO：227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO：229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO：230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：232)、MNLGATLK(SEQ ID NO：233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO：234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO：239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO：240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO：241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO：242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO：243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO：244)、RLRPHPGAL(SEQ ID NO：245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO：246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO：247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO：248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO：249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO：250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO：252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO：253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO：254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO：255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO：257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)、CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)及NQMNLGATL(SEQ ID NO：267)，視情況其中該第一多肽或該第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
態樣2.如態樣1之T細胞調節多聚體多肽，其中該一或多個免疫調節結構域中之至少一者為變異體免疫調節多肽，其呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對該同源共免疫調節多肽之親和力相比
有所減小，且其中該抗原決定基以至少10-7M之親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)，使得：
i)該T細胞調節多聚體多肽結合至第一T細胞之親和力比該T細胞調節多聚體多肽結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中該第一T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽及以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR，且其中該第二T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽但在其表面上不表現以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR；且/或
ii)當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽對同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽之變異體的該T細胞調節多聚體多肽對該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率範圍為1.5：1至106：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
態樣3.如態樣2之T細胞調節多聚體多肽，其中：
a)該T細胞調節多聚體多肽結合至該第一T細胞之親和力比其結合該第二T細胞之親和力高至少50%、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或
b)該變異體免疫調節多肽結合該共免疫調節多肽之親和力為約10-4M至約10-7M、約10-4M至約10-6M、約10-4M至約10-5M；且/或
c)其中當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽對同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽之變異體的該T細胞調節多聚體多肽對該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率為至少10：1、至少50：1、至少102：1或至少103：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
態樣4.如態樣1-3中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中
a1)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；
ii)該第一MHC多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽；且
b1)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該第二MHC多肽；及
ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或
a2)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一MHC多肽；且
b2)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)至少一種免疫調節多肽；
ii)該第二MHC多肽；及
iii)Ig Fc多肽；或
a3)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一MHC多肽；且
b3)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該第二MHC多肽；及
ii)Ig Fc多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽；或
a4)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一MHC多肽；且
b4)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該第二MHC多肽；及
ii)至少一種免疫調節多肽；或
a5)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該第一MHC多肽；且
b5)第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)至少一種免疫調節多肽；及
ii)該第二MHC多肽；或
a6)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；
ii)該第一MHC多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽；且
b6)該第二多肽包含：
i)該第二MHC多肽。
態樣5.如態樣1-4中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中：
a)該第一MHC多肽為β2-微球蛋白多肽；且該第二MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；或
b)該第一MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；且該第二MHC多肽為β2-微球蛋白多肽。
態樣6.如態樣5之T細胞調節多聚體多肽，其中：
a)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該β2-微球蛋白多肽；且
b)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)至少一種免疫調節多肽；
ii)該I類MHC重鏈多肽；及
iii)Ig Fc多肽。
態樣7.如態樣5之T細胞調節多聚體多肽，其中：
a)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該WT-1肽抗原決定基；及
ii)該β2-微球蛋白多肽；且
b)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：
i)該I類MHC重鏈多肽；及
ii)Ig Fc多肽；及
iii)至少一種免疫調節多肽。
態樣8.如態樣1-7中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽係選自由以下組成之群：細胞介素、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、CD40多肽、CD70多肽及其組合。
態樣9.如態樣1-8中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽為IL-2多肽。
態樣10.如態樣1-9中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含至少兩種免疫調節多肽，且其中該等免疫調節多肽中之至少兩者為相同的，視情況其中該兩種或更多種免疫調節多肽係串聯在一起。
態樣11.如態樣1-10中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該免疫調節多肽為變異體IL-2多肽，其呈現出對IL-2受體之親和力與野生型IL-2多肽對該IL-2受體之親和力相比有所減小。
態樣12.如態樣11之T細胞調節多聚體多肽，其中該變異體IL-2多肽包含：i)H16A取代及F42A取代；或ii)H16T取代及F42A取代。
態樣13.如態樣1-12中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第
一多肽與該第二多肽彼此共價連接，視情況其中該共價鍵聯係經由二硫鍵。
態樣14.如態樣1-13中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽或介於該抗原決定基與該第一MHC多肽之間的連接子包含提供第一Cys殘基之胺基酸取代，其中該第二MHC多肽包含提供第二Cys殘基之胺基酸取代，且其中該二硫鍵聯係在該第一Cys殘基與該第二Cys殘基之間。
態樣15.如態樣1-14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多肽包含在以下各物之間的二硫鍵：i)存在於該WT-1肽抗原決定基與該第一I類MHC多肽之間的連接子中之Cys，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由Y84C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。
態樣16.如態樣1-14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多肽包含在以下各物之間的二硫鍵：i)經由R12C取代引入該第一I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由A236C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。
態樣17.如態樣1-14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多肽包含在以下各物之間的第一二硫鍵：i)存在於該WT-1肽抗原決定基與該第一I類MHC多肽之間的連接子中之Cys，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由Y84C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；及在以下各物之間的第二二硫鍵：i)經由R12C取代引入該β2M多肽中之Cys殘基；與ii)經由A236C取代引入該I類MHC重鏈多肽中之Cys殘基。
態樣18.如態樣15或態樣17之T細胞調節多聚體多肽，其中介於該WT-1肽抗原決定基與該第一MHC之間的該連接子為GCGGS(G4S)n(SEQ ID
NO：315)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9。
態樣19.如態樣1-18中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基之長度為約4個胺基酸至約25個胺基酸。
態樣20.如態樣1-19中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽包含胺基酸序列CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)及NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)。
態樣21.如態樣1-20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽或該第二MHC多肽包含：
a)與圖9A中描繪之HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或
b)與圖10A中描繪之HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或
c)與圖11A中描繪之HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
態樣22.如態樣1-21中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*2402多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且其中該抗原決定基係選自由以下組成之群：RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)及NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)。
態樣23.如態樣1-21中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*0201多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且其中該抗原決定基係選自由以下組成之群：VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)及YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)。
態樣24.如態樣1-23中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含第一異二聚體及第二異二聚體，且其中該第一異二聚體與該第二異二聚體藉由介於該第一異二聚體與該第二異二聚體之Ig Fc多肽之間的一或多個二硫鍵來共價結合。
態樣25.一種核酸，其包含編碼如態樣1-24中任一項之第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
態樣26.一種表現載體，其包含如態樣25之核酸。
態樣27.一種選擇性調節對於韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)抗原決定基具有特異性之T細胞之活性的方法，該方法包括使該T細胞與根據態樣1-24中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該接觸選擇性調節該WT-1抗原決定基特異性T細胞之活性。
態樣28.一種治療患有癌症之患者的方法，該方法包括向該患者投與有效量的包含根據態樣1-24中任一項之T細胞調節多聚體多肽之醫藥組成物。
態樣29.如態樣28之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、韋爾姆斯氏瘤、間皮瘤、軟組織肉瘤、神經胚細胞瘤或腎胚細胞瘤。
態樣30.如態樣28或態樣29之方法，其進一步包括向該個體投與一或多種檢查點抑制劑。
態樣31.如態樣30之方法，其中該檢查點抑制劑為結合至選自由以
下組成之群之多肽的抗體：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3K δ、PI3K γ、TAM、精胺酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
態樣32.如態樣31之方法，其中該檢查點抑制劑為對PD-1、PD-L1或CTLA4有特異性之抗體。
態樣33.如態樣30之方法，其中該一或多種檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：納武單抗、派姆單抗、披地單抗、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿維魯單抗、伊匹珠單抗、曲利木單抗、披地單抗、IMP321、MGA271、BMS-986016、利魯單抗、烏瑞魯單抗、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠單抗、瓦利魯單抗、阿維單抗、加利昔單抗、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德、NLG-919、INCB024360、KN035、及其組合。
態樣34.一種調節個體之免疫反應的方法，該方法包括向該個體投與有效量的如態樣1-24中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該投與誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應，且其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1。
態樣35.一種選擇性遞送免疫調節多肽至靶標T細胞之方法，該方法包括使混合T細胞群與如態樣1-24中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該混合T細胞群包含該靶標T細胞及非靶標T細胞，其中該靶標T細胞對存在於該T細胞調節多聚體多肽內之該WT-1抗原決定基有特異性，且其中該接觸遞送存在於該T細胞調節多聚體多肽內之該一或多種免疫調節多肽至該靶標T細胞。
態樣36.一種偵測自個體獲得之混合T細胞群中結合WT-1抗原決定
基之靶標T細胞之存在的方法，該方法包括：a)使該混合T細胞群與如態樣1-24中任一項之T細胞調節多聚體多肽在活體外接觸，其中該T細胞調節多聚體多肽包含該WT-1抗原決定基；及b)偵測T細胞響應於該接觸之活化及/或增殖，其中經活化及/或增殖之T細胞指示該靶標T細胞之存在。
實例
提出以下實例以便向一般技藝人士提供如何製備及使用本發明之完全揭露及描述，且以下實例不欲限制發明者視為其發明之事物的範疇，亦不欲表示以下實驗為進行之所有或僅有實驗。已努力確保關於所用數值(例如，量、溫度等)之準確性，但應慮及一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則份為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏度表示，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如，bp，鹼基對；kb，千鹼基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內；i.p.，腹膜內；s.c.，皮下；及其類似縮寫。
實例1
測試經由兩個二硫鍵連接TMMP異二聚體之兩個多肽鏈對穩定性及產生之影響。
生成以下TMMP：a)包含1715+2380多肽之TMMP；及b)包含1715多肽及2381多肽之TMMP。多肽鏈之胺基酸序列提供於圖14A-14C中。如圖15及圖16所示，TMMP包括：i)A02：01對偶基因之I類HLA-A重鏈多肽；及ii)IL2(H16A；F42A)免疫調節(「MOD」)多肽之兩個拷貝。2380多肽包含WT1肽WT1(37-45)，而2381多肽包含WT1肽WT1(126-134)。1715-2380 TMMP為包含1715多肽及2380多肽之異二聚體的同二聚體。同樣，1715-2381 TMMP為包含1715多肽及2381多肽之異二聚體的同二聚體。因此，TMMP包括：i)1715+2380異二聚體之2個拷貝，由存在於1715多肽中之IgFc多肽之間的2個二硫
鍵連接；或ii)1715+2381異二聚體之2個拷貝，由存在於1715多肽中之IgFc多肽之間的2個二硫鍵連接。此排列示意性描繪於圖17C中。
TMMP 1715+2380為經雙二硫鍵連接之異二聚體：a)第一二硫鍵聯係在以下各物之間：i)存在於WT1肽與2380多肽之β2M鏈之間的連接子中之Cys；與ii)藉由Y84C取代引入存在於1715多肽中之I類重鏈中的Cys；且b)第二二硫鍵聯係在以下各物之間：i)藉由R12C取代引入存在於2380多肽中之β2M多肽中的Cys；與ii)藉由A236C取代引入存在於1715多肽中之I類重鏈中的Cys。
TMMP 1715+2381為經二硫鍵連接之異二聚體：a)第一二硫鍵聯係在以下各物之間：i)存在於WT1肽與2381多肽之β2M鏈之間的連接子中之Cys；與ii)藉由Y84C取代引入存在於1715多肽中之I類重鏈中的Cys；且b)第二二硫鍵聯係在以下各物之間：i)藉由R12C取代引入存在於2381多肽中之β2M多肽中的Cys；與ii)藉由A236C取代引入存在於1715多肽中之I類重鏈中的Cys。
在ExpiCHO細胞(其係改自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；ThermoFisher；參見例如Jain等人(2017)Protein Expr.Purif.134：38)中產生TMMP且將其自該等細胞生長之細胞培養基中純化。進行兩個純化步驟。在第一步驟中，使細胞培養基變澄清，且使澄清之細胞培養基經歷蛋白A管柱純化。在第二純化步驟中，使來自蛋白A管柱之溶離物經歷尺寸排阻層析。
對經純化之TMMP之穩定性進行測試。在將經純化之TMMP保存於液體溶液(含有365mM NaCl之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，pH 7.4)中在37℃下達28日或在42℃下達28日之後，判定所存在的異二聚體TMMP之量。
另外，使經純化之TMMP經歷3次冷凍/解凍循環。
結果描繪於圖15及圖16中。
如圖15所示，1715-2380異二聚體(在圖15中亦稱為「單體」)之同
二聚體佔來自蛋白A管柱之溶離物的80%。如圖16所示，1715-2381異二聚體(在圖16中亦稱為「單體」)之同二聚體佔來自蛋白A管柱之溶離物的79%。
發現異二聚體1715-2380及1715-2381之同二聚體對於3次冷凍/解凍循環係穩定的。
各種TMMP之肽/HLA、IL-2及Fc結構域的解折疊溫度錶示為Tm(℃)，其提供於圖15及圖16中。另外，發生聚集之溫度(Tm℃)提供於圖15及圖16中。
實例2：包含WT1抗原決定基、HLA-A*02重鏈、異二聚體之2個多肽鏈之間的一個或兩個二硫鍵、及位置1處之變異體IL-2免疫調節多肽的TMMP之生物化學表徵
此項研究中所用之構築體匯總於表2中。
該等構築體之多肽鏈之胺基酸序列提供於圖14A-14I中。
「G2C」指示TMMP包括以下各物之間的二硫鍵：i)在肽抗原決定基與β2M多肽之間的肽連接子中之Cys；與ii)在I類MHC重鏈之位置84處的Cys，其中I類MHC重鏈具有Y84C取代。
「R12C」指示TMMP包括以下各物之間的二硫鍵：i)在β2M多肽之位置12處之Cys，其中β2M多肽具有R12C取代；與ii)在I類MHC重鏈之位置236處的Cys，其中I類MHC重鏈具有A236C取代。
「G2C+R12C」指示TMMP包括「G2C」二硫鍵及「R12C」二硫
鍵。
WT-1(37-45)為VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)。
WT-1(126-134)為RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)。
WT-1(126-134(R126Y))為YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)且亦稱為「126-134模擬抗原決定基」。
IL-2「位置1」示意性描繪於圖19中。
結果
測試TMMP模擬CD8+ T細胞之抗原特異性增殖的能力。TMMP包括以下各物作為抗原決定基：i)WT1 37-45；ii)WT1 126-134；或iii)WT1 126-134(R126Y)。全部TMMP包括A02對偶基因I類MHC重鏈。
將自人類供體獲得之外周血單核細胞(PBMC)在活體外與不同濃度(0nM、10nM、100nM、300nM或1000nM)之TMMP一起溫育10日。在10日溫育期之後，判定對抗原決定基有特異性之細胞的數目。來自兩個供體(「Leukopak 7及Leukopak 12」)之PBMC的資料展示於圖21中。
圖21中呈現之資料表明在兩個供體中，WT1特異性TMMP可在10日刺激培養期間誘導來自總PBMC之WT1特異性CD8+ T細胞的擴增。此擴增在具有低或不可偵測之WT1特異性T細胞前軀體之PBMC中達成，表明TMMP能夠在來自未促發或純真庫之供體中誘導抗原特異性反應。資料表明對3個經選擇之WT1肽(37-45、126-134及126-134 R126Y)中之任一者有特異性且在兩個經測試之二硫鍵構架(G2C及R12C/G2C)之任一者上的TMMP誘導來自總PBMC之WT1特異性CD8+ T細胞的擴增。
在活體外在重組人類IL-2存在下以所指示之WT1肽刺激來自不同人類供體(L7、L10及L12)之PBMC達10日且接著以含有相同肽且含有G2C二硫鍵或R12C及G2C二硫鍵兩者之TMMP再刺激8日。資料描繪於圖22中。
圖22中呈現之資料表明在來自三個供體之PBMC中，含有WT1之TMMP可在10日促發培養之後的8日再刺激培養期間自總PBMC擴增WT1特異性CD8+ T細胞。此擴增自具有可偵測數目之WT1特異性T細胞前軀體之細胞發生，表明TMMP能夠在具有經促發/預先存在的WT-1特異性T細胞庫之供體中擴增抗原特異性T細胞。資料表明對3種WT1肽(37-45、126-134及126-134 R126Y)中之任一者有特異性且在兩個經測試之二硫鍵構架(G2C及R12C/G2C)之任一者上的TMMP誘導此類擴增。
測試藉由與含有WT1 37-45肽且含有G2C二硫鍵或R12C及G2C二硫鍵兩者之TMMP接觸來進行擴增之CD8+ T細胞響應於呈遞WT1-37-45肽或不相關肽(SL9)之靶細胞(T2細胞)而產生TNF-α及IFN-γ之能力。使用佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(PMA)及離子黴素(ionomycin)(「iono」)作為陽性對照。使用以培養基處理之CD8+ T細胞作為陰性對照。將藉由TMMP擴增之CD8+ T細胞與以WT1肽或不相關肽(來自HIV之SL9肽)裝載之『靶細胞』(T2細胞)一起溫育。將CD8+ T細胞對以WT 37-45肽脈衝處理之T2細胞的反應(如藉由IFN-γ及TNF-α之產生所指示)與對以SL9肽脈衝處理之T2細胞的反應相比較。資料展示於圖23中。
圖23中呈現之資料證明以含有具有G2C或R12C/G2C構架之TMMP的WT1 37-45擴增之WT1 37-45-特異性CD8+ T細胞的選擇性多官能性。僅在識別呈遞WT1 37-45肽而非SL9肽之靶細胞時觀測到所量測之反應(TNF-α及IFN-γ產生)。陽性及陰性對照孔顯示在不存在刺激時(如在僅有培養基之孔中所見)CD8+ T細胞不存在基線活性且抗原特異性細胞及非抗原特異性細胞能夠在強抗原非特異性刺激(PMA+離子黴素)後顯示功能性反應。
使用相同檢定，測試藉由含有WT1 126-134肽(「WT1 126」)且含有R12C及G2C二硫鍵之TMMP擴增之CD8 T細胞響應於呈遞WT1-126-134肽、
WT1-126-134 R126Y肽或不相關肽(SL9)之靶細胞(T2細胞)而產生TNF-α及IFN-γ之能力。資料展示於圖24中。
圖24中呈現之資料證明以R12C/G2C構架上之WT1 126-134特異性Immuno-STAT擴增之WT1 126-134特異性CD8+ T細胞的選擇性多官能性。僅在識別呈遞WT1 126-134肽或WT1 126-134 R126Y肽而非SL9肽之靶細胞時觀測到所量測的反應(TNF-α及IFN-γ產生)。陽性及陰性對照孔顯示在不存在刺激時(如在僅有培養基之孔中所見)CD8+ T細胞不存在基線活性且抗原特異性細胞及非抗原特異性細胞能夠在強抗原非特異性刺激(PMA+離子黴素)後顯示功能性反應。
測試二硫鍵對經IL-2驅動之免疫細胞活化的作用。CD69為大部分淋巴細胞及一些其他免疫細胞上之早期活化標記物。在不同類型之刺激條件(包括IL-2刺激)下，細胞上調CD69。評定在NK細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞上之CD69上調。CD69上調表明存在於TMMP中之IL-2多肽為有活性的且其功能與對照(重組人類IL-2)相比有所減弱。將來自不同人類供體之PBMC與表中列出之各種TMMP(「IST」)一起溫育。包括包含CMV抗原決定基或MART-1抗原決定基之TMMP作為對照。展示來自一人類供體(Leukopak 6)之資料。資料展示於圖25中。圖25展示作為容易響應於IL-2而上調CD69的細胞之相關及代表性實例的NK細胞上之CD69上調。在CD8+ T細胞閘(cell gate)及CD4+ T細胞閘上觀測到類似資料。
圖25中呈現之資料表明在位置1上經工程化至在各種二硫鍵構架(R12C、G2C及R12C/G2C)上建立之HLA-A02特異性Immuno-STAT中的IL-2免疫調節多肽為功能性的(如藉由在相關免疫細胞表面上誘導CD69所觀測到的)且與野生型重組人類IL-2相比有所減弱。
為了評價存在於TMMP中之變異體IL-2免疫調節多肽之效力，進行
CTLL-2增殖檢定。CTLL-2細胞依賴於IL-2進行生長；因此，CTLL-2增殖為存在於培養基中之IL-2之量及/或功效的量度(例如，其中IL-2由與TMMP接觸之T細胞產生)。Gillis等人(1978)J.Immunol.120：2027。
資料展示於圖26中。圖26中呈現之資料表明在位置1上經工程化至在各種二硫鍵構架(R12C、G2C及R12C/G2C)上建立之HLA-A02特異性Immuno-STAT(TMMP)中的IL-2免疫調節多肽為功能性的(如藉由CTLL-2增殖之誘導所觀測到的)且與普留淨相比有所減弱。
測試該等實驗中所用之TMMP結合至FcRn之能力。TMMP包括可結合至FcRn之Ig Fc區。結合至FcRn為活體內半衰期延長之指示。Souders等人(2015)MAbs 7：912。「1715+2380」TMPP之資料展示於圖27中。
測試「1715+2380」TMPP結合至其他Fc受體之能力。「1715+2380」TMPP包括具有LALA取代之Ig Fc區，其減少Ig Fc與FcRI、RIIA、IIB、IIIA-F及IIIB之結合，從而減弱經Ig Fc介導之效應物功能。資料展示於圖27中。
材料及方法
圖21
使用分離術儀器獲得來自兩個健康供體之Leukopak。將Leukopak以等體積之室溫磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋。藉由如下密度梯度離心自經稀釋之leukopak分離PBMC。在50mL錐形管中以13mL Ficoll-Paque使30mL經稀釋之leukopak處於下層，且在400g下在室溫下在無制動器之擺動桶式轉子中離心30分鐘。自血漿-Ficoll界面收集單核細胞層(淋巴細胞、單核細胞及血小板)，將其轉移至新的50mL錐形管中且藉由在室溫下在300g下離心10分鐘來以3倍過量PBS洗滌。在小心移除上清液後，使細胞再懸浮且藉由在室溫下在200g下離心10分鐘來以50mL PBS洗滌以移除血小板。在洗滌及血小板移除後，將所獲得之PBMC自50mL管中彙集，在PBS中再懸浮，計數，藉由在300g下
離心10分鐘來沉澱，且使其以50x106個細胞/ml之最終濃度再懸浮於細胞冷凍培養基中。
由如上文所述之兩個leukopak製備人類健康供體PBMC。在實驗當日，在37℃水浴中使細胞解凍且在溫熱的ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(Stemcell Technologies)中藉由在350 x g下離心6分鐘來洗滌。移除上清液，且使細胞再懸浮於ImmunoCultTM培養基中。使用Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)來評定活細胞計數。調整培養基體積以使細胞濃度為5x106個細胞/ml且在6孔板中每孔接種2mL細胞(等同於10x106個細胞)。在4ml培養基之總體積中，將PBMC以指定量之Immuno-STAT或僅以培養基刺激。將細胞在37℃、5% CO2下刺激10日，其中在第5日及第7日藉由自孔中抽吸2mL培養上清液且再添加2mL新鮮培養基來更換培養基。
在培養後，收穫細胞且藉由在350 x g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數，且藉由用以下各物染色來處理細胞以用於流動式細胞測量術：生存力染劑、適當的WT1肽特異性HLA-A*0201四聚體(MBL International)及針對CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)之抗體。洗滌經染色之細胞且藉由流動式細胞測量術進行分析。
使用Attune NxT流動式細胞測量儀(Invitrogen)進行資料採集。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
基於藉由流動式細胞測量術分析之抗原特異性T細胞之頻率、體積及事件及在培養結束時收穫之細胞的總體積及數目，計算每孔抗原特異性T細胞之數目且繪製為所示曲線圖。
圖22
將來自兩個供體之PBMC用10μg/ml指定肽及50U/ml重組人類IL-2
擴增10日。在6孔板中在每孔4ml Immunocult培養基中以總計1千萬個細胞進行擴增。將細胞在37℃、5% CO2下刺激10日，其中在第5日及第7日藉由自孔中抽吸2mL培養上清液且再添加具有50U/ml重組人類IL-2之2mL新鮮培養基來更換培養基。在培養後，收穫細胞且藉由在350g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數。在六孔板之至少3個孔中進行每種刺激條件。使用來自一個孔之PBMC來在用以下各物染色後藉由流動式細胞測量術評估培養物中WT1特異性CD8+ T細胞之頻率/量：生存力染劑、適當的WT1肽特異性HLA-A*0201四聚體(MBL International)及針對CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)之抗體。洗滌經染色之細胞且藉由流動式細胞測量術進行分析。使用至少兩個孔，使用來自Stem Cell Technologies之CD8+ T細胞陰性選擇套組富集CD8+ T細胞。在先前用絲裂黴素C以1：2比率處理之自體PBMC存在下，將經純化之CD8+ T細胞用指定TMMP再刺激8日，其中在每孔4ml體積之Immunocult培養基中具有最終5百萬-1千萬個細胞。以先前確定對於供體與特定TMMP之組合而言最佳的濃度使用TMMP。
在培養時，收穫細胞且藉由在350g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數，且藉由用以下各物染色來處理以用於流動式細胞測量術：生存力染劑、適當的WT1肽特異性HLA-A*0201四聚體(MBL International)及針對CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)之抗體。洗滌經染色之細胞且藉由流動式細胞測量術進行分析。
使用Attune NxT流動式細胞測量儀(Invitrogen)進行資料採集。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
基於藉由流動式細胞測量術分析之抗原特異性T細胞之頻率、體積
及事件及在培養結束時收穫之細胞的總體積及數目，計算每孔抗原特異性T細胞之數目且繪製為所示曲線圖。
圖23
將來自兩個供體之PBMC用10μg/ml WT1 37-45肽及50U/ml重組人類IL-2擴增10日。在6孔板中在每孔4ml Immunocult培養基中以總計1千萬個細胞進行擴增。將細胞在37℃、5% CO2下刺激10日，其中在第5日及第7日藉由自孔中抽吸2mL培養上清液且再添加具有50U/ml重組人類IL-2之2mL新鮮培養基來更換培養基。在培養後，收穫細胞且藉由在350g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數。在六孔板之至少3個孔中進行該刺激。使用來自一個孔之PBMC來在用以下各物染色後藉由流動式細胞測量術評估培養物中WT1 37-45肽特異性CD8+ T細胞之頻率/量：生存力染劑、適當的WT1 37-45肽特異性HLA-A*0201四聚體(MBL International)及針對CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)之抗體。洗滌經染色之細胞且藉由流動式細胞測量術進行分析。使用Attune NxT流動式細胞測量儀(Invitrogen)進行資料採集。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
使用至少兩個孔，使用來自Stem Cell Technologies之CD8+ T細胞陰性選擇套組富集CD8+ T細胞。在先前用絲裂黴素C以1：2比率處理之自體PBMC存在下，將經純化之CD8+ T細胞用G2C或R12C/G2C構架上之指定WT1 37-45特異性Immuno-STAT再刺激8日，其中在每孔4ml體積之Immunocult培養基中具有最終5百萬-1千萬個細胞。以先前確定對於該供體而言最佳之濃度使用G2C或R12C/G2C構架上之WT1 37-45特異性Immuno-STAT。
在培養後，收穫細胞且藉由在350g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數，且使用來自Stem
Cell Technologies之CD8+ T細胞陰性選擇套組富集CD8+ T細胞。
將靶細胞T2細胞(ATCC)在37℃、5% CO2下用5μg/mL WT1 37-45肽或人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Gag77-85 SL9肽脈衝處理2小時。在肽裝載後，將T2細胞洗滌兩次且將其再懸浮於ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(Stemcell Technologies)中。
將經富集之CD8+ T細胞及經肽裝載之T2細胞以1：1比率(各自1x106個細胞)混合於96孔板中，每孔200μL之總體積。將培養基及佛波醇12-肉豆蔻酸鹽13-乙酸鹽(PMA)/離子黴素分別作為陰性對照及陽性對照添加至對照孔中。在刺激後0.5至1小時，將針對CD107a之染色抗體直接添加至孔中。將細胞刺激5小時，用PBS洗滌且在冰上使用FVS780針對生存力進行染色10分鐘。將細胞洗滌，在室溫下用WT1 37-45肽特異性四聚體(以APC及PE標記)染色15分鐘。隨後，將細胞洗滌，且在冰上用針對CD3及CD8之抗體染色30分鐘。將經染色之細胞洗滌兩次且在4℃下再懸浮於細胞內(IC)固定緩衝液中隔夜。次日，將細胞洗滌且再懸浮於滲透緩衝液中且在室溫下溫育5分鐘。將經滲透之細胞洗滌且用針對干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之抗體染色，在室溫下再懸浮於滲透緩衝液中達30分鐘。將經染色之細胞洗滌，再懸浮於2mL FACS緩衝液中，且將其轉移至96孔深板中。使用Attune NxT流動式細胞測量儀(Thermofisher Scientific,MA)進行資料採集。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
圖24
將來自兩個供體之PBMC用10μg/ml WT1 126-134肽及50U/ml重組人類IL-2擴增10日。在6孔板中在每孔4ml Immunocult培養基中以總計1千萬個細胞進行擴增。將細胞在37℃、5% CO2下刺激10日，其中在第5日及第7日藉由自孔中抽吸2mL培養上清液且再添加具有50U/ml重組人類IL-2之2mL
新鮮培養基來更換培養基。在培養後，收穫細胞且藉由在350g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數。在六孔板之至少3個孔中進行該刺激。使用來自一個孔之PBMC來在用以下各物染色後藉由流動式細胞測量術評估培養物中WT1 126-134肽特異性CD8+ T細胞之頻率/量：生存力染劑、適當的WT1 126-134肽特異性HLA-A*0201四聚體(MBL International)及針對CD69、CD3、CD14、CD19、CD127、CD56、CD4(Biolegend)、CD8、CD25(BD Biosciences)之抗體。洗滌經染色之細胞且藉由流動式細胞測量術進行分析。使用Attune NxT流動式細胞測量儀(Invitrogen)進行資料採集。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
使用至少兩個孔，使用來自Stem Cell Technologies之CD8+ T細胞陰性選擇套組富集CD8+ T細胞。在先前用絲裂黴素C以1：2比率處理之自體PBMC存在下，將經純化之CD8+ T細胞用R12C/G2C構架上之WT1 126-134特異性Immuno-STAT再刺激8日，其中在每孔4ml體積之Immunocult培養基中有最終5百萬-1千萬個細胞。以先前確定對於該供體而言最佳之濃度使用R12C/G2C構架上之WT1 126-134特異性Immuno-STAT。
在培養後，收穫細胞且藉由在350g下離心5分鐘來沉澱，藉由Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)判定活細胞計數，且使用來自Stem Cell Technologies之CD8+ T細胞陰性選擇套組富集CD8+ T細胞。
將靶細胞T2細胞(ATCC)在37℃、5% CO2下用5μg/mL WT1 126-134肽、WT1 126-134 R126Y肽或人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Gag77-85 SL9肽脈衝處理2小時。在肽裝載後，將T2細胞洗滌兩次且再懸浮於ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(Stemcell Technologies)中。
將經富集之CD8+ T細胞及經肽裝載之T2細胞以1：1比率(各自1x106個細胞)混合於96孔板中，每孔200μL之總體積。將培養基及佛波醇12-肉豆蔻
酸鹽13-乙酸鹽(PMA)/離子黴素分別作為陰性對照及陽性對照添加至對照孔中。在刺激後0.5至1小時，將針對CD107a之染色抗體直接添加至孔中。將細胞刺激5小時，用PBS洗滌且在冰上使用FVS780針對生存力進行染色10分鐘。將細胞洗滌，在室溫下用WT1 126-134肽特異性四聚體(以APC及PE標記)染色15分鐘。隨後，將細胞洗滌，且在冰上用針對CD3及CD8之抗體染色30分鐘。將經染色之細胞洗滌兩次且在4℃下再懸浮於細胞內(IC)固定緩衝液中隔夜。次日，將細胞洗滌且再懸浮於滲透緩衝液中且在室溫下溫育5分鐘。將經滲透之細胞洗滌且用針對干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之抗體染色，在室溫下再懸浮於滲透緩衝液中達30分鐘。將經染色之細胞洗滌，再懸浮於2mL FACS緩衝液中，且將其轉移至96孔深板中。使用Attune NxT流動式細胞測量儀(Thermofisher Scientific,MA)進行資料採集。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
圖25
由自Hemacare(Northridge,CA)獲得之leukopak製備人類健康供體PBMC且在-150℃下保持低溫保存，直至實驗當日。
在實驗當日在水浴中解凍細胞1分鐘，將其用10mL溫熱的ImmunoCultTM-XF Cell Expansion Media(Stemcell Technologies,Vancouver,Canada)洗滌，藉由離心(350g，5分鐘)沉澱，且使其再懸浮於10mL培養基中。使用Countess自動化細胞計數器(Invitrogen,CA)計數細胞，調整培養基體積以使細胞濃度達3.8x106個細胞/mL且將237.5uL細胞懸浮液添加至圓底96孔板中。
於Immunocult培養基中製備指定Immuno-STAT及rh-IL-2之20X稀釋液系列。為了刺激PBMC，將12.5μL 20X稀釋液系列添加至含有細胞之孔中且混合以獲得最終檢定藥物濃度。將PBMC在37℃、5% CO2下溫育20至24小時。
在刺激後，藉由在350g下離心5分鐘來使細胞沉澱。收集上清液，將其冷凍並保存在-20℃下，直至進一步分析。將經沉澱之PBMC用PBS洗滌兩次且在4℃下在50μL可固定之活細胞/死細胞FVS780染劑中染色10分鐘。用200μL染色緩衝液淬滅染色且藉由離心(350 x g，5分鐘)來使細胞沉澱。將細胞在4℃下用50μL體積中針對CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD56及CD69之抗體染色30分鐘。在染色後，將細胞用染色緩衝液洗滌，藉由離心(350 x g，5分鐘)沉澱，使其再懸浮於130μL染色緩衝液中且藉由流動式細胞測量術，使用Attune®流動式細胞測量儀進行分析。將所採集之資料輸出為fcs文檔且使用Flowjo軟體(Tree Star,OR)進行分析。
對在IL-2刺激後上調CD69敏感的不同細胞子集評定CD69上調。基於染色中所用之表面標記物的表現水準，形成閘門以鑑別NK細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞。
圖26
在檢定前一日，將CTLL-2細胞用培養基洗滌且以1x105個細胞/ml在75-T燒瓶中在37C、5% CO2下培養24小時以用於IL-2饑餓。在24小時饑餓培養後，將細胞以5000個細胞/孔接種在100微升/孔的具有蓋之96孔細胞培養簇平底板(Costar corning，目錄號3599)中。在刺激前使用Vi細胞生存力分析儀(Beckman-Coulter)檢查細胞生存力及計數。
於補充有10% HI FBS之完全RPMI中製備經指定之Immuno-STAT(TMMP)或普留淨(Prometheus Therapeutics)之稀釋液系列(10點；3倍稀釋步驟)作為最終檢定濃度之2X儲備液。將100μL此2X稀釋液系列添加至先前接種在96孔板中之細胞中且經混合以獲得最終檢定藥物濃度。重複三次測試各濃度。在37C、5% CO2下將細胞溫育三日。
在培養三日後，將來自各孔之100μL細胞轉移至平底白色經組織培
養物處理之96孔板中。根據由製造商提供之說明書，使用CellTiter-Glo Luminescent細胞生存力檢定套組(Promega目錄號G7571)來製備100μL CellTiter-Glo®試劑，且將其添加至細胞中。藉由將板置於回轉式振盪器上2分鐘來混合細胞與CellTiter-Glo®試劑以誘導細胞裂解。接著在室溫下將板溫育10分鐘以使發光信號穩定。量測發光且在Biotek synergy neo2多模式讀取器軟體Gen5 3.04上記錄。
圖27
在Octet HTX系統(ForteBio)上進行所有實驗。在檢定緩衝液中使Anti-penta-his(HIS1K)動力學級別生物感測器(ForteBio,#18-5122)水合且在pH 1.7甘胺酸中預調節。對除了FcRn以外的全部檢定使用檢定緩衝液。用於FcRn之緩衝液為PBS、0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.02% Tween-20 pH 7.2。用於FcRn試劑之檢定緩衝液為PBS、0.1% BSA、0.02% Tween-20 pH 6。
將各經His標記之受體以5μg/mL(FcRI例外：10ug/mL)之濃度固定於HIS1K生物感測器上120秒。接著將經抗原裝載之HIS1K生物感測器浸入各個別抗體以300nM開始之7點1：3稀釋液系列中。使用僅含有檢定緩衝液之孔來測試緩衝液與經裝載之生物感測器之間的非特異性結合。觀測締合達60秒，隨後觀測解離60秒。在HIS1K裝載後，使用解離緩衝液建立短基線(60秒)。
儘管本發明已關於其具體實施例加以描述，但熟習此項技術者應瞭解的是可在不脫離本發明之真實精神及範疇下進行各種變化且可用等效物進行替代。此外，可進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、方法、一或多個方法步驟適合於本發明之目標、精神及範疇。所有此等修改皆意欲在隨附於此之申請專利範圍之範疇內。
Claims (36)
- 一種T細胞調節多聚體多肽，其包含：至少一種異二聚體，該至少一種異二聚體包含：a)第一多肽，該第一多肽包含：i)韋爾姆斯氏瘤-1(Wilms tumor-1，WT-1)肽抗原決定基，其中該WT-1肽之長度為至少4個胺基酸；及ii)第一I類主要組織相容性複合物(MHC)多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二I類MHC多肽，及c)至少一種活化免疫調節多肽，其中該第一多肽及/或該第二多肽包含該免疫調節多肽，且其中該WT-1肽抗原決定基包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：NLM NLGATL(SEQ ID NO：258)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO：223)、WNQMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：224)、CMTWNYMNLGATLKG(SEQ ID NO：225)、WNYMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：226)、MTWNQMNLGATLKGV(SEQ ID NO：227)、TWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：228)、CMTWNLMNLGATLKG(SEQ ID NO：229)、MTWNLMNLGATLKGV(SEQ ID NO：230)、TWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：231)、WNLMNLGATLKGVAA(SEQ ID NO：232)、MNLGATLK(SEQ ID NO：233)、MTWNYMNLGATLKGV SEQ ID NO：234)、TWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：235)、CMTWNQMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：236)、CMTWNLMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：237)、CMTWNYMNLGATLKGVA(SEQ ID NO：238)、GYLRNPTAC(SEQ ID NO：239)、GALRNPTAL(SEQ ID NO：240)、YALRNPTAC(SEQ ID NO：241)、GLLRNPTAC(SEQ ID NO：242)、RYRPHPGAL(SEQ ID NO：243)、YQRPHPGAL(SEQ ID NO：244)、RLRPHP GAL(SEQ ID NO：245)、RIRPHPGAL(SEQ ID NO：246)、QFPNHSFKHEDPMGQ(SEQ ID NO：247)、HSFKHEDPY(SEQ ID NO：248)、QFPNHSFKHEDPM(SEQ ID NO：249)、QFPNHSFKHEDPY(SEQ ID NO：250)、KRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：251)、KRPFMCAYPGCYK(SEQ ID NO：252)、FMCAYPGCY(SEQ ID NO：253)、FMCAYPGCK(SEQ ID NO：254)、KRPFMCAYPGCNKRY(SEQ ID NO：255)、SEKRPFMCAYPGCNK(SEQ ID NO：256)、KRPFMCAYPGCYKRY(SEQ ID NO：257)、NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)、CMTWNQMN(SEQ ID NO：261)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)及NQMNLGATL(SEQ ID NO：267)，視情況其中該第一多肽或該第二多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
- 如請求項1之T細胞調節多聚體多肽，其中該一或多個免疫調節結構域中之至少一者為變異體免疫調節多肽，該變異體免疫調節多肽呈現出對同源共免疫調節多肽之親和力與相應野生型免疫調節多肽對該同源共免疫調節多肽之親和力相比有所減小，且其中該抗原決定基以至少10-7M之親和力結合至T細胞上之T細胞受體(TCR)，使得：i)該T細胞調節多聚體多肽結合至第一T細胞之親和力比該T細胞調節多聚體多肽結合第二T細胞之親和力高至少25%，其中該第一T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽及以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR，且其中該第二T細胞在其表面上表現該同源共免疫調節多肽，但在其表面上 不表現以至少10-7M之親和力結合該抗原決定基之TCR；且/或ii)當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽對同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽之變異體的該T細胞調節多聚體多肽對該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率範圍為1.5：1至106：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
- 如請求項2之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)該T細胞調節多聚體多肽結合至該第一T細胞之親和力比其結合該第二T細胞之親和力高至少50%、至少2倍、至少5倍或至少10倍；且/或b)該變異體免疫調節多肽結合該共免疫調節多肽之親和力為約10-4M至約10-7M、約10-4M至約10-6M、約10-4M至約10-5M；且/或c)其中當藉由生物層干涉術量測時，對照T細胞調節多聚體多肽對同源共免疫調節多肽之結合親和力與包含野生型免疫調節多肽之變異體的該T細胞調節多聚體多肽對該同源共免疫調節多肽之結合親和力的比率為至少10：1、至少50：1、至少102：1或至少103：1，其中該對照包含該野生型免疫調節多肽。
- 如請求項1至3中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中a1)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；ii)該第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；且b1)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該第二MHC多肽；及ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或a2)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b2)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；ii)該第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽；或a3)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b3)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該第二MHC多肽；及ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；或a4)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b4)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該第二MHC多肽；及ii)至少一種免疫調節多肽；或a5)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該第一MHC多肽；且b5)第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；及ii)該第二MHC多肽；或a6)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；ii)該第一MHC多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽；且b6)該第二多肽包含：i)該第二MHC多肽。
- 如請求項1至4中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)該第一MHC多肽為β2-微球蛋白多肽；且該第二MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；或b)該第一MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；且該第二MHC多肽為β2-微球蛋白多肽。
- 如請求項5之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該β2-微球蛋白多肽；且b)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)至少一種免疫調節多肽；ii)該I類MHC重鏈多肽；及iii)Ig Fc多肽。
- 如請求項5之T細胞調節多聚體多肽，其中：a)該第一多肽以自N端至C端之次序包含：i)該WT-1肽抗原決定基；及ii)該β2-微球蛋白多肽；且b)該第二多肽以自N端至C端之次序包含：i)該I類MHC重鏈多肽；及ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一種免疫調節多肽。
- 如請求項1至7中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽係選自由以下組成之群：細胞介素、4-1BBL多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、CD40多肽、CD70多肽及其組合。
- 如請求項1至8中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該至少一種免疫調節多肽為IL-2多肽。
- 如請求項1至9中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含至少兩種免疫調節多肽，且其中該等免疫調節多肽中之至少兩者為相同的，視情況其中該兩種或更多種免疫調節多肽係串聯在一起。
- 如請求項1至10中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該免疫調節多肽為變異體IL-2多肽，其呈現出對IL-2受體之親和力與野生型IL-2多肽對該IL-2受體之親和力相比有所減小。
- 如請求項11之T細胞調節多聚體多肽，其中該變異體IL-2多肽包含：i)H16A取代及F42A取代；或ii)H16T取代及F42A取代。
- 如請求項1至12中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一多肽與該第二多肽彼此共價連接，視情況其中該共價鍵聯係經由二硫鍵。
- 如請求項1至13中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽或介於該抗原決定基與該第一MHC多肽之間的連接子包含提供第一Cys殘基之胺基酸取代，其中該第二MHC多肽包含提供第二Cys殘基之胺基酸取代，且其中該二硫鍵聯係在該第一Cys殘基與該第二Cys殘基 之間。
- 如請求項1至14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多肽包含介於以下之間的二硫鍵：i)存在於該WT-1肽抗原決定基與該第一I類MHC多肽之間的連接子中之Cys，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由Y84C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。
- 如請求項1至14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多肽包含介於以下之間的二硫鍵：i)經由R12C取代引入該第一I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由A236C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽。
- 如請求項1至14中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多肽包含介於以下之間的第一二硫鍵：i)存在於該WT-1肽抗原決定基與該第一I類MHC多肽之間的連接子中之Cys，其中該第一I類MHC多肽為β2M多肽；與ii)經由Y84C取代引入該第二I類MHC多肽中之Cys殘基，其中該第二I類MHC多肽為I類MHC重鏈多肽；及介於以下之間的第二二硫鍵：i)經由R12C取代引入該β2M多肽中之Cys殘基；與ii)經由A236C取代引入該I類MHC重鏈多肽中之Cys殘基。
- 如請求項15或請求項17之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基與該第一MHC之間的該連接子為GCGGS(G4S)n(SEQ ID No：315)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或9。
- 如請求項1至18中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該WT-1肽抗原決定基之長度為約4個胺基酸至約25個胺基酸。
- 如請求項1至19中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該 WT-1肽包含胺基酸序列CMTWNQMNL(SEQ ID NO：266)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)、NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)、SLGEQQYSV(SEQ ID NO：265)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)及NLMNLGATL(SEQ ID NO：258)。
- 如請求項1至20中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽或該第二MHC多肽包含：a)與屬於SEQ ID NO：198之HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或b)與屬於SEQ ID NO：207之HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；或c)與屬於SEQ ID NO：214之HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至21中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*2402多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且其中該抗原決定基係選自由以下組成之群：RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)、CYTWNQMNL(SEQ ID NO：269)及NYMNLGATL(SEQ ID NO：263)。
- 如請求項1至21中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該第一MHC多肽為β2M多肽，且其中該第二MHC多肽包含與HLA-A*0201多肽具有至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，且其中該抗原決定基係選 自由以下組成之群：VLDFAPPGA(SEQ ID NO：259)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：260)及YMFPNAPYL(SEQ ID NO：264)。
- 如請求項1至23中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含第一異二聚體及第二異二聚體，且其中該第一異二聚體與該第二異二聚體係藉由該第一異二聚體及該第二異二聚體之該等Ig Fc多肽之間的一或多個二硫鍵來共價結合。
- 一種核酸，其包含編碼如請求項1至24中任一項之第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
- 一種表現載體，其包含如請求項25之核酸。
- 一種選擇性調節對於韋爾姆斯氏瘤-1(WT-1)抗原決定基有特異性之T細胞之活性的方法，該方法包括使該T細胞與如請求項1至24中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該接觸選擇性調節該WT-1抗原決定基特異性T細胞之活性。
- 一種治療患有癌症之患者的方法，該方法包括向該患者投與有效量的包含如請求項1至24中任一項之T細胞調節多聚體多肽之醫藥組成物。
- 如請求項28之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病、骨髓瘤、卵巢癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、韋爾姆斯氏瘤、間皮瘤、軟組織肉瘤、神經胚細胞瘤或腎胚細胞瘤。
- 如請求項28或請求項29之方法，其進一步包括向該個體投與一或多種檢查點抑制劑。
- 如請求項30之方法，其中該檢查點抑制劑為結合至選自由以下組成之群之多肽的抗體：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3K δ、PI3K γ、TAM、精胺酸酶、CD137、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、 CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1及PD-L2。
- 如請求項31之方法，其中該檢查點抑制劑為對PD-1、PD-L1或CTLA4有特異性之抗體。
- 如請求項30之方法，其中該一或多種檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、皮地利珠單抗(pidilizumab)、AMP-224、MPDL3280A、MDX-1105、MEDI-4736、阿維魯單抗(arelumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、皮地利珠單抗(pidilizumab)、IMP321、MGA271、BMS-986016、利魯單抗(lirilumab)、烏瑞魯單抗(urelumab)、PF-05082566、IPH2101、MEDI-6469、CP-870,893、莫木利珠單抗(Mogamulizumab)、瓦利魯單抗(Varlilumab)、阿維魯單抗(Avelumab)、加利昔單抗(Galiximab)、AMP-514、AUNP 12、伊多莫德(Indoximod)、NLG-919、INCB024360、KN035及其組合。
- 一種調節個體之免疫反應的方法，該方法包括向該個體投與有效量的如請求項1至24中任一項之T細胞調節多聚體多肽，其中該投與誘導抗原決定基特異性T細胞反應及抗原決定基非特異性T細胞反應，且其中該抗原決定基特異性T細胞反應與該抗原決定基非特異性T細胞反應之比率為至少2：1。
- 一種選擇性遞送免疫調節多肽至靶標T細胞之方法，該方法包括使混合T細胞群與如請求項1至24中任一項之T細胞調節多聚體多肽接觸，其中該混合T細胞群包含該靶標T細胞及非靶標T細胞，其中該靶標T細胞對存在於該T細胞調節多聚體多肽內之該WT-1抗原決定基有特異性，且其中該接觸遞送存在於該T細胞調節多聚體多肽內之該一或多種免疫調節多肽至該靶標T細胞。
- 一種偵測自個體獲得之混合T細胞群中結合WT-1抗原決定基之靶標T細胞之存在的方法，該方法包括：a)使該混合T細胞群與如請求項1至24中任一項之T細胞調節多聚體多肽在活體外接觸，其中該T細胞調節多聚體多肽包含該WT-1抗原決定基；及b)偵測T細胞回應於該接觸之活化及/或增殖，其中經活化及/或增殖之T細胞指示該靶標T細胞之存在。
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