ES2832546T3

ES2832546T3 - Péptidos WT-1 inmunogénicos y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2832546T3
Application number: ES14741142T
Authority: ES
Inventors: David A Scheinberg; Tao Dao
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2014-01-15
Publication date: 2021-06-10
Anticipated expiration: 2034-01-15
Also published as: AU2014207615A1; CN105377291B; CA2898099A1; CY1123563T1; EP2945647A4; RS61173B1; JP6486278B2; AU2023201564A1; JP2019122377A; CN116253788A; HRP20201867T1; CN116789792A; SI2945647T1; AU2018241209B2; EP2945647B1; WO2014113490A3; PL2945647T3; LT2945647T; JP2016506907A; JP6853842B2

Abstract

Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos NLMNLGATL (SEQ ID NO:6).

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos WT-1 inmunogénicos y métodos de uso de los mismos

Campo de la invención

Esta invención proporciona péptidos, composiciones y vacunas que comprenden los mismos, y su uso para tratar, reducir la incidencia e inducir respuestas inmunitarias a un cáncer que expresa WT1.

Antecedentes de la invención

El tumor de Wilms (WT), un nefroblastoma pediátrico que se presenta con una frecuencia de 1 de cada 10 000 nacimientos, ha sido objeto de intensa investigación clínica y básica durante varios años. El tumor es de origen embrionario, se detecta en niños usualmente durante los primeros 5 años de vida y puede presentarse unilateral o bilateralmente. Un WT surge cuando las células mesenquimales metanéfricas condensadas del riñón en desarrollo no logran diferenciarse adecuadamente. La implicación del gen supresor tumoral del tumor de Wilms 1 (WT1) en la etiología del WT ilustró el impacto que las alteraciones genéticas pueden tener tanto en el desarrollo como en la tumorigénesis.

La proteína del tumor de Wilms I (WT1) es un factor de transcripción con dedos de zinc que se expresa durante la ontogénesis normal, tal como en el riñón, testículos y ovarios fetales. En adultos, la expresión de WTI se limita a niveles bajos en células madre hematopoyéticas, células progenitoras mioepiteliales, podocitos renales y algunas células en testículos y ovarios. La demostración reciente de que WTI se sobreexpresa en varios tipos de leucemia sugirió que WTI sería un objetivo atractivo para la inmunoterapia para diversos cánceres.

La proteína oncogénica del tumor de Wilms (WT1) es un objetivo atractivo para la inmunoterapia para leucemias y una amplia gama de cánceres. Se han identificado péptidos derivados de la proteína WT1 que inducen células T CD8 citotóxicas restringidas por HLA-A0201, capaces de destruir las células tumorales. Dos péptidos que se unen a HLA-A0201 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 56) o HLA-A2402 (CMTWNQMNL; SEQ ID NO: 57) se han estudiado ampliamente en todo el mundo y se han realizado ensayos clínicos en pacientes con leucemia y otros tumores sólidos (Oka y otros, Scientific World Journal 2007; 7: 649-665; Mundlos y otros, Development 1993;119:1329-41; Keilholz y otros, Leukemia 2005; 19: 1318-1323). Estos resultados son alentadores y han proporcionado pruebas sólidas y un fundamento para el direccionamiento terapéutico de los epítopos de células T derivadas de WT1 para las leucemias y una amplia gama de cánceres humanos.

La aplicación terapéutica de los dos péptidos derivados de WT1 anteriores se limita a las personas que son HLA-A0201, un haplotipo de HLA que se encuentra en aproximadamente el 40 % de los caucásicos y HLA-A2402, un haplotipo que se encuentra en aproximadamente el 40 % de los japoneses y otras poblaciones asiáticas. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de péptidos derivados de WT1 que podrían usarse para la mayoría de las poblaciones del mundo. Para extender la aplicación terapéutica en una gama más amplia de población, se desean nuevos péptidos derivados de la proteína WT1 que se unan a múltiples haplotipos de HLA. Dichos péptidos serían capaces, por lo tanto, de estimular las células T de un porcentaje mayor de la población objetivo, lo que permitiría una estrategia de vacuna que se dirigiría a un gran segmento de la población, con células de memoria citotóxicas duraderas.

El documento WO 2007/120673 describe péptidos WT-1 inmunogénicos, composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden los péptidos, y métodos para tratar, reducir la incidencia e inducir respuestas inmunitarias a un cáncer que expresa WT1, mediante el uso de los péptidos y las composiciones.

Breve descripción de la invención

Esta solicitud describe péptidos, composiciones y composiciones inmunogénicas tales como vacunas que comprenden péptidos inmunogénicos y métodos para tratar, reducir la incidencia e inducir respuestas inmunitarias a un cáncer que expresa WT1, que comprenden administrar péptidos inmunogénicos o estimular las células T fuera de un paciente humano que después pueden infundirse en el paciente para su tratamiento.

En una modalidad, la presente invención proporciona un péptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos (AA) seleccionada de SEQ ID NO: 6, 14, 15, 16, 17 y 22. En una modalidad, el péptido aislado se une a una molécula HLA de clase I y/o una molécula HLA de clase II. En una modalidad, la presente invención proporciona un péptido de unión a HLA de clase I aislado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6. En una modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 de unión a HLA de clase II aislado que comprende una secuencia de aminoácidos (AA) seleccionada de SEQ ID NO: 14, 15, 16 y 17. Estos péptidos pueden denominarse como péptidos de la invención.

La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de la invención. La presente invención también proporciona un vector, tal como un vector de virus atenuado o un vector de Salmonella typhi, que comprende la molécula de ácido nucleico. El vector puede codificar además cualquiera de las interleucinas 1 a 15, interferón alfa, beta o gamma, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), proteína activadora de neutrófilos (NAP), factor activador y quimiotáctico de macrófagos (MCAF), RANTES, péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-Ia o MIP-Ib, un componente del complemento, o combinaciones de los mismos.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de la invención, o una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido, o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico y un portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende uno o más péptidos de la invención, y opcionalmente, una célula presentadora de antígeno (APC) y/o un adyuvante, diluyente o portador y/o al menos un péptido derivado de WT1 adicional. En una modalidad, el adyuvante es QS21, adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, BCG, alumbre, un factor de crecimiento, una citocina, una quimiocina, una interleucina, Montanide ISA 51 o GM-CSF.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o vacuna de la invención para su uso para tratar un sujeto con un cáncer que expresa WT1 o reducir la incidencia de un cáncer que expresa WT1, o su recaída.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende (a) una célula presentadora de antígeno (APC) y (b) un péptido de la invención, o una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido, o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico.

En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso de un péptido o vacuna o composición de la invención, o una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido, o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico, para inducir in vitro la formación y proliferación de CTL específicos para células de un cáncer que expresa WT1.

En una modalidad, el cáncer que expresa WT1 es una leucemia, un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, un cáncer gástrico, un cáncer de colon, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un tumor de células germinales, un cáncer de ovario, un cáncer uterino, un cáncer de tiroides, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un sarcoma de Kaposi, un sarcoma, un carcinoma hepatocelular, un tumor de Wilms, una leucemia mielógena aguda (AML), un síndrome mielodisplásico (MDS) o un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En una modalidad, el cáncer que expresa WT1 es mesotelioma.

Breve descripción de las figuras

En las figuras de la presente descripción, el conjunto de barras de datos agrupados en los gráficos para cada péptido se presenta en el mismo orden de izquierda a derecha que se muestra en la leyenda de la figura de arriba a abajo.

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de estabilización T2 que muestra que la unión del péptido NLMNLGATL a la molécula HLA-A2 es más fuerte que la de los péptidos n Qm NLGATL y NYMNLGATL. Se pulsó NQMNLGATL nativo, NLMNLGATL heteróclito o n Ym NLGATL sobre células T2 a las concentraciones indicadas como se describe en los Materiales y métodos. La estabilización de la molécula HLA-A2 por los péptidos se midió mediante la expresión de la molécula HLA-A2;

La Figura 2 A-B muestra que el péptido NLMNLGATL induce una fuerte respuesta de células T específica para el péptido que reacciona de forma cruzada con su secuencia nativa NQMNLGATL. Para cada péptido, las barras representan, de izquierda a derecha, CD14, péptido nativo, NLMNLGATL y PSMA, respectivamente. Se estimularon células T CD3 de un donante homocigoto HLA-A0201 sano con ya sea un péptido NQM o NLMNLGATL durante 3 (A) o 5 (B) rondas. La respuesta específica para el péptido se midió mediante la secreción de IFN-g tras el reto con el péptido individual. Cada punto de datos representa el promedio /- SD de los cultivos por triplicado;

La Figura 3 muestra que el péptido NLMNLGATL induce citotoxicidad de las células T contra células de leucemia WT1+HLA-A0201+. Las células T de un donante positivo para HLA-A0201 se estimularon con péptido NLMNLGATL durante 5 rondas. La citotoxicidad de las células se midió mediante un ensayo de liberación de 51Cr-5 h contra la línea celular de AML SET-2 (WT1+, HLA-A0201+), HL-60 (WT1+, HLA-A0201-) o blastos de leucemia primaria de un paciente positivo para HLA-A2. Cada punto de datos representa el promedio /- SD de los cultivos por triplicado;

La Figura 4 A-B muestra la respuesta de células T específica para el péptido en el donante HLA-A2402. Se estimularon células T CD3 de un donante homocigoto HLA-A2402 sano con péptidos NQMNLGATL, NLMNLGATL o NYMNLGATL durante 3 (A) o 5 (B) rondas. Para cada péptido, las barras representan, de izquierda a derecha, CD14, péptido nativo, NLMNLGATL, NYMNLGATL y péptido irrelevante, respectivamente. La respuesta específica para el péptido se midió mediante la secreción de IFN-g tras el reto con el péptido individual. Cada punto de datos representa el promedio /- SD de los cultivos por triplicado;

La Figura 5 A-B muestra las respuestas de células T específicas para el péptido HLA-DR.B1. (A). Se estimularon células T CD3 con péptido DR-het-1 o DR-het-2 durante 5 rondas y se midió la respuesta específica para el epítopo mediante el ensayo Elispot de IFN-g. Para cada péptido, las barras representan, de izquierda a derecha, CD14, péptido nativo, NLMNLGATL, WT1-CMT, PSMA, DR-Nat-1/Nat-2, DR-het-1/het-2, B2A2L, BA25 y HL-60, respectivamente. (B). Las células T CD3 se estimularon con péptidos cortos NQMNLGATL, NLMNLGATL y péptidos largos DR-nativo-1, DR-nativo-2, DR-het-1 o DR-het-2 durante 5 rondas y se midió la citotoxicidad mediante el ensayo de liberación de 51Cr, contra la línea celular de leucemia BA-25 (HLA-A2+/A24+, WT1+) y las células de control HL-60. Cada punto de datos representa el promedio /- SD de los cultivos por triplicado;

La Figura 6 representa células T CD3 de un donante positivo para HLA-B0702 que se estimularon con 2 conjuntos de péptidos (cinco en total) por 5 veces in vitro. La respuesta específica para el péptido se midió mediante el ensayo ELISPOT de IFN-gamma, contra un péptido individual; los péptidos probados de izquierda a derecha son las SEQ ID NOS: 34, 37, 38, 30 y 31; y para cada péptido, las barras representan, de izquierda a derecha, las respuestas a CD14, péptido nativo-1, Het-1 a nativo-1, Het-2 a nativo-1, nativo-2, Het-1 a nativo-2 y control, respectivamente; y

La Figura 7 representa los resultados de un ensayo ELISPOT mediante el uso de SA del donante (5 estimulaciones) para el péptido A24 Het-1 (SEQ ID NO: 6) y Het-2 (SEQ ID NO: 7), en comparación con la secuencia nativa (SEQ ID NO: 5). Para cada péptido, las barras representan, de izquierda a derecha, CD14, péptido nativo-A24, A24-het-1, A24-het-2, A24-235 y PSMA, respectivamente. Los péptidos heteróclitos generan respuestas de reacción cruzada.

Descripción detallada de la invención

Esta solicitud describe péptidos inmunogénicos, y composiciones y vacunas que comprenden péptidos inmunogénicos, y métodos para tratar, reducir la incidencia e inducir respuestas inmunitarias a un cáncer que expresa WT1, que comprenden administrar uno o más péptidos inmunogénicos.

Esta solicitud describe péptidos sintéticos y métodos para tratar, reducir la incidencia e inducir respuestas inmunitarias contra un cáncer que expresa WT1, que comprenden péptidos inmunogénicos.

La molécula de WT1 de la que se derivan los péptidos de la presente invención tiene, en otra modalidad, la secuencia:

1 SRQRPHPGAL RNPTACPLPH FPPSLPPTHS PTHPPRAGTA AQAPGPRRLL

51 AAILDFLLLQ DPASTCVPEP ASQHTLRSGP GCLQQPEQQG VRDPGGIWAK

101 LGAAEASAER LQGRRSRGAS GSEPQQMGSD VRDLNALLPA VPSLGGGGGC

151 ALPVSGAAQW APVLDFAPPG ASAYGSLGGP APPPAPPPPP PPPPHSFIKQ

201 EPSWGGAEPH EEQCLSAFTV HFSGQFTGTA GACRYGPFGP PPPSQASSGQ

251 ARMFPNAPYL PSCLESQPAI RNQGYSTVTF DGTPSYGHTP SHHAAQFPNH

301 SFKHEDPMGQ QGSLGEQQYS VPPPVYGCHT PTDSCTGSQA LLLRTPYSSD

351 NLYQMTSQLE CMTWNQMNLG ATLKGVAAGS SSSVKWTEGQ SNHSTGYESD

401 NHTTPILCGA QYR1HTHGVF RGIQDVRRVP GVAPTLVRSA SETSEKRPFM

451 CAYPGCNKRY FKLSHLQMHS RKHTGEKPYQ CDFKDCERRF SRSDQLKRHQ

501 RRHTGVKPFQ CKTCQRKFSR SDHLKTHTRT HTGKTSEKPF SCRWPSCQKK

551 FARSDELVRH HNMHQRNMTK LQLAL (SEQ I >NO:51).

La secuencia anterior de la proteína WT-1 es la publicada por Gessler y otros, (Gessler M, Poustka A, Cavenee W, Neve RL, Orkin SH, Bruns GA. Homozygous deletion in Wilms tumours of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping. Nature. 1990;343(6260):774-778. Publicado previamente el 22/02/1990 como DOI 10.1038/343774a0.) que comprende 575 aminoácidos e incluye los primeros 126 aminoácidos en el extremo N-terminal que faltan en la isoforma (Exón 5+, KTS+) de WT-116.

En otra modalidad, la secuencia de WT1 es

MGSDVRD1NALLPA VPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPP

PPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQA

RMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGS

LGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLK

GVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYR1HTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTL

VRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLK

RHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVR

HHNMHQRNMTKLQLAL (Núm. de acceso GenBanK AY245105; SEQ ID NO: 52).

En otra modalidad, la molécula de WT1 tiene la secuencia:

AAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAP

VLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQF

TGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHT

PSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDN

LYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGHSTGYESDNHTTPILCGAQYR1HTHGVFRGIQDVRRV

PGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRF

SRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARS

DELVRHHNMHQRNMTKLQLAL (Núm. de acceso GenBank NM_000378; SEQ ID NO: 53).

En otra modalidad, la molécula de WT1 tiene la secuencia:

MQDPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRRSRGA

SGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGP

APPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQ

ASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDP

MGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQM

NLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYR1HTHGVFRGIQDVRRV

PGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRF

SRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARS

DELVRHHNMHQRNMTKLQLAL (Núm de acceso GenBank NP_077742; SEQ ID NO: 54).

En otra modalidad, la proteína WT1 tiene la secuencia establecida en GenBank, núm. de acceso NM_024426. En otras modalidades, la proteína WT1 tiene o comprende una de las secuencias establecidas en una de las siguientes entradas de secuencia: NM_024425, NM_024424, NM_000378, S95530, D13624, D12496, D 12497 o X77549. En otra modalidad, la proteína WT1 tiene cualquier otra secuencia WT1 conocida en la técnica. Esta solicitud describe péptidos, composiciones y composiciones inmunogénicas tales como vacunas que comprenden péptidos inmunogénicos y métodos para tratar, reducir la incidencia e inducir respuestas inmunitarias a un cáncer que expresa WT1, que comprenden la administración de péptidos inmunogénicos. En algunos casos, los péptidos descritos en la presente descripción se derivan de péptidos que son secuencias nativas de WT1, y pueden denominarse en la presente descripción como péptidos derivados de WT1 o como un péptido WT1.

En una modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos (AA) NLMNLGATL (SEQ ID NO: 6). En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 14), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 15), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 16), WNLMNLGATLKG (SEQ ID n O: 17) y CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 22). En una modalidad, el péptido aislado se une a una molécula HLA de clase I, una molécula HLA de clase II o la combinación de las mismas. En una modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 de unión a HLA de clase I aislado que tiene la secuencia de aminoácidos NLMNLGATL (SEQ ID NO: 6). En una modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 de unión a HLA de clase II aislado que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 14), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 15), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 16) y WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 17). Estos péptidos pueden denominarse como péptidos de la invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende (a) una célula presentadora de antígenos y (b) un péptido de la invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende uno o más péptidos de la invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 o vacuna de la presente invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido WT1 o vacuna de la presente invención para su uso en la reducción de la incidencia de un cáncer que expresa WT1, o su recaída, en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un péptido WT1 de la presente invención o una molécula de nucleótidos que codifican el péptido WT1 para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra el cáncer en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un péptido WT1 de la presente invención o una molécula de nucleótidos que codifican el péptido WT1 para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un péptido WT1 de la presente invención o una molécula de nucleótidos que codifican el péptido WT1 para su uso en la reducción de la incidencia de un cáncer que expresa WT1, o su recaída, en un sujeto.

En una modalidad, el cáncer que expresa WT1 es una leucemia mielógena aguda (AML). En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 se asocia con un síndrome mielodisplásico (MDS). En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un MDS. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor de Wilms. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es una leucemia. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer hematológico. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un linfoma. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un mesotelioma. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un mesotelioma maligno. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer gástrico. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de colon. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de pulmón. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de mama. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor de células germinales. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de ovario. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer uterino. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de tiroides. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un carcinoma hepatocelular. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de tiroides. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de hígado. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer renal. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un sarcoma de Kaposi. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un sarcoma. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es cualquier otro carcinoma o sarcoma.

En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor sólido. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer que expresa WT1. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un síndrome mielodisplásico (MDS). En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de pulmón. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de mama. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer colorrectal. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de próstata. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de ovario. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer renal. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer pancreático. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de cerebro. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer gastrointestinal. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un cáncer de piel. En otra modalidad, el tumor sólido se asocia con un melanoma.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido de la invención aislado en combinación con al menos 1 péptido derivado de WT1 adicional. En ciertas modalidades, se proporciona una composición que comprende al menos 2 péptidos diferentes. En ciertas modalidades, se proporciona una composición que comprende al menos 3 o al menos 4 péptidos diferentes. En ciertas modalidades, la composición de la presente invención es una vacuna.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido o composición de la presente invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido o composición de la presente invención para su uso en la reducción de la incidencia de un cáncer que expresa WT1, o su recaída, en un sujeto.

En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para inducir la formación y proliferación de CTL específicos para la proteína WT1, el método comprende poner en contacto una población de linfocitos con un péptido o composición de la presente invención, lo que induce de esta manera la formación y proliferación de un CTL específico de la proteína WT1. Este método puede realizarse in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando se realiza in vitro o ex vivo, estos CTL pueden infundirse después en un paciente para obtener un efecto terapéutico.

En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para inducir la formación y proliferación de (a) un linfocito CD8+ específico para la proteína WT1; o (b) un linfocito CD4+ específico para la proteína WT1, o la combinación de los mismos, el método comprende poner en contacto una población de linfocitos con un péptido o composición de la presente invención, lo que induce de esta manera la formación y proliferación de (a) un linfocito CD8+ específico para la proteína WT1; o (b) un linfocito CD4+ específico para la proteína WT1; o una combinación de los mismos. Este método puede realizarse in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando se realiza in vitro o ex vivo, estos CTL pueden infundirse después en un paciente para obtener un efecto terapéutico.

Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso de un péptido o molécula de ácido nucleico o vector o composición de la presente invención para inducir in vitro la formación y proliferación de CTL específicos para células de un cáncer que expresa WT1.

"Péptido", en otra modalidad de los métodos y composiciones de la presente invención, se refiere a un compuesto de subunidades AA conectadas por enlaces peptídicos. En otra modalidad, el péptido comprende un análogo de AA. En otra modalidad, el péptido comprende un peptidomimético. Los diferentes análogos de AA y peptidomiméticos que pueden incluirse en los péptidos de los métodos y composiciones de la presente invención se enumeran más abajo. En otra modalidad, las subunidades se unen mediante enlaces peptídicos. En otra modalidad, la subunidad se une por otro tipo de enlace, por ejemplo, éster, éter, etc.

Los péptidos no alterados de la presente invención (como se describen tanto anteriormente como más abajo) se denominan colectivamente en la presente descripción como "péptidos WT1". Cada una de las modalidades enumeradas más abajo para "péptidos WT1" se aplica a péptidos WT1 no alterados y péptidos heteróclitos HLA de clase I y clase II de la presente invención.

En otra modalidad, un péptido WT1 de la presente invención se une a una molécula HLA de clase I o una molécula de clase II. En otra modalidad, el péptido se une tanto a una molécula de clase I como a una de clase II. En otra modalidad, la molécula HLA de clase II es una molécula HLA-DRB. En otra modalidad, la molécula HLA de clase II es una molécula HLA-DRA. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DQA1. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DQB1. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DPA1. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DPB 1. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DMA. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DMB. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DOA. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA-DOB. En otra modalidad, la molécula HLA es cualquier otra molécula HLA de clase II conocida en la técnica.

En otra modalidad, la molécula HLA de clase I cuyo motivo de unión está contenido en o comprende un péptido de la presente invención es, en otra modalidad, una molécula HLA-A. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-B. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-C. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-A0201. En otra modalidad, la molécula es HLA A1. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA A2. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA A2.1. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA A3. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA A3.2. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA A11. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA A24. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA B7. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA B27. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es HLA B8.

En otra modalidad, el péptido derivado de WT1 de unión a moléculas HLA de clase I de la presente invención se une a una superfamilia de moléculas HLA de clase I. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia A2. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia A3. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia A24. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia B7. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia B27. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia B44. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia C1. En otra modalidad, la superfamilia es la superfamilia C4. En otra modalidad, la superfamilia es cualquier otra superfamilia conocida en la técnica.

En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula A0101, A0201, A0203, A2402, A6901, B0702, A3101, B3501, B3503, B3508, B3802, B3801, B3901, B4001, B4402, B4701, B5701, C0401, C1701, DRB-,0101, DRB-,0402, DRB-|0402, DRB-|0401 o DRB-|1104. En otra modalidad, los péptidos de la invención se unen a las moléculas HLA de clase I o clase II descritas para cada péptido en las Tablas más abajo. En una modalidad, ciertos péptidos pueden unirse a más de un alelo de HLA.

En otra modalidad, un péptido WT1 de los métodos y composiciones de la presente invención se diseña de manera que muestre afinidad por una molécula HLA. En otra modalidad, la afinidad es una afinidad alta, como se describe en la presente descripción.

Las moléculas HLA, conocidas en otra modalidad como moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), se unen a los péptidos y los presentan a las células inmunitarias. Por lo tanto, en otra modalidad, la inmunogenicidad de un péptido está determinada parcialmente por su afinidad por las moléculas HLA. Las moléculas HLA de clase I interactúan con las moléculas de CD8, que están presentes generalmente en los linfocitos T citotóxicos (CTL). Las moléculas HLA de clase II interactúan con las moléculas de CD4, que están presentes generalmente en los linfocitos T auxiliares.

En otra modalidad, un péptido de la presente invención es inmunogénico. En otra modalidad, "inmunogénico" se refiere a la capacidad de estimular, provocar o participar en una respuesta inmunitaria. En otra modalidad, la respuesta inmunitaria provocada es una respuesta inmunitaria mediada por células. En otra modalidad, la respuesta inmunitaria es una combinación de respuestas mediadas por células y humorales.

En otra modalidad, las células T que se unen al complejo péptido-molécula de MHC se activan y se inducen a proliferar y lisar las células que expresan una proteína que comprende el péptido. Típicamente, las células T se activan inicialmente por células presentadoras de antígenos "profesionales" ("APC"; por ejemplo, células dendríticas, monocitos y macrófagos), que presentan moléculas coestimuladoras que alientan la activación de las células T en contraposición a la anergia o la apoptosis. En otra modalidad, la respuesta es heteróclita, como se describe en la presente descripción, de manera que el CTL lisa una célula neoplásica que expresa una proteína que tiene una secuencia de AA homóloga a un péptido de esta invención, o un péptido diferente al usado para estimular primero la célula T.

En otra modalidad, un encuentro de una célula T con un péptido de esta invención induce su diferenciación en una célula T efectora y/o de memoria. Los encuentros posteriores entre la célula T efectora o de memoria y el mismo péptido, o, en otra modalidad, con un péptido relacionado de esta invención, conducen a una respuesta inmunitaria más rápida y más intensa. Dichas respuestas se miden, en otra modalidad, al medir el grado de proliferación de la población de células T expuestas al péptido. En otra modalidad, dichas respuestas se miden mediante cualquiera de los métodos enumerados más abajo.

En otra modalidad, los péptidos de la presente invención se unen a una molécula HLA de clase II con alta afinidad. En otras modalidades, la molécula HLA de clase II es cualquier molécula HLA de clase II enumerada en la presente descripción.

En otra modalidad, los derivados de péptidos de la presente invención se unen a una molécula HLA de clase I con alta afinidad. En otras modalidades, la molécula de MHC de clase I es cualquier molécula de MHC de clase I enumerada en la presente descripción.

En otra modalidad, un péptido de la presente invención se une a una molécula HLA de clase II con una afinidad significativa, mientras que un péptido derivado del péptido original se une a una molécula HLA de clase I con una afinidad significativa.

En otra modalidad, "afinidad" se refiere a la concentración de péptido necesaria para inhibir la unión de un péptido estándar a la molécula de MHC indicada en un 50 %. En otra modalidad, "alta afinidad" se refiere a una afinidad que es tal que se requiere una concentración de aproximadamente 500 nanomolar (nM) o menos del péptido para una inhibición del 50 % de la unión de un péptido estándar. En otra modalidad, se requiere una concentración de aproximadamente 400 nM o menos del péptido. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 300 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 200 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 150 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 100 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 80 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 60 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 40 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 30 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 20 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 15 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 10 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 8 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 6 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 4 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 3 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 2 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 1,5 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 1 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 0,8 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 0,6 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 0,5 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 0,4 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es de 0,3 nM. En otra modalidad, la afinidad de unión es inferior a 0,3 nM.

En otra modalidad, "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de unión a la molécula de MHC. En otra modalidad, la afinidad se mide mediante el uso de un método conocido en la técnica para medir las afinidades de unión competitivas. En otra modalidad, la afinidad se mide mediante el uso de un método conocido en la técnica para medir las afinidades de unión relativas. En otra modalidad, el método es un ensayo de unión competitiva. En otra modalidad, el método es un radioinmunoensayo o RIA. En otra modalidad, el método es un análisis BiaCore. En otra modalidad, el método es cualquier otro método conocido en la técnica. En otra modalidad, el método produce una IC50 con relación a una IC50 de un péptido de referencia de afinidad conocida.

En otra modalidad, "alta afinidad" se refiere a una IC50 de 0,5 a 500 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 1-300 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 1,5-200 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 2-100 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 3-100 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 4-100 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 6-100 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 10-100 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 30-100 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 3-80 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 4-60 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 5-50 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 6-50 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 8-50 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 10-50 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 20-50 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 6-40 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 8-30 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 10-25 nM. En otra modalidad, la IC50 es de 15-25 nM.

En otra modalidad, un péptido de la presente invención se une a una superfamilia de moléculas HLA. Las superfamilias de moléculas HLA comparten motivos de unión muy similares o idénticos. En otra modalidad, la superfamilia es una superfamilia de HLA de clase I. En otra modalidad, la superfamilia es una superfamilia de HLA de clase II.

Los términos "péptido de unión a HLA", "péptido de unión a una molécula HLA de clase I" y "péptido de unión a una molécula HLA de clase II" se refieren, en otra modalidad, a un péptido que se une a una molécula HLA con afinidad medible. En otra modalidad, los términos se refieren a un péptido que se une a una molécula HLA con alta afinidad. En otra modalidad, los términos se refieren a un péptido que se une a una molécula HLA con suficiente afinidad para activar un precursor de célula T. En otra modalidad, los términos se refieren a un péptido que se une a una molécula HLA con suficiente afinidad para mediar en el reconocimiento por una célula T. La molécula HLA es, en otras modalidades, cualquiera de las moléculas HLA enumeradas en la presente descripción.

"Heteróclito" se refiere, en otra modalidad, a un péptido que genera una respuesta inmunitaria que reconoce el péptido original a partir del que se deriva el péptido heteróclito (por ejemplo, el péptido no contiene el residuo de anclaje u otras mutaciones de residuos). En otra modalidad, "péptido original" se refiere a un péptido de la presente invención. En otra modalidad, "heteróclito" se refiere a un péptido que genera una respuesta inmunitaria que reconoce el péptido original a partir del que se deriva el péptido heteróclito, en donde la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con el péptido heteróclito es mayor que la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con el péptido original. En otra modalidad, una respuesta inmunitaria "heteróclita" se refiere a una respuesta inmunitaria que reconoce el péptido original a partir del que se deriva el péptido mejorado (por ejemplo, el péptido no contiene las mutaciones del residuo de anclaje). En otra modalidad, una respuesta inmunitaria "heteróclita" se refiere a una respuesta inmunitaria que reconoce el péptido original a partir del que se deriva el péptido heteróclito, en donde la magnitud de la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con el péptido heteróclito es superior a la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con el péptido original. En otra modalidad, la magnitud de la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con el péptido heteróclito es superior a la respuesta inmunitaria sustancialmente igual a la respuesta a la vacunación con el péptido original. En otra modalidad, la magnitud de la respuesta inmunitaria generada por la vacunación con el péptido heteróclito es superior a la respuesta inmunitaria inferior a la respuesta a la vacunación con el péptido original. En otra modalidad, un péptido heteróclito de la presente invención es un péptido heteróclito de HLA de clase I. Los métodos para identificar residuos de HLA de clase I y de clase II, y para mejorar la unión a HLA mediante la mutación de los residuos, se conocen bien en la técnica, como se describe más abajo.

En otra modalidad, un péptido heteróclito de la presente invención induce una respuesta inmunitaria que aumenta al menos 2 veces con respecto al péptido WT1 a partir del que se deriva el péptido heteróclito ("péptido nativo"). En otra modalidad, el aumento es de 3 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 5 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 7 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 10 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 15 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 20 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 30 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 50 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 100 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 150 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 200 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 300 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 500 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de 1000 veces con respecto al péptido nativo. En otra modalidad, el aumento es de más de 1000 veces con respecto al péptido nativo.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido heteróclito para HLA de clase II derivado a partir de un péptido WT1 aislado de la presente invención. En otra modalidad, el proceso de derivación comprende introducir una mutación que potencia la unión del péptido a una molécula HLA de clase II. En otra modalidad, el proceso de derivación consiste en introducir una mutación que potencia la unión del péptido a una molécula HLA de clase I. En otra modalidad, la mutación es en un residuo de anclaje a HLA de clase II. En otra modalidad, un péptido heteróclito de clase II de la presente invención se identifica y prueba de una manera análoga a la identificación y prueba de péptidos heteróclitos de HLA de clase I, como se ejemplifica en la presente descripción.

En otra modalidad, el sitio de unión a HLA de clase II en un péptido de la presente invención se crea o mejora mediante la mutación de un residuo de anclaje a motivo de HLA de clase II. En otra modalidad, el residuo de anclaje que se modifica está en la posición P1. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P2. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P6. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P9. En otra modalidad, el residuo de anclaje se selecciona de las posiciones P1, P2, P6 y P9. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P3. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P4. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P5. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P6. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P8. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P10. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P11. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P12. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P13. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en cualquier otro residuo de anclaje de una molécula HLA de clase II que se conoce en la técnica. En otra modalidad, otros residuos distintos de P1, p2, P6 y P9 sirven como residuos de anclaje secundarios; por lo tanto, mutarlos puede mejorar la unión a HLA de clase II.

En otra modalidad, se genera un péptido heteróclito mediante la introducción de una mutación que crea un motivo de anclaje. "Motivos de anclaje" o "residuos de anclaje" se refieren, en otra modalidad, a 1 o un conjunto de residuos preferidos en posiciones particulares en una secuencia de unión a HLA.

La secuencia de unión a HLA es una secuencia de unión a HLA de clase II. En otra modalidad, la secuencia de unión a HLA es una secuencia de unión a HLA de clase I. En otra modalidad, las posiciones correspondientes a los motivos de anclaje son aquellas que desempeñan un papel significativo en la unión a la molécula HLA. En otra modalidad, el residuo de anclaje es un motivo de anclaje primario. En otra modalidad, el residuo de anclaje es un motivo de anclaje secundario.

Los métodos para predecir epítopos de MHC de clase I y II se conocen bien en la técnica. En una modalidad, es útil el programa informático de la Bioinformatics & Molecular Analysis Section (National Institutes of Health, Washington, d C) disponible en http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken parker comboform. Este programa informático clasifica los péptidos de 9-mer o 10-mer en un coeficiente de disociación de medio tiempo predicho a partir de moléculas HLA de clase I (Pinilla, y otros, Curr Opin Immunol, 11 (2): p. 193-202 (1999)). En otra modalidad, el epítopo del MHC de clase II se predice mediante el uso de TEPITOPE (Meister GE, Roberts Cg y otros, Vaccine 1995 13: 581-91). En otra modalidad, el epítopo del MHC de clase II se predice mediante el uso de EpiMatrix (De Groot AS, Jesdale BM y otros, AIDS Res Hum Retroviruses 199713: 529-31). En otra modalidad, el epítopo del MHC de clase II se predice mediante el uso del método Predict (Yu K, Petrovsky N y otros, Mol Med. 2002 8: 137-48). En otra modalidad, el epítopo del MHC de clase II se predice mediante el uso del algoritmo de predicción de epítopo SYFPEITHI (Ejemplos). En otra modalidad, el epítopo del MHC de clase II se predice mediante el uso de Rankpep. En otra modalidad, el epítopo del MHC de clase II se predice mediante el uso de cualquier otro método conocido en la técnica.

En otra modalidad, en el caso de péptidos de unión a HLA de clase II (por ejemplo, péptidos de unión a HLA-DR), el residuo de anclaje que se modifica está en la posición P1. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P2. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P6. En otra modalidad, el residuo de anclaje está en la posición P9. En otras modalidades, el residuo de anclaje está en la posición P3, P4, P5, P6, P8, P10, P11, P12 o P13. En otra modalidad, el residuo de anclaje es cualquier otro residuo de anclaje de una molécula HLA de clase II que se conoce en la técnica. En otra modalidad, otros residuos distintos de P1, P2, P6 y P9 sirven como residuos de anclaje secundarios; por lo tanto, mutarlos puede mejorar la unión a HLA de clase II. En otra modalidad, se muta cualquier combinación de los residuos anteriores.

En otra modalidad, un péptido WT1 de la presente invención se une a 2 moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, el péptido se une a tres moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, el péptido se une a cuatro moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, el péptido se une a cinco moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, el péptido se une a seis moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, el péptido se une a más de seis moléculas HLA de clase II distintas.

En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II que están unidas por un péptido WT1 de la presente invención se codifican por dos o más alelos distintos en un locus de HLA de clase II dado. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II se codifican por 3 alelos distintos en un locus. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II se codifican por 4 alelos distintos en un locus. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II se codifican por 5 alelos distintos en un locus. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II se codifican por 6 alelos distintos en un locus. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II se codifican por más de seis alelos distintos en un locus.

En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II unidas por el péptido WT1 se codifican por genes de HLA de clase II en 2 loci distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA unidas se codifican por genes de HLA de clase II en 2 o más loci distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA unidas se codifican por genes de HLA de clase II en 3 loci distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA unidas se codifican por genes de HLA de clase II en 3 o más loci distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA unidas se codifican por genes de HLA de clase II en 4 loci distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA unidas se codifican por genes de HLA de clase II en 4 o más loci distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA unidas se codifican por genes de HLA de clase II en más de 4 loci distintos. En otras modalidades, los loci se seleccionan del loci HLA-DRB. En otra modalidad, el péptido de unión a HLA de clase II es un péptido de unión a HLA-DRA. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DQA1. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DQB 1. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DPA1. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DPB 1. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DMA. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DMB. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DOA. En otra modalidad, el péptido es un péptido de unión a HLA-DOB. En otra modalidad, el péptido se une a cualquier otra molécula HLA de clase II conocida en la técnica.

En otra modalidad, un péptido WT1 de la presente invención se une a 2 moléculas HLA-DRB distintas. En otra modalidad, el péptido se une a 3 moléculas HLA-DRB distintas. En otra modalidad, el péptido se une a 4 moléculas HLA-DRB distintas. En otra modalidad, el péptido se une a 5 moléculas HLA-DRB distintas. En otra modalidad, el péptido se une a 6 moléculas HLA-DRB distintas. En otra modalidad, el péptido se une a más de 6 moléculas HLA-d Rb distintas.

En otra modalidad, un péptido WT1 de la presente invención se une a moléculas HLA-DRB que se codifican por 2 alelos de HLA-DRB distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA-DRB se codifican por 3 alelos de HLA-DRB distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA-DRB se codifican por 4 alelos de h LA-DRB distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA-DRB se codifican por 5 alelos de HLA-DRB distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA-DRB se codifican por 6 alelos de HLA-DRB distintos. En otra modalidad, las moléculas HLA-DRB se codifican por más de 6 alelos de HLA-DRB distintos.

En otra modalidad, un péptido WT1 de la presente invención se une a moléculas HLA-DRB que se codifican por 2 alelos de HLA-DRB distintos seleccionados de DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 y DRB 1501. En otra modalidad, el péptido WT1 se une a moléculas HLA-DRB codificadas por 3 alelos de HLA-DRB distintos seleccionados de d Rb 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 y DRB 1501. En otra modalidad, el péptido WT1 se une a moléculas HLA-DRB codificadas por 4 alelos de HLA-DRB distintos seleccionados de DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 y DRB 1501. En otra modalidad, el péptido WT1 se une a moléculas HLA-DRB codificadas por 5 alelos de HLA-DRB distintos seleccionados de DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101, DRB 1104 y DRB 1501. En otra modalidad, el péptido WT1 se une a moléculas HLA-DRB codificadas por cada uno de los siguientes alelos de HLA-DRB: DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 y DRB 1501.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende 2 péptidos WT1 distintos de la presente invención. En otra modalidad, los 2 péptidos WT1 distintos son ambos no alterados. En otra modalidad, 1 de los péptidos WT1 es no alterado, mientras que el otro es heteróclito. En otra modalidad, ambos péptidos WT1 son heteróclitos.

En otra modalidad, la composición comprende 3 péptidos WT1 distintos de la presente invención. En otra modalidad, la composición comprende 4 péptidos WT1 distintos de la presente invención. En otra modalidad, la composición comprende 5 péptidos WT1 distintos de la presente invención. En otra modalidad, la composición comprende más de 5 péptidos WT1 aislados distintos de la presente invención.

En otra modalidad, 2 de los péptidos WT1 en la composición son no alterados. En otra modalidad, 2 de los péptidos WT1 en la composición son heteróclitos. En otra modalidad, 2 de los péptidos WT1 en la composición son no alterados y 2 son heteróclitos. En otra modalidad, más de 2 de los péptidos WT1 en la composición son no alterados. En otra modalidad, más de 2 de los péptidos WT1 en la composición son heteróclitos. En otra modalidad, más de 2 de los péptidos WT1 en la composición son no alterados y más de 2 son heteróclitos.

En otra modalidad, 1 de los péptidos WT1 adicionales en una composición de la presente invención tiene una secuencia seleccionada de las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 y 55. En otra modalidad, 2 de los péptidos WT1 adicionales tienen una secuencia seleccionada de las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 y 55. En otra modalidad, 3 de los péptidos WT1 adicionales tienen una secuencia seleccionada de las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 y 55.

En otra modalidad, cualquier otro péptido WT1 inmunogénico conocido en la técnica se utiliza como un péptido WT1 adicional. En otra modalidad, se utiliza cualquier combinación de péptidos WT1 inmunogénicos conocidos en la técnica. Las fuentes no limitantes de otros péptidos WT1 incluyen los documentos WO2005053618, WO2007047764 y WO2007120673.

En otra modalidad, una composición de la presente invención contiene 2 péptidos heteróclitos de HLA de clase II que se derivan a partir del mismo péptido WT1 aislado de la presente invención. En otra modalidad, los 2 péptidos heteróclitos de HLA de clase II contienen mutaciones en diferentes residuos de anclaje a moléculas HLA de clase II. En otra modalidad, los 2 péptidos heteróclitos de HLA de clase II contienen diferentes mutaciones en los mismos residuos de anclaje. En otra modalidad, 2 de los péptidos heteróclitos de HLA de clase II se derivan a partir de diferentes péptidos WT1 aislados de la presente invención.

En otra modalidad, 2 péptidos WT1 de la presente invención, o los péptidos WT1 que corresponden a dos péptidos heteróclitos de HLA de clase II de la presente invención, se solapan entre sí. En otra modalidad, el solapamiento entre los péptidos es de al menos 7 aminoácidos (AA). En otra modalidad, el solapamiento es de al menos 8 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de al menos 9 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 7 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 8 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 9 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 10 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 11 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 12 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 13 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 14 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 15 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de 16 AA. En otra modalidad, el solapamiento es de más de 16 AA.

En otra modalidad, los péptidos en una composición de la presente invención se unen a 2 moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, los péptidos se unen a 3 moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, los péptidos se unen a 4 moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, los péptidos se unen a 5 moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, los péptidos se unen a más de 5 moléculas HLA de clase II distintas. En otra modalidad, los péptidos de la composición se unen a las mismas moléculas HLA de clase II.

En otra modalidad, cada uno de los péptidos WT 1 en una composición de la presente invención se une a un conjunto de moléculas HLA de clase II. En otra modalidad, cada uno de los péptidos WT1 se une a un conjunto de moléculas HLA de clase II distinto. En otra modalidad, los péptidos WT1 en la composición se unen al mismo conjunto de moléculas HLA de clase II. En otra modalidad, 2 de los péptidos WT1 se unen a un conjunto de moléculas HLA de clase II distinto pero solapado. En otra modalidad, 2 o más de los péptidos WT1 se unen al mismo conjunto de moléculas HLA de clase II, mientras que otro de los péptidos WT1 se une a un conjunto distinto. En otra modalidad, 2 o más de los péptidos WT1 se unen a un conjunto de moléculas HLA de clase II solapado, mientras que otro de los péptidos WT1 se une a un conjunto distinto.

En otra modalidad, 2 o más de los péptidos WT1 en una composición de la presente invención se unen cada uno a más de 1 molécula HLA-DRB. En otra modalidad, las 4 o más moléculas HLA-DRB unidas por los péptidos en la composición son distintas entre sí. En otra modalidad, las moléculas HLA-DRB se codifican por diferentes alelos de HLA-DRB.

En otra modalidad, 2 o más de las moléculas HLA de clase II unidas por péptidos WT1 en una composición de la presente invención son moléculas HLA-DRB. En otra modalidad, 3 o más de las moléculas HLA de clase II que se unen son moléculas HLA-DRB. En otras modalidades, las moléculas HLA de clase II que se unen pueden ser cualquiera de las moléculas HLA de clase II enumeradas en la presente descripción. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II que se unen se codifican por 2 o más alelos de HLA de clase II distintos en un locus dado. En otra modalidad, las moléculas HLA de clase II que se unen se codifican por genes de HLA de clase II en 2 o más loci distintos.

En otra modalidad, un "conjunto de moléculas HLA de clase II" se refiere a las moléculas HLA de clase II codificadas por diferentes alelos en un locus particular. En otra modalidad, el término se refiere a moléculas HLA de clase II con una especificidad de unión particular. En otra modalidad, el término se refiere a moléculas HLA de clase II con una secuencia consenso peptídica particular. En otra modalidad, el término se refiere a una superfamilia de moléculas HLA de clase II.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido WT1 de unión a moléculas HLA de clase II no alterado de la presente invención y un segundo péptido WT1 de unión a moléculas HLA de clase I. En otra modalidad, la composición comprende más de 1 péptido Wt 1 de unión a moléculas HLA de clase II de la presente invención, además del péptido WT1 de unión a moléculas HLA de clase I. En otra modalidad, la composición comprende más de 1 péptido WT1 de unión a moléculas HLA de clase I, además del péptido WT1 de unión a moléculas HLA de clase II.

En otra modalidad, la secuencia de AA del otro péptido WT1 de unión a moléculas HLA de clase I comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41,42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 y 55. En otra modalidad, la secuencia de AA del otro péptido WT1 de unión a la molécula HLA de clase I se selecciona de las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50 y 55.

En otra modalidad, el péptido WT1 de unión a la molécula HLA de clase I es un péptido heteróclito de HLA de clase I. En otra modalidad, el péptido WT1 de unión a la molécula HLA de clase I contiene una mutación en un residuo de anclaje de la molécula HLA de clase I del mismo, como se describe más adelante en la presente descripción. Como se proporciona en la presente descripción, los péptidos derivados de WT1 se modificaron en residuos de anclaje a HLA para generar péptidos heteróclitos con un aumento de la unión predicha a HLA-A0201 y HLA-A0301. Los péptidos con un aumento de la unión predicha también mostraron una capacidad mejorada para unirse a moléculas HLA de clase I y una mayor inmunogenicidad.

En otra modalidad, la mutación que potencia la unión a MHC está en el residuo en la posición 1 del péptido heteróclito de HLA de clase I. En otra modalidad, el residuo se cambia a tirosina. En otra modalidad, el residuo se cambia a glicina. En otra modalidad, el residuo se cambia a treonina. En otra modalidad, el residuo se cambia a fenilalanina. En otra modalidad, el residuo se cambia a cualquier otro residuo conocido en la técnica. En otra modalidad, una sustitución en la posición 1 (por ejemplo, a tirosina) estabiliza la unión del residuo de anclaje de la posición 2.

En otra modalidad, la mutación es en la posición 2 del péptido heteróclito de HLA de clase I. En otra modalidad, el residuo se cambia a leucina. En otra modalidad, el residuo se cambia a valina. En otra modalidad, el residuo se cambia a isoleucina. En otra modalidad, el residuo se cambia a metionina. En otra modalidad, el residuo se cambia a cualquier otro residuo conocido en la técnica.

En otra modalidad, la mutación está en la posición 6 del péptido heteróclito de HLA de clase I. En otra modalidad, el residuo se cambia a valina. En otra modalidad, el residuo se cambia a cisteína. En otra modalidad, el residuo se cambia a glutamina. En otra modalidad, el residuo se cambia a histidina. En otra modalidad, el residuo se cambia a cualquier otro residuo conocido en la técnica.

En otra modalidad, la mutación está en la posición 9 del péptido heteróclito de HLA de clase I. En otra modalidad, la mutación cambia el residuo en la posición C-terminal del mismo. En otra modalidad, el residuo se cambia a valina. En otra modalidad, el residuo se cambia a treonina. En otra modalidad, el residuo se cambia a isoleucina. En otra modalidad, el residuo se cambia a leucina. En otra modalidad, el residuo se cambia a alanina. En otra modalidad, el residuo se cambia a cisteína. En otra modalidad, el residuo se cambia a cualquier otro residuo conocido en la técnica.

En otra modalidad, la mutación puntual está en un residuo de anclaje primario. En otra modalidad, los residuos de anclaje primario a HLA de clase I están en las posiciones 2 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en un residuo de anclaje secundario. En otra modalidad, los residuos de anclaje secundario a HLA de clase I están en las posiciones 1 y 8. En otra modalidad, los residuos de anclaje secundario a HLA de clase I están en las posiciones 1, 3, 6, 7 y 8. En otra modalidad, la mutación puntual está en una posición seleccionada de las posiciones 4, 5 y 8.

En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 1, 2, 8 y 9 del motivo de unión a HLA de clase I. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 1, 3, 6 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 1, 2, 6 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 1, 6 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 1, 2 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 1, 3 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 2 y 9. En otra modalidad, la mutación puntual está en 1 o más residuos en posiciones seleccionadas de las posiciones 6 y 9.

En otra modalidad, el péptido WT de unión a la molécula HLA de clase I tiene una longitud de 9 AA. En otra modalidad, el péptido tiene una longitud de 10 AA. Como se proporciona en la presente descripción, los péptidos nativos y heteróclitos de 9-10 AA exhibieron una unión sustancial a moléculas HLA de clase I y capacidad para provocar la secreción de citocinas y la citolisis por CTL.

En otra modalidad, la molécula HLA de clase I que se une por el péptido WT1 que se une a la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-A. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-A2. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-A3. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-A1 1. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-B 8. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I es una molécula HLA-0201. En otra modalidad, la molécula HLA de clase I se une a cualquier otra molécula HLA de clase I conocida en la técnica.

En otra modalidad, un péptido WT1 de la presente invención tiene una longitud de 9-11 aminoácidos (AA). En otra modalidad, el péptido varía en tamaño de 9-18, o en otra modalidad, de 9-15, o en otra modalidad, de 9-11 AA de longitud. En otra modalidad, el péptido es de 9 AA o en otra modalidad, de 10 AA o en otra modalidad, de 12 AA de longitud, o en otra modalidad, cualquier longitud entre ellos.

En otra modalidad, un péptido de la presente invención es una variante de longitud de un péptido enumerado en los Ejemplos. En otra modalidad, la variante de longitud es un aminoácido (AA) más corta que el péptido de los Ejemplos. En otra modalidad, la variante de longitud es dos AA más corta que el péptido de los Ejemplos. En otra modalidad, la variante de longitud es más de dos AA más corta que el péptido de los Ejemplos. En otra modalidad, el péptido más corto está truncado en el extremo N-terminal. En otra modalidad, el péptido más corto está truncado en el extremo C-terminal. En otra modalidad, el péptido truncado está truncado tanto en el extremo N-terminal como en el C-terminal. Los péptidos son, en otra modalidad, susceptibles de truncamiento sin cambiar la afinidad por las moléculas HLA, como se conoce bien en la técnica.

En otra modalidad, la variante de longitud es más larga que un péptido enumerado en los Ejemplos de la presente invención. En otra modalidad, el péptido más largo se extiende en el extremo N-terminal de acuerdo con la secuencia de WT1 circundante. Los péptidos son, en otra modalidad, susceptibles de extensión en el extremo N-terminal sin cambiar la afinidad por las moléculas HLA, como se conoce bien en la técnica. Por lo tanto, dichos péptidos son equivalentes de los péptidos enumerados en los ejemplos. En otra modalidad, el péptido extendido N-terminal se extiende por un residuo. En otra modalidad, el péptido extendido N-terminal se extiende por dos residuos. En otra modalidad, el péptido extendido N-terminal se extiende por tres residuos. En otra modalidad, el péptido extendido N-terminal se extiende por más de tres residuos.

En otra modalidad, el péptido más largo se extiende en el extremo C terminal de acuerdo con la secuencia de WT1 circundante. En otra modalidad, los péptidos son susceptibles de extensión en el extremo C-terminal sin cambiar la afinidad por las moléculas HLA, como se conoce bien en la técnica. Por lo tanto, dichos péptidos son equivalentes de los péptidos enumerados en los Ejemplos de la presente invención. En otra modalidad, el péptido extendido C-terminal se extiende por un residuo. En otra modalidad, el péptido extendido C-terminal se extiende por dos residuos. En otra modalidad, el péptido extendido C-terminal se extiende por tres residuos. En otra modalidad, el péptido extendido C-terminal se extiende por más de tres residuos.

En otra modalidad, el péptido extendido se extiende tanto en el extremo N-terminal como en el C-terminal de acuerdo con la secuencia WT1 circundante.

En otra modalidad, un péptido truncado de la presente invención retiene los residuos de anclaje a HLA (por ejemplo, los residuos de anclaje a HLA de clase I) en el segundo residuo y el residuo C-terminal, con un número menor de residuos intermedios (por ejemplo, 5) que un péptido enumerado en los Ejemplos de la presente invención. Los péptidos son, en otra modalidad, susceptibles de dicha mutación sin cambiar la afinidad por las moléculas HLA. En otra modalidad, dicho péptido truncado se diseña mediante la eliminación de uno de los residuos intermedios de una de las secuencias anteriores. En otra modalidad, los residuos de anclaje a HLA se retienen en el segundo y octavo residuos. En otra modalidad, los residuos de anclaje a HLA se retienen en el primer y octavo residuos.

En otra modalidad, un péptido extendido de la presente invención retiene los residuos de anclaje a HLA (por ejemplo, los residuos de anclaje a HLA de clase I) en el segundo residuo y el residuo C-terminal, con un número mayor de residuos intermedios (por ejemplo, 7 u 8) que un péptido enumerado en los Ejemplos de la presente invención. En otra modalidad, dicho péptido extendido se diseña mediante la adición de uno o más residuos entre dos de los residuos intermedios de una de las secuencias anteriores. Se conoce bien en la técnica que pueden eliminarse o añadirse residuos entre las secuencias intermedias de péptidos de unión a HLA sin cambiar la afinidad por HLA. Por lo tanto, dichos péptidos son equivalentes de los péptidos enumerados en los Ejemplos de la presente invención. En otra modalidad, los residuos de anclaje a HLA se retienen en el segundo y noveno residuos. En otra modalidad, los residuos de anclaje a HLA se retienen en el primer y octavo residuos. En otra modalidad, los residuos de anclaje a HLA se retienen en los dos residuos separados por seis residuos intermedios.

"Fragmento", en otra modalidad, se refiere a un péptido de 11 o más AA de longitud. En otra modalidad, un péptido de la presente invención tiene una longitud de 16 Aa . En otra modalidad, el péptido tiene una longitud de 12 AA. En otra modalidad, el péptido es de 13 AA. En otra modalidad, el péptido es de 14 AA. En otra modalidad, el péptido es de 15 o más AA. En otra modalidad, el péptido es de 17 AA.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido de esta invención. En otra modalidad, la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la composición comprende además un adyuvante. En otra modalidad, la composición comprende 2 o más péptidos de la presente invención. En otra modalidad, la composición comprende además cualquiera de los aditivos, compuestos o excipientes que se establecen más abajo. En otra modalidad, el adyuvante es KLH, QS21, adyuvante completo o incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, BCG o alumbre. En otras modalidades, el portador es cualquier portador enumerado en la presente descripción. En otras modalidades, el adyuvante es cualquier adyuvante enumerado en la presente descripción.

En otra modalidad, esta invención proporciona una vacuna que comprende un péptido de esta invención. En otra modalidad, esta invención proporciona una vacuna que comprende una célula presentadora de antígeno (APC) y un péptido de esta invención. En otra modalidad, la vacuna comprende además un portador. En otra modalidad, la vacuna comprende además un adyuvante. En otra modalidad, la vacuna comprende además una APC. En otra modalidad, la vacuna comprende además una combinación de más de 1 de un antígeno, portador y/o APC. En otra modalidad, la vacuna es una composición basada en células.

En otra modalidad, el término "vacuna" se refiere a un material o composición que, cuando se introduce en un sujeto, proporciona una respuesta profiláctica o terapéutica para una enfermedad, afección o síntoma particular de las mismas. En otra modalidad, esta invención comprende vacunas basadas en péptidos, en donde el péptido comprende cualquier modalidad enumerada en la presente descripción, lo que incluye compuestos inmunomoduladores tales como citocinas, adyuvantes, etc.

En otra modalidad, una vacuna de la presente invención comprende además un adyuvante. En otra modalidad, el adyuvante es Montanide ISA 51. Montanide ISA 51 contiene un aceite metabolizable natural y un emulsionante refinado. En otra modalidad, el adyuvante es GM-CSF. GM-CSF recombinante es una proteína humana cultivada, en otra modalidad, en un vector de levadura (S. cerevisiae). GM-CSF promueve la expansión clonal y la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas, APC y células dendríticas y células T.

En otra modalidad, el adyuvante es una citocina. En otra modalidad, el adyuvante es un factor de crecimiento. En otra modalidad, el adyuvante es una población celular. En otra modalidad, el adyuvante es QS21. En otra modalidad, el adyuvante es el adyuvante incompleto de Freund. En otra modalidad, el adyuvante es fosfato de aluminio. En otra modalidad, el adyuvante es hidróxido de aluminio. En otra modalidad, el adyuvante es BCG. En otra modalidad, el adyuvante es alumbre.

En otra modalidad, el adyuvante es una interleucina. En otra modalidad, el adyuvante es una quimiocina. En otra modalidad, el adyuvante es cualquier otro tipo de adyuvante conocido en la técnica. En otra modalidad, la vacuna WT1 comprende dos de los adyuvantes anteriores. En otra modalidad, la vacuna WT1 comprende más de dos de los adyuvantes anteriores.

En otras modalidades, una vacuna o composición de la presente invención puede comprender cualquiera de las modalidades de péptidos WT1 de la presente invención y combinaciones de los mismos.

Debe entenderse que cualquiera de las modalidades descritas en la presente descripción, con respecto a péptidos, vacunas y composiciones de esta invención, puede emplearse en cualquiera de los usos médicos de esta invención.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con un MDS.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en la supresión o la detención de la progresión de un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en la reducción de la incidencia de un cáncer que expresa WT1 en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en la reducción de la incidencia de una AML.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en la reducción de la incidencia de recaída de un cáncer que expresa WT1 en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en la reducción de la incidencia de recaída de una AML en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna WT1 de la presente invención para su uso en la ruptura de la tolerancia de las células T a un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa WT1, que comprende (a) inducir en un donante la formación y proliferación de linfocitos T citotóxicos humanos (CTL) que reconocen una célula maligna del cáncer mediante un método descrito en la presente descripción; y (b) infundir el CTL humano en el sujeto, y tratar de esta manera a un sujeto que tiene un cáncer.

En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa WT 1, que comprende (a) inducir la formación y proliferación ex vivo de CTL humanos que reconocen una célula maligna del cáncer mediante un método descrito en la presente descripción, en donde las células inmunitarias humanas se obtienen a partir de un donante; y (b) infundir el CTL humano en el sujeto, y tratar de esta manera a un sujeto que tiene un cáncer.

Los métodos para la inmunoterapia ex vivo se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente de EE. UU. núms. de serie 2006/0057130, 2005/0221481, 2005/0214268, 2003/0175272, 2002/0127718 y la patente de EE. UU. núm. 5,229,115. Se conocen bien en la técnica métodos adicionales y se describen, por ejemplo, en Davis ID y otros, (Blood dendritic cells generated with Flt3 ligand and CD40 ligand prime CD8+ T cells efficiently in cancer patients. J Immunother. 2006 Sep-Oct;29(5):499-511) y Mitchell MS y otros, (The cytotoxic T cell response to peptide analogs of the HLA-A*0201 - restricted MUC1 signal sequence epitope, M1.2. Cancer Immunol Immunother.

28 de julio de 2006).

En otra modalidad, la presente solicitud describe un método para inducir la formación y proliferación de CTL específicos para células de un cáncer que expresa WT1, el método comprende poner en contacto una población de linfocitos con una vacuna de la presente invención. En otra modalidad, la vacuna es una APC asociada con un péptido de la presente invención. En otra modalidad, la vacuna es una APC asociada con una mezcla de péptidos de la presente invención.

Por lo tanto, en otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido de la invención o una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico para inducir in vitro la formación y proliferación de CTL específicos para células de un cáncer que expresa WT1.

En otra modalidad, esta invención proporciona una vacuna de la presente invención para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria heteróclita dirigida contra un cáncer que expresa WT1 en un sujeto.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un péptido de la invención para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria anti-mesotelioma en un sujeto. En otra modalidad, el mesotelioma es un mesotelioma maligno.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula de nucleótidos que codifica un péptido de la invención para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria antimesotelioma en un sujeto. En otra modalidad, el mesotelioma es un mesotelioma maligno.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un péptido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con un mesotelioma. En otra modalidad, el mesotelioma es un mesotelioma maligno.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula de nucleótidos que codifica un péptido de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto con mesotelioma. En otra modalidad, el mesotelioma es un mesotelioma maligno.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un péptido de la invención para su uso en la reducción de la incidencia de un mesotelioma, o su recaída, en un sujeto. En otra modalidad, el mesotelioma es un mesotelioma maligno.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula de nucleótidos que codifica un péptido de la invención para su uso en la reducción de la incidencia de un mesotelioma, o su recaída, en un sujeto. En otra modalidad, el mesotelioma es un mesotelioma maligno.

En otra modalidad, una célula objetivo de una respuesta inmunitaria provocada por un péptido de la presente invención presenta el péptido WT1 de la presente invención, o un fragmento WT1 correspondiente, en una molécula HLA. En otra modalidad, la molécula HLA es una molécula HLA de clase I. En otras modalidades, la molécula HLA es cualquier subtipo de HLA de clase I o molécula HLA de clase I conocido en la técnica. En otra modalidad, la respuesta inmunitaria contra el péptido o fragmento WT1 es una respuesta inmunitaria heteróclita.

En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es una leucemia mielógena aguda (AML). En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 se asocia con un síndrome mielodisplásico (MDS). En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un MDS. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor de Wilms. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es una leucemia. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer hematológico. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un linfoma. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un mesotelioma. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un mesotelioma maligno. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer gástrico. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de colon. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de pulmón. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de mama. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un tumor de células germinales. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de ovario. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer uterino. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT 1 es un cáncer de tiroides. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un carcinoma hepatocelular. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de tiroides. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer de hígado. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un cáncer renal. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un sarcoma de Kaposi. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es un sarcoma. En otra modalidad, el cáncer que expresa WT1 es cualquier otro carcinoma o sarcoma.

En otra modalidad, se sospecha que un cáncer o tumor a tratar mediante la presente invención expresa WT1. En otra modalidad, la expresión de WT1 no se ha verificado mediante la prueba de la muestra de tumor real. En otra modalidad, el cáncer o tumor es de un tipo que se conoce que expresa WT1 en muchos casos. En otra modalidad, el tipo expresa WT1 en la mayoría de los casos.

Cualquiera de las modalidades enumeradas en la presente descripción, con respecto a péptidos, vacunas y composiciones de esta invención, puede emplearse en cualquiera de los usos médicos de esta invención.

En otra modalidad, se usan múltiples péptidos de esta invención para estimular una respuesta inmunitaria en los métodos de la presente invención.

Los expertos en la técnica entenderán que los métodos descritos en la presente descripción permiten el diseño de otros péptidos derivados de WT1. Los métodos permiten además el diseño de péptidos que se unen a otras moléculas HLA. Los métodos permiten además el diseño de vacunas que combinan péptidos derivados de WT1 de la presente invención.

En otra modalidad, las vacunas de la presente invención tienen la ventaja de activar o provocar células T CD4<+> específicas para WT1 que contienen una variedad de alelos de HLA de clase II diferentes. En otra modalidad, las vacunas tienen la ventaja de activar o provocar células T CD4<+> específicas para WT1 en una proporción sustancial de la población (por ejemplo, en diferentes modalidades, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75%, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o superior al 95 %). En otra modalidad, las vacunas activan o provocan células T CD4<+> específicas de WT1 en una proporción sustancial de una población particular (por ejemplo, caucásicos americanos).

En otra modalidad, los tratamientos de la presente invención proporcionan una mejora en una respuesta inmunitaria que ya se ha montado por un sujeto. En otra modalidad, los tratamientos de la presente invención comprenden administrar el péptido, la composición o la vacuna 2 o más veces. En otra modalidad, los péptidos varían en su composición, concentración o una combinación de las mismas. En otra modalidad, los péptidos proporcionan el inicio de una respuesta inmunitaria contra un antígeno de interés en un sujeto que aún no ha iniciado una respuesta inmunitaria contra el antígeno. En otra modalidad, los CTL que se inducen proliferan en respuesta a la presentación del péptido en la APC o célula cancerosa. En otras modalidades, la referencia a la modulación de la respuesta inmunitaria implica, uno o ambos de los brazos humoral y celular del sistema inmunitario, que se acompaña de la presencia de células T auxiliares Th2 y Th1, respectivamente, o en otra modalidad, cada brazo individualmente.

En otras modalidades, los tratamientos que afectan el crecimiento de un tumor dan como resultado (1) la inhibición directa de la división de las células tumorales, o (2) la lisis de las células tumorales mediada por células inmunitarias, o ambas, lo que conduce a una supresión de la expansión neta de las células tumorales.

La inhibición del crecimiento tumoral por cualquiera de estos dos mecanismos puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica basado en varios métodos bien conocidos. En otra modalidad, la inhibición tumoral se determina al medir el tamaño real del tumor durante un período de tiempo. En otra modalidad, la inhibición tumoral puede determinarse al estimar el tamaño de un tumor (durante un período de tiempo) mediante el uso de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Más específicamente, puede utilizarse una variedad de métodos de obtención de imágenes radiológicas (por ejemplo, tomografía computarizada por emisión de positrones y fotón único; ver en general, "Nuclear Medicine in Clinical Oncology ", Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, Nueva York, 1986), para estimar el tamaño del tumor. Dichos métodos también pueden utilizar una variedad de agentes de obtención de imágenes, lo que incluye, por ejemplo, agentes de obtención de imágenes convencionales (por ejemplo, citrato de galio-67), así como también reactivos especializados para la obtención de imágenes de metabolitos, la obtención de imágenes de receptores o la obtención de imágenes inmunológicas (por ejemplo, marcadores tumorales específicos de anticuerpos monoclonales radiomarcados). Además, también pueden utilizarse métodos no radiactivos tales como el ultrasonido (ver, "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff y Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, Nueva York, 1984), para estimar el tamaño de un tumor.

Además de los métodos in vivo para determinar la inhibición tumoral discutidos anteriormente, pueden utilizarse una variedad de métodos in vitro para predecir la inhibición tumoral in vivo. Los ejemplos representativos incluyen la actividad citolítica antitumoral mediada por linfocitos determinada, por ejemplo, mediante un ensayo de liberación de <51>Cr (Ejemplos), proliferación de linfocitos dependiente del tumor (Ioannides, y otros, J. Immunol. 146(5):1700-1707, 1991), generación in vitro de anticuerpos específicos de tumores (Herlyn, y otros, J. Immunol. Meth. 73:157-167, 1984), inhibición del crecimiento celular in vitro mediado por células (por ejemplo, CTL, células T auxiliares) o humoral (por ejemplo, anticuerpos) (Gazit, y otros, Cancer Immunol Immunother 35:135-144, 1992) y, para cualquiera de estos ensayos, la determinación de la frecuencia del precursor celular (Vose, Int. J. Cancer 30:135-142 (1982), y otros.

En otra modalidad, los métodos para suprimir el crecimiento tumoral indican un estado de crecimiento que se reduce en comparación con el crecimiento sin contacto con, o exposición a un péptido de esta invención. El crecimiento de las células tumorales puede evaluarse por cualquier medio conocido en la técnica, lo que incluye, pero no se limita a, medir el tamaño del tumor, determinar si las células tumorales proliferan mediante el uso de un ensayo de incorporación de <3>H-timidina o mediante el conteo de las células tumorales. "Suprimir" el crecimiento de células tumorales se refiere, en otras modalidades, a ralentizar, retrasar o detener el crecimiento del tumor o a la reducción del tumor.

En otra modalidad, se mide la expresión de WT1. En otra modalidad, se mide la expresión del transcrito de WT1. En otra modalidad, se miden los niveles de proteína WT1 en el tumor.

Los métodos para determinar la presencia y la magnitud de una respuesta inmunitaria se conocen bien en la técnica. En otra modalidad, los ensayos de proliferación de linfocitos, en donde la captación por células T de una sustancia radiactiva, por ejemplo, <3>H-timidina, se mide como una función de la proliferación celular. En otras modalidades, la detección de la proliferación de células T se logra mediante la medición de los aumentos en la producción de interleucina-2 (IL-2), el flujo de Ca<2+> o la captación de colorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.

En otra modalidad, la estimulación de CTL se determina por medios conocidos por los expertos en la técnica, lo que incluye, detección de proliferación celular, producción de citocinas y otros. El análisis de los tipos y cantidades de citocinas secretadas por las células T al entrar en contacto con objetivos pulsados por ligando puede ser una medida de la actividad funcional. Las citocinas pueden medirse mediante ensayos ELISA o ELISPOT para determinar la tasa y la cantidad total de producción de citocinas. (Fujihashi K. y otros, (1993) J. Immunol. Meth. 160: 181; Tanguay S. y Killion J. J. (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259).

En otra modalidad, la actividad de CTL se determina mediante un ensayo de lisis de liberación de <51>Cr. La lisis de objetivos marcados con <51>Cr pulsados con péptidos por células T específicas de antígeno puede compararse con células objetivo pulsadas con péptido de control. En otra modalidad, las células T se estimulan con un péptido de esta invención y puede determinase la lisis de las células objetivo que expresan el péptido nativo en el contexto del MHC. La cinética de lisis, así como también la lisis global del objetivo en un punto temporal fijado (por ejemplo, 4 horas) se usan, en otra modalidad, para evaluar el desempeño del ligando. (Ware C.F. y otros, (1983) J Immunol 131: 1312).

Los métodos para determinar la afinidad de un péptido por una molécula HLA se conocen bien en la técnica. En otra modalidad, la afinidad se determina mediante ensayos de estabilización de TAP.

En otra modalidad, la afinidad se determina mediante un radioinmunoensayo competitivo. En otra modalidad, se utiliza el siguiente protocolo: las células objetivo se lavan dos veces en PBS con albúmina de suero bovino al 1 % (BSA; Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ). Las células se resuspenden a 10<7>/ml en hielo y los péptidos nativos unidos a la superficie celular se separan durante 2 minutos a 0 [grados.]C mediante el uso de tampón citrato-fosfato en presencia de 3 mg/ml de microglobulina beta2. El sedimento se resuspende a 5 x 10<6> células/ml en PBS/BSA al 1 % en presencia de 3 mg/ml de microglobulina beta2 y 30 mg/ml de desoxirribonucleasa, y se incuban alícuotas de 200 ml en presencia o ausencia de péptidos específicos para HLA durante 10 minutos a 20 <0>C, después con péptido marcado con <125>I durante 30 minutos a 20 <0>C. El <125>I unido total se determina después de dos lavados con PBS/BSA al 2 % y un lavado con PBS. Las afinidades relativas se determinan mediante la comparación de concentraciones crecientes del péptido de prueba frente a un péptido de unión conocido.

En otra modalidad, se realiza un análisis de especificidad de la unión del péptido a HLA en la superficie de células vivas (por ejemplo, células SKLY-16) para confirmar que la unión es a la molécula HLA apropiada y para caracterizar su restricción. Esto incluye, en otra modalidad, la competencia con exceso de péptidos no marcados que se conoce se une a moléculas HLA iguales o distintas y el uso de células objetivo que expresan tipos de HLA iguales o distintos. Este ensayo se realiza, en otra modalidad, en PBMC humanas frescas vivas o fijadas con paraformaldehído al 0,25 %, líneas celulares de leucemia y líneas de células T transformadas con EBV de tipos de h La específicos. La avidez relativa de los péptidos que se encuentra que se unen a moléculas de MHC en las células específicas se analiza mediante ensayos de competencia como se describió anteriormente contra péptidos marcados con <125>I de alta afinidad conocida por la molécula HLA relevante, por ejemplo, tirosinasa o secuencia de péptidos de HBV. En otra modalidad, un péptido de unión a HLA de clase II de los métodos y composiciones de la presente invención es más largo que la longitud mínima para la unión a una molécula HLA de clase II, que es, en otra modalidad, de aproximadamente 12 AA. En otra modalidad, el aumento de la longitud del péptido de unión a HLA de clase II permite la unión a más de una molécula HLA de clase II. En otra modalidad, el aumento de la longitud permite la unión a una molécula HLA de clase II cuyo motivo de unión no se conoce. En otra modalidad, el aumento de la longitud permite la unión a una molécula HLA de clase I. En otra modalidad, se conoce el motivo de unión de la molécula HLA de clase I. En otra modalidad, no se conoce el motivo de unión de la molécula HLA de clase I.

En otra modalidad, los péptidos de la presente invención comprenden un aminoácido no clásico tal como: 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilato (Kazmierski y otros, (1991) J. Am Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-metilfenilalanina, (2S,3R)-metilfenilalanina, (2R,3S)-metil-fenilalanina y (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby (1991) Tetrahedron Lett. 32(41): 5769-5772); ácido 2-aminotetrahidronaftalen-2-carboxílico (Landis (1989) Tesis de Doctorado, Universidad de Arizona); hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilato (Miyake y otros, (1984) J. Takeda Res. Labs. 43:53-76); ácido histidin-isoquinolin-carboxílico (Zechel y otros, (1991) Int. J. Pep. Protein Res.

38(2):131-138); y HIC (histidina ciclo urea), (Dharanipragada y otros, (1993) Int. J. Pep. Protein Res. 42(1):68-77) y ((1992) Acta. Crst., Crystal Struc. Comm. 48(IV): 1239-124).

En otra modalidad, un péptido de esta invención comprende un análogo de AA o peptidomimético que, en otras modalidades, induce o favorece estructuras secundarias específicas. Dichos péptidos comprenden, en otras modalidades, lo siguiente: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), un análogo dipéptido inductor del giro-[beta] (Kemp y otros, (1985) J. Org. Chem. 50:5834-5838); análogos inductores de láminas-[beta] (Kemp y otros, (1988) Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); análogos inductores de giro-[beta] (Kemp y otros, (1988) Tetrahedron Lett.

29:5057-5060); análogos inductores de hélice alfa (Kemp y otros, (1988) Tetrahedron Lett. 29:4935-4938); análogos inductores de giro gamma (Kemp y otros, (1989) J. Org. Chem. 54:109:115); análogos proporcionados por las siguientes referencias: Nagai y Sato (1985) Tetrahedron Lett. 26:647-650; y DiMaio y otros, (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans, pág. 1687; un análogo de giro de Gly-Ala (Kahn y otros, (1989) Tetrahedron Lett. 30:2317); isóstero de enlace amida (Jones y otros, (1988) Tetrahedron Lett. 29(31):3853-3856); tretrazol (Zabrocki y otros, (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen y otros, (1990) Int. J. Protein Pep. Res. 35:501:509); y análogos enseñados en Olson y otros, (1990) J. Am. Chem. Sci. 112:323-333 y Garvey y otros, (1990) J. Org. Chem. 55(3):936-940. Los miméticos conformacionalmente restringidos de giros beta y protuberancias beta, y péptidos que los contienen, se describen en la patente de EE. UU. núm. 5,440,013, emitida el 8 de agosto de 1995 a Kahn.

En otras modalidades, un péptido de esta invención se conjuga con una de diversas otras moléculas, como se describe más abajo, que puede ser a través de un enlace covalente o no covalente (formación de complejo), cuya naturaleza varía, en otra modalidad, en dependencia del propósito particular. En otra modalidad, el péptido forma un complejo covalente o no covalentemente con un portador macromolecular (por ejemplo, un portador inmunogénico), lo que incluye, pero no se limita a, polímeros naturales y sintéticos, proteínas, polisacáridos, polipéptidos (aminoácidos), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y lípidos. En otra modalidad, un péptido de esta invención se une a un sustrato. En otra modalidad, el péptido se conjuga con un ácido graso, para su introducción en un liposoma (Patente de EE. UU. núm. 5,837,249). En otra modalidad, un péptido de la invención forma un complejo covalente o no covalentemente con un soporte sólido, una variedad de los cuales se conocen en la técnica. En otra modalidad, el enlace del péptido al portador, sustrato, ácido graso o soporte sólido sirve para aumentar una respuesta inmunitaria provocada.

En otras modalidades, el portador es tiroglobulina, una albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano), toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli (lisina: ácido glutámico), una proteína de la influenza, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B, hemocianina de lapa californiana, una albúmina u otra proteína portadora o péptido portador; vacuna recombinante del virus de la hepatitis B, o una APC.

En otra modalidad, el término "aminoácido" (AA) se refiere a un AA natural o, en otra modalidad, un AA no natural o sintético, y puede incluir, en otras modalidades, glicina, isómeros ópticos D o L, análogos de AA, peptidomiméticos, o combinaciones de los mismos.

En otra modalidad, los términos "cáncer", "neoplasia", "neoplásico" o "tumor" se usan indistintamente y se refieren a células que han experimentado una transformación maligna que las hace patológicas para el organismo huésped. Las células cancerosas primarias (es decir, las células obtenidas cerca del sitio de transformación maligna) pueden distinguirse fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, en particular el examen histológico. La definición de una célula cancerosa, como se usa en la presente descripción, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino también cualquier célula derivada a partir de un ancestro de la célula cancerosa. Esto incluye células cancerosas metastatizadas y cultivos in vitro y líneas celulares derivadas a partir de células cancerosas. En otra modalidad, un tumor es detectable sobre la base de masa tumoral; por ejemplo, mediante procedimientos tales como tomografía axial computarizada, obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), rayos X, ultrasonido o palpación, y en otra modalidad, se identifica mediante hallazgos bioquímicos o inmunológicos, este último que se usa para identificar células cancerosas, también, en otras modalidades.

Los métodos para sintetizar péptidos se conocen bien en la técnica. En otra modalidad, los péptidos de esta invención se sintetizan mediante el uso de un procedimiento de síntesis en estado sólido apropiado (ver, por ejemplo, Steward y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, California (1968); Merrifield (1967) Recent Progress en Hormone Res 23: 451). La actividad de estos péptidos se prueba, en otras modalidades, mediante el uso de ensayos como se describe en la presente descripción.

En otra modalidad, los péptidos de esta invención se purifican mediante métodos estándar, lo que incluye cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad y de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. En otra modalidad, se usa cromatografía de inmunoafinidad, en la cual se aísla un epítopo mediante la unión a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que se generaron contra ese péptido, o un péptido relacionado de la invención, y se fijaron a un soporte estacionario.

En otra modalidad, las etiquetas de afinidad tales como hexa-His (Invitrogen), dominio de unión a maltosa (New England Biolabs), secuencia de recubrimiento de influenza (Kolodziej y otros, (1991) Meth. Enzymol. 194:508-509), glutatión-S-transferasa u otras, se unen a los péptidos de esta invención para permitir una fácil purificación mediante el paso sobre una columna de afinidad apropiada. Los péptidos aislados también pueden caracterizarse físicamente, en otras modalidades, mediante el uso de técnicas tales como proteólisis, resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos x.

En otra modalidad, los péptidos de esta invención se producen mediante traducción in vitro, mediante técnicas conocidas, como resultará evidente para un experto en la técnica. En otra modalidad, los péptidos se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante fosforilación, glucosilación, entrecruzamiento, acilación, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo, molécula de membrana u otro ligando, (Ferguson y otros, (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:285-320).

En otra modalidad, los péptidos de esta invención comprenden además un marcador detectable, que en otra modalidad, es fluorescente, o en otra modalidad, luminiscente, o en otra modalidad, radiactivo, o en otra modalidad, denso en electrones. En otras modalidades, el marcador detectable comprende, por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), DS-Red (proteína roja fluorescente), fosfatasa alcalina secretada (SEAP), beta-galactosidasa, luciferasa, <32>P, <125>I, <3>H y <14>C, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo y umbeliferona, luciferina o cualquier número de otros marcadores conocidos por un experto en la técnica. El marcador particular usado dependerá del tipo de inmunoensayo usado.

En otra modalidad, un péptido de esta invención se une a un sustrato que, en otra modalidad, sirve como un portador. En otra modalidad, la unión del péptido a un sustrato sirve para aumentar una respuesta inmunitaria provocada.

En otra modalidad, los péptidos de esta invención se unen a otras moléculas, como se describe en la presente descripción, mediante el uso de agentes de reticulación convencionales tales como carbodiimidas. Ejemplos de carbodiimidas son 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida (CMC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y 1-etil-3-(4-azonia-44-dimetilpentil)carbodiimida.

En otras modalidades, los agentes de reticulación comprenden bromuro de cianógeno, glutaraldehído y anhídrido succínico. En general, puede usarse cualquiera de una serie de agentes homo-bifuncionales, lo que incluye un aldehído homobifuncional, un epóxido homobifuncional, un imido-éster homobifuncional, un éster de N-hidroxisuccinimida homobifuncional, una maleimida homobifuncional, un haluro de alquilo homobifuncional, un disulfuro de piridilo homobifuncional, un haluro de arilo homobifuncional, una hidrazida homobifuncional, un derivado de diazonio homobifuncional y un compuesto fotorreactivo homobifuncional. También se prevén, en otras modalidades, compuestos heterobifuncionales, por ejemplo, compuestos que tienen un grupo reactivo con amina y uno reactivo con sulfhidrilo, compuestos con un grupo reactivo con amina y uno fotorreactivo y compuestos con un grupo reactivo con carbonilo y uno reactivo con sulfhidrilo.

En otras modalidades, los agentes de reticulación homo-bifuncionales incluyen los ésteres de N-hidroxisuccinimida bifuncionales ditiobis(succinimidilpropionato), suberato de disuccinimidilo y tartrato de disuccinimidilo; los imidoésteres bifuncionales adipimidato de dimetilo, pimelimidato de dimetilo y suberimidato de dimetilo; los reticulantes bifuncionales reactivos con sulfhidrilo 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)propionamido]butano, bismaleimidohexano y bis-N-maleimido-1,8-octano; los haluros de arilo bifuncionales 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno y 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenilsulfona; agentes fotorreactivos bifuncionales tales como bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro; los aldehídos bifuncionales formaldehído, malondialdehído, succinaldehído, glutaraldehído y adipaldehído; un epóxido bifuncional tal como 1,4-butanodiol diglicidil éter; las hidrazidas bifuncionales dihidrazida de ácido adípico, carbohidrazida y dihidrazida de ácido succínico; los diazonios bifuncionales o-tolidina, bencidina diazotizada y bisdiazotizada; los haluros de alquilo bifuncionales N1N'-etilen-bis(yodoacetamida), N1N'-hexametilen-bis(yodoacetamida), N1N'-undecametilenbis(yodoacetamida), así como también haluros de bencilo y halomostazas, tales como ácido ala'-diyodo-p-xileno sulfónico y tri(2-cloroetil)amina, respectivamente,

En otras modalidades, los agentes de reticulación heterobifuncionales usados para unir los péptidos a otras moléculas, como se describe en la presente descripción, incluyen, pero no se limitan a, SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), MB S (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), SIAB (N-succinimidil(4-yodoacteil)aminobenzoato), SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), GMBS (éster de N-(gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida), MPBH (hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico), M2C2H (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxil-hidrazida), SMPT (succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno) y SPDP (3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo).

En otra modalidad, los péptidos de la invención se formulan como unión no covalente de monómeros mediante interacciones iónicas, adsorbentes o bioespecíficas. Los complejos de péptidos con moléculas altamente cargadas positiva o negativamente pueden lograrse, en otra modalidad, mediante la formación de puentes salinos en entornos de baja fuerza iónica, tales como en agua desionizada. Pueden crearse grandes complejos, en otra modalidad, mediante el uso de polímeros cargados tales como poli-(ácido L-glutámico) o poli-(L-lisina), que contienen numerosas cargas negativas y positivas, respectivamente. En otra modalidad, los péptidos se adsorben a superficies tales como perlas de micropartículas de látex u otros polímeros hidrófobos, mediante la formación de complejos de péptidosuperantígeno asociados de forma no covalente que imitan eficazmente proteínas reticuladas o polimerizadas químicamente, en otras modalidades. En otra modalidad, los péptidos se unen de forma no covalente a mediante el uso de interacciones bioespecíficas entre otras moléculas. Por ejemplo, la utilización de la fuerte afinidad de la biotina por proteínas tales como avidina o estreptavidina o sus derivados podría usarse para formar complejos de péptidos. Los péptidos, de acuerdo con este aspecto, y en otra modalidad, pueden modificarse para poseer grupos biotina mediante el uso de reactivos de biotinilación comunes tales como el éster N-hidroxisuccinimidílico de D-biotina (NHS-biotina), que reacciona con grupos amina disponibles.

En otra modalidad, un péptido de la presente invención se une a un portador. En otra modalidad, el portador es KLH. En otras modalidades, el portador es cualquier otro portador conocido en la técnica, lo que incluye, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúmina de suero humano, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli (lisina:ácido glutámico), influenza, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B, vacuna recombinante del virus de la hepatitis B y similares.

En otra modalidad, los péptidos de esta invención se conjugan con un lípido, tal como P3 CSS. En otra modalidad, los péptidos de esta invención se conjugan en una perla.

En otra modalidad, las composiciones de esta invención comprenden además compuestos inmunomoduladores. En otras modalidades, el compuesto inmunomodulador es una citocina, quimiocina o componente del complemento que potencia la expresión de moléculas accesorias o de adhesión del sistema inmunitario, sus receptores o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el compuesto inmunomodulador incluye interleucinas, por ejemplo, interleucinas 1 a 15, interferones alfa, beta o gamma, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), quimiocinas tales como proteína activadora de neutrófilos (NAP), factor activador y quimiotáctico de macrófagos (MCAF), RANTES, péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-Ia y MIP-Ib, componentes del complemento o combinaciones de los mismos. En otras modalidades, el compuesto inmunomodulador estimula la expresión o potencia la expresión de OX40, OX40L (gp34), linfotactina, CD40, CD40L, B7.1, B7.2, TRAP, ICAM-1, 2 0 3, receptores de citocinas o una combinación de los mismos.

En otra modalidad, el compuesto inmunomodulador induce o potencia la expresión de moléculas coestimuladoras que participan en la respuesta inmunitaria, que incluyen, en algunas modalidades, CD40 o su ligando, CD28, CTLA-4 o una molécula B7. En otra modalidad, el compuesto inmunomodulador induce o potencia la expresión de un antígeno termoestable (HSA) (Liu Y. y otros, (1992) J. Exp. Med. 175:437-445), cadena no variable de MHC modificada con sulfato de condroitina (Ii-CS) (Naujokas M. F. y otros, (1993) Cell 74:257-268), o una molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-I) (Van R. H. (1992) Cell 71:1065-1068), que ayuda, en otra modalidad, a la estimulación conjunta al interactuar con sus ligandos afines en las células T.

En otra modalidad, la composición comprende un solvente, lo que incluye agua, medios de dispersión, medios de cultivo celular, agentes isotónicos y similares. En otra modalidad, el solvente es una solución tamponada isotónica acuosa con un pH de aproximadamente 7,0. En otra modalidad, la composición comprende un diluyente tal como agua, solución salina tamponada con fosfato o solución salina. En otra modalidad, la composición comprende un solvente, que no es acuoso, tal como propiletilenglicol, polietilenglicol y aceites vegetales.

En otra modalidad, la composición se formula para su administración mediante cualquiera de las muchas técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, esta invención proporciona la administración de la composición farmacéutica por vía parenteral, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramucosa, tópica, oral o por inhalación.

En otra modalidad, la vacuna que comprende un péptido de esta invención comprende además una población celular que, en otra modalidad, comprende linfocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas, células endoteliales, células madre o combinaciones de las mismas, que, en otra modalidad, son autólogas, singénicas o alogénicas, entre sí. En otra modalidad, la población celular comprende un péptido de la presente invención. En otra modalidad, la población celular capta el péptido.

En otra modalidad, las poblaciones celulares de esta invención se obtienen a partir de fuentes in vivo, tales como, por ejemplo, sangre periférica, productos de la sangre de leucoféresis, productos de la sangre de aféresis, ganglios linfáticos periféricos, tejido linfoide asociado al intestino, bazo, timo, sangre del cordón umbilical, ganglios linfáticos mesentéricos, hígado, sitios de lesiones inmunológicas, por ejemplo, líquido sinovial, páncreas, líquido cefalorraquídeo, muestras tumorales, tejido granulomatoso o cualquier otra fuente donde puedan obtenerse dichas células. En otra modalidad, las poblaciones celulares se obtienen a partir de fuentes humanas, que son, en otras modalidades, de fuentes humanas neonatales, infantiles o adultas. En otra modalidad, las poblaciones celulares de esta invención se obtienen a partir de fuentes animales, tales como, por ejemplo, porcinos o simios, o cualquier otro animal de interés. En otra modalidad, las poblaciones celulares de esta invención se obtienen a partir de sujetos que son normales, o en otra modalidad, enfermos, o en otra modalidad, susceptibles a una enfermedad de interés.

En otra modalidad, las poblaciones celulares se separan mediante métodos de separación basados en afinidad. Las técnicas para la separación por afinidad incluyen, en otras modalidades, separación magnética, mediante el uso de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados junto con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, complemento y citotoxinas e "inmunoadsorción" con un anticuerpo unido a una matriz sólida, tal como una placa, o cualquier otra técnica conveniente. En otra modalidad, las técnicas de separación incluyen el uso de clasificadores de células activadas por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de sofisticación, tal como múltiples canales de colores, canales detectores de la dispersión de la luz obtusos y de ángulo bajo, canales de impedancia, etc. En otras modalidades, puede emplearse cualquier técnica que permita la separación de las poblaciones celulares de esta invención y debe considerarse como parte de esta invención.

En otra modalidad, las células dendríticas son de las diversas poblaciones de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides, calificados como tales (Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296). En otra modalidad, las células dendríticas usadas en esta invención se aíslan de la médula ósea, o en otra modalidad, se derivan de células progenitoras de la médula ósea, o, en otra modalidad, se aíslan de/se derivan de sangre periférica, o en otra modalidad, se derivan de, o son una línea celular.

En otra modalidad, las poblaciones celulares descritas en la presente descripción se aíslan a partir de la fracción de glóbulos blancos de un mamífero, tal como un murino, un simio o un ser humano (ver, por ejemplo, el documento WO 96/23060). La fracción de glóbulos blancos puede, en otra modalidad, aislarse de la sangre periférica del mamífero.

Los métodos para aislar células dendríticas se conocen bien en la técnica. En otra modalidad, las DC se aíslan mediante un método que incluye las siguientes etapas: (a) proporcionar una fracción de glóbulos blancos obtenida a partir de una fuente de mamífero mediante métodos conocidos en la técnica tales como leucoforesis; (b) separar la fracción de glóbulos blancos de la etapa (a) en cuatro o más subfracciones mediante elutriación centrífuga a contracorriente; (c) estimular la conversión de monocitos en una o más fracciones de la etapa (b) a células dendríticas al poner en contacto las células con ionóforo de calcio, GM-CSF e IL-13 o GM-CSF e IL-4, (d) identificar la fracción enriquecida en células dendríticas de la etapa (c); y (e) recolectar la fracción enriquecida de la etapa (d), preferentemente, a aproximadamente 4 [deg.]C.

En otra modalidad, la fracción enriquecida en células dendríticas se identifica mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, que identifica al menos uno de los siguientes marcadores: HLA-DR, HLA-DQ o B7.2 y la ausencia simultánea de los siguientes marcadores: CD3, CD14, CD16, 56, 57 y CD 19, 20.

En otra modalidad, la población celular comprende linfocitos, que son, en otra modalidad, células T, o en otra modalidad, células B. Las células T se caracterizan, en otras modalidades, como células NK, células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos (CTL), TBL, células T vírgenes o combinaciones de las mismas. Debe entenderse que las células T que son primarias, o líneas celulares, clones, etc. deben considerarse como parte de esta invención. En otra modalidad, las células T son CTL, o líneas de CTL, clones de CTL o CTL aislados de tumores, inflamatorios u otros infiltrados.

En otra modalidad, las células madre hematopoyéticas o las células progenitoras tempranas comprenden las poblaciones celulares usadas en esta invención. En otra modalidad, dichas poblaciones se aíslan o derivan mediante leucaféresis. En otra modalidad, la leucaféresis sigue a la administración de citocinas, de médula ósea, sangre periférica (PB) o sangre de cordón umbilical neonatal. En otra modalidad, las células madre o progenitoras se caracterizan por su expresión superficial del marcador de antígeno de superficie conocido como CD34<+>, y la exclusión de la expresión de los marcadores de antígeno de linaje de superficie, Lin-.

En otra modalidad, un péptido, composición o vacuna de esta invención se administrará a un sujeto junto con células de la médula ósea. En otra modalidad, la modalidad de la administración junto con células de la médula ósea sigue a la irradiación previa del sujeto, como parte del curso de la terapia, para suprimir, inhibir o tratar el cáncer en el sujeto.

En otra modalidad, la frase "poner en contacto una célula" o "poner en contacto una población" se refiere a un método de exposición, que puede ser, en otras modalidades, directo o indirecto. En otra modalidad, dicho contacto comprende la inyección directa de la célula a través de cualquier medio bien conocido en la técnica, tal como la microinyección. También se prevé, en otra modalidad, que el suministro a la célula sea indirecto, tal como a través del suministro en un medio de cultivo que rodea la célula, o administración a un sujeto, a través de cualquier vía bien conocida en la técnica, y como se describe en la presente descripción.

En otra modalidad, la generación de CTL descrita en la presente descripción se logra in vivo y se efectúa mediante la introducción en un sujeto de una célula presentadora de antígeno que se pone en contacto in vitro con un péptido de esta invención (ver, por ejemplo, Paglia y otros, (1996) J. Exp. Med. 183:317-322).

En otra modalidad, los péptidos y composiciones de la presente invención se suministran a la APC. En otra modalidad, las APC pulsadas con péptidos se administrarán a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria o tratar o inhibir el crecimiento o la recurrencia de un tumor.

En otra modalidad, los péptidos se suministran a la APC en forma de ADNc que codifica los péptidos. En otra modalidad, el término "células presentadoras de antígeno" (APC) se refiere a células dendríticas (DC), monocitos/macrófagos, linfocitos B u otro(s) tipo(s) de células que expresan las moléculas coestimuladoras/MHC necesarias, que permiten de manera eficaz el reconocimiento por las células T del péptido presentado. En otra modalidad, la APC es una célula cancerosa.

En otra modalidad, los CTL se ponen en contacto con 2 o más poblaciones de APC. En otra modalidad, las 2 o más poblaciones de APC presentan péptidos diferentes.

En otra modalidad, se usan técnicas que conducen a la expresión de antígeno en el citosol de APC (por ejemplo, DC) para suministrar los péptidos a la APC. Los métodos para expresar antígenos en la APC se conocen bien en la técnica. En otra modalidad, las técnicas incluyen (1) la introducción en la APC de ADN desnudo que codifica un péptido de esta invención, (2) la infección de la APC con vectores recombinantes que expresan un péptido de esta invención, y (3) la introducción de un péptido de esta invención en el citosol de una APC mediante el uso de liposomas. (Ver Boczkowski D. y otros, (1996) J. Exp. Med. 184:465-472; Rouse y otros, (1994) J. Virol. 68:5685-5689; y Nair y otros, (1992) J. Exp. Med. 175:609-612).

En otra modalidad, se usan APC promotoras tales como las derivadas a partir de la línea celular humana 174xCEM.T2, denominada T2, que contiene una mutación en su ruta de procesamiento de antígenos que restringe la asociación de péptidos endógenos con moléculas de MHC de clase I de la superficie celular (Zweerink y otros, (1993) J. Immunol.

150:1763-1771), como se ejemplifica en la presente descripción.

En otra modalidad, como se describe en la presente descripción, el sujeto se expone a un péptido, o una composición/población celular que comprende un péptido de esta invención, que difiere de la proteína nativa expresada, en donde subsecuentemente se desarrolla una respuesta inmunitaria del huésped que reacciona de forma cruzada con la proteína/antígeno nativo.

En otra modalidad, el sujeto, como se menciona en cualquiera de los métodos o modalidades de esta invención, es un ser humano. En otras modalidades, el sujeto es un mamífero, que puede ser un ratón, rata, conejo, hámster, conejillo de indias, caballo, vaca, oveja, cabra, cerdo, gato, perro, mono o simio.

En otra modalidad, los péptidos, las vacunas y las composiciones de esta invención estimulan una respuesta inmunitaria que da como resultado la lisis de las células tumorales.

En otra modalidad, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción se usa para provocar CTL, que se provocan in vitro. En otra modalidad, los CTL se provocan ex vivo. En otra modalidad, los CTL se provocan in vitro. Los CTL resultantes, en otra modalidad, se administrarán al sujeto, lo que trata de esta manera la afección asociada con el péptido, un producto de expresión que comprende el péptido o un homólogo del mismo.

En otra modalidad, el método descrito implica la introducción de la secuencia genética que codifica los péptidos de esta invención mediante el uso, por ejemplo, de una o más técnicas de suministro de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la invención incluyen, en otra modalidad, ADN, ARN y mezclas de ADN y ARN, solos o junto con componentes que no son ácidos nucleicos. En otra modalidad, el método descrito comprende administrar al sujeto un vector que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un péptido de la presente invención (Tindle, R. W. y otros, Virology (1994) 200:54). En otra modalidad, el método descrito comprende administrar al sujeto ADN desnudo que codifica un péptido, o en otra modalidad, dos o más péptidos de esta invención (Nabel, y otros, PNAS-USA (1990) 90:11307). En otra modalidad, se utilizan vacunas contra el cáncer basadas en análogos y multiepítopos (Fikes y otros, Design of multi-epitope, analogue-based cancer vaccines. Expert Opin Biol Ther., septiembre de 2003; 3(6):985-93).

Los ácidos nucleicos pueden administrarse a un sujeto a través de cualquier medio conocido en la técnica, lo que incluye la administración parenteral o intravenosa, o en otra modalidad, por medio de una pistola de genes. En otra modalidad, los ácidos nucleicos se administrarán en una composición, que corresponde, en otras modalidades, a cualquier modalidad enumerada en la presente descripción.

Los vectores para su uso de acuerdo con esta invención pueden comprender cualquier vector que facilite o permita la expresión de un péptido de esta invención. Los vectores comprenden, en algunas modalidades, virus atenuados, tales como vaccinia o viruela aviar, tal como se describe en, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 4,722,848. En otra modalidad, el vector es BCG (bacilo de Calmette Guerin), tal como se describe en Stover y otros, (Nature 351:456-460 (1991)). Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración terapéutica o la inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de Salmonella typhi y similares, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción en la presente descripción.

En otra modalidad, el vector codifica además un compuesto inmunomodulador, como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, se administrará al sujeto un vector adicional que codifica el mismo, simultáneamente, antes o después de la administración del vector que codifica un péptido de esta invención al sujeto.

En otra modalidad, los péptidos, composiciones y vacunas de esta invención se administrarán a un sujeto, o se utilizarán en los tratamientos de esta invención, en combinación con otros compuestos contra el cáncer y quimioterapéuticos, lo que incluye anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos cancerosos alternativos, o en otra modalidad, epítopos que consisten en una secuencia de AA que corresponde a, o en parte a, aquella de la que se derivan los péptidos de esta invención.

Esta invención contempla diversas modalidades de intervalos de dosis. [mu] se refiere a micro; [mu]g se refiere a microgramo o microgramos. En otra modalidad, la dosis es 20 [mu]g por péptido al día. En otra modalidad, la dosis es

10 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 30 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 40 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 60 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 80 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, dosis es 100 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 150 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, dosis es 200 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 300 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, dosis es 400 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 600 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, dosis es 800 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 1000 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad,

dosis es 1500 [mu]g/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 2000 [mu]g/péptido/día.

En otra modalidad, la dosis es 10 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 30 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 40 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 60 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 80 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 100 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 150 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 200 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 300 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 400 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 600 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 800 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 1000 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 1500 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 2000 [mu]g/péptido/dosis.

En otra modalidad, la dosis es 10-20 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 20-30 [mu]g/péptido/dosis.

En otra modalidad, la dosis es 20-40 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 30-60 [mu]g/péptido/dosis.

En otra modalidad, la dosis es 40-80 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 50-100 [mu]g/péptido/dosis.

En otra modalidad, la dosis es 50-150 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 100-200 [mu]g/péptido/dosis.

En otra modalidad, la dosis es 200-300 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 300-400 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 400-600 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 500

800 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 800-1000 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es

1000-1500 [mu]g/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 1500-2000 [mu]g/péptido/dosis.

En otra modalidad, la cantidad total de péptido por dosis o por día es una de las cantidades anteriores. En otra modalidad, la dosis total de péptido por dosis es una de las cantidades anteriores.

Esta invención contempla diversas modalidades de intervalos de dosis. En otra modalidad, la dosis es 20 mg por péptido por día. En otra modalidad, la dosis es 10 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 30 mg/péptido/día.

En otra modalidad, la dosis es 40 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 60 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 80 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 100 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 150 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 200 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 300 mg/péptido/día.

En otra modalidad, la dosis es 400 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 600 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 800 mg/péptido/día. En otra modalidad, la dosis es 1000 mg/péptido/día.

En otra modalidad, la dosis es 10 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 30 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 40 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 60 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 80 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 100 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 150 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 200 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 300 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 400 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 600 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 800 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 1000 mg/péptido/dosis.

En otra modalidad, la dosis es 10-20 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 20-30 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 20-40 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 30-60 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 40-80 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 50-100 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 50-150 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 100-200 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 200-300 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 300-400 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 400-600 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 500-800 mg/péptido/dosis. En otra modalidad, la dosis es 800-1000 mg/péptido/dosis.

En otra modalidad, la presente solicitud describe un kit que comprende un péptido, composición o vacuna de la presente invención. En otra modalidad, el kit comprende además una etiqueta o prospecto. En otra modalidad, el kit se usa para detectar una respuesta CD4 específica de WT1 mediante el uso de una prueba de hipersensibilidad de tipo retardada. En otra modalidad, el kit se usa para cualquier otro método enumerado en la presente descripción. En otra modalidad, el kit se usa para cualquier otro método conocido en la técnica.

Ejemplo 1. Materiales y Métodos

Diseño de péptidos. Mediante el uso de tres algoritmos predictivos computarizados BIMAS (http://www-bimas.cit.nih. gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform), SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/) y RANKPEP (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html), se seleccionaron epítopos tanto para células T CD8 como CD4 y se comenzó con las secuencias de la proteína WT1 nativa que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria en donantes normales. Los péptidos heteróclitos se diseñaron mediante la alteración de un solo aminoácido en los residuos de anclaje de los péptidos nativos para la clase I, lo que dio como resultado una unión predicha más alta que sus secuencias nativas. Los péptidos de clase II se diseñaron mediante la adición de residuos flanqueantes a los péptidos de clase I, para estimular simultáneamente tanto las células T CD4 como las CD8. Si bien los algoritmos pueden predecir muchas secuencias, estos modelos no predicen la unión al MHC cuando se prueban en células vivas en el 30 % de los casos (Gomez-Nunez y otros, Leuk Res. 2006;30(10): 1293-8), por lo tanto, es necesario realizar pruebas in vitro. Además, incluso si se demuestra la unión, es posible que no se produzca una respuesta de células T citotóxicas, lo que requiere un estudio in vitro adicional.

Síntesis de péptidos. Todos los péptidos se compraron y sintetizaron por Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX). Los péptidos fueron estériles con una pureza del 70 % al 90 %. Los péptidos se disolvieron en DMSO y se diluyeron en solución salina a 5 mg/ml y se almacenaron a -80 °C. Los péptidos de control usados son: para HLA-DR.B1: péptido de unión a DR.B1 derivado de JAK-2 JAK2-DR (GVCVCGDENILVQEF; SEQ ID NO:59) o péptido derivado de BCR.ABL (IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP; SEQ ID NO:60); para HLA-A0201: péptido EW derivado del sarcoma de ewing (QLQNPSYDK; SEQ ID NO:61) y para HLA-A2402: péptido 624-632 derivado del antígeno de membrana específico de la próstata (PMSA) (TYSVSf Ds L; SEQ ID NO:62).

Líneas celulares, citocinas y anticuerpos. Las líneas celulares de leucemia humana BA25 y HL-60 se usaron como objetivos para medir la citotoxicidad de las células T. El factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humanos (GM-CSF), la interleucina (IL)-1beta, IL-4, IL-6, IL-15, el factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa y la prostaglandina E2 (PGE2) se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis, MN). La beta 2-microglobulina (b2-m) se adquirió de Sigma (St. Louis, MO). Los anticuerpos usados para los ensayos de inmunofluorescencia, lo que incluye AcM para CD3, CD4, CD8, HLA-A2 (clon BB7.2) humanos y controles de isotipo se obtuvieron de BD Biosciences (San Diego, CA). Los kits de aislamiento celular para CD14 y CD3 se adquirieron de Miltenyi Biotec. (Bergisch Gladbach, Alemania).

Ensayo T2 para la unión de péptidos. Las células T2 (TAP, HLA-A0201+) se incubaron durante toda la noche a 37 °C a 1 x 106 células/ml en medio RPMI libre de FCS suplementado con beta-2m humana 10 ug/ml (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) en ausencia (control negativo) o presencia de péptidos a diversas concentraciones finales (50, 10 y 2 ug/ml). Se añadió brefeldina A (Sigma) a 5 ug/ml a los cultivos durante las últimas dos horas de incubación. Después, las células T2 se lavaron y se tiñeron con AcM anti-HLA-A2.1 (BB7.2) conjugado con FITC durante 30 min a 4 °C y seguido de lavado con tampón de tinción (PBS más FBS al 1 % y azida al 0,02 %). La expresión de HLA-A2 en la superficie celular se midió mediante citometría de flujo en un FACScalibur (Becton Dickinson) y se analizó con el programa informático FlowJo 9.6.3.

Estimulación in vitro y cultivos de células T humanas. Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de donantes sanos de tipo HLA mediante centrifugación de densidad Ficoll. Los monocitos CD14+ se aislaron por selección positiva mediante el uso de AcM para CD14 humano acoplado con perlas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se usaron para la primera estimulación de células T. La fracción CD14 de PBMC se usó para el aislamiento de CD3, por separación celular inmunomagnética negativa mediante el uso de un kit de aislamiento de células pan-T (Miltenyi Biotec). La pureza de las células fue siempre superior al 98 %. Las células T se estimularon durante 7 días en presencia de RPMI 1640 suplementado con plasma autólogo (AP) al 5 %, péptidos sintéticos 20 ug/ml, B2-m 1 ug/ml e IL-15 10 ng/ml. Se generaron células dendríticas (DC) derivadas de monocitos a partir de células CD14+, al cultivar las células en medio RPMI 1640 suplementado con AP al 1 %, IL-4 recombinante 500 unidades/ml y GM-CSF 1000 unidades/ml. En los días 2 y 4 de incubación, se añadió medio fresco con IL-4 y GM-CSF o reemplazó la mitad del medio de cultivo. El día 5, se añadieron 20 ug/ml del péptido de clase II a las DC inmaduras, para el procesamiento. El día 6, se añadió un cóctel de citocinas de maduración (Dao y otros, Plos One 2009; 4(8):e6730). El día 7 u 8, las células T se volvieron a estimular con DC maduras, con IL-15. En la mayoría de los casos, las células T se estimularon 3 veces de la misma manera, mediante el uso de células DC o CD14+ como células presentadoras de antígeno (APC). Una semana después de la estimulación final, se examinó la respuesta de las células T específicas para el péptido mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima de puntos (ELISPOT) de IFN-g y se evaluó la citotoxicidad mediante el ensayo de liberación de 51cromo (Cr).

ELISPOT de IFN-g. Las placas HA-Multiscreen (Millipore) se recubrieron con 100 ul de anticuerpo anti-IFN-g humano de ratón (10 Ag/ml; clon 1-D1K; Mabtech) en PBS, se incubaron durante toda la noche a 4 °C, se lavaron con PBS para eliminar el anticuerpo no unido y se bloquearon con RPMI 1640/plasma autólogo (AP) al 10 % durante 2 h a 37 °C. Se sembraron en placas células T CD3+ purificadas (>98 % de pureza) ya sea con CD14+ autólogo (relación E: APC 10:1) o DC autólogas (relación E: APC 30:1). Se añadieron diversos péptidos de prueba a los pocillos a 20 ug/ml. Los pocillos de control negativo contenían APC y células T sin péptidos o con péptidos irrelevantes. Los pocillos de control positivo contenían células T más APC más fitohemaglutinina 20 ug/ml (PHA, Sigma). Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las placas de microtitulación se incubaron durante 20 h a 37 °C y después se lavaron minuciosamente con PBS/Tween al 0,05 % y se añadieron 100 ul/pocillo de anticuerpo de detección biotinilado contra IFN-g humano (2 ug/ml; clon 7-B6-1; Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas adicionales a 37 °C y el desarrollo de los puntos se realizó como se describe (Dao y otros, op. cit.). Las cantidades de puntos se determinaron automáticamente con el uso de un analizador de imágenes de video asistido por computadora con el programa informático KS ELISPOT 4.0 (Carl Zeiss Vision).

Ensayo de liberación de 51cromo. La presencia de CTL específicos se midió en un ensayo de liberación de cromo estándar como se describe (Dao y otros, op. cit.). En resumen, las células objetivo solas o pulsadas con 50 ug/ml de péptidos sintéticos durante 2 horas (en algunos casos durante toda la noche) a 37 °C, se marcan con 50 uCi/millón de células de Na251CrO4 (NEN Life Science Products, Inc.). Después de un lavado minucioso, las células objetivo se incuban con células T a relaciones E: T que varían de 100:1 a 10:1. Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las placas se incubaron durante 4-5 horas a 37 °C en CO2 al 5 %. Se cosecharon los fluidos sobrenadantes y se midió la radiactividad en un contador gamma. El porcentaje de lisis específica se determinó a partir de la siguiente fórmula: [(liberación experimental - liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea)] x 100 %. La liberación máxima se determinó mediante lisis de objetivos radiomarcados en SDS al 1 %.

Ejemplo 2. Unión de los péptidos nativos y sus análogos a HLA-A0201 y HLA-A2402

Mediante el uso de una agrupación de péptidos solapados de 15 mer que comprenden la proteína WT1 humana para sensibilizar las células T humanas in vitro, la secuencia 239-248 (NQMNLGATL; SEQ ID No : 5; abreviada NQM en la presente descripción) se ha identificado recientemente como un epítopo inmunogénico de células T CD8 en el contexto de HLA-A2402 (Doubrovina y otros, Blood 2012; 123(8):1633-46). Para generar péptidos análogos con mayor inmunogenicidad, se tamizaron las puntuaciones de predicción del péptido nativo y los posibles análogos con diversas sustituciones de aminoácidos en las posiciones 2 y 9 (residuos de anclaje de clase I), mediante el uso de tres bases de datos disponibles en línea (BIMAS, RANKPEP y SYFPEITHI). Las puntuaciones de unión predichas a partir de las tres bases de datos mostraron una mejor unión del péptido NQMNLGATL nativo (SEQ ID NO: 5) a la molécula HLA-A0201 que a la molécula HLA-A2402 (Tabla I). Cuando la glutamina en la posición 2 se sustituyó por leucina, la puntuación de unión a HLA-A2402 permaneció en un nivel similar en los 3 programas de predicción. Sin embargo, se predijo una puntuación de unión significativamente mayor para HLA-A0201. Por otro lado, cuando la glutamina en la posición 2 se sustituyó por tirosina, la puntuación de unión a HLA-A2402 mejoró drásticamente, al mostrar un aumento de la unión aproximadamente 90 veces mayor según la predicción BIMAS. Se predijo que los tres péptidos se escindirían en el c-terminal mediante el algoritmo RANKPEP, lo que sugiere el procesamiento del fragmento de péptido. La puntuación de unión se comprobó mediante sustitución con diversos aminoácidos en la posición 9, pero ninguno de ellos mostró una unión mejorada significativa en comparación con la sustitución en la posición 2. Por lo tanto, los dos péptidos análogos NLMNLGATL (SEQ ID NO: 6; abreviado NLM o A24-het-1 en la presente descripción) y NYMNLGATL (SEQ ID NO: 7; abreviado NYM o A24-het-2 en la presente descripción) se seleccionaron para estudios adicionales.

Tabla 1. Puntuaciones de unión predictivas de los péptidos a HLA-A0201 y A2402

Ejemplo 3. Unión de los péptidos a moléculas HLA-A0201 y HLA-A2402

La inmunogenicidad de los péptidos restringidos por MHC de clase I requiere la capacidad de unir y estabilizar moléculas de MHC de clase I en la superficie de la célula viva. Además, la predicción por computadora tiene solo hasta un 70 % de precisión; por lo tanto, se buscó la medición directa de la fuerza de la interacción entre los péptidos y las moléculas HLA-A0201 mediante el uso de un ensayo de unión y estabilización convencional que usa las células T2 humanas HLA-A0201 deficientes en transporte de antígeno (negativas para TAP2). Las células T2 carecen de función TAP y, en consecuencia, no logran cargar adecuadamente las moléculas de clase I con péptidos antigénicos generados en el citosol. La asociación de péptidos añadidos de forma exógena con moléculas HLA-A0201 vacías y termolábiles las estabiliza y da como resultado un aumento en el nivel de HLA-A0201 de superficie reconocible por un AcM anti-HLA-A0201 específico tal como BB7.2.

El ensayo de unión a T2 mostró que el péptido NQMNLGATL nativo (SEQ ID NO: 5) no aumentó la expresión de HLA-A2 en las células T2 (Figura 1, panel superior). Sin embargo, el péptido análogo NLMNLGATL (SEQ ID NO: 6) estabilizó la molécula HLA-A2 al mostrar un aumento dependiente de la dosis en la expresión de HLA-A2, en comparación con las células T2 sin pulsación de péptidos (Figura 1, panel central). De manera similar al péptido nativo NQMNLGATL, el péptido NYMNLGATL (SEQ ID n O: 7) no aumentó la expresión de HLA-A2 (Figura 1, panel inferior). Estos datos confirmaron las puntuaciones de unión a HLA-A2, predichos por el algoritmo basado en computadora.

Ejemplo 4. Inducción de una respuesta de células T CD8 específica para el péptido en el contexto de moléculas HLA-A0201 y A2402

Aunque la afinidad por las moléculas de MHC es necesaria para la presentación del péptido, el reconocimiento por las células T del péptido presentado por las moléculas HLA es otro requisito importante para provocar la respuesta específica para el péptido. Por lo tanto, mediante el uso de un protocolo de estimulación in vitro, se evaluaron los nuevos análogos de péptidos WT1 sintéticos para determinar su capacidad para estimular la respuesta de células T específica para el péptido tanto en donantes HLA-A0201 como A2402.

Para expandir los precursores de células T específicas para el péptido, se realizaron de tres a cinco estimulaciones in vitro y se midió la respuesta de células T específicas mediante la producción de IFN-g, cuando se retaron con péptidos individuales. El péptido NLMNLGATL indujo una fuerte secreción de IFN-g que reaccionó de forma cruzada con el péptido NQMNLGATL nativo. Cinco estimulaciones de células T mejoraron la respuesta al mostrar más puntos de IFN-g (Figura 2B) que 3 estimulaciones (Figura 2A). Las células T después de la estimulación con el péptido NLMNLGATL también se probaron para determinar la citotoxicidad mediante el uso de un ensayo de liberación de 51Cr. No se observó destrucción contra células HL-60 que eran positivas para WT1, pero negativas para HLA-A2. Sin embargo, las células T destruyeron la línea celular SET-2 de AML WT1+ y HLA-A0201+ y los blastos de leucemia primaria derivados a partir de un paciente que es positivo para HLA-A0201 (Figura 3). Se determinó si tanto los péptidos heteróclitos NLMNLGATL como NYMNLGATL podían inducir una mejor respuesta de células T CD8 en donantes HLA-A2402. El péptido NLMNLGATL pudo inducir respuestas de células T contra los péptidos NLMNLGATL y NQMNLGATL nativo, pero no hubo una mejora significativa en comparación con la respuesta de células T inducida por el péptido NQMNLGATL nativo. Por el contrario, el péptido NYMNLGATL indujo una fuerte respuesta de células T contra sí mismo y el péptido nativo después de 3 estimulaciones (Figura 4A), pero la respuesta se extinguió después de 5 rondas de estimulación (Figura 4B), que también mostró una débil reactividad cruzada con la secuencia nativa. Estos datos demostraron que el péptido heteróclito NLMNLGATL es un epítopo fuerte para las células T CD8 en el contexto de la molécula HLA-A0201. El péptido NYMNLGATL, por otro lado, indujo una respuesta de células T CD8 en donantes positivos para HLA-A0201, pero la respuesta no fue significativamente mejor que la del péptido NQMNLGATL.

Ejemplo 5. Inducción de respuesta de células T por péptidos HLA-DR.B1 que reconocen el epítopo de células T CD8 NQMNLGATL

Se ha demostrado que un péptido que combina tanto los epítopos CD4 como CD8 es más eficaz que el epítopo de clase I único para provocar una respuesta inmunitaria eficaz para el diseño de vacunas, porque las células T CD4 pueden ayudar a los CTL CD8 al activar completamente las DC a través de la señalización CD40/CD40L, así como también al producir IL-2 e IFN-g. Además, si las células T estimuladas con péptidos más largos, en los que están incrustados los epítopos de las células T CD8, pudieran reconocer los péptidos cortos, confirmaría el procesamiento de los epítopos de las células T CD8. Por lo tanto, se diseñaron cuatro péptidos de unión a HLA-DR.B1 que abarcan los epítopos NQMNLGATL y NLMNLGATL, respectivamente:

DR-Nativo-1: cmtwNQMNLGATLkg (SEQ ID NO: 8)

DR-Nativo-2: wNQMNLGATLkgvaa (SEQ ID NO: 9)

DR-het-1: cmtwNLMNLGATLkg (SEQ ID NO: 14)

DR-het-2: wNLMNLGATLkgvaa (SEQ ID NO: 17)

Dado que no existe un método definitivo para predecir la escisión de péptidos de clase II, se diseñaron dos versiones diferentes de los péptidos de clase II mediante el uso de los algoritmos BIMAS, SYFPEITHI y RANKPEP (Tabla 2).

Cuando las células T se estimularon con dos péptidos DR.B1 "heteróditos" que abarcan el epítopo NLMNLGATL, indujeron respuestas de células T que eran específicas tanto para péptidos cortos como largos, mostrado por la secreción de IFN-g. Dado que los péptidos CD4 inducen una respuesta más potente debido a su producción masiva de citocinas, el fondo usualmente es más alto que la estimulación del péptido de células T CD8. Por lo tanto, aunque ambos péptidos DR-heteróclitos indujeron respuestas específicas, el péptido DR-het-2 mostró una respuesta más clara que el péptido DR-het-1 en un donante mostrado en la Figura 5A. Fue evidente que las respuestas inducidas por el péptido DR-het-2 eran específicas tanto para los péptidos cortos NQMNGATL y NLMNGATL, como para los péptidos DR-nativo 2 y het-2. Más importante aún, las respuestas se dirigieron contra la línea de células tumorales irradiadas BA-25 (WT1+A2+), pero no para las células HL-60 que eran WT1+ pero negativas para A0201. De manera similar, cuando se estimularon las células T con péptidos cortos (NQMNLGATL o NLMNGATL) o péptidos largos como se indica en la Figura 5B, sólo se destruyeron las células BA-25 pero no las células HL-60.

Ejemplo 6. Otros péptidos de unión a HLA-DR.B1 que reconocen el epítopo de células T CD8 NQMNLGATL

Además de los péptidos DR descritos anteriormente, se diseñaron y evaluaron péptidos de unión a HLA-DR.B1 adicionales que abarcan los epítopos NQMNLGATL, NLMNLGATL y NLMNLGATL (Tabla 3):

Tabla 3. Puntuaciones de unión predictiva de los péptidos a HLA-DR.B1

(continuación)

Ejemplo 7. Generación de péptidos derivados de la oncoproteína WT1 que se unen a moléculas humanas HLA-B7 de clase I y HLA-Dr de clase II

También se diseñaron péptidos que se unen a HLA-B0702 (Tabla 4). Se diseñaron las siguientes secuencias de péptidos: RQRPHPGAL (B7-Nativo 1; SEQ ID NO: 34), RLRPHPGAL (B7-het-1; SEQ ID NO: 37), RIRPHPGAL (B7-het-2; SEQ ID NO: 38), GALRNPTAC (Nativo 2; SEQ ID NO: 29), y GALRNPTAL (B7-het-3; SEQ ID NO: 31). Las puntuaciones de unión predictiva de estas y otras variantes se muestran en la Tabla 4. Estos péptidos se probaron in vitro y estimulan las respuestas de células T heteróclitas (Figura 6). Se estimularon células T CD3 de un donante positivo para HLA-B0702 con 2 conjuntos de péptidos (cinco en total) por 5 veces in vitro. La respuesta específica para el péptido se midió mediante el ensayo ELISPOT de IFN-gamma, frente a un péptido individual.

Para el primer conjunto de péptidos, tanto heteróclito-1 como 2, indujeron las respuestas específicas para péptido, pero la reactividad cruzada con el péptido nativo 1 (N1) fue más fuerte para el péptido het-2 que para el péptido het-1. Para el segundo conjunto de péptidos, el péptido heteróclito indujo una fuerte producción de IFN-g, cuando se retó con el péptido estimulante, pero no se encontró reactividad cruzada con la secuencia nativa.

Tabla 4. Puntuaciones de unión predictiva de los péptidos B7 a HLA-B7 y otros haplotipos.

(continuación)

Basado en el hallazgo de que los péptidos nativos RQRPHPGAL (p-125 a -117; SEQ ID NO: 34) y GALRNPTAC (p-118 a-110; SEQ ID NO: 29) inducen respuestas de células T en el contexto de la molécula HLA-B7, mediante el uso de algoritmos de predicción de unión a HLA, se diseñó un péptido heteróclito para el péptido GALRNPTAC (SEQ ID NO:31) y dos péptidos heteróclitos para RQRPHPGAL (s Eq ID NOS: 37 y 38). Basado en la predicción de unión, estos péptidos también pueden estimular las células T en el contexto de otros haplotipos de HLA, tales como: A0201, A0301, B8, B1501, B37 y B5101 (Tabla 4).

Ejemplo 8. Generación de péptidos derivados de la oncoproteína WT1 que se unen a moléculas humanas HLA-B35, A0101, A0301, A1101 de clase I y HLA-DR de clase II

El péptido QFPNHSFKHEDPMGQ (p170-182) (SEQ ID NO: 39) induce la respuesta de células T en el contexto de HLA-DR.B1 0301 y 0401. Las secuencias cortas incrustadas dentro del péptido largo, HSFKHEDPM, inducen la respuesta de células T en el contexto de B3501. Basado en las predicciones de los algoritmos de predicción de unión a HLA, se diseñó un péptido largo heteróclito, que es la extensión del péptido corto het-B35-1.

Las secuencias de los péptidos son: péptido de clase II: DR.B1-03/04-Nativo: QFPNHSFKHEDPM (SEQ ID NO: 42), DR.B1-03/04-Het: QFPNHSFKHEDPY (SEQ ID NO: 43; péptidos de clase I: 1. Nativo: HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 40), 2. Het-01/03-1: HSFKHEDPY (para A0101 y A0301) (SEQ ID NO: 41) y 3. Het-03/11-1 HSFKHEDPK (para A0301 y A1101) (SEQ ID NO: 42). Los péptidos heteróclitos para el haplotipo HLA-B3501 se probaron in silico (Tabla 5).

Ejemplo 9. Generación de péptidos derivados de la oncoproteína WT1 que se unen a moléculas humanas HLA-A1, A3, A11 de clase I y HLA-DR.B1-0401 de clase II

Se demostró que el péptido KRPFMCAYPGCNK (320-332) (SEQ ID NO: 44) induce la respuesta de células T en el contexto de HLA-DR.B1 0401. La secuencia corta incrustada dentro del péptido largo, FMCAYPGCN (SEQ ID NO: 45) , induce la respuesta de células T en el contexto de B35, B7 y A0101 (Tabla 6). Se investigaron las puntuaciones de unión de los péptidos a múltiples haplotipos de HLA mediante el uso de algoritmos de predicción. Se diseñó un péptido largo heteróclito, que es la extensión del péptido corto het-1. Se diseñaron dos péptidos heteróclitos cortos que se unen mejor a HLA-A0101, 0301 y 1101. Las secuencias de los péptidos son: péptido de clase II: DR.B1-04 Nativo: KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 44), DR.B1-04 het: KRPFMCAYPGCYK (SEQ ID NO: 46); péptidos de clase I: 1. Nativo: FMCAYPGCN (SEQ ID NO: 45), 2. DR.B1-04-Het-1 corto: FMCAYPGCY (para A0101) (SEQ ID NO: 47), 3. DR.B1-04-Het-2-corto: FMCAYPGCK (para A0301 y A1101) (SEQ ID NO: 48). KRPFMCAYPGCYK (SEQ ID NO: 46) es la extensión de DR.B1-04-het 1 corto, FMCAYPGCN (s EQ ID NO: 45), en el que el final de las secuencias CN se convierte en CY.

Tabla 6. Puntuaciones de unión predictiva de los péptidos a HLA-DR.B1-0401 y B35, B7, A0101, A0301 y A1101.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos NLMNLGATL (SEQ ID NO:6).

2. Un péptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO:14), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:15), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:16), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 17) y CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 22).

3. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho péptido aislado se une a una molécula HLA de clase I, una molécula HLA de clase II o la combinación de las mismas.

4. Un péptido de unión de clase I aislado que comprende la secuencia NLMNLGATL (SEQ ID NO: 6).

5. Un péptido de unión de clase II aislado que comprende una secuencia seleccionada de CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO:14), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:15), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO:16) y WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 17).

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Un vector, tal como un vector de virus atenuado o un vector de Salmonella typhi, que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6.

8. El vector de conformidad con la reivindicación 7, que codifica además cualquiera de las interleucinas 1 a 15, interferón alfa, beta o gamma, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), proteína activadora de neutrófilos (NAP), factor activador y quimiotáctico de macrófagos (MCAF), RANTES, péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-Ia o MIP-Ib, un componente del complemento o combinaciones de los mismos.

9. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, y un portador, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Una vacuna que comprende uno o más péptidos aislados de conformidad con las reivindicaciones 1-5.

11. La vacuna de conformidad con la reivindicación 10 que comprende además una célula presentadora de antígeno y/o un adyuvante, un diluyente o un portador.

12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 10 u 11 que comprende además al menos un péptido derivado de WT1 adicional.

13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, en donde dicho adyuvante es QS21, adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, BCG, alumbre, un factor de crecimiento, una citocina, una quimiocina, una interleucina, Montanide ISA 51 o GM-CSF.

14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9 o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-13 para su uso en el tratamiento de un sujeto con un cáncer que expresa WT1 o para reducir una incidencia de un cáncer que expresa WT1, o su recaída.

15. La composición farmacéutica o vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho cáncer que expresa WT1 es una leucemia, un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, un cáncer gástrico, un cáncer de colon, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un tumor de células germinales, un cáncer de ovario, un cáncer uterino, un cáncer de tiroides, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un sarcoma de Kaposi, un sarcoma, un carcinoma hepatocelular, un tumor de Wilms, una leucemia mielógena aguda (AML), un síndrome mielodisplásico (MDS) o un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

16. La composición farmacéutica o vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicho cáncer que expresa WT1 es mesotelioma.

17. Una composición que comprende (a) una célula presentadora de antígeno y (b) un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8.

18. El uso del péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 o el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-8 o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-13 o la composición de conformidad con la reivindicación 17 para inducir in vitro la formación y proliferación de CTL específicos para células de un cáncer que expresa WT1.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho cáncer que expresa WT1 es una leucemia, un tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, un cáncer gástrico, un cáncer de colon, un cáncer de pulmón, un cáncer de mama, un tumor de células germinales, un cáncer de ovario, un cáncer uterino, un cáncer de tiroides, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un sarcoma de Kaposi, un sarcoma, un carcinoma hepatocelular, un tumor de Wilms, una leucemia mielógena aguda (AML), un síndrome mielodisplásico (MDS) o un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 en donde el cáncer es mesotelioma.