CN114805538B - 一种增强til功效的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增强TIL功效的培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明利用一种重组白细胞介素10(rIL‑10)，重激活因在体外培养时间过长造成终末衰竭的TIL细胞，进一步增强其对癌症免疫的反应，从而提高TIL治疗的功效，对于肿瘤尤其是实体瘤的治疗具有巨大的临床意义和战略意义。

Description

一种增强TIL功效的培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种增强TIL功效的培养方法。
背景技术
恶性肿瘤的发生、发展涉及一系列复杂的分子生物学机制，包括肿瘤细胞、间质细胞和宿主的炎症细胞之间的相互作用。免疫系统是重要的肿瘤防御系统，其影响肿瘤从生长开始到进展和扩散的所有阶段，在宿主抑制肿瘤发生及发展的过程中起着至关重要的作用。正常情况下，人体的免疫系统维持着相对平衡的状态，但一旦免疫细胞发生改变，这一平衡状态被打破，人体免疫机制对肿瘤细胞的作用将会减弱，加快肿瘤进展。在肿瘤发生、肿瘤进展和转移扩散的过程中，肿瘤细胞对免疫系统的有效逃避是必不可少的，其可以使机体的免疫细胞不能识别肿瘤细胞，从而使机体的免疫系统失去对肿瘤的监视和清除功能，并且此过程可能与肿瘤细胞对自身的抗原进行修饰以及改变肿瘤细胞外的微环境相关。免疫系统与癌细胞相互的复杂作用在控制和消除肿瘤方面起着至关重要的作用，并受到激活和抑制信号之间微妙平衡的调节。
肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)是浸润在肿瘤实质与间质内的一类特殊免疫细胞，它包括一系列免疫相关细胞，如细胞毒性CD8+T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和T辅助细胞，以及那些具有免疫抑制作用的细胞，包括B细胞和调节性CD4+T细胞，它们在癌细胞和淋巴细胞之间传递特殊信息，与癌细胞的增殖和消除密切相关。树突状细胞是一种免疫细胞，在肿瘤组织中含有癌细胞特有的抗原，并在T细胞移动到淋巴结后用抗原特异性激活。这些T细胞作为细胞毒性T细胞攻击癌细胞，癌细胞释放各种细胞因子抑制其免疫功能，逃避这种攻击。研究表明，调节性T细胞在癌症的免疫逃避机制中起着重要作用。调节性T细胞被认为参与维持免疫耐受，癌细胞可通过诱导调节性T细胞来抑制免疫系统，以促进自身的增殖，从而抑制宿主的过度免疫反应。
肿瘤浸润淋巴细胞回输治疗实体瘤，作为一种重要的过继性细胞疗法(ACT)，具有天然多靶点的肿瘤抗原特异性、高浸润性和副作用小等优势，愈受医药界的关注。TIL细胞主要是从恶性胸腹水、癌组织或癌旁组织中分离出的浸润淋巴细胞，因而受到个体肿瘤的差异性、肿瘤的大小、淋巴细胞的浸润程度和手术污染等条件限制，加上现有工艺水平的不利影响，导致其在体外难以稳定地大规模扩增。作为一种高度差异化、定制化和靶向性的免疫疗法，提高TIL疗法有效性和可及性的方法之一是增强TIL对肿瘤细胞的免疫功效。例如，专利CN202110468954.5公开了一种TIL细胞扩增培养基及其使用方法，该培养基包括灭活牛血清、白介素-5、白介素-9、白介素-21、单克隆抗体、灵芝多糖、谷胱甘肽、卡拉胶、半乳糖醛酸、乙酰氨基酚和基础培养基，可促进细胞的增殖，并提高其杀伤活性。专利CN201910863394.6则公开了一种功能增强型TIL细胞的培养方法，包括：从肿瘤组织分离淋巴细胞，加入启动培养基，进行启动淋巴细胞培养，培养10天或14天获得启动TIL细胞，收获启动的TIL细胞冻存备用；用诱导培养基悬浮淋巴细胞，置于37℃、5％CO2孵箱进行TIL细胞诱导培养1天；用扩增培养基进行半量换液，进行扩瓶培养和扩袋培养，共培养13天或14天；在培养第14天或第15天，收集TIL细胞，生理盐水洗涤，用功能增强培养基重悬TIL细胞后，孵育30分钟；收集TIL细胞，获得功能增强型TIL细胞；其所述的培养方法能获得具有更强的杀伤肿瘤细胞的活性、更高水平的抗肿瘤细胞因子分泌能力的功能增强型TIL细胞。
为了能够更好地提高TIL细胞对实体瘤细胞的杀伤效果，亟需提供一种操作简便、成本更低的增强TIL功效的培养方法。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种增强TIL功效的培养方法。本发明利用一种重组白细胞介素10(rIL-10)，重激活因在体外培养时间过长造成终末衰竭的TIL细胞，进一步增强其对癌症免疫的反应，从而提高TIL治疗的功效，对于肿瘤尤其是实体瘤的治疗具有巨大的临床意义和战略意义。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种重组白细胞介素10(rIL-10)，所述的rIL-10包括：
(1)、SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽A，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽B和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽C；
或者(2)、与(1)中的任一多肽相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的多肽；
或者(3)、与(1)中的任一多肽相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合的多肽；所述的置换是保守置换。
具体地，所述的rIL-10还包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸接头中的任意两种。
进一步具体地，所述的rIL-10的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
另一方面，本发明提供了上述rIL-10在激活、制备和/或培养TIL细胞中的应用。
又一方面，本发明提供了一种TIL细胞的激活方法，所述的方法包括以下步骤：采用上述rIL-10培养TIL细胞，激活TIL细胞。
具体地，所述的方法包括以下步骤：取TIL细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，置于培养箱中培养4-120h，获得TIL细胞。
进一步具体地，所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
进一步具体地，所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
在某些实施例中，所述的rIL-10的浓度为100ng/mL。
在某些实施例中，所述的rIL-10的浓度为200ng/mL。
在某些实施例中，所述的rIL-10的浓度为400ng/mL。
在某些实施例中，所述的rIL-10的浓度为800ng/mL。
在某些实施例中，所述的rIL-10的浓度为1600ng/mL。
在某些实施例中，所述的rIL-10的浓度为3200ng/mL。
进一步具体地，所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000031
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Figure BDA0003654379880000032
培养基中的一种或多种。
又一方面，本发明提供了一种TIL细胞的制备和/或培养方法，所述的方法包括以下步骤：(1)TIL细胞纯化扩增；(2)采用上述rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)TIL细胞纯化扩增：取癌组织加入酶解离为单细胞，过滤，滤液离心取沉淀，加入含有白细胞介素2(IL-2)的培养基，置于培养箱中培养10-35d；
(2)终末衰竭的TIL细胞重激活：取上述步骤(1)培养的细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，置于培养箱中培养4-120h，获得TIL细胞。
具体地，步骤(1)中所述的癌组织取自实体瘤组织、恶性胸腹水或癌旁组织中的一种或多种。
在某些实施例中，所述的癌组织以细针抽吸物(FNA)、核心活检物、小活检物(包括例如，穿孔活检物)获得。
在某些实施例中，将所述的癌组织剪碎成1-3mm3的小块。
具体地，步骤(1)中所述的酶为胶原酶、透明质酸酶或DNA酶中的一种或多种。
进一步具体地，所述的胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶或IV型胶原酶中的一种或多种。
进一步具体地，步骤(1)中所述的酶的浓度为0.05-2mg/mL。
具体地，步骤(1)中所述的过滤采用20-180μm的滤网进行。
具体地，步骤(1)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(1)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
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Figure BDA0003654379880000042
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(1)中所述的培养时长可以为10d、11d、12d、13d、14d、15d、16d、17d、18d、19d、20d、21d、22d、23d、24d、25d、26d、27d、28d、29d、30d、31d、32d、33d、34d或35d。
具体地，步骤(2)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为100ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为400ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为800ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为1600ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为3200ng/mL。
具体地，步骤(2)中所述的培养基为无血清培养基。
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Figure BDA0003654379880000052
培养基中的一种或多种。
又一方面，本发明提供了一种TIL细胞的制备和/或培养方法，所述的方法包括以下步骤：(1)TIL细胞纯化扩增；(2)采用滋养层细胞快速扩增TIL细胞；(3)采用上述rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)TIL细胞纯化扩增：取癌组织加入酶解离为单细胞，过滤，滤液离心取沉淀，加入含有白细胞介素2(IL-2)的培养基，置于培养箱中培养10-35d；
(2)所述的步骤(1)TIL细胞扩增培养至14-35天时，加入滋养层细胞以快速扩增TIL细胞，具体方法为：S1.滋养层细胞制备：取适量的PBMC，用X射线辐照，获得滋养层细胞；S2.将S1制备的滋养层细胞与步骤(1)培养至14-35天的TIL细胞混合，并加入抗体偶联磁珠，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基，置于培养箱中培养10-35d；
(3)终末衰竭的TIL细胞重激活：取上述步骤(2)培养的细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，置于培养箱中培养4-120h，获得TIL细胞。
具体地，步骤(1)中所述的癌组织取自实体瘤组织、恶性胸腹水或癌旁组织中的一种或多种。
在某些实施例中，所述的癌组织以细针抽吸物(FNA)、核心活检物、小活检物(包括例如，穿孔活检物)获得。
在某些实施例中，将所述的癌组织剪碎成1-3mm3的小块。
具体地，步骤(1)中所述的酶为胶原酶、透明质酸酶或DNA酶中的一种或多种。
进一步具体地，所述的胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶或IV型胶原酶中的一种或多种。
进一步具体地，步骤(1)中所述的酶的浓度为0.05-2mg/mL。
具体地，步骤(1)中所述的过滤采用20-180μm的滤网进行。
具体地，步骤(1)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(1)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
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Figure BDA0003654379880000062
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(1)中所述的培养时长可以为10d、11d、12d、13d、14d、15d、16d、17d、18d、19d、20d、21d、22d、23d、24d、25d、26d、27d、28d、29d、30d、31d、32d、33d、34d或35d。
进一步具体地，步骤S1中所述的X射线辐照的条件为：50-350Gy，每次1-30min，辐照≥1次。
进一步具体地，步骤S2中所述的滋养层细胞与步骤(1)培养至14-35天的TIL细胞的比例为1：1-300：1。
进一步具体地，步骤S2中所述的抗体偶联磁珠为CD3抗体偶联磁珠、CD3/CD28抗体偶联磁珠或CD3/CD28/CD117抗体偶联磁珠中的一种或多种。
进一步具体地，步骤S2中所述的抗体偶联磁珠的浓度为10-120ng/mL。
进一步具体地，步骤S2中所述的抗体偶联磁珠与步骤(1)培养至14-35天的TIL细胞的比例为20:1-1:10。
具体地，步骤S2中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤S2中所述的培养基为无血清培养基。
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Figure BDA0003654379880000064
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(3)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为100ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为400ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为800ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为1600ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为3200ng/mL。
具体地，步骤(3)中所述的培养基为无血清培养基。
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Figure BDA0003654379880000072
培养基中的一种或多种。
又一方面，本发明提供了一种TIL细胞的制备和/或培养方法，所述的方法包括以下步骤：(1)TIL细胞纯化扩增；(2)采用上述rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞；(3)采用上述rIL-10与上述步骤(2)重激活的TIL细胞制备得到TIL细胞混悬液。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)TIL细胞纯化扩增：取癌组织加入酶解离为单细胞，过滤，滤液离心取沉淀，加入含有白细胞介素2(IL-2)的培养基，置于培养箱中培养10-35d；
(2)终末衰竭的TIL细胞重激活：取上述步骤(1)培养的细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，置于培养箱中培养4-120h，获得重激活的TIL细胞；
(3)取上述步骤(2)重激活的TIL细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，制备得到TIL细胞混悬液。
具体地，步骤(1)中所述的癌组织取自实体瘤组织、恶性胸腹水或癌旁组织中的一种或多种。
在某些实施例中，所述的癌组织以细针抽吸物(FNA)、核心活检物、小活检物(包括例如，穿孔活检物)获得。
在某些实施例中，将所述的癌组织剪碎成1-3mm3的小块。
具体地，步骤(1)中所述的酶为胶原酶、透明质酸酶或DNA酶中的一种或多种。
进一步具体地，所述的胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶或IV型胶原酶中的一种或多种。
进一步具体地，步骤(1)中所述的酶的浓度为0.05-2mg/mL。
具体地，步骤(1)中所述的过滤采用20-180μm的滤网进行。
具体地，步骤(1)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(1)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000081
TexMACSTMGMPMedium、GT-T551、GibcoTMCTSTMOpTmizerTMProSFM或/>
Figure BDA0003654379880000082
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(1)中所述的培养时长可以为10d、11d、12d、13d、14d、15d、16d、17d、18d、19d、20d、21d、22d、23d、24d、25d、26d、27d、28d、29d、30d、31d、32d、33d、34d或35d。
具体地，步骤(2)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为100ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为400ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为800ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为1600ng/mL。
在某些实施例中，步骤(2)中所述的rIL-10的浓度为3200ng/mL。
具体地，步骤(2)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000083
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Figure BDA0003654379880000084
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(3)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
具体地，步骤(3)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000091
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Figure BDA0003654379880000092
培养基。
又一方面，本发明提供了一种TIL细胞的制备和/或培养方法，所述的方法包括以下步骤：(1)TIL细胞纯化扩增；(2)采用滋养层细胞快速扩增TIL细胞；(3)采用上述rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞；(4)采用上述rIL-10与上述步骤(3)重激活的TIL细胞制备得到TIL细胞混悬液。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)TIL细胞纯化扩增：取癌组织加入酶解离为单细胞，过滤，滤液离心取沉淀，加入含有白细胞介素2(IL-2)的培养基，置于培养箱中培养10-35d；
(2)所述的步骤(1)TIL细胞扩增培养至14-35天时，加入滋养层细胞以快速扩增TIL细胞，具体方法为：S1.滋养层细胞制备：取适量的PBMC，用X射线辐照，获得滋养层细胞；S2.将S1制备的滋养层细胞与步骤(1)培养至14-35天的TIL细胞混合，并加入抗体偶联磁珠，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基，置于培养箱中培养10-35d；
(3)终末衰竭的TIL细胞重激活：取上述步骤(2)培养的细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，置于培养箱中培养4-120h，获得TIL细胞；
(4)取上述步骤(3)重激活的TIL细胞，离心取沉淀，用含有白细胞介素2(IL-2)的培养基重悬，加入上述rIL-10，制备得到TIL细胞混悬液。
具体地，步骤(1)中所述的癌组织取自实体瘤组织、恶性胸腹水或癌旁组织中的一种或多种。
在某些实施例中，所述的癌组织以细针抽吸物(FNA)、核心活检物、小活检物(包括例如，穿孔活检物)获得。
在某些实施例中，将所述的癌组织剪碎成1-3mm3的小块。
具体地，步骤(1)中所述的酶为胶原酶、透明质酸酶或DNA酶中的一种或多种。
进一步具体地，所述的胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶或IV型胶原酶中的一种或多种。
进一步具体地，步骤(1)中所述的酶的浓度为0.05-2mg/mL。
具体地，步骤(1)中所述的过滤采用20-180μm的滤网进行。
具体地，步骤(1)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(1)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000101
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Figure BDA0003654379880000102
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(1)中所述的培养时长可以为10d、11d、12d、13d、14d、15d、16d、17d、18d、19d、20d、21d、22d、23d、24d、25d、26d、27d、28d、29d、30d、31d、32d、33d、34d或35d。
进一步具体地，步骤S1中所述的X射线辐照的条件为：50-350Gy，每次1-30min，辐照≥1次。
进一步具体地，步骤S2中所述的滋养层细胞与步骤(1)培养至14-35天的TIL细胞的比例为1-300：1。
进一步具体地，步骤S2中所述的抗体偶联磁珠为CD3抗体偶联磁珠、CD3/CD28抗体偶联磁珠或CD3/CD28/CD117抗体偶联磁珠中的一种或多种。
进一步具体地，步骤S2中所述的抗体偶联磁珠的浓度为10-120ng/mL。
进一步具体地，步骤S2中所述的抗体偶联磁珠与步骤(1)培养至14-35天的TIL细胞的比例为20:1-1:10。
具体地，步骤S2中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤S2中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000103
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Figure BDA0003654379880000104
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(3)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为100ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为200ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为400ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为800ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为1600ng/mL。
在某些实施例中，步骤(3)中所述的rIL-10的浓度为3200ng/mL。
具体地，步骤(3)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000111
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Figure BDA0003654379880000112
培养基中的一种或多种。
具体地，步骤(4)中所述的IL-2的浓度为300-8000IU/mL。
具体地，步骤(4)中所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
具体地，步骤(4)中所述的培养基为无血清培养基。
进一步具体地，所述的无血清培养基为X-VIVO、
Figure BDA0003654379880000113
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Figure BDA0003654379880000114
培养基。
又一方面，本发明还提供了一种TIL细胞，所述的TIL细胞由上述方法制备得到。
又一方面，本发明还提供了上述TIL细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
具体地，所述的肿瘤为实体瘤。
进一步具体地，所述的肿瘤选自肺癌、头颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胃癌、肾癌、鼻咽癌、甲状腺癌口腔癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、脑胶质癌、前列腺癌、膀胱癌、脑胶质癌、皮肤癌、髓母细胞瘤或脂肪肉瘤。
进一步具体地，所述的肿瘤为肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌或肝癌。
又一方面，本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物包括上述TIL细胞。
具体地，所述的抗肿瘤药物还包含任选的药学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
具体地，所述的药物组合物还包含组合治疗剂，所述的组合治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、免疫抑制剂、细胞毒性药物。
又一方面，本发明提供了一种TIL细胞治疗注射液，所述的注射液包括上述TIL细胞。
具体地，所述的注射液的制备方法包括以下步骤：收集重激活的TIL细胞，用0-20％的人血白蛋白氯化钠注射液洗涤2次，再用0.5-20％的人血白蛋白氯化钠注射液重悬，制备得到注射液。
需要说明的是，本发明所述的rIL-10不仅可以用于TIL细胞的重激活，也可用于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、T细胞受体工程改造的T细胞(TCR-T)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的重激活。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明采用一种重组白细胞介素10(rIL-10)重激活因在体外培养时间过长造成终末衰竭的TIL细胞，从而进一步增强其对癌症免疫的反应，提高TIL治疗的功效，对于肿瘤尤其是实体瘤的治疗具有巨大的临床意义和战略意义。
附图说明
图1为重激活宫颈癌TIL对HeLa细胞的杀伤结果图。
图2为重激活宫颈癌TIL细胞IFN-γ释放量结果图。
图3为重激活肺癌TIL对A549细胞的杀伤结果图。
图4为重激活肺癌TIL细胞IFN-γ释放量结果图。
图5为重激活乳腺癌TIL对MCF-7细胞的杀伤结果图。
图6为重激活乳腺癌TIL细胞IFN-γ释放量结果图。
图7为重激活结肠癌TIL对HCT116细胞的杀伤结果图。
图8为重激活结肠癌TIL细胞IFN-γ释放量结果图。
图9为重激活食管癌TIL对TE-1细胞的杀伤结果图。
图10为重激活食管癌TIL细胞IFN-γ释放量结果图。
图11为重激活肝癌TIL对HEPG2细胞的杀伤结果图。
图12为重激活肝癌TIL细胞IFN-γ释放量结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
定义：
本发明所述的“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”是指原本获得时是白细胞但其离开受试者的血流且迁移至肿瘤中的细胞群体。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和继代TIL。“原代TIL”是如本文概述的获自患者组织样品的细胞(有时称为“新鲜获得”或“新鲜分离”)，而“继代TIL”是任何经本文所述的扩增或增生的TIL细胞，包括但不限于本体TIL(bulk TIL)和经扩增的TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)。TIL细胞可包括遗传修饰的TIL。
本发明所述的“快速扩增”是指抗原特异性TIL细胞在数量上在一周时间段内增加至少约3倍(或4、5、6、7、8或9...倍)，更优选在一周时间段内增加至少约10倍(或20、30、40、50、60、70、80或90倍)，或最优选在一周时间段内增加至少约100倍。
本发明所述的“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC是抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞是经照射的异体外周血单核细胞。
本发明所述的“CD3抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人、人源化、嵌合或鼠抗体。
本发明所述的“CD3/CD28抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3/CD28受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人、人源化、嵌合或鼠抗体。
本发明所述的“CD3/CD28/CD117”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3/CD28/CD117受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人、人源化、嵌合或鼠抗体。
本发明所述的“细针抽吸物”或FNA是指一种类型的活检程序，其可用于取样或诊断程序，包括肿瘤取样，其中采集样品但不移除或切除肿瘤。在细针抽吸中，将中空针头(例如25至18号)插入肿瘤或含有肿瘤的区域，并且获得流体和细胞(包括组织)以用于进一步分析或如本文所述的扩增。进行FNA时，细胞被移除且不保留组织细胞的组织学结构。FNA可包含TIL。在一些例子中，细针抽吸活检是使用超声引导细针抽吸活检针头进行。FNA针头可购自Becton Dickinson、Covidien等。
本发明所述的“核心活检”或“核心针活检”是指一种活检程序，其可用于取样或诊断程序，包括肿瘤取样，其中采集样品但不移除或切除肿瘤。在核心活检中，将中空针头(例如16至11号)插入肿瘤或含有肿瘤的区域，并且获得流体和细胞(包括组织)以用于进一步分析或如本文所述的扩增。进行核心活检时，细胞可在保留一些组织细胞的组织学结构下移走，因为其相较于FNA有较大的针头大小。核心活检针通常是能够保留至少一些部分的肿瘤组织学结构的规格大小。核心活检物可包含TIL。在一些例子中，核心针活检是使用购自Bard Medical或Becton Dickinson等的活检仪器、真空辅助核心针活检仪器、立体定位引导核心针活检仪器、超声引导核心针活检仪器、MRI引导核心针活检仪器进行。
本发明所述的“白细胞介素10”(Interleukin-10，IL-10)是一种多效性细胞因子，可以在多种类型细胞中发挥免疫抑制或免疫刺激的作用。其可以通过上调线粒体丙酮酸载体依赖的氧化磷酸化来进行代谢重编程，可以重激活终末衰竭的T细胞，并增强其对癌症免疫的反应。
本发明所述的“重组白细胞介素10”(rIL-10)的序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0003654379880000141
Figure BDA0003654379880000151
本发明所述的“实体瘤”是指组织的异常团块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可为良性或恶性。术语“实体瘤癌症”是指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肺癌、头颈癌、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌、胃癌、肾癌、鼻咽癌、甲状腺癌口腔癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、脑胶质癌、前列腺癌、膀胱癌、脑胶质癌、皮肤癌、髓母细胞瘤或脂肪肉瘤。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
本发明所述的“微环境”可指整个实质或血液肿瘤微环境或可指在微环境中的个别细胞子集。如本文中所使用的肿瘤微环境是指如Swartz,等人,Cancer Res.2012,72,2473所描述的“促进肿瘤性转换、支持肿瘤生长和入侵、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性且提供显性转移成长空间的细胞、可溶性因子、信号传导分子、细胞外基质和机械刺激”的复杂混合物。虽然肿瘤表达应被T细胞识别的抗原，但免疫系统因为微环境的免疫抑制作用而很少进行肿瘤清除。
实施例1
1、宫颈癌TIL细胞纯化扩增：
宫颈癌组织剪碎成1-3mm3小块，加入0.1mg/mL胶原酶5mL，置于解离管中，于组织解离器上将癌组织解离成单细胞，20μm滤网过滤，滤液离心取沉淀，加入含6000IU/mL IL-2的X-VIVO培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养35天。
2、终末衰竭的TIL细胞重激活：
取步骤1中扩增的TIL细胞离心，去掉上清，分成2组，6000IU/mL IL-2的X-VIVO培养基重悬，分别加入浓度0、100ng/mL rIL-10(SEQ ID NO:10)、100ng/mL多肽A(SEQ ID NO:1)、100ng/mL多肽B+接头2+多肽C(SEQ ID NO:21)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
3、TIL增强肿瘤免疫功能检测：
取步骤2中处理的TIL细胞，离心取沉淀，用含6000IU/mL IL-2浓度的X-VIVO培养基重悬，与宫颈癌细胞系HeLa细胞按3:1效靶比混合，总细胞浓度为2x105/mL，分别加入浓度0、100ng/mL rIL-10、100ng/mL多肽A、100ng/mL多肽B+接头2+多肽C，取200μL混合细胞液置于平底圆孔透明96孔板中，每组5孔，于37℃，5％CO2培养箱中共培养。共培养8h，每孔吸走100μL上清(不吸走细胞)用于ELISA试剂盒检测IFN-γ释放量，剩余每孔加入20μL MTS，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3-4h，490nm波长下检测吸光值(OD)，计算杀伤率。检测结果如下表2及下表3所示。
表2.重激活宫颈癌TIL对HeLa细胞的杀伤
Figure BDA0003654379880000161
表3.重激活宫颈癌TIL细胞IFN-γ释放量
Figure BDA0003654379880000162
重激活宫颈癌TIL对HeLa细胞的杀伤结果显示(表2)，TIL:HeLa＝3:1，相比对照组(0ng/mL)，100ng/mL rIL-10刺激的实验组杀伤效果均增强42.16％，效果显著。
重激活宫颈癌TIL细胞IFN-γ释放量ELISA检测结果显示(表2)，TIL:HeLa＝3:1，相比对照组(0ng/mL)，100ng/mL rIL-10刺激的实验组IFN-γ释放量增加23.68％，效果显著。
实施例2
1、肺癌TIL细胞纯化扩增：
肺癌组织剪碎成1-3mm3小块，加入0.05mg/mL型胶原酶5mL，置于解离管中，于组织解离器上将癌组织解离成单细胞，40μm滤网过滤，滤液离心取沉淀，加入含500IU/mL IL-2的TexMACSTMGMPMedium，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养14天。
取适量的PBMC，用X射线辐照1次:100Gy，3min，离心去上清，用TexMACSTMGMPMedium重悬，即为饲养层细胞(Feeder)。Feeder计数，与TIL按1:1混合，并加入30ng/mL CD3抗体和CD3/CD28抗体偶联磁珠，磁珠与TIL比例为1:10，加入3000IU/mL IL-2。混合后的细胞，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养21天。
2、终末衰竭的TIL细胞重激活：
取步骤1中扩增的TIL细胞离心，去掉上清，分成2组，用含3000IU/mL IL-2的TexMACSTMGMPMedium重悬，分别加入浓度0、200ng/mL rIL-10、200ng/mL多肽A、200ng/mL多肽B+接头2+多肽C，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
3、TIL增强肿瘤免疫功能检测：
取步骤2中处理的TIL细胞，离心取沉淀，用含3000IU/mL IL-2的TexMACSTMGMPMedium重悬，与非小细胞肺癌细胞系A549细胞按1:1效靶比混合，总细胞浓度为1x105/mL，分别加入浓度0、200ng/mL rIL-10、200ng/mL多肽A、200ng/mL多肽B+接头2+多肽C，取200μL混合细胞液置于平底圆孔透明96孔板中，每组5孔，于37℃，5％CO2培养箱中共培养。共培养4h，每孔吸走100μL上清(不吸走细胞)用于ELISA试剂盒检测IFN-γ释放量，剩余每孔加入20μLMTS，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3-4h，490nm波长下检测吸光值(OD)，计算杀伤率。检测结果如下表4及下表5所示。
表4.重激活肺癌TIL对A549细胞的杀伤
Figure BDA0003654379880000171
表5.重激活肺癌TIL细胞IFN-γ释放量
Figure BDA0003654379880000172
Figure BDA0003654379880000181
/>
重激活肺癌TIL对A549细胞的杀伤结果显示(表4)，TIL:A549＝1:1，相比对照组(0ng/mL)，200ng/mL rIL-10刺激的实验组杀伤效果增强64.74％，效果显著。
重激活肺癌TIL细胞IFN-γ释放量ELISA检测结果显示(表5)，TIL:A549＝1:1，相比对照组(0ng/mL)，200ng/mL rIL-10刺激的实验组IFN-γ释放量增加了45.80％，效果显著。
实施例3
1、乳腺癌TIL细胞纯化扩增：
乳腺癌组织剪碎成1-3mm3小块，加入1mg/mL胶原酶5mL，置于解离管中，于组织解离器上将癌组织解离成单细胞，180μm滤网过滤，滤液离心取沉淀，加入含1000IU/mL IL-2的
Figure BDA0003654379880000182
培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养35天。
2、终末衰竭的TIL细胞重激活：
取步骤1中扩增的TIL细胞离心，去掉上清，分成2组，1000IU/mL IL-2的
Figure BDA0003654379880000183
培养基重悬，分别加入浓度0、400ng/mL rIL-10，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
3、TIL增强肿瘤免疫功能检测：
取步骤2中处理的TIL细胞，离心取沉淀，用含1000IU/mL IL-2浓度的
Figure BDA0003654379880000184
培养基重悬，与乳腺癌细胞系MCF-7细胞按3:1效靶比混合，总细胞浓度为2x105/mL，分别加入浓度0、400ng/mL rIL-10，取200μL混合细胞液置于平底圆孔透明96孔板中，每组5孔，于37℃，5％CO2培养箱中共培养。共培养24h，每孔吸走100μL上清(不吸走细胞)用于ELISA试剂盒检测IFN-γ释放量，剩余每孔加入20μL MTS，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3-4h，490nm波长下检测吸光值(OD)，计算杀伤率。检测结果如下表6及下表7所示。
表6.重激活乳腺癌TIL对MCF-7细胞的杀伤
Figure BDA0003654379880000185
Figure BDA0003654379880000191
表7.重激活乳腺癌TIL细胞IFN-γ释放量
Figure BDA0003654379880000192
重激活乳腺癌TIL对MCF-7细胞的杀伤结果显示(表6)，TIL:MCF-7＝3:1，相比对照组(0ng/mL)，400ng/mL rIL-10刺激的实验组杀伤效果均增强36.32％，效果显著。
重激活乳腺癌TIL细胞IFN-γ释放量ELISA检测结果显示(表7)，TIL:MCF-7＝3:1，相比对照组(0ng/mL)，400ng/mL rIL-10刺激的实验组IFN-γ释放量增加17.96％，效果显著。
实施例4
1、结肠癌TIL细胞纯化扩增：
结肠癌组织剪碎成1-3mm3小块，加入0.5mg/mL型胶原酶5mL，置于解离管中，于组织解离器上将癌组织解离成单细胞，70μm滤网过滤，滤液离心取沉淀，加入含8000IU/mLIL-2的
Figure BDA0003654379880000193
置于37℃，5％CO2的培养箱中培养21天。
取适量的PBMC，用X射线辐照1次:350Gy，3min，离心去上清，用
Figure BDA0003654379880000194
重悬，即为Feeder。Feeder计数，与TIL按100:1混合，并加入120ng/mL CD3抗体，加入500IU/mL IL-2。混合后的细胞，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养14天。
2、终末衰竭的TIL细胞重激活：
取步骤1中扩增的TIL细胞离心，去掉上清，分成2组，用含500IU/mL IL-2的
Figure BDA0003654379880000195
重悬，分别加入浓度0、800ng/mL rIL-10，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
3、TIL增强肿瘤免疫功能检测：
取步骤2中处理的TIL细胞，离心取沉淀，用含500IU/mL IL-2的
Figure BDA0003654379880000201
重悬，与结肠癌细胞系HCT116细胞按1:1效靶比混合，总细胞浓度为1x105/mL，分别加入浓度0、800ng/mL rIL-10，取200μL混合细胞液置于平底圆孔透明96孔板中，每组5孔，于37℃，5％CO2培养箱中共培养。共培养48h，每孔吸走100μL上清(不吸走细胞)用于ELISA试剂盒检测IFN-γ释放量，剩余每孔加入20μL MTS，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3-4h，490nm波长下检测吸光值(OD)，计算杀伤率。检测结果如下表8及下表9所示。
表8.重激活结肠癌TIL对HCT116细胞的杀伤
Figure BDA0003654379880000202
表9.重激活结肠癌TIL细胞IFN-γ释放量
Figure BDA0003654379880000203
重激活结肠癌TIL对HCT116细胞的杀伤结果显示(表8)，TIL:HCT116＝1:1，相比对照组(0ng/mL)，800ng/mL rIL-10刺激的实验组杀伤效果增强22.22％，效果显著。
重激活结肠癌TIL细胞IFN-γ释放量ELISA检测结果显示(表9)，TIL:HCT116＝1:1，相比对照组(0ng/mL)，800ng/mL rIL-10刺激的实验组IFN-γ释放量增加24.51％，效果显著。
实施例5
1、食管癌TIL细胞纯化扩增：
食管癌组织剪碎成1-3mm3小块，加入2mg/mL胶原酶5mL，置于解离管中，于组织解离器上将癌组织解离成单细胞，70μm滤网过滤，滤液离心取沉淀，加入含3000IU/mL IL-2的GT-T551培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养21天。
2、终末衰竭的TIL细胞重激活：
取步骤1中扩增的TIL细胞离心，去掉上清，分成2组，3000IU/mL IL-2的GT-T551培养基重悬，分别加入浓度0、1600ng/mL rIL-10，置于37℃，5％CO2培养箱中培养96h。
3、TIL增强肿瘤免疫功能检测：
取步骤2中处理的TIL细胞，离心取沉淀，用含3000IU/mL IL-2浓度的GT-T551培养基重悬，与食管癌细胞系TE-1细胞按12:1效靶比混合，总细胞浓度为6.5x105/mL，分别加入浓度0、1600ng/mL rIL-10，取200μL混合细胞液置于平底圆孔透明96孔板中，每组5孔，于37℃，5％CO2培养箱中共培养。共培养24h，每孔吸走100μL上清(不吸走细胞)用于ELISA试剂盒检测IFN-γ释放量，剩余每孔加入20μL MTS，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3-4h，490nm波长下检测吸光值(OD)，计算杀伤率。检测结果如下表10及下表11所示。
表10.重激活食管癌TIL对TE-1细胞的杀伤
Figure BDA0003654379880000211
表11.重激活食管癌TIL细胞IFN-γ释放量
Figure BDA0003654379880000212
重激活食管癌TIL对TE-1细胞的杀伤结果显示(表10)，TIL:TE-1＝12:1，相比对照组(0ng/mL)，1600ng/mL rIL-10刺激的实验组杀伤效果均增强53.75％，效果显著。
重激活食管癌TIL细胞IFN-γ释放量ELISA检测结果显示(表11)，TIL:TE-1＝12:1，相比对照组(0ng/mL)，1600ng/mL rIL-10刺激的实验组IFN-γ释放量增加140.17％，效果显著。
实施例6
1、肝癌TIL细胞纯化扩增：
肝癌组织剪碎成1-3mm3小块，加入0.2mg/mL型胶原酶5mL，置于解离管中，于组织解离器上将癌组织解离成单细胞，100μm滤网过滤，滤液离心取沉淀，加入含6000IU/mL IL-2的GibcoTMCTSTMOpTmizerTMProSFM，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养28天。
取适量的PBMC，用X射线辐照2次:100Gy，3min，离心去上清，用GibcoTMCTSTMOpTmizerTMProSFM重悬，即为饲养细胞(Feeder)。Feeder计数，与TIL按6:1混合，并加入5ng/mL CD3抗体和CD3/CD28/CD137抗体偶联磁珠，磁珠与TIL比例为20:1，加入3000IU/mL IL-2。混合后的细胞，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养14天。
2、终末衰竭的TIL细胞重激活：
取步骤1中扩增的TIL细胞离心，去掉上清，分成2组，用含3000IU/mL IL-2的GibcoTMCTSTMOpTmizerTMProSFM重悬，分别加入浓度0、3200ng/mL rIL-10，置于37℃，5％CO2培养箱中培养120h。
3、TIL增强肿瘤免疫功能检测：
取步骤2中处理的TIL细胞，离心取沉淀，用含3000IU/mL IL-2的GibcoTMCTSTMOpTmizerTMProSFM重悬，与肝癌细胞系HEPG2细胞按6:1效靶比混合，总细胞浓度为3.5x105/mL，分别加入浓度0、3200ng/mL rIL-10，取200μL混合细胞液置于平底圆孔透明96孔板中，每组5孔，于37℃，5％CO2培养箱中共培养。共培养12h，每孔吸走100μL上清(不吸走细胞)用于ELISA试剂盒检测IFN-γ释放量，剩余每孔加入20μL MTS，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育3-4h，490nm波长下检测吸光值(OD)，计算杀伤率。检测结果如下表12及下表13所示。
表12.重激活肝癌TIL对HEPG2细胞的杀伤
Figure BDA0003654379880000221
表13.重激活肝癌TIL细胞IFN-γ释放量
Figure BDA0003654379880000231
重激活肝癌TIL对HEPG2细胞的杀伤结果显示(表12)，TIL:HEPG2＝6:1，相比对照组(0ng/mL)，3200ng/mL rIL-10刺激的实验组杀伤效果增强115.23％，效果显著。
重激活肝癌TIL细胞IFN-γ释放量ELISA检测结果显示(表13)，TIL:HEPG2＝6:1，相比对照组(0ng/mL)，3200ng/mL rIL-10刺激的实验组IFN-γ释放量略增加110.17％，效果显著。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州智瓴生物医药有限公司
<120> 一种增强TIL功效的培养方法
<130> 20220519
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val Arg Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn
20 25 30
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
35 40 45
Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu
50 55 60
Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser
65 70 75 80
Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn
85 90 95
Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu
100 105 110
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys
115 120 125
Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys
130 135 140
Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe
145 150 155 160
Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met
165 170
<210> 2
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu
1 5 10 15
Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr
20 25 30
Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu
35 40 45
Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala
50 55 60
Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln
65 70 75 80
His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp
85 90
<210> 3
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
Thr Glu Phe Asp Phe Ser Asp Tyr Val Lys Arg Lys Asp Pro Asp Ala
1 5 10 15
Leu Leu Lys His Val Lys His Met Leu Leu Leu Thr Asn Thr Phe Gly
20 25 30
Ala Ile Asn Tyr Val Ala Thr Glu Val Phe Arg Glu Glu Leu Gly Ala
35 40 45
Arg Pro Asp Ala Thr Lys Val Leu Ile Ile Ile Thr Asp Gly Glu Ala
50 55 60
Thr Asp Ser Gly Asn Ile Asp Ala Ala Lys Asp Ile Ile Arg Tyr Ile
65 70 75 80
Ile Gly Ile Gly Lys His Phe Gln Thr Lys Glu Ser Gln Glu Thr Leu
85 90 95
His Lys Phe Ala
100
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Gly Arg Gly Asp Glu Gln Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Arg Ser Leu Asp
20
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp Gly Ser Glu Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
Glu Ala Ala Ala Lys Gly Arg Gly Asp Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
Ala Pro Glu Pro Gly Arg Gly Asp Lys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 10
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Val Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu
20 25 30
Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp
35 40 45
Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp
50 55 60
Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
65 70 75 80
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu
85 90 95
Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala
100 105 110
His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
115 120 125
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val
130 135 140
Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr
165 170 175
Met Thr Met Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Gly Arg Gly Asp Glu
180 185 190
Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp Asp Pro Pro Lys Thr His Met
195 200 205
Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala
210 215 220
Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly
225 230 235 240
Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly
245 250 255
Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu
260 265 270
Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro
275 280 285
Leu Thr Leu Arg Trp Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp
290 295 300
Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Thr Glu Phe Asp Phe Ser Asp Tyr Val
305 310 315 320
Lys Arg Lys Asp Pro Asp Ala Leu Leu Lys His Val Lys His Met Leu
325 330 335
Leu Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile Asn Tyr Val Ala Thr Glu Val
340 345 350
Phe Arg Glu Glu Leu Gly Ala Arg Pro Asp Ala Thr Lys Val Leu Ile
355 360 365
Ile Ile Thr Asp Gly Glu Ala Thr Asp Ser Gly Asn Ile Asp Ala Ala
370 375 380
Lys Asp Ile Ile Arg Tyr Ile Ile Gly Ile Gly Lys His Phe Gln Thr
385 390 395 400
Lys Glu Ser Gln Glu Thr Leu His Lys Phe Ala His His His His His
405 410 415
His
<210> 11
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
gcactgctct gttgcctggt cctcctgact ggggtgaggg ccagcccagg ccagggcacc 60
cagtctgaga acagctgcac ccacttccca ggcaacctgc ctaacatgct tcgagatctc 120
cgagatgcct tcagcagagt gaagactttc tttcaaatga aggatcagct ggacaacttg 180
ttgttaaagg agtccttgct ggaggacttt aagggttacc tgggttgcca agccttgtct 240
gagatgatcc agttttacct ggaggaggtg atgccccaag ctgagaacca agacccagac 300
atcaaggcgc atgtgaactc cctgggggag aacctgaaga ccctcaggct gaggctacgg 360
cgctgtcatc gatttcttcc ctgtgaaaac aagagcaagg ccgtggagca ggtgaagaat 420
gcctttaata agctccaaga gaaaggcatc tacaaagcca tgagtgagtt tgacatcttc 480
atcaactaca tagaagccta catgacaatg 510
<210> 12
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
gaccccccca agacacatat gacccaccac cccatctctg accatgaggc caccctgagg 60
tgctgggccc tgggcttcta ccctgcggag atcacactga cctggcagcg ggatggggag 120
gaccagaccc aggacacgga gctcgtggag accaggcctg caggggatgg aaccttccag 180
aagtgggcgg ctgtggtggt gccttctgga gaggagcaga gatacacctg ccatgtgcag 240
catgagggtc tgcccaagcc cctcaccctg agatgg 276
<210> 13
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 13
acagaatttg atttctcaga ttatgttaaa cggaaggacc ctgatgctct gctgaagcat 60
gtaaagcaca tgttgctgtt gaccaatacc tttggtgcca tcaattatgt cgcgacagag 120
gtgttccggg aggagctggg ggcccggcca gatgccacca aagtgcttat catcatcacg 180
gatggggagg ccactgacag tggcaacatc gatgcggcca aagacatcat ccgctacatc 240
atcgggattg gaaagcattt tcagaccaag gagagtcagg agaccctcca caaatttgca 300
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
aaagagtcag gttctgtgtc ttctggaaga ggagacgagc aactagcgca atttcgttcg 60
ctagat 66
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 15
gagggcaaat cttctggatc cggaagagga gacggctccg aatccaagag cact 54
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 16
ggcggcggcg gctctggaag aggagacggc ggcggcggct ct 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 17
gaggctgctg ctaaaggaag aggagacgag gctgctgcta aa 42
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 18
gctcctgaac ctggaagagg agacaagcct gctcct 36
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 19
ggtggtggtg gtggtggtag aggagacggt ggtggtggtg gtggt 45
<210> 20
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 20
atggattaca aggatgacga cgataaggca ctgctctgtt gcctggtcct cctgactggg 60
gtgagggcca gcccaggcca gggcacccag tctgagaaca gctgcaccca cttcccaggc 120
aacctgccta acatgcttcg agatctccga gatgccttca gcagagtgaa gactttcttt 180
caaatgaagg atcagctgga caacttgttg ttaaaggagt ccttgctgga ggactttaag 240
ggttacctgg gttgccaagc cttgtctgag atgatccagt tttacctgga ggaggtgatg 300
ccccaagctg agaaccaaga cccagacatc aaggcgcatg tgaactccct gggggagaac 360
ctgaagaccc tcaggctgag gctacggcgc tgtcatcgat ttcttccctg tgaaaacaag 420
agcaaggccg tggagcaggt gaagaatgcc tttaataagc tccaagagaa aggcatctac 480
aaagccatga gtgagtttga catcttcatc aactacatag aagcctacat gacaatgaaa 540
gagtcaggtt ctgtgtcttc tggaagagga gacgagcaac tagcgcaatt tcgttcgcta 600
gatgaccccc ccaagacaca tatgacccac caccccatct ctgaccatga ggccaccctg 660
aggtgctggg ccctgggctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcgggatggg 720
gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 780
cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggagaggagc agagatacac ctgccatgtg 840
cagcatgagg gtctgcccaa gcccctcacc ctgagatggg agggcaaatc ttctggatcc 900
ggaagaggag acacagaatt tgatttctca gattatgtta aacggaagga ccctgatgct 960
ctgctgaagc atgtaaagca catgttgctg ttgaccaata cctttggtgc catcaattat 1020
gtcgcgacag aggtgttccg ggaggagctg ggggcccggc cagatgccac caaagtgctt 1080
atcatcatca cggatgggga ggccactgac agtggcaaca tcgatgcggc caaagacatc 1140
atccgctaca tcatcgggat tggaaagcat tttcagacca aggagagtca ggagaccctc 1200
cacaaatttg cacatcatca ccatcaccat tga 1233
<210> 21
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 21
Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu
1 5 10 15
Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr
20 25 30
Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu
35 40 45
Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala
50 55 60
Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln
65 70 75 80
His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Gly Lys Ser
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Thr Glu
100 105 110
Phe Asp Phe Ser Asp Tyr Val Lys Arg Lys Asp Pro Asp Ala Leu Leu
115 120 125
Lys His Val Lys His Met Leu Leu Leu Thr Asn Thr Phe Gly Ala Ile
130 135 140
Asn Tyr Val Ala Thr Glu Val Phe Arg Glu Glu Leu Gly Ala Arg Pro
145 150 155 160
Asp Ala Thr Lys Val Leu Ile Ile Ile Thr Asp Gly Glu Ala Thr Asp
165 170 175
Ser Gly Asn Ile Asp Ala Ala Lys Asp Ile Ile Arg Tyr Ile Ile Gly
180 185 190
Ile Gly Lys His Phe Gln Thr Lys Glu Ser Gln Glu Thr Leu His Lys
195 200 205
Phe Ala His His His His His His
210 215

Claims (12)

1. 一种重组白细胞介素10 rIL-10，其特征在于：所述的rIL-10包括：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽A，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽B和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽C；
所述的rIL-10还包括SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的氨基酸接头；
所述的rIL-10的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
2.权利要求1所述的rIL-10在制备和/或培养TIL细胞中的应用。
3.一种TIL细胞的激活方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：采用权利要求1所述的rIL-10培养TIL细胞，激活TIL细胞。
4.一种TIL细胞的制备和/或培养方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：（1）TIL细胞纯化扩增；（2）采用权利要求1所述的rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞。
5.一种TIL细胞的制备和/或培养方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：（1）TIL细胞纯化扩增；（2）采用滋养层细胞快速扩增TIL细胞；（3）采用权利要求1所述的rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞。
6.一种TIL细胞的制备和/或培养方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：（1）TIL细胞纯化扩增；（2）采用权利要求1所述的rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞；（3）采用权利要求1所述的rIL-10与上述步骤（2）重激活的TIL细胞制备得到TIL细胞混悬液。
7.一种TIL细胞的制备和/或培养方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：（1）TIL细胞纯化扩增；（2）采用滋养层细胞快速扩增TIL细胞；（3）采用权利要求1所述的rIL-10重激活终末衰竭的TIL细胞；（4）采用权利要求1所述的rIL-10与上述步骤（3）重激活的TIL细胞制备得到TIL细胞混悬液。
8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于：所述的rIL-10的浓度为10-3200ng/mL。
9.一种TIL细胞，其特征在于：所述的TIL细胞由权利要求3-7任一项所述的方法制备得到。
10.权利要求9所述的TIL细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为实体瘤。
11.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述的抗肿瘤药物包括权利要求9所述的TIL细胞。
12.一种TIL细胞治疗注射液，其特征在于：所述的注射液包括权利要求9所述的TIL细胞。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776451A (en) * 1991-01-16 1998-07-07 Schering Corporation Use of interleukin-10 in adoptive immunotherapy of cancer
CN1224465A (zh) * 1996-05-06 1999-07-28 先灵公司 使用白介素－10产生抑制细胞群体
CN101962413A (zh) * 2010-09-21 2011-02-02 中国科学技术大学 具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用
CN113286609A (zh) * 2018-12-19 2021-08-20 库尔生物制药有限公司 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776451A (en) * 1991-01-16 1998-07-07 Schering Corporation Use of interleukin-10 in adoptive immunotherapy of cancer
CN1224465A (zh) * 1996-05-06 1999-07-28 先灵公司 使用白介素－10产生抑制细胞群体
CN101962413A (zh) * 2010-09-21 2011-02-02 中国科学技术大学 具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用
CN113286609A (zh) * 2018-12-19 2021-08-20 库尔生物制药有限公司 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adaptive plasticity of IL-10+ and IL-35+ Treg cells cooperatively promotes tumor T cell exhaustion;Deepali V. Sawant,et al.;Nat Immunol.;第20卷(第6期);第 724–735页 *

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