KR20230135571A - 종양 침윤 림프구 배지 및 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
TIL 세포 확장용 배양 조성물에 관한 것으로, IL-2, IL-7, IL-15 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 상기 면역 관문 항체는 PD-1 항체, CTLA-4 항체, LAG-3 항체, TIM-3 항체, TIGIT 항체 및 BTLA 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고; TIL 세포 확장 배지, TIL 세포 집단 제조 방법 및 약학 조성물에 더 관한 것이다. 상기 배양 조성물은 IL-2의 용량을 대폭 하향 조절하는 동시에 세포 증식과 활력을 보장하며, 환자에게 재주입한 후 IL-2 치료를 제거하여 부작용을 감소시키고; 확장 과정에서 피더 세포를 사용하지 않으며, 외부 오염을 감소시키고 생산 공정을 단순화하며, 생산 비용을 절감하고, 생산 시간을 단축시킨다.
Description
본 발명은 바이오 기술 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양 침윤 림프구 배지 및 이의 응용에 관한 것이다.
종양 면역 치료 분야의 발전으로 인해 이 요법이 현대 암 치료의 주류가 되었다. 최근 몇 년 동안, 항종양 면역을 자극하고 향상시키기 위한 다양한 전략이 개발되어 여러 임상 연구에서 평가되었다. 악성 종양에 대한 면역 치료는 최근 몇 년 동안 괄목할 만한 임상적 효능을 얻었으며, 여기에는 주로 면역 관문(예를 들어 CTLA4, PD1/PDL1) 단일 항체 치료, 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 치료, TCR-T 치료 등이 포함된다. 여기에서 CAR-T 세포 치료는 혈액 종양 면역에서 매우 현저한 치료 효능을 얻었으나, 고형 종양 면역 치료 측면에서, CAR-T, TCR-T 및/또는 면역 관문 억제제 치료는 모두 상이한 정도로 병목 현상에 직면해 있다.
1998년 미국 국립암연구소(NCI) 외과 분과(Surgery Branch)는 종양 침윤 림프구(TIL)가 환자 치료에 사용된 최초 사례를 보고하였다. TIL에 대한 광범위한 연구는 항종양 활성을 갖는 세포가 흑색종 환자의 종양 조직으로부터 분리될 수 있음을 보여주었다. 최근 몇 년 동안, 입양 전이 치료(ACT)에서 부피가 크고 치유가 어려운 종양, 특히 고형 종양의 경우, TIL이 매우 현저한 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미국 Iovance Therapeutics사는 현재 2상 임상 또는 중추적(pivotal) 3상 단계에 진입한 다수의 TIL 세포 약물을 보유하고 있으며, 이의 적응증으로는 흑색종, 자궁경부암, 두경부암, 비소세포폐암, 난소암, 결장암, 췌장암 및 육종이 있다. 여기에서 LN145는 2019년 FDA로부터 자궁경부암 적응증에 대한 패스트 트랙 지정(fast track designation)을 획득해 화학요법 과정 또는 이후에 진행된 말기 자궁경부암 치료를 위한 획기적인 치료법으로 인정받았다.
종양 면역 치료에 TIL을 사용하려면 다량의 세포가 필요한데, 이는 TIL 세포 확장의 기술 및 공정 제어 측면에서 비교적 큰 도전 과제이다. 과거의 통상적인 방법은 IL-2 기반의 사전 급속 확장 절차(pre-Rapid Expansion Procedure, pre-REP)를 채택한 후 이어서 "급속 확장 과정(REP)"을 수행하는 것이다. REP는 14일 이내에 TIL 세포를 1000배 더 확장할 수 있으나, 이 과정은 항-CD3 항체(OKT3) 및 고용량 IL-2와 함께 피더 세포로서 복사를 거친 복수의 공여체에서 유래한 과량의 동종이계 PBMC(즉 단핵세포, MNC)가 대량으로 필요하다. REP 과정을 거친 TIL은 흑색종 환자가 면역억제 치료 후 면역 입양 치료(ACT)를 성공적으로 구현할 수 있게 한다. WO2018182817A1 및 WO2019190579A1은 TIL의 생산 방법을 개시하였으며, 이는 전술한 TIL 확장 배양 방법을 기반으로 개선된, 대규모 상업 생산에 적합하고 약품 법규 규정에 부합하는 TIL 배양 방법을 제공하여, 1011 자릿수의 TIL을 생성 및 획득하고, 배양 기간을 단축할 수 있다. 그러나 해당 배양 방법은 여전히 피더 세포로서 복수의 공여체에서 유래한 동종이계 복사의 PBMC 세포가 필요하다. 피더 세포의 사용은 여전히 잠재적인 오염 위험이 존재하며, 생산 등급 피더 세포의 제조도 전체 TIL 제조 과정의 복잡성을 증가시킨다. 또한 상기 방법은 여전히 비교적 높은 농도의 IL-2(6000IU/mL, 3000IU/mL)를 사용하며, 후속적인 재주입에서 세포 고갈의 위험이 있을 수 있다.
따라서, 당업계에서는 보다 안전하고 효율이 높은 TIL 세포 생체외 확장 시스템이 필요하다.
본 발명은 종래 기술의 현황을 고려하여, 배지 성분을 최적화함으로써, 보다 안전하고 효율이 높은 TIL 세포 생체외 확장 시스템을 개발하고, 임상적 사용 범위를 개선하였다.
본 발명의 일 양상은 TIL 세포 확장용 배양 조성물을 제공하며, 여기에는 IL-2, IL-7, IL-15 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 포함되고, 바람직하게는, 상기 면역 관문 항체에는 PD-1 항체가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-21, IL-12, GM-CSF 및 기억 T 세포 비율을 증가시키는 소분자 중 어느 하나, 둘, 셋 또는 넷을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 IL-21 및 IL-12, 또는 IL-21, IL-12 및 GM-CSF, 또는 GM-CSF 및 기억 T 세포의 비율을 증가시키는 소분자를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 기억 T 세포 비율을 증가시키는 소분자는 TWS119이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체는 PD-1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, TIM3 항체, TIGIT 항체 및 BTLA 항체 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, OX40 항체, GITR 항체, ICOS 항체, CD206 항체 및 CD40 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체 중에서 선택된 어느 하나, 둘, 셋 또는 넷을 더 포함한다. 예를 들어, 상기 배양 조성물은 (1) CD3 항체 및 CD28 항체, 또는 (2) CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체를 더 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, OX40 항체, GITR 항체, ICOS 항체, CD206 항체 및 CD40 항체는 활성화 항체이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 자가 혈소판 또는 동종 혈소판을 더 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 각각의 항체는 단일 클론 항체(mAb)이다.
하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 항체는 기질과 결합된다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 기질은 고체 기질이며, 예를 들어 마이크로스피어, 웰플레이트, 플레이트, 세포 배양 플라스크 또는 세포 배양 백이다. 바람직하게는, 상기 마이크로스피어는 자성 비드이다. 바람직하게는, 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합이다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체 및 GM-CSF를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CD3 항체 및 CD28 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체 및 GM-CSF를 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, GITR 항체, CD3 항체, CD28 항체, TWS119 및 CD137 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, TIGIT 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GM-CSF 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, LAG3 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, TIGIT 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, CD40 항체, OX-40 항체 및 자가 혈소판을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CTLA-4 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, GITR 항체, GM-CSF, TWS119 및 동종 혈소판을 포함한다. 바람직하게는, 상기 CD3 항체 및 상기 CD28 항체는 기질과 결합된다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 IL-2의 농도는 200 내지 6000IU/mL이며, 예를 들어 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000IU/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 IL-2의 농도는 200 내지 950, 200 내지 850, 200 내지 750, 200 내지 650, 200 내지 550, 200 내지 500IU/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 IL-7의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 IL-7의 농도는 5 내지 65, 5 내지 55, 5 내지 45, 5 내지 35, 5 내지 25, 5 내지 15ng/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 IL-15의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 IL-15의 농도는 5 내지 65, 5 내지 55, 5 내지 45, 5 내지 35, 5 내지 25, 5 내지 15, 10 내지 50ng/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 PD-1 항체의 농도는 1 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 PD-1 항체의 농도는 1 내지 65, 1 내지 55, 1 내지 45, 1 내지 35, 1 내지 25, 1 내지 15, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3μg/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 IL-21의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 IL-21의 농도는 5 내지 65, 5 내지 55, 5 내지 45, 5 내지 35, 5 내지 25, 5 내지 15ng/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 IL-12의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 IL-15의 농도는 5 내지 65, 10 내지 55, 10 내지 45, 10 내지 35, 10 내지 25, 15 내지 25, 10 내지 15ng/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 CD3 항체의 농도는 0.5 내지 10μg/mL이며, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10μg /mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 CD3 항체의 농도는 0.5 내지 9.5, 0.5 내지 8.5, 0.5 내지 7.5, 0.5 내지 6.5, 0.5 내지 5.5, 0.5 내지 3, 1.5 내지 4.5, 2.5 내지 3.5μg/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 CD28 항체의 농도는 0.5 내지 10μg/mL이며, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 CD28 항체의 농도는 0.5 내지 9.5, 0.5 내지 8.5, 0.5 내지 7.5, 0.5 내지 6.5, 0.5 내지 5.5, 0.5 내지 1, 1.5 내지 4.5, 2.5 내지 3.5μg/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 CD137 항체의 농도는 1 내지 100μg/mL이며, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 CD137 항체의 농도는 1 내지 95, 1 내지 85, 1 내지 75, 1 내지 65, 1 내지 55, 1 내지 45, 1 내지 35, 1 내지 25, 1 내지 15, 1 내지 9, 1.5 내지 8, 2 내지 7, 2.5 내지 6, 2.5 내지 5, 3 내지 5μg/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 GITR 항체의 농도는 1 내지 100μg/mL이며, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 GITR 항체의 농도는 1 내지 95, 1 내지 85, 1 내지 75, 1 내지 65, 1 내지 55, 1 내지 45, 1 내지 35, 1 내지 25, 1 내지 15, 1 내지 9, 1.5 내지 8, 2 내지 7, 2.5 내지 6, 3 내지 5, 2 내지 3μg/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 GM-CSF의 농도는 200 내지 5000U/mL이며, 예를 들어 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000U/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 GM-CSF의 농도는 200 내지 1500, 200 내지 1200, 200 내지 950, 200 내지 850, 200 내지 750, 200 내지 650, 200 내지 550, 200 내지 500U/mL이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 TWS119의 농도는 1 내지 500μM이며, 예를 들어 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500μM, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 TWS119의 농도는 1 내지 250, 2 내지 150, 3 내지 95, 4 내지 85, 5 내지 75, 6 내지 65, 7 내지 55, 8 내지 45, 9 내지 35, 10 내지 25, 10 내지 15μM이다.
하나 이상의 상기 구현예에서, 배양 조성물 중 자가 혈소판 또는 동종 혈소판의 농도는 0.5Х108/mL 내지 1.0Х109/mL이며, 예를 들어 0.5Х108, 1.0Х108, 1.5Х108, 2.0Х108, 2.5Х108, 3.0Х108, 3.5Х108, 4.0Х108, 4.5Х108, 5.0Х108, 5.5Х108, 6.0Х108, 6.5Х108, 7.0Х108, 7.5Х108, 8.0Х108, 8.5Х108, 9.0Х108, 9.5Х108, 1.0Х109/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 배양 조성물 중 자가 혈소판 또는 동종 혈소판의 농도는 0.5Х108 내지 9.5Х108, 0.5Х108 내지 7.5Х108, 0.5Х108 내지 5.5Х108, 1.0Х108 내지 5.5Х108, 1.0Х108 내지 5.0Х108, 1.0Х108 내지 4.5Х108, 1.0Х108 내지 4.0Х108, 1.0Х108 내지 3.5Х108, 1.5Х108 내지 3.0Х108, 1.5Х108 내지 2.5Х108/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 및 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 및 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 및 3μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 및 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 및 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 및 1μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 상기 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 상기 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 20ng/mL의 IL-12: 3μg/mL의 CD3 항체: 3μg/mL의 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 20ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 3μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 상기 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 상기 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200IU/mL의 IL-2: 50ng/mL의 IL-7:50ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 10ng/mL의 IL-12: 3μg/mL의 CD3 항체: 0.5μg/mL의 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200IU/mL의 IL-2, 50ng/mL의 IL-7, 50ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 10ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 0.5μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 20ng/mL의 IL-12: 3μg/mL의 CD3 항체: 3μg/mL의 CD28 항체: 3μg/mL의 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 20ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 3μg/mL의 CD28 항체, 3μg/mL의 CD137 항체 및 3μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2: 30ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 15ng/mL의 IL-12: 0.5μg/mL의 CD3 항체: 1μg/mL의 CD28 항체: 2.5μg/mL의 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2, 30ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 1μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 15ng/mL의 IL-12, 0.5μg/mL의 CD3 항체, 1μg/mL의 CD28 항체, 2.5μg/mL의 CD137 항체 및 3μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF: 1 내지 500μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF 및 1 내지 500μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체: 200 내지 500U/mL의 GM-CSF: 1 내지 100μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 500U/mL의 GM-CSF 및 1 내지 100μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 3μg/mL의 CD3 항체: 3μg/mL의 CD28 항체: 3μg/mL의 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체: 200U/mL의 GM-CSF: 10μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 3μg/mL의 CD3 항체, 3μg/mL의 CD28 항체, 3μg/mL의 CD137 항체, 3μg/mL의 GITR 항체, 200U/mL의 GM-CSF 및 10μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2: 40ng/mL의 IL-7: 40ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 1μg/mL의 CD3 항체: 1μg/mL의 CD28 항체: 5μg/mL의 CD137 항체: 2μg/mL의 GITR 항체: 200U/mL의 GM-CSF: 10μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2, 40ng/mL의 IL-7, 40ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 1μg/mL의 CD3 항체, 1μg/mL의 CD28 항체, 5μg/mL의 CD137 항체, 2μg/mL의 GITR 항체, 200U/mL의 GM-CSF 및 10μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체:기질에 결합된 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 3μg/mL의 CD3 항체, 0.5μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 상기 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 10ng/mL의 IL-12: 3μg/mL의 CD3 항체: 0.5μg/mL의 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 10ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 0.5μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 기질에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 기질에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 50ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD137 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 50ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 1μg/mL의 PD-1 항체, 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체, 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체 및 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체: 1 내지 500μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체 및 1 내지 500μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체: 1 내지 100μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체 및 1 내지 100μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 25ng/mL의 IL-15: 2μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체: 10μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 25ng/mL의 IL-15, 2μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 3μg/mL의 GITR 항체 및 10μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체:기질에 결합된 CD3 항체:기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 TIGIT 항체: 200 내지 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 5μg/mL의 TIGIT 항체 및 200 내지 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 7ng/mL의 IL-7: 50ng/mL의 IL-15: 2μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 2.5μg/mL의 TIGIT 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 7ng/mL의 IL-7, 50ng/mL의 IL-15, 2μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 2.5μg/mL의 TIGIT 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 LAG-3 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체:1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 LAG-3 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 LAG-3 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 LAG-3 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2: 30ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 LAG-3 항체: 10ng/mL의 IL-21: 15ng/mL의 IL-12: 0.5μg/mL의 CD3 항체: 1μg/mL의 CD28 항체: 2.5μg/mL의 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2, 30ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 LAG-3 항체, 10ng/mL의 IL-21, 15ng/mL의 IL-12, 0.5μg/mL의 CD3 항체, 1μg/mL의 CD28 항체, 2.5μg/mL의 CD137 항체 및 3μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD40 항체: 1 내지 100μg/mL의 OX-40 항체: 1Х108 내지 5Х108/mL의 자가 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD40 항체, 1 내지 100μg/mL의 OX-40 항체 및 1Х108 내지 5Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 50μg/mL의 TIGIT 항체: 1 내지 50μg/mL의 CD40 항체: 1 내지 50μg/mL의 OX-40 항체: 1Х108 내지 3Х108/mL의 자가 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 50μg/mL의 TIGIT 항체, 1 내지 50μg/mL의 CD40 항체, 1 내지 50μg/mL의 OX-40 항체 및 1Х108 내지 3Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 25ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD137 항체: 2.5μg/mL의 TIGIT 항체: 2μg/mL의 CD40 항체: 3μg/mL의 OX-40 항체: 3Х108/mL의 자가 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 25ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 2.5μg/mL의 TIGIT 항체, 2μg/mL의 CD40 항체, 3μg/mL의 OX-40 항체 및 3Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 1 내지 100μg/mL의 CTLA-4 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF: 1Х108 내지 5Х108/mL의 동종 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 100μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF 및 1Х108 내지 5Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 1 내지 50μg/mL의 CTLA-4 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 1 내지 50μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 50μg/mL의 GITR 항체: 200 내지 500U/mL의 GM-CSF: 1Х108 내지 3Х108/mL의 동종 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 50μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 50μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 50μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 500U/mL의 GM-CSF 및 1Х108 내지 3Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체: 2μg/mL의 CTLA-4 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 5μg/mL의 CD137 항체: 2μg/mL의 GITR 항체: 200U/mL의 GM-CSF: 1Х108/mL의 동종 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 1μg/mL의 PD-1 항체, 2μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 5μg/mL의 CD137 항체, 2μg/mL의 GITR 항체, 200U/mL의 GM-CSF 및 1Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
본 발명은 TIL 세포 확장 배지를 더 제공하며, 여기에는 본원에 따른 TIL 세포 확장용 배양 조성물, 혈청 및/또는 혈소판, 및 기초 배지가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 기초 배지는 AIM-V, X-VIVO, DMEM, RPMI1640, OpTmizerTM, FUJIFILM Irvin MHM-C로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 혈청은 인간 AB 혈청, 대상체 자가 혈청 또는 동물 유래 혈청으로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 혈청의 농도는 1 내지 10%이며, 예를 들어 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 바람직하게는, 혈청의 농도는 1.5 내지 9.5%, 2.5 내지 8.5%, 3.5 내지 7.5%, 4.5 내지 6.5%이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 혈소판의 밀도는 0.5Х108/mL 내지 3Х108/mL이며, 예를 들어 0.5Х108/mL, 1Х108/mL, 1.5Х108/mL, 2Х108/mL, 2.5Х108/mL, 3Х108/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 혈소판은 대상체 자가 혈액 유래의 혈소판 또는 동종 혈액 유래의 혈소판이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배지는 항생제를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 항생제는 페니실린 및 스트렙토마이신 중 하나 이상으로부터 선택된다.
하나 이상의 구현예에서, 배지 중 페니실린의 농도는 10 내지 1000IU/mL, 20 내지 800IU/mL, 50 내지 100IU/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 배지 중 페니실린의 농도는 10 내지 1000IU/mL, 20 내지 800IU/mL, 50 내지 100IU/mL이다.
본 발명은 종양 침윤 림프구(TIL)의 시드 세포 배지를 더 제공하며, 여기에는 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 포함되고, 여기에서 상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고, 상기 면역 관문은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및/또는 CTLA-4를 포함하고, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-2의 농도는 약 3000IU/mL 이하이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/mL 내지 약 3000IU/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-7을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-7의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-15를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-15의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 종양 괴사 인자 TNF를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 TNFα를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 TNFα의 농도는 약 10 내지 약 100pg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 콜로니 자극 인자를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 GM-CSF, G-CSF 및/또는 M-CSF를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 GM-CSF의 농도는 약 200 내지 약 5000U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 G-CSF의 농도는 약 300 내지 약 1000U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 M-CSF의 농도는 약 300 내지 약 800U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 인터페론을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 IFN-γ, IFN-α 및/또는 IFN-β를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 약 1000ng/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IFN-γ의 농도는 약 300 내지 약 1000U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IFN-α의 농도는 약 500 내지 약 1000U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IFN-β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 사이토카인은 IL-4, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-18, IL-12, IL-21 및/또는 IL-10을 더 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-4의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-1α의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-1β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-6의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-9의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-18의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-21의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 IL-10의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 25μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시드 세포 배지는 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함하며, 여기에서 상기 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 항원 결합 단편, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및/또는 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 10μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 5 내지 약 10μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 혈청 배지는 혈청을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 혈청은 인간 AB 혈청을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 혈청의 농도는 약 1 내지 약 10%(v/v)이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 혈청 배지는 AIM-V 배지를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 X-VIVO 배지를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 세포 배양 성분은 항생제를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 세포 배양 성분은 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 1 내지 약 200U/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시드 세포 배지는 M2형 대식세포 억제제를 포함하고, 상기 M2형 대식세포 억제제는 RRx001 및/또는 CNI-1493을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 M2형 대식세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시드 세포 배지는 조절 T 세포(Treg) 억제제를 더 포함하고, 상기 조절 T 세포 억제제는 CAL-101, 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib) 및/또는 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시드 세포 배지는 골수 유래의 억제성 세포(MDSC) 억제제를 더 포함하고, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제는 AG490, 데시타빈(decitabine), 수니티닙(sunitinib) 및/또는 BBI608을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μg/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시드 세포 배지는 T 세포 활성화제를 더 포함하고, 상기 T 세포 활성화제는 LYC-55716, GNE-1858 및/또는 메틸렌 블루를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 T 세포 활성화제의 농도는 약 1 내지 약 10μM이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시드 세포 배지는 T 세포 분화 억제제를 더 포함하고, 상기 T 세포 분화 억제제는 TWS119를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 T 세포 분화 억제제의 농도는 약 1 내지 약 10μM이다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 본 출원에 따른 시드 세포 배지 배양으로 획득한 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 약학 조성물을 제공하며, 여기에는 본 출원에 따른 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 담체가 포함된다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 암 치료 약물 제조에서 상기 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단 및 본 출원에 따른 약학 조성물의 응용을 제공한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 암은 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관기질종양, 장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막기질육종, 골반강 저분화 선암 및 담관암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구 확장에서 상기 시드 세포 배지의 응용을 제공한다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구의 시드 세포 배양 방법을 제공하며, 여기에는 본 출원에 따른 시드 세포 배지에서 분리된 종양 침윤 림프구를 배양하는 단계가 포함된다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구 확장 방법을 제공하며, 여기에는 본 출원에 따른 시드 세포 배지에서 분리된 종양 침윤 림프구를 배양하여, 상기 종양 침윤 림프구의 시드 세포를 획득하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는 필요한 피험자의 복수, 외과적으로 절제된 원발성 종양 샘플, 동시성 및 이시성의 외과적으로 절제된 전이성 종양 샘플, 생검 샘플 및 체액으로 구성된 군으로부터 선택된 샘플에서 유래된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 체액은 혈액, 조직액, 림프액 및/또는 체강액을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관기질종양, 장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막기질육종, 골반강 저분화 선암 및 담관암으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양에서 유래한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는 절단된 종양 조직에서 유래하며, 상기 절단된 종양 조직의 직경은 약 1 내지 약 10mm이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양의 시간은 약 3 내지 20일이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양의 온도는 약 30 내지 42℃이다.
본 발명은 TIL 세포 확장용 배지 또는 TIL 세포 함유 약물 제조에서 본원에 따른 TIL 세포 확장용 배양 조성물의 응용을 더 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 약물은 암 치료에 사용된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 암은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종으로부터 선택된다.
본 발명은 TIL 세포 함유 약물 제조에서 본원에 따른 TIL 세포 확장용 배지의 응용을 더 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 약물은 암 치료에 사용된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 암은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종으로부터 선택된다.
본 발명은 TIL 세포 집단 확장 방법을 더 제공하며, 여기에는 본원에 따른 배지를 사용하여 TIL 세포 집단을 배양하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다.
본 발명은 TIL 세포 집단의 제조 방법을 더 제공하며, 여기에는:
(1) TIL 시드 세포 배지를 이용하여 종양 세포 함유 조직을 배양하여, 제1 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(2) 본원에 따른 배지를 이용하여 제1 TIL 세포 집단을 배양하여, 제2 TIL 세포 집단을 획득하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 암 대상체로부터 획득된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 전처리를 거친다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 전처리에는 종양 조직의 단편화 및/또는 해리가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 기계적 절단의 방식을 통해 단편화된 조직 조각을 형성한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 단편화된 조직 조각의 크기는 2Х2Х2mm3, 3Х3Х3mm3, 4Х4Х4mm3, 5Х5Х5mm3 또는 6Х6Х6mm3이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)의 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에서 상기 제1 TIL 세포 집단 초기의 접종 밀도는 2.0Х105/cm2 내지 5.0Х105/cm2이며, 바람직하게는, 2.5Х105/cm2 내지 4.5Х105/cm2이고, 보다 바람직하게는, 2.5Х105/cm2 내지 3.0Х105/cm2이다.
하나 이상의 구현예에서, 종양 세포 함유 조직은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종 등 암을 앓는 대상체의 종양 조직 또는 체액이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 체액은 혈액, 흉수, 조직액, 림프액 및/또는 복수를 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 TIL 시드 세포 배지는 전술한 바와 같이, PCT/CN2021/096585에 기재된 내용을 참조하며, 이는 본원에 전체로서 인용되었다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)에 따른 배양의 온도는 30 내지 42℃이며, 바람직하게는 37℃이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에 따른 배양의 온도는 30 내지 42℃이며, 바람직하게는 37℃이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)과 단계 (2)에 따른 배양의 CO2 농도는 5%이다.
본 발명은 TIL 세포 집단의 제조 방법을 더 제공하며, 여기에는:
(1) TIL 시드 세포 배지를 이용하여 종양 세포 함유 조직을 배양하여, 제1 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(2) (1)의 상기 제1 TIL 세포 집단을, 전술한 배양 조성물에서 기질과 결합되는 항체 중 어느 하나 이상에 접촉시켜, 제2 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(3) (2)의 상기 제2 TIL 세포 집단을, 전술한 배양 조성물에서 기질과 결합되는 항체를 제외한 성분 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지로 옮겨 배양하여, 제3 TIL 세포 집단을 획득하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 암 대상체로부터 획득된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 수술 또는 생검을 통해 획득된 종양 조직이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 전처리를 거친다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 전처리에는 종양 조직의 단편화 및/또는 해리가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 조직은 기계적 절단의 방식을 통해 단편화된 조직 조각을 형성한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 단편화된 조직 조각의 크기는 2Х2Х2mm3, 3Х3Х3mm3, 4Х4Х4mm3, 5Х5Х5mm3 또는 6Х6Х6mm3이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)의 TIL 시드 세포 배지는 전술한 TIL 시드 세포 배지이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)에 따른 배양의 온도는 30 내지 42℃이며, 바람직하게는 37℃이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)에 따른 배양의 CO2 농도는 5%이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (1)의 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 기질과 결합되는 상기 항체에는 CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체 중 어느 하나 이상이 포함되고; 바람직하게는, CD3 항체 및 CD28 항체가 포함되고; 보다 바람직하게는, CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 상기 기질은 멀티웰 플레이트, 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 상기 접촉은 단계 (1)의 제1 TIL 세포 집단을 기질에 결합된 항체와 함께 배양하는 것이고; 바람직하게는, 상기 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이다. 바람직하게는, 상기 배양의 CO2 농도는 5%이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에서, 상기 배양은 전술한 배양 조성물에서 기질에 결합된 항체를 제외한 성분 중 어느 하나 이상을 함유하는 배지에서 수행한다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에서 상기 접촉은 1 내지 3일 지속된다. 바람직하게는, 2 내지 3일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)의 제1 TIL 세포 집단의 밀도는 1.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL이고; 바람직하게는, 2.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL이고; 보다 바람직하게는 2.5Х105/mL 내지 3.5Х106/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)의 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에 따른 배양의 온도는 30 내지 42℃이며, 바람직하게는 37℃이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에 따른 배양의 CO2 농도는 5%이다.
본 발명은 TIL 세포 집단을 더 제공하며, 이는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된다.
본 발명은 암 치료용 약물 제조에서 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된 TIL 세포 집단의 용도를 더 제공한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 암은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종으로부터 선택된다.
본 발명은 약학 조성물을 더 제공하며, 여기에는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된 전술한 TIL 세포 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 보조제가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 약학 조성물은 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된 TIL 세포 집단 및 히드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 화학 요법 약물을 더 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 화학 요법 약물은 시클로포스파미드(cyclophosphamide)이다.
본 발명은 세포 동결 보존 제제를 더 제공하며, 여기에는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된 전술한 TIL 세포 집단 및 동결 보존액이 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 동결 보존액은 세포 동결 보존액 또는 조직 동결 보존액이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 동결 보존액은 무혈청 동결 보존액이며, 예를 들어 BioLife Solutions의 CryoStor CS10 동결 보존액이 있다.
본 발명은 고형 종양 치료 방법을 더 제공하며, 여기에는:
(1) 고형 종양 환자의 종양 조직을 획득하고, 전술한 TIL 세포 집단 제조 방법으로 TIL 세포를 제조하여 획득하는 단계;
(2) 고형 종양 환자에 대해 전처리를 수행하는 단계; 및
(3) 전처리를 거친 고형 종양 환자에게 (1)의 TIL 세포를 재주입하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 고형 종양 치료 방법에는,
(4) 치료 효능을 평가하는 단계가 더 포함될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 고형 종양에는 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종이 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에 따른 전처리는 상기 고형 종양 환자에게 화학 요법 약물 및 히드록시클로로퀸을 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 상기 화학 요법 약물은 시클로포스파미드이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시클로포스파미드의 투여 용량은 5 내지 50mg/kg/일이다. 바람직하게는, 20 내지 50mg/kg/일이다. 보다 바람직하게는, 20 내지 25mg/kg/일이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 히드록시클로로퀸의 투여 용량은 400 내지 800mg/일이다. 바람직하게는, 500 내지 800mg/일이다. 보다 바람직하게는, 600 내지 800mg/일이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에 따른 전처리는 TIL 세포 재주입 전 6일째 내지 재주입 전 3일째 중의 어느 1일, 2일 또는 3일 수행한다. 바람직하게는, 상기 전처리는 TIL 세포 재주입 전 5일째, 4일째 및 3일째에 수행한다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (2)에 따른 전처리에는, TIL 세포 재주입 전 5일째에 상기 고형 종양 환자에게 400 내지 800mg 히드록시클로로퀸을 경구로 투여하고 5 내지 50mg/kg 시클로포스파미드를 정맥주사로 투여하고, 재주입 전 4일째와 3일째에 각각 상기 고형 종양 환자에게 5 내지 50mg/kg 시클로포스파미드를 정맥주사로 투여하는 단계가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 시클로포스파미드는 정맥주사 또는 경구로 투여된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 히드록시클로로퀸은 정맥주사 또는 경구로 투여된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에서 상기 (1)의 TIL 세포는 본원에서 전술한 세포 동결 보존 제제 중에 보관된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에서 상기 자가 재주입된 TIL 세포의 수는 1.0Х1010 내지 1.2Х1011개의 TIL 세포이다. 바람직하게는, 2.0Х1010 내지 8.0Х1010개의 TIL 세포이다. 보다 바람직하게는, 2.0Х1010 내지 5.0Х1010개의 TIL 세포이다. 보다 바람직하게는, 2.0Х1010 내지 4.0Х1010개의 TIL 세포이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에서 상기 자가 재주입된 TIL 세포의 수는 1.0Х1010개의 TIL 세포, 1.5Х1010개의 TIL 세포, 2.0Х1010개의 TIL 세포, 2.5Х1010개의 TIL 세포, 3.0Х1010개의 TIL 세포, 3.5Х1010개의 TIL 세포, 4.0Х1010개의 TIL 세포, 4.5Х1010개의 TIL 세포, 5.0Х1010개의 TIL 세포, 5.5Х1010개의 TIL 세포, 6.0Х1010개의 TIL 세포, 6.5Х1010개의 TIL 세포, 7.0Х1010개의 TIL 세포, 7.5Х1010개의 TIL 세포, 8.0Х1010개의 TIL 세포, 8.5Х1010개의 TIL 세포, 9.0Х1010개의 TIL 세포, 9.5Х1010개의 TIL 세포, 1.0Х1011개의 TIL 세포, 1.2Х1010개의 TIL 세포이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에서 상기 재주입된 TIL 세포의 세포 제제의 세포 밀도는 1.0Х108/mL 내지 2.0Х108/mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (3)에서 상기 재주입된 TIL 세포의 세포 제제의 부피는 200mL 내지 600mL이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 (3)의 상기 자가 재주입은 정맥주사에 의해 수행된다.
하나 이상의 구현예에서, 단계 (4)의 상기 치료 효능 평가에는 종양 영상 평가 및 종양 마커 발현 수준 평가가 포함된다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 영상 평가는 CT 및/또는 MRI에 의해 수행된다. 바람직하게는, 상기 종양 영상 평가 표준은 RECIST v1.1이다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 종양 마커 발현 수준은 면역조직화학, 혈액 지수 검출 및/또는 고속 시퀀싱 검출에 의해 검사가 수행된다.
발명의 장점:
1) 본 발명은 조직이 최적화된 확장 배지를 사용하며, 여기에는 IL-2 이외의 더 많은 다른 사이토카인과 활성화 항체의 도입이 포함되고, 이는 생체외 배양 과정에서 종양 미세환경에서 억제된 TIL 세포를 효과적으로 재활성화시킬 수 있다.
2) IL-2의 용량을 대폭 하향조절하는 동시에 세포 증식과 활력을 보장하여, 잠재적인 세포 고갈의 위험을 줄이며, 동시에 최적화된 생체외 배양 공정을 통해 배양된 TIL 세포의 IL-2에 대한 의존도를 크게 낮추었다.
3) 본 발명의 TIL 세포 배지와 TIL 세포 배양 방법으로 배양하여 획득한 TIL은 IL-2에 대한 의존도를 크게 낮추며, 임상 환자 재주입 전의 전처리에서 일반 치료 방안에 필수적인 화학 요법 약물 플루다라빈(fludarabine)을 제거할 수 있고, 사용된 화학 요법 약물 시클로포스파미드의 용량도 현재 일반적인 용량에 비해 크게 감소되었으며, 일반적인 TIL 재주입 후 IL-2를 대용량 주사하는 것에 비해, 재주입 후 IL-2 주사 없이도 인체 내에서 효율적이고 안정적으로 증식할 수 있고, 높은 수준의 이상 반응이 없어, 유의미하고 긍정적인 치료 효능을 나타내는 동시에 임상적 부작용이 크게 감소되었고; 동시에 일부 신체증후 상태가 비교적 떨어져 고용량 IL-2 치료를 견딜 수 없는 말기 고형 종양 환자에 대해서도 본 발명의 배양법에 의해 제조된 TIL 세포를 사용하여 자가 재주입 치료를 수행할 수 있으며, 즉 본 발명의 TIL 세포 배지와 TIL 세포 배양 방법에 의해 제조된 TIL 세포는 더 많은 잠재적인 고형 종양 환자를 커버할 수 있다.
4) 본 발명의 TIL 세포는 확장 과정에서 피더 세포(예를 들어 외인성 동종 PBMC 또는 기타 세포)를 사용하지 않으며, 외부 오염을 감소시키는 동시에 생산 공정이 크게 간소화되어, 생산 비용이 낮아지고 생산 시간이 단축되었다. 본 발명의 배지를 사용하여 TIL 세포를 제조하면 피더 세포를 사용하지 않고도 1010 내지 1011 세포를 빠르게 획득할 수 있다.
도 1은 조직 샘플 T001 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 2는 조직 샘플 T002 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 3은 조직 샘플 T003 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 4는 조직 샘플 T004 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 5는 조직 샘플 T005 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 6은 조직 샘플 T006 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 7은 조직 샘플 T007 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 8은 조직 샘플 T008 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 9는 조직 샘플 T009 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 10은 조직 샘플 T010 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 11은 조직 샘플 T011 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 12는 조직 샘플 T012 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 13은 조직 샘플 T013 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 14는 조직 샘플 T014 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 15는 조직 샘플 T015 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 16은 조직 샘플 T016 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 17은 조직 샘플 T017 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 18은 표적 세포 HGC27에 대한 T001 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 19는 표적 세포 A375에 대한 T002 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 20은 표적 세포 HeLa에 대한 T003 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 21은 표적 세포 HGC27에 대한 T005 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 22는 표적 세포 HGC27에 대한 T004 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 23은 동계 종양 오가노이드에 대한 T006 유래 TIL의 사멸 효과도이다.
도 24는 HGC27 유래의 CDX 종양 조직 마우스 모델에 대한 T001 유래 TIL의 사멸 효과이다.
도 25는 A375 유래의 종양 조직 CDX 마우스 모델에 대한 T002 유래 TIL의 사멸 효과이다.
도 26은 상동적 대합(homologous pairing)의 PDX 종양 조직 마우스 모델에 대한 T008 유래 TIL의 사멸 효과도이다.
도 27은 상동적 대합(homologous pairing)의 PDX 종양 조직 마우스 모델에 대한 T007 유래 TIL의 생체내 종양 향성 효과도이다.
도 28은 T009 환자의 TIL 세포 재주입 치료 후 상이한 시점의 영상학적 평가 결과이다.
도 29는 T009 환자의 재주입 전부터 재주입 후 120일에 가까운 시간 구간에서 말초 혈액 내 백혈구, 호중구 및 림프구 수의 변화 추세 그래프이다.
도 30은 T009 환자의 재주입 전부터 재주입 후 20일의 시간 구간에서 말초 혈액 내 백혈구, 호중구 및 림프구 수의 변화 추세 그래프이다.
도 31은 T009 환자의 말초 혈액에 재주입된 TIL 세포의 TCR 클론형 빈도와 림프구 총 수의 시간 변화에 따른 중첩 추세이다.
도 2는 조직 샘플 T002 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 3은 조직 샘플 T003 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 4는 조직 샘플 T004 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 5는 조직 샘플 T005 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 6은 조직 샘플 T006 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 7은 조직 샘플 T007 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 8은 조직 샘플 T008 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 9는 조직 샘플 T009 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 10은 조직 샘플 T010 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 11은 조직 샘플 T011 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 12는 조직 샘플 T012 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 13은 조직 샘플 T013 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 14는 조직 샘플 T014 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 15는 조직 샘플 T015 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 16은 조직 샘플 T016 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 17은 조직 샘플 T017 유래 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과도이다.
도 18은 표적 세포 HGC27에 대한 T001 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 19는 표적 세포 A375에 대한 T002 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 20은 표적 세포 HeLa에 대한 T003 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 21은 표적 세포 HGC27에 대한 T005 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 22는 표적 세포 HGC27에 대한 T004 유래 TIL의 RTCA 사멸 효과도이다.
도 23은 동계 종양 오가노이드에 대한 T006 유래 TIL의 사멸 효과도이다.
도 24는 HGC27 유래의 CDX 종양 조직 마우스 모델에 대한 T001 유래 TIL의 사멸 효과이다.
도 25는 A375 유래의 종양 조직 CDX 마우스 모델에 대한 T002 유래 TIL의 사멸 효과이다.
도 26은 상동적 대합(homologous pairing)의 PDX 종양 조직 마우스 모델에 대한 T008 유래 TIL의 사멸 효과도이다.
도 27은 상동적 대합(homologous pairing)의 PDX 종양 조직 마우스 모델에 대한 T007 유래 TIL의 생체내 종양 향성 효과도이다.
도 28은 T009 환자의 TIL 세포 재주입 치료 후 상이한 시점의 영상학적 평가 결과이다.
도 29는 T009 환자의 재주입 전부터 재주입 후 120일에 가까운 시간 구간에서 말초 혈액 내 백혈구, 호중구 및 림프구 수의 변화 추세 그래프이다.
도 30은 T009 환자의 재주입 전부터 재주입 후 20일의 시간 구간에서 말초 혈액 내 백혈구, 호중구 및 림프구 수의 변화 추세 그래프이다.
도 31은 T009 환자의 말초 혈액에 재주입된 TIL 세포의 TCR 클론형 빈도와 림프구 총 수의 시간 변화에 따른 중첩 추세이다.
TIL 세포 배양에서 외인성 오염을 줄이고 생산 공정을 단순화하며, 생산 비용을 낮추고, 생산 시간을 단축하기 위해, 본 발명자는 종양 조직으로부터 TIL 세포의 확장(REP) 배지 제조 및 TIL 세포 제조 또는 확장 방법을 개발하였다. 이러한 배지를 사용하여 TIL 세포를 처리하면 피더 세포를 사용하지 않고도 1010 내지 1011 이상의 세포를 빠르게 확장하여 획득할 수 있다.
용어 정의
본 출원에서, 용어 "인터페론"은 통상적으로 바이러스 복제 및 세포 증식을 억제하고 면역 반응을 조절하는 종 특이성이 높은 단백질 계열을 의미한다. 전형적으로 적합한 인터페론에는 재조합 인터페론 α-2b, 재조합 인터페론 α-2a, 재조합 인터페론 α-2c, 인터페론 α-n1, 컨센서스 α 인터페론 또는 인터페론 α-n3이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "콜로니 자극 인자"는 통상적으로 분비형의 당단백질을 지칭하며, 이는 조혈 줄기 세포 표면 상의 수용체 단백질과 결합하여, 세포내 신호 전달 경로를 활성화시킴으로써, 세포를 증식시키고 특정 유형의 혈액 세포로 분화시킨다(통상적으로 백혈구이며, 적혈구 형성에 대해서는, 에리스로포이에틴(erythropoietin)을 참조함). 이들은 인공 합성되어 외인성으로 투여될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "항원 결합 단편"은 통상적으로 항체 분자의 일부분을 지칭하며, 이는 항체와 항원 사이의 특이성 결합을 담당하는 아미노산을 포함한다. 항원에서 항체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 부분은 전술한 바와 같이 "에피토프"라고 불린다. 전술한 바와 같이, 항원 결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있지만, 둘 모두를 반드시 포함할 필요는 없다. Fd 단편은 예를 들어 2개의 VH 영역을 가지며 통상적으로 완전한 항원 결합 도메인의 일부 항원 결합 기능을 보유한다. 항체의 항원 결합 단편의 예시에는 (1) VL, VH, 불변 경쇄(CL) 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편인 Fab 단편; (2) 힌지 영역의 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편이 있는 2가 단편인 F(ab'); (3) 2개의 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (4) 항체 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (5) VH 도메인을을 갖는 dAb 단편(Ward et al., "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli," Nature 341:544-546(1989), 이는 본원에 전체로서 인용됨); (6) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (7) 예를 들어 scFv-라이브러리 유래의 단일 사슬 Fv(scFv)가 포함된다. Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH는 독립적인 유전자에 의해 암호화되나, 이는 합성 링커를 통해 재조합 방법으로 결합될 수 있고, 합성 링커는 이것이 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조되도록 한다(단일 사슬 Fv(scFv)라고 칭함)(예를 들어 Huston et al., "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988) 참조). 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 획득되며, 완전한 항체와 동일한 방식으로 상기 단편의 기능을 평가한다. 본 출원에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원, 특히 세포 표면 수용체 분자 항원에 특이적으로 결합하는 리간드를 더 포함한다. 리간드는 통상적으로 높은 친화도 및 특이성 방식으로 수용체 단백질(예를 들어 상기 항원)에 결합하여 기능적 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드 또는 화합물이다. 예를 들어, 상기 리간드는 CD40의 리간드 CD40L, CD137의 리간드 CD137L, CD28의 리간드 CD80 및/또는 OX-40의 리간드 OX-40L을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "면역 관문"은 통상적으로 CD4+와 CD8+T 세포의 세포 표면 상의 분자 그룹을 지칭한다. 이러한 분자는 항종양 면역 반응을 하향 조절하거나 억제하는 "브레이크"로서 효과적으로 사용될 수 있다. DNA, RNA 또는 단백질 수준을 억제함으로써 이러한 억제성 분자를 억제할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "활성화 항체"는 통상적으로 TCR 및/또는 공동자극수용체와 같은 T 세포 표면 수용체와 같은 면역 세포에 대한 항체를 지칭하며, 이러한 항체는 TCR 및/또는 공동자극수용체와 서로 결합되어, 이러한 수용체의 다운스트림의 활성화 신호 경로를 개시함으로써, 상기 면역 세포의 활성화 및 증식 수준을 현저하게 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "공동자극수용체"는 통상적으로 T 세포와 같은 면역 세포 표면에 발현되는 면역 반응의 활성화가 의존하는 일련의 수용체를 지칭한다. 공동자극수용체는 항원 제시 세포가 존재하고 제1 신호가 제공되었다는 전제 하에서, 그에 상응하는 활성화 항체, 리간드 또는 항원 결합 단편과 서로 결합한 후 공동자극 신호를 개시하여, 면역 이펙터 세포를 완전히 활성화시킨다. 공동자극수용체에 의해 매개된 신호 경로의 활성화는 통상적으로 면역 반응의 유효한 발생에 대해 핵심적인 역할을 수행한다. 일반적인 공동자극수용체에는 CD28, CD40, CD137 및 OX-40이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "종양 괴사 인자 TNF"는 통상적으로 TNF 단백질을 지칭하며, 이는 TNF 리간드의 상과(superfamily)가 아니다. 인간 TNFα의 Genbank 수탁 번호는 NP_000585.2이다. 용어 "TNFα"는 TNFα의 전구체 형태, 프로-TNFα(pro-TNFa), 전장 TNFα 및 세포내 과정에 의해 생성된 임의 형태의 TNFα를 포함한다. 해당 용어는 TNFα의 자연 발생 및 비자연 발생 변이체를 더 포함하며, 예를 들어 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체 및 이소형이 있다. TNFα는 TNFR1(1형 TNF 수용체; CD120a; p55/60) 및 TNFR2(2형 TNF 수용체; CD120b; p75/80)의 두 수용체에 결합할 수 있다. TNFα는 전염증성 사이토카인으로 기능하며, 예를 들어 신경염증에서 기능한다.
본 출원에서, 용어 "종양 침윤 림프구"는 통상적으로 종양 조직으로부터 분리된 침윤 림프구를 지칭한다. 면역조직화학적 염색 결과에 따르면, 종양 침윤 림프구에는 CD3+ T 세포, CD20+, CD79α+ B 세포, 형질 세포 및 CD56+ NK 세포가 포함될 수 있으며; T 세포, 소량의 B 세포, NK 세포, 대식세포 및 수지상 세포가 포함될 수도 있다. 상기 종양 침윤 림프구는 직접적인 세포 독성 T 림프구와 사이토카인 분비를 통해 고효율의, 특이성이 강한 항종양 사멸 효과를 나타낼 수 있다. 본 출원에서, 상기 종양 침윤 림프구는 단핵 백혈구 세포를 포함할 수 있으며, 상기 단핵 백혈구 세포는 혈류를 떠나 종양으로 이동한다. 상기 종양 침윤 림프구는 T 세포, B 세포, 자연살해세포 및 자연살해 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "시드 세포"는 통상적으로 본 출원의 배지 내에 포함된 임의 적합한 배지를 사용하여 종양 조직으로부터 배양한 종양 침윤 림프구를 지칭한다. 이러한 세포는 후속적으로 추가 확장 배양하는 시작 세포 집단으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 피험자 개체에 대해 재주입 치료를 수행하는 데 사용되는 세포 집단과 같이, 최종 용도의 세포 집단으로도 사용될 수 있다. 상기 시드 세포는 종양 조직으로부터 임의의 상이한 배양 기간을 거쳐 획득할 수 있고, 상기 시드 세포의 배양 기간은 상기 시드 세포의 후속 용도에 따라 결정될 수 있으며, 특정한 배양 기간에 국한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "IL-15"는 통상적으로 T 세포(특히 장 상피내 림프구(IEL)) 및 자연살해(NK) 세포의 유효한 성장, 생존 및 활성화 인자를 충당하는 전염증성 사이토카인을 의미하며, "IL-15 항체" 및 "인터류킨 15"로 불릴 수도 있다. CD, 류마티스 관절염(RA) 및 건선을 비롯한 다양한 염증성 질환에서 IL-15의 발현 증가가 입증되었다(Malamut et al., 2010). IL-15는 CD 면역병리학의 중심 조절인자이자 RCD에서 림프종 형성의 비중복 동인으로 간주된다.
본 출원에서, 용어 "IL-2"는 통상적으로 정상적인 말초 혈액 림프구에 의해 생성되고 체내에 저농도로 존재하는 림포카인으로부터 유래된 단백질을 지칭한다. 초기에, Morgan et al. (1976) Science 193: 1007-1008에는 IL-2가 기재되었는데, 자극된 T 림프구 증식을 유도할 수 있는 능력 때문에 처음에 T 세포 성장 인자로 불렸다. 해당 용어는 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 IL-2의 발현 후 변형된 단백질도 포함한다.
본 출원에서, 용어 "IL-7"은 통상적으로 IL-7 유전자에 의해 암호화된 단백질을 의미한다. IL-7은 골수와 흉선의 기질 세포에서 분비되는 조혈 성장 인자이다. 이는 각질형성세포, 수지상 세포, 간세포, 뉴런 및 상피 세포에 의해 생성될 수 있다. IL-7은 T 세포 및 B 세포에 대한 작용에 관여할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "PD-1"은 통상적으로 CD28 계열에 속하는 면역 억제 수용체를 지칭한다. PD-1은 주로 이전에 활성화된 T 세포의 생체 내에서 발현되며, 두 가지 리간드인 PD-1과 PD-2를 결합한다. 완전한 hPD-1 서열은 GenBank 수탁 번호 U64863을 참조할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "LYC-55716"는 통상적으로 RORγ 활성화제를 지칭한다. 이의 CAS 번호는 2055536-64-4이다.
본 출원에서, 용어 "GNE-1858"은 통상적으로 HPK1 억제제를 지칭하며, 이의 CAS 번호는 T11438이다.
본 출원에서, 용어 "TWS119"는 통상적으로 GSK-3 억제제를 지칭하며, 이의 CAS 번호는 601514-19-6이다.
본 출원에서, 용어 "RRX-001"은 통상적으로 방사선 감작 활성을 가진 후생 유전학적 조절인자를 지칭한다. 상기 RRX-001은 CD47/SIRPα 축을 하향 조절하고 종양 미세 환경에서 TAM 및 기타 면역 억제 세포를 면역 자극 표현형으로 재분극시킬 수 있다. 이의 CAS 번호는 925206-65-1이다.
본 출원에서, 용어 "CNI-1493"은 통상적으로 염증성 사이토카인(TNF 포함)의 생성을 차단할 수 있는 화합물을 지칭하며, 이의 CAS 번호는 164301-51-3이다.
본원에서, 용어 "TIL 유도"는 동물 종양으로부터 TIL 세포를 분리하는 과정을 지칭한다. TIL 세포를 일정 수량으로 생체외 확장한 후, 동물 체내에 다시 주입하여, 종양 성장, 전이를 제어하는 효과를 구현할 수 있다.
본 발명은 개방 수술 또는 최소 침습 수술에 의해 획득된 종양 조직을 포함하는 임의 종양 조직으로부터 TIL을 분리하는데 적합하다. 예시적인 종양 조직은 예를 들어 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종 등의 암 종양 조직이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 TIL 세포 확장용 배양 조성물 및 배지를 제공한다. 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 방안에서, 상기 배양 조성물은 IL-21, IL-12, GM-CSF 및 기억 T 세포 비율을 증가시키는 소분자 중 어느 하나, 둘, 셋 또는 넷을 더 포함한다. 상기 기억 T 세포 비율을 증가시키는 소분자에는 TWS119가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
상기 면역 관문 항체는 PD-1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, TIM3 항체, TIGIT 항체 및 BTLA 항체 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다.
상기 배양 조성물은 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, OX40 항체, GITR 항체, ICOS, CD206 항체 및 CD40 항체 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체 중 어느 하나, 둘, 셋 또는 넷을 더 포함한다. 본원에 따른 배양 조성물 또는 배지의 항체는 분산 또는 고정된 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 항체는 기질(예를 들어 고체 기질)과 결합될 수 있다. 특정한 예시적 일 구현예에서, 상기 고체 기질은 마이크로스피어이며, 예를 들어 자성 비드가 있다. 특정한 예시적 일 구현예에서, 상기 고체 기질은 세포 배양용 플레이트 재질이며, 예를 들어 웰 플레이트, 접시, 세포 배양 플라스크 또는 세포 배양 백이 있다.
본원에서, 면역 관문 항체는 면역 세포에서 자가면역 기능을 조절하는 단백질 분자에 대한 항체이다.
본원에서, 당업계에 공지된 바와 같이, 자연적인 완전한 항체는 사량체이며, 여기에는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드가 포함된다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인: 아미노 말단의 가변 도메인 VH, 불변 도메인 CH1, 불변 도메인 CH2 및 카르복시 말단의 불변 도메인 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 즉 아미노 말단의 가변 도메인 VL 및 카르복시 말단의 불변 도메인 CL을 포함한다. 각각의 가변 도메인은 3개의 "상보성 결정 영역", 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3와, 4개의 "프레임워크" 영역: FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. "항원 결합 단편"은 항체에서 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단편을 나타낸다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, Fv 단편, 이황화 결합된 Fv 단편, 단일 사슬 항체(scFv), 분리된 CDR 또는 CDR 세트, 폴리펩티드-Fc 융합체, 단일 도메인 항체, 낙타 항체, 차폐 항체, 소형 모듈식 면역 약물, 이중 기능성 항체, 나노 항체, 휴마바디(Humabody) 항체를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체 및 GM-CSF를 포함한다. 또는, 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체를 포함한다. 또는 상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, GITR 항체, GM-CSF 및 TWS119를 포함한다.
본 발명의 TIL 세포 확장 배지는 본원에 따른 TIL 세포 확장용 배양 조성물, 혈청 및/또는 혈소판, 및 기초 배지를 포함한다. 본원에 따른 배양 조성물 또는 배지는 항생제를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항생제는 페니실린 및 스트렙토마이신 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본원에 따른 배양 조성물 또는 배지에서, IL-2의 농도는 200 내지 6000IU/mL이며, 예를 들어 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000IU/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이고; IL-7의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. IL-15의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. PD-1 항체의 농도는 1 내지 100μg /mL이며, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 7, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. IL-21의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. IL-12의 농도는 5 내지 100ng/mL이며, 예를 들어 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100ng/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. CD3 항체의 농도는 0.5 내지 10μg/mL이며, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10μg /mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. CD28 항체의 농도는 0.5 내지 10μg/mL이며, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. CD137의 농도는 1 내지 100μg/mL이며, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 배양 조성물 중 GITR 항체의 농도는 1 내지 100μg/mL이며, 예를 들어 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100μg/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. 배양 조성물 중 GM-CSF의 농도는 200 내지 5000U/mL이며, 예를 들어 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000U/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다. TWS119의 농도는 1 내지 500μM이며, 예를 들어 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500μM, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다.
구체적인 구현예에서, 본원에 따른 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 및 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 및 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 500IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 및 3μg/mL의 PD-1 항체를 포함한다. 상기 배지는 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 OpTmizerTM을 더 함유한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 본원에 따른 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체를 포함한다. 상기 배지는 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 OpTmizerTM을 더 함유한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 20ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 3μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF를 포함한다. 상기 배지는 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 AIM-V를 더 함유한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200IU/mL의 IL-2: 50ng/mL의 IL-7: 50ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 10ng/mL의 IL-12: 3μg/mL의 CD3 항체: 0.5μg/mL의 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF를 포함한다. 상기 배지는 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 AIM-V를 더 함유한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 400IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 20ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 3μg/mL의 CD28 항체, 3μg/mL의 CD137 항체 및 3μg/mL의 GITR 항체를 포함한다. 상기 배지는 자가 혈소판, PS 이중 항체 및 X-VIVO를 더 함유한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 400IU/mL의 IL-2: 30ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 15ng/mL의 IL-12: 0.5μg/mL의 CD3 항체: 1μg/mL의 CD28 항체: 2.5μg/mL의 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체를 포함한다. 상기 배지는 자가 혈소판, PS 이중 항체 및 X-VIVO를 더 함유한다.
구체적인 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF 및 1 내지 500μM의 TWS119를 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 3 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 500U/mL의 GM-CSF 및 1 내지 100μM의 TWS119를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 300IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 3μg/mL의 CD3 항체, 3μg/mL의 CD28 항체, 3μg/mL의 CD137 항체, 3μg/mL의 GITR 항체, 200U/mL의 GM-CSF 및 10μM의 TWS119를 포함한다. 또는 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물 또는 배지는 300IU/mL의 IL-2: 40ng/mL의 IL-7: 40ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 1μg/mL의 CD3 항체: 1μg/mL의 CD28 항체: 5μg/mL의 CD137 항체: 2μg/mL의 GITR 항체: 200U/mL의 GM-CSF: 10μM의 TWS119를 포함한다. 상기 배지는 동종 혈소판, PS 이중 항체 및 MHM-C를 더 함유한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 3μg/mL의 CD3 항체, 0.5μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 10ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 10ng/mL의 IL-21: 10ng/mL의 IL-12: 3μg/mL의 CD3 항체: 0.5μg/mL의 CD28 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 상기 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 10ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 10ng/mL의 IL-21, 10ng/mL의 IL-12, 3μg/mL의 CD3 항체, 0.5μg/mL의 CD28 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 50ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD137 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 하나의 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 기질에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 기질에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 50ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 1μg/mL의 PD-1 항체, 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체, 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체 및 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체: 1 내지 500μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체: 1 내지 100μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 25ng/mL의 IL-15: 2μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체: 10μM의 TWS119와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체 및 1 내지 500μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체 및 1 내지 100μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 25ng/mL의 IL-15, 2μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 3μg/mL의 GITR 항체 및 10μM의 TWS119, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 TIGIT 항체: 200 내지 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 7ng/mL의 IL-7: 50ng/mL의 IL-15: 2μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 2.5μg/mL의 TIGIT 항체: 500U/mL의 GM-CSF와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 5μg/mL의 TIGIT 항체 및 200 내지 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 7ng/mL의 IL-7, 50ng/mL의 IL-15, 2μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 2.5μg/mL의 TIGIT 항체 및 500U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 LAG-3 항체: 5 내지 100ng/mL의 IL-21: 5 내지 100ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 LAG-3 항체: 5 내지 50ng/mL의 IL-21: 5 내지 50ng/mL의 IL-12: 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체: 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체: 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2: 30ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 LAG-3 항체: 10ng/mL의 IL-21: 15ng/mL의 IL-12: 0.5μg/mL의 CD3 항체: 1μg/mL의 CD28 항체: 2.5μg/mL의 CD137 항체: 3μg/mL의 GITR 항체와 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 LAG-3 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 LAG-3 항체, 5 내지 50ng/mL의 IL-21, 5 내지 50ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 5μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 5μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 5μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 5μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 400IU/mL의 IL-2, 30ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 LAG-3 항체, 10ng/mL의 IL-21, 15ng/mL의 IL-12, 0.5μg/mL의 CD3 항체, 1μg/mL의 CD28 항체, 2.5μg/mL의 CD137 항체 및 3μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD40 항체: 1 내지 100μg/mL의 OX-40 항체: 1Х108 내지 5Х108/mL의 자가 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 기질에 결합된 CD137 항체: 1 내지 50μg/mL의 TIGIT 항체: 1 내지 50μg/mL의 CD40 항체: 1 내지 50μg/mL의 OX-40 항체: 1Х108 내지 3Х108/mL의 자가 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2: 5ng/mL의 IL-7: 25ng/mL의 IL-15: 3μg/mL의 PD-1 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD3 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD28 항체: 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백에 결합된 CD137 항체: 2.5μg/mL의 TIGIT 항체: 2μg/mL의 CD40 항체: 3μg/mL의 OX-40 항체: 3Х108/mL의 자가 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD40 항체, 1 내지 100μg/mL의 OX-40 항체 및 1Х108 내지 5Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 50μg/mL의 TIGIT 항체, 1 내지 50μg/mL의 CD40 항체, 1 내지 50μg/mL의 OX-40 항체 및 1Х108 내지 3Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 500IU/mL의 IL-2, 5ng/mL의 IL-7, 25ng/mL의 IL-15, 3μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 2.5μg/mL의 TIGIT 항체, 2μg/mL의 CD40 항체, 3μg/mL의 OX-40 항체 및 3Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
하나 이상의 다른 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2: 5 내지 100ng/mL의 IL-7: 5 내지 100ng/mL의 IL-15: 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체: 1 내지 100μg/mL의 CTLA-4 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체: 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF: 1Х108 내지 5Х108/mL의 동종 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2: 5 내지 50ng/mL의 IL-7: 5 내지 50ng/mL의 IL-15: 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체: 1 내지 50μg/mL의 CTLA-4 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 1 내지 50μg/mL의 CD137 항체: 1 내지 50μg/mL의 GITR 항체: 200 내지 500U/mL의 GM-CSF: 1Х108 내지 3Х108/mL의 동종 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2: 10ng/mL의 IL-7: 30ng/mL의 IL-15: 1μg/mL의 PD-1 항체: 2μg/mL의 CTLA-4 항체: 기질에 결합된 CD3 항체: 기질에 결합된 CD28 항체: 5μg/mL의 CD137 항체: 2μg/mL의 GITR 항체: 200U/mL의 GM-CSF: 1Х108/mL의 동종 혈소판과 같은 비율의 각각의 성분을 포함한다.
구체적인 다른 일 구현예에서, 상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 100μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF 및 1Х108 내지 5Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 50μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 50μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 50μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 500U/mL의 GM-CSF 및 1Х108 내지 3Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 배양 조성물은 300IU/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-7, 30ng/mL의 IL-15, 1μg/mL의 PD-1 항체, 2μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 5μg/mL의 CD137 항체, 2μg/mL의 GITR 항체, 200U/mL의 GM-CSF 및 1Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분의 등비 농축물을 포함한다.
본원에 따른 항체는 임의 물종에서 유래된 항체 또는 재조합 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단일 클론 항체이다. 이러한 항체는 당업계에 공지된 것으로서, 예를 들어 PD-1 항체 티슬렐리주맙(Tislelizumab), PD-1 항체 신틸리맙(Sintilimab), PD-1 항체 토리팔리맙(Toripalimab), PD-1 항체 캄렐리주맙(Camrelizumab), CD3 항체 ab86883, CD28 항체 MAB342, GITR 항체는 CN103951753B에서 SEQ ID NO:104 및 SEQ ID NO:105로 표시되고, CD137 항체는 CN111182919A에서 SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11로 표시된다. 이러한 특허문헌 또는 공개는 본원에 전체로서 인용되었다.
상기 유도 조성물 또는 배지에서, CD3 항체와 CD28 항체 농도비는 3:1 내지 1:6, 2:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4이다. 상기 확장 조성물 또는 배지에서, CD3 항체와 CD28 항체 농도비는 3:1 내지 1:6, 2:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4이고; CD3 항체와 CD137 항체 농도비는 3:1 내지 1:6, 2:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4이다.
본원에 따른 혈청은 당업계에 공지된 것으로서 동물 세포(예를 들어 TIL 세포) 배양에 사용될 수 있는 임의 혈청일 수 있으며, 예를 들어 인간 AB 혈청, 대상체 자가 혈청 또는 동물 유래 혈청이 있다. 혈청의 농도는 1 내지 10%이며, 예를 들어 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다.
본원에 따른 혈소판은 대상체 혈액 유래의 혈소판 또는 동종 혈액 유래의 혈소판일 수 있다. 상기 혈소판의 밀도는 0.5Х108 내지 3Х108/mL이며, 예를 들어 0.5Х108/mL, 1Х108/mL, 1.5Х108/mL, 2Х108/mL, 2.5Х108/mL, 3Х108/mL, 또는 상기 값 중 어느 2개 값 사이의 범위이다.
본원에 따른 "기초 배지"는 당업계에 공지된 것으로서 TIL 세포 배양에 사용되는 배지이며, 여기에는 AIM-V, X-VIVO, DMEM, RPMI1640, OpTmizer, MHM-C가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 이러한 배지의 성분 및 함량은 당업계에 공지된 것으로서, 이의 유래는 실시예에 설명된 바와 같다.
본원에 따른 방법에 사용되는 TIL 시드 세포 배지는 당업계에 공지된 것으로서 종양 조직으로부터 TIL 세포를 유도할 수 있는 임의 배지일 수 있다. 예시적인 TIL 시드 세포 배지는 PCT/CN2021/096585에 설명된 바와 같으며, 이는 전체로서 본원에 인용되었다.
예를 들어, 본원에 따른 TIL 시드 세포 배지는, 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기에서 상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지이다. 상기 IL-2의 농도는 약 3000IU/mL 이하 또는 약 200IU/mL 이하이다. 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구의 시드 세포 배지를 더 제공하며, 여기에는 세포 배양 성분, 사이토카인 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 포함되고, 여기에서 상기 사이토카인은 IL-2를 포함하고, 상기 면역 관문은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및/또는 CTLA-4를 포함하고, 상기 세포 배양 성분은 혈청 배지 또는 무혈청 배지이다.
본 출원에서, 상기 사이토카인은 인간 유래의 사이토카인일 수 있다.
본 출원에서, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 및/또는 완전 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-2의 농도는 약 3000IU/mL 이하일 수 있다(예를 들어, 약 2900IU/mL 이하, 약 2800IU/mL 이하, 약 2700IU/mL 이하, 약 2600IU/mL 이하, 약 2500IU/mL 이하, 약 2400IU/mL 이하, 약 2300IU/mL 이하, 약 2200IU/mL 이하, 약 2100IU/mL 이하, 약 2000IU/mL 이하, 약 1900IU/mL 이하, 약 1800IU/mL 이하, 약 1700IU/mL 이하, 약 1600IU/mL 이하, 약 1500IU/mL 이하, 약 1400IU/mL 이하, 약 1300IU/mL 이하, 약 1100IU/mL 이하, 약 1000IU/mL 이하, 약 900IU/mL 이하, 약 800IU/mL 이하, 약 700IU/mL 이하, 약 600IU/mL 이하, 약 500IU/mL 이하, 약 400IU/mL 이하, 약 300IU/mL 이하 또는 더욱 낮을 수 있음). 예를 들어, 상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/mL 이하, 또는 약 2500IU/mL 이하, 또는 약 3000 IU/mL 이하일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IL-7을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-7의 농도는 약 5 내지 약 100ng/mL일 수 있다(예를 들어, 약 5 내지 약 95ng/mL, 약 5 내지 약 90ng/mL, 약 5 내지 약 85ng/mL, 약 5 내지 약 80ng/mL, 약 5 내지 약 75ng/mL, 약 5 내지 약 70ng/mL, 약 5 내지 약 65ng/mL, 약 5 내지 약 60ng/mL, 약 5 내지 약 55ng/mL, 약 5 내지 약 50ng/mL, 약 5 내지 약 45ng/mL, 약 5 내지 약 40ng/mL, 약 5 내지 약 35ng/mL, 약 5 내지 약 30ng/mL, 약 5 내지 약 25ng/mL, 약 5 내지 약 20ng/mL 또는 약 5 내지 약 10ng/mL일 수 있음). 예를 들어, 상기 IL-7의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL일 수 있다(예를 들어, 적어도 약 200U/mL, 적어도 약 500U/mL, 또는 적어도 약 1000U/mL일 수 있음). 본 출원에서, 상기 IL-7의 농도는 약 200 내지 1000IU/mL일 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 200IU/mL, 적어도 약 500IU/mL 또는 적어도 약 1000IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IL-15를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-15의 농도는 약 5 내지 약 100ng/mL일 수 있다(예를 들어, 약 5 내지 약 95ng/mL, 약 5 내지 약 90ng/mL, 약 5 내지 약 85ng/mL, 약 5 내지 약 80ng/mL, 약 5 내지 약 75ng/mL, 약 5 내지 약 70ng/mL, 약 5 내지 약 65ng/mL, 약 5 내지 약 60ng/mL, 약 5 내지 약 55ng/mL, 약 5 내지 약 50ng/mL, 약 5 내지 약 45ng/mL, 약 5 내지 약 40ng/mL, 약 5 내지 약 35ng/mL, 약 5 내지 약 30ng/mL, 약 5 내지 약 25ng/mL, 약 5 내지 약 20ng/mL 또는 약 5 내지 약 10ng/mL일 수 있음). 예를 들어, 상기 IL-15의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있다(예를 들어, 적어도 약 200U/mL, 적어도 약 250U/mL, 적어도 약 300U/mL, 또는 적어도 약 500U/mL일 수 있음). 본 출원에서, 상기 IL-15의 농도는 200 내지 500IU/mL일 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 200IU/mL, 적어도 약 250IU/mL, 적어도 약 300IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 종양 괴사 인자 TNF를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 TNFα를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 TNFα의 농도는 약 10 내지 약 100pg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 10 내지 약 95pg/mL, 약 10 내지 약 90pg/mL, 약 10 내지 약 80pg/mL, 약 10 내지 약 70pg/mL, 약 10 내지 약 60pg/mL, 약 10 내지 약 50pg/mL, 약 10 내지 약 40pg/mL, 약 15 내지 약 40pg/mL, 약 10 내지 약 25pg/mL, 약 15 내지 약 25pg/mL, 약 10 내지 약 30pg/mL, 약 10 내지 약 20pg/mL 또는 약 10 내지 약 15pg/mL일 수 있음). 본 출원에서, 상기 TNF-α의 농도는 약 10 내지 100pg/mL일 수 있고, 예를 들어, 약 10 내지 100pg/mL, 약 15 내지 100pg/mL, 약 20 내지 100pg/mL 또는 약 25 내지 100pg/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 10pg/mL, 적어도 약 15pg/mL, 적어도 약 20pg/mL 또는 적어도 약 25pg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 콜로니 자극 인자를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 GM-CSF, G-CSF 및/또는 M-CSF를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 GM-CSF의 농도는 약 200 내지 약 5000U/mL일 수 있고(예를 들어, 약 200 내지 약 800U/mL, 약 200 내지 약 500U/mL, 약 300 내지 약 5000U/mL, 약 500 내지 약 5000U/mL, 약 1000 내지 약 5000U/mL, 약 1500 내지 약 5000U/mL, 약 2000 내지 약 5000U/mL, 약 2500 내지 약 5000U/mL, 약 3000 내지 약 5000U/mL, 약 3500 내지 약 5000U/mL, 약 4000 내지 약 5000U/mL 또는 약 4500 내지 약 5000U/mL일 수 있음), 예를 들어, 약 200 내지 약 1000U/mL, 약 200 내지 약 800U/mL, 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 200U/mL, 적어도 약 500U/mL 또는 적어도 약 800U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 G-CSF의 농도는 약 300 내지 약 1000U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 G-CSF의 농도는 약 500 내지 약 1000U/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 500U/mL 또는 적어도 약 1000U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 M-CSF의 농도는 약 300 내지 약 800U/mL일 수 있다. 예를 들어, 상기 M-CSF의 농도는 약 300 내지 약 500U/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 300U/mL, 적어도 약 500U/mL 또는 적어도 약 800U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 인터페론을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IFN-γ, IFN-α 및/또는 IFN-β를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 약 1000ng/mL일 수 있다(예를 들어, 약 15 내지 약 1000ng/mL, 약 20 내지 약 1000ng/mL, 약 30 내지 약 1000ng/mL, 약 40 내지 약 1000ng/mL, 약 50 내지 약 1000ng/mL, 약 60 내지 약 1000ng/mL, 약 70 내지 약 1000ng/mL, 약 80 내지 약 1000ng/mL, 약 90 내지 약 1000ng/mL, 약 100 내지 약 1000ng/mL, 약 200 내지 약 1000ng/mL, 약 300 내지 약 1000ng/mL, 약 400 내지 약 1000ng/mL, 약 500 내지 약 1000ng/mL, 약 600 내지 약 1000ng/mL, 약 700 내지 약 1000ng/mL, 약 800 내지 약 1000ng/mL 또는 약 900 내지 약 1000ng/mL일 수 있음). 예를 들어, 상기 IFN-γ의 농도는 약 10 내지 1000ng/mL일 수 있고, 예를 들어, 상기 IFN-γ의 농도는 약 300 내지 약 1000ng/mL, 약 300 내지 약 800ng/mL, 또는 약 300 내지 약 500ng/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 300ng/mL, 적어도 약 500ng/mL, 적어도 약 800ng/mL 또는 적어도 약 1000ng/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IFN-α의 농도는 약 500 내지 약 1000U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 500ng/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IFN-β의 농도는 약 200 내지 약 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 상기 IFN-β의 농도는 약 250 내지 500ng/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 200ng/mL, 적어도 약 250ng/mL 또는 적어도 약 500ng/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 사이토카인은 IL-4, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-18, IL-12, IL-21 및/또는 IL-10을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-4의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 200IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-1α의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 200IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-1β의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 200IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-6의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 200IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-9의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 200IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-18의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 200IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 1000U/mL일 수 있고, 예를 들어, 상기 IL-12의 농도는 약 200 내지 약 1000U/mL, 약 200 내지 약 500U/mL, 또는 약 300 내지 약 1000U/mL일 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 200IU/mL, 적어도 약 250IU/mL, 적어도 약 300IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-21의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어, 상기 IL-21의 농도는 약 250 내지 1000U/mL일 수 있으며, 예를 들어 적어도 약 200IU/mL, 적어도 약 250IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 IL-10의 농도는 약 200 내지 500U/mL일 수 있고, 예를 들어 적어도 약 200IU/mL, 적어도 약 250IU/mL, 적어도 약 300IU/mL 또는 적어도 약 500IU/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 3 내지 약 100μg/mL, 약 5 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 100μg/mL, 약 15 내지 약 100μg/mL, 약 16 내지 약 100μg/mL, 약 17 내지 약 100μg/mL, 약 18 내지 약 100μg/mL, 약 19 내지 약 100μg/mL, 약 20 내지 약 100μg/mL, 약 25 내지 약 100μg/mL, 약 30 내지 약 100μg/mL, 약 36 내지 약 100μg/mL, 약 40 내지 약 100μg/mL, 약 45 내지 약 100μg/mL, 약 50 내지 약 100μg/mL, 약 55 내지 약 100μg/mL, 약 60 내지 약 100μg/mL, 약 65 내지 약 100μg/mL, 약 70 내지 약 100μg/mL, 약 80 내지 약 100μg/mL 또는 약 90 내지 약 100μg/mL일 수 있음). 본 출원에서, 상기 PD-1 mAb의 농도는 약 3 내지 100μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL, 적어도 약 10μg/mL, 적어도 약 15μg/mL, 적어도 약 20μg/mL, 적어도 약 25μg/mL, 적어도 약 36μg/mL, 적어도 약 50μg/mL 또는 적어도 약 100μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 약 5 내지 약 10μg/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 10μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 25μg/mL일 수 있다. 본 출원에서, 상기 TIGIT mAb의 농도는 약 2.5 내지 20μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 약 5 내지 25μg/mL일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 2.5μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 20μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL일 수 있다. 본 출원에서, 상기 CTLA-4 mAb의 농도는 약 3 내지 50μg/mL, 약 5 내지 50μg/mL 또는 약 10 내지 50μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL, 적어도 약 10μg/mL 또는 적어도 약 50μg/mL일 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 공동자극수용체 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 항원 결합 단편, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및/또는 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 100μg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 2 내지 약 100μg/mL, 약 3 내지 약 100μg/mL, 약 3 내지 약 20μg/mL, 약 4 내지 약 100μg/mL, 약 5 내지 약 100μg/mL, 약 6 내지 약 100μg/mL, 약 7 내지 약 100μg/mL, 약 8 내지 약 100μg/mL, 약 9 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 100μg/mL, 약 12 내지 약 100μg/mL, 약 20 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 90μg/mL, 약 10 내지 약 80μg/mL, 약 10 내지 약 70μg/mL, 약 10 내지 약 50μg/mL, 약 10 내지 약 20μg/mL 또는 약 3 내지 약 12μg/mL일 수 있음). 본 출원에서, 상기 CD137 mAb의 농도는 약 3 내지 20μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL, 적어도 약 10μg/mL, 적어도 약 12μg/mL 또는 적어도 약 20μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 3 내지 약 10μg/mL일 수 있다. 본 출원에서, 상기 OX-40 mAb의 농도는 약 5 내지 10μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 10μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 내지 약 10μg/mL일 수 있다. (예를 들어, 약 2 내지 약 10μg/mL, 약 3 내지 약 10μg/mL, 약 3 내지 약 5μg/mL, 약 4 내지 약 10μg/mL, 약 5 내지 약 10μg/mL, 약 6 내지 약 10μg/mL, 약 7 내지 약 10μg/mL 또는 약 8 내지 약 10μg/mL일 수 있음). 본 출원에서, 상기 CD28 mAb의 농도는 약 3 내지 10μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 3μg/mL, 적어도 약 5μg/mL 또는 적어도 약 10μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 공동자극수용체 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 5 내지 약 10μg/mL일 수 있다. 본 출원에서, 상기 CD40 mAb의 농도는 약 6 내지 10μg/mL 또는 약 5 내지 8μg/mL일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 5μg/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청 배지에는 혈청이 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청에는 인간 AB 혈청이 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청의 농도는 약 1 내지 약 10%(v/v)일 수 있다(예를 들어, 약 1.5 내지 약 10%, 약 2 내지 약 10%, 약 3 내지 약 10%, 약 4 내지 약 10%, 약 5 내지 약 10%, 약 1 내지 약 9%, 약 1 내지 약 8%, 약 1 내지 약 7% 또는 약 1 내지 6%일 수 있음).
예를 들어, 상기 혈청 배지에는 AIM-V 배지가 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 무혈청 배지에는 X-VIVO 배지 또는 CTSTMOpTmizerTM 배지가 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 배양 성분에는 항생제가 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 세포 배양 성분에는 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS가 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 1 내지 약 200U/mL일 수 있다(예를 들어, 약 1 내지 약 5U/mL, 약 1 내지 약 10U/mL, 약 1 내지 약 20U/mL, 약 1 내지 약 30U/mL, 약 1 내지 약 40U/mL, 약 1 내지 약 50U/mL, 약 1 내지 약 60U/mL, 약 1 내지 약 70U/mL, 약 1 내지 약 80U/mL, 약 1 내지 약 90U/mL, 약 1 내지 약 100U/mL, 약 1 내지 약 120U/mL, 약 1 내지 약 140U/mL, 약 1 내지 약 160U/mL, 약 1 내지 약 180U/mL 또는 약 1 내지 약 200U/mL일 수 있음). 예를 들어, 상기 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS의 농도는 약 100U/mL일 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 M2형 대식세포 억제제도 포함할 수 있고, 상기 M2형 대식세포 억제제는 RRx001 및/또는 CNI-1493을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 M2형 대식세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM일 수 있다(예를 들어, 약 0.5 내지 약 100μM, 약 1 내지 약 100μM, 약 2 내지 약 100μM, 약 2.5 내지 약 100μM, 약 3 내지 약 100μM, 약 2 내지 약 3μM, 약 5 내지 약 100μM, 약 10 내지 약 100μM, 약 20 내지 약 100μM, 약 0.1 내지 약 90μM, 약 0.5 내지 약 90μM, 약 1 내지 약 90μM, 약 5 내지 약 90μM 또는 약 0.1 내지 약 80μM일 수 있음).
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 조절 T 세포(Treg) 억제제를 더 포함할 수 있고, 상기 조절 T 세포 억제제는 CAL-101, 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib) 및/또는 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM일 수 있다(예를 들어, 약 0.5 내지 약 100μM, 약 1 내지 약 100μM, 약 5 내지 약 100μM, 약 10 내지 약 100μM, 약 20 내지 약 100μM, 약 0.1 내지 약 90μM, 약 0.5 내지 약 90μM, 약 1 내지 약 90μM, 약 5 내지 약 90μM 또는 약 0.1 내지 약 80μM일 수 있음). 예를 들어, 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 1 내지 약 5μM, 약 1 내지 약 3μM, 약 1.5 내지 약 5μM, 약 2 내지 약 5μM, 약 2.5 내지 약 5μM 또는 약 3 내지 약 5μM일 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 골수 유래의 억제성 세포 억제제를 더 포함할 수 있고, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제는 AG490, 데시타빈(decitabine), 수니티닙(sunitinib) 및/또는 BBI608을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μg/mL일 수 있다(예를 들어, 약 0.5 내지 약 100μg/mL, 약 1 내지 약 100μg/mL, 약 2 내지 약 100μg/mL, 약 5 내지 약 100μg/mL, 약 6 내지 약 100μg/mL, 약 7 내지 약 100μg/mL, 약 8 내지 약 100μg/mL, 약 9 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 100μg/mL, 약 20 내지 약 100μg/mL, 약 10 내지 약 90μg/mL, 약 10 내지 약 80μg/mL, 약 10 내지 약 70μg/mL 또는 약 10 내지 약 50μg/mL일 수 있음). 예를 들어, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제의 농도는 약 1 내지 약 3μg/mL, 또는 약 1.5 내지 약 3μg/mL일 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 상기 조절 T 세포(Treg) 억제제, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제 및 상기 M2형 대식세포 억제제 중 적어도 하나, 적어도 둘 및 적어도 셋을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 T 세포 활성화제를 더 포함할 수 있고, 상기 T 세포 활성화제는 LYC-55716, GNE-1858 및/또는 메틸렌 블루를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 T 세포 활성화제의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있고, 예를 들어, 약 1 내지 약 9μM, 약 1 내지 약 8μM, 약 1 내지 약 7μM, 약 1 내지 약 6μM, 약 2 내지 약 10μM, 약 3 내지 약 10μM, 약 4 내지 약 10μM 또는 약 5 내지 약 10μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 T 세포 분화 억제제를 더 포함할 수 있고, 상기 T 세포 분화 억제제는 TWS119를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 T 세포 분화 억제제의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있고, 예를 들어, 약 1 내지 약 9μM, 약 1 내지 약 8μM, 약 1 내지 약 7μM, 약 1 내지 약 6μM, 약 2 내지 약 10μM, 약 3 내지 약 10μM, 약 4 내지 약 10μM 또는 약 5 내지 약 10μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 RRX-001의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 수니티닙(Sunitinib)의 농도는 약 1.5 내지 약 3μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 1.5μM 또는 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 CNI-1493의 농도는 약 2 내지 약 3μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 2μM, 적어도 약 2.5μM 또는 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 이마티닙(Imatinib)의 농도는 약 2 내지 약 5μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 2μM 또는 적어도 약 5μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 CAL-101의 농도는 약 1.5 내지 약 5μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 1.5μM 또는 적어도 약 5μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 다사티닙(Dasatinib)의 농도는 약 2 내지 약 3μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 2μM, 적어도 약 2.5μM 또는 적어도 약 3μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 LYC-55716의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 1μM 또는 적어도 약 10μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 GNE-1858의 농도는 약 4 내지 약 5μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 4nM, 적어도 약 4.5nM 또는 적어도 약 5nM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 메틸렌 블루의 농도는 약 1 내지 약 2μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 1μM, 적어도 약 1.5μM 또는 적어도 약 2μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 TWS119의 농도는 약 1 내지 약 10μM일 수 있고, 예를 들어, 적어도 약 1μM, 적어도 약 5μM 또는 적어도 약 10μM일 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 1000U/mL IL-7, 적어도 약 100μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-9, IL-15, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2000U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-9, 적어도 약 500U/mL IL-15, 적어도 약 50μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 50μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, G-CSF, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2000U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-7, 적어도 약 1000U/mL G-CSF, 적어도 약 36μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 20pg/mL TNFα, 적어도 약 3% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-12, IL-21, GM-CSF, LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-12, 적어도 약 500U/mL IL-21, 적어도 약 800U/mL GM-CSF, 적어도 약 10μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-21, IFN-γ, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 500U/mL IL-1β, 적어도 약 2500U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-6, 적어도 약 200U/mL IL-21, 적어도 약 1000U/mL IFN-γ, 적어도 약 20μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 50μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 25pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-1α, IL-2, IL-9, IL-18, IFN-α, IFN-β, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 500U/mL IL-1α, 적어도 약 2000U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-9, 적어도 약 200U/mL IL-18, 적어도 약 500U/mL IFN-α, 적어도 약 500U/mL IFN-β, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 25μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 25pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-4, 적어도 약 200U/mL IL-10, 적어도 약 250U/mL IL-21, 적어도 약 10μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 20μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 10pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-6, IL-12, IL-21, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-6, 적어도 약 500U/mL IL-12, 적어도 약 200U/mL IL-21, 적어도 약 20μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10pg/mL TNFα, 적어도 약 3% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-1β, IL-2, IL-7, IL-21, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 200U/mL IL-1β, 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 200U/mL IL-21, 적어도 약 500U/mL G-CSF, 적어도 약 500U/mL GM-CSF, 적어도 약 1000U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 15pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2500U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-4, 적어도 약 500U/mL IL-12, 적어도 약 500U/mL GM-CSF, 적어도 약 300U/mL M-CSF, 적어도 약 200U/mL IFN-β, 적어도 약 800U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 200U/mL IL-15, 적어도 약 800U/mL GM-CSF, 적어도 약 10μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 20μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 20pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-4, IL-10, IL-10, G-CSF, M-CSF, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2500U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-4, 적어도 약 500U/mL IL-10, 적어도 약 250U/mL IL-10, 적어도 약 500U/mL G-CSF, 적어도 약 300U/mL M-CSF, 적어도 약 5μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, IL-21, IFN-α, IFN-γ, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 500U/mL IL-21, 적어도 약 500U/mL IFN-α, 적어도 약 800U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, IFN-β, IFN-γ, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-7, 적어도 약 500U/mL IL-15, 적어도 약 250U/mL IFN-β, 적어도 약 1000U/mL IFN-γ, 적어도 약 5μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 15μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 적어도 약 5%의 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 200U/mL IL-15, 적어도 약 500U/mL GM-CSF, 적어도 약 1000U/mL IFN-γ, 적어도 약 3μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 300U/mL IL-12, 적어도 약 300U/mL G-CSF, 적어도 약 200U/mL GM-CSF, 적어도 약 500U/mL IFN-α, 적어도 약 500U/mL IFN-γ, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 10pg/mL TNFα, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, RRx-001, CAL-101, 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 1000U/mL IL-7, 적어도 약 50μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μM RRx-001, 적어도 약 1.5μM CAL-101, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-10, IL-18, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 수니티닙(Sunitinib), 이마티닙(Imatinib), 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2500U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-10, 적어도 약 200U/mL IL-18, 적어도 약 10μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μM 수니티닙(Sunitinib), 적어도 약 5μM 이마티닙(Imatinib), 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-1β, IL-6, GM-CSF, M-CSF, CNI-1493, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-1β, 적어도 약 500U/mL IL-6, 적어도 약 500U/mL GM-CSF, 적어도 약 500U/mL M-CSF, 적어도 약 5μM CNI-14, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-9, IL-10, IL-21, GM-CSF, OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 수니티닙(Sunitinib), 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-9, 적어도 약 200U/mL IL-10, 적어도 약 500U/mL IL-21, 적어도 약 500U/mL GM-CSF, 적어도 약 5μg/mL OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 36μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 1.5μM 수니티닙(Sunitinib), 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-6, IL-12, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TNFα, 이마티닙(Imatinib), 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2500U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-6, 적어도 약 1000U/mL IL-12, 적어도 약 10μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL OX-40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 15pg/mL TNFα, 적어도 약 5μM 이마티닙(Imatinib), 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 CTSTMOpTmizerTM 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 다사티닙(Dasatinib), 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-7, 적어도 약 300U/mL IL-15, 적어도 약 12μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 3μM 다사티닙(Dasatinib), 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-6, IL-12, G-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 다사티닙(Dasatinib), LYC-55716, GNE-1858, 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 3000U/mL IL-2, 적어도 약 200U/mL IL-6, 적어도 약 500U/mL IL-12, 적어도 약 1000U/mL G-CSF, 적어도 약 500U/mL M-CSF, 적어도 약 500U/mL IFN-β, 적어도 약 800U/mL IFN-γ, 적어도 약 3μg/mL CTLA-4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μM 다사티닙(Dasatinib), 적어도 약 10μM LYC-55716, 적어도 약 4.5nM GNE-1858, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 X-VIVO 15 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-1α, IL-9, GM-CSF, CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CNI-1493, 메틸렌 블루, TWS119, 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 적어도 약 2500U/mL IL-2, 적어도 약 500U/mL IL-1α, 적어도 약 500U/mL IL-9, 적어도 약 800U/mL GM-CSF, 적어도 약 3μg/mL CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μg/mL TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 적어도 약 2.5μM CNI-1493, 적어도 약 -1μM 메틸렌 블루, 적어도 약 5μM TWS119, 적어도 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 시드 세포 배지는 IL-2, IL-1α, IL-12, IL-21, G-CSF, M-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, CNI-1493, 다사티닙(Dasatinib), GNE-1858, 메틸렌 블루, 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 시드 세포 배지는 약 3000U/mL IL-2, 약 200U/mL IL-1α, 약 500U/mL IL-12, 약 500U/mL IL-21, 약 300U/mL G-CSF, 약 800U/mL M-CSF, 약 500U/mL IFN-α, 약 300U/mL IFN-β, 약 300U/mL IFN-γ, 약 3μg/mL CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 5μg/mL CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 5μg/mL LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 3μg/mL PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 3μM CNI-1493, 약 2μM 다사티닙(Dasatinib), 약 5nM GNE-1858, 약 1.5μM 메틸렌 블루, 약 5% 인간 혈청, 무혈청 배지 AIM-V 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 PS 이중 항체를 포함할 수 있다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 본 출원에 따른 시드 세포 배지 배양으로 획득한 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단을 제공한다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 약학 조성물을 제공하며, 여기에는 본 출원에 따른 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단 및 약학적으로 허용 가능한 담체가 포함된다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 암 치료 약물 제조에서 상기 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단 및 본 출원에 따른 약학 조성물의 응용을 제공한다.
본 출원에 따른 시드 세포 배지는 상이한 유형에서 유래한 암의 종양 침윤 림프구를 확장하는 데 적용될 수 있다. 본 출원에 따른 시드 세포 배지는 암 유형에 대한 광범위한 스펙트럼 및 보편적인 적용성을 갖는다. 경우에 따라, 상기 시드 세포 배지는 상이한 유형의 암에서 유래한 종양 침윤 림프구를 배양하는 데 적합할 수 있으며, 상이한 유형의 암에서 유래한 종양 침윤 림프구의 시드 세포 또는 이의 세포 집단을 획득하는 데 적합할 수 있다. 경우에 따라, 본 출원에 따른 시드 세포 배지 및/또는 본 출원에 따른 약학 조성물은 암 치료용 약물 제조에 사용될 수 있다. 본 출원에서, 상기 암은 자궁경부암(예를 들어, 재발성 자궁경부암을 포함할 수 있음), 난소암, 골반강 저분화 선암, 장암(예를 들어, 간 전이와 같은 전이가 있는 장암을 포함할 수 있음), 위암, 흑색종, 유방암 및/또는 자궁내막기질육종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 암은 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관기질종양, 장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막기질육종, 골반강 저분화 선암 및 담관암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구 확장에서 상기 시드 세포 배지의 응용을 제공한다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구의 시드 세포 배양 방법을 제공하며, 여기에는 본 출원에 따른 시드 세포 배지에서 분리된 종양 침윤 림프구를 배양하는 단계가 포함된다.
다른 일 양상에서, 본 출원은 종양 침윤 림프구 확장 방법을 제공하며, 여기에는 본 출원에 따른 시드 세포 배지에서 분리된 종양 침윤 림프구를 배양하여, 상기 종양 침윤 림프구의 시드 세포를 획득하는 단계가 포함된다.
예를 들어, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는 필요한 피험자의 복수, 외과적으로 절제된 원발성 종양 샘플, 동시성 및 이시성의 외과적으로 절제된 전이성 종양 샘플, 생검 샘플 및 체액으로 구성된 군으로부터 선택된 샘플에서 유래될 수 있다.
예를 들어, 상기 체액은 혈액, 조직액, 림프액 및/또는 체강액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 체액은 복수(예를 들어 위암 환자의 복수, 또는 유방암 환자의 복수) 및/또는 흉수(예를 들어 자궁내막기질육종 환자의 흉수)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는, 흑색종, 신경교종, 위암, 폐암, 위장관기질종양, 장암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 자궁내막기질육종, 골반 저분화 선암 및 담관암으로 구성된 군으로부터 선택된 암에서 유래할 수 있으며, 예를 들어, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는, 자궁경부암(예를 들어, 재발성 자궁경부암을 포함할 수 있음), 난소암, 골반강 저분화 선암, 장암(예를 들어, 간 전이와 같은 전이가 발생한 장암을 포함할 수 있음), 위암, 흑색종, 유방암 및/또는 자궁내막기질육종으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 조직에서 유래할 수 있다.
예를 들어, 상기 분리된 종양 침윤 림프구는 종양 조직이 절단된 조직 조각으로부터 유래할 수 있으며, 상기 종양 조직은 절단된 후 조직 조각의 직경이 약 1 내지 약 10mm이고, 예를 들어, 약 2 내지 약 10mm, 약 3 내지 약 10mm, 약 4 내지 약 10mm, 약 5 내지 약 10mm, 약 6 내지 약 10mm, 약 7 내지 약 10mm 또는 약 8 내지 약 10mm일 수 있다.
예를 들어, 상기 배양의 시간은 약 3 내지 20일일 수 있다. 예를 들어, 상기 배양 시간은 약 3 내지 15일일 수 있으며, 예를 들어, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일 또는 약 20일일 수 있다.
예를 들어, 상기 배양의 온도는 약 30 내지 42℃일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 30℃, 적어도 약 31℃, 적어도 약 32℃, 적어도 약 33℃, 적어도 약 34℃, 적어도 약 35℃, 적어도 약 36℃, 적어도 약 37℃, 적어도 약 38℃, 적어도 약 39℃, 적어도 약 40℃, 적어도 약 41℃ 또는 적어도 약 42℃일 수 있다.
예를 들어, 상기 배양의 CO2 농도는 약 1 내지 10%일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9% 또는 적어도 약 10%일 수 있다.
본 출원에서, 본 출원에 따른 시드 세포 배지를 사용하면, 종양 침윤 림프구의 시드 세포의 세포 활성을 현저하게 향상시킬 수 있다(예를 들어, 종양 침윤 림프구의 시드 세포의 세포 총 수를 현저하게 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, 종양 침윤 림프구의 시드 세포의 수를 적어도 약 108 자릿수에 도달시킬 수 있고; 예를 들어, 종양 침윤 림프구의 시드 세포의 세포 생존율을 현저하게 향상시킬 수 있는데, 예를 들어, 종양 침윤 림프구의 시드 세포의 세포 생존율을 적어도 약 85%에 도달시킬 수 있고; 예를 들어, 종양 침윤 림프구의 시드 세포가 분비하는 사이토카인(예를 들어 IFN-γ)의 수를 현저하게 향상시킬 수 있음). 본 출원에서, 본 출원에 따른 시드 세포 배지를 사용하여, 종양 침윤 림프구의 시드 세포에서 CD3+ 세포의 비율을 현저하게 향상시킬 수 있다.
본 출원에서, 본 출원에 따른 시드 세포 배지를 사용하여, 종양 침윤 림프구의 시드 세포의 공여체 피험자(예를 들어 종양 환자)에게 재주입한 후 제품 TIL을 일부 재주입한 TCR 클론을 현저하게 향상시킬 수 있는 빈도가 공여체 피험자 말초 혈액에서 현저하게 대폭 증가하며, 공여체 피험자 말초 혈액의 TCR 레퍼토리와 TIL 재주입 제품의 TCR 레퍼토리의 유사도 역시 현저하게 상승하고, 장시간 변하지 않고 유지될 수 있다. 또한, 공여체 피험자가 본 출원에 따른 시드 세포 배지에서 배양된 TIL 세포의 자가 재주입을 수행한 후, 그 체내의 림프구가 비교적 활발한 증식을 일으킬 수 있다.
상기 TIL 시드 세포 배지의 사이토카인은, 상기 사이토카인에 IL-7이 포함되고; 상기 IL-7의 농도는 예를 들어 약 5 내지 약 100ng/mL인 특징을 더 가질 수 있다. 상기 사이토카인은 IL-15를 포함하고; 상기 IL-15의 농도는 예를 들어 약 5 내지 약 100ng/mL이다. 상기 사이토카인은 종양 괴사 인자 TNF를 포함하며, 예를 들어 TNFα이고; 상기 TNFα의 농도는 예를 들어 약 10 내지 약 100pg/mL이다. 상기 사이토카인은 콜로니 자극 인자를 포함하며, 예를 들어 GM-CSF이고; 상기 GM-CSF의 농도는 예를 들어 약 200 내지 약 5000U/mL이다. 상기 사이토카인은 인터페론을 포함하며, 예를 들어 IFN-γ이고; 상기 IFN-γ의 농도는 예를 들어 약 10 내지 약 1000ng/mL이다. 상기 사이토카인은 IL-4, IL-12, IL-21 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 인터류킨을 더 포함한다.
상기 TIL 시드 세포 배지의 면역 관문 항체는, 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 상기 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도가 예를 들어 약 10 내지 약 100μg/mL인 특징을 더 가질 수 있다. 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 예를 들어 인간 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 상기 CD137 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 예를 들어 약 1 내지 약 100μg/mL이다. 상기 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 예를 들어 인간 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고; 상기 CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 예를 들어 약 1 내지 약 10μg/mL이다.
상기 TIL 시드 세포 배지의 세포 배양 성분은, 혈청 배지에 혈청, 예를 들어 인간 AB 혈청이 포함되고; 상기 혈청의 농도가 예를 들어 약 1 내지 약 10%(v/v)인 특징을 더 가질 수 있다. 상기 혈청 배지에는 AIM-V 배지가 포함된다. 상기 무혈청 배지에는 X-VIVO 배지 및 MHM-C 배지가 포함된다.
상기 TIL 시드 세포 배지의 세포 배양 성분은, 무혈청 배지에 혈소판, 예를 들어 대상체 자가 혈액 유래의 혈소판 또는 동종 혈액 유래의 혈소판을 포함하고; 상기 혈소판의 밀도가 예를 들어 약 0.5Х108 내지 약 3Х108/mL인 특징을 더 가질 수 있다. 상기 무혈청 배지에는 X-VIVO 배지 및 MHM-C 배지가 포함된다.
상기 TIL 시드 세포 배지는 M2형 대식세포 억제제를 더 포함할 수 있고, 상기 M2형 대식세포 억제제는 RRx001 및/또는 CNI-1493을 포함할 수 있다. 상기 M2형 대식세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM이다. 상기 TIL 시드 세포 배지는 조절 T 세포(Treg) 억제제를 더 포함할 수 있고, 상기 조절 T 세포 억제제는 CAL-101, 다사티닙(dasatinib), 이마티닙(imatinib) 및/또는 파노비노스탓(Panobinostat)을 포함할 수 있다. 상기 조절 T 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μM이다. 상기 TIL 시드 세포 배지는 골수 유래의 억제성 세포 억제제를 더 포함할 수 있고, 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제는 AG490, 데시타빈(decitabine) 수니티닙 및/또는 BBI608을 포함한다. 상기 골수 유래의 억제성 세포 억제제의 농도는 약 0.1 내지 약 100μg/mL이다.
본 발명은 TIL 세포 확장용 배지 또는 TIL 세포 함유 약물 제조에서 본원에 따른 TIL 세포 확장용 배양 조성물의 응용을 더 제공한다. 본 발명은 TIL 세포 함유 약물 제조에서 본원에 따른 TIL 세포 확장용 배지의 응용을 더 제공한다. 이러한 약물은 그로부터 TIL 세포를 획득한 종양 조직과 관련된 암을 치료하는 데 사용된다.
본 발명은 TIL 세포 집단 확장 방법을 더 제공하며, 여기에는 본원에 따른 TIL 세포 배양 조성물을 함유한 배지를 사용하여 TIL 세포 집단을 배양하는 단계가 포함된다. 상기 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속되고; 및/또는 상기 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다. 상기 배양의 조건은 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들어 약 30 내지 42℃, 약 1 내지 10%의 CO2이다.
본 발명은 TIL 세포 집단의 제조 방법 1을 더 제공하며, 여기에는:
(1) TIL 시드 세포 배지를 이용하여 종양 조직을 배양하여, 제1 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(2) 본원에 따른 배지를 이용하여 제1 TIL 세포 집단을 배양하여, 제2 TIL 세포 집단을 획득하는 단계가 포함된다.
본 발명은 TIL 세포 집단의 제조 방법 2를 더 제공하며, 여기에는:
(1) TIL 시드 세포 배지를 이용하여 종양 세포 함유 조직을 배양하여, 제1 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(2) (1)의 제1 TIL 세포 집단을 전술한 배양 조성물에서 기질과 결합되는 항체 중 어느 하나 이상에 접촉시켜, 제2 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(3) (2)의 제2 TIL 세포 집단을 전술한 배양 조성물에서 기질과 결합되는 항체를 제외한 성분 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지로 옮겨 배양하여, 제3 TIL 세포 집단을 획득하는 단계가 포함된다.
상기 방법 1 및 방법 2의 상기 제2 TIL 세포 집단은 1010 내지 1011 이상의 TIL 세포를 구비한다. 통상적으로, 상기 종양 조직은 전처리를 거쳐야 하며, 여기에는 종양 조직의 세척, 단편화 및/또는 해리가 포함된다. 상기 종양 조직의 단편화 및/또는 해리 방법은 기계적 절단 방식 또는 효소 소화일 수 있다. 상기 종양 조직은 기계적 절단 방식으로 형성된 단편화된 조직 조각의 크기가 후속적인 배양과 추가적인 처리가 용이한 임의의 일반적인 크기일 수 있으며, 선택적으로, 2Х2Х2mm3, 3Х3Х3mm3, 4Х4Х4mm3, 5Х5Х5mm3 또는 6Х6Х6mm3이다.
TIL 세포를 유도하기 위하여, 상기 방법 1 및 방법 2의 단계 (1)의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속되고; 및/또는 단계 (1)의 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다. 충분한 수의 TIL 세포를 확장하기 위하여, 상기 방법 1의 단계 (2)의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속되고; 및/또는 상기 방법 1의 단계 (2)의 배양은 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다. 상기 배양의 조건은 당업계에 공지된 바와 같으며, 예를 들어 약 30 내지 42℃, 약 1 내지 10%의 CO2이다.
상기 방법 2의 단계 (2)에서, 기질과 결합되는 상기 항체는 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, CD40 항체, OX-40 항체 및 GITR 항체로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다. 상기 기질은 멀티웰 플레이트, 세포 배양 접시, 세포 배양 백 및 자성 비드로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합이며, 상기 항체를 기질 상에 고정시킬 수 있으면 된다. 예를 들어, 상기 기질은 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백일 수 있으며, 상기 결합은 상기 항체를 함유한 모액을 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백의 바닥부나 내벽에 배양하여 코팅시킬 수 있으며, 코팅 전처리를 거친 후, 배양 접시 바닥부에 부착된 기질 상에 고정된 항체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 활성화 항체이다.
상기 방법 2의 단계 (2)에서, 상기 접촉은 바람직하게는 상기 방법 2의 단계 (1)의 제1 TIL 세포 집단을 기질에 결합된 항체와 함께 배양하는 것이고; 상기 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이다. 바람직하게는, 상기 배양의 CO2 농도는 5%이다. 상기 배양은 바람직하게는 전술한 배양 조성물에서 기질에 결합된 항체를 제외한 성분 중 어느 하나 이상을 함유하는 배지에서 수행한다. 선택적으로, 전술한 배양 조성물에서 기질에 결합된 항체를 제외한 성분 중 어느 하나 이상을 함유하는 상기 배지는 1) IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체; 2) IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12 및 GM-CSF; 3) IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, GITR 항체 및 TWS119; 4) IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, TIGIT 항체 및 GM-CSF; 5) IL-2, IL-7, IL-15, LAG3 항체, IL-21, IL-12 및 GITR 항체; 6) IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, TIGIT 항체, CD40 항체, OX-40 항체 및 자가 혈소판; 7) IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CTLA-4 항체, CD137 항체, GITR 항체, GM-CSF, TWS119 및 동종 혈소판 성분 조합 중 어느 하나 이상을 포함한다. 상기 접촉은 1 내지 3일 지속되며, 예를 들어 1일, 2일, 3일 지속된다.
방법 2의 단계 (2)에서, 상기 제1 TIL 세포 집단의 밀도는 1.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL이고; 바람직하게는, 2.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL이고; 보다 바람직하게는 2.5Х105/mL 내지 3.5Х106/mL이다. 선택적으로, 1.0Х105/mL, 2.0Х105/mL, 2.5Х105/mL, 3.0Х105/mL, 3.5Х105/mL, 4.0Х105/mL, 4.5Х105/mL, 5.0Х105/mL, 5.5Х105/mL, 6.0Х105/mL, 6.5Х105/mL, 7.0Х105/mL, 7.5Х105/mL, 8.0Х105/mL, 8.5Х105/mL, 9.0Х105/mL, 9.5Х105/mL 또는 10Х106/mL이다.
상기 방법 2의 단계 (3)에서, 상기 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일 지속되고; 또는 최장 20일, 최장 15일, 최장 14일, 최장 13일, 최장 12일, 최장 11일, 최장 10일, 최장 9일, 최장 8일, 최장 7일, 최장 6일, 최장 5일 지속된다. 상기 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는 37℃이다. 상기 배양의 CO2 농도는 5%이다.
상기 방법 1 및 방법 2의 단계 (1)에서, 상기 TIL 시드 세포 배지는 전술한 TIL 시드 세포 배지 중 어느 하나일 수 있다. 선택적으로, 상기 TIL 시드 세포 배지는 1) IL-2, IL-6, IL-21, IFN-γ, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 2) IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, CD137 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 3) IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 4) IL-1β, IL-2, IL-7, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 5) IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, TIGIT 항체, CTLA-4 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 6) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 7) IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, G-CSF, M-CSF, CD28 항체, OX-40 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 8) IL-2, IL-7, IL-15, IFN-γ, CD137 항체, CD40 항체, OX-40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 9) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 10) IL-2, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 11) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, PD-1 항체, RRx-001, CAL-101, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 12) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, M-CSF, PD-1 항체, CNI-1493, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 13) IL-2, IL-7, IL-15, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, 다사티닙, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 14) IL-2, IL-6, IL-12, G-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, CTLA-4 항체, PD-1 항체, 다사티닙, LYC-55716, GENE-1858, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 15) IL-1α, IL-2, IL-9, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, TIGIT 항체, CNI-1493, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 16) IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, G-CSF, M-CSF, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, CNI-1493, 다사티닙, GNE-1858, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지 성분의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 TIL 시드 세포 배지는 1) IL-2, IL-6, IL-21, IFN-γ, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 2) IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, CD137 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 3) IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 CTSTMOpTmizerTM; 4) IL-1β, IL-2, IL-7, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 CTSTMOpTmizerTM; 5) IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, TIGIT 항체, CTLA-4 항체, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 6) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, PD-1 항체, TNF-α, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 7) IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, G-CSF, M-CSF, CD28 항체, OX-40 항체, PD-1 항체, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 AIM-V 배지; 8) IL-2, IL-7, IL-15, IFN-γ, CD137 항체, CD40 항체, OX-40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 9) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, TNF-α, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 10) IL-2, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 11) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, PD-1 항체, RRx-001, CAL-101, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 CTSTMOpTmizerTM; 12) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, M-CSF, PD-1 항체, CNI-1493, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 13) IL-2, IL-7, IL-15, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, 다사티닙, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 14) IL-2, IL-6, IL-12, G-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, CTLA-4 항체, PD-1 항체, 다사티닙, LYC-55716, GENE-1858, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 15) IL-1α, IL-2, IL-9, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, TIGIT 항체, CNI-1493, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 X-VIVO 15 배지; 16) IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, G-CSF, M-CSF, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, CNI-1493, 다사티닙, GNE-1858, 인간 AB 혈청, PS 이중 항체 및 AIM-V 배지의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조하여 획득한 TIL 세포 집단은 암 치료용 약물 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된 TIL 세포 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 함유하는 약학 조성물을 더 포함한다. 본원에서, 약학적으로 허용 가능한 보조제는 약리학적 및/또는 생리학적으로 피험자 및 활성 성분과 상용성인 담체, 희석제 및/또는 부형제를 지칭하며, 여기에는 pH 조절제, 계면활성제, 탄수화물, 아쥬반트, 항산화제, 킬레이트제, 이온강도 증강제 및 방부제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 적합한 약학적으로 허용 가능한 보조제는 당업계에서 TIL 세포 재주입(예를 들어 정맥주사)에 일반적으로 사용되는 보조제일 수 있다.
통상적으로, 약학 조성물에는 치료 유효량의 TIL 세포가 함유된다. 치료 유효량은 피험자에게서 질병 또는 증상을 치료, 예방, 경감 및/또는 완화할 수 있는 용량을 의미한다. 환자의 연령, 성별, 질병 및 그 중증도, 환자의 기타 신체적 상태 등과 같은 요인에 따라 치료 유효량을 결정할 수 있다. 본원에서, 피험자 또는 환자는 통상적으로 포유동물, 특히 사람을 의미한다.
본 발명은 세포 동결 보존 제제를 더 제공하며, 여기에는 본원의 어느 하나의 구현예에 따른 방법으로 획득된 전술한 TIL 세포 집단 및 동결 보존액이 포함된다.
본원의 동결 보존액은 조직 동결 보존액 또는 세포 동결 보존액일 수 있으며, 본 발명의 TIL 세포가 저온 조건에서, 예를 들어 드라이아이스 동결 보존 또는 액체 질소 동결 보존의 조건 하에서 활력을 유지하도록 만들 수 있다. 바람직하게는, 상기 동결 보존액은 무혈청 동결 보존액일 수 있으며, 상기 세포 동결 보존 제제는 저온으로부터 회복 후 제거할 필요 없이 곧바로 개체에 재주입될 수 있고 개체에 현저한 독성 부작용이 없다.
본 발명은 세포 요법을 더 포함하며, 여기에는 본원에 따른 방법을 이용하여 TIL 세포를 제조하는 단계, 및 대상체에 상기 TIL 세포를 투여하는 단계가 포함된다. 예를 들어, 투여된 TIL 세포는 수용자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 또한, TIL 세포에 의해 매개된 면역 반응은 입양 면역 요법 단계의 일부분일 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예의 방식으로 본 발명을 설명한다. 이러한 실시예는 설명을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않음에 유의한다. 실시예에 사용된 방법과 재료는, 달리 설명되지 않는 한, 모두 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법과 재료이다.
실시예
실시예 1: 배지 제조
하기 성분을 사용하여 TIL 시드 세포 배지를 제조하였다.
GITR 항체는 GenScript사에서 합성하였다(서열은 CN103951753B의 SEQ ID NO:104 및 SEQ ID NO:105).
표 1 내지 표 3에 따라 상이한 TIL 세포 배지를 제조하였다. 기초 배지는 비율에 따라 예를 들어 혈청 및 이중 항체를 넣은 후 4℃에 거치하여 1개월을 초과하지 않도록 보관하였다. 사용하기 전에 배지를 4℃에서 꺼내어, 37℃ 수조에 넣고 예열한 후, 사용하기 전에 기타 성분(각종 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 인터페론, TNF-α, 각종 항체 및 기타 분자)을 작업 농도까지 첨가한 후 TIL 세포 배양에 사용하였다. 표 3에서 "코팅"에 대응하는 성분(CD3 mAb, CD28 mAb 및 CD137 mAb)은 용액 성분의 형태로 배지에 존재하지 않지만, 세포 배양 시작 전에 이러한 성분을 함유한 모액을 세포 배양 접시, 예를 들어 멀티웰 플레이트, 접시 또는 세포 배양 백의 바닥부 또는 내벽에서 배양하고, 코팅 전처리를 거친 후, 배양 접시 바닥부에 부착된 기질에 고정된 성분을 형성하였다. 상기 코팅 전치리의 방식은 당업계에 공지된 일반적인 단백질 코팅 작업일 수 있다. 예를 들어, 구체적인 하나의 처리 방식에서, 코팅할 성분 CD3 mAb, CD28 mAb 및/또는 CD137 mAb를 PBS로 코팅 모액을 만들고, 여기에 함유된 각각의 성분의 농도는 모두 5μg/mL이며, 코팅 모액을 상기 세포 배양 접시에 첨가하여, 세포 배양 접시의 바닥부 또는 내벽이 코팅 모액에 의해 완전히 덮이도록 보장하였고, 4℃에서 밤새 배양한 후, 코팅 모액을 버리고, PBS로 5회 세척한 다음 후속 사용을 위해 두었다. 표 3에서 자가 혈소판의 혈액은 환자 자신의 혈액에서 유래하고, 동종 혈소판의 혈액은 건강한 성인의 혈액에서 유래하며, 혈소판의 제조는 CN105107233B에 개시된 제조 방법에 따라 수행하였고, 이는 본 출원에 전체로서 인용되었다. 하기 배지에 사용된 일부 사이토카인의 질량-활성 환산 관계는 IL-7: 1mg=1.21Х107U; IL-15: 1mg=1.14Х107U; IL-12: 1mg=1.02Х107U; IL-21: 1mg=1.07Х107U이다.
실시예 2: 환자 고형 종양 샘플 처리와 TIL 세포 배양
1) 최종 농도 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 50μg/mL 겐타마이신을 함유하는 생리식염수를 제조하여 후속 사용을 위해 준비하였다.
2) 2차 생물학적 안전 캐비닛의 무균 환경 하에서 획득한 새로 분리된 종양 환자의 종양 조직 샘플을 30mL의 단계 1)에서 제조한 생리식염수가 첨가된 10cm 배양 접시에서 세척한 다음, 30mL의 단계 1)에서 제조한 생리식염수를 첨가한 새로운 10cm 접시에 옮기고, 총 3회 반복하여 세척하였다.
3) 멸균된 메스로 지방 조직과 괴사 조직을 제거하고, 종양 조직을 직경 3Х3Х3mm3의 작은 조각으로 절단하고, 2개의 G-REX100 배양조(Wilsonwolf사에서 구입)를 취하고, 각각의 G-REX100 배양조에 무작위로 선택한 종양 조직 42조각을 넣고, 배양조에 실시예 1에서 제조한 TIL 배지 중 하나를 시드 세포 배지로서 첨가하였으며; 여분의 종양 조직 조각은 CryoStor10(BioLifeSolutions사에서 구입) 동결 보존액으로 프로그램 가능 냉각기를 통해 액체 질소 동결 보존을 수행하였다.
4) 3)에서 종양 조직 조각이 함유된 G-REX100 배양조에 1L 시드 세포 배지를 첨가한 후, 종양 조직 조각을 37℃, 5% CO2에서 배양하였고, 4일마다 절반 부피의 오래된 시드 세포 배지를 제거하고, 절반 부피의 새로운 시드 세포 배지를 보충하였으며, 11 내지 15일째에 원심분리를 수행하여 TIL 시드 세포를 수확한 후 세포 총 수와 생존율을 통계하였다.
5) a: 모든 성분이 모두 배지 용액 성분인 확장 배지(표 2 내지 표 3에서 번호 18 및 22번에 해당하는 배지)에 대하여, G-REX500M 배양조(Wilsonwolf사에서 구입)에 5L의 예열된 확장 배지를 첨가하고, 단계 4)에서 획득한 시드 세포를 2.0Х105/cm2 내지 5.0Х105/cm2의 접종 밀도에 따라 접종하였으며, 37℃, 5% CO2에서 배양하고, 4일마다 세포를 계수하였으며, 절반 부피의 오래된 확장 배지를 제거하고, 절반 부피의 새로운 확장 배지를 보충하였으며, 각각의 G-REX500M 배양조의 세포 총 수가 1.0Х1010에 도달하면, 1:2 비율로 플라스크에 나누었고, 각각의 플라스크에 새로운 확장 배지를 5L까지 보충한 후 계속해서 배양하였다. 확장 배지에서 전후로 총 12 내지 15일 배양한 후 세포를 수확하여, TIL 제품 세포를 획득하였다.
b: 일부 성분이 전술한 바와 같이 미리 코팅 처리된 확장 배지(표 2 내지 표 3에서 번호 17, 19, 20, 21, 23, 24에 해당하는 배지)에 대하여, 4)에서 수확한 시드 세포를 취하고, 코팅 성분을 제외한 모든 기타 상응하는 용액 중 성분을 함유하는 확장 배지를 사용하여 1.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL로 재현탁하고, 코팅 성분으로 코팅 전처리된 세포 배양 접시에 첨가하였으며, 37℃, 5% CO2로 2 내지 3일 동안 활성화시킨 후, 활성화된 세포를 원심분리하여 수집하였고, 미리 예열된 확장 배지가 첨가된 G-REX500M 배양조에 접종하였으며, G-REX500M 배양조의 확장 배지는 코팅 성분을 제외한 모든 기타 상응하는 용액 중 성분을 함유하는 확장 배지와 동일하다. 각각의 G-REX500M에서 확장 배지 부피는 5L이다. 활성화된 시드 세포를 2.0Х105/cm2 내지 5.0Х105/cm2의 접종 밀도에 따라 접종하고, 37℃, 5% CO2에서 배양하였으며, 4일마다 세포를 계수한 후, 절반 부피의 오래된 확장 배지를 제거하고, 절반 부피의 새로운 확장 배지를 보충하여, 각각의 G-REX500M 배양조의 세포 총 수가 1.0Х1010에 도달하면, 1:2 비율로 플라스크에 나누었고, 각각의 플라스크에 새로운 확대 배지를 5L까지 첨가한 후 계속해서 배양하였다. G-REX500M 배양조의 확장 배지에서 전후로 총 10 내지 12일 동안 배양한 후 세포를 수확하여, TIL 제품 세포를 획득하였다.
6) 5)에서 수확한 유세포 분석기를 취하여 수확한 제품 세포의 표현형을 검출하고, HTRF IFN-γ 검출 키트(Cisbio Human IFN gamma kit 제품 번호: 62HIFNGPET)를 사용하여 설명서에 기재된 방법에 따라 IFN-γ 분비 수준을 검출하였다.
하기 표 4는 종양 조직 샘플 번호, 암종, 배양 과정에 사용된 시드 세포 배지 및 확장 배지의 표 1 내지 표 3에 대응하는 번호, 각각의 조직 샘플 시드 세포 배지 및 확장 배지 각각의 배양 시간 및 G-REX500M 세포 접종 밀도를 나타낸 것이며; 표 5는 단계 5)의 b에서, 상응하는 종양 조직 샘플의 코팅기 접시 유형, 코팅 활성화 재현탁 세포 밀도 및 코팅 활성화 시간을 나타낸 것이다.
245mm 세포 배양 접시는 Corning사(Cat. 431111)에서 구입하엿으며, 세포 배양 백은 Takara사(CultiLifeTM 215 Culture Bag, Cat. FU0005)에서 구입하였다. 상기 TIL 제품 세포의 제조 전과정은 모두 GMP 수준의 생산 작업장에서 관련 법규 요건에 따라 수행되었다. 세포를 수확한 후 원심분리를 수행하고, D-PBS로 세척하고, 생리식염수에 재현탁하였으며, 품질관리검사(CD3+ 비율, CD4+ 및 CD8+ 비율, IFN-γ 분비 수준, 멸균, 내독소, 삼투압 등) 후 각각의 지표는 <중화인민공화국 약전> 또는 국내외에서 이미 판매되는 면역 세포 치료 제품의 해당 일반 표준을 충족시켰다.
결과는 표 6 및 도 1 내지 7에 도시된 바와 같다. 표 6은 본 발명의 배지 및 배양 방법을 사용하여 표 4의 각각의 조직 샘플로부터 배양하여 획득한 종양 침윤 림프구(TIL)의 시드 세포 수, 제품 세포 수, 제품 세포 생존율, 제품 세포 표현형 및 제품 세포의 IFN-γ 분비 수준을 나타낸 것이다. 도 1 내지 17은 각각 번호가 T001, T002, T003, T004, T005, T006, T007, T008, T009, T010, T011, T012, T013, T014, T015, T016, T017인 조직 샘플 유래의 TIL 제품 세포의 유세포 분석 표현형 분석 결과에 대응한다.
표 6의 결과에 따르면, 본 출원의 각각의 군의 시드 세포 배지를 사용하여 배양한 고형 종양 조직은 12일에 제품 수확 시 모두 적어도 약 108에 달하는 세포 총 수를 획득할 수 있었으며, 특히 일부 종양 샘플에서는 총 수가 최고 2Х108을 초과하고 3Х108을 초과하는 TIL 시드 세포를 획득할 수 있으며, 예를 들어 T002, T010 및 T013이 있다. 각각의 군의 시드 세포가 본 출원의 각각의 군의 상이한 확장 배지에서 배양된 후, 최종 약 24일에 수확 시 모두 1010 내지 1011 자릿수의 TIL 제품 세포를 획득할 수 있었으며, 여기에서 절대 다수가 모두 1011 자릿수 이상이었다. 모든 군별로 수확한 TIL 제품 세포의 생존율은 모두 비교적 높았으며, 극히 개별 샘플을 제외하고는 절대 다수가 모두 90%를 초과하였고, T005, T008 및 T013과 같은 일부는 99%에 근접하였으며, 검출 결과 각각의 군의 TIL 제품 세포의 IFN-γ 분비량도 모두 비교적 높은 수준이었는데, 이는 본 출원의 배지와 배양 방법으로 획득한 모든 TIL 제품 세포가 모두 비교적 높은 활성화 상태에 있음을 설명한다. 도 1 내지 17에 도시된 바와 같이, 모든 군별 TIL 제품 세포는 모두 고순도 림프구이며, 이의 CD45+ 세포 비중은 모두 100%이거나 100%에 근접하였다. 모든 TIL 제품 세포에서, CD3+ 세포 비중이 가장 낮은 것은 80%에 근접하였고(79.25%), 절대 다수 군별 TIL 제품 세포의 CD3+ 세포 비중이 모두 90%를 초과하였으며, 일부 군은 100%에 근접하였다(예를 들어 T006, T013, T002, T015). 모든 군별 샘플 TIL 제품 세포에서, 대부분 군의 CD3+ 세포 집단의 CD8+ T 세포 비중은 50%에 근접하거나 초과하였으며, 도 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16 및 17에 도시된 바와 같이, CD4+ T 세포에 대해 절대적인 장점이 있었고; 일부 군의 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포 비중은 도 2 및 9에 도시된 바와 같이 1:1에 근접하였다. 상기 결과는, 본 출원의 각각의 군의 시드 세포 배지와 확장 배지 조합을 사용하여 상이한 종양 조직 샘플로부터 배양하여 획득한 TIL 제품 세포가 우수한 표현형을 가짐을 나타낸다.
실시예 3: T001 유래 TIL의 표적 세포에 대한 사멸 효과
위암 세포주 HGC27(모두 Merck사에서 구입, Cat. 94042256)을 표적 세포로 선택하고, ACEA Biosciences사의 실시간 무표지 세포 기능 분석기(RTCA)를 이용하여 실시예 2에서 제조된 T001 조직 유래 TIL 제품 세포의 생체외 사멸 활성을 검출하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다:
(1) 영점 조정: 각각의 웰에 50μL의 DMEM 또는 1640 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, step 1을 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: HGC27 세포를 웰당 104개 세포/50μL로 검출 전극을 함유한 플레이트에 플레이팅하고, 몇 분간 거치한 후, 세포가 안정화되면, 다시 기기에 넣고, step 2를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 세포 지수(Cell Index)가 1.0에 가까워질 때까지 표적 세포를 19시간 동안 배양한 후, step 2를 일시 중지하고, 웰당 50μL의 이펙터 세포를 첨가하였으며, TIL 세포 생존율 비율을 각각 효과 표적비 2:1, 4:1 및 8:1에 따라 이펙터 세포 수를 추가하고, step 3를 시작하였으며, 계속해서 50시간을 초과하여 공동 배양한 후, 세포 증식 그래프를 관찰하였다.
결과는 도 18에 도시된 바와 같이, 효과 표적비가 2:1일 때, 종양 세포 대조군에 비해, T001 유래의 TIL 세포는 종양 세포 HGC27에 대한 명백한 사멸 효과를 나타냈다. 효과 표적비가 높아짐에 따라, TIL 세포의 HGC27에 대한 사멸 효과도 현저하게 높아졌다.
실시예 4: T002 유래 TIL의 표적 세포에 대한 사멸 효과
흑색종 세포주 A375(모두 ATCC사에서 구입)를 표적 세포로 선택하고, ACEA Biosciences사의 실시간 무표지 세포 기능 분석기(RTCA)를 사용하여 실시예 2에서 제조된 T002 조직 유래 TIL 제품 세포의 생체외 사멸 활성을 검출하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다:
(1) 영점 조정: 각 웰에 50μL의 DMEM 또는 1640 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, step 1을 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: 표적 세포 A375를 웰당 104개 세포/50μL로 검출 전극을 함유한 플레이트에 플레이팅하고, 몇 분간 거치한 후, 세포가 안정화되면, 다시 기기에 넣고, step 2를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 세포 지수(Cell Index)가 1.5가 될 때까지 표적 세포를 20시간 동안 배양한 후, step 2를 일시 중지하고, 웰당 50μL의 이펙터 세포를 첨가하였으며, TIL 세포 생존율 비율을 효과 표적비 2:1, 4:1및 8:1에 따라 각각 이펙터 세포 수를 추가하고, step 3를 시작하였으며, 계속해서 50시간을 초과하여 공동 배양한 후, 세포 증식 그래프를 관찰하였다.
결과는 도 19에 도시된 바와 같이, 효과 표적비가 2:1일 때, 종양 세포 대조군에 비해, T002 유래의 TIL 세포는 종양 세포 A375에 대한 명백한 사멸 효과를 나타냈다. 효과 표적비가 높아짐에 따라, TIL 세포의 A375에 대한 사멸 효과도 현저하게 높아졌다.
실시예 5: T003 유래 TIL의 표적 세포에 대한 사멸 효과
자궁경부암 세포주 HeLa(모두 ATCC사에서 구입)를 표적 세포로 선택하고, ACEA Biosciences사의 실시간 무표지 세포 기능 분석기(RTCA)를 사용하여 실시예 2에서 제조된 T003 조직 유래 TIL 제품 세포의 생체외 사멸 활성을 검출하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다:
(1) 영점 조정: 각각의 웰에 50μL의 DMEM 또는 1640 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, step 1을 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: 표적 세포 HeLa를 웰당 104개 세포/50μL로 검출 전극을 함유한 플레이트에 플레이팅하고, 몇 분간 거치한 후, 세포가 안정화되면, 다시 기기에 넣고, step 2를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 세포 지수(Cell Index)가 1.0이 될 때까지 표적 세포를 20시간 동안 배양한 후, step 2를 일시 중지하고, 웰당 50μL의 이펙터 세포를 첨가하였으며, TIL 세포 생존율 비율을 효과 표적비 2:1, 4:1 및 8:1에 따라 각각 이펙터 세포 수를 추가하고, step 3를 시작하였으며, 계속해서 50시간을 초과하여 공동 배양한 후, 세포 증식 그래프를 관찰하였다.
결과는 도 20에 도시된 바와 같이, 효과 표적비가 2:1일 때, 종양 세포 대조군에 비해, T003 유래의 TIL 세포는 종양 세포 HeLa에 대한 명백한 사멸 효과를 나타냈다. 효과 표적비가 높아짐에 따라, TIL 세포의 HeLa에 대한 사멸 효과도 현저하게 높아졌다.
실시예 6: T005 유래 TIL의 표적 세포에 대한 사멸 효과
위암 세포주 HGC27(Merck사에서 구입, Cat. 94042256)을 표적 세포로 선택하고, ACEA Biosciences사의 실시간 무표지 세포 기능 분석기(RTCA)를 이용하여 실시예 2에서 제조된 T005 조직 유래 TIL 제품 세포의 생체외 사멸 활성을 검출하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다:
(1) 영점 조정: 각각의 웰에 50μL의 DMEM 또는 1640 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, step 1을 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: 표적 세포 HGC27를 웰당 104개 세포/50μL로 검출 전극을 함유한 플레이트에 플레이팅하고, 몇 분간 거치한 후, 세포가 안정화되면, 다시 기기에 넣고, step 2를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 세포 지수(Cell Index)가 약 1.0이 될 때까지 표적 세포를 21시간 동안 배양한 후, step 2를 일시 중지하고, 웰당 50μL의 이펙터 세포를 첨가하였으며, TIL 세포 생존율 비율을 각각 효과 표적비 2:1, 4:1 및 8:1에 따라 이펙터 세포 수를 추가하고, step 3를 시작하였으며, 계속해서 50시간을 초과하여 공동 배양한 후, 세포 증식 그래프를 관찰하였다.
결과는 도 21에 도시된 바와 같이, 효과 표적비가 2:1일 때, 종양 세포 대조군에 비해, T005 유래의 TIL 세포는 종양 세포 HGC27에 대해 비교적 강한 사멸 효과를 나타냈다. 또한 효과 표적비가 높아짐에 따라, TIL 세포의 HGC27에 대한 사멸 효과가 더 이상 현저하게 향상되지 않았는데, 이는 낮은 효과 표적비 하에서 T005 유래 TIL 세포의 표적 세포 HGC27에 대한 사멸 효과가 이미 상한에 도달했음을 보여준다.
실시예 7: T004 유래 TIL의 표적 세포에 대한 사멸 효과
위암 세포주 HGC27(Merck사에서 구입, Cat. 94042256)을 표적 세포로 선택하고, ACEA Biosciences사의 실시간 무표지 세포 기능 분석기(RTCA)를 이용하여 실시예 2에서 제조된 T004 조직 유래 TIL 제품 세포의 생체외 사멸 활성을 검출하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다:
(1) 영점 조정: 각각의 웰에 50μL의 DMEM 또는 1640 배양액을 첨가하고, 기기에 넣은 다음, step 1을 선택하고, 영점으로 조정하였다.
(2) 표적 세포 플레이팅: 표적 세포 HGC27를 웰당 104개 세포/50μL로 검출 전극을 함유한 플레이트에 플레이팅하고, 몇 분간 거치한 후, 세포가 안정화되면, 다시 기기에 넣고, step 2를 시작하여, 세포를 배양하였다.
(3) 이펙터 세포 첨가: 세포 지수(Cell Index)가 약 1.5가 될 때까지 표적 세포를 21시간 동안 배양한 후, step 2를 일시 중지하고, 웰당 50μL의 이펙터 세포를 첨가하였으며, TIL 세포 생존율 비율을 각각 효과 표적비 2:1, 4:1 및 8:1에 따라 이펙터 세포 수를 추가하고, step 3를 시작하였으며, 계속해서 80시간을 초과하여 공동 배양한 후, 세포 증식 그래프를 관찰하였다.
결과는 도 22에 도시된 바와 같이, 효과 표적비가 2:1일 때, 종양 세포 대조군에 비해, T004 유래의 TIL 세포는 종양 세포 HGC27에 대해 일정한 사멸 효과를 나타냈다. 효과 표적비가 높아짐에 따라, TIL 세포의 HGC27에 대한 사멸 효과도 단계적으로 현저하게 높아졌다.
실시예 8: TIL 세포의 동종 종양 오가노이드에 대한 사멸 효과
실시예 2의 새로운 T006 종양 조직을 취하여, 공개된 문헌(Chiara M Cattaneo, Krijn K Dijkstra, Lorenzo F Fanchi, Sander Kelderman, Sovann Kaing, Nienke van Rooij, Stieneke van den Brink, Ton N Schumacher, Emile E Voest. Tumor organoid-T-cell coculture systems Nat Protoc. 2020 Jan;15(1):15-39. , 해당 문헌은 전체로서 본원에 인용됨) 제10페이지에 기재된 방법에 따라 종양 조직을 처리한 후 오가노이드(Patient-derived organoid, PDO) 배양을 수행하였으며, 배양에 사용된 키트 기기는 모두 해당 공개 문헌의 기재를 참조하여 구입하였다. 2 내지 3회 성공적으로 배양 및 계대한 PDO를 취하여 다음 절차에 따라 동종 TIL 세포(T006 TIL 제품 세포) 및 PDO의 공동 배양 및 사멸 실험을 수행하였다.
1일째:
1. 배양된 T006 PDO 계열을 취하여, PDO 배지를 버리고, 적절한 양으로 예열된 디스파제(2mg/mL가 PBS에 용해됨)로 PDO를 처리하였으며, PDO를 건으로 부드럽게 블로잉하여, PDO를 37℃에서 5 내지 15분 동안 방치하였으며; 단세포가 나타나는 것을 방지하였다.
2. PDO를 원심분리관으로 옮기고, 디스파제 1mL당 100μL EDTA(0.5M)를 첨가하고, PBS를 10mL까지 보충하여, 원심분리를 수행하였다.
3. 2mL의 PDO 배지를 사용해 PDO를 12웰 플레이트로 옮기고, 10μM Y-27632(MCE사에서 구매, Ca. HY10071에서 구입)를 첨가하여 아노이키스를 방지하였고, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다.
2일째:
1. PDO에 200ng/mL의 IFNγ를 첨가하여 밤새 처리하여 항원 제시를 강화하였다.
2. 96웰 플레이트 상에서 5μg/mL CD28 mAb 코팅된 PBS(웰당 50μL)를, 4℃에서 24시간 동안 배양하였다.
3. 24웰 G-REX에 1Х107개 TIL 세포를 플레이팅하고, 150U/mL IL-2와 20μg/mL PD1 mAb를 첨가하여 밤새 처리하였다.
3일째:
1. 12웰 플레이트에서 PDO를 수집하였다. 오가노이드와 배지의 현탁액을 15mL 시험관으로 옮겼다. 총 부피를 2개로 등분하여 나누었으며, 총 부피의 1/11은 단일 세포로 분리하여 계수하는 데 사용하였고, 총 부피의 10/11은 실험에 사용하였다.
2. 1/11을 단일 세포로 효소 분해하였다. PDO를 500μL TrypLE에 재현탁하고, 37℃에서 5 내지 15분 동안 배양하였다. 기관이 해리되었는지 여부를 몇 분마다 검사하였다. 이들이 단일 세포로 분해되면 종료를 중지하고, 계산하였다.
3. PBS로 10/11 PDO를 2회 세척하였으며, 배지에 첨가된 IFN-γ를 제거하였다.
4. TIL 세포 배지(표 1에서 8번 배지)에서 1Х105/mL 단일 세포로 오가노이드를 재현탁하였다. PD-1 mAb를 40μg/mL의 농도로 추가하고 Y-27632를 20μM의 농도로 추가하였다.
5. TIL 세포를 수집하고, 800g을 3분간 원심분리하였으며, 표 1의 8번 배지를 이용해 재현탁하고, 밀도를 5Х105/mL로 조정하였다.
6. 세포 수를 2군으로 균등하게 나누고, 86웰 플레이트에 첨가하였다.
군 1: 100μL PDO + 100μL 8번 배지
군 2: 100μL PDO + 100μL 5Х104 TIL 세포를 함유한 8번 배지
군 1과 군 2는 각각의 군에 3개의 평행 서브 웰을 각각 만든다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 각각의 서브 웰의 TIL과 PDO 혼합 현탁액을 취하여 단일 세포 현탁액으로 효소 소화하며, 장암 세포 마커 EpCAM의 유세포 분석 항체로 종양 세포를 염색하고, 염료 키트 Zombie NIRTM Fixable Viability Kit(Biolegend사에서 구입)로 염색하여 사세포와 생세포를 구분하였으며, 염색 후 유세포 분석기로 검출하였다.
결과는 도 23에 도시된 바와 같다. **: p<0.01. 동종의 TIL 세포와 48시간 동안 공동 배양한 후, PDO+TIL군의 EpCAM+ 종양 세포 생존율이 PDO+TIL 배지군에 비해 현저히 감소하였다. 이는 T006 종양 조직 유래 배양에서 획득된 오가노이드가 동종의 쌍을 이루는 TIL 세포에 의해 효과적으로 사멸될 수 있음을 보여준다.
실시예 9: T001 조직 샘플 유래 TIL 제품 세포의 마우스 세포주 유래 종양 이식물(Cell line-derived xenograft, CDX) 종양 조직에 대한 사멸 효과
실험 동물
면역결핍 B-NDG 마우스(Biocytogen사에서 구입)를 CDX 모델로 선택하여 실험 동물을 구축하였다.
실험 설계와 그룹화: 하기 표 7과 같다.
TIL 세포는 실시예 2에서 제조된 조직 샘플 T001 유래의 TIL 제품 세포이고, 꼬리 정맥 주사 전에 세포를 원심분리하여 PBS에 재현탁하여, 세포 밀도가 2Х107/mL인 PBS 세포 현탁액을 제조하였다.
동물 사육
필요한 양의 B-NDG 마우스를 구입한 후, SPF 수준의 동물실험실에서 사육하였으며, 적응기는 7 내지 10일이었다.
환경: 마우스는 동물실험실의 투명 수지 플라스틱 케이지에 수용되었다. 마우스 케이지 바닥재는 고압멸균된 톱밥과 옥수수속 바닥재이며, 주기적으로 교체하였다. 동물실험실에는 고효율 공기 필터를 배치하고, 온도는 20 내지 26℃(68 내지 79℉)사이로 유지하였으며, 상대 습도는 40 내지 70%였다. 지속 관찰하여 온도와 습도를 기록하였다. 조명 조건은 매일 12시간 동안 일광을 조사하고 12시간 동안 조명을 제공하지 않는다는 것이다.
식이 섭취: 실험용 마우스는 전용 마우스 먹이(방사선으로 살균, Shanghai Silaike Experiment Animal사, 중국)를 무제한으로 얻을 수 있으며, 언제든지 멸균에 가까운 깨끗한 식수를 구애 없이 얻을 수 있었다.
종양 세포 접종
각각의 마우스는 우측 피하에 HGC-27 종양 세포를 접종시켰으며(마우스당 2Х106 세포 접종), 0.1mL의 50% 기질을 함유한 배지에 접종하여, 종양의 성장을 촉진시켰다.
동물 그룹화 및 투여
종양 부피가 약 50mm3에 도달했을 때, 12마리의 동물을 종양 부피에 따라 무작위로 그룹화하였으며, n=6이고, 모든 군이 비교선 상에서 비교 가능하도록 확보하였다. 그룹화 당일을 P0으로 기록하였다. 실험 기간 동안 매주 3회 동물 체중과 종양 부피를 측정하였으며, 매일 동물의 임상 증상을 관찰하였다. 종양 부피는 mm3으로 나타냈으며, 공식은 V=0.5ХaХb2이고, 여기에서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다.
결과
실험 결과는 도 24에 도시된 바와 같다. 군 간의 종양 부피 크기 차이는 언페어드 양측 꼬리 t-검정（unpaired two-tailed t-test）을 통해 통계학적으로 분석하였다. *: p<0.05; **: p<0.01. 도 24의 결과에 따르면, 투여 23일째에, PBS 주입 대조군 종양 마우스에 비해, TIL 세포 투여군 마우스의 종양 부피 증가가 매우 현저하게 억제되었으며, 이는 T001 유래의 TIL 제품 세포가 위암 종양에 대해 생체내에서 매우 현저한 사멸 효과를 나타냄을 보여준다.
실시예 10: T002 조직 샘플 유래 TIL 제품 세포의 마우스 CDX 종양 조직에 대한 사멸 효과
실험 동물
면역결핍 B-NDG 마우스(Biocytogen사에서 구입)를 CDX 모델로 선택하여 실험 동물을 구축하였다.
실험 설계와 그룹화: 하기 표 8과 같다.
TIL 세포는 실시예 2에서 제조된 조직 샘플 T002 유래의 TIL 제품 세포이고, 꼬리 정맥 주사 전에 세포를 원심분리하여 PBS에 재현탁하여, 세포 밀도가 2Х107/mL인 PBS 세포 현탁액을 제조하였다.
종양 세포 접종
각각의 마우스는 우측 피하에 흑색종 세포 A375를 접종시켰으며(마우스당 2Х106 세포 접종), 0.1mL의 50% 기질을 함유한 배지에 접종하여, 종양의 성장을 촉진시켰다.
동물 사육, 동물 그룹화 및 투여는 실시예 9와 동일하다.
결과
실험 결과는 도 25에 도시된 바와 같다. 군 간의 종양 부피 크기 차이는 언페어드 양측 꼬리 t-검정을 통해 통계학적으로 분석하였다. *: p<0.05; **: p<0.01. 도 25의 결과에 따르면, 투여 22일째에, PBS 주입 대조군 종양 마우스에 비해, TIL 세포 투여군 마우스의 종양 부피 증가가 매우 현저하게 억제되었으며, 이는 T002 유래의 TIL 제품 세포가 흑색종에 대해 생체내에서 매우 현저한 사멸 효과를 나타냄을 보여준다.
실시예 11: T008 조직 샘플 유래 TIL 제품 세포의 동종의 쌍을 이루는 환자 유래 종양 이식물(Patient-derived xenograft, PDX) 종양 조직에 대한 사멸 효과
실험 동물
면역결핍 B-NDG 마우스(Biocytogen사에서 구입)를 PDX 모델로 선택하여 실험 동물을 구축하였다.
실험 설계와 그룹화: 하기 표 9와 같다.
TIL 세포는 실시예 2에서 제조된 조직 샘플 T008 유래의 TIL 제품 세포이고, 꼬리 정맥 주사 전에 세포를 원심분리하여 PBS에 재현탁하여, 세포 밀도가 1Х108/mL인 PBS 세포 현탁액을 제조하였다.
동물 사육
필요한 양의 B-NDG 마우스를 구입한 후, SPF 수준의 동물실험실에서 사육하였으며, 적응기는 7 내지 10일이었다.
환경: 마우스는 동물실험실의 투명 수지 플라스틱 케이지에 수용되었다. 마우스 케이지 바닥재는 고압멸균된 톱밥 및 옥수수속 바닥재이며, 주기적으로 교체하였다. 동물실험실에는 고효율 공기 필터를 배치하고, 온도는 20 내지 26℃(68 내지 79℉)사이로 유지하였으며, 상대 습도는 40 내지 70%였다. 지속 관찰하여 온도와 습도를 기록하였다. 조명 조건은 매일 12시간 동안 일광을 조사하고 12시간 동안 조명을 제공하지 않는다는 것이다.
식이 섭취: 실험용 마우스는 전용 마우스 먹이(방사선으로 살균, Shanghai Silaike Experiment Animal사, 중국)를 무제한으로 얻을 수 있으며, 언제든지 멸균에 가까운 깨끗한 식수를 구애 없이 얻을 수 있었다.
PDX 모델의 구축
1) 환자 종양 조직 샘플 처리: T008 종양 조직의 일부를 취하여, 무균 상태에서 괴사 조직, 지방 조직, 결합 조직 등을 제거하고, 세척한 후 메스로 여러 5Х5Х5mm3 조직 조각으로 분할하여, 종양 샘플 운반보존액 UW에 넣고, 종양 조각을 B-NDG 마우스에 접종할 준비를 하였다.
2) 종양 조직 샘플 접종: 여러 B-NDG 마우스를 취하고, 마우스 견갑부 피부를 준비한 후 마우스 피하 종양 접종 고정기를 이용하여 마우스를 고정하고, 아이오도포르로 소독하였으며, 리도카인으로 국소 마취한 후 PDX 모델 종양 조각을 투관침으로 접종하여 1)의 종양 조각을 우측 서혜부에 접종하였다. 접종 당일을 P0으로 기록하고, 매주 종양을 2회 측정하였으며, 종양 부피 계산 공식은 V=0.5ХaХb2이고, 여기에서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다.
3) PDX 조직 계대: 각각의 접종 마우스의 종양 조직의 성장을 관찰하고, 종양 조직 부피가 300mm3를 초과하여 성장할 때까지 기다린 후, 마우스를 마취하고, 종양 조각을 취하여, 멸균 조건 하에서 메스로 5Х5Х5mm3 조직 조작으로 절단한 후 단계 2)를 반복하였으며, 새로운 마우스 우측 서혜부에 접종하고, PDX 종양의 다음 계대 성장을 기다렸다.
4) 단계 3)을 반복하였으며, 계속해서 2 내지 3계대를 진행한 후, 일부 마우스 생체내 PDX 조직을 취하여 조직 절편의 병리학적 분석을 수행하여, PDX 조직이 여전히 인간 유래 조직(마우스 유래 조직이 아님)임을 확인한 후, 표 9의 실험 계획에 따라 사용하는 마우스 수의 1.5배로 계속해서 PDX 조직을 마우스에 접종하고(즉, PDX 조직 조각을 마우스 24마리에 접종), 마우스의 종양 형성을 관찰하였으며, 매주 2회 종양을 측정하여, 종양 형성을 기다렸다.
동물 그룹화 및 투여
PDX를 접종한 마우스의 종양 부피가 약 50mm3에 도달했을 때, 24마리의 동물중에서 16마리의 종양 부피가 적합한 동물을 선택하고, 종양 부피에 따라 무작위로 그룹화하였고, n=8이며, 모든 군이 기준선 상에서 비교 가능하도록 확보하였다. 그룹화 당일을 D0으로 기록하였으며, 표 9 방안에 따라 투여하였다. 실험 기간 동안 매주 3회 동물 체중과 종양 부피를 측정하였으며, 매일 동물의 임상 증상을 관찰하였다. 종양 부피는 mm3으로 나타냈으며, 종양 측정 공식은 상술한 바와 같다.
결과
실험 결과는 도 26에 도시된 바와 같다. 군 간의 종양 부피 크기 차이는 언페어드 양측 꼬리 t-검정을 통해 통계학적으로 분석하였다. *: p<0.05; **: p<0.01. 도 26의 결과에 따르면, 투여 40일째에, PBS 주입 대조군 종양 마우스에 비해, TIL 세포 투여군 마우스의 종양 부피 증가가 매우 현저하게 억제되었으며, 이는 T008 유래의 TIL 제품 세포가 그 유래 환자와 동일한 종양 PDX 조직에 대해 생체내에서 매우 현저한 사멸 효과를 나타냄을 보여준다.
실시예 12: 동종의 쌍을 이룬 PDX 마우스 생체내의 T007 조직 샘플 유래 TIL 제품 종양 향성 검측
1. 환자 말초 혈액 PBMC로부터 T 세포 분리 제조
Ficoll 분리법을 이용하여 T007 조직 샘플에 대응하는 환자의 말초 혈액 20mL에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 분리 획득하였다. PBMC를 벽에 부착하여 2 내지 4시간 동안 배양하였으며, 여기에서 벽에 부착되지 않은 현탁 세포가 바로 초기 T 세포이고, 현탁 세포를 15ml 원심분리관에 수집하여, 1200rmp으로 3분 동안 원심분리하였으며, 상청액을 버리고, 생리식염수를 첨가하였고, 1200rmp으로 3분 동안 원심분리하였으며, 생리식염수를 버리고, 이 단계를 반복하였다. 수확된 T 세포는 200IU/mL IL-2 및 5% 인간 AB 혈청을 함유하는 X-VIVO15를 사용해 재현탁하고, CD3 mAb 및 CD28 mAb로 사전 코팅된 세포 배양 접시에 넣고, 37℃, 5% CO2 세포 인큐베이터에서 3일 동안 활성화시켰으며, 세포 현탁액을 새로운 배양 접시에 옮겨 배양하였고, 적어도 1.0Х108T 세포를 배양 획득할 때까지, 1 내지 2일마다 새로운 배지로 교체하여, 후속 실험에 사용하도록 준비하였다.
2. 루시퍼라제 발현을 통합하는 T 세포 및 TIL 세포 제조
GeneChem사에서 루시퍼라제 유전자를 발현하는 렌티바이러스 입자를 구입하였으며, 제품 번호는 LVCON101이다. 하기 단계에 따라 루시퍼라제를 발현하는 렌티바이러스를 이용하여 1에서 제조한 T007 환자의 말초 혈액 유래 T 세포(사용 세포 수: 1Х108) 및 실시예 2에서 제조한 T007 종양 조직 샘플 유래 TIL 제품 세포(사용 세포 수: 1Х108)를 형질도입하였으며, 구체적인 단계는 하기와 같다:
1단계: 감염 전 준비로서, 냉장고에서 바이러스를 꺼내어, 얼음 위에서 융화시키고, 바이러스를 FBS 무함유 DMEM으로 10배 희석하였다.
2단계: 감염 작업으로서, T 세포와 TIL 세포 800g을 3분 동안 원심분리하고, 세포 침전을 무혈청 X-VIVO 15 기초 배지로 재현탁한 후, 세포 MOI 및 바이러스 역가에 따라, 상응하는 양의 바이러스를 추가하였으며, 계산 공식은 바이러스 부피=(MOIХ세포수)/바이러스 역가이다. MOI 값=50에 따라 말초 혈액 T 세포 및 TIL 세포를 감염시키고, 감염 후 8 내지 12시간 후에 인간 AB 혈청을 최종 농도 5% v/v 및 IL-2 최종 농도 200IU/mL까지 첨가하고, 계속해서 24 내지 48시간 동안 배양하였다.
3단계: 세포 배양 및 계대로서, 도중에 세포를 보액하여 세포 활성을 유지할 수 있다.
4단계: 감염 효과 확인으로서, 감염 72시간 후, 소량의 세포를 취하여 96웰 플레이트 중 하나의 웰에 추가하고, 동시에 20μl 루시퍼라제의 기질 루시페린과 소금 희석액을 추가하여, 소동물 생체내 영상 장치를 통해 형광 상태를 관찰하였다.
결과에서는 T 세포와 TIL 세포 모두 형광 값이 명확하게 검출될 수 있었으며, 이는 루시퍼라제를 발현하는 렌티바이러스가 T007의 T 세포와 TIL 세포를 성공적으로 형질도입하였음을 나타내며, 이는 T-Luc 세포와 TIL-Luc 세포로 각각 기록하였다.
3. PDX 모델의 구축
실시예 11의 "PDX 모델의 구축" 부분에 기재된 방법을 참조하며, 일부 T007 종양 조직을 취하여, 면역 결핍 B-NDG 마우스의 T007 종양 조직을 기반으로 PDX 모델을 구축하였고, 2 내지 3계대의 안정적인 계대에서 여전히 마우스 유래가 아닌 인간 유래 PDX 조직임을 병리학적 검출 확인한 후 실험 요건에 따라 B-NDG 마우스는 종양 조각 이식 접종으로 수행하였으며, 종양 조각 접종 부위는 마우스 우측 서혜부였다.
4. TIL 세포 생체내 종양 향성 검출
실험 설계와 그룹화는 하기 표 10과 같다.
2에서 제조된 T-Luc 세포와 TIL-Luc 세포를 원심분리하고, 세포 침전을 PBS로 재현탁하여 밀도가 1Х108/mL인 세포 현탁액을 제조하였으며, T007 PDX 종양 보유 마우스 3개 군을 표 10의 실험방안에 따라 투여를 수행하였다. 투여 1일(D1) 및 10일(D10) 후 3개 군 마우스 각각에 루시퍼라제 기질 루시페린을 주사하여 반응시킨 후 다시 소동물 생체내 영상 장치에서 생체 형광 이미징을 수행하여, 종양 보유 마우스 체내에서 T-Luc 세포와 TIL-Luc 세포의 분포 상태를 관찰하였다.
결과는 도 27에 도시된 바와 같다. 도 27에 도시된 바와 같이, 꼬리정맥 재주입 1일 후, 말초 혈액 유래의 T 세포와 TIL 세포가 혈액 순환 후 모두 폐에서 유의하게 농축되었다. 재주입 10일 후, 형광 생체내 이미징에서, T 세포와 TIL 세포 모두 종양 경향을 나타냈으나, 말초 혈액 유래의 T 세포에 비해, TIL 세포 종양 경향이 더욱 현저한 것으로 나타났다.
실시예 13: TIL 임상 재주입과 생체내 TIL 세포 증식
본 출원의 배양 방법으로 획득한 TIL의 임상적 안전성과 유효성을 검증하기 위하여, 고형 종양에 대한 TIL 재주입 치료의 임상 시험을 수행하였다. 본 임상 시험은 상하이시 제10인민병원윤리위원회(第10人民醫院倫理委員會)의 승인을 받았으며, 구체적으로 http://www.chictr.org.cn/, 등록번호: ChiCTR2100044705; 또는 www.clinicaltrials.gov, 등록 번호 NCT04766320을 참조한다. 또한 본 임상 시험은 상하이교통대학의학원 부속 동인병원(同仁醫院) 및 쑤저우대학 부속 제2병원과도 협력하였으며, www.clinicaltrials.gov 등록 번호는 각각 NCT04967833 및 NCT04943913이다.
연구방안
1. 피험자 편입, 배제 기준 및 군 할당 방법
편입 기준:
1) 18세≤연령≤75세;
2) 병리학적으로 진단된 악성 종양의 원발성/재발성/전이성 환자;
3) 예상 수명>3개월;
4) Karnofsky≥60%의 ECOG 점수 0 내지 2점;
5) 피험자는 현재 표준 치료에 실패했거나, 표준 치료 방안이 없음;
6) 피험자는 TIL을 분리할 수 있는 천자 또는 생검에 적합한 생조직의 종양 영역 또는 악성 삼출액이 반드시 있어야 함;
7) 적어도 1개의 평가 가능한 종양 병변이 있음;
8) 백혈구 수≥2.5Х109/L, 절대 호중구 수≥1.5Х109/L, 혈소판 수≥100Х109, 헤모글로빈≥90g/L;
9) 혈청 크레아티닌 청소율 50mL/min 이상; 크레아티닌≤1.5ХULN; ALT(alanine aminotransaminase)/AST(aspartate aminotransferase)<정상군의 3배, 간전이군＜정상군의 5배; 총 빌리루빈≤1.5ХULN;
10) 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)≤1.5ХULN; 국제 표준화 비율(INR)≤1.5ХULN;
11) 정맥 채널이 충분하고, 수술 또는 천자에 대한 절대적 또는 상대적 금기 사항 없음;
12) 가임 가능성이 있는 피험자는 반드시 사전 동의 시점에 승인된 고효율 피임 방법을 시작하고, 림프 청소 프로그램 완료 후 1년 이내에 계속 실시해야 함;
13) 방사선 요법, 화학 요법 및 생물학적 제제를 포함한, 악성 종양에 대한 모든 치료 방법은, 반드시 TILs를 취득하기 28일 전에 중단해야 함;
14) 충분한 이해 능력이 있고 사전 동의서에 자발적으로 서명함;
15) 순응적이며, 연구 방문 계획 및 기타 프로토콜 요구 사항을 잘 준수할 수 있음.
배제 기준:
1) 글루코코르티코이드 치료, 일일 용량이 15mg보다 큰 프레드니손(또는 해당 용량의 호르몬)을 사용해야 하는 경우;
2) 자가면역성 질환에 면역 억제 치료가 필요한 경우;
3) 혈청 크레아티닌>1.5ХULN, SGOT(Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase)>5배 정상치 상한; 총 빌리루빈>1.5ХULN인 경우;
4) 1초간 노력성 호기량(FEV1)<2L, 폐 일산화탄소 확산량(DLCO)(보정)<40%인 경우;
5) 다음 중 하나로 정의되는 현저한 심혈관 이상인 경우: NYHA(New York Heart Association) 클래스 III 또는 IV급 울혈성 심부전, 임상적으로 유의한 저혈압, 임상적으로 조절되지 않는 고혈압, 조절되지 않는 증상성 관상동맥 질환 또는 박출률<35%; 임상 개입이 필요한 심실성 부정맥, II-III도 방실 차단 등과 같은 심각한 심장 박동 또는 전도 이상;
6) 환자가 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 또는 HIV 항체 검사 양성;
활동성 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염(HBsAg 양성 및/또는 항-HCV 양성), 매독 감염 또는 매독트레포네마 항체 양성인 경우;
7) 심각한 신체적 또는 정신적 질병이 있는 경우;
8) 혈액 배양 양성 또는 감염의 영상학적 증거가 있는 경우;
9) 1개월 이내 또는 현재 다른 약물, 또는 기타 생물학적, 화학적 요법 또는 방사선 요법을 받고 있는 경우;
10) 세포 치료와 유사한 화학적 또는 생물학적 조성의 화합물로 인한 알레르기 반응 병력이 있는 경우;
11) 면역 치료를 받은 적이 있으며 irAE 등급≥3인 경우;
12) 이전 항종양 치료의 이상 반응이 CTCAE 5.0버전 등급 평가≤1까지 회복되지 않은 경우(탈모 등 연구자가 안전성 위험이 없다고 판단한 독성은 제외);
13) 임산부 또는 수유부의 경우;
14) 연구자가 피험자에게 기타 심각한 전신성 질환 병력이 있거나, 본 임상 연구에 참여하기에 부적합한 기타 이유가 있다고 판단한 경우.
2. 치료 효능 평가 기준
1차적 치료 효능 지표:
1) 객관적 반응률(ORR);
2) 질병 통제율(DCR);
3) 반응 지속 시간(DOR);
4) 무진행 생존기(PFS);
5) 전체 생존기(OS).
2차적 치료 효능 지표:
1) 임상적 치료 효능 평가: 완전관해(CR), 부분관해(PR), 불변(SD), 진행(PD) 등;
2) 치료 전후의 삶의 질 변화.
치료 효능은 RECIST1.1의 기준에 따라, 연구자가 관찰할 수 있는 ORR로 정의되었다.
3. 이상 반응의 기록 및 처리 조치
3.1 이상 반응의 정의
이상 반응(AE): 피험자가 사전 동의서에 서명하고 시험을 시작한 시점으로부터, 마지막 의학적 방문 시점까지 사이에 출현한 의학적 이상 반응으로, 증상 징후, 질병 또는 실험실 검사 이상으로 나타날 수 있으나, 치료 또는 시험 약물과 반드시 인과 관계가 있는 것은 아니다.
새로운 상태 또는 기존 상태의 악화는 AE로 간주된다. 연구 시작 전에 존재하였고, 연구 기간 동안 악화되지 않은 안정적인 만성 질환, 예를 들어 관절염은 AE로 간주되지 않는다. 비정상적인 실험실 검사 결과, 임상 증상 또는 징후가 연구자에 의해 임상적으로 유의하다고 판단된 경우는 AE로 간주된다.
심각한 이상 반응(SAE): 시험 과정에서 출현한 것으로 다음 조건 중 하나 이상을 충족하는 이상 반응을 의미한다: (1) 사망에 이르게 하는 것; (2) 생명을 위협하는 것, 즉 미래에 심각하게 발전할 것으로 추정되는 경우 사망 가능성이 아니라, 위중한 환자의 즉각적인 사망 위험을 의미함; (3) 입원 또는 장기 입원을 초래하는 것; (4) 영구적 또는 유의한 기능 상실; (5) 기형 발생, 선천적 결함 발생; (6) 기타 중요한 의학적 반응.
3.2 이상 반응 중증도 판단 기준
연구 과정에서 발생한 모든 이상 반응의 중증도는 NCI-CTCAE 5.0 버전에 따라 평가하였으며, 1 내지 5등급으로 나누었다.
1 등급: 경도; 무증상 또는 경미; 임상적 또는 진단적 소견만 있음; 치료가 필요하지 않음.
2 등급: 중등도; 비교적 작고, 국소적 또는 비침습적 치료가 필요함; 연령에 해당하는 도구적 일상생활 활동이 제한 받음.
3 등급: 심각하거나 의학적으로 중요한 의미가 있지만 즉시 생명을 위협하지는 않음; 입원 또는 장기 입원을 초래함; 장애, 일상 생활의 개인 활동이 제한됨.
4 등급: 생명을 위협함; 긴급 치료가 필요함.
5 등급: AE 관련 사망.
4. 재주입 전 전처리
TIL 세포 재주입 전에, 환자는 림프구 전처리 방안(히드록시클로로퀸 600 내지 800mgХ1일, 시클로포스파미드 20 내지 25mg/kg/dХ3일)을 수용하였고, 전처리 방안에 사용된 약물, 용량, 일수(투여 빈도)는, 연구자가 환자의 실제 상황에 따라 판단하여 조정할 수 있다.
재주입 당일을 0일로 정의하였다. TIL 세포 재주입 전에, 연구자는 환자에게 하기와 같은 화학 요법 전처리를 수행해야 한다(전처리 후 환자는 백혈구가 감소할 수 있으므로, 병실 내 사람들의 불필요한 유동 차단, 환자의 마스크 착용 등과 같이 감염 예방에 주의해야 함).
- 5일 시클로포스파미드(Cy) 20 내지 25mg/kg 정맥 주사 + 히드록시클로로퀸(HCQ) 600 내지 800mg 경구 투여
- 4일 시클로포스파미드 20 내지 25mg/kg 정맥 주사
- 3일 시클로포스파미드 20 내지 25mg/kg 정맥 주사
- 2일, - 1일 환자 휴식
0일 TIL 세포 재주입
5. TIL 세포 재주입 및 치료 효능 평가
전술한 4의 재주입 전에 전처리를 완료한 후 0일째에 환자에게 재주입하였으며, 각각의 환자에게 1회 재주입하였고, 1회 재주입 용량은 2Х1010 내지 5Х1010개 TIL 세포이며, 재주입된 세포 제제의 세포 밀도는 1.0Х108 내지 2.0Х108/mL이고, 재주입된 세포 제제의 부피는 200 내지 600mL이다. 환자에게 0일째에 TIL 세포를 재주입하였고, 재주입 후 어떠한 사이토카인도 투여하지 않았다. 재주입 후 환자는 병원에서 5 내지 8일 동안 관찰하였으며, 재주입 후 환자의 상태를 관측 및 기록하였다. 환자가 사전 동의하였음을 전제로 상이한 시점에 환자 말초 혈액을 채취하여 PBMC의 조성 및 변화를 검출하였으며, 재주입 1 내지 3개월 후 영상학적으로 효과를 평가하였다.
6. TIL 임상 재주입 결과
현재까지 총 16명의 피험자를 군에 편입시켰다. 하기 표 11은 임상 치료 효능 평가를 거친 환자 중 11명의 환자에 대한 기본 정보를 기재한 것이다(평가 기간은 재주입 후 1 내지 3개월 이내로 상이함).
16명의 피험자에서, 이상 반응에는 1 등급 오한 5건(31.3%), 1 등급 발열 7건(43.8%), 2 등급 발열 6건(37.5%)이 포함되었으며, 상기 증상은 모두 시간이 지나면서 사라졌다. 그 외에는 기타 이상 반응은 관찰되지 않았다.
T017 환자는 영상학적 평가를 거쳐 종양이 현저하게 축소된 것으로 나타났으며, 부분관해(PR)로 판정되었다. 해당 환자는 TIL 세포 재주입 전후 각각 말초 혈액을 채취하여, 일부 종양 마커의 수준을 검측하였으며, 비교 결과는 하기 표 12와 같다.
표 12의 결과에 따르면, T017 환자는 재주입 전에, 상기 몇 가지 종양 마커 중 정상 범위 내에 있던 알파 태아단백 및 CA199를 제외하고는, 나머지 각각의 항목이 모두 정상 범위를 훨씬 초과하였다. TIL 재주입 30일 후 해당 환자 말초 혈액에서 상기 종양 마커가 다시 검출되었으며, 기준을 초과한 여러 항목 중 인간 부고환 단백질 4가 정상 범위보다 약간 높은 것을 제외하고는, 나머지는 모두 정상 범위로 돌아왔거나 유지되었음을 발견할 수 있었다.
도 28은 T009 환자의 TIL 세포 재주입 후의 영상학적 평가 결과이다. 자기공명영상 결과에서, 재주입 전 종양 병변의 크기가 약 3cm인 것으로 나타났다. 재주입 전에 비해, 해당 환자는 TIL 재주입 6주 후 종양 병변이 현저하게 축소되었다(당시 부분관해(PR)로 판정됨). 재주입 10주 후, 종양은 영상학적으로 이미 검출될 수 없었고, RECIST 1.1 지침 표준에 따라 완전관해(CR)로 판정되었다.
환자는 재주입 전부터 재주입 후 120일까지의 시간 동안 복수의 상이한 시점에 모두 채혈 및 혈액 일반 검사를 수행하였다. T009 환자가 사전 동의했다는 전제 하에, 해당 환자의 TIL 재주입 당일 재주입 전(D0) 및 재주입 후 2일째, 7일째, 11일째, 13일째, 17일째, 24일째, 29일째, 31일째, 43일째, 49일째, 53일째 및 59일째(D2, D7, D11, D13, D17, D24, D29, D31, D43, D49, D53 및 D59)에 채취한 말초 혈액에 대해 Ficoll 밀도 구배 원심분리법을 통해 그로부터 PBMC를 분리 획득한 후, Trizol(Life Technologies)을 사용하여 세포를 용해시키고, 세포 용해액에 대해 RNA를 추출하여, TCR β 사슬 CDR3 영역의 RNA 시퀀싱을 수행하였으며(TCR-seq, Hangzhou ImmuQuad Biotechnologies사), 동시에 환자에게 임상적으로 재주입하는 데 사용되는 T009 TIL 제품 세포에 대해서도 TCR β 사슬 CDR3 영역의 TCR-seq를 수행하여, 상이한 시점의 말초 혈액 PBMC 및 재주입된 TIL 제품 세포의 TCR β 사슬 CDR3 라이브러리를 획득하였다. TCR-seq를 통해 획득한 D0, D2, D7, D11, D13, D17, D24, D29, D31, D43, D49, D53 및 D59의 TCR β 사슬 CDR3 라이브러리를 TIL 제품 세포의 TCR β 사슬 CDR3 라이브러리와 각각 비교한 후, 찾은 교집 부분 TCR이 바로 TIL 재주입 전후 상이한 시점(D2, D7, D11, D13, D17, D24, D29, D31, D43, D49, D53 및 D59)에서 환자 말초 혈액에 재주입된 TIL 세포의 클론형에 대응하는 TCR이다.
도 29는 환자의 재주입 전부터 재주입 후 120일에 가까운 시간 구간에서 말초 혈액 내 백혈구, 호중구 및 림프구 수의 변화 추세 그래프이다. 도 30은 도 29의 재주입 전부터 재주입 후 20일까지의 부분 확대도이다. 도 29 및 30에서 재주입 전 전처리 후부터 재주입 당일(D0)까지, 상기 3가지 세포의 절대적 계수가 모두 현저하게 감소하였음을 알 수 있다. D0에서 시작해, 백혈구, 호중구 양대 유형의 절대적 계수는 여전히 계속 감소하였고, 약 D10에서 백혈구와 호중구 모두 최저 수준으로 떨어졌으며, 이는 문헌 보고와 일치하였다(M E Gershwin, E J Goetzl, A D Steinberg Cyclophosphamide: use in practice Ann Intern Med. 1974 Apr; 80(4):531-40). 그러나 림프구 계수는 D0 이후부터 유의하게 증가하기 시작하였고, 이러한 증가 추세는 D0 이후 약 일주일 동안 현저하게 나타났으며, 백혈구, 호중구 양대 유형 세포의 절대적 계수의 감소 추세와 뚜렷한 대조를 이루었는데, 이는 TIL 세포 재주입 후, 림프구가 생체내에서 현저하게 증식되었음을 나타낸다.
도 31은 환자의 말초 혈액에 재주입된 TIL 세포의 TCR 클론형 빈도와 림프구 총 수의 시간 변화에 따른 중첩 추세이다. 도 31에서, 재주입 당일, TIL을 재주입한 TCR 클론형 빈도가 순간적으로 최고 피크에 도달한 후, 최저점으로 떨어졌다가, 이어서 다시 계속 상승함을 명확하게 관찰할 수 있으며, 이러한 상승 추세는 림프구 총 수의 증가 경향과 재주입 후 30일까지 모두 매우 일치하였는데, 이는 환자 말초 혈액에서 림프구 수가 재주입 후 유의하게 증가한 것이 재주입한 TIL의 TCR 클론형의 증식과 높은 상관관계가 있음을 나타낸다.
도 29, 30 및 31의 결과를 조합하면, 본 발명의 TIL 제품 세포가 환자가 저용량의 시클로포스파미드+히드록시클로로퀸으로 전처리된 후 재주입되면, 인체 내에서 능동적이고 효과적으로 증식할 수 있음을 설명할 수 있다.
비교예
중국특허출원 CN110785486A 명세서 142페이지 실시예 19에 기재된 방법의 과정 2A(즉, 본원의 자칭 Gen2 제조 방법)와 CN110785486A 명세서 177페이지 실시예 27에 개시된 pre-REP 배양 단계(즉, 본 출원의 시드 세포 배양 단계에 해당함)에 IL-2, IL-15 및 IL-21을 첨가하는 기술방안을 결합하여, 실시예 2 표 4의 T004, T009, T013 및 T014 조직 샘플로부터 TIL 제품 세포를 제조하였고, 채택된 제조 방법은 CN110785486A 명세서 실시예 19와 27 및 기타 모든 관련된 실시예에 기재된 방법이며, 방법이 유래된 CN110785486A는 본원에 전체로서 인용되었다. 참조된 TIL 제조 방법에 필요한 피더 세포는 건강한 인간 PBMC에서 유래하였다.
CN110785486A에 기재된 제조 방법(이하 "비교 방법"이라 칭함) 및 본 발명의 제조 방법(이하 "본 방법"이라 칭함)에 의해 제조된 최종 TIL 제품 세포에 대해 하기 지표 검측 및 비교를 각각 수행하였다:
1) 세포 계수 및 생존율:
2) 전체 세포에서 CD45+ 세포가 차지하는 비율;
3) CD45+ 세포에서 CD3+ 세포가 차지하는 비율;
4) CD3+ 세포에서 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포가 차지하는 비율;
5) CD3+ 세포에서 기억 T 세포가 차지하는 비율;
6) IFN-γ 분비 수준;
7) T 세포 고갈 수준;
8) CD3+ 세포에서 조절성 T 세포(Treg)가 차지하는 비율.
기억 T 세포 비율, 고갈 T 세포 및 활성 T 세포는 유세포 분석기를 통해 검측하였으며, 구체적으로, Tcm은 CD45RO+CCR7+ 세포 검출을 통해 확정하였고; Tem은 CD45RO+CCR7- 세포 검측을 통해 확정하였고; 고갈 T 세포는 Lag3+ 세포 검출을 통해 확정하였고; IFN-γ 분비 수준 검출은 본 출원 실시예 2에 기재된 방법과 동일하며; Treg는 CD4+CD25+Foxp3+ 세포 검출을 통해 확정하였다.
결과는 표 13에 표시된 바와 같다.
표 13의 결과에서, 비교 방법으로 배양하여 획득한 TIL 제품 세포는 세포 수, 생존율, CD45+ 세포 비율 및 CD3+/CD45+ 비율의 몇 가지 지표 측면에서 본 방법으로 배양한 TIL 제품 세포와 비교적 근접한 것으로 나타났다. 두 가지 방법으로 배양한 TIL 제품 세포 중의 CD3+ 세포에서 CD8+ 세포가 차지하는 비율이 근접하였으며, 비교 방법으로 배양한 TIL 세포에서 CD4+ 세포 비율이 상대적으로 더 높은 반면, 본 방법으로 배양한 TIL 세포에서 일부 세포는 CD4-CD8-CD3+ T 세포, 즉 이중 음성 T 세포였다. 두 가지 방법으로 배양한 TIL 세포의 기억 T 세포 표현형에서 Tcm이 전체 T 세포에서 차지하는 비율은 최고 모두 약 10%였으며, 두 TIL 세포의 IFN-γ 분비 수준도 상대적으로 근접하였다. 그러나 비교 방법으로 배양한 TIL 세포에 비해, 본 발명의 방법으로 4개 조직 샘플에서 배양한 TIL 제품 세포는 고갈 T 세포 및 Treg에서의 비율이 모두 현저하게 더 낮았으며, 이는 본 방법으로 배양한 TIL 세포가 생체내 및 생체외 활성화, 증식 및 사멸 성능 측면에서 더 큰 잠재적 이점을 가지고 있음을 보여준다.
상기에서 본 출원의 구현예를 상세히 설명하였으나, 본 출원은 상술한 구현예의 구체적인 내용으로 한정되지 않으며, 본 출원의 기술적 사상의 범위 내에서, 본 출원의 기술방안을 다양하게 간단히 변형할 수 있고, 이러한 간단현 변형은 모두 본 출원의 보호 범위에 속한다. 또한, 상기 구체적인 구현예에 설명된 각각의 구체적인 기술적 특징은, 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있으며, 불필요한 중복을 피하기 위해, 본 출원은 각종 가능한 조합 방식을 추가로 설명하지 않았음에 유의한다. 그 외, 본 출원의 각종 상이한 구현예도 서로 임의로 조합될 수 있으며, 이것이 본 출원의 사상에 반하지 않는 한, 마찬가지로 본 출원에 개시된 내용으로 간주되어야 한다.
Claims (12)
- TIL 세포 확장용 배양 조성물로서,
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15 및 면역 관문 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 바람직하게는 상기 면역 관문 항체는 PD-1 항체, CTLA-4 항체, LAG-3 항체, TIM-3 항체, TIGIT 항체 및 BTLA 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고,
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 IL-21, IL-12, GM-CSF 및 기억 T 세포 비율을 증가시키는 소분자 중 어느 하나, 둘, 셋 또는 넷을 더 포함하고,
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, OX40 항체, GITR 항체, ICOS 항체, CD206 항체 및 CD40 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하고,
바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, OX40 항체, GITR 항체, ICOS 항체, CD206 항체 및 CD40 항체는 활성화 항체이고,
바람직하게는, 상기 배양 조성물은 자가 혈소판 또는 동종 혈소판을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 하나 이상의 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 기질은 고체 기질이고, 상기 고체 기질은 마이크로스피어, 웰 플레이트, 접시, 세포 배양 플라스크 및 세포 배양 백 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 및/또는
상기 기억 T 세포 비율을 증가시키는 소분자는 TWS119이고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체 및 GM-CSF를 포함하고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR 항체를 포함하고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CD3 항체 및 CD28 항체를 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체 및 GM-CSF를 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체를 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, GITR 항체, CD3 항체, CD28 항체, TWS119 및 CD137 항체를 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, TIGIT 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GM-CSF를 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, LAG3 항체, IL-21, IL-12, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체 및 GITR을 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, TIGIT 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, CD40항체, OX-40 항체 및 자가 혈소판을 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체, CD137 항체 및 CD28 항체는 기질과 결합되고, 및/또는
상기 배양 조성물은 IL-2, IL-7, IL-15, PD-1 항체, CTLA-4 항체, CD3 항체, CD28 항체, CD137 항체, GITR 항체, GM-CSF, TWS119 및 동종 혈소판을 포함하고, 바람직하게는, 상기 CD3 항체와 CD28 항체는 기질과 결합되는 것을 특징으로 하는, 배양 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 및 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 및 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 3 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 1 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF 및 1 내지 500μM의 TWS119, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 500IU/mL의 IL-2, 5 내지 50ng/mL의 IL-7, 5 내지 50ng/mL의 IL-15, 1 내지 50μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 200 내지 1000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체 및 기질에 결합된 CD137 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체 및 1 내지 500μM의 TWS119, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체 및 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 LAG-3 항체, 5 내지 100ng/mL의 IL-21, 5 내지 100ng/mL의 IL-12, 0.5 내지 10μg/mL의 CD3 항체, 0.5 내지 10μg/mL의 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체 및 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나;
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 기질에 결합된 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 TIGIT 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD40 항체, 1 내지 100μg/mL의 OX-40 항체 및 1Х108 내지 5Х108/mL의 자가 혈소판, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하거나; 또는
상기 배양 조성물은 200 내지 6000IU/mL의 IL-2, 5 내지 100ng/mL의 IL-7, 5 내지 100ng/mL의 IL-15, 1 내지 100μg/mL의 PD-1 항체, 1 내지 100μg/mL의 CTLA-4 항체, 기질에 결합된 CD3 항체, 기질에 결합된 CD28 항체, 1 내지 100μg/mL의 CD137 항체, 1 내지 100μg/mL의 GITR 항체, 200 내지 5000U/mL의 GM-CSF 및 1Х108 내지 5Х108/mL의 동종 혈소판, 또는 이러한 성분들의 등비 농축물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양 조성물.
- TIL 세포 확장 배지로서,
혈청 및/또는 혈소판, 기초 배지, 및 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TIL 세포 확장용 배양 조성물을 포함하고,
바람직하게는, 상기 배양 조성물은,
상기 기초 배지는 AIM-V, X-VIVO, DMEM, RPMI1640, OpTmizerTM, FUJIFILM Irvin MHM-C로부터 선택되고;
상기 혈청은 인간 AB 혈청, 대상체 자가 혈청 또는 동물 유래 혈청으로부터 선택되고;
혈청의 농도는 1 내지 10%이고;
상기 혈소판은 동종 혈소판 또는 대상체 자가 혈소판이고;
상기 혈소판 농도는 0.5Х108-1.0Х109/mL이고;
IL-2의 농도는 200 내지 6000IU/mL이고;
IL-7의 농도는 5 내지 100ng/mL이고;
IL-15의 농도는 5 내지 100ng/mL이고;
PD-1 항체의 농도는 1 내지 100μg/mL이고;
IL-21의 농도는 5 내지 100ng/mL이고;
IL-12의 농도는 5 내지 100ng/mL이고;
CD3 항체의 농도는 0.5 내지 10μg/mL이고;
CD28 항체의 농도는 0.5 내지 10μg/mL이고;
CD137 항체의 농도는 1 내지 100μg/mL이고;
GITR 항체의 농도는 1 내지 100μg/mL이고;
GM-CSF의 농도는 200 내지 5000U/mL이고;
TWS119의 농도는 1 내지 500μM인 특징들로부터 선택되는 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는, TIL 세포 확장 배지.
- TIL 세포 함유 약물의 제조에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 배양 조성물 또는 제4항에 따른 배지의 용도(應用)로서,
바람직하게는, 상기 약물은 암 치료에 사용되고,
보다 바람직하게는, 상기 암은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종 중 하나 이상으로부터 선택되는, 용도. - TIL 세포 집단 확장 방법으로서,
제4항에 따른 배지를 사용하여 TIL 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고,
바람직하게는, 상기 배양은 적어도 5일 동안 지속 및/또는, 상기 배양은 최장 20일 동안 지속되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- TIL 세포 집단 제조 방법으로서,
(1) TIL 시드 세포 배지를 이용하여 종양 세포 함유 조직을 배양하여, 제1 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(2) 제4항에 따른 배지를 이용하여 제1 TIL 세포 집단을 배양하여, 제2 TIL 세포 집단을 획득하는 단계를 포함하고,
바람직하게는, 상기 방법은,
a) 상기 종양 조직은 전처리를 거치며, 바람직하게는, 상기 전처리는 종양 조직의 단편화 및/또는 해리를 포함하고,
b) 상기 종양 세포 함유 조직은 암 대상체의 종양 조직 또는 체액이고,
c) 상기 단계 (1)의 상기 TIL 시드 세포 배지는 1) IL-2, IL-6, IL-21, IFN-γ, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 2) IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, CD137 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 3) IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 4) IL-1β, IL-2, IL-7, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 5) IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, TIGIT 항체, CTLA-4 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 6) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 7) IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, G-CSF, M-CSF, CD28 항체, OX-40 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 8) IL-2, IL-7, IL-15, IFN-γ, CD137 항체, CD40 항체, OX-40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 9) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 10) IL-2, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 11) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, PD-1 항체, RRx-001, CAL-101, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 12) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, M-CSF, PD-1 항체, CNI-1493, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 13) IL-2, IL-7, IL-15, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, 다사티닙, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 14) IL-2, IL-6, IL-12, G-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, CTLA-4 항체, PD-1 항체, 다사티닙, LYC-55716, GENE-1858, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 15) IL-1α, IL-2, IL-9, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, TIGIT 항체, CNI-1493, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 16) IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, G-CSF, M-CSF, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, CNI-1493, 다사티닙, GNE-1858, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지 성분의 조합 중 어느 하나를 포함하고,
d) 단계 (1)의 배양은 적어도 5일 동안 지속되고,
e) 단계 (1)의 배양은 최장 20일 동안 지속되고,
f) 단계 (1)의 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이고,
g) 단계 (1)의 배양의 CO2 농도는 5%이고,
h) 상기 단계 (2)의 배양은 적어도 5일 동안 지속되고,
i) 단계 (2)의 배양은 최장 20일 동안 지속되고,
j) 단계 (2)의 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이고,
k) 단계 (2)의 배양의 CO2 농도는 5%이고,
l) 상기 종양 세포 함유 조직은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종 등의 암을 앓는 대상체의 종양 조직 또는 체액인 특징들로부터 선택되는 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는, TIL 세포 집단 제조 방법.
- TIL 세포 집단 제조 방법으로서,
(1) TIL 시드 세포 배지를 이용하여 종양 세포 함유 조직을 배양하여, 제1 TIL 세포 집단을 획득하는 단계,
(2) 상기 단계 (1)의 제1 TIL 세포 집단을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 배양 조성물에서 기질과 결합되는 항체 중 어느 하나 이상에 접촉시켜, 제2 TIL 세포 집단을 획득하는 단계, 및
(3) 상기 단계 (2)의 제2 TIL 세포 집단을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 배양 조성물에서 기질과 결합되는 항체를 제외한 성분들 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지로 옮겨 배양하여, 제3 TIL 세포 집단을 획득하는 단계를 포함하고,
바람직하게는, 상기 방법은,
a) 상기 종양 조직은 전처리를 거치며, 바람직하게는, 상기 전처리는 종양 조직의 단편화 및/또는 해리를 포함하고,
b) 상기 종양 세포 함유 조직은 암 대상체의 종양 조직 또는 체액이고,
c) 단계 (1)의 상기 TIL 시드 세포 배지는 1) IL-2, IL-6, IL-21, IFN-γ, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 2) IL-2, IL-4, IL-10, IL-21, CD137 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 3) IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 4) IL-1β, IL-2, IL-7, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, LAG3 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 5) IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, TIGIT 항체, CTLA-4 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 6) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 7) IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, G-CSF, M-CSF, CD28 항체, OX-40 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 8) IL-2, IL-7, IL-15, IFN-γ, CD137 항체, CD40 항체, OX-40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 9) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, CD137 항체, CD28 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 10) IL-2, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, TIGIT 항체, PD-1 항체, TNF-α, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 11) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, PD-1 항체, RRx-001, CAL-101, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 12) IL-2, IL-7, IL-15, GM-CSF, M-CSF, PD-1 항체, CNI-1493, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 13) IL-2, IL-7, IL-15, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, 다사티닙, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 14) IL-2, IL-6, IL-12, G-CSF, M-CSF, IFN-β, IFN-γ, CTLA-4 항체, PD-1 항체, 다사티닙, LYC-55716, GENE-1858, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 15) IL-1α, IL-2, IL-9, IL-15, GM-CSF, CD137 항체, CD28 항체, LAG3 항체, TIGIT 항체, CNI-1493, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지; 16) IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, G-CSF, M-CSF, IFN-γ, CD28 항체, CD40 항체, LAG3 항체, PD-1 항체, CNI-1493, 다사티닙, GNE-1858, 혈청, 이중 항체 및 기초 배지 성분의 조합 중 어느 하나를 포함하고,
d) 단계 (1)의 배양은 적어도 5일 동안 지속되고,
e) 단계 (1)의 배양은 최장 20일 동안 지속되고,
f) 단계 (1)의 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이고,
g) 단계 (1)의 배양의 CO2 농도는 5%이고,
h) 단계 (2)의 기질은 멀티웰 플레이트, 세포 배양 접시 또는 세포 배양 백이고,
i) 단계 (2)의 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합이고,
j) 단계 (2)의 기질과 결합되는 상기 항체에는 CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체 중 어느 하나 이상이 포함되고; 바람직하게는, CD3 항체 및 CD28 항체가 포함되고; 보다 바람직하게는, CD3 항체, CD28 항체 및 CD137 항체가 포함되고,
k) 단계 (2)의 상기 접촉은 단계 (1)의 제1 TIL 세포 집단을 기질에 결합된 항체와 함께 배양하는 것이고; 바람직하게는, 상기 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이고; 바람직하게는, 상기 배양의 CO2 농도는 5%이고,
l) 단계 (2)에서, 상기 배양은 전술한 배양 조성물에서 기질에 결합된 항체를 제외한 성분들 중 어느 하나 이상을 함유하는 배지에서 수행하고,
m) 단계 (2)의 제1 TIL 세포 집단의 밀도는 1.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL이고; 바람직하게는, 2.0Х105/mL 내지 1.0Х106/mL이고; 보다 바람직하게는 2.5Х105/mL 내지 3.5Х106/mL이고,
n) 단계 (2)의 접촉은 1 내지 3일 동안 지속되고; 바람직하게는, 2 내지 3일 동안 지속되고,
o) 단계 (3)의 배양은 적어도 5일 동안 지속되고,
p) 단계 (3)의 배양은 최장 20일 동안 지속되고,
q) 단계 (3)의 배양의 온도는 30 내지 42℃이고, 바람직하게는, 37℃이고,
r) 단계 (3)의 배양의 CO2 농도는 5%이고,
s) 상기 종양 세포 함유 조직은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종 등의 암을 앓는 대상체의 종양 조직 또는 체액인 특징들로부터 선택되는 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는, TIL 세포 집단 제조 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 획득한 TIL 세포 집단.
- 암 치료용 약물 제조에서 제9항에 따른 TIL 세포 집단의 용도(用途)로서,
바람직하게는, 상기 암은 위암, 갑상선 종양, 담낭암, 담관암, 폐암, 흑색종, 두경부암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 간암, 결장직장암, 뇌신경교종, 췌장암, 방광암, 전립선암, 신장암, 골육종 중 하나 이상으로부터 선택되는, 용도.
- 제9항에 따른 TIL 세포 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는, 약학 조성물.
- 세포 동결 보존 제제로서,
제9항에 다른 TIL 세포 집단 및 동결 보존액을 포함하고,
바람직하게는, 상기 동결 보존액은 세포 동결 보존액 또는 조직 동결 보존액이고,
바람직하게는, 상기 동결 보존액은 무혈청 동결 보존액인 것을 특징으로 하는, 세포 동결 보존 제제.
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