TW202336229A - 表現趨化因子受體及細胞接著分子之cd3陰性細胞之集團、及其用途及其製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種細胞毒殺活性更高之免疫細胞、及可期待較高效果之用於NK細胞療法之醫藥組合物。本發明提供一種包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團。本發明提供一種為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞進而為CD11c高表現性之細胞集團。本發明提供一種浸潤至固體腫瘤之為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞。又，本發明提供一種包含此種細胞集團及作為醫藥而容許之添加物之醫藥組合物。進而，本發明提供一種上述細胞集團之製造方法。
Description
本發明係關於一種表現趨化因子受體及細胞接著分子之CD(Cluster of Differentiation，分化簇)3陰性細胞之集團及其用途。
相關申請案之相互參照
本申請案係主張2018年3月27日申請之日本專利特願2018−059624號之優先權，其所有記載係特別以揭示之形式引用於此。
自然殺手細胞(NK細胞)係作為自然免疫之主要因素而發揮作用之細胞毒殺性之淋巴細胞，擔任對腫瘤細胞或病毒感染進行初期防禦機制。
藉由體外培養使採集自患者本身之NK細胞增殖、活化數百倍～數千倍並移回至患者之NK細胞療法作為副作用相對較少之治療方法受到關注。通常，對正常成人之末梢血進行一次血球分離術可回收約1×10
10個單核球，若將末梢血單核球中之NK細胞之構成比率設為約7%，則可獲得7×10
8個NK細胞。另一方面，若將患者之體重設為60 kg，則可謂需要6×10
6個～4.8×10
9個NK細胞。因此，正在推進將自供體獲得之NK細胞培養擴增而獲得足以使靶細胞死絕之NK細胞之技術的開發。例如，專利文獻1提出有一種NK細胞之擴增方法，其特徵在於包含如下步驟：製備包含NK細胞之細胞集團之步驟；自包含NK細胞之細胞集團去除T細胞之步驟；及利用包含2500 IU/mL至2813 IU/mL之IL(Interleukin，介白素)-2之培養基對去除後之殘餘細胞進行培養的步驟。
又，經活體外(ex vivo)培養之NK細胞雖於活體內(in vitro)對腫瘤細胞株表現出細胞毒殺性，但存在臨床上之治療效果不充分之情形。因此，正提出提高NK細胞之活性之培養技術。例如，專利文獻2提出有一種NK細胞之活體外培養方法，其係將包含NK細胞之細胞集團與至少1種增殖因子、以及有效濃度、有效暴露時間及有效暴露持續時間之菸鹼醯胺及/或其他菸鹼醯胺成分一併培養，而實現CD62L之經提昇之表現、經提昇之遊走應答、經提昇之導向及活體內保持、更大之增殖、經增大之細胞毒殺活性中之至少1種。
作為免疫細胞療法用免疫細胞，除NK細胞以外，正在研究以表現嵌合抗原受體之方式經遺傳性地修飾之T細胞(CAR-T)。該技術可藉由遺傳性地修飾對成為靶之腫瘤具有之抗原不具特異性之T細胞，而自末梢血大量製作針對成為靶之腫瘤具有之抗原獲得了特異性之效應T細胞。然而，CAR-T細胞療法存在對固體腫瘤無明顯之治療效果之情形，作為其中一個原因，可列舉CAR-T細胞未到達固體腫瘤(非專利文獻1)。關於CAR-T細胞向腫瘤之導向，報告有存在如下可能性：於基因修飾之期間，趨化因子受體缺失，向腫瘤細胞之趨化性下降(非專利文獻2)。另一方面，報告有如下情形：轉導CCR(C-C Motif Chemokine Receptor，趨化因子C-C-基元受體)2b而表現功能性趨化因子受體之CAR-T細胞係向腫瘤之移動增加，抗腫瘤活性提昇(非專利文獻3)。
非專利文獻4係調查最熟知之來自人類末梢血之CD56陽性之NK細胞的趨化因子受體之表現。於該研究中，報告有CD56
低NK細胞主要為CXCR(C-X-C Motif Chemokine Receptor，趨化因子C-X-C-基元受體)1/CXCR2
+及CXCR3/CCR5
-/+，幾乎所有CD56
高NK細胞為CXCR1/CXCR2
-及CXCR3/CCR5
+。又，亦報告有CD56
低及CD56
高NK細胞兩者為CCR4
-及CCR6
-(非專利文獻4)。
[專利文獻1]日本專利特開2013-27385號公報(日本專利第5572863號)
[專利文獻2]日本專利特表2013-515497號公報
[非專利文獻1] Melero I. et al., Cancer Discovery 2014;4:522-526.
[非專利文獻2] Jena B. et al., Blood, 2018;116:1035-1044.
[非專利文獻3] Moon E. et al., Clin Cancer Res, 2011;17(14):4719-4730.
[非專利文獻4] Lima M. et al., Journal of Immunology Research, Volume 2015, Article ID 839684, 18 pages
專利文獻1～2及非專利文獻1～4之所有記載係特別以揭示之形式引用於此。
[發明所欲解決之問題]
CAR-T細胞存在藉由基因操作而除抗原特異性以外獲得趨化性等所期望之功能之可能性，但被用作基因治療用製品，於確保品質及安全性之方面定製有嚴格之準則，有開發耗費成本及時間之問題。
又，即便確認到NK細胞於活體內對腫瘤細胞株表現出細胞毒殺活性，亦存在活體內之抗腫瘤活性不充分之問題。認為其原因在於：NK細胞對腫瘤之趨化性較弱，且不浸潤至固體腫瘤。
迄今為止，提出有提高NK細胞之培養效率之技術、及提高NK細胞之活性之培養技術，但藉由該等技術製造之NK細胞仍非足以用於臨床者。本發明之課題在於使用培養技術而提供具有更高抗腫瘤活性之免疫細胞。
[解決問題之技術手段]
根據本發明，提供以下之發明。
[1]一種細胞集團，其包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞。
[2]如[1]之細胞集團，其中上述為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞進而為CD11a高表現性及CD11c高表現性，高表現性係藉由與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞的集團之表現進行比較而判斷。
[3]如[1]或[2]之細胞集團，其中上述為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞進而為整合素(Integrin)α1陽性、整合素α3陽性及整合素β3陰性。
[4]如[1]至[3]中任一項之細胞集團，其中於上述細胞集團中，為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率為30%以上。
[5]如[1]至[4]中任一項之細胞集團，其中選自由CD3及CD19所組成之群中之任一者為陽性之細胞的比率未達5%。
[6]如[1]至[5]中任一項之細胞集團，其中於上述細胞集團中，選自由CD4、CD8、CD14、CD19及CD36所組成之群中之任一者為陽性之細胞經去除。
[7]如[1]至[6]中任一項之細胞集團，其用於向固體腫瘤浸潤。
[8]一種為CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性、整合素α1陽性、整合素α3陽性及整合素β3陰性且為CD3陰性之細胞，其浸潤至固體腫瘤。
[9]一種醫藥組合物，其包含如[1]至[7]中任一項之細胞集團、及作為醫藥而容許之添加物。
[10]一種細胞集團之製造方法，其係如[1]至[7]中定義之細胞集團之製造方法，其包含如下步驟：
製備初代單核球細胞集團之步驟；
自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞之步驟；
自初代單核球細胞集團去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之步驟；及
利用包含IL-2之培養基對CD3陽性細胞、及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者經去除的殘餘細胞集團進行培養之步驟。
以下記載之本發明之說明存在基於代表性之實施形態或具體例而完成的情形，但本發明並不限定於此種實施形態。再者，於本說明書中，使用「～」表示之數值範圍係指包含於「～」之前後記載之數值作為下限值及上限值之範圍。
[為CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性及CD3陰性之細胞之集團]
本發明提供一種包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團。存在將為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞表示為「CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞」，或簡單地表示為「CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-」之情形。關於記載表面抗原標記物所使用之「/」係指「及、且」，例如「CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-」係指「為CCR5
+，為CCR6
+，為CXCR3
+且為CD3
-」。
(趨化因子受體)
CCR5、CCR6及CXCR3為趨化因子受體。趨化因子及趨化因子受體係與因炎症或免疫應答引起之細胞遊走、造血幹細胞向骨髓之導向等相關。趨化因子係為了使白血球、淋巴細胞、NK細胞、T細胞等遊走至組織而所需之物質，趨化因子受體係於細胞之表面接受趨化因子，向細胞內傳遞各種訊號。
報告有CCR5及CCR6係單核細胞、巨噬細胞及樹狀細胞等所具有，且CXCR3係T細胞及NK細胞等所具有(Nagarsheth N, et al. Nat Rev Immunol. 2017)。關於CCR5，報告有於毒殺性T細胞向固體腫瘤之導向方面較為重要(Gonzaelez-Martin A, et al. Oncoimmunology. 2012)。關於CCR6，報告有將CCR6與CD103一併誘導至腫瘤內係於在腫瘤部位保持T細胞之方面發揮作用(Franciszkiewicz K, et al. Cancer Res. 2012)。
如下所述，CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團具有對腫瘤細胞株之毒殺活性較高之特徵。該特徵係於既知之NK細胞中亦觀察到之特徵。然而，迄今為止未報告CCR6陽性之NK細胞。例如，非專利文獻4報告有CD56陽性NK細胞為CCR6陰性。因此，藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團係至少可於為CCR6陽性之方面，與既知的NK細胞之集團進行區分。存在將本發明之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團特別稱為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-類NK細胞之集團，或簡稱為類NK細胞之集團之情形。此處，既知之NK細胞係不表現T細胞受體(TCR)、作為T細胞普通標記物之CD3，進而不表現作為膜免疫球蛋白之B細胞受體之大型顆粒性淋巴細胞，雖於一部分中存在CD16陰性集團，但通常於人類中為CD16陽性且為CD56陽性。只要為業者，則可基於細胞表面標記物之表現模式等而容易地判斷是否為NK細胞。
關於表面標記物，存在為陽性時以+表示，為陰性時以-表示之情形。例如，存在CCR5陽性表示為CCR5
+，CCR5陰性表示為CCR5
-之情形。陽性包含為高表現性(
高)之情形及為低表現性(
低)之情形。陽性、陰性、高表現性、低表現性可基於藉由流式細胞法獲得之曲線圖而判斷。於曲線圖出現之位置存在根據機器之電壓設定、感度設定、使用抗體選殖、染色條件、使用色素等而發生變動之情形，但只要為業者，則可於所獲得之曲線圖中以不將被認定為一群之細胞集團分開之方式適當地劃線。
於判斷目標標記物之表現為陽性還是陰性時，可將使用同型對照(Isotype control)抗體之情形用作陰性對照進行判斷。同型對照抗體係不與特定之抗原進行反應之抗體。通常，於使用抗體之實驗中，存在因與靶以外之蛋白質之非特異性結合、或與細胞表面上之Fc(Fragment crystallizable，可結晶片斷)受體之結合而產生背景之可能性。藉由與使用成為陰性對照之抗體之體系進行比較，一次抗體對目標抗原之反應為特異性之情況變明確。又，可排除背景之影響，準確地解釋訊號之強度。
於本說明書中，所謂「細胞集團」係指包含複數個細胞、例如1×10
5cells以上之細胞之一群。藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團可製備成各種細胞密度。例如，可製備成1×10
5cells/mL以上。
包含於CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的細胞之個數較佳為1×10
6cells以上，更佳為5×10
6cells以上，進而較佳為1×10
7cells以上。又，包含於CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的細胞之數量可設為適於投予至人類之1×10
6cells～1×10
10cells。又，CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團之細胞密度為1×10
5cells/mL以上，較佳為2×10
5cells/mL以上，更佳為5×10
5cells/mL以上。為了對人類進行點滴，可設為5×10
5cells/mL左右。細胞密度之上限值例如可設為1×10
10cells/mL以下。CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團之細胞密度之範圍並無特別限定，可設為1×10
5～1×10
10cells/mL、2×10
5～1×10
10cells/mL、3×10
5～1×10
10cells/mL、4×10
5～1×10
10cells/mL、5×10
5～1×10
10cells/mL、6×10
5～1×10
10cells/mL、7×10
5～1×10
10cells/mL、8×10
5～1×10
10cells/mL、9×10
5～1×10
10cells/mL、1×10
6～1×10
10cells/mL、1×10
7～1×10
10cells/mL、1×10
8～1×10
10cells/mL、1×10
5～1×10
9cells/mL、2×10
5～1×10
9cells/mL、3×10
5～1×10
9cells/mL、4×10
5～1×10
9cells/mL、5×10
5～1×10
9cells/mL、6×10
5～1×10
9cells/mL、7×10
5～1×10
9cells/mL、8×10
5～1×10
9cells/mL、9×10
5～1×10
9cells/mL、1×10
6～1×10
8cells/mL、1×10
6～1×10
9cells/mL、或1×10
7～1×10
9cells/mL。又，CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團之細胞密度可設為適於培養或冷凍保存之1×10
6～1×10
8cells/mL，又，可設為適於投予至人類之1×10
5～1×10
9cells/mL。
於藉由本發明所提供之上述細胞集團中，為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率(比率(%)＝CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之個數/全部細胞之個數×100)可為30%以上。認為於上述細胞集團中，為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率越高則治療效果越高，故而比率較佳為30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、或50%以上。又，於上述細胞集團中，CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率亦可更高，亦可為55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上。
目標標記物之表現程度(低表現性還是高表現性)可藉由與於相同條件下測定之對照細胞之集團的結果進行比較而判斷。對照細胞之集團之例為如本說明書之實施例中所記載的初級NK之、自末梢血獲得之未進行實質性培養的NK細胞之集團。
經培養固定時間之細胞之集團中之CCR6的表現程度係可使用流式細胞法，將該細胞集團中之CCR6表現量與自末梢血獲得之未進行實質性培養的NK細胞之集團(對照，已知為CCR6陰性)中之CCR6表現量進行比較而判斷。於經培養固定時間之細胞之集團中之CCR6的表現呈雙峰性，且雙峰之表現量均高於對照之情形時，可判斷為具有低表現性及高表現性。
包含於藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的細胞可為CCR6高表現性、或為CCR6低表現性。又，藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團亦可包含為CCR6高表現性之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞的集團、及為CCR6低表現性之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團兩者。包含兩者之細胞集團係若藉由流式細胞法對CCR6進行解析，則呈雙峰性。
又，包含於藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的細胞可為CCR5陽性及CXCR3陽性。此外，亦可存在為CCR5高表現性及CXCR3高表現性之情形。為高表現性之情況係可藉由與巨噬細胞或MDSC(Myeloid Derived Suppressor Cells，髓源抑制性細胞)等骨髓球系細胞中之CCR5及CXCR3之表現進行比較而判斷。
包含於藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的細胞中，選自由CXCR1及CXCR2所組成之群中之任一者可為陰性。包含於藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的細胞中，選自由CCR2、CCR4及CXCR4所組成之群中之任一者可為陰性、或者為極低表現性。
藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係可藉由下文將述的類NK細胞之集團之製造方法獲得。下文將述之類NK細胞之集團之製造方法包含自初代單核球細胞的集團去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之步驟，但存在無需去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之情形。
包含於藉由本發明所提供之細胞集團的細胞可來自天然。於本發明中，所謂來自天然之細胞，表示非基因重組細胞、並非來自外來基因導入動物或者轉形細胞之細胞、或並非藉由細胞融合技術製作之細胞，但並非意指天然存在之細胞其本身，而係指藉由培養技術製造之細胞。於本發明中，所謂非基因重組細胞，係指並非利用自使用基因修飾技術人為地改變個體之遺傳資訊之動物之血液分離的單核球而製造之細胞。又，亦並非使用基因修飾技術對自血液分離之單核球或造血幹細胞人為地修飾遺傳資訊而製造之細胞之集團。所謂並非來自外來基因導入動物或轉形細胞之細胞，於本發明中係指不經由將外來基因導入至生物或細胞之步驟而製作之細胞。所謂並非藉由細胞融合技術製作之細胞，係指並非藉由細胞融合而產生之細胞，亦並非來自該細胞之細胞，例如係指未進行藉由細胞融合等實現的細胞表面抗原之表現之調節。
(細胞接著分子)
藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞可為CD11c高表現性(CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高)。CD11c係亦作為整合素αX而熟知之細胞接著分子。已知CD11c表現於單核細胞、巨噬細胞、顆粒細胞、骨髓系樹狀細胞。已知CD11c與CD18結合而參與細胞接著等。
經培養固定時間之細胞之集團中之CD11c的表現程度係可使用流式細胞法，將該細胞集團中之CD11c表現量與自末梢血獲得之未進行實質性培養的NK細胞之集團(對照，已知為CD11c低表現性)中之CD11c表現量進行比較而判斷。於經培養固定時間之細胞之集團中之CD11c的表現高於對照之表現量之情形時，可判斷為具有高表現性。
藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞可為CD11a/CD18高表現性(CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11a
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD18
高)。已知CD11a/CD18另稱為LFA(Lymphocyte Function Associated Antigen，淋巴細胞功能相關抗原)-1，分佈於T淋巴細胞，與ICAM(Intercellular Adhesion Molecule，細胞間黏附分子)-1或ICAM-4相互作用而參與白血球之接著或趨化性，誘發免疫耐受性。
經培養固定時間之細胞之集團中之CD11a/CD18的表現程度係可使用流式細胞法，將該細胞集團中之CD11a/CD18表現量與自末梢血獲得之未進行實質性培養的NK細胞之集團(對照，已知為CD11a/CD18低表現性)中之CD11a/CD18表現量進行比較而判斷。於經培養固定時間之細胞之集團中之CD11a/CD18的表現高於對照之表現量之情形時，可判斷為具有高表現性。
藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞進而可為選自由整合素α1、整合素α3、整合素α4、整合素α5、ICAM-1、及整合素β1所組成之群中之任一者為高表現性。藉由與自末梢血獲得之未進行實質性培養的NK細胞之集團(對照，已知整合素α1、整合素α3、整合素α4、整合素α5、ICAM-1、整合素β1為陰性或低表現性)進行比較，可判斷為具有高表現性。
已知整合素α4/整合素β1另稱為VLA(Very Late Activation Antigen，極晚期活化抗原)-4，與纖維黏連蛋白、VCAM(Vascular Cell Adhesion Molecule，血管細胞黏附分子)-1等相互作用而參與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性球向炎症部位之遊走。已知整合素α1/整合素β1另稱為VLA-1，分佈於廣泛之細胞，與膠原蛋白、層黏連蛋白相互作用而參與神經突起伸長或淋巴細胞浸潤。已知整合素α3/整合素β1另稱為VLA-3，分佈於廣泛之細胞，與層黏連蛋白-5、TSP(Thrombospondin，凝血栓蛋白)、uPAR(urokinase-type Plasminogen Activator Receptor，尿激酶纖溶酶原激活物受體)相互作用而參與腎臟或肺之形態形成、癌之浸潤或轉移。
藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞進而可為整合素α1陽性、整合素α3陽性及整合素β3陰性。如下文將述之實施例1之圖1C及D中所記載，培養前之NK細胞(初級NK)係整合素α1、-α3及-β3均為陰性。另一方面，已知培養2週後之NK細胞係整合素α1、-α3及-β3均為陽性(Maenpaa et al., Int. J. Cancer: 53, 850-855, 1993, Tables II, III, Figure 2)。藉由本發明所提供之細胞集團中之為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞與先前之NK細胞之培養物相比，至少於為整合素α1陽性、整合素α3陽性及整合素β3陰性之方面不同。
藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞可為整合素α4/整合素β1高表現性。藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞可為整合素α1/整合素β1高表現性。藉由本發明所提供之包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之細胞集團係該CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞可為整合素α3/整合素β1高表現性。
藉由本發明所提供之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高/整合素α1
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高/整合素α1
高/整合素α3
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高/ICAM-1
高、或者CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
高/CD11a
高/CD18
高/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高/ICAM-1
高/整合素β1
高、或CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高/ICAM-1
高、或者CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高/ICAM-1
高/整合素β1
高細胞之集團。
包含於藉由本發明所提供之類NK細胞之集團的上述特定之類NK細胞係選自由CD16及CD56所組成之群中之任一者或兩者可為陽性。例如，包含於藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團的CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞係選自由CD16及CD56所組成的群中之任一者或兩者可為陽性。包含於藉由本發明所提供之類NK細胞之集團的上述特定之類NK細胞係選自由CXCR1及CXCR4所組成之群中之任一者或兩者可為陰性。
藉由本發明所提供之類NK細胞之集團係選自由CD3及CD19所組成之群中的任一者為陽性之細胞之比率可未達10%。於細胞集團中，該等細胞之比率可藉由流式細胞法而分析。細胞集團中之選自由CD3及CD19所組成之群中之任一者為陽性的細胞之比率較佳為未達5%，更佳為未達2%。其原因在於：認為細胞集團中之為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率更高之情況下，腫瘤細胞毒殺活性較高。
(趨化性及浸潤)
藉由本發明所提供之類NK細胞之集團可具有向腫瘤部位之經提昇之趨化性。又，藉由本發明所提供之類NK細胞之集團可浸潤至腫瘤塊。所謂向腫瘤塊之浸潤，係指細胞(例如，免疫細胞)滲入至腫瘤塊之內部之狀態。
向腫瘤部位之趨化性可藉由細胞遊走分析進行評估。細胞游走分析可於腫瘤細胞之存在下，藉由Transwell法等實施。
與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞的集團相比，藉由本發明所提供之類NK細胞之集團可具有向腫瘤部位之經提昇之趨化性。根據本發明者等人之研究，認為與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞之集團相比，於藉由本發明所提供之類NK細胞之集團中，趨化因子受體CCR5、CXCR3及CCR6之表現較高係與向腫瘤部位之經提昇之趨化性有關。
向腫瘤塊之浸潤可藉由針對自腫瘤細胞株製作之球狀細胞團塊之細胞毒殺分析而評估。球狀細胞團塊係經三維細胞培養所得之細胞凝集塊，細胞間之相互作用、及細胞外基質發達。又，有於外緣部存在緊密結合之情形，認為藉由內部成為低氧狀態且低pH值，而代謝或功能活性更接近活體內之組織。腫瘤球狀細胞團塊係作為用於藥物開發之下一代之活體內實驗模型而受到期待(Hirschhaeuser F. et al., J Biotechnol. 2010 Jul 1;148(1):3-15; Xiang X. et al., 2011 PLoS ONE 6(1): e14640. doi:10.1371/journal. pone. 0014640; Milotti E, Chignola R., 2010 PLoS ONE 5(11):e13942. doi:10.1371/journal. pone. 0013942)。例如，可對藉由本發明所提供之類NK細胞進行螢光標記，觀察向球狀細胞團塊內部之移動。自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞不浸潤至球狀細胞團塊，但藉由本發明所提供之類NK細胞可浸潤至球狀細胞團塊。認為對於向固體腫瘤之浸潤而言，細胞接著分子LFA-1/VLA-4有所重要(Sackstein R, et al. Lab Invest. 2017)。根據本發明者等人之研究，認為與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞之集團相比，於藉由本發明所提供之類NK細胞之集團中，細胞接著分子之表現較高係與向球狀細胞團塊之浸潤有關。
於使用由IMR32細胞株(人類MYCN擴增神經胚細胞瘤細胞株)形成之球狀細胞團塊作為固體腫瘤塊之細胞毒殺分析中，自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞存在於球狀細胞團塊的周邊，但未浸潤。又，抗GD2抗體(Unituxin(註冊商標))可單獨毒殺IMR32細胞株(Doronin et al., BMC Cancer 2014, 14:295)，但對於形成有球狀細胞團塊之IMR32，於顯微鏡下未觀察到如毒殺細胞之形態變化。另一方面，藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團係浸潤至球狀細胞團塊，於開始分析12小時以後，球狀細胞團塊開始崩解。
此外，與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞相比，藉由本發明所提供之類NK細胞之集團係對球狀細胞團塊之細胞毒殺活性非常高。又，對球狀細胞團塊之細胞毒殺活性於併用藉由本發明所提供之類NK細胞之集團及抗體的體系、與未併用抗體之體系之兩個體系中，並無顯著差。
如上所述，藉由本發明所提供之類NK細胞之集團可發揮較高之細胞毒殺活性。所謂細胞毒殺活性，除特別記載之情形以外，係指對象細胞(效應細胞、E)對靶細胞(T)之溶解能力。細胞毒殺活性能以因效應細胞而致死之靶細胞之百分率(%)表示，根據下式而求出。
(與效應細胞共培養之情形時之細胞死亡－自然細胞死亡(陰性對照))/(最大細胞死亡(陽性對照)－自然細胞死亡(陰性對照))×100
於以藉由本發明所提供之類NK細胞作為效應細胞而測定對固體腫瘤塊之細胞毒殺活性之情形時，靶細胞除了IMR32細胞株之球狀細胞團塊以外，可使用自神經膠質瘤、乳癌、大腸癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤細胞株製作之球狀細胞團塊等，但並不限定於該等。可使用之球狀細胞團塊之大小可為直徑150～500 μm左右，但並不限定於此。效應細胞與靶細胞、活細胞與死細胞可藉由以放射性物質、螢光色素等標記之抗體等試劑進行區分，又，進行定量。以類NK細胞作為效應細胞時之細胞毒殺活性例如可將IMR32細胞株之球狀細胞團塊作為靶，於培養時間為8至48小時、較佳為12～24小時之條件下進行測定。
本發明提供一種浸潤至固體腫瘤之為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞。認為先前之NK細胞對固體腫瘤無效，但藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞之集團係可浸潤至固體腫瘤而毒殺腫瘤細胞。向固體腫瘤之浸潤可藉由如下方式判斷：觀察到CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞移動至腫瘤塊(球狀細胞團塊)之內部，進而腫瘤塊之形狀經時性地變化，腫瘤塊崩解。毒殺腫瘤細胞係可藉由利用流式細胞法測得之死細胞之數量增加而確認。
(對活體內之固體腫瘤之治療效果)
藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-類NK細胞之集團可具有對活體內之固體腫瘤的治療效果。
對活體內之固體腫瘤之治療效果可藉由將人類腫瘤細胞移植至免疫缺乏小鼠等動物並對過程進行觀察來評估。關於預防效果，亦可與移植同時進行類NK細胞之集團投予而進行評估。或者，關於治療效果，亦可於確認腫瘤之成長5天左右後進行類NK細胞之集團投予而進行評估。評估可藉由解剖安樂死之小鼠，觀察經螢光標記之腫瘤細胞而實施。
活體內之治療計劃存在對動物投予單次或複數次之情形。與利用獨立之單次投予、或利用連續注入無關，類NK細胞之集團之初始候補用量係每1 kg為1×10
5cells～1×10
8cells。可與類NK細胞之集團一併而投予IL-2。IL-2可為了於動物內維持所投予之類NK細胞之活性而投予。IL-2之初始候補用量係每1隻為1,000～10,000 IU。活體內之治療計劃中，可根據任意適當之方法而採用肌內、靜脈內、動脈內、腹腔內、或皮下投予。治療效果之評估可藉由觀察經螢光標記之腫瘤細胞，及/或算出螢光陽性區域之像素數而進行。
與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞之集團相比，藉由本發明所提供之類NK細胞之集團係可減少移植至免疫缺乏小鼠之SKOV3細胞(人類卵巢癌細胞株)之數量。藉由本發明所提供之類NK細胞之集團係可大致殺滅移植至免疫缺乏小鼠之SKOV3細胞(人類卵巢癌細胞株)。關於移植至免疫缺乏小鼠之SKOV3細胞，於未進行治療之情形時確認到形成腫瘤結節，但於利用藉由本發明所提供之類NK細胞之集團進行治療之小鼠中，SKOV3細胞大致殺滅，未觀察到腫瘤結節。根據於活體內表現出之向腫瘤塊之浸潤能力、及活體內之治療效果的結果，可謂藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-類NK細胞之集團可浸潤至固體腫瘤而毒殺腫瘤細胞。
[類NK細胞之集團之製造方法]
本發明提供一種為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之集團之製造方法，其包含如下步驟：製備初代單核球細胞集團之步驟；自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞之步驟；自初代單核球細胞集團去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之步驟；及利用包含IL-2之培養基，對該CD3陽性細胞、以及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者經去除之殘餘細胞集團進行培養的步驟。
(初代單核球細胞集團)
於本發明之製造方法中，初代單核球細胞集團可藉由自採集自受驗者之血球細胞分離單核球之步驟而獲得。血球細胞存在自選自由末梢血、臍帶血、骨髓及淋巴結所組成之群中之任一者採集之情形。血球細胞存在藉由血球分離法自末梢血採集之情形。培養前之初代單核球細胞集團可為不包含CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞者。
於本發明之製造方法中，初代單核球細胞集團存在自選自由如下細胞所組成之群中之至少1種細胞製備的情形：來自選自由胚性幹細胞、成體幹細胞及誘導性多潛能幹(iPS)細胞所組成之群組中之任一幹細胞之造血幹細胞，來自臍帶血之造血幹細胞，來自末梢血之造血幹細胞，來自骨髓血之造血幹細胞，臍帶血單核球，及末梢血單核球。作為初代單核球細胞集團之供體之受驗者存在來自作為接受者之患者本身、該患者之近親、或與患者無血緣關係者之情形。受驗者存在為正常健康人、患有疾病之患者之情形。藉由本發明所提供之類NK細胞存在來自接受者之主要組織相容性抗原(MHC)、與殺傷性免疫球蛋白樣受體(Killer Immunoglobulin-like Receptor：KIR)不一致之供體之情形。
(CD3陽性之去除、以及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之去除)
於本發明之製造方法中，存在可藉由自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞之步驟，而去除T細胞及/或NKT細胞之情形。T細胞之去除存在藉由除了CD3陽性細胞以外將選自CD4陽性細胞及CD8陽性細胞中之1種或2種去除之步驟而達成的情形。又，於本發明之製造方法中，關於自初代單核球細胞集團去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之步驟，單核細胞之去除存在藉由將選自CD14陽性細胞、CD36陽性細胞、及HLA(Human Leukocyte Antigen，人類白血球抗原)-DR陽性細胞中之1種、2種或3種細胞去除之步驟而達成的情形。B細胞之去除存在藉由將選自CD19陽性細胞及CD20陽性細胞中之1種或2種細胞去除之步驟而達成的情形。
於本發明之製造方法中，CD3陽性細胞之去除、與選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者的去除可同時進行，亦可藉由各別之步驟進行。單核細胞之去除與B細胞之去除可同時進行，亦可藉由各別之步驟進行。
本發明之類NK細胞之製造方法存在包含自初代單核球細胞集團去除選自由樹狀細胞、顆粒細胞及巨噬細胞所組成之群中的任一者之步驟之情形。選自由樹狀細胞、顆粒細胞及巨噬細胞所組成之群中之任一者之去除存在藉由將選自CD66b陽性細胞、CD123陽性細胞、及HLA-DR陽性細胞中的1種、2種或3種細胞去除之步驟而實施的情形。
本發明之類NK細胞之製造方法存在包含自初代單核球細胞集團去除造血前驅細胞之步驟的情形。去除造血前驅細胞之步驟存在藉由將CD34陽性細胞去除之步驟而達成的情形。
本發明之類NK細胞之製造方法存在包含自初代單核球細胞集團去除紅血球及紅血球胚細胞系前驅細胞之步驟的情形。去除紅血球及紅血球胚細胞系前驅細胞之步驟存在藉由將血型糖蛋白(glycophorin)A陽性細胞去除之步驟而達成的情形。
初代單核球細胞集團可使用業者熟知之各種順序製備。例如，於自如臍帶血及末梢血之血液回收單核球時，可使用比重離心法。進而，初代單核球細胞集團、及自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞以及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者而成之殘餘細胞集團可利用對細胞表面標記物之特異性抗體進行免疫螢光染色，使用細胞分選儀或流式細胞儀單離、鑑定。又，自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞、以及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者而成之殘餘細胞集團亦可使用包含由Invitrogen公司售賣的Dynal公司製造之Dynabeads(商標)、或Miltenyi Biotec公司之CliniMACS(商標)但不限定於該等之免疫磁珠，將表現特定的細胞表面抗原之細胞分離去除而製備。
又，存在利用T細胞、NKT細胞、單核細胞、B細胞、樹狀細胞、顆粒細胞、巨噬細胞、紅血球、紅血球胚細胞系前驅細胞或造血前驅細胞之特異性結合配偶體，選擇性地毒殺或殺滅T細胞、NKT細胞、單核細胞、B細胞、樹狀細胞、顆粒細胞、巨噬細胞、紅血球、紅血球胚細胞系前驅細胞或造血前驅細胞之情形。
再者，自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞之步驟、及自初代單核球細胞集團去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者的步驟亦可為一併去除CD3陽性細胞、單核細胞及B細胞之步驟。去除CD3陽性細胞、單核細胞及B細胞之步驟亦可為將其他細胞類型、例如選自由紅血球、紅血球胚細胞系前驅細胞、造血前驅細胞、樹狀細胞、顆粒細胞、巨噬細胞及NKT細胞所組成之群中之任一者，與CD3陽性細胞、單核細胞及B細胞一併去除的步驟。
(培養基)
為了培養自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞、以及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者而成之殘餘細胞集團而使用的細胞培養用培養基包含KBM501培養基(Kohjinbio股份有限公司，包含1,750 JRU/ml之IL-2，人類NK細胞初次培養(Primary Culture)用)、CellGro SCGM培養基(CellGenix，岩井化學藥品股份有限公司)、X-VIVO15培養基(龍沙，塔卡拉生物股份有限公司)、COSMEDIUM 008(Cosmo Bio，包含1,750 JRU/ml之IL-2，人類NK細胞初次培養用)、CTS AIM V Medium Gibco
TMCTS
TMAIM V
TMMedium(Thermo Fisher Scientific，用以增殖、操作T細胞及樹狀細胞之既知組成之無血清培養基)、CTS OpTmizer T Cell Expansion Basal Medium(Thermo Fisher Scientific，人類T淋巴細胞之成長及增殖用)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，伊思柯夫改良杜爾貝科培養基)、MEM(Minimum Essential Medium，最低必需培養基)、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，杜爾貝科改良伊格爾培養基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute，洛斯維帕克紀念研究所)-1640等，但並不限定於該等。
存在於培養基中以可達成本發明之目的之濃度添加介白素-2(IL-2)之情形。IL-2之濃度存在為100 IU/mL～5000 IU/mL之情形。IL-2之濃度亦可存在為2500 IU/mL～2813 IU/mL之情形。IL-2較佳為具有人類之胺基酸序列，為安全起見，較佳為利用重組DNA(Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸)技術生產。IL-2之濃度存在以日本標準單位(JRU)及國際單位(IU)表示之情形。1 IU為約0.622 JRU。
存在於培養基中添加受驗者之自體血清、可自BioWhittaker公司及其他公司購得之人類AB型血清、或可自日本紅十字公司購得之獻血人類血清白蛋白之情形。自體血清及人類AB型血清較佳為以1～10%之濃度添加，獻血人類血清白蛋白較佳為以1～10%之濃度添加。包含於培養基之血清可為人類血清或非人類動物血清，較佳為人類血清白蛋白。可使用可自Corefront公司及其他公司購得之血小板提取物(UltraGro
TM等)來代替血清。血小板提取物較佳為以1～10%之濃度添加。
存在於培養基中以不損及類NK細胞之集團之擴增效果為條件而包含適當之蛋白質、細胞激素、抗體、化合物及其他成分之情形。細胞激素存在選自由介白素3(IL-3)、介白素7(IL-7)、介白素12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-21(IL-21)、幹細胞因子(SCF)、及FMS樣酪胺酸激酶3配體(Flt3L)所組成之群中之情形。IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、SCF及Flt3L較佳為具有人類胺基酸序列，為安全起見，較佳為利用重組DNA技術生產。
培養基較佳為無血清培養基。無血清培養基較佳為包含血清白蛋白、轉鐵蛋白、及胰島素。開發、市售有用以培養淋巴細胞之無血清培養基，於本發明中可利用該等無血清培養基。無血清培養基之較佳之一例係於基礎培養基中添加有市售之CTS Immune Cell SR(Thermo Fisher Scientific)作為支援人類T細胞的增殖之組成者。包含於培養基之血清白蛋白可為人類血清白蛋白或非人類動物血清白蛋白，較佳為人類血清白蛋白。
培養可藉由無餵養培養進行。其原因在於：若於培養中使用餵養細胞，則於製造之細胞之集團中產生感染之風險。
培養基之更換、添加或者補充能以獲得所期望之細胞數之類NK細胞為條件而於開始培養後的任一時間進行，較佳為每隔3～5天進行一次。
培養時使用之培養容器包含可商業性地購得之培養皿、培養用袋、燒瓶、培養盤、多孔培養盤，但並不限定於該等。培養條件係以不損及類NK細胞之擴增效果為條件，並無特別限定，通常為37℃、5%CO
2及飽和水蒸氣環境下之培養條件。培養期間係以將類NK細胞之集團中之細胞擴增至所期望之細胞數為止為條件，並無特別限定。培養期間亦可根據培養條件而變化。若為37℃、5%CO
2及飽和水蒸氣環境下之培養條件，則培養期間可為4～15天。培養期間之上限可為21天左右。
藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+/整合素α1
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+/整合素α1
+/整合素α3
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+/整合素α1
+/整合素α3
+/整合素α4
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+/整合素α1
+/整合素α3
+/整合素α4
+/整合素α5
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+/整合素α1
+/整合素α3
+/整合素α4
+/整合素α5
+/ICAM-1
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/CD11c
+/CD11a
+/CD18
+/整合素α1
+/整合素α3
+/整合素α4
+/整合素α5
+/ICAM-1
+/整合素β1
+細胞的集團。藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高、CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高/ICAM-1
高、或者CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-/整合素α1
高/整合素α3
高/整合素α4
高/整合素α5
高/ICAM-1
高/整合素β1
高集團。又，包含於該等類NK細胞之集團的上述特定之類NK細胞係選自由CD16及CD56所組成的群中之任一者或兩者可為陽性。例如包含於該等類NK細胞之集團的CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-細胞係選自由CD16及CD56所組成之群中的任一者或兩者可為陽性。包含於該等類NK細胞之集團的上述特定之類NK細胞係選自由CXCR1及CXCR4所組成的群中之任一者或兩者可為陰性。
藉由流式細胞法進行之細胞集團之細胞表面抗原之表現解析可測量表現各表面抗原的細胞之數量，故而可知細胞集團之表現各表面抗原之細胞之比率(陽性率)。例如，於算數解釋中，若於細胞集團中表現表面抗原A之細胞於全部細胞中存在50%，表現表面抗原B之細胞於全部細胞中為50%，則存在表現表面抗原A及B之細胞於全部細胞中為0%之可能性。然而，若表現表面抗原A之細胞於全部細胞中為90%，表現表面抗原B之細胞於全部細胞中為90%，則不存在一併表現表面抗原A及B之細胞於全部細胞中為0%之可能性。
於下文將述之實施例1之藉由流式細胞法進行之細胞集團的細胞表面抗原之表現解析中明確：於藉由培養獲得之細胞集團中，CCR5陽性細胞存在92.7%，CCR6陽性細胞存在96.3%，且CXCR3陽性細胞存在51.4%。由該結果表示，於細胞集團中存在CCR5、CCR6及CXCR3均為陽性之細胞。關於CD11a陽性(高表現性)細胞及CD11c陽性(高表現性)細胞，亦明確於藉由培養獲得之細胞集團中分別存在99.8%及96.8%。由該結果表示，於細胞集團中存在CCR5、CCR6、CXCR3、CD11a及CD11c均為陽性之細胞。關於整合素α1陽性細胞及整合素α3陽性細胞，亦明確於藉由培養獲得之細胞集團中分別存在91.0%及75.3%。由該結果表示，於細胞集團中存在CCR5、CCR6、CXCR3、整合素α1及整合素α3均為陽性之細胞。
藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團中的上述特定之類NK細胞之純度(純度(%)＝上述類NK細胞之個數/全部細胞之個數×100)可為30%以上。認為特定之類NK細胞之集團之純度越高，則治療效果越高，故而純度較佳為30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、或50%以上。又，上述特定之類NK細胞之集團之純度亦可更高，亦可為55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上。
藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可為如下的細胞集團：包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞，且選自由CD3、CD4、CD8、CD14、CD19及CD36所組成之群中之任一者為陽性之細胞經去除。又，藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團可包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞，且選自由CD3、CD4、CD8、CD14、CD19及CD36所組成之群中之任一者為陽性之細胞的比率未達10%。該等細胞之比率可藉由流式細胞法進行分析。細胞集團中之選自由CD3、CD4、CD8、CD14、CD19及CD36所組成之群中之任一者為陽性的細胞之比率較佳為未達5%、更佳為未達2%。其原因在於：認為細胞集團中之為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率較高之情況下，腫瘤細胞毒殺活性較高。
藉由本發明之製造方法獲得之類NK細胞之集團於優先培養並擴增所期望之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-類NK細胞的集團之含義下，可謂為濃縮類NK細胞之集團。
藉由培養獲得之特定之類NK細胞之集團存在除了目標類NK細胞以外包含NK細胞前驅物、T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞等的情形。於培養後，存在使用例如比重離心法、免疫磁珠、FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting，螢光活化細胞分類法)、流式細胞法等選擇目標類NK細胞、或其集團之情形。例如，存在使用抗CD3抗體、抗CD16抗體、抗CD34抗體、抗CD36抗體、抗CD69抗體、抗CD94抗體、抗CD107a抗體、抗KIR3DL1(Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor, 3 Domains Long Cytoplasmic Tail 1，殺手細胞免疫球蛋白樣受體3區域長胞質尾區1)抗體、抗KIR3DL2(Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor, 3 Domains Long Cytoplasmic Tail 2，殺手細胞免疫球蛋白樣受體3區域長胞質尾區2)抗體、抗KIR2DL3(Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor, 2 Domains Long Cytoplasmic Tail 3，殺手細胞免疫球蛋白樣受體2區域長胞質尾區3)抗體、抗KIR2DL1(Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor, 2 Domains Long Cytoplasmic Tail 1，殺手細胞免疫球蛋白樣受體2區域長胞質尾區1)抗體、抗KIR2DS1(Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor, 2 Domains Short Cytoplasmic Tail 1，殺手細胞免疫球蛋白樣受體2區域短胞質尾區1)抗體、抗KIR2DL5(Killer Cell Immunoglobulin Like Receptor, 2 Domains Long Cytoplasmic Tail 5，殺手細胞免疫球蛋白樣受體2區域長胞質尾區5)抗體、抗NKp46抗體、抗NKp30抗體、抗NKG2D(Natural Killer Group 2, Member D，自然殺手細胞2族成員D)抗體等，將目標類NK細胞之集團選擇性地分離之情形。抗體存在為單株抗體、多株抗體等之情形。目標類NK細胞之集團之選擇存在將T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞及其他細胞選擇性地去除而進行之情形。
[類NK細胞之集團之用途]
本發明提供一種醫藥組合物，其包含類NK細胞之集團、及作為醫藥而容許之添加物。關於作為醫藥而容許之添加物，例如可例示等張劑、pH值調整劑、緩衝劑、穩定劑、冷凍保護劑、抗生素等。具體而言，可列舉水、乙醇、氯化鈉、葡萄糖、白蛋白等。包含於本發明之醫藥組合物之類NK細胞之集團較佳為上述的藉由本發明所提供之CCR5
+/CCR6
+/CXCR3
+/CD3
-類NK細胞之集團。又，包含於本發明之醫藥組合物之細胞集團較佳為腫瘤細胞毒殺活性較高之類NK細胞的集團，更佳為浸潤至固體腫瘤之類NK細胞之集團。
本發明之醫藥組合物存在投予至具有與藉由本發明之製造方法製造之類NK細胞不同的HLA基因型之患者之情形。
典型而言，醫藥組合物呈將類NK細胞懸浮於溶液之形態。用以懸浮類NK細胞之溶液係通常例如為包含DMSO(Dimethylsulfoxide，二甲基亞碸)之冷凍用保護液、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)、培養基、血清等。溶液存在包含作為醫藥品及準藥品而於藥學上容許之載體之情形。
本發明之醫藥組合物存在為了治療傳染病或癌而使用之情形。又，本發明之醫藥組合物可用於治療對類NK細胞具有敏感性之各種疾病。又，本發明之醫藥組合物可用於預防對類NK細胞具有敏感性之各種疾病。疾病例如包含口腔癌、膽囊癌、膽管癌、肺癌、肝臟癌、大腸癌、腎臟癌、膀胱癌、白血病或因病毒、細菌等引起之傳染病，但並不限定於該等。本發明之細胞療法存在單獨實施，或者與外科療法、化學療法、放射線療法、抗體醫藥品等組合而實施之情形。於使用本發明之醫藥組合物之細胞療法中，類NK細胞存在例如向靜脈、動脈、皮下、腹腔內等投予之情形。
本發明之醫藥組合物可與IL-2製劑一併投予。IL-2製劑可為基因重組型，亦可為替西介白素(基因重組)。
本發明之醫藥組合物即便未必與抗體醫藥品併用，亦可獲得較高之治療效果。作為既知之由NK細胞所得之細胞毒殺機制之一，已知抗體依存性細胞毒殺(Antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。NK細胞於其細胞表面上具有Fc受體(CD16)，但ADCC係NK細胞經由Fc受體而與結合於靶細胞之抗體結合，進行靶細胞之毒殺之機制。存在期待ADCC活性而併用既知之NK細胞與對CD16親和性較高之抗體之情形。然而，本發明之類NK細胞之集團即便不併用抗體，亦具有較高之細胞毒殺活性。可知與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞之集團相比，包含於本發明之醫藥組合物的類NK細胞之集團具有向腫瘤部位之經提昇之趨化性，進而浸潤至腫瘤塊。關於細胞毒殺分析，於併用類NK細胞之集團與抗體之體系及單獨使用類NK細胞之集團的體系中，兩個體系表現出較高之細胞毒殺活性，但並無顯著差。該情況表示即便不誘導ADCC活性，類NK細胞亦對腫瘤細胞具有較高之細胞毒殺活性。
本發明之醫藥組合物存在可與抗體醫藥品併用之情形。作為可與本發明之醫藥組合物併用之抗體之具體例，可列舉：替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、碘(iodine)131、卡妥索單抗(catumaxomab)、博納吐單抗(blinatumomab)、莫羅單抗(muromonab)-CD3、阿昔單抗(abciximab)、利妥昔單抗(rituximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、英夫利昔單抗(infliximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、本妥昔單抗(brentuximab)、司妥昔單抗(siltuximab)、地努圖希單抗(dinutuximab)、奧托昔單抗(obiltoxaximab)、達利珠單抗(daclizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、托珠單抗(tocilizumab)、雷珠單抗(ranibizumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、賽妥珠單抗(certolizumabpegol)、莫加珠單抗(mogamulizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、帕博利珠單抗(pembrolizuma)、依達賽珠單抗(idarucizumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)、伊珠單抗(ixekizumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、阿達木單抗(adalimumab)、帕尼單抗(panitumumab)、戈利木單抗(golimumab)、優特克單抗(ustekinumab)、卡那單抗(canakinumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、地諾單抗(denosumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、貝利木單抗(belimumab)、瑞西巴庫單抗(raxibacumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、納武單抗(nivolumab)、蘇金單抗(secukinumab)、依洛尤單抗(evolocumab)、阿利庫單抗(alirocumab)、及耐昔妥珠單抗(necitumumab)。
可與本發明之醫藥組合物併用之抗體較佳為對CD16親和性較高者。又，於本發明之醫藥組合物中，存在抗體之至少一部分亦可結合於類NK細胞之情形。
本發明之醫藥組合物之製造較佳為以符合醫藥品及準藥品之製造管理及品質管理規則的條件(good manufacturing practice，GMP)及再生醫學等製品之製造管理及品質管理之基準(Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice，GCTP)實施。
本發明提供一種製造用於治療固體腫瘤之醫藥的類NK細胞之用途。本發明提供一種用於固體腫瘤之浸潤的類NK細胞之集團。
本發明提供一種用以治療及預防患者之固體腫瘤之方法，包含對患者投予治療有效量之類NK細胞之集團之步驟。本發明之類NK細胞之集團可毒殺固體腫瘤之腫瘤細胞，故而對於治療及預防患者之固體腫瘤有效。
本發明提供一種用於上述治療用途或研究用途之套組。套組可包含袋、小瓶及管等1個或複數個容器。容器能以醫藥組合物之形式包含藉由本發明所提供之細胞集團，上述醫藥組合物係包含藉由本發明所提供之細胞集團，且一併包含藉由任意選擇而作為醫藥容許之添加物。套組能以與其他藥劑或抗體醫藥品之組合之形式含有容器，該容器包含藉由本發明所提供之細胞的集團。套組係藉由任意選擇而與有關本說明書中記載之治療用途或研究用途之標籤或說明書一併包含細胞集團。
於本發明中，臍帶血及末梢血之全血之採集、自體血清之製備、來自全血的單核球之製備、培養該單核球前後之細胞數之測定、培養前後之單核球中的NK細胞、T細胞、造血前驅細胞及其他細胞類型之構成比率之測定、類NK細胞之擴增倍率的算出、及關於測定誤差或顯著性之統計解析係亦可使用業者周知之任一方法實施。
以下說明之本發明之實施例係僅以例示為目的，並不限定本發明之技術範圍。本發明之技術範圍僅由發明申請專利範圍限定。可將不偏離本發明之主旨作為條件而進行本發明之變更，例如本發明之構成要素之追加、刪除及置換。
[實施例]
[實施例1]
＜＜趨化因子受體之表現確認＞＞
藉由比重離心對正常健康人志願者之末梢血進行分離，獲得末梢血單核球(以下記作PBMC)。對每1×10
7細胞使用5 μL之CliniMACS CD3(miltenyibiotec公司，目錄編號130-017-601)而自PBMC去除CD3陽性細胞(將此處回收之細胞表示為「初級NK」)，培養殘餘細胞。培養係將細胞以5×10
5細胞/mL之密度懸浮於KBM-501(Kohjinbio，添加5% AB血清(Serum))，使用6孔培養盤(Thermo Fisher Scientific，140675)、或T-75燒瓶(Thermo Fisher Scientific，156499)培養14天(於第9天添加培養基)。將該細胞集團之細胞表示為「培養14天之細胞」及「本發明之細胞」。
趨化因子受體之解析係使用14天培養結束後之本發明之細胞、及作為對照而於培養前回收的細胞即「初級NK」。解析係利用流式細胞法進行，使用BD LSRFortessa
TM細胞分析儀(BD生物科技公司)。培養14天之細胞及初級NK之螢光標記係藉由如下方式進行：將各細胞於將表1所示之各抗體以最終濃度1 μg/mL懸浮於PBS(和光純藥工業)中而得之抗體溶液中，以2～8℃於暗處培養30分鐘。
[表1]
| 抗體名 | Cat. | 製造商 | 備註 |
| FITC標記抗人類CD181(CXCR1)抗體 | 320605 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| PE/Cy7標記抗人類CD182(CXCR2)抗體 | 320715 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| PE標記抗人類CD183(CXCR3)抗體 | 353705 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| PerCP/Cy5.5標記抗人類CD184(CXCR4)抗體 | 306515 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| PE標記抗人類CD192(CCR2)抗體 | 357205 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| PE標記抗人類CD194(CCR4)抗體 | 359411 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| PE/Cy7標記抗人類CD195(CCR5)抗體 | 359107 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| FITC標記抗人類CD196(CCR6)抗體 | 353411 | Biolegend | 趨化因子受體 |
| Pacific Blue™標記抗人類CD56(NCAM)抗體 | 318325 | Biolegend | NK細胞標記物 |
| APC/Cy7標記抗人類CD3抗體 | 300426 | Biolegend | T細胞標記物 |
將結果示於圖1A。經培養14天之本發明之細胞係較強地表現趨化因子受體CCR5、CCR6、及CXCR3，較弱地表現CCR2。未表現CXCR1及CXCR2。
已知通常CCR5、CCR6、CXCR3係MDSC(Myeloid-derived suppressor cells)或Treg(Regulatery T cell，調節性T細胞)等免疫抑制性之細胞集團所具有，該等細胞於活體內多存在於被稱為冷腫瘤(Cold tumor)之狀態之腫瘤組織。認為本發明之細胞具有與該等細胞同樣之趨化性，因此設想亦可高效率地浸潤至認為免疫治療極其難以奏效之冷腫瘤而實現毒殺。
培養14天之細胞集團(培養後)中之CCR5陽性細胞、CXCR3陽性細胞、CCR6陽性細胞之比率分別為92.7%、96.3%、51.4%(圖1A)。因此，92.7%×96.3%×51.4%＝45.88%，故而培養14天之細胞集團中之CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性之細胞概率性地計算為45.9%。
＜＜細胞接著分子群之表現確認＞＞
於細胞接著分子群之解析中，使用與實施例1同樣地培養14天之本發明之細胞、及作為對照之初級NK。藉由流式細胞法進行解析。將用於螢光標記之抗體記載於表2。螢光標記係按照與上述同樣之順序進行。
[表2]
| 抗體名 | Cat. | 製造商 | 備註 |
| APC標記抗人類CD11a抗體 | 301212 | Biolegend | ICAM-1 |
| APC標記抗人類CD11b抗體 | 301309 | Biolegend | 整合素αM |
| PerCP/Cy5.5標記抗人類CD11c抗體 | 337210 | Biolegend | 整合素αX |
| PE標記抗人類CD29抗體 | 303003 | Biolegend | 整合素β1 |
| APC標記抗人類CD18抗體 | 302113 | Biolegend | 整合素β2 |
| APC標記抗人類CD61抗體 | 336411 | Biolegend | 整合素β3 |
| PE標記抗小鼠CD49a抗體 | 328303 | Biolegend | 整合素α1 |
| FITC標記抗人類CD49b抗體 | 314306 | Biolegend | 整合素α2 |
| PE標記抗人類CD49c抗體 | 343803 | Biolegend | 整合素α3 |
| PE標記抗人類CD49d抗體 | 304303 | Biolegend | 整合素α4 |
| PE標記抗人類CD49e抗體 | 328009 | Biolegend | 整合素α5 |
| APC標記抗人類CD31抗體 | 303115 | Biolegend | PECAM-1 |
| Pacific Blue™標記抗人類CD56(NCAM)抗體 | 318325 | Biolegend | NK細胞標記物 |
| APC/Cy7標記抗人類CD3抗體 | 300426 | Biolegend | T細胞標記物 |
將結果示於圖1C及D。經培養14天之本發明之細胞較強地表現細胞接著分子ICAM1、整合素α1、LFΑ-1α、整合素β2、整合素α3、整合素αX、整合素β2、PECAM-1、整合素α5、整合素α4及整合素β1。
於向腫瘤組織之浸潤中，需要向血管外漏出後通過間質、向腫瘤細胞塊接著及滲入等細胞彼此於複數個重要部位之接著或者與細胞外基質之接著，認為由本發明所獲得之細胞具有可實現上述任一者之接著分子表現模式。
[實施例2]
＜＜CD3陽性細胞及CD19陽性細胞之含有率＞＞
為了對CD3陽性細胞及CD19陽性細胞之含有率進行解析，使用與實施例1同樣地培養14天之本發明之細胞，使用PBMC作為對照。用於螢光標記之抗體係PE(Phycoerythrin，藻紅素)標記抗人類CD3抗體(Biolegend，300408)及PerCP-Cy5.5(Peridinin Chlorophyll Protein-Cyanine 5.5 Complexes，多甲藻黃素葉綠素蛋白-花青錯合物)標記抗人類CD19抗體(Biolegend，302230)。螢光標記係按照與實施例1同樣之順序進行。
將結果示於圖2。包含於經培養14天之本發明之細胞的CD3陽性細胞為0.025%，CD19陽性細胞為0.28%。另一方面，包含於未經培養之PBMC的CD3陽性細胞為64.7%，CD19陽性細胞為8.57%。
[實施例3]
＜＜向固體腫瘤塊之浸潤確認＞＞
以IMR32球狀細胞團塊為靶而觀察本發明之細胞之浸潤。
藉由胰蛋白酶EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)剝離IMR32細胞(人類MYCN擴增神經胚細胞瘤細胞株)，利用RPMI(10%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清))以於100 μL中成為3×10
3細胞之方式製備，接種至EZ-Bind Shut II(註冊商標)微培養盤(IWAKI，Cat. 4870-800LP)，以37℃培養48～72小時而形成IMR32球狀細胞團塊。IMR32球狀細胞團塊係使用200 μL吸頭以每孔1個移植至384孔微培養盤(薄膜底部，高內涵成像用)(CORNING，Cat. 4518)，以37℃培養1～2小時左右而接著至底面。
用於靶細胞之細胞毒殺分析的本發明之細胞係藉由實施例1中記載之方法誘導。用作對照之NK細胞之集團(表示為初級NK)係利用EasySep
TM人類NK細胞富集套組(Human NK Cell Enrichment Kit)(STEMCELL Technologies，Cat. 19055)對藉由比重離心自正常健康人志願者之末梢血分離的PBMC進行處理、單離。本發明之細胞與初級NK係藉由PKH26紅色(Red)螢光細胞連接套組(普通細胞膜用)(SIGMΑ-ALDOLICH，Cat. PKH26GL，以下記作PKH26)染色。
於附著有IMR32球狀細胞團塊之384孔微培養盤之每個孔中，分別以1×10
4細胞/20 μL(KBM-501，5% AB血清)注入本發明之細胞或初級NK，以37℃培養21小時，藉此實施IMR32球狀細胞團塊之細胞毒殺分析。圖像之記錄係於對IMR32球狀細胞團塊分別應用本發明之細胞、初級NK、抗GD2抗體後，在1、6、12、18、21小時之時間點藉由BZ-9000(KEYENCE)進行攝影、記錄。抗GD2抗體係使用地努圖希單抗(Unituxin
TM，United Therapeutics公司)，以最終濃度成為10 μg/mL之方式添加。
將結果示於圖3。可知經PKH26染色之本發明之細胞滲入至IMR32球狀細胞團塊之內部。又，於自開始分析12小時以後，腫瘤塊包含中心部在內而開始崩解。經PKH26染色之初級NK聚集於IMR32球狀細胞團塊之表面，但未滲入至內部。針對形成有球狀細胞團塊之IMR32，抗GD2抗體(Unituxin(註冊商標))係於顯微鏡下未觀察到毒殺活性。
[實施例4]
＜＜對固體腫瘤塊之毒殺活性確認＞＞
標靶之IMR32球狀細胞團塊係如實施例3所記載般製備，並附著至384孔微培養盤。本發明之細胞及初級NK係如實施例3所記載般製備，並進行PHK26染色。IMR32球狀細胞團塊之細胞毒殺分析係以僅添加本發明之細胞或初級NK、添加本發明之細胞或初級NK與抗GD2抗體、僅添加抗GD2抗體之5個群進行，準備未添加效應細胞且亦未添加抗GD2抗體者作為對照(control)。本發明之細胞或初級NK係於附著有IMR32球狀細胞團塊之384孔微培養盤之每個孔中添加1×10
4細胞/20 μL(KBM-501，5% AB血清)。抗GD2抗體係使用地努圖希單抗(Unituxin
TM，UnitedTherapeutics公司)，以最終濃度成為10 μg/mL之方式添加至附著有MR32球狀細胞團塊之384孔微培養盤。細胞毒殺分析係藉由以37℃培養21小時而進行。
於進行細胞毒殺分析後，進行離心分離(500 g，5分鐘，4℃)，去除上清液之後，添加經PBS稀釋之7-AAD溶液(Beckman Coulter，A07704)並懸浮，於室溫下培養10分鐘。使用流式細胞儀(BD LSR Fortessa，BD生物科技公司)進行測定，利用FlowJo軟體進行解析。
細胞毒殺活性係藉由下式計算。再者，於以下之實施例中亦同樣地計算。
(效應細胞與經培養之情形時之靶細胞之細胞死亡－自然細胞死亡(陰性對照))/(最大細胞死亡(陽性對照)－自然細胞死亡(陰性對照))×100
將結果示於圖4A～C。本發明之細胞係無論有無抗GD2抗體，均滲入至IMR32球狀細胞團塊之內部，包含中心部在內而開始崩解(圖4A之下段)。關於初級NK，觀察到無論有無抗GD2抗體，均聚集於IMR32球狀細胞團塊之表面但未滲入至內部，然而於抗GD2抗體之存在下，與不存在該抗GD2抗體相比而更堆積於IMR32球狀細胞團塊之周邊(圖4A之中段)。
本發明之細胞係無論有無抗GD2抗體，均表現出高於初級NK之細胞毒殺活性(圖4C)。
[實施例5]
＜＜利用活體內固體腫瘤模型進行之治療效果確認＞＞
利用RPMI1640培養作為導入有GFP之人類卵巢癌細胞株之SKOV3細胞。向6～7週齡之NOG小鼠之腹腔內以1×10
5細胞/200 μL(利用PBS製備)移植SKOV3細胞(經GFP標記之人類卵巢癌細胞株，利用RPMI1640培養)。將移植日設為第0天。此後，於第5天(5天後)將本發明之細胞或初級NK以2.5×10
6細胞/200 μL(利用PBS製備)進行腹腔內投予(i.p.)。又，於第5、6、7天對1每隻投予5,000 IU之hIL(human interleukin，人類介白素)-2(Imunace，鹽野義製藥股份有限公司)。對照組係於第0天以後不進行細胞及hIL-2之投予。將治療排程示於圖5。
於第21天對小鼠實施安樂死並解剖，藉由BZ-9000(基恩士)攝影腸間膜，利用ImageJ對GFP陽性區域進行定量。於攝影時，將腸間膜於10 cm之盤(dish)上擴展，使用2倍之物鏡於固定條件(攝影器材、攝影面積、激發波長、曝光時間、解析時之濾色及閾值(Threshold))下實施所有攝影/解析。使用JMP軟體對經定量化之資料進行統計解析。於單因子(One-way)ANOVA(分散分析)後，使用塔基-克萊默(Tukey-Kramer)法(多重比較檢驗)。
將結果示於圖6A及B。於未進行治療及投予有初級NK之小鼠之腸間膜中觀察到腫瘤結節，但於投予有本發明之細胞之小鼠之腸間膜中未觀察到腫瘤結節。腸間膜之GFP陽性區域之全部像素之總密度係未進行治療的小鼠最高，其次為投予有初級NK之小鼠較高，投予有本發明之細胞之小鼠較低。未進行治療之小鼠與投予有初級NK之小鼠之間無顯著差，但未進行治療之小鼠及投予有初級NK之小鼠與投予有本發明之細胞的小鼠之間存在顯著差(p＜0.01)。該等結果表示藉由投予本發明之細胞，移植至免疫缺乏小鼠之SKOV3細胞死絕。確認到本發明之細胞於活體內固體腫瘤模型中之治療效果。
[實施例6]
＜＜細胞集團之改良製造方法＞＞
如下般製備細胞，製作3種類型之細胞集團。
1)按照1∶1將藉由以下所示之2)及3)之方法獲得之細胞混合所得者(以下，表示為「類NK＋單核細胞」)。
2)使用EasySep
TM未去除CD16之人類單核球富集套組(Human Monocyte Enrichment Kit WITHOUT CD16 DEPLETION)(STEMCELL，Cat. 19058)自PBMC去除CD2、CD3、CD19、CD20、CD56、CD66b、CD123、血型糖蛋白A陽性細胞之後，以5×10
5細胞/mL之密度懸浮至KBM-501(5% AB血清)，利用Nunc Easy Flask 75 FILIT NUNCLON DSI(Thermo Fisher Scientific，Cat. 156944)或者Nunc MULTIDISH 6 NUNCLON DELTA SI(Thermo Fisher Scientific，Cat. 140675)培養14天所得者(以下，表示為「濃縮單核細胞」)。
3)使用EasySep
TM人類NK細胞富集套組(STEMCELL，Cat. 19055)自PBMC去除CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLΑ-DR、血型糖蛋白A陽性細胞之後，以5×10
5細胞/mL之密度懸浮至KBM-501(5% AB血清)，利用Nunc Easy Flask 75 FILIT NUNCLON DSI(Thermo Fisher Scientific，Cat. 156944)或者Nunc MULTIDISH 6 NUNCLON DELTA SI(Thermo Fisher Scientific，Cat. 140675)培養14天所得者(以下，表示為「濃縮類NK」)。
將自開始培養後第10天之細胞之照片示於圖7。於除濃縮單核細胞群以外之2個群中，確認到多數個呈典型之類活化淋巴細胞之形態的細胞。關於濃縮單核細胞群，確認到多數個大型且接著較強之骨髓球系細胞，但亦可確認到浮游之相對小型之細胞。培養狀態均良好，適當地進行KBM-501中之增殖，未發現明顯之細胞凋亡。
＜＜毒殺活性之測定、CD107a陽性率之測定＞＞
利用包含10%FBS(日冷生物科技，171012-500ML)、100單位之青黴素、及100 μg/mL之鏈黴素(Nacalai Tesque，26253-84)之RPMI1640培養基(和光純藥工業，189-02025)(以下，記作10%FBS/RPMI1640)，將K562細胞(人類慢性骨髓性白血病細胞株)製備成1×10
6細胞/mL之濃度。使用PKH26紅色螢光細胞連接套組(Red Fluorescent Cell Linker Kit)(Sigma)對所製備之K562細胞進行染色，以成為2×10
6細胞/mL之方式製備。
準備上述3種類型之細胞集團(類NK＋單核細胞、濃縮類NK、濃縮單核細胞)中之任一類型與K562細胞之群、僅上述3種類型的細胞集團(類NK＋單核細胞、濃縮類NK、濃縮單核細胞)中之任一類型之群、作為陰性對照之僅K562細胞之群、作為陽性對照之利用10%福馬林固定K562細胞之群。
上述3種類型之細胞集團(類NK＋單核細胞、濃縮類NK、濃縮單核細胞)中之任一類型與K562細胞係於以細胞數比計成為1∶1之方式添加至96孔培養盤後進行混合，以37℃反應2小時。作為順序，首先將K562細胞添加至培養盤，其次以成為最終濃度1 μg/mL之方式添加200 μg/mL之APC(Allophycocyanin，別藻藍蛋白)標記抗人類CD107a抗體※(Biolegend，328620)，最後添加上述3種細胞集團(類NK＋單核細胞、濃縮類NK、濃縮單核細胞)。於培養後，進行離心分離(500 g，5分鐘，4℃)，去除上清液之後，添加經PBS之7-AAD溶液(Beckman Coulter，A07704)並懸浮，於室溫下培養10分鐘後進行清洗。使用流式細胞儀(BD LSR Fortessa，BD生物科技公司)進行測定，藉由FlowJo軟體進行解析。
將結果示於圖8A及B。類NK＋單核細胞集團及濃縮類NK細胞集團表現出較高之細胞毒殺活性。
※：CD107a存在於NK細胞內之顆粒，於脫顆粒(釋出穿孔蛋白、顆粒酶)時移動至細胞膜表面上，因此CD107a為陽性係間接地表示NK已攻擊對象。
＜＜趨化因子受體之表現確認＞＞
按照實施例1中記載之順序，對藉由本實施例之改良製造方法(以濃縮類NK細胞集團、及類NK＋單核細胞集團為材料之製造方法)製作的類NK細胞中之趨化因子受體CCR4、CCR5、CCR6、CXCR3及CXCR4之表現進行實驗。
將結果示於圖9。藉由本實施例之改良製造方法，可獲得包含CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性之細胞之細胞集團。又，可知存在CCR6之表現性因供體而異之情形。
圖1A係本發明之培養14天之細胞(培養後(postcultured))之趨化因子受體的表現。對照係未經培養之初級(primary)NK細胞。
圖1B係使用同型對照(Isotype control)抗體之陰性對照。
圖1C係本發明之培養14天之細胞(培養後)之細胞接著分子的表現。對照係未經培養之初級NK細胞。
圖1D係本發明之培養14天之細胞(培養後)之細胞接著分子的表現。對照係未經培養之初級NK細胞。
圖2係本發明之培養14天之細胞(培養後)之CD3陽性細胞及CD19陽性細胞的含有率。對照係PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單核球)。
圖3係於利用抗GD(Glycolipid Disialoganglioside，糖脂二唾液酸神經節苷脂)2抗體、初級NK細胞及本發明之培養14天之細胞(培養後)進行之固體腫瘤塊(IMR32(Institute for Medical Research-32，人神經母細胞瘤細胞)球狀細胞團塊(spheroid))的細胞毒殺分析中，在1、6、12、18、21小時的時間點拍攝之固體腫瘤塊(IMR32球狀細胞團塊)之照片。
圖4A係於利用初級NK細胞及本發明之培養14天之細胞(培養後)進行之固體腫瘤塊(IMR32球狀細胞團塊)的細胞毒殺分析中，在21小時之時間點拍攝之固體腫瘤塊(IMR32球狀細胞團塊)之照片。作為對照，表示無效應細胞之體系中之固體腫瘤塊(IMR32球狀細胞團塊)之照片。
圖4B係藉由7AAD(7-Aminoactinomycin D，7-胺基放線菌素D)染色進行之死細胞之流式細胞法解析。
圖4C係初級NK及本發明之培養14天之細胞(培養後)之細胞毒殺活性。
圖5係活體內固體腫瘤模型之治療排程。
圖6係活體內固體腫瘤模型之治療效果。(A)係腸間膜之整體影像。腸映出為環狀，於其內側存在腸間膜。(B)係腸間膜之GFP(Green Fluorescent Protein，綠色螢光蛋白)陽性區域之全部像素之總密度。
圖7係利用改良製造方法開始培養後之第10天之細胞。
圖8(A)係類NK＋單核細胞(Mono)、濃縮類NK、及濃縮單核細胞之細胞毒殺活性。(B)係CD107a陽性率。
圖9係藉由以濃縮類NK細胞集團、及類NK＋單核細胞集團為材料之製造方法製作之類NK細胞之趨化因子受體的表現確認。關於CCR5、CCR6及CXCR3，以箭頭表示濃縮類NK細胞之曲線圖。
Claims (10)
- 一種細胞集團，其包含為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞。
- 如請求項1之細胞集團，上述為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞進而為CD11a高表現性及CD11c高表現性，高表現性係藉由與自末梢血獲得之未進行實質性培養之NK細胞的集團之表現進行比較而判斷。
- 如請求項1或2之細胞集團，其中上述為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞進而為整合素α1陽性、整合素α3陽性及整合素β3陰性。
- 如請求項1或2之細胞集團，其中於上述細胞集團中，為CCR5陽性、CCR6陽性及CXCR3陽性且為CD3陰性之細胞之比率為30%以上。
- 如請求項1或2之細胞集團，其中選自由CD3及CD19所組成之群中之任一者為陽性之細胞的比率未達5%。
- 如請求項1或2之細胞集團，其中於上述細胞集團中，選自由CD4、CD8、CD14、CD19及CD36所組成之群中之任一者為陽性之細胞經去除。
- 如請求項1或2之細胞集團，其用於向固體腫瘤浸潤。
- 一種為CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性、整合素α1陽性、整合素α3陽性及整合素β3陰性且為CD3陰性之細胞，其係浸潤至固體腫瘤。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之細胞集團、及作為醫藥而容許之添加物。
- 一種細胞集團之製造方法，其係如請求項1至7中定義之細胞集團之製造方法，其包含如下步驟： 製備初代單核球細胞集團之步驟； 自初代單核球細胞集團去除CD3陽性細胞之步驟； 自初代單核球細胞集團去除選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者之步驟；及 利用包含IL-2之培養基對上述CD3陽性細胞、以及選自由單核細胞及B細胞所組成之群中之任一者經去除的殘餘細胞集團進行培養之步驟。
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