CN111918963B - 表达趋化因子受体和细胞粘附分子的cd3阴性细胞群体及其用途和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞毒活性更高的免疫细胞以及可期待高效用于NK细胞疗法的药物组合物。本发明提供包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体。本发明提供CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞进一步高表达CD11c的细胞群体。本发明提供对实体肿瘤浸润的CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞。本发明还提供包含这样的细胞群体及药学上允许的添加物的药物组合物。本发明进一步提供上述细胞群体的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及表达趋化因子受体和细胞粘附分子的CD3阴性细胞群体及其用途。
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月27日申请的日本特愿2018-59624的优先权，将其全部记载特别作为公开而援引于此。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)为作为自然免疫的主要因子工作的细胞毒性的淋巴细胞，承担针对肿瘤细胞、病毒感染的初期保护机制。
将从患者自身采集的NK细胞，通过体外的培养使其增殖几百倍～数千倍并使其活化，输回患者的NK细胞疗法，作为副作用比较少的治疗方法而受到关注。通常，从正常的成人的外周血的1次单采血液成分术(apheresis)中可以回收约1×1010个单核的细胞(mononuclear cell)，如果将外周血单核的细胞中的NK细胞的构成比率取约7％，则可得到7×108个NK细胞。另一方面，如果设患者的体重为60kg，则需要6×106个～4.8×109个NK细胞。为此，对将从供体得到的NK细胞进行培养扩增，而得到杀灭靶细胞而言足够的NK细胞的技术的开发正在推进。例如，专利文献1提出了NK细胞的扩增方法，其特征在于包括制备包含NK细胞的细胞群体的步骤，从包含NK细胞的细胞群体除去T细胞的步骤，和将进行了除去而剩余的细胞在包含2500IU/mL～2813IU/mL的IL-2的培养基中培养的步骤。
另外，对离体培养的NK细胞而言，存在虽然在体外对肿瘤细胞株显示细胞毒性但在临床上治疗效果不够充分的情况。因此，提出了提高NK细胞的活性的培养技术。例如，专利文献2中提出了NK细胞的离体培养方法，所述NK细胞具有选自CD62L的表达升高，迁移应答升高，寻靶及在体内的保持升高，更大的增殖，增大的细胞毒活性中的至少一个，所述方法包括将包含NK细胞的细胞群体与至少一个生长因子以及有效的浓度，有效的暴露时间及有效的继续暴露时间的尼克酰胺和/或其它尼克酰胺成分一起培养。
作为免疫细胞疗法用的免疫细胞，除了NK细胞以外，也研究了进行基因的改造而使其表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)。在该技术中，通过将对作为靶标的肿瘤的抗原不具有特异性的T细胞进行基因的改造，可以从外周血大量制作对作为靶标的肿瘤具有的抗原获得了特异性的效应子T细胞。但是，CAR-T细胞疗法存在对实体肿瘤不很有治疗效果的情况，作为其原因之一，可举出CAR-T细胞没有到达实体肿瘤(非专利文献1)。关于CAR-T细胞向肿瘤的寻靶，报告称有可能为在基因改造时趋化因子受体发生缺失，向肿瘤细胞的趋化性降低(非专利文献2)。另一方面，报告称对于转导CCR2b而使其表达功能性趋化因子受体的CAR-T细胞而言，向肿瘤的转移增加，抗肿瘤活性升高(非专利文献3)。
在非专利文献4中，调查了最为人所知的源自人外周血的CD56阳性的NK细胞中的趋化因子受体表达。在该研究中报告了CD56低NK细胞主要为CXCR1/CXCR2+及CXCR3/CCR5-/+，大部分的CD56高NK细胞为CXCR1/CXCR2-及CXCR3/CCR5+。另外，也报道了CD56低及CD56高NK细胞这两者为CCR4-及CCR6-(非专利文献4)。
专利文献1：日本特开2013-27385号公报(日本专利第5572863号)
专利文献2：日本特表2013-515497号公报
非专利文献1：Melero I.等，Cancer Discovery 2014；4：522-526.
非专利文献2：Jena B.等，Blood，2018；116：1035-1044.
非专利文献3：Moon E.等，Clin Cancer Res，2011；17(14)：4719-4730.
非专利文献4：Lima M.等，Journal of Immunology Research，Volume 2015，Article ID 839684，18页
将专利文献1～2及非专利文献1～4的全部记载特别作为公开而援引于此。
发明内容
发明所要解决的问题
对CAR-T细胞而言，具备通过基因操作而获得除了抗原特异性以外的趋化性等期望的功能的可能，但作为基因治疗用产品使用，为了确保品质及安全性而制订了严格的准则，存在开发成本和时间的问题。
另外，对NK细胞而言，即使已确认了在体外对肿瘤细胞株显示细胞毒活性，也存在在体内的抗肿瘤活性并不足够的问题。认为其原因在于，NK细胞相对于肿瘤的趋化性弱，并且对实体肿瘤不浸润。
至今，提出了提高NK细胞的培养效率的技术、提高NK细胞的活性的培养技术，而采用这些技术制备的NK细胞对于临床使用而言仍然并不足够。存在使用培养技术提供具有更高的抗肿瘤活性的免疫细胞的课题。
解决问题的手段
根据本发明可提供以下发明。
[1]细胞群体，其包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞。
[2]根据[1]所述的细胞群体，其中，上述CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞进一步为CD11a高表达及CD11c高表达，所述高表达通过与外周血得到的没有进行实质培养的NK细胞群体中的表达的比较而判断。
[3]根据[1]或[2]所述的细胞群体，其中，上述CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞进一步为整联蛋白α1阳性、整联蛋白α3阳性及整联蛋白β3阴性。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞群体，其中，在上述细胞群体中CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比例为30％以上。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细胞群体，其中，选自由CD3及CD19组成的组中的任一种为阳性的细胞的比率低于5％。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细胞群体，其中，在上述细胞群体中选自由CD4，CD8，CD14，CD19及CD36组成的组中的任一种为阳性的细胞被除去。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细胞群体，其用于对实体肿瘤浸润。
[8]细胞，其为对实体肿瘤浸润的CCR5阳性、CCR6阳性、CXCR3阳性、整联蛋白α1阳性、整联蛋白α3阳性及整联蛋白β3阴性且CD3阴性的细胞。
[9]药物组合物，其包含[1]～[7]中任一项所述的细胞群体，及药学上允许的添加物。
[10][1]～[7]定义的细胞群体的制备方法，包括
制备初代单核的细胞群体的步骤；
从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞的步骤；
从初代单核的细胞群体中除去选自由单核细胞(monocyte)及B细胞组成的组中的任一种的步骤；和
将除去CD3阳性细胞以及选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种后剩余的细胞群体在包含IL-2的培养基中培养的步骤。
附图说明
[图1A]本发明的14天培养细胞(经培养后)中的趋化因子受体的表达。对照为没有进行培养的初代NK细胞。
[图1B]使用了同种型对照(Isotype control)抗体的阴性对照。
[图1C]本发明的14天培养细胞(经培养后)中的细胞粘附分子的表达。对照为没有进行培养的初代NK细胞。
[图1D]本发明的14天培养细胞(经培养后)中的细胞粘附分子的表达。对照为没有进行培养的初代NK细胞。
[图2]本发明的14天培养细胞(经培养后)中CD3阳性细胞及CD19阳性细胞的含有率。对照为PBMC。
[图3]为利用抗GD2抗体，初代NK细胞及本发明的14天培养细胞(经培养后)进行的实体肿瘤团块(IMR32球状体)的细胞伤害测定中，在1，6，12，18，21小时的时间点拍摄的实体肿瘤团块(IMR32球状体)的照片。
[图4A]利用初代NK细胞及本发明的14天培养细胞(经培养后)进行的实体肿瘤团块(IMR32球状体)的细胞伤害测定中，在21小时的时间点拍摄的实体肿瘤团块(IMR32球状体)的照片。将在无效应细胞的体系中的实体肿瘤团块(IMR32球状体)的照片作为对照示出。
[图4B]采用7AAD染色的死细胞的流式细胞术分析。
[图4C]初代NK及本发明的14天培养细胞(经培养后)的细胞毒活性。
[图5]体内的实体肿瘤模型的治疗日程表。
[图6]体内的实体肿瘤模型中的治疗效果。(A)肠系膜的整体图像。肠映照为环状，在其内侧存在肠系膜。(B)肠系膜的GFP阳性区域的所有像素的总密度。
[图7]改良制备方法中的培养开始之后第10天的细胞。
[图8](A)NK样+Mono，浓缩NK样，及浓缩Mono的细胞毒活性。(B)CD107a阳性率。
[图9]通过将浓缩NK样细胞群体，及NK样+mono细胞群体作为材料的制备方法制备的NK样细胞中，趋化因子受体表达的确认。在浓缩NK样细胞的图表中，对于CCR5，CCR6及CXCR3用箭头示出。
具体实施方式
以下记载的本发明的说明是基于代表性的实施方式、具体例进行的，但本发明并不受限于这样的实施方式。需要说明的是，本说明书中使用“～”表示的数值范围意思是将在“～”的前后中记载的数值作为下限值及上限值而包含的范围。
[CCR5阳性、CCR6阳性、CXCR3阳性及CD3阴性的细胞群体]
本发明提供细胞群体，其包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞。有时将CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞用“CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞”，或只是“CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-”表示。关于表面抗原标记的记载中使用的“/”而言，意思是“及，且”，例如“CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-”为“CCR5+，CCR6+，CXCR3+且CD3-”的含义。
(趋化因子受体)
CCR5，CCR6及CXCR3为趋化因子受体。趋化因子及趋化因子受体参与炎症、免疫应答中的细胞迁移，造血干细胞的骨髓的归巢等。趋化因子为用于使白细胞，淋巴细胞，NK细胞，T细胞等迁移到组织中所必需的物质，趋化因子受体在细胞的表面接受趋化因子，向细胞内传递各种信号。
据报道，CCR5及CCR6为单核细胞，巨噬细胞及树突细胞等所具有，以及CXCR3为T细胞及NK细胞等所具有(Nagarsheth N，et al.Nat Rev Immunol.2017)。关于CCR5，据报道对于细胞毒性T细胞的向实体肿瘤的寻靶是重要的(Gonzaelez-A，etal.Oncoimmunology.2012)。关于CCR6，据报道与CD103一起的CCR6的肿瘤内诱导承担了在肿瘤部位中的T细胞保持的功能(Franciszkiewicz K，et al.Cancer Res.2012)。
CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体具有如后所述的相对于肿瘤细胞株的细胞毒活性高的特征。这是在已知的NK细胞中也可观察到的特征。然而，CCR6阳性的NK细胞至今尚无报告。例如：非专利文献4中报道了CD56阳性NK细胞为CCR6阴性。因此，根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体与已知的NK细胞群体之间，至少在CCR6阳性的方面能够区别。存在将本发明的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体具体称为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-NK样细胞群体，或简称NK样细胞群体的情况。这里，已知的NK细胞为不表达T细胞受体(TCR)，作为T细胞的普遍标记的CD3，更不表达作为膜免疫球蛋白的B细胞受体的大型的颗粒性淋巴细胞，虽然在一部分中存在CD16阴性群体，但通常在人类中为CD16阳性且CD56阳性。本领域技术人员可以基于细胞表面标记的表达模式等容易地判断是否为NK细胞。
关于表面标记，有时将阳性以+表示，阴性以-表示。例如，CCR5阳性有时表示为CCR5+，CCR5阴性有时表示为CCR5-。阳性中包括为高表达(高)的情况和为低表达(低)的情况。阳性、阴性、高表达、低表达可以基于根据流式细胞术得到的图表而判断。在图表中出现的位置，可能根据仪器的电压设定、灵敏度设定、使用的抗体克隆、染色条件、使用的染料等不同而变动，但本领域技术人员可以在得到的图表中，以将被认为是一组的细胞群体不分开的方式适当进行划线。
对目标的标记的表达而言，在为阳性还是为阴性的判断中，可以将使用了同种型对照(Isotype control)抗体的情况用作阴性对照而判断。同种型对照抗体为与特定的抗原不反应的抗体。一般而言，在使用了抗体的实验中，存在由于与靶标以外的蛋白质的非特异性结合、与细胞表面上的Fc受体的结合而产生背景的可能性。通过与使用了作为阴性对照的抗体的体系进行比较，由此使得明确相对于目标的抗原的一次抗体的反应为特异性的。另外，可以排除背景的影响，准确解释信号的强度。
在本说明书中“细胞群体”是指多个细胞，例如由1×105细胞以上的细胞构成的一群。根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体可以制备成各种细胞密度。可以制备为例如1×105细胞/mL以上。
CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的细胞的数量优选为1×106细胞以上，更优选为5×106细胞以上，进一步优选为1×107细胞以上。CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的细胞的数量还可以为适于对人的施用的1×106细胞～1×1010细胞。另外，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中的细胞密度为1×105细胞/mL以上、优选为2×105细胞/mL以上，更优选为5×105细胞/mL以上。用于对人的点滴注射，可以为5×105细胞/mL左右。可以使细胞密度的上限值为例如1×1010细胞/mL以下。CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中的细胞密度的范围没有特别限定，可以为1×105～1×1010细胞/mL，2×105～1×1010细胞/mL，3×105～1×1010细胞/mL，4×105～1×1010细胞/mL，5×105～1×1010细胞/mL，6×105～1×1010细胞/mL，7×105～1×1010细胞/mL，8×105～1×1010细胞/mL，9×105～1×1010细胞/mL，1×106～1×1010细胞/mL，1×107～1×1010细胞/mL，1×108～1×1010细胞/mL，1×105～1×109细胞/mL，2×105～1×109细胞/mL，3×105～1×109细胞/mL，4×105～1×109细胞/mL，5×105～1×109细胞/mL，6×105～1×109细胞/mL，7×105～1×109细胞/mL，8×105～1×109细胞/mL，9×105～1×109细胞/mL，1×106～1×108细胞/mL，1×106～1×109细胞/mL，或1×107～1×109细胞/mL。CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中的细胞密度还可以为适于培养、冻存的1×106～1×108细胞/mL，还可以为适于对人的施用的1×105～1×109细胞/mL。
根据本发明提供的上述细胞群体中，CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比例为(比例(％)＝CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞的个数/全部细胞的个数×100)可以为30％以上。对在上述细胞群体中，CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比例而言，考虑比例越高治疗效果越高，因此，比例优选为30％以上，35％以上，40％以上，45％以上，或50％以上。另外，在上述细胞群体中，CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比例也可以更高，可以为55％以上，60％以上，65％以上，70％以上，75％以上，80％以上，85％以上，90％以上，或95％以上。
目标的标记的表达的程度(为低表达、或为高表达)，可以通过与在相同条件下测定的对照细胞群体的结果的比较来判断。对照细胞群体的例子为如本说明书的实施例中记载的初代(primary)NK那样的从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体。
经培养一定时期的细胞群体中CCR6的表达的程度可以通过以下进行判断：使用流式细胞术，将该细胞群体中的CCR6表达量，与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体(对照，已知为CCR6阴性)中的CCR6表达量相比而判断。经培养一定时期的细胞群体中CCR6的表达为双峰性，在双峰都比对照表达量高的情况下可以判断为存在低表达和高表达。
本发明中提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的细胞可以为CCR6高表达或CCR6低表达。另外，根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中，也可以包含CCR6高表达的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体，及CCR6低表达的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体这两者。包含两者的细胞群体在用流式细胞法对CCR6进行分析时为双峰性。
另外，根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的细胞可以为CCR5阳性及CXCR3阳性。此外，也可以存在CCR5高表达及CXCR3高表达的情况。高表达可以通过与巨噬细胞、MDSC等骨髓细胞系细胞中的CCR5及CXCR3的表达的比较而判断。
本发明中提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的细胞可以为选自由CXCR1及CXCR2组成的组中的任一种为阴性。本发明中提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的细胞可以为选自由CCR2，CCR4及CXCR4组成的组中的任一种阴性、或极低表达。
本发明中提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体可以根据后述的NK样细胞群体的制备方法得到。在后述的NK样细胞群体的制备方法中包括从初代单核的细胞群体中除去选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的步骤，但也存在不必除去选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的情况。
本发明中提供的细胞群体中包含的细胞可以为源自天然的。在本发明中，源自天然的细胞表示非基因重组细胞、或不是源自外来基因导入动物或转化细胞的细胞、或不是通过细胞融合技术制作的细胞，但含义不是指天然存在的细胞本身，而指通过培养技术制造的细胞。非基因重组细胞在本发明中是指：不是使用基因改造技术而人为地使个体的遗传信息改变的动物的血液中分离的单核的细胞制造的细胞的含义。另外，也不是对于从血液分离的单核的细胞、造血干细胞使用基因改造技术而人为地使遗传信息改变而制备的细胞群体。不是源自外来基因导入动物或转化细胞的细胞在本发明中是指：以未经将外来基因导入生物或细胞的步骤的方式制作的细胞。对不是通过细胞融合技术制作的细胞而言，是指不是通过细胞融合而产生的细胞，也并不是源自这样细胞的细胞的意思，例如是指没有进行采用细胞融合等的细胞表面抗原的表达调节的意思。
(细胞粘附分子)
根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以为CD11c高表达(CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高)。CD11c为作为整联蛋白αX已经为人知晓的细胞粘附分子。CD11c已知在单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，骨髓类的树突细胞中表达。CD11c已知与CD18结合，参与细胞粘附等。
经培养一定时期的细胞群体中CD11c的表达的程度可以通过以下进行判断：使用流式细胞术，将该细胞群体中的CD11c表达量与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体(对照，已知为CD11c低表达)中的CD11c表达量相比而判断。在经培养一定时期的细胞群体中CD11c的表达比对照表达量高的情况下，可以判断为存在高表达。
根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以为CD11a/CD18高表达(CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11a高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD18高)。对CD11a/CD18而言，别名为LFA-1，已知在T淋巴细胞中分布，与ICAM-1或ICAM-4进行相互作用，参与白细胞的粘附、趋化性，诱导免疫耐受。
经培养一定时期的细胞群体中CD11a/CD18的表达的程度可以通过以下进行判断：使用流式细胞术，将该细胞群体中的CD11a/CD18表达量与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体(对照，已知为CD11a/CD18低表达)中的CD11a/CD18表达量相比而判断。在经培养一定时期的细胞群体中的CD11a/CD18的表达比对照表达量高的情况下，可以判断为存在高表达。
根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以进一步高表达选自由整联蛋白α1，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α5，ICAM-1，及整联蛋白β1组成的组中的任一种。通过与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体(对照，已知为整联蛋白α1，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α5，ICAM-1，整联蛋白β1阴性或低表达)的比较，可以判断存在高表达。
整联蛋白α4/整联蛋白β1的别名为VLA-4，已知与纤维粘连蛋白，VCAM-1等进行相互作用，参与淋巴细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞向炎症部位的迁移。整联蛋白α1/整联蛋白β1的别名为VLA-1，已知在广泛的细胞中分布，与胶原，层粘连蛋白进行相互作用，参与轴突生长、淋巴细胞浸润。整联蛋白α3/整联蛋白β1的别名为VLA-3，已知在广泛的细胞中分布，与层粘连蛋白-5，TSP，uPAR进行相互作用，参与肾脏、肺的形态发生，癌症的浸润、转移。
根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞可以进一步为整联蛋白α1阳性、整联蛋白α3阳性及整联蛋白β3阴性。如后述的实施例1的图1C及D中所述的那样，培养前的NK细胞(初代NK)为整联蛋白α1，α3及β3中的任一项均阴性。另一方面，已知在培养2周之后的NK细胞为整联蛋白α1，α3及β3中的任一项均阳性(Maenpaa等，Int.J.Cancer：53，850-855，1993，表II，III，图2)。根据本发明提供的细胞群体中的CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞与以往的NK细胞的培养物之间，至少在整联蛋白α1阳性、整联蛋白α3阳性及整联蛋白β3阴性的方面不同。
根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以为整联蛋白α4/整联蛋白β1高表达。根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以为整联蛋白α1/整联蛋白β1高表达。根据本发明提供的包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性细胞的细胞群体中，该CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以为整联蛋白α3/整联蛋白β1高表达。
根据本发明提供的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高/整联蛋白α1高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高/ICAM-1高，或CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c高/CD11a高/CD18高/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高/ICAM-1高/整联蛋白β1高，或CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高/ICAM-1高，或
CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高/ICAM-1高/整联蛋白β1高细胞群体。
根据本发明提供的NK样细胞群体中包含的上述特定的NK样细胞可以为选自由CD16及CD56组成的组中的任一者或两者阳性。例如：根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体中包含的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以为选自由CD16及CD56组成的组中的任一者或两者阳性。根据本发明提供的NK样细胞群体中包含的上述特定的NK样细胞可以为选自由CXCR1及CXCR4组成的组中的任一者或两者阴性。
根据本发明提供的NK样细胞群体中，可以为选自由CD3及CD19组成的组中的任一种为阳性的细胞的比率低于10％。在细胞群体中，这些细胞的比率可以通过流式细胞法分析。优选细胞群体中的选自由CD3及CD19组成的组中的任一种为阳性的细胞的比率低于5％，更优选低于2％。这是由于认为细胞群体中CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比率更高的一者的肿瘤细胞毒活性更高。
(趋化性及浸润)
根据本发明提供的NK样细胞群体能够具有升高的朝向肿瘤部位的趋化性。另外，根据本发明提供的NK样细胞群体能够对肿瘤团块浸润。对肿瘤团块的浸润是指细胞(例如：免疫细胞)侵入到肿瘤团块内部的状态。
朝向肿瘤部位的趋化性可以通过细胞迁移测定进行评价。细胞迁移测定可以在肿瘤细胞的存在下，通过Transwell法等实施。
对根据本发明提供的NK样细胞群体而言，与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体相比，能够具有升高的朝向肿瘤部位的趋化性。基于本发明人等的研究，认为与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体相比，根据本发明提供的NK样细胞群体中，趋化因子受体CCR5，CXCR3及CCR6的表达高与升高的朝向肿瘤部位的趋化性相关。
对肿瘤团块的浸润可以根据由相对于肿瘤细胞株制作的球状体的细胞伤害测定进行评价。球状体为经三维细胞培养的细胞凝聚团块，细胞间的相互作用和细胞外基质发达。还存在在外缘部中存在紧密连接的情况，通过内部为低氧状态且形成低pH，由此代谢、功能活性更接近于生物体内的组织。肿瘤球状体作为用于药物开发的新一代的体内实验模型受到期待(Hirschhaeuser F.等，J Biotechnol.2010Jul 1；148(1)：3-15；Xiang X.等，2011PLoS ONE 6(1)：e14640.doi：10.1371/journal.pone.0014640；Mil otti E，ChignolaR.，2010PLoS ONE 5(11)：e13942.doi：10.1371/journal.p one.0013942)。例如，可以将根据本发明提供的NK样细胞进行荧光标记，观察向球状体内部的转移。从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞不对球状体浸润，而根据本发明提供的NK样细胞能够对球状体浸润。认为对于对实体肿瘤浸润而言，细胞粘附分子LFA-1/VLA-4较为重要(Sa ckstein R，etal.Lab Invest.2017)。基于本发明人等的研究，认为与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体相比，根据本发明提供的NK样细胞群体中，细胞粘附分子的表达高与朝向球状体的浸润有关。
作为实体肿瘤团块使用了由IMR32细胞株(人MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞株)形成的球状体的细胞伤害测定中，从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞虽然存在于球状体的周边，但没有发生浸润。另外，抗GD2抗体(Unituxin(注册商标))被认为在单独时能够伤害IMR32细胞株(Doronin等，BMC Cancer 2014，14：295)，但对于形成了球状体的IMR32，在显微镜下未观察到细胞受损伤的那种形态变化。一方面，根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体对球状体浸润，在测定开始的12小时以后，球状体开始崩解。
此外，与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞相比，在根据本发明提供的NK样细胞群体中，相对于球状体的细胞毒活性非常高。另外，对相对于球状体的细胞毒活性而言，在将根据本发明提供的NK样细胞群体与抗体组合使用的体系、和不与抗体组合使用的体系的两个体系间没有显著性的差异。
根据本发明提供的NK样细胞群体如上所述能够发挥高的细胞毒活性。除非有特别记载的情况，细胞毒活性是指对象细胞(效应细胞，E)的针对靶细胞(T)的溶解能力。细胞毒活性可以利用由于效应细胞而导致死亡的靶细胞的百分率(％)表示，根据下式求出。
(与效应细胞共培养的情况中的细胞死亡-自然细胞死亡(阴性对照))/(最大细胞死亡(阳性对照)-自然细胞死亡(阴性对照))×100
将根据本发明提供的NK样细胞作为效应细胞，测定对实体肿瘤团块的细胞毒活性时，靶细胞除了IMR32细胞株的球状体的以外，可以使用由胶质瘤，乳腺癌，大肠癌，卵巢癌，前列腺癌等肿瘤细胞株制作的球状体等，但不限于这些。可使用的球状体的大小可以为直径约150～500μm，但不限于这些。效应细胞和靶细胞、活细胞和死细胞可以利用被放射性物质、荧光染料等标记了的抗体等试剂进行区别以及定量。将NK样细胞作为效应细胞时的细胞毒活性可以通过以下测定：例如将IMR32细胞株的球状体作为靶标，在培养时间为8～48小时、优选为12～24小时的条件下测定。
本发明提供对实体肿瘤浸润的CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞。认为以往的NK细胞为对实体肿瘤不奏效，但根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体对实体肿瘤发生浸润，能够伤害肿瘤细胞。对实体肿瘤浸润可以通过以下判断：观察到CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞转移到肿瘤团块(球状体)的内部，并且肿瘤团块的形状经时地发生变化，肿瘤团块发生崩解而判断。肿瘤细胞受到伤害可以通过采用流式细胞术的死细胞的数量的增加而确认。
(体内中的对实体肿瘤的治疗效果)
根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-NK样细胞群体可以具有体内中的对实体肿瘤治疗效果。
体内中的对实体肿瘤的治疗效果可以通过将人肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠等动物中，观察经过而评价。对于预防效果，也可以与移植同时进行NK样细胞群体的施用而进行评价。或者，对于治疗效果，也可以根据确认肿瘤的生长起，进行约5天的NK样细胞群体施用而进行评价。评价可以通过解剖进行安乐死的小鼠，观察被荧光标记的肿瘤细胞而实施。
在体内的治疗计划中，存在对于动物进行单次或多次施用的情况。不论是采用独立的单次施用、或采用连续注入，NK样细胞群体以每1kg 1×105细胞～1×108细胞作为初期候选用量。可以与NK样细胞群体一起施用IL-2。IL-2可以用于在动物内保持被施用的NK样细胞的活性而施用。IL-2以每1只1,000～10,000IU作为初期候选用量。在体内的治疗计划中，可以通过任意适当的办法采用肌内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。对于治疗效果的评价可以通过观察被荧光标记的肿瘤细胞，和/或计算荧光阳性区域的像素数而进行。
根据本发明提供的NK样细胞群体与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体相比，可以使移植至免疫缺陷小鼠的SKOV3细胞(人卵巢癌细胞株)的数量减少。根据本发明提供的NK样细胞群体可以基本消灭移植至免疫缺陷小鼠的SKOV3细胞(人卵巢癌细胞株)。移植至免疫缺陷小鼠的SKOV3细胞在无治疗的情况下，确认形成肿瘤结节，而在利用根据本发明提供的NK样细胞群体进行治疗的小鼠中，SKOV3细胞基本消灭，未观察到肿瘤结节。根据在体外示出的对肿瘤团块的浸润能力和体内的治疗效果的结果，可以说根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-NK样细胞群体可以对实体肿瘤浸润而伤害肿瘤细胞。
[NK样细胞群体的制备方法]
本发明提供CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞群体的制备方法，包括，制备初代单核的细胞群体的步骤；从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞的步骤；从初代单核的细胞群体中除去选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的步骤；将除去该CD3阳性细胞以及选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种后剩余的细胞群体在包含IL-2的培养基中培养的步骤。
(初代单核的细胞群体)
在本发明的制备方法中，初代单核的细胞群体可以通过从受试者采集的血细胞中分离单核的细胞的步骤得到。血细胞存在从选自由外周血，脐带血，骨髓及淋巴结组成的组中的任一种采集的情况。对血细胞而言，存在从外周血利用单采血液成分术(apheresis)采集的情况。培养前的初代单核的细胞群体可以为不包含CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞的那些。
在本发明的制备方法中，初代单核的细胞群体存在从选自由：源自选自由胚胎干细胞、成体干细胞及人工多功能性干(iPS)细胞组成的组中的任意干细胞的造血干细胞、源自脐带血的造血干细胞、源自外周血的造血干细胞、源自骨髓血的造血干细胞、脐带血单核的细胞、外周血单核的细胞组成的组中的至少1种细胞制备的情况。作为初代单核的细胞群体的供体的受试者，存在源自为作为接受者的患者自身、或该患者的近亲属、或与患者没有血缘关系的人的情况。对受试者而言，存在健康的人和罹患疾病的患者的情况。根据本发明提供的NK样细胞存在源自与接受者的主要组织相容性抗原(MHC)和杀伤免疫球蛋白样受体(Killer Immunoglobulin-like Receptor：KIR)不一致的供体的情况。
(CD3阳性的除去，以及选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的除去)
在本发明的制备方法中，存在通过从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞的步骤而除去T细胞和/或NKT细胞的情况。对T细胞的除去而言，存在通过如下步骤进行实现的情况：除去除了CD3阳性细胞以外，选自CD4阳性细胞及CD8阳性细胞中的一种或两种。另外，在本发明的制备方法中，对从初代单核的细胞群体中除去选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的步骤而言，单核细胞的除去存在以下情况：通过将选自CD14阳性细胞，CD36阳性细胞，及HLA-DR阳性细胞中的一种，两种，或3种细胞除去的步骤而实现。B细胞的除去存在以下情况：通过将选自CD19阳性细胞及CD20阳性细胞中的一种或两种细胞除去的步骤而实现。
在本发明的制备方法中，CD3阳性细胞的除去和选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的除去可以同时进行，也可以在不同步骤中进行。单核细胞的除去和B细胞的除去可以同时进行，也可以在不同步骤中进行。
本发明的NK样细胞的制备方法中，存在包括从初代单核的细胞群体中除去选自由树突细胞，粒细胞及巨噬细胞组成的组中的任一种的步骤的情况。选自由树突细胞，粒细胞及巨噬细胞组成的组中的任一种的除去存在以下情况：通过除去选自CD66b阳性细胞，CD123阳性细胞，及HLA-DR阳性细胞中的一种，两种或三种细胞的步骤而实施。
本发明的NK样细胞的制备方法中，存在包括从初代单核的细胞群体中除去造血祖细胞的步骤的情况。除去造血祖细胞的步骤存在通过除去CD34阳性细胞的步骤而实现的情况。
本发明的NK样细胞的制备方法中，存在包括从初代单核的细胞群体中除去红细胞及成红细胞系祖细胞的步骤的情况。除去红细胞及成红细胞系祖细胞的步骤，存在通过除去血型糖蛋白A(glycophorin)阳性细胞的步骤实现的情况。
初代单核的细胞群体可以使用本领域技术人员已知的各种方法进行制备。例如，在从如脐带血及外周血那样的血液中回收单核的细胞的时候，可以使用密度离心法。进一步，初代单核的细胞群体，及从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞以及选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种后剩余的细胞群体，可以利用针对细胞表面标记的特异性的抗体进行免疫荧光染色，使用细胞分选仪或流式细胞仪进行分离、鉴定。另外，从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞以及选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种后剩余的细胞群体，可以使用包括但不限于由Invitrogen公司销售的Dynal公司制Dynabeads(商标)，Miltenyi Biotech公司的CliniMACS(商标)的免疫磁性珠而分离除去表达特定的细胞表面抗原的细胞而制备。
另外，也可以利用针对T细胞，NKT细胞，单核细胞，B细胞，树突细胞，粒细胞，巨噬细胞，红细胞，成红细胞系祖细胞或造血祖细胞的特异性的结合配偶体，使T细胞，NKT细胞，单核细胞，B细胞，树突细胞，粒细胞，巨噬细胞，红细胞，成红细胞系祖细胞或造血祖细胞选择性受伤或被杀灭。
需要说明的是，从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞的步骤，和从初代单核的细胞群体中选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种除去的步骤可以为一起除去CD3阳性细胞，单核细胞及B细胞的步骤。除去CD3阳性细胞，单核细胞及B细胞的步骤也可以为将其它细胞类型，例如：选自由红细胞，成红细胞系祖细胞，造血祖细胞，树突细胞，粒细胞，巨噬细胞及NKT细胞组成的组中的任一种与CD3阳性细胞，单核细胞及B细胞一起除去的步骤。
(培养基)
用于培养从初代单核的细胞(mononuclear cell)群体中除去CD3阳性细胞以及选自由单核细胞(monocyte)及B细胞组成的组中的任一种后剩余的细胞群体的细胞培养用培养基包括KBM501培养基(Kohjin-bio株式会社，包含IL-2 1,750JRU/ml，人NK细胞初代培养用)，CellGro SCGM培养基(CellGenix，岩井化学药品株式会社)，X-VIVO15培养基(lonza，TAKARABio株式会社)，COSMEDIUM 008(Cosmo Bio，包含IL-2 1,750JRU/ml，人NK细胞初代培养用)，CTS AIM V培养基GibcoTMCTSTMAIM VTM培养基(Thermo Fisher Scientific，用于对T细胞及树突细胞进行增殖和操作的已知组成的无血清培养基)，CTS OpTmizer T CellExpansion Basal培养基(Thermo Fisher Scientific，人T淋巴细胞的生长及增殖用)，IMDM，MEM，DMEM，RPMI-1640等，但不限于这些。
可以在培养基中利用可以实现本发明的目标的浓度添加白介素-2(IL-2)。对IL-2的浓度而言，存在100IU/mL～5000IU/mL的情况。IL-2的浓度也可以为2500IU/mL～2813IU/mL。IL-2优选具有人的氨基酸序列，从安全方面优选利用重组DNA技术进行生产。IL-2的浓度存在以日本国内标准单位(JRU)及国际单位(IU)表示的情况。1IU为约0.622JRU。
可以在培养基中，添加受试者的自体血清、可以从例如BioWhittaker公司及其他获取的人AB型血清、从日本红十字会可以获取的献血人血清白蛋白。自体血清及人AB型血清优选以1～10％的浓度添加，献血人血清白蛋白优选以1～10％的浓度添加。培养基中包含的血清可以为人血清或非人动物血清，优选为人血清白蛋白。可以代替血清而使用可以从例如Corefront公司及其他获取的血小板提取物(UltraGroTM等)。血小板提取物优选以1～10％的浓度添加。
在培养基中，存在以不破坏NK样细胞群体的扩增效果为条件而包含适当的蛋白质，细胞因子，抗体，化合物以及其它成分的情况。细胞因子存在为选自由白介素3(IL-3)，白介素7(IL-7)，白介素12(IL-12)，白介素-15(IL-15)，白介素-21(IL-21)，干细胞因子(SCF)，及FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)组成的组中的情况。IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、SCF及Flt3L优选具有人的氨基酸序列，从安全方面优选利用重组DNA技术进行生产。
培养基优选为无血清培养基。无血清培养基优选包含血清白蛋白、转铁蛋白及胰岛素。用于培养淋巴细胞的无血清培养基已经开发、市售，在本发明中可以利用它们。无血清培养基的优选例之一为在基础培养基中作为支持人T细胞的增殖的组成而添加了市售的CTS Immune Cell SR(Thermo Fisher Scientific)而成的那些。培养基中包含的血清白蛋白可以为人血清白蛋白或非人动物血清白蛋白，优选为人血清白蛋白。
培养可以通过无饲养细胞培养进行。这是由于如果在培养中使用饲养细胞，则对制备的细胞群体产生感染的风险。
对培养基的交换或添加或补充而言，以可以得到期望的细胞数的NK样细胞作为条件，可以在培养开始之后任何时候进行，优选为每3～5天。
培养时使用的培养容器包括可以商业获取的平皿，培养用袋，烧瓶，板，多孔板，但不限于这些。对培养条件而言，以不破坏NK样细胞的扩增效果为条件，没有特别限定，通常为在37℃，5％CO2及饱和水蒸气气体氛围中的培养条件。对培养时期而言，以将NK样细胞群体中的细胞扩增至期望的细胞数作为条件，没有特别限定。培养时期电可以根据培养条件而变化。如果是37℃，5％CO2及饱和水蒸气气体氛围中的培养条件，则培养时期可以为4～15天。培养时期的上限可以为21天前后。
通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+/整联蛋白α1+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+/整联蛋白α1+/整联蛋白α3+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+/整联蛋白α1+/整联蛋白α3+/整联蛋白α4+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+/整联蛋白α1+/整联蛋白α3+/整联蛋白α4+/整联蛋白α5+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+/整联蛋白α1+/整联蛋白α3+/整联蛋白α4+/整联蛋白α5+/ICAM-1+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/CD11c+/CD11a+/CD18+/整联蛋白α1+/整联蛋白α3+/整联蛋白α4+/整联蛋白α5+/ICAM-1+/整联蛋白β1+细胞群体。通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高，CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高/ICAM-1高，或CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-/整联蛋白α1高/整联蛋白α3高/整联蛋白α4高/整联蛋白α5高/ICAM-1高/整联蛋白β1高群体。另外，这些NK样细胞群体中包含的上述特定的NK样细胞可以是选自由CD16及CD56组成的组中的任一者或两者为阳性。例如，这些NK样细胞群体中包含的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-细胞可以是选自由CD16及CD56组成的组中的任一者或两者为阳性。这些NK样细胞群体中包含的上述特定的NK样细胞可以是选自由CXCR1及CXCR4组成的组中的任一者或两者为阴性。
在基于流式细胞法的细胞群体的细胞表面抗原的表达分析中，可以测量表达各表面抗原的细胞的数量，因此，细胞群体内中的表达各表面抗原的细胞的比例(性率)是知道的。例如：以数学上的解释，在细胞群体内表达表面抗原A的细胞在全部细胞中存在50％，表达表面抗原B的细胞在全部细胞中为50％的话，存在表达表面抗原A及B的细胞在全部细胞中为0％的可能性。但是，表达表面抗原A的细胞在全部细胞中为90％，表达表面抗原B的细胞在全部细胞中为90％的话，则一起表达表面抗原A及B的细胞在全部细胞中为0％的可能性是没有的。
在后述的实施例1的基于流式细胞法的细胞群体的细胞表面抗原的表达分析中，在通过培养得到的细胞群体中，明确了CCR5阳性细胞存在92.7％，CCR6阳性细胞存在96.3％，及CXCR3阳性细胞存在51.4％。根据该结果，显示在细胞群体内存在CCR5和CCR6和CXCR3共阳性的细胞。明确了对于CD11a阳性(高表达)细胞及CD11c阳性(高表达)细胞而言，也在通过培养得到的细胞群体中分别存在99.8％及96.8％。根据该结果，显示在细胞群体内存在CCR5和CCR6和CXCR3和CD11a和CD11c共阳性的细胞。明确了对于整联蛋白α1阳性细胞及整联蛋白α3阳性细胞，也在通过培养得到的细胞群体中，分别存在91.0％及75.3％。根据该结果，显示在细胞群体内存在CCR5和CCR6和CXCR3和整联蛋白α1和整联蛋白α3共阳性的细胞。
就通过培养得到的给定的NK样细胞群体中的上述特定的NK样细胞的纯度为(纯度(％)＝上述NK样细胞的个数/全部细胞的个数×100)而言，可以为30％以上。考虑到特定的NK样细胞群体的纯度越高治疗效果越高，因此，优选纯度为30％以上，35％以上，40％以上，45％以上，或50％以上。另外，上述特定的NK样细胞群体的纯度也可以更高，可以为55％以上，60％以上，65％以上，70％以上，75％以上，80％以上，85％以上，90％以上，或95％以上。
通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞，而选自由CD3，CD4，CD8，CD14，CD19及CD36组成的组中的任一种为阳性的细胞被除去的细胞群体。另外，通过培养得到的给定的NK样细胞群体可以为包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞，而选自由CD3，CD4，CD8，CD14，CD19及CD36组成的组中的任一种为阳性的细胞的比率低于10％。这些细胞的比率可以采用流式细胞法分析。细胞群体中的选自由CD3，CD4，CD8，CD14，CD19及CD36组成的组中的任一种为阳性的细胞的比率优选低于5％，更优选低于2％。这是由于认为细胞群体中CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比率更高的一者的肿瘤细胞毒活性更高。
本发明的制备方法中得到的NK样细胞群体在使期望的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-NK样细胞群体优先地进行培养、扩增的意义上，可说是浓缩NK样细胞群体。
可以在通过培养得到的给定的NK样细胞群体中，除了目标的NK样细胞以外，包含NK细胞前体，T细胞，NKT细胞，造血祖细胞等。培养之后，存在使用例如密度离心法，免疫磁性珠，FACS，流式细胞术等来选择目标的NK样细胞或其群体的情况。存在使用例如：抗CD3抗体，抗CD16抗体，抗CD34抗体，抗CD36抗体，抗CD69抗体，抗CD94抗体，抗CD107a抗体，抗KIR3DL1抗体，抗KIR3DL2抗体，抗KIR2DL3抗体，抗KIR2DL1抗体，抗KIR2DS1抗体，抗KIR2DL5抗体，抗NKp46抗体，抗NKp30抗体，抗NKG2D抗体等，将目标的NK样细胞群体选择地分离的情况。存在抗体为单克隆抗体、多克隆抗体等的情况。目标的NK样细胞群体的选择中，存在进行将T细胞，NKT细胞，造血祖细胞以及其它细胞选择性除去的情况。
[NK样细胞群体的利用]
本发明提供药物组合物，其包含NK样细胞群体，及药学上允许的添加物。药学上允许的添加物，可例示例如：等渗化剂、pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、冷冻保护剂、抗生素等。具体而言，可列举：水、乙醇、氯化钠、葡萄糖、白蛋白等。本发明的药物组合物中包含的NK样细胞群体优选为上述根据本发明提供的CCR5+/CCR6+/CXCR3+/CD3-NK样细胞群体。另外，本发明的药物组合物中包含的细胞群体优选为肿瘤细胞毒活性高的NK样细胞群体，更优选为对实体肿瘤浸润的NK样细胞群体。
本发明的药物组合物可以对根据本发明的制备方法制备的NK样细胞具有不同的HLA基因型的患者进行施用。
药物组合物典型的为将NK样细胞悬浊于溶液而成的形态。对用于悬浊NK样细胞的溶液而言，例如：包含DMSO的冷冻用保护液、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基、血清等是通常的。溶液存在作为药物及准药而包含在药学上允许的载体的情况。
本发明的药物组合物存在用于治疗传染病或癌症而使用的情况。本发明的药物组合物还可以适用于对NK样细胞具有敏感性的各种疾病的治疗中。本发明的药物组合物还可以适用于对NK样细胞具有敏感性的各种疾病的预防中。疾病例如包括：口腔癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、肝癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、白血病、基于病毒、细菌等的传染病，但不限于这些。本发明的细胞疗法存在单独，或与外科疗法、化学疗法、放射疗法、抗体药物等组合而实施的情况。在使用了本发明的药物组合物的细胞疗法中，存在NK样细胞被施用到例如：静脉、动脉、皮下、腹膜内等的情况。
本发明的药物组合物可以与IL-2制剂一起施用。IL-2制剂可以为基因重组型，可以为替西白介素(Teceleukin)(基因重组)。
本发明的药物组合物即使不必与抗体药物组合使用，也可以期待较高的治疗效果。作为基于已知的NK细胞细胞毒的机制之一，已知抗体依赖性细胞毒性(Antibodydependent cellular cytotoxicity，ADCC)。NK细胞在其细胞表面上具有Fc受体(CD16)，而ADCC为NK细胞经由Fc受体与结合在靶细胞的抗体进行结合，施行靶细胞的伤害的机制。期待ADCC活性，存在与已知的与NK细胞和CD16的亲和性高的抗体组合使用的情况。然而，本发明的NK样细胞群体即使不与抗体组合使用，也具有高细胞毒活性。对本发明的药物组合物中包含的NK样细胞群体而言，知晓与从外周血得到的没有进行实质的培养的NK细胞群体相比，具有升高的对肿瘤部位的趋化性，此外，对肿瘤团块进行浸润。在细胞伤害测定中，在将NK样细胞群体和抗体组合使用的体系，和将NK样细胞群体单独使用的体系中，两种体系中显示了高细胞毒活性，没有显著性的差异。这点显示，即使不引起ADCC活性，NK样细胞也对肿瘤细胞有较高的细胞毒活性。
本发明的药物组合物存在可以与抗体药物组合使用的情况。作为能和本发明的药物组合物组合使用的抗体的具体例，可列举替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)，碘131(iodine131)，卡妥索单抗(catumaxomab)，博纳吐单抗(blinatumomab)，莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)，阿昔单抗(abciximab)，利妥昔单抗(rituximab)，巴利昔单抗(basiliximab)，英利昔单抗(infliximab)，西妥昔单抗(cetuximab)，本妥昔单抗(brentuximab)，司妥昔单抗(siltuximab)，地努妥昔单抗(dinutuximab)，奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)，达昔单抗(daclizumab)，帕利珠单抗(palivizumab)，曲妥珠单抗(trastuzumab)，gemtuzumab，阿仑单抗(alemtuzumab)，奥马珠单抗(omalizumab)，艾伐珠单抗(efalizumab)，贝伐珠单抗(bevacizumab)，那他珠单抗(natalizumab)，妥西珠单抗(tocilizumab)，雷珠单抗(ranibizumab)，依库珠单抗(eculizumab)，培瑟妥珠单抗(certolizumabpegol)，莫加利珠单抗(mogamulizumab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，曲妥珠单抗(trastuzumab)，奥比妥珠单抗(obinutuzumab)，维多利珠单抗(vedolizumab)，兰洛利珠单抗(pembrolizuma)，艾达赛珠单抗(idarucizumab)，美泊利珠单抗(mepolizumab)，依洛妥珠单抗(elotuzumab)，达雷妥木单抗(daratumumab)，艾塞吉珠单抗(ixekizumab)，瑞司利珠单抗(reslizumab)，阿达姆单抗(adalimumab)，帕尼姆单抗(panitumumab)，戈利木单抗(golimumab)，乌司特单抗(ustekinumab)，卡那单抗(canakinumab)，奥法妥木单抗(ofatumumab)，迪诺舒单抗(denosumab)，艾匹利木单抗(ipilimumab)，贝利木单抗(belimumab)，雷昔巴库单抗(raxibacumab)，雷姆赛卢单抗(ramucirumab)，尼沃鲁单抗(nivolumab)，瑟库吉努单抗(secukinumab)，依沃苏单抗(evolocumab)，阿利苏单抗(alirocumab)，及奈西妥木单抗(necitumumab)。
能和本发明的药物组合物组合使用的抗体优选为与CD16的亲和性高的。另外，在本发明的药物组合物中，也可以存在抗体至少一部分与NK样细胞结合的情况。
本发明的药物组合物的制备，优选根据适合于药物及准药的制造管理及品质管理规定的条件(良好操作规范(good manufacturing practice)，GMP)及再生医疗等产品的制造管理及品质管理的基准(良好的基因、细胞和基于组织的产品制造实践(Good Gene，Cellular，and Tissue-based Products Manufacturing Practice)，GCTP)而实施。
本发明提供NK样细胞群体用于在实体肿瘤的治疗中使用的药物的制备中的用途。本发明提供用于使用对实体肿瘤浸润的NK样细胞群体。
本发明提供用于患者的实体肿瘤的治疗及预防的方法，包括对患者施用治疗的有效量的NK样细胞群体的步骤。本发明的NK样细胞群体可以伤害实体肿瘤的肿瘤细胞，因此，对患者的实体肿瘤的治疗及预防有用。
本发明提供用于上述治疗用途或研究用途中使用的试剂盒。试剂盒可以包含一个或多个容器，如袋、管形瓶及管等。容器可以根据任选以与药学上允许的添加物一起包含的药物组合物形式包含根据本发明提供的细胞群体。试剂盒可以以与另外的药品或抗体药物的组合的形式包含根据本发明提供的包含细胞群体的容器。对试剂盒而言，根据任选与关于本说明书记载的治疗用途或研究用途的标签或说明书一起包含细胞群体。
在本发明中，对于脐带血及外周血的全血的采集、和自体血清的制备、和从全血的单核的细胞的制备、和该单核的细胞的培养前后的细胞数的测定、和培养前后的单核的细胞中的NK细胞、T细胞、造血前驱细胞其它细胞类型的构成比率的测定、和NK样细胞的扩增倍率的算出、和对测定误差、有差异性的统计分析而言，只要采用本领域技术人员众所周知的任何方法实施即可。
以下进行说明的本发明的实施例仅为例示的目的，并不意在对本发明的技术范围进行限定。本发明的技术范围仅由权利要求书的记载而限定。在不脱离本发明的主旨的条件下，可以进行本发明的改变，例如，本发明的构成条件的追加、删除及取代。
实施例
[实施例1]
<趋化因子受体的表达确认>
健康人志愿者的外周血通过密度离心进行分离，得到了外周血单核的细胞(下文中，PBMC)。以每1×107细胞使用CliniMACS CD3(Miltenyi Biotech公司，目录编号130-017-601)5μL而从PBMC中除去CD3阳性细胞(将在此回收的细胞记作“初代NK”)，培养剩余的细胞。培养中，将细胞以5×105细胞/mL的密度悬浊于KBM-501(Kohjin-bio，5％AB血清添加)中，使用6孔板(Thermo Fisher Scientific，140675)或T-75烧瓶(Thermo FisherScientific，156499)培养14天(第9天添加培养基)。将该细胞群体的细胞记作“14天培养细胞”及“本发明的细胞”。
趋化因子受体的分析使用了14天培养结束后的本发明的细胞，及作为对照的培养前回收的细胞的“初代NK”。分析采用流式细胞法进行，使用了BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Bioscience公司)。14天培养细胞及初代NK的荧光标记通过将各细胞在将表1所示的各抗体以终浓度1μg/mL悬浊在PBS(和光纯药工业)中的抗体溶液中，于2～8℃暗处孵育30分钟而进行。
[表1]
| 抗体名 | Cat. | 制造商 | 备考 |
| FITC标记抗人CD181(CXCR1)抗体 | 320605 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| PE/Cy7标记抗人CD182(CXCR2)抗体 | 320715 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| PE标记抗人CD183(CXCR3)抗体 | 353705 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| PerCP/Cy5.5标记抗人CD184(CXCR4)抗体 | 306515 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| PE标记抗人CD192(CCR2)抗体 | 357205 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| PE标记抗人CD194(CCR4)抗体 | 359411 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| PE/Cy7标记抗人CD195(CCR5)抗体 | 359107 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| FITC标记抗人CD196(CCR6)抗体 | 353411 | Biolegend | 趋化因子受体 |
| Pacific BlueTM标记抗人CD56(NCAM)抗体 | 318325 | Biolegend | NK细胞标记 |
| APC/Cy7标记抗人CD3抗体 | 300426 | Biolegend | T细胞标记 |
将结果示于图1A。14天培养的本发明的细胞强表达趋化因子受体CCR5，CCR6，及CXCR3，弱表达CCR2。CXCR1及CXCR2没有表达。
已知通常CCR5，CCR6，CXCR3为MDSC(骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derivedsuppressor cells))、Treg等免疫抑制性的细胞群体所具有，这些细胞在生物体内中称为冷性肿瘤(Cold tumor)状态的肿瘤组织中较多存在。考虑到本发明的细胞与它们具有相同的趋化性，预想即使对免疫治疗极其难于奏效的冷性肿瘤也能够有效地浸润，伤害。
14天培养细胞群体(经培养后)中的CCR5阳性细胞，CXCR3阳性细胞，CCR6阳性细胞的比例分别为92.7％，96.3％，51.4％(图1A)。因此，由于92.7％×96.3％×51.4％＝45.88％，因此14天培养细胞群体中CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性的细胞概率性计算为45.9％。
<细胞粘附分子群的表达确认>
在细胞粘附分子群的分析中，与实施例1同样地使用了14天培养的本发明的细胞，及作为对照的初代NK。采用流式细胞法进行分析。将用于荧光标记的抗体记载于表2。荧光标记以与上述相同的方法进行。
[表2]
| 抗体名 | Cat. | 制造商 | 备考 |
| APC标记抗人CD11a抗体 | 301212 | Biolegend | ICAM-1 |
| APC标记抗人CD11b抗体 | 301309 | Biolegend | 整联蛋白αM |
| PerCP/Cy5.5标记抗人CD11c抗体 | 337210 | Biolegend | 整联蛋白αX |
| PE标记抗人CD29抗体 | 303003 | Biolegend | 整联蛋白β1 |
| APC标记抗人CD18抗体 | 302113 | Biolegend | 整联蛋白β2 |
| APC标记抗人CD61抗体 | 336411 | Biolegend | 整联蛋白β3 |
| PE标记抗小鼠CD49a抗体 | 328303 | Biolegend | 整联蛋白α1 |
| FITC标记抗人CD49b抗体 | 314306 | Biolegend | 整联蛋白α2 |
| PE标记抗人CD49c抗体 | 343803 | Biolegend | 整联蛋白α3 |
| PE标记抗人CD49d抗体 | 304303 | Biolegend | 整联蛋白α4 |
| PE标记抗人CD49e抗体 | 328009 | Biolegend | 整联蛋白α5 |
| APC标记抗人CD31抗体 | 303115 | Biolegend | PECAM-1 |
| Pacific BlueTM标记抗人CD56(NCAM)抗体 | 318325 | Biolegend | NK细胞标记 |
| APC/Cy7标记抗人CD3抗体 | 300426 | Biolegend | T细胞标记 |
将结果示于图1C及D。14天培养的本发明的细胞强表达细胞粘附分子ICAM1，整联蛋白α1，LFA-1α，整联蛋白β2，整联蛋白α3，整联蛋白αX，整联蛋白β2，PECAM-1，整联蛋白α5，整联蛋白α4及整联蛋白β1。
对肿瘤组织的浸润而言，向血管外的泄漏后继续通过间质，对肿瘤细胞团块的粘附以及侵入等多个重要位置中的细胞之间的粘附或与细胞外基质的粘附是必要的，认为本发明中得到的细胞为具有可以实现其中任一种的粘附分子表达模式的细胞。
[实施例2]
<CD3阳性细胞及CD19阳性细胞的含有率>
为了分析CD3阳性细胞及CD19阳性细胞的含有率，与实施例1同样地使用14天培养的本发明的细胞，作为对照使用了PBMC。用于荧光标记的抗体为PE标记抗人CD3抗体(Biolegend，300408)及PerCP-Cy 5.5标记抗人CD19抗体(Biolegend，302230)。荧光标记以与实施例1相同的方法进行。
将结果示于图2。14天培养的本发明的细胞中包含的CD3阳性细胞为0.025％，CD19阳性细胞为0.28％。另一方面，不进行培养的PBMC中包含的CD3阳性细胞为64.7％，CD19阳性细胞为8.57％。
[实施例3]
<对实体肿瘤团块的浸润的确认>
以IMR32球状体作为靶标，观察了本发明的细胞的浸润。
将IMR32细胞(人MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞株)利用胰蛋白酶EDTA剥离，利用RPMI(10％FBS)制备使得为100μL中有3×103细胞，接种于EZ-Bind Shut II(注册商标)微量滴定板(IWAKI，Cat.4870-800LP)中，于37℃培养48～72小时而使其形成了IMR32球状体。将IMR32球状体使用200μL枪头移植到384孔微量滴定板(膜为底，用于高含量影像)(CORNING，Cat.4518)中，每1孔1个，于37℃孵育1～2小时左右而使其与底面粘附。
用于靶细胞的细胞伤害测定的本发明的细胞通过实施例1所述的方法诱导。作为对照使用的NK细胞群体(记作初代NK)为从健康人志愿者的外周血采用密度离心分离的PBMC用EasySepTM人NK细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，Cat.19055)处理，进行分离的。本发明的细胞和初代NK利用PKH26 Red Fluorescent Cell Linker试剂盒(一般细胞膜用)(SIGMA-ALDOLICH，Cat.PKH26GL，以下称为PKH26)染色。
对于附着有IMR32球状体的384孔微量滴定板的1个孔，分别以1×104细胞/20μL(KBM-501，5％AB血清)注入本发明的细胞或初代NK，通过于37℃孵育21小时实施了IMR32球状体的细胞伤害测定。图像的记录为通过BZ-9000(KEYENCE)在对IMR32球状体分别应用本发明的细胞，初代NK，抗GD2抗体之后1，6，12，18，21小时的时间点拍摄，记录。抗GD2抗体使用地努妥昔单抗(UnituxinTM，UnitedTherapeutics公司)，添加至终浓度10μg/mL。
将结果示于图3。可知经PKH26染色的本发明的细胞侵入IMR32球状体内部。另外，在测定开始的12小时以后，肿瘤团块包括中央部开始崩解。经PKH26染色的初代NK集中在IMR32球状体表面，但没有侵入内部。在显微镜下未观察到抗GD2抗体(Unituxin(注册商标))对于形成球状体的IMR32的细胞毒活性。
[实施例4]
<对实体肿瘤团块的细胞毒活性确认>
靶标的IMR32球状体如实施例3所述那样制备，使其附着于384孔微量滴定板中。本发明的细胞及初代NK如实施例3所述那样制备，进行PHK26染色。IMR32球状体的细胞伤害测定中以添加本发明的细胞或仅初代NK，添加本发明的细胞或初代NK和抗GD2抗体，仅添加抗GD2抗体的5组进行，准备了效应细胞和抗GD2抗体都不添加的情况作为对照(对照)。对本发明的细胞或初代NK而言，对于附着有IMR32球状体的384孔微量滴定板的1个孔添加了1×104细胞/20μL(KBM-501，5％AB血清)。抗GD2抗体使用地努妥昔单抗(UnituxinTM，UnitedTherapeutics公司)，以使得终浓度为10μg/mL的方式添加到附着有MR32球状体的384孔微量滴定板中。细胞伤害测定通过在37℃孵育21小时进行。
细胞伤害测定之后，离心(500g，5分钟，4℃)，除去上清之后，添加用PBS稀释的7-AAD溶液(Beckman Coulter，A07704)，悬浊，于室温培养10分钟。使用流式细胞仪(BD LSRFortessa，BD Bioscience公司)进行测定，利用FlowJo软件分析。
细胞毒活性利用下式进行计算。需要说明的是，在以下实施例中也同样地计算。
(在与效应细胞培养的情况下的靶细胞的细胞死亡-自然细胞死亡(阴性对照))/(最大细胞死亡(阳性对照)-自然细胞死亡(阴性对照))×100
结果示于图4A～C中。本发明的细胞无论抗GD2抗体的有无，均侵入到IMR32球状体内部，在包括中央部开始崩解(图4A下层)。观察到初代NK不论抗GD2抗体的有无，均集中在IMR32球状体表面，但没有侵入到内部，在抗GD2抗体的存在下，与不存在时相比，更多地积累在IMR32球状体的外围(图4A中层)。
本发明的细胞无论抗GD2抗体的有无，与初代NK相比均显示更高的细胞毒活性(图4C)。
[实施例5]
<基于体内实体肿瘤模型的治疗效果确认>
将为导入GFP的人卵巢癌细胞株的SKOV3细胞在RPMI1640中培养。在6～7周龄的NOG小鼠的腹膜内，以1×105细胞/200μL(用PBS配制)移植了SKOV3细胞(GFP标记的人卵巢癌细胞株，在RPMI1640中培养)。将移植之日作为第0天。之后，在第5天(5天之后)以2.5×106细胞/200μL(用PBS配制)将本发明的细胞或初代NK进行腹膜内(i.p.)施用。另外，在第5，6，7天，每1只以5,000IU施用hIL-2(Imunace，盐野义制药株式会社)。对照组中在第0天以后未进行细胞及hIL-2的施用。治疗日程表示于图5。
在第21天将小鼠安乐死，解剖，通过BZ-9000(Keyence)拍摄肠系膜，通过ImageJ定量GFP阳性区域。在拍摄时中，将肠系膜展开到10cm皿上，使用2倍的物镜，全部拍摄/分析在固定条件(拍摄设备，拍摄面积，激发波长，曝光时间，分析时的过滤(filtering)以及阈值)下实施。对定量的数据使用JMP软件进行统计分析。在单向(One-way)ANOVA(方差分析)之后，使用了Tukey-Kramer法(多重比较检验)。
结果示于图6A及B。在无治疗及施用初代NK的小鼠的肠系膜中观察到肿瘤结节，在施用本发明的细胞的小鼠的肠系膜中未观察到肿瘤结节。对肠系膜的GFP阳性区域的所有像素的总密度而言，无治疗的小鼠最高，然后是施用初代NK的小鼠高，施用本发明的细胞的小鼠中较低。无治疗的小鼠与施用初代NK的小鼠之间没有显著性的差异，在无治疗的小鼠及施用初代NK的小鼠，与施用本发明的细胞的小鼠之间存在显著性的差异(p＜0.01)。这些结果显示，根据本发明的细胞施用将移植至免疫缺陷小鼠的SKOV3细胞消灭了。在体内实体肿瘤模型中确认了本发明的细胞的治疗效果。
[实施例6]
<细胞群体的改良制备方法>
如下所述制备细胞，制作了3个类型的细胞群体。
1)将以下所示的2)及3)的方法中得到的细胞以1∶1混合的细胞(下文中，表示为“NK样+mono”)。
2)使用EasySepTMHuman Monocyte Enrichment Kit WITHOUT CD16DEPLETION(STEMCELL，Cat.19058)从PBMC除去CD2，CD3，CD19，CD20，CD56，CD66b，CD123，血型糖蛋白A阳性细胞之后，以5×105细胞/mL的密度悬浊于KBM-501(5％AB血清)中，利用Nunc EasyFlask 75 FILIT NUNCLON DSI(Thermo Fisher Scientific，Cat.156944)或NuncMULTIDISH 6NUNCLON DELTASI(Thermo Fisher Scientific，Cat.140675)培养14天的细胞(下文中，表示为“浓缩mono”)。
3)使用EasySepTMHuman NK Cell Enrichment Kit(STEMCELL，Cat.19055)从PBMC除去CD3，CD4，CD14，CD19，CD20，CD36，CD66b，CD123，HLA-DR，血型糖蛋白A阳性细胞之后，以5×105细胞/mL的密度悬浊于KBM-501(5％AB血清)中，利用Nunc Easy Flask 75 FILITNUNCLON DSI(Thermo Fisher Scientific，Cat.156944)或Nunc MULTIDISH 6 NUNCLONDELTA SI(Thermo Fisher Scientific，Cat.140675)培养14天的情况(下文中，表示为“浓缩NK样”)。
将培养开始之后第10天的细胞的照片示于图7。在除了浓缩Mono组以外的2组中，确认到许多典型的活化淋巴细胞样的形态的细胞。对于浓缩Mono组，虽然确认到了许多大型而粘附较强的骨髓细胞系的细胞，但也可确认到漂浮的比较小型的细胞。它们的培养状况均良好，在KBM-501中的增殖适当地进行，没有见到显著的细胞凋亡。
<细胞毒活性测定，CD107a阳性率测定>
将K562细胞(人慢性骨髓性白血病细胞株)利用包含10％FBS(NichireiBioscience，171012-500ML)及100单位的青霉素，100μg/mL的链霉素(Nacalai Tesque，26253-84)的RPMI1640培养基(和光纯药工业，189-02025)(下文中，称为10％FBS/RPMI1640)制备为1×106细胞/mL的浓度。将制备的K562细胞使用PKH26 Red FluorescentCell Linker试剂盒(Sigma)染色，制备为2×106细胞/mL。
准备了上述3种类型的细胞群体(NK样+mono，浓缩NK样，浓缩mono)的任一类型与K562细胞的组，仅上述的3类型的细胞群体(NK样+mono，浓缩NK样，浓缩mono)的任一类型的组，作为阴性对照的仅K562细胞的组，作为阳性对照的将K562细胞利用10％福尔马林固定的组。
上述3种类型的细胞群体(NK样+mono，浓缩NK样，浓缩mono)的任一类型与K562细胞以细胞数比1∶1的方式添加到96孔板中之后，混合，于37℃反应2小时。作为顺序，最初在板中添加K562细胞，接着添加200μg/mL的APC标记抗人CD107a抗体※(Biolegend，328620)终浓度为1μg/mL，最后添加了上述3种细胞群体(NK样+mono，浓缩NK样，浓缩mono)。培养之后，离心(500g，5分钟，4℃)除去上清之后，添加用PBS稀释的7-AAD溶液(Beckman Coulter，A07704)，悬浊，于室温培养10分钟后洗涤。使用流式细胞仪(BD LSR Fortessa，BDBioscience公司)进行测定，利用FlowJo软件分析。
结果示于图8A及B。NK样+mono细胞群体及浓缩NK样细胞群体显示了高细胞毒活性。
※：CD107a存在于NK细胞内颗粒中，当脱颗粒(放出穿孔素，颗粒酶)时转移到细胞膜表面上，因此CD107a阳性间接显示了NK攻击。
<趋化因子受体的表达确认>
对于利用本实施例的改良制备方法(浓缩NK样细胞群体，及NK样+mono细胞群体作为材料的制备方法)制作的NK样细胞中的趋化因子受体CCR4，CCR5，CCR6，CXCR3及CXCR4的表达，以实施例1所述的方法进行了实验。
将结果示于图9。根据本实施例的改良制备方法可以得到包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性细胞的细胞群体。另外可知根据供体而存在CCR6表达不同的情况。
Claims (8)
1.细胞群体，其包含CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞，
所述CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞
(i)进一步为CD11a高表达及CD11c高表达，所述高表达通过与外周血得到的没有进行实质培养的NK细胞群体中的表达的比较而判断，
(ii)进一步为整联蛋白α1阳性、整联蛋白α3阳性及整联蛋白β3阴性。
2.根据权利要求1所述的细胞群体，其中，在所述细胞群体中，CCR5阳性、CCR6阳性及CXCR3阳性且CD3阴性的细胞的比例为30％以上。
3.根据权利要求1或2所述的细胞群体，其中，选自由CD3及CD19组成的组中的任一种为阳性的细胞的比率低于5％。
4.根据权利要求1或2所述的细胞群体，其中，在所述细胞群体中，选自由CD4，CD8，CD14，CD19及CD36组成的组中的任一种为阳性的细胞被除去。
5.根据权利要求1或2所述的细胞群体，其用于对实体肿瘤浸润。
6.细胞，其为对实体肿瘤浸润的CCR5阳性、CCR6阳性、CXCR3阳性、整联蛋白α1阳性、整联蛋白α3阳性及整联蛋白β3阴性且CD3阴性的细胞。
7.药物组合物，其包含权利要求1～5中任一项所述的细胞群体，及药学上允许的添加物。
8.权利要求1～5中定义的细胞群体的制备方法，包括，
制备初代单核的细胞群体的步骤；
使用Miltenyi Biotech公司的CliniMACSTM珠，从初代单核的细胞群体中除去CD3阳性细胞的步骤；
从初代单核的细胞群体中除去选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种的步骤；和
将所述除去CD3阳性细胞以及选自由单核细胞及B细胞组成的组中的任一种后剩余的细胞群体在包含IL-2的培养基中培养的步骤，其中所述培养基包含人AB型培养基。
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