CN113891934A - 扩增天然杀伤（nk）细胞子集的方法以及相关组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于离体扩增天然杀伤(NK)细胞的特化子集的方法以及含有此类NK细胞的组合物。还提供了用于鉴定或检测NK细胞的特化子集的方法。还提供了使用所提供的组合物治疗疾病和病症如癌症的方法，所述方法包括与能够结合疾病相关组织或细胞如肿瘤细胞或感染细胞的抗体组合。

Description

扩增天然杀伤(NK)细胞子集的方法以及相关组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月21日提交的标题为“扩增天然杀伤(NK)细胞子集的方法以及相关组合物和方法(METHODS FOR EXPANSIONOF NATURAL KILLER(NK)CELL SUBSET ANDRELATED COMPO SITIONS AND METHODS)”的美国临时申请号62/770,686的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年11月21日创建、大小为7.8千字节的名为776032000540SeqList.txt的文件提供。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体而并入。
技术领域
本公开文本提供了用于离体扩增天然杀伤(NK)细胞的特化子集的方法以及含有此类NK细胞的组合物。还提供了用于鉴定或检测NK细胞的特化子集的方法。还提供了使用本公开文本的组合物治疗疾病和病症(如癌症)的方法，所述方法包括与能够结合至疾病相关组织或细胞(如肿瘤细胞或感染细胞)的抗体组合。
背景技术
基于抗体的疗法已经频繁地用于治疗癌症和其他疾病。对抗体疗法的反应已经典型地集中在这些抗体对肿瘤细胞的直接抑制作用(例如，抑制生长因子受体和随后诱导凋亡)，但是这些抗体的体内作用可能更复杂并且可能涉及宿主免疫系统。天然杀伤(NK)细胞是免疫效应细胞，当Fc受体(CD16；FcγRIII)结合至与携带抗原的细胞结合的抗体的Fc部分时，所述天然杀伤细胞介导抗体依赖性细胞毒性。NK细胞(包括其特定的特化子集)可以用于治疗方法中，所述治疗方法包括用于改善对抗体疗法的反应的方法。然而，在细胞疗法(如过继细胞疗法)中应用NK细胞的主要障碍是它们在人外周血中的相对较低的丰度以及缺乏特定的特化子集的表面表型特征。需要改善的方法来获得用于治疗用途的NK细胞组合物。本文提供了满足这种需求的实施方案。
发明内容
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g–NK)的方法，所述方法包括：(a)分离富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述分离包括从来自人受试者的样品选择：(i)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，(ii)呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞，(iii)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(iv)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(v)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞，或(vi)呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞；以及(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：(a)分离富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述分离包括从来自人受试者的样品选择：(i)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(ii)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(iii)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，或(iv)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞；以及(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：(a)分离富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述分离包括从来自人受试者的样品选择：(i)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，(ii)呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞，(iii)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(iv)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(v)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞，或(vi)呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞；以及(b)将所述富集NK细胞的群体与经辐照的221.AEH饲养细胞和经辐照的外周血单核(PBMC)饲养细胞组合，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1，并且PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在为或约1:1与为或约5:1之间，包含端值。任选地，其中所述PBMC饲养细胞对所述受试者而言是自体的。所述方法还包括：(c)在存在重组IL-2和抗CD3抗体或抗原结合片段的情况下培养(b)的所述群体，其中在所述培养开始的7天内，用含有重组IL-2的新鲜培养基更换所述细胞培养基，并且任选地此后在所述培养的持续时间内每2或3天进一步用含有重组IL-2的新鲜培养基更换所述细胞培养基，其中所述培养产生扩增的g-NK细胞群体；以及(d)收集所述扩增的细胞群体。
在任何所提供的实施方案中，在分离或选择富集了NK细胞的细胞群体之前，所提供的方法包括从所述人受试者收获所述样品。在一些任何实施方案中，所述人受试者呈CMV血清反应阳性。在一些任何实施方案中，所述人受试者具有CD16 158V+NK细胞基因型。在所提供的方法的实施方案中，所述样品是或包含外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述样品是单采术或白细胞单采术样品。
在任何所提供的实施方案中，所述方法包括从来自受试者的样品分离富集了NK细胞的细胞。在一些实施方案中，所述分离是通过从所述样品选择富集了NK细胞的细胞群体。在一些实施方案中，所述选择是通过基于免疫亲和力的选择。在一些任何实施方案中，所述分离属于(i)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。在一些任何实施方案中，所述分离属于(ii)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD57posCD28neg)的细胞。在一些实施方案中，所述分离属于(iii)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。在一些实施方案中，所述分离属于(iv)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。在一些实施方案中，所述分离包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。在一些实施方案中，所述分离属于(v)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。在一些实施方案中，所述分离属于(vi)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞。
在一些任何所提供的分离或选择富集了NK细胞的细胞群体的方法中，所述方法可以包括如在进行所述细胞的培养如以用于扩增所述细胞群体之前，低温保存所分离的富集NK细胞的群体。在一些任何此类实施方案中，在培养所述细胞如以用于扩增所述细胞群体之前，所提供的方法包括解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体包含选自以下的表型：(i)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，(ii)呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞，(iii)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(iv)呈CD3(CD3neg)阴性且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(v)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞，或(vi)呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞；以及(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的富集了g-NK细胞的NK细胞群体。在一些实施方案中，获得富集了NK细胞的细胞群体包括解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：(a)获得富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体包含选自以下的表型：(i)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(ii)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(iii)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，或(iv)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞；以及(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。在一些实施方案中，获得富集了NK细胞的细胞群体包括解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体属于(i)，并且包含呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体属于(ii)，并且包含呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体属于(iii)，并且包含呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体属于(iv)，并且包含呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体属于(v)，并且包含呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体属于(vi)，并且包含呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞。
在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。在一些任何此类实施方案中，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g–NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)选择(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD57阳性的细胞，从而富集第一选择的群体；以及(2)从所述第一选择的群体选择除(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD57阳性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞。在一些实施方案中，所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；以及(2)从所述第一选择的群体选择呈CD57阳性的细胞，从而富集呈CD4阴性且呈CD57阳性的细胞。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞，从而富集第一选择的群体；(2)从所述第一选择的群体选择(a)呈CD56阳性的细胞或(b)呈CD38阴性的细胞，从而富集第二选择的群体；以及(3)从所述第二选择的群体选择除(a)呈CD56阳性的细胞或(b)呈CD38阴性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD56阳性且呈CD38阴性的细胞。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；以及(3)从所述第二选择的群体选择呈CD38阴性的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD56阳性且呈CD38阴性的细胞。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)选择(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD16阳性的细胞，从而富集第一选择的群体；以及(2)从所述第一选择的群体选择除(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD16阳性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞。在一些实施方案中，所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；以及(2)从所述第一选择的群体选择呈CD16阳性的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞。在一些实施方案中，所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
本文提供了一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；(3)从所述第二选择的群体选择(a)呈NKG2A阴性的细胞或(b)呈CD161阴性的细胞，从而富集第三选择的群体；以及(4)从所述第三选择的群体选择除(a)呈NKG2A阴性的细胞或(b)呈CD161阴性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞。在一些实施方案中，所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；(3)从所述第二选择的群体选择呈NKG2A阴性的细胞以产生第三选择的群体；以及(4)从所述第三选择的群体选择呈CD161阴性的细胞以富集呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞。在一些实施方案中，所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
在一些任何实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；(3)从所述第二选择的群体选择呈CD161阴性的细胞以产生第三选择的群体；以及(4)从所述第三选择的群体选择呈NKG2A阴性的细胞以富集呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞。在一些实施方案中，所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
在一些任何所提供的实施方案中，所述样品包括外周血单核细胞(PBMC)。在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养之前，所述方法包括从所述人受试者收获所述样品。在一些实施方案中，所述人受试者呈CMV血清反应阳性。在一些实施方案中，所述人受试者具有CD16 158V+NK细胞基因型。在一些实施方案中，所述样品是单采术或白细胞单采术样品。在一些任何所提供的实施方案中，所述富集的NK细胞来自先前已从来自所述受试者的样品分离的低温保存样品。
在一些任何所提供的实施方案中，所述培养还在存在以下项的情况下进行：(iii)原代人外周血单核细胞(PBMC)饲养细胞，其中所述PBMC饲养细胞是经辐照的。在一些任何实施方案中，所述培养是在将所述富集NK细胞的群体与经辐照的221.AEH饲养细胞和经辐照的PBMC饲养细胞组合之后进行的。在一些此类实施方案中，PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在为或约1:1与为或约5:1之间，包含端值。在一些任何所提供的实施方案中，所述PBMC饲养细胞对所述受试者而言是自体的。在一些任何所提供的实施方案中，所述培养的至少一部分是在存在至少一种刺激剂的情况下进行的，所述至少一种刺激剂能够刺激所述PBMC饲养细胞的一种或多种T细胞的激活。在一些实施方案中，所述刺激剂与TCR复合物的成员特异性地结合，任选地其中所述药剂与CD3、任选CD3ε特异性地结合。在一些实施方案中，所述至少一种刺激剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段是OKT3抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是在为或约10ng/mL与为或约100ng/mL之间。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是为或约50ng/mL。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少一种刺激剂是在所述培养开始时或与经辐照的PBMC饲养细胞同时或大约同时开始添加。在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养的至少一部分期间，所述PBMC饲养细胞被激活。
在一些任何所提供的实施方案中，经辐照的221.AEH饲养细胞与NK细胞的比率是为或约1:1或更大。在一些任何所提供的实施方案中，经辐照的221.AEH饲养细胞与NK细胞的比率是在1:1与5:1之间，包含端值。在一些任何所提供的实施方案中，经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在1:1与3:1之间，包含端值。在一些任何所提供的实施方案中，经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是或是约2.5:1。在一些任何所提供的实施方案中，经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是或是约1:1。在一些任何所提供的实施方案中，PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是为或约5:1。
在一些任何此类实施方案中，所述NK细胞是新鲜分离的或尚未冷冻或解冻的。在一些任何此类实施方案中，所述NK细胞在冷冻后已被解冻。
在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养的至少一部分期间，重组IL-2的浓度是在为或约10IU/mL与为或约500IU/mL之间。在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养的至少一部分期间，重组IL-2的浓度是为或约100IU/mL重组IL-2。在一些任何所提供的实施方案中，所述重组IL-2是在所述培养开始时或大约在所述培养开始时开始添加。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法还包括在所述培养期间更换所述培养基一次或多次。在一些任何所提供的实施方案中，所述培养基的更换是在所述培养开始后为或约3至7天内、任选地在所述培养开始后5天或大约5天进行。在一些任何所提供的实施方案中，所述培养基的更换是在所述培养的剩余持续时间内每两天或三天进行。在一些任何所提供的实施方案中，所述培养基的更换从所述培养基减少或去除所述至少一种刺激剂。在一些任何所提供的实施方案中，在每次更换所述培养基时，所述方法包括将含有重组IL-2的新鲜培养基添加至所述培养物。在一些任何此类实施方案中，以在为或约10IU/mL与为或约500IU/mL之间的浓度添加所述重组IL-2，包含端值。在一些实施方案中，以为或约100IU/mL重组IL-2的浓度添加所述重组IL-2。
在一些任何所提供的实施方案中，所述富集NK细胞的群体包含至少或至少约0.2x106个富集的NK细胞、至少或至少约1.0x106个富集的NK细胞、或为或约10x106个富集的NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体的浓度是在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间。在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体的浓度是在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.5x106个富集的NK细胞/mL之间。在一些任何所提供的实施方案中，在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体具有为或约0.2x106个富集的NK细胞/mL的浓度。
在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约2.50x108个g-NK细胞的扩增的时间。在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.0x108个g-NK细胞的扩增的时间。在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约1.0x109个g-NK细胞的扩增的时间。在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.0x109个g-NK细胞的扩增的时间。
在一些任何所提供的实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。在一些实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约14天。在一些实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约21天。
在一些实施方案中，与所述培养开始时相比，所述方法在所述培养结束时产生增加数量的g-NK细胞。在一些任何此类实施方案中，所述增加是大于或大于约100倍、大于或大于约200倍、大于或大于约300倍、大于或大于约400倍、大于或大于约500倍、大于或大于约600倍、大于或大于约700倍或大于或大于约800倍。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约1000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2500倍大。
在一些任何所提供的实施方案中，在培养后收集通过本文提供的方法产生的扩增的g-NK细胞群体。
在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞呈FcRγneg。在一些此类实施方案中，所述g-NK细胞还呈CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些实施方案中，所述g-NK细胞具有表型FcRγneg//CD45pos/CD3neg/CD56pos。
在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim /neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何此类实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD38neg。在一些任何此类实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征还包括CD45pos/CD3neg/CD56pos。在特定实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征包括CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在其他特定实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征包括CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg。在其他特定实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征包括CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD38neg。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法还包括在所述培养后，从所述扩增的细胞群体纯化或选择具有g-NK细胞替代表面标记物特征的细胞群体。在一些任何此类施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些任何此类实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何实施方案中，g-NK细胞替代表面标记物特征还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法还包括将所述扩增的g-NK细胞群体配制在药学上可接受的赋形剂中。在一些任何所提供的实施方案中，所述方法还包括在存在低温保护剂的情况下低温保存所述细胞和/或配制所述细胞。
本文还提供了一种包含通过任何所提供的方法产生的g-NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少或至少约108个g-NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中g-NK细胞的数量包含为或约108至为或约1012个g-NK细胞、为或约108至为或约1011个g-NK细胞、为或约108至为或约1010个g-NK细胞、为或约108至为或约109个g-NK细胞、为或约109至为或约1012个g-NK细胞、为或约109至为或约1011个g-NK细胞、为或约109至为或约1010个g-NK细胞、为或约1010至为或约1012个g-NK细胞、为或约1010至为或约1011个g-NK细胞、或为或约1011至为或约1012个g-NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞或具有g-NK替代标记物特征的细胞还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD38neg。
本文还提供了一种包含通过任何所提供的方法产生的g-NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少或至少约106个g-NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含为或约106至为或约1010个g-NK细胞、为或约106至为或约109个g-NK细胞、为或约106至为或约108个g-NK细胞、为或约106至为或约107个g-NK细胞、为或约107至为或约1010个g-NK细胞、为或约107至为或约109个g-NK细胞、为或约107至为或约108个g-NK细胞、为或约108至为或约1010个g-NK细胞、为或约108至为或约109个g-NK细胞、或为或约109至为或约1010个g-NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞或具有g-NK替代标记物特征的细胞还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。
本文提供了一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。本文提供了一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有选自CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg和NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的细胞包含作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞包含作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
本文提供了一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的细胞包含作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞包含作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
本文提供了一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的细胞包含作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞包含作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含选自CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg和NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含选自CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg和NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些任何所提供的实施方案中，在包含所述g-NK细胞替代标记物特征的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约108个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约106个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含为或约108至为或约1012个细胞、为或约108至为或约1011个细胞、为或约108至为或约1010个细胞、为或约108至为或约109个细胞、为或约109至为或约1012个细胞、为或约109至为或约1011个细胞、为或约109至为或约1010个细胞、为或约1010至为或约1012个细胞、为或约1010至为或约1011个细胞、或为或约1011至为或约1012个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含为或约106至为或约1010个细胞、为或约106至为或约109个细胞、为或约106至为或约108个细胞、为或约106至为或约107个细胞、为或约107至为或约1010个细胞、为或约107至为或约109个细胞、为或约107至为或约108个细胞、为或约108至为或约1010个细胞、为或约108至为或约109个细胞、或为或约109至为或约1010个细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述组合中的细胞来自单一供体受试者，所述细胞已经从相同样品扩增。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含低温保护剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物是无菌的。
本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含任何所提供的组合物和用于治疗疾病的另外的药剂。在一些任何实施方案中，所述试剂盒还包含用于施用所述组合物和用于治疗疾病或病症的另外的药剂的说明书。
本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含任何所提供的组合物和用于施用所述组合物与用于治疗疾病的另外的药剂的组合疗法的说明书。
在一些任何所提供的实施方案中，所述另外的药剂是抗体或Fc融合蛋白。在一些任何此类实施方案中，所述抗体识别或特异性结合肿瘤相关抗原。在一些任何此类实施方案中，所述抗体识别或结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。在一些任何此类实施方案中，所述抗体是全长抗体和/或包含Fc结构域。
在一些任何所提供的方法中，所述另外的药剂是细胞毒性剂或癌症药物。在一些任何所提供的实施方案中，所述另外的药剂是溶瘤病毒。
本文提供了一种制品，所述制品包含根据任何所提供的实施方案所述的试剂盒。本文提供了一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用任何所提供的组合物。在一些任何此类实施方案中，所述方法包括向所述个体施用从或从约1x105个NK细胞/kg至为或约1x107个NK细胞/kg。在一些任何此类实施方案中，所述方法包括向所述个体施用从或从约5x107个NK细胞至为或约10x109个NK细胞。在一些任何此类实施方案中，所述方法包括向所述个体施用从或从约1x108至1x1010个细胞/m2，或施用从或从约1x106至1x1010个NK细胞/kg。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用另外的药剂以用于治疗所述疾病或病症。在一些实施方案中，所述另外的药剂是抗体或Fc融合蛋白。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症，并且所述抗体识别与所述癌症相关的肿瘤抗原。在一些任何此类实施方案中，所述抗体识别或特异性地结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。在一些任何此类实施方案中，所述抗体包含Fc结构域和/或是全长抗体。
在一些任何所提供的实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用癌症药物或细胞毒性剂以用于治疗所述疾病或病症。在一些任何所提供的方法中，所述另外的药剂是溶瘤病毒。
在一些任何所提供的方法中，依序施用所述另外的药剂和所述组合物。在一些任何所提供的实施方案中，在施用所述组合物之前施用所述另外的药剂。在一些任何所提供的实施方案中，同时施用所述另外的药剂和所述组合物。
在一些任何所提供的实施方案中，所述疾病或病症选自炎性病症、感染和癌症。在一些任何此类实施方案中，所述疾病或病症是感染，并且所述感染是病毒感染或细菌感染。在一些任何此类实施方案中，所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些任何此类实施方案中，所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症包括实体瘤。在一些任何此类实施方案中，所述感染是病毒感染或细菌感染。在一些任何此类实施方案中，所述癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些任何此类实施方案中，所述癌症包括实体瘤。
在一些任何所提供的实施方案中，所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症选自胃或胃食管连接部的腺癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、内分泌/神经内分泌癌、头颈癌、胃肠道间质癌、骨巨细胞瘤、肾癌、肝癌、肺癌、神经母细胞瘤、卵巢上皮/输卵管/原发性腹膜癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌和软组织癌。
在一些任何所提供的实施方案中，所述个体是人。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中的NK细胞对所述个体而言是同种异体的。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中的NK细胞对所述受试者而言是自体的。
本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组选自CD16、CD57、CD7和CD161或者NKG2A和CD161。
本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组包含NKG2A和CD161。
本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组包含CD3、CD56和CD38。
在一些任何所提供的实施方案中，所述表面标记物组还包含CD3、CD45和CD56。在一些任何所提供的实施方案中，所述组还包含CD45。在一些任何所提供的实施方案中，所述多种试剂中的每一种是对所述表面标记物组中的一种标记物具有特异性的结合分子。在一些实施方案中，所述结合分子是抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述结合分子被可检测地标记。在一些任何所提供的实施方案中，所述试剂盒还包含用于使用所述表面标记物组作为用于检测细胞样品中g-NK细胞数量的替代标记物的说明书。
本文提供了一种使用任何所提供的试剂盒检测包含天然杀伤(NK)细胞的样品中的g-NK替代表面标记物特征的方法。
本文提供了一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测包含CD16、CD57、CD7和CD161的表面标记物组的试剂接触；以及(b)检测所述样品中具有所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的细胞的存在或不存在。
本文提供了一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测选自CD16、CD57、CD7和CD161或者NKG2A和CD161的表面标记物组的试剂接触；以及(b)检测所述样品中具有所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg或NKG2Aneg/CD161neg的细胞的存在或不存在。本文提供了一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测包含NKG2A和CD161的表面标记物组的试剂接触；以及(b)检测所述样品中具有所述表型NKG2Aneg/CD161neg的细胞的存在或不存在。
在一些任何此类实施方案中，所述表面标记物组还包含CD45、CD3和CD56，并且其中所述表型还包含CD45pos/CD3neg/CD56pos。
本文提供了一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测包含CD3、CD56和CD38的表面标记物组的试剂接触；以及(b)检测所述样品中具有所述表型CD38posCD56pos/CD38neg的细胞的存在或不存在。
在一些任何所提供的实施方案中，所述多种试剂中的每一种是对所述表面标记物组中的一种标记物具有特异性的结合分子。在一些任何所提供的实施方案中，所述结合分子是抗体或抗原结合片段。在一些任何所提供的实施方案中，所述结合分子被可检测地标记。在一些任何所提供的实施方案中，所述检测是通过流式细胞术进行的。
附图说明
图1描绘了具有CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg或CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg的替代细胞外表面表型的细胞子集内g-NK(CD45pos/CD3neg/CD56pos/FcRγneg)的百分比。值为平均值±标准误差。
图2A描绘了如在实施例2中所述的涉及CD3耗尽接着CD57富集的示例性扩增方案的流程图。在该示意图中，在扩增期期间，除了经辐照的221.AEH细胞之外，经辐照的PBMC也可以被包括在内作为饲养细胞。
图2B和图2C描绘了从来自CMV+供体的外周血单核细胞分离的富集的NK细胞的g-NK扩增。显示的所有结果均来自通过各种方法富集的新鲜NK细胞的14天扩增，不同之处在于对通过CD3耗尽富集的解冻的NK细胞进行21天扩增。图2B描绘了通过如实施例2中所述的各种方法扩增后的g-NK细胞的总数。图2C描绘了通过如实施例2中所述的各种方法扩增之前和之后的g-NK细胞的百分比。值为平均值±标准误差。
图2D和图2E描绘了从来自CMV+供体的外周血单核细胞分离的富集的NK细胞的g-NK扩增。显示的所有结果均来自通过各种方法富集的新鲜NK细胞或通过CD3耗尽富集的解冻的NK细胞的14天扩增。图2D描绘了通过如实施例2中所述的各种方法扩增后的g-NK细胞的总数。图2E描绘了通过如实施例2中所述的各种方法扩增之前和之后的g-NK细胞的百分比。值为平均值±标准误差。
图3描绘了通过实施例2中所述的涉及富集CD3negCD57pos NK细胞的方法或通过替代方法扩增的NK细胞对221AEH和K562细胞系(n＝8)的NK细胞毒性活性(5:1NK细胞与靶标比率)。值为平均值±标准误差。
图4A和图4B描绘了与抗CD20抗体(利妥昔单抗)组合时g-NK细胞相比于常规NK细胞的针对淋巴瘤细胞系RAJI的ADCC活性。图4A显示了相比于具有低g-NK比例的供体(n＝4)，在具有高g-NK的供体中通过以富集的CD3negCD57pos细胞开始的过程扩增的g-NK细胞的ADCC活性。图4B显示了从同一供体(n＝4)富集的新鲜或先前冷冻的(且解冻的)NK细胞扩增的g-NK细胞、常规NK细胞(cNK)和NKG2Cpos(适应性)NK细胞的ADCC(1:1NK细胞与靶标比率)活性。值为平均值±标准误差。
图5A和图5B描绘了g-NK细胞相比于常规(cNK)NK细胞的ADCC活性。图5A显示了与抗HER2(曲妥珠单抗)组合的g-NK和cNK细胞对乳腺癌细胞系SKBR3的ADCC活性。图5B显示了与抗EGFR(西妥昔单抗)组合的g-NK和cNK细胞对头颈癌细胞系CAL27的ADCC活性。值为平均值±SE。
图6A-图6C描绘了g-NK细胞相比于常规NK细胞(cNK)的ADCC活性。图6A显示了与抗EGFR(西妥昔单抗)组合的g-NK和cNK细胞对结直肠癌细胞系HT29的ADCC活性。图6B显示了与抗EGFR(西妥昔单抗)组合的g-NK和cNK细胞对结直肠癌细胞系SW480的ADCC活性。图6C显示了与抗EGFR(西妥昔单抗)组合的g-NK和cNK细胞对肺癌细胞系A549的ADCC活性。值为平均值±SE。
图7A-图7C描绘了输注1x107个g-NK或cNK细胞后，在NSG小鼠中g-NK(新鲜的或冷冻的)和cNK(冷冻的)的持久性。图7A显示了在输注后第5、8、14、15和22天存在于NSG小鼠全血中的人NK细胞的数量。图7B显示了在NK细胞输注后22天存在于NSG小鼠脾脏中的人NK细胞的数量。图7C显示了在NK细胞输注后22天存在于NSG小鼠骨髓中的人NK细胞的数量。对于所有3个臂，N＝3。值为平均值±SE。
图8A和图8B描绘了g-NK和利妥昔单抗在淋巴瘤异种移植模型中对肿瘤负荷和存活率的影响。图8A显示了相对于未治疗的小鼠或仅用利妥昔单抗治疗的小鼠，在NSG小鼠中用g-NK和利妥昔单抗(利妥昔单抗+g-NK)治疗对Raji肿瘤负荷的影响，如通过生物发光(BLI)所测量。值为平均值±SE。图8B显示了相对于未治疗的小鼠或仅用利妥昔单抗治疗的小鼠，在Raji接种的NSG小鼠中用g-NK和利妥昔单抗(利妥昔单抗+g-NK)治疗对存活率的影响。对于所有臂，N＝8。
图9A和图9B描绘了g-NK细胞相比于常规NK细胞(cNK)的ADCC活性。图9A显示了与抗CD38(达雷木单抗；Dara)或抗SLAMF7(埃罗妥珠单抗；Elo)组合的新鲜分离的g-NK和cNK细胞对多发性骨髓瘤细胞系MM.1S(n＝16)的ADCC活性。图9B显示了与抗CD38(达雷木单抗；Dara)或抗SLAMF7(埃罗妥珠单抗；Elo)组合的扩增的g-NK和cNK细胞对多发性骨髓瘤细胞系MM.1S(n＝5)的ADCC活性。值为平均值±SE。
图10A和图10B描绘了在多发性骨髓瘤的异种移植模型中g-NK分别对达雷木单抗(Dara)和埃罗妥珠单抗(Elo)的体内功效的影响。图10A显示了相对于未治疗的小鼠或用cNK和达雷木单抗(Dara+cNK)、仅Dara、媒介物或仅g-NK治疗的小鼠，在NSG小鼠中用g-NK和达雷木单抗(Dara+g-NK)治疗对MM.1S肿瘤负荷(BLI)的影响。图10B显示了相对于未治疗的小鼠或用cNK和埃罗妥珠单抗(Elo+cNK)、仅Elo、媒介物或仅g-NK治疗的小鼠，在NSG小鼠中用g-NK和埃罗妥珠单抗(Elo+g-NK)治疗对MM.1S肿瘤负荷(BLI)的影响。对于所有臂，N＝6。值为平均值±SE。
图11A和图11B描绘了g-NK对用达雷木单抗(Dara)或埃罗妥珠单抗(Elo)治疗的接种MM.1S的NSG小鼠的存活率的影响。图11A显示了相对于未治疗的小鼠或用cNK和达雷木单抗(Dara+cNK)、仅Dara、媒介物或仅g-NK治疗的小鼠，在接种MM.1S的NSG小鼠中用g-NK和达雷木单抗(Dara+g-NK)治疗对存活率的影响。图11B显示了相对于未治疗的小鼠或用cNK和埃罗妥珠单抗(Elo+cNK)、仅Elo、媒介物或仅g-NK治疗的小鼠，在接种MM.1S的NSG小鼠中用g-NK和埃罗妥珠单抗(Elo+g-NK)治疗对存活率的影响。对于所有臂，N＝6。
图12A-图12C描绘了在多发性骨髓瘤的异种移植模型中，当与达雷木单抗(dara)或埃罗妥珠单抗(elo)组合时g-NK和cNK针对骨髓和脾脏的持久性和归巢。图12A显示了用达雷木单抗或埃罗妥珠单抗治疗的接种MM.1S的NSG小鼠的脾脏中g-NK和cNK的数量。图12B显示了用达雷木单抗或埃罗妥珠单抗治疗的接种MM.1S的NSG小鼠的骨髓中g-NK和cNK的数量。图12C显示了用达雷木单抗或埃罗妥珠单抗治疗的接种MM.1S的NSG小鼠的血液中g-NK和cNK的数量。对于所有臂，N＝6。值为平均值±SE。
图13A-图13D描绘了在g-NK和cNK上CD20(利妥昔单抗的靶标)、CD38(达雷木单抗的靶标)和SLAMF7(埃罗妥珠单抗的靶标)的表达。图13A显示了表达CD20的扩增的g-NK细胞、未扩增的NK细胞(CD3-/CD56+)和MM.1S细胞的百分比。图13B显示了表达CD38的扩增的g-NK细胞，未扩增的NK细胞(CD3-/CD56+)和MM.1S细胞的百分比。图13C显示了表达SLAMF7的扩增的g-NK细胞、未扩增的NK细胞(CD3-/CD56+)和MM.1S细胞的百分比。图13D显示了在扩增之前和之后表达CD38的cNK和g-NK的百分比。对于所有臂，N＝3。值为平均值±SE。
图14A-图14C描绘了g-NK细胞相比于常规NK细胞(cNK)的ADCC活性。图14A显示了与抗Her2(曲妥珠单抗；Tras)组合的新鲜分离的g-NK和cNK细胞对卵巢癌细胞系SKOV3(n＝16)的ADCC活性。图14B显示了与抗Her2(曲妥珠单抗；Tras)组合的扩增的g-NK和cNK细胞对卵巢癌细胞系SKOV3(n＝5)的ADCC活性。图14C显示了与抗EGFR(西妥昔单抗)组合的扩增的g-NK和cNK细胞对卵巢癌细胞系SKOV3(n＝4)的ADCC活性。值为平均值±SE。
图15A-图15C描绘了g-NK对曲妥珠单抗(Tras)在卵巢癌异种移植模型中的体内功效的影响。图15A显示了相对于仅用曲妥珠单抗(仅Tras)治疗的小鼠，在NSG小鼠中用g-NK和曲妥珠单抗(Tras+g-NK)治疗对SKOV3肿瘤负荷的影响。图15B显示了相对于用cNK和曲妥珠单抗(Tras+cNK)治疗的小鼠，在接种SKOV3的NSG小鼠中用g-NK和曲妥珠单抗(Tras+g-NK)治疗对存活率的影响。对于所有臂，N＝10。图15C显示了相对于用cNK和曲妥珠单抗(Tras+cNK)、仅Tras或媒介物治疗的小鼠，在接种SKOV3的NSG小鼠中用g-NK和曲妥珠单抗(Tras+g-NK)治疗对存活率的影响。
图16A-图16C描绘了在卵巢癌异种移植模型中与曲妥珠单抗组合时g-NK和cNK的持久性。图16A显示了用曲妥珠单抗治疗的接种SKOV3的NSG小鼠的血液中g-NK和cNK的数量。图16B显示了用曲妥珠单抗治疗的接种SKOV3的NSG小鼠的脾脏中g-NK和cNK的数量。图16C显示了用曲妥珠单抗治疗的接种SKOV3的NSG小鼠的骨髓中g-NK和cNK的数量。对于所有臂，N＝6。值为平均值±SE。
图17A和图17B描绘了g-NK细胞相比于常规NK细胞(cNK)的ADCC活性。图17A显示了与抗CD38(达雷木单抗；Dara)组合的扩增的g-NK和cNK细胞对多发性骨髓瘤细胞系ARH-77(n＝4)的ADCC活性。图17B显示了与抗CD38(达雷木单抗；Dara)组合的扩增的g-NK和cNK细胞对多发性骨髓瘤细胞系MM.1R(n＝4)的ADCC活性。值为平均值±SE。
图18A和图18B描绘了g-NK细胞相比于常规NK细胞(cNK)的ADCC活性。图18A显示了与抗EGFR(西妥昔单抗；Cet)组合的新鲜分离的g-NK和cNK细胞对结直肠癌细胞系SW-480(n＝16)的ADCC活性。图18B显示了与抗EGFR(西妥昔单抗)组合的扩增的g-NK和cNK细胞对结直肠癌细胞系SW-480(n＝5)的ADCC活性。值为平均值±SE。
图19比较了在cNK(n＝4)、g-NK(n＝7)和CD16 158V g-NK细胞(n＝5)之间对SW-480(使用西妥昔单抗；Cet)、SKOV3(使用曲妥珠单抗，Tras；或西妥昔单抗，Cet)和MM.1S细胞(使用达雷木单抗，Dara；或埃罗妥珠单抗，Elo)的ADCC。值为平均值±SE。
图20A-图20D描绘了CD16基因的g-NK细胞表达与对多发性骨髓瘤和实体瘤细胞系的ADCC之间的关系。图20A显示了g-NK CD16表达与对MM.1S细胞(使用达雷木单抗，Dara)的ADCC之间的正相关。图20B显示了g-NK CD16表达与对MM.1S细胞(使用埃罗妥珠单抗，Elo)的ADCC之间的正相关。图20C显示了g-NK CD16表达与对卵巢癌SKOV3(使用曲妥珠单抗，Tras)的ADCC之间的正相关。图20D显示了g-NK CD16表达与对结直肠癌SW-480细胞系(使用西妥昔单抗，Cet)的ADCC之间的正相关。N＝4个g-NK细胞系。
具体实施方式
本文提供了用于呈NKG2C阳性(NKG2Cpos)的NK细胞的离体扩增的方法，所述NK细胞包括缺乏或缺少FceRIγ(FcRγ)链(称为g-NK细胞)的天然杀伤(NK)细胞的特化子集。本文还提供了用于基于替代表面标记物特征检测细胞的g-NK子集的试剂盒和方法。因此，在一些情况下，在本公开文本中对g-NK细胞的提及可以包括缺少FcRγ链的NK细胞或具有此类细胞的替代表面标记物特征的细胞。
天然杀伤(NK)细胞是对于通过细胞因子和趋化因子分泌以及通过释放细胞毒性颗粒来介导抗病毒和抗癌免疫而言重要的先天性淋巴细胞(Vivier等人Science 331(6013):44-49(2011)；Caligiuri,Blood 112(3):461-469(2008)；Roda等人,CancerRes.66(1):517-526(2006))。NK细胞是包含第三大淋巴细胞群体的效应细胞，并且对于宿主针对肿瘤和病原体感染细胞的免疫监测是重要的。然而，与T和B淋巴细胞不同，NK细胞被认为仅具有有限的使用种系编码的激活受体识别靶标的能力(Bottino等人,Curr TopMicrobiol Immunol.298:175-182(2006)；Stewart等人,Curr Top MicrobiolImmunol.298:1-21(2006))。
NK细胞的激活可以通过NK细胞受体与靶细胞上配体的直接结合而发生，如直接肿瘤细胞杀伤所见，或者通过结合至与携带抗原的细胞结合的抗体的Fc部分，通过Fc受体(CD16；也称为CD16a或FcγRIIIa)的交联而发生。在激活后，NK细胞大量产生细胞因子和趋化因子，并且同时展现出有效的细胞溶解活性。NK细胞能够经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤肿瘤细胞。在一些情况下，当NK细胞表面上的受体(如CD16)识别与细胞表面结合的IgGl或IgG3抗体时，触发ADCC。这触发释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒，从而导致靶细胞死亡。由于NK细胞表达激活的Fc受体CD16，其识别IgG包被的靶细胞，因此靶标识别范围扩大(Ravetch和Bolland,Annu Rev Immunol.19:275-290(2001)；LanierNat.Immunol.9(5):495-502(2008)；Bryceson和Long,Curr Opin Immunol.20(3):344-352(2008))。ADCC和抗体依赖性细胞因子/趋化因子产生主要通过NK细胞介导。
参与抗体依赖性反应(如NK细胞介导的ADCC)的CD16除了在NK细胞上表达外，CD16还以糖基磷脂酰肌醇锚定形式(也称为FcγRIIIB或CD16B)存在。应理解，本文对CD16的提及是关于在NK细胞上表达的CD16a形式，而不意在指糖基磷脂酰肌醇锚定形式。所述CD16受体能够与衔接子TCR-CD3复合物的ζ链(CD3ζ)和/或FcRγ链缔合，以通过基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)转导信号。在一些方面，CD16接合(CD16交联)经由通过CD16缔合的衔接子链FcRγ或CD3ζ中的之一或二者产生的细胞内信号引发NK细胞反应。CD16的触发导致γ或ζ链的磷酸化，这进而募集酪氨酸激酶(syk和ZAP-70)，从而引发导致快速和有效效应子功能的信号转导级联。最熟知的效应子功能是释放携带有毒蛋白质的细胞质颗粒，以通过抗体依赖性细胞毒性的过程杀伤附近的靶细胞。CD16交联还导致产生细胞因子和趋化因子，其进而激活并协调一系列免疫反应。
细胞因子和趋化因子的这种释放可在体内在NK细胞的抗癌活性方面起作用。NK细胞还在其细胞质中具有含有穿孔素和蛋白酶(颗粒酶)的小颗粒。当从NK细胞释放时，穿孔素在靶定细胞的细胞膜中形成孔，颗粒酶和相关分子可通过所述孔进入，从而诱导细胞凋亡。NK细胞诱导靶细胞的细胞凋亡而不是坏死的事实是显著的-病毒感染的细胞的坏死将释放病毒粒子，而细胞凋亡导致细胞内部病毒的破坏。
缺乏FcRγ衔接子蛋白的NK细胞的特化子集(也称为g-NK细胞)能够介导稳健的ADCC反应(参见例如，公开的专利申请号US2013/0295044)。反应增加的机制可能是由于表观遗传修饰的变化而影响了FcRγ的表达。所述g-NK细胞大量表达信号传导衔接子ζ链，但缺少信号传导衔接子γ链的表达。与常规NK细胞相比，这些γ缺陷型g-NK细胞在被抗体激活时展现出显著增强的活性。例如，可以通过抗体介导的CD16的交联或通过抗体包被的肿瘤细胞激活g-NK细胞。在一些方面，与表达γ链的常规NK细胞相比，g-NK细胞产生更大量的细胞因子(例如IFN-γ或TNF-α)和趋化因子(例如MIP-1α、MIP-1β和RANTES)和/或展示出比更高的脱粒反应。所述g-NK细胞提供颗粒酶B的高表达，所述颗粒酶B是天然杀伤细胞的细胞毒性机制的组分。此外，与常规NK细胞相比，所述g-NK细胞的寿命延长，并且它们的存在是长期维持的。在一些实施方案中，g-NK细胞在功能上和表型上是稳定的。
在一些实施方案中，g-NK细胞比常规NK细胞(例如，不缺少γ链的NK细胞)更有效地引发ADCC反应。在一些情况下，ADCC是治疗性抗体(包括抗癌抗体)的作用机制。在一些方面，通过施用NK细胞的细胞疗法可与抗体配合用于治疗和相关目的。本文提供了涉及组合施用含有g-NK细胞(例如，如通过所提供的方法产生的)和抗体(例如，抗癌抗体)的组合物的方法。在一些实施方案中，由于g-NK细胞子集的改善的亲和力、细胞毒性和/或细胞因子介导的效应功能，因此g-NK细胞的抗体定向靶向导致患者的改善的结局。
在一些实施方案中，与表达FcRγ的天然杀伤细胞相比，所述g-NK细胞产生显著更大量的细胞因子。在另一个实施方案中，所述细胞因子是干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)或其组合。在一个实施方案中，所述g-NK细胞产生显著更大量的趋化因子。在一个实施方案中，所述趋化因子是MIP-1α、MIP-1β或其组合。在另一个实施方案中，所述g-NK细胞在通过Fc受体CD16刺激时产生所述细胞因子或所述趋化因子。
g-NK细胞代表在外周血中相对较小百分比的NK细胞，从而限制了在治疗方法中使用这些细胞的能力。特别地，为了在临床中利用g-NK细胞，由于g-NK细胞通常是稀有的群体，因此需要高的优先扩增率。其他扩增NK细胞的方法能够达到千倍的14天NK细胞扩增率，但它们产生低分化、NKG2Cneg、FceRIγpos(FcRγpos)NK细胞(Fujisaki等人(2009)CancerRes.,69:4010-4017；Shah等人(2013)PLoS One,8:e76781)。此外，本文发现，针对扩增与g-NK细胞表型重叠的NK细胞进行优化的扩增不会优先扩增g-NK细胞至支持治疗用途的量。特别地，先前已经报道与g-NK细胞展现出表型重叠的NKG2Cpos NK细胞可以使用HLA-E转染的221.AEH细胞优先扩增(Bigley等人(2016)Clin.Exp.Immunol.,185:239-251)。用此类组成性地表达HLA-E的HLA表达细胞进行培养将NK细胞推向NKG2Cpos/NKG2Aneg表型的方向(NKG2C是HLA-E的激活受体，而NKG2A是HLA-E的抑制受体)。人们认为，由于此类细胞将g-NK包括在内，因此此类方法将足以扩增g-NK细胞。然而，如本文的例子所示，该方法不能实现g-NK细胞的稳健扩增。
所提供的方法克服了这些限制。与先前的方法相比，所提供的方法利用更大的221.AEH细胞与NK细胞比率。特别地，先前的方法已经使用较低比率的221.AEH细胞，如10:1比率的NK细胞与221.AEH比率。本文发现，较大比率的HLA-E表达饲养细胞(如221AEH细胞)导致更大且更偏向g-NK表型的总体扩增。在一些实施方案中，通过辐照所述饲养细胞，更大比率的221.AEH细胞是可能的。此外，还发现包含激活的(例如抗CD3激活的)自体PBMC(如经辐照的激活的PBMC)可以用作另外的饲养细胞以对扩增增压。在一些方面，使用经辐照的饲养细胞系也是有利的，因为它提供了GMP兼容的方法。还发现在扩增期间包含重组IL-2支持稳健的扩增。
还发现与最初基于单独CD3耗尽富集NK细胞的方法相比，在扩增方法之前从细胞样品富集NK细胞(如在扩增之前通过富集CD16或CD57细胞)进一步显著增加了可以实现的g-NK细胞扩增的量。在另一个实施方案中，可以在扩增之前进行的另一种富集是通过对CD56的阳性选择和对CD38的阴性选择或耗尽来富集NK细胞。在另一个实施方案中，可以在扩增之前进行的另一种富集是通过对CD56的阳性选择，接着对NKG2Aneg的阴性选择或耗尽以及对CD161neg的阴性选择或耗尽来富集NK细胞。在任何此类实施方案中，所述富集的NK细胞可以从含有NK细胞的细胞样品富集，如从外周血单核细胞(PBMC)富集。在一些实施方案中，在从细胞样品富集NK细胞之前，可以通过对CD3的阴性选择或耗尽来去除T细胞。
总之，所提供的用于扩增g-NK细胞的方法可以实现NK细胞的如下扩增，其从培养开始时的最初1000万个富集的NK细胞达到超过10亿个细胞，并且在一些情况下高达80亿个或更多个。特别地，所提供的方法可以导致高产(>1000倍)扩增率，且在扩增后维持或在一些情况下增加所述g-NK细胞的功能性。此外，发现所提供的方法足以扩增先前冷冻的NK细胞，这通常无法通过涉及拯救解冻的NK细胞的许多现有方法实现。在一些实施方案中，这是通过增加扩增方案的持续时间来实现的。在一些实施方案中，这是通过将221AEH饲养细胞与NK细胞的比率降低至例如约1:1 221AEH与NK细胞来实现的。如本文所示，所提供的方法产生展现出有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的g-NK细胞，从而支持此类细胞用于治疗应用的效用。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物、以及科学文献和数据库均出于所有目的通过引用整体并入本文，如同指明每个单独的参考文献具体且单独地通过引用并入的相同程度。
为了公开文本的清楚，而不是通过限制的方式，将具体实施方式划分为以下小节。本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。
如本文所用术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)涉及所述值或参数本身的实施方案。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和/或“基本上由多个方面和实施方案组成”。
如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。例如，任选地取代的基团意指所述基团未被取代或被取代。
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或完全合成的，如重组产生的，包括其含有免疫球蛋白分子的可变重链和/或轻链区的至少一部分的任何片段，所述片段足以形成抗原结合位点，并且当组装时，足以特异性地结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。典型地，抗体最小限度地包括可变重(VH)链和/或可变轻(VL)链的全部或至少一部分。通常，VH和VL的配对一起形成抗原结合位点，但在一些情况下，单个VH或VL结构域足够用于抗原结合。所述抗体还可包括恒定区的全部或一部分。本文提及的抗体包括全长抗体和抗原结合片段。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换使用，以指代基本上完整形式的抗体，与抗体片段相反。全长抗体是典型地具有两个全长重链(例如，VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两个全长轻链(VL-CL)以及铰链区的抗体，如通过分泌B细胞的抗体从哺乳动物物种(例如人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)产生的抗体和合成产生的具有相同结构域的抗体。特别地，整个抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分、所述完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、二硫化物连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子，包括单链fv(scFv)或单链Fab(scFab)；上述任何一种的抗原结合片段以及来自抗体片段的多特异性抗体。出于本文的目的，抗体片段典型地包括足以接合或交联NK细胞表面上的CD16的抗体片段。
术语“自体”是指源自个体自身组织内部或取自个体自身组织的细胞或组织。例如，在NK细胞的自体转移或移植中，供体和受体是同一个人。
术语“同种异体”是指属于或获自相同物种，但在遗传上不同的细胞或组织，并且因此在一些情况下，是免疫学不相容的。典型地，术语“同种异体”用于定义从供体移植到相同物种的受体的细胞。
关于细胞组合物的术语“富集的”是指其中与相同体积的起始组合物(如直接从受试者获得或分离的起始组合物)中的细胞类型的数量或百分比相比，所述细胞类型或群体的数量或百分比有所增加的组合物。所述术语不需要从组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在富集的组合物中以等于或甚至接近100％存在。
术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。
提及蛋白质或核酸时，术语“异源”是指源自不同遗传来源的蛋白质或核酸。例如，对于细胞而言异源的蛋白质或核酸源自除在其中表达它的细胞之外的生物或个体。
如本文所用，术语“引入”包括在体外或在体内将DNA引入细胞中的各种方法，此类方法包括转化、转导、转染(例如电穿孔)和感染。载体可用于将编码分子的DNA引入细胞中。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其他载体，如腺病毒载体或腺相关载体。
术语“组合物”是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞或抗体)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。所述制剂通常呈允许活性成分(例如抗体)的生物活性有效的形式。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，组合是指两个或更多个项目之间或之中的任何相关联。所述组合可以是两个或更多个单独的项目，如两种组合物或两个集合，可以是其混合物，如两个或更多个项目的单一混合物，或其任何变化。组合的元素通常在功能上相关联或相关。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，其出于包括但不限于治疗用途的目的，任选地包括其他元素，如另外的药剂和所述组合或其元素的使用说明。
如本文所用，术语“治疗(treatment和treating)”指设计用于在临床病理学的进程中改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预。希望的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、以及消退或者预后改进。例如当与障碍(例如，嗜酸性粒细胞介导的疾病)相关的一种或多种症状得到减轻或消除时，个体得到成功“治疗”。例如，如果治疗导致提高患有疾病的那些人的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、减少疾病复发的频率、减轻疾病的严重性、延缓疾病的发展或进展、和/或延长个体的存活时间，则个体成功地得到“治疗”。
“有效量”是指至少在必需的剂量和时间上有效实现所需的或指示的效果(包括治疗或预防结果)的量。有效量可在一次或多次施用中提供。“治疗有效量”至少是实现特定障碍的可测量改进所需要的细胞的最低剂量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低动物中与癌症、病毒感染、微生物感染或脓毒性休克相关的严重性、持续时间和/或症状的组合物的量。本文的治疗有效量可根据如患者的疾病状态、年龄、性别和重量的因素而变化。治疗有效量还可以是其中治疗上有益的效果超过抗体的任何毒性或有害影响的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现希望的预防结果的量。典型地但不是必需地，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量可小于治疗有效量。
如本文所用，“个体”或“受试者”是哺乳动物。出于治疗目的的“哺乳动物”包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，所述个体或受试者是人。
II.用于扩增天然杀伤细胞子集的方法
本文提供了一种用于从来自人受试者的生物样品扩增NK细胞子集的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括从来自人受试者的生物样品扩增呈NKG2Cpos的NK细胞的子集。在一些实施方案中，所述方法可以包括从来自人受试者的生物样品扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的细胞子集。在一些实施方案中，所述方法包括从来自人受试者的生物样品分离富集了天然杀伤(NK)细胞的细胞群体，并在其中所述g-NK细胞子集和/或与所述g-NK细胞子集重叠或共有细胞外表面标记物的NK细胞子集优先生长和/或扩增的条件下培养所述细胞。例如，可以使用饲养细胞或在存在细胞因子的情况下培养NK细胞，以增强g-NK细胞子集和/或与所述g-NK细胞子集重叠或共有细胞外表面标记物的NK细胞子集的生长和/或扩增。在一些方面，所提供的方法还可以扩增NK细胞的其他子集，如呈NKG2Cpos的任何NK细胞。
在一些实施方案中，所述样品(例如生物样品)是含有多个细胞群体的样品，所述多个细胞群体包括NK细胞群体。在一些实施方案中，所述生物样品是或包含血细胞，例如外周血单核细胞。在一些方面，所述生物样品是全血样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，所述样品是外周血单核细胞(PBMC)的样品。因此，在所提供的方法的一些实施方案中，可以获得外周血单核细胞(PBMC)的群体。含有包括NK细胞群体在内的多个细胞群体的样品可以用作用于根据所提供的方法富集或选择用于扩增的NK细胞子集的细胞。
在一些实施方案中，所述生物样品来自作为健康受试者的受试者。在一些实施方案中，所述生物样品来自患有疾病或病症(例如癌症)的受试者。
在一些实施方案中，所述细胞是从样品(如生物样品)分离或选择的，例如从受试者(如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者)获得或得到的细胞。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗干预(如细胞被分离、处理和/或工程化所用于的过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接从受试者采集的组织、液体和其他样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。在一些方面，所述样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。
在一些例子中，从受试者的循环血液获得细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，包括NK细胞、T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。在一些实施方案中，洗涤从所述受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将该细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心(如通过使用
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密度离心)而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，所述生物样品来自从正常外周血收集的富含leukopak的白细胞单采术产物。在一些实施方案中，所述leukopak可以含有新鲜细胞。在一些实施方案中，所述leukopak是低温保存的样品，其被解冻以用于所提供的方法中。
在一些实施方案中，所述生物细胞的来源含有从为或约5x105至为或约5x108个NK细胞或g-NK细胞子集或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含g-NK细胞的替代标记物的NK细胞子集。在一些实施方案中，NK细胞或g-NK细胞子集或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含g-NK细胞的替代标记物的NK细胞子集的数量是从为或约5x105至为或约1x108、从为或约5x105至为或约5x107、从为或约5x105至为或约1x107、从为或约5x105至为或约5x106、从为或约5x105至为或约1x106、从为或约1x106至为或约1x108、从为或约1x106至为或约5x107、从为或约1x106至为或约1x107、从为或约1x106至为或约5x106、从为或约5x106至为或约1x108、从为或约5x106至为或约5x107、从为或约5x106至为或约1x107、从为或约1x107至为或约1x108、从为或约1x107至为或约5x107、或从为或约5x107至为或约1x108。
在一些实施方案中，所述生物样品来自呈CMV血清反应阳性的受试者。CMV感染可以导致NK细胞的表型和功能分化，包括出现高分数的表达NKG2C的NK细胞，所述NK细胞展现出增强的抗病毒活性。表达NKG2C的CMV相关NK细胞展示出改变的DNA甲基化模式和信号传导分子(如FcRγ)的降低的表达(Schlums等人,Immunity(2015)42:443–56)。相对于常规的NK细胞子集，这些NK细胞与更有效的抗体依赖性激活、扩增和功能有关。在一些情况下，所述生物样品可以来自呈CMV血清反应阴性的受试者，因为在CMV血清反应阴性个体中也可以检测到具有降低的FcRγ表达(尽管通常处于较低水平)的NK细胞。在一些情况下，所述生物样品可以来自CMV血清反应阳性个体。
在一些实施方案中，来自所述受试者的NK细胞在CD16基因核苷酸526中具有单核苷酸多态性(SNP rs396991)[胸苷(T)→鸟嘌呤(G)]，其导致在成熟(经处理的)形式的蛋白质中的位置158处的苯丙氨酸(F)至缬氨酸(V)的氨基酸(aa)取代(F158V，在本文中也称为158V+)。已经发现，CD16 F158V多态性与对IgGl抗体的显著更高亲和力相关，并且具有建立更稳健的NK细胞介导的ADCC反应的能力(Mellor等人(2013)Journal of Hematology&Oncology,6:1；Musolino等人(2008)Journal of Clinical Oncology,26:1789-1796以及Hatjiharissi等人(2007)Blood,110:2561-2564)。在一些实施方案中，由于CD16 158V+/g-NK细胞子集的改善的亲和力、细胞毒性和/或细胞因子介导的效应功能，因此CD16 158V+/g-NK细胞的抗体定向靶向导致患者的改善的结局。
在一些实施方案中，所提供的方法包括从具有CD16 158V+NK细胞基因型的受试者的生物样品富集或分离被鉴定为NK细胞或其子集。在一些实施方案中，所述方法包括针对CD16 158V+NK细胞基因型的存在来筛选受试者。在一些实施方案中，从来自受试者的样品(如血液样品或骨髓样品)提取基因组DNA，所述样品是或包含NK细胞。在一些实施方案中，所述样品是或包含血细胞，例如外周血单核细胞。在一些实施方案中，所述样品是或包含分离的NK细胞。在一些实施方案中，所述样品是来自健康供体受试者的样品。可以采用从样品提取DNA的任何方法。例如，可以使用标准技术(如硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取)从样品(例如细胞)容易地分离核酸(Chomocyznski等人(1987)Anal.Biochem.162:156)。可商购的试剂盒(如Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，威斯康辛州麦迪逊))也可容易地用于提取基因组DNA。
可以对任何合适的样品进行基因型分型。在任何本文所述的实施方案中，所述基因型分型反应可以是例如焦磷酸测序反应、DNA测序反应、MassARRAY MALDI-TOF、RFLP、等位基因特异性PCR、实时等位基因分型或微阵列。在一些实施方案中，使用针对多态性的等位基因特异性引物进行基因组DNA的基于PCR的技术(如RT-PCR)。用于扩增样品中的靶核酸序列的PCR方法在本领域中是熟知，并且已经描述于例如以下文献中：Innis等人(编辑)PCRProtocols(Academic Press,NY 1990)；Taylor(1991)Polymerase chain reaction:basicprinciples and automation；PCR:A Practical Approach,McPherson等人(编辑)IRLPress,Oxford；Saiki等人(1986)Nature 324:163；以及美国专利号4,683,195、4,683,202和4,889,818，将所述全部文献通过引用以其整体并入本文。
用于检测158V+多态性的引物是已知的或可以由技术人员容易地设计的，参见例如，国际公开PCT申请号WO 2012/061814；Kim等人(2006)Blood,108:2720-2725；Cartron等人(2002)Blood,99:754-758；Koene等人(1997)Blood,90:1109-1114；Hatijiharissi等人(2007)Blood,110:2561-2564；Somboonyosdech等人(2012)Asian Biomedicine,6:883-889。在一些实施方案中，可以使用嵌套引物进行PCR，接着进行等位基因特异性限制酶消化。在一些实施方案中，所述第一PCR引物包含核酸序列5’-ATA TTT ACA GAA TGG CACAGG-3’(SEQ ID NO:2)和5’-GAC TTG GTA CCC AGG TTG AA-3’(SEQ ID NO:3)，而第二PCR引物是5’-ATC AGA TTC GAT CCT ACT TCT GCA GGG GGC AT-3’(SEQ ID NO:4)和5’-ACGTGC TGA GCT TGA GTG ATG GTG ATG TTC AC-3’(SEQ ID NO:5)，其在一些情况下取决于等位基因的性质而产生94bp片段。在一些实施方案中，所述引物对包含SEQ ID NO:6(CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT)和SEQ ID NO:7(GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCAAT)中所示核酸序列。在一些实施方案中，所述引物对包含SEQ ID NO:6(CCCAACTCAA CTTCCCAGTGTGAT)和SEQ ID NO:8(GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCAA)中所示核酸序列。在一些实施方案中，所述引物对包含SEQ ID NO:6(CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT)和SEQ ID NO:9(GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCA)中所示核酸序列。在一些实施方案中，基因型分型可以通过在提取RNA后使用如下引物序列定量实时RT-PCR来进行：SEQ ID NO:10(5′-CCAAAAGCCACACTCAAAGAC-3′)中所示的CD16有义和SEQ ID NO:11(5′-ACCCAGGTGGAAAGAATGATG-3′)中所示的反义以及SEQ ID NO:12(5′-AACATCACCATCACTCAAGGTTTGG-3′)中所示的TaqMan探针。
为了确认基因型分型，等位基因特异性扩增可以使用一组V等位基因特异性引物(例如SEQ ID NO:13中所示正向引物，5’-CTG AAG ACA CAT TTT TAC TCC CAAA-3’；和SEQID NO:14中所示反向引物，5’-TCC AAA AGC CAC ACT CAA AGA C-3’)或一组F等位基因特异性引物(例如，SEQ ID NO:15中所示正向引物，5’-CTG AAG ACA CAT TTT TAC TCC CAAC-3’；和SEQ ID NO:14中所示反向引物，5’-TCC AAA AGC CAC ACT CAA AGA C-3’)。
CD16a的基因组序列可在NCBI数据库中以NG_009066.1获得。CD16A的基因ID是2214。CD16的序列信息(包括基因多态性)可以UniProt登录号P08637获得。CD16(F158)的序列示于SEQ ID NO:16中(残基F158是粗体并加下划线)。在一些实施方案中，CD16(F158)还包含如MWQLLLPTALLLLVSA(SEQ ID NO:17)所示的信号肽。
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(SEQ ID NO:16)
CD16 158V+(导致F158V的多态性)的序列被称为VAR_003960，并且具有SEQ IDNO:18中所示序列(158V+多态性以粗体加下划线显示)。在一些实施方案中，CD16(158V+)还包含如MWQLLLPTALLLLVSA(SEQ ID NO:17)所示的信号肽。
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK(SEQ ID NO:18)
在一些实施方案中，使用在5'端含有荧光染料标记(例如FAM或VIC)且在3'端含有小沟结合剂(MGB)和非荧光猝灭剂(NFQ)的等位基因特异性探针以及用于检测特定的SNP靶标的未标记的PCR引物，对基因组脱氧核糖核酸(DNA)样品采用单核苷酸多态性(SNP)分析。在一些实施方案中，所述测定通过与所述探针缔合的染料的荧光的变化来测量或检测SNP的存在。在此类实施方案中，探针与两个未标记的引物之间的靶DNA杂交，并且来自5'端的荧光染料的信号通过荧光共振能量转移(FRET)被其3'端的NFQ猝灭。在PCR期间，Taq聚合酶使用模板作为指导来延伸未标记的引物，并且当聚合酶到达标记的探针时，其切割所述分子，从而使染料与猝灭剂分离。在一些方面，qPCR仪器可以检测来自未猝灭的标记的荧光。示例性试剂是可商购的SNP测定，例如用于rs396991的代码C_25815666_10(A ppliedBiosystems，用于CD16中V158F的SNP基因型分型的目录号4351379)。
在一些实施方案中，鉴定了对于CD16 158V+(V158F)多态性杂合或纯合的受试者。在一些实施方案中，鉴定了对于CD16 158V+(V158F)多态性纯合的受试者。在一些实施方案中，从来自被鉴定为对于CD16 158V+多态性杂合或纯合的受试者的生物样品分离或富集NK细胞或NK细胞子集。在一些实施方案中，从来自被鉴定为对于CD16 158V+多态性纯合的受试者的生物样品分离或富集NK细胞或NK细胞子集。
在一些实施方案中，所述方法包括从所述生物样品(如从所述受试者分离或获得的群体PBMC)富集NK细胞。在一些实施方案中，富集了NK细胞的细胞群体是通过基于一种或多种天然杀伤细胞特异性标记物的分离或选择来富集的。选择特定的标记物或表面标记物的组合是在技术人员的水平之内。在一些实施方案中，所述一种或多种表面标记物是以下表面抗原中的任何一种或多种：CD11a、CD3、CD7、CD14、CD16、CD19、CD25、CD27、CD56、CD57、CD161、CD226、NKB1、CD62L、CD244、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2A、NKG2C、KIR2DL1和/或KIR2DL3。在一些实施方案中，所述一种或多种表面标记物是以下表面抗原中的任何一种或多种：CD11a、CD3、CD7、CD14、CD16、CD19、CD25、CD27、CD38CD56、CD57、CD161、CD226、NKB1、CD62L、CD244、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2A、NKG2C、SLAMF7(CD319)、KIR2DL1和/或KIR2DL3。在特定实施方案中，所述一种或多种表面抗原包括CD3以及以下表面抗原中的一种或多种：CD16、CD56或CD57。在一些实施方案中，所述一种或多种表面抗原是CD3和CD57。在一些实施方案中，所述一种或多种表面抗原是CD3、CD56和CD16。在其他实施方案中，所述一种或多种表面抗原是CD3、CD56和CD38。在其他实施方案中，所述一种或多种表面抗原是CD3、CD56、NKG2A和CD161。用于检测此类表面抗原的试剂(包括荧光染料缀合的抗体)是熟知的，并且是技术人员可以获得的。
在一些实施方案中，所述NK细胞群体通过所提供的方法从样品富集了(如通过分离或选择)如下细胞，所述细胞呈(标记物+)阳性或表达高水平(标记物高)的一种或多种特定标记物(如表面标记物)，或呈(标记物-)阴性或表达相对较低水平(标记物低)的一种或多种标记物。在一些情况下，此类标记物是在某些NK细胞群体上不存在或以相对较低的水平表达，但在某些其他淋巴细胞群体(如T细胞)上存在或以相对较高的水平表达的那些。在一些情况下，此类标记物是在某些NK细胞群体上存在或以相对较高水平表达，但在某些其他淋巴细胞群体(如T细胞或其子集)上不存在或以相对较低水平表达的那些。
在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记物的用于分离的方法。在一些实施方案中，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)的表达或表达水平分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性结合至此类标记物的抗体或结合配偶体，之后通常进行洗涤步骤，并分离已经结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至所述抗体或结合配偶体的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记物的细胞。例如，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要使不表达所述标记物的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要使所有此类细胞完全去除。例如，在一些方面，对于CD3的阴性选择富集了呈CD3-的细胞群体，但也可以含有一些残留的或小百分比的其他未选择的细胞，其在一些情况下包括仍存在于所述富集的群体中的呈CD3+的小百分比的细胞。在一些例子中，CD57+或CD16+群体之一的阳性选择富集了所述群体，即CD57+或CD16+群体，但也可以含有一些残留或小百分比的其他未选择的细胞，其在一些情况下包括仍存在于所述富集的群体中的另一种CD57或CD16群体。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单一分离步骤可以同时耗尽表达多种标记物的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(各自对阴性选择所靶向的标记物具有特异性)一起孵育。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育来对多种细胞类型同时进行阳性选择。
在一些方面，所述选择包括如在来自PBMC样品的细胞中基于一种或多种表面抗原的表达的阳性和/或阴性选择步骤。在一些实施方案中，所述分离包括对表达CD56的细胞、表达CD16的细胞或表达CD57的细胞的阳性选择和/或对表达CD38的细胞的阴性选择和/或对表达非NK细胞标记物(如T细胞标记物)的细胞的阴性选择，例如对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择。例如，在一些实施方案中，所述分离包括对表达CD56的细胞、表达CD16的细胞或表达CD57的细胞的阳性选择和/或对表达非NK细胞标记物(如T细胞标记物)的细胞的阴性选择，例如对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择。在一些实施方案中，所述分离包括对表达CD56的细胞、表达CD16的细胞或表达CD57的细胞的阳性选择和/或对表达CD38(CD38neg)、CD161(CD161neg)、NKG2A(NKG2Aneg)的细胞的阴性选择，和/或对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择。在一些实施方案中，所述选择包括分离呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。
在一些实施方案中，所述分离包括对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择和对表达CD56(CD56pos)的细胞的阳性选择。在一些实施方案中，所述选择还可以包括对表达CD38(CD38neg)的细胞的阴性选择。在特定实施方案中，所述分离或选择的细胞呈CD3negCD56posCD38neg。
在一些实施方案中，所述选择包括对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择、对表达CD56(CD56pos)的细胞的阳性选择、接着是对表达NKG2A(NKG2Aneg)和CD161(CD161neg)的细胞的阴性选择。在具体的实施方案中，所述分离或选择的细胞呈CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg。
在一些实施方案中，所述选择包括对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择和对表达CD57(CD57pos)的细胞的阳性选择。在特定实施方案中，所述分离或选择的细胞呈CD3negCD57pos。
在一些实施方案中，所述选择包括对表达CD3(CD3neg)的细胞的阴性选择和对表达CD16(CD16pos)的细胞的阳性选择。在特定实施方案中，所述分离或选择的细胞呈CD3negCD16pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何此类实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD38neg。在一些任何此类实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征还包括CD45pos/CD3neg/CD56pos。在特定实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征包括CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在其他特定实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征包括CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg。在其他特定实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征包括CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD38neg。
在一些实施方案中，如通过基于一种或多种细胞表面标记物的表达的阳性或阴性选择进行的分离、选择和/或富集细胞的方法可以包括基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述基于免疫亲和力的选择包括使含有细胞(如PBMC)的样品与抗体或结合配偶体接触，所述抗体或结合配偶体与所述一种或多种细胞表面标记物特异性地结合。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如球体或珠，例如微珠、纳米珠(包括琼脂糖)、磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。在一些实施方案中，所述球体或珠可以被填充到柱中以实现免疫亲和色谱法，其中使含有细胞(例如PBMC)的样品与所述柱的基质接触并随后从中洗脱或释放。
所述孵育通常在如下条件下进行：其中所述抗体或结合配偶体与细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)特异性地结合，其与此类抗体或结合配偶体特异性地结合，其附着至所述磁性颗粒或磁珠。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且附接有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引至磁体的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经历进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着至随后要进行孵育和/或培养的细胞；在一些方面，所述颗粒保持附着至用于施用至患者的细胞。在一些实施方案中，从所述细胞去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotech，加利福尼亚州奥本市)进行的。磁激活细胞分选(MACS)系统能够对附着有磁化颗粒的细胞进行高纯度选择。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作：其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成该第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中而免于被洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在一些任何此类实施方案中，所述方法包括在富集(如选择和/或分离)所述NK细胞或其子集之前向所述受试者施用IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或CCL5。
在所提供的方法的实施方案中，将所述富集的NK细胞在存在饲养细胞的情况下(如在支持NK细胞子集并且特别是g-NK细胞子集的增殖和扩增的条件下)孵育或培养。
在特定方面，所述饲养细胞包括刺激或促进NKG2C+细胞的扩增和/或抑制NKG2A+细胞的扩增的细胞。在一些实施方案中，所述饲养细胞是表达HLA-E或含有HLA-A2信号序列的杂合体HLA-E或者用其转染的细胞。例如，这种杂合体的例子是含有MHC I类(如HLA-A2)启动子和信号序列以及HLA-E成熟蛋白质序列的AEH杂合基因，其在一些情况下可以产生与由HLA-E基因编码的蛋白质相同，但是可以在细胞表面上稳定表达的成熟蛋白质(参见例如，Lee等人(1998)Journal of Immunology,160:4951-4960)。在一些实施方案中，所述细胞是LCL 721.221、K562细胞或RMA-S细胞，其被转染以表达在存在MHC I类(如HLA-A2)前导序列的情况下稳定的MHC-E分子。被工程化以表达在存在MHC I类(如HLA-A2)前导序列肽的情况下稳定的细胞表面HLA-E的细胞系是本领域已知的(Lee等人(1998)Journal ofImmunology,160:4951-4960；Zhongguo等人(2005)13:464-467；Garcia等人(2002)EurJ.Immunol.,32:936-944)。在一些实施方案中，经辐照的221.AEH细胞可以用作饲养细胞或任何其他HLA-E转染的原文呈HLA阴性的细胞系，如K562。用于在本文所提供的方法中使用的这种细胞系的例子是221-AEH细胞。
在特定实施方案中，添加至培养物中的HLA-E表达饲养细胞(例如221AEH细胞)是非分裂的(如通过γ辐照)。在一些实施方案中，用约1000至10000rad(如1000-5000rad)范围内的γ射线辐照HLA-E表达饲养细胞以防止细胞分裂。在一些实施方案中，用约10Gy至100Gy(如10-50Gy)范围内的γ射线辐照HLA-E表达饲养细胞以防止细胞分裂。
在一些实施方案中，将富集的、选择的和/或分离的NK细胞在存在HLA-E表达饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)的情况下以如下的饲养细胞与富集的NK细胞的比率孵育或培养：大于或约1:10HLA-E饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)与富集的NK细胞，如从为或约1:10至为或约10:1的此类饲养细胞与富集的NK细胞。
在一些实施方案中，HLA-E表达饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)的所述比率是此类饲养细胞与富集的NK细胞的如下比率：在为或约1:10与为或约10:1之间、在为或约1:10与为或约5:1之间、在为或约1:10与为或约2.5:1之间、在为或约1:10与为或约1:1之间、在为或约1:10与为或约1:2.5之间、在为或约1:10与为或约1:5之间、在为或约1:5与为或约10:1之间、在为或约1:5与为或约5:1之间、在为或约1:5与为或约2.5:1之间、在为或约1:5与为或约1:1之间、在为或约1:5与为或约1:2.5之间、在为或约1:2.5与为或约10:1之间、在为或约1:2.5与为或约5:1之间、在为或约1:2.5与为或约2.5:1之间、在为或约1:2.5与为或约1:1之间、在为或约1:1与为或约10:1之间、在为或约1:1与为或约5:1之间、在为或约1:1与为或约2.5:1之间、在为或约2.5:1与为或约10:1之间、在为或约2.5:1与为或约5:1或在为或约5:1与为或约10:1之间，每个都包含端值。
在一些实施方案中，HLA-E表达饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)的所述比率是此类饲养细胞与富集的NK细胞的如下比率：为或约1.25:1、1.5:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2:5:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.5.:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1或5:1，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，HLA表达饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)的所述比率是此类饲养细胞与富集的细胞的如下比率：小于或小于约5:1。在一些实施方案中，HLA表达饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)的所述比率是如下比率：在为或约1:1与2.5:1之间，包含端值。在一些实施方案中，HLA表达饲养细胞(例如221.AEH细胞)(如其经辐照的群体)的所述比率是如下比率：为或约2.5:1。
在一些情况下，如果起始NK细胞群体在扩增之前已被低温保存，即经受冷冻/解冻，则与使用新鲜NK细胞的方法相比，可以采用更低的221.AEH与NK细胞比率。此处发现，1:1 221.AEH与冷冻/解冻NK细胞的比率导致与在含有2.5:1比率的221.AEH与新鲜NK细胞的培养物中可比较的扩增。在一些方面，较低的比率确保培养物中较多数量的NK细胞以允许更多的细胞间接触，这可以在促进初始生长和扩增中起作用。在一些实施方案中，如果来自样品的初始富集的NK细胞群体已经经受冷冻/解冻，则使用为或约2:1至1:2比率的221.AEH与冷冻/解冻NK细胞。在特定实施方案中，所述比率是1:1。应理解，可以使用较高的比率，如2.5:1 221.AEH与冷冻/解冻NK细胞，但这可能需要较长时间的培养(例如为或约21天)以达到所需的阈值密度或数量。
在一些实施方案中，通过向培养物中进一步添加非分裂外周血单核细胞(PBMC)来扩增所述NK细胞。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含经γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约1000至10000rad(如1000-5000rad)范围内的γ射线辐照所述PBMC以防止细胞分裂。在一些实施方案中，用约10Gy至100Gy(如10-50Gy)范围内的γ射线辐照所述PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在所述孵育的至少一部分期间，所述经辐照的饲养细胞与所述非分裂(如经辐照的)HLA-E表达饲养细胞同时存在于培养基中。在一些方面，在同一天(如在孵育开始的当天，例如在同一时间或大约或接近同一时间)，将非分裂(例如经辐照的)PBMC饲养细胞、HLA-E表达饲养细胞和富集的NK细胞添加至培养物。
在一些实施方案中，所述孵育或培养还在存在作为饲养细胞的经辐照的PBMC的情况下进行。在一些实施方案中，所述经辐照的PBMC饲养细胞对于分离或选择所述富集的NK细胞的同一受试者而言是自体的或来自所述受试者。在特定实施方案中，所述PBMC是从相同的生物样品(例如，如用于富集NK细胞的全血或白细胞单采术或单采术产物)获得的。获得后，在如上所述富集NK细胞之前，保留一部分PBMC用于辐照。
在一些实施方案中，经辐照的PBMC作为饲养细胞以此类饲养细胞与富集的NK细胞的如下比率存在：从为或约1:10至为或约10:1、从为或约1:10至为或约5:1、从为或约1:10至为或约2.5:1、从为或约1:10至为或约1:1、从为或约1:10至为或约1:2.5、从为或约1:10至为或约1:5、从为或约1:5至为或约10:1、从为或约1:5至为或约5:1、从为或约1:5至为或约2.5:1、从为或约1:5至为或约1:1、从为或约1:5至为或约1:2.5、从为或约1:2.5至为或约10:1、从为或约1:2.5至为或约5:1、从为或约1:2.5至为或约2.5:1、从为或约1:2.5至为或约1:1、从为或约1:1至为或约10:1、从为或约1:1至为或约5:1、从为或约1:1至为或约2.5:1、从为或约2.5:1至为或约10:1、从为或约2.5:1至为或约5:1或从为或约5:1至为或约10:1。
在一些实施方案中，所述经辐照的PBMC作为饲养细胞以此类饲养细胞与富集的NK细胞的如下比率存在：在为或约1:1与为或约5:1之间，如为或约1.25:1、1.5:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2:5:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.5:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1或5:1，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，经辐照的PBMC以此类饲养细胞与富集的细胞的如下比率存在：为或为约5:1。
在特定实施方案中，在所述孵育或培养的至少一部分期间，所述经辐照的PBMC的一种或多种细胞或细胞类型(如T细胞)被激活和/或所述孵育或培养是在存在能够刺激所述PBMC饲养细胞的一种或多种T细胞的激活的至少一种刺激剂的情况下进行的。在一些实施方案中，至少一种刺激剂与TCR复合物的成员特异性地结合。在一些实施方案中，所述至少一种刺激剂与CD3、任选CD3ε特异性地结合。在一些方面，所述至少一种刺激剂是抗CD3抗体或抗原结合片段。示例性抗CD3抗体包括小鼠抗人CD3(OKT3)。
在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段存在于包括经辐照的PBMC饲养细胞的孵育的至少一部分期间。在一些实施方案中，将所述抗CD3抗体或抗原结合片段与所述经辐照的PBMC在同一时间或大约同一时间添加至所述培养或孵育。例如，在所述孵育或培养开始时或大约开始时添加所述抗CD3抗体或抗原结合片段。在特定方面，在所述培养或孵育过程期间，可以如通过更换或洗涤培养基去除所述抗CD3抗体或抗原结合片段或降低其浓度。在特定实施方案中，在更换或洗涤之后，所述方法不包括将所述抗CD3抗体或抗原结合片段添加回培养基或重装至培养基。
在一些实施方案中，在所述培养或孵育的至少一部分期间所述抗CD3抗体或抗原结合片段以如下浓度添加或存在：在为或约10ng/mL与为或约5μg/mL之间，如在为或约10ng/mL与为或约2μg/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约500ng/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约100ng/mL之间、在为或约10ng/mL与为或约50ng/mL之间、在为或约50ng/mL与为或约5μg/mL之间，如在为或约50ng/mL与为或约2μg/mL之间、在为或约50ng/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约50ng/mL与为或约500ng/mL之间、在为或约50ng/mL与为或约100ng/mL之间、在为或约100ng/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约100ng/mL与为或约2μg/mL之间、在为或约100ng/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约100ng/mL与为或约500ng/mL之间、在为或约500ng/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约500ng/mL与为或约2μg/mL之间、在为或约500ng/mL与为或约1μg/mL之间、在为或约1μg/mL与为或约5μg/mL之间、在为或约1μg/mL与为或约2μg/mL或在为或约2μg/mL与为或约5μg/mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述CD3抗体或抗原结合片段的浓度是为或约10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL，或任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是或是约50ng/mL。
在一些实施方案中，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的抗原结合部分或片段，即含有特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。术语抗体不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段，如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。通常，“抗原结合片段”含有免疫球蛋白重链和/或轻链的与目的抗原的至少一个表位结合的至少一个CDR。就这一点而言，抗原结合片段可以包含来自结合抗原的抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列的1、2、3、4、5个或所有6个CDR，如对于含有VH和VL的抗体通常包含六个CDR(对于重链和轻链中的每一条为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”)，或对于含有单可变结构域的抗体包含三个CDR。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
在一些实施方案中，所述孵育或培养是在存在如下浓度的此类富集的NK细胞(如选择和/或分离的NK细胞)的情况下开始的：为或约、或至少或至少约0.05x106个富集的NK细胞/mL、为或约0.1x106个富集的NK细胞/mL、为或约0.2x106个富集的NK细胞/mL、为或约0.5x106个富集的NK细胞/mL或为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL。在所提供的方法的实施方案中，所述孵育或培养是在存在如下浓度的此类富集的NK细胞(如选择和/或分离的NK细胞)的情况下开始的：在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间，如在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.75x106之间、在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.5x106之间、在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.20x106个富集的NK细胞/mL之间、在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.1x106个富集的NK细胞/mL之间、在为或约0.1x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间、在为或约0.1x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.75x106之间、在为或约0.1x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.5x106之间、在为或约0.1x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.20x106个富集的NK细胞/mL之间、在为或约0.20x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间、在为或约0.20x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.75x106之间、在为或约0.20x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.5x106之间、在为或约0.5x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间、在为或约0.5x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.75x106之间、在为或约0.75x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述孵育或培养是在存在如下浓度的此类富集的NK细胞(如选择和/或分离的NK细胞)的情况下开始的：为或约0.2x106个富集的NK细胞/mL。在一些任何此类实施方案中，在所述孵育或培养开始时添加或存在的富集的NK细胞(如如上所述从PBMC选择或分离)的量是至少或至少约1x105个细胞、至少或至少约2x105个细胞、至少或至少约3x105个细胞、至少或至少约4x105个细胞、至少或至少约5x105个细胞、至少或至少约6x105个细胞、至少或至少约7x105个细胞、至少或至少约8x105个细胞、至少或至少约9x105个细胞、至少或至少约1x106个细胞或更多。在特定实施方案中，富集的NK细胞(如如上所述从PBMC选择或分离)的量是至少或至少约或者是或是约1x106个细胞。
在这些实施方案的一些中，所述NK细胞可以用生长因子来培养。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、GSK3i、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18和IL-21的生长因子。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子是IL-2或IL-7和IL-15。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子是IL-2、IL-21或IL-7和IL-15。在一些实施方案中，所述生长因子是重组细胞因子，如重组IL-2、重组IL-7、重组IL-21或重组IL-15。
在特定实施方案中，所提供的方法包括在存在重组IL-2的情况下孵育或培养所述富集的NK细胞和饲养细胞。在一些实施方案中，在所述孵育的至少一部分期间，所述重组IL-2以如下浓度存在：在为或约1IU/mL与为或约500IU/mL之间，如在为或约1IU/mL与为或约250IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约250IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约250IU/mL或在为或约250IU/mL与为或约500IU/mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，在所述孵育的至少一部分期间，所述IL-2的浓度是为或约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL，或任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，所述重组IL-2的浓度是或是约100IU/mL。
在特定实施方案中，所提供的方法包括在存在重组IL-21的情况下孵育或培养所述富集的NK细胞和饲养细胞。在一些实施方案中，在所述孵育的至少一部分期间，所述重组IL-21以如下浓度存在：在为或约1IU/mL与为或约500IU/mL之间，如在为或约1IU/mL与为或约250IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约250IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约250IU/mL或在为或约250IU/mL与为或约500IU/mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，在所述孵育的至少一部分期间，所述IL-21的浓度是为或约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL，或任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，所述重组IL-21的浓度是或是约100IU/mL。
在一些实施方案中，所述方法包括更换所述培养基，其在一些方面包括洗涤所述细胞。例如，在所述培养或孵育的至少一部分期间，可以间歇地如每天、每隔一天、每三天或每周一次更换或洗出所述培养基。在特定实施方案中，在所述培养开始后为或约3天至7天内(如为或约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天)开始更换或洗出所述培养基。在特定实施方案中，在为或约第5天开始更换或洗出所述培养基。
去除或洗出所述培养基后，将其重装。在一些实施方案中，重装的培养基包含所述一种或多种生长因子或细胞因子，如重组IL-2。因此，在一些实施方案中，在所述孵育或培养期间间歇地添加所述生长因子或细胞因子，如重组IL-2。在一些此类方面中，所述生长因子或细胞因子(如重组IL-2)是在所述培养或孵育开始时或大约开始时添加，然后在所述培养或孵育期间间歇地添加，如每次更换或洗出所述培养基时添加。在一些实施方案中，在第0天(所述孵育开始)时开始将所述生长因子或细胞因子(如重组IL-2)添加至所述培养或孵育，并且在每次更换或从所述培养基洗出时，进一步添加其以用所述生长因子或细胞因子(如重组IL-2)重装所述培养或孵育。在一些实施方案中，所述方法包括在所述孵育开始时(第0天)，以及在所述孵育的持续时间内每两天或每三天在每次洗涤或更换所述培养基时，例如在所述培养或孵育的为或约第5天、第7天、第9天、第11天和第14天添加重组IL-2。在任何此类实施方案中，将所述重组IL-2以如下浓度添加至所述培养或孵育：在为或约1IU/mL与为或约500IU/mL之间，如在为或约1IU/mL与为或约250IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约1IU/mL与为或约50IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约250IU/mL之间、在为或约50IU/mL与为或约100IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约500IU/mL之间、在为或约100IU/mL与为或约250IU/mL或在为或约250IU/mL与为或约500IU/mL之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，将所述重组IL-2以如下浓度添加至所述培养或孵育：为或约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL，或任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，所述重组IL-2的浓度是或是约100IU/mL。
在一些实施方案中，一种或多种另外的细胞因子可以用于所述NK细胞的扩增，其包括但不限于IL-21、IL-18、IL-7、IL-15和/或IL-12。在一些实施方案中，一种或多种另外的细胞因子可以用于所述NK细胞的扩增，其包括但不限于重组IL-21、重组IL-18、重组IL-7、重组IL-15和/或重组IL-12。
在所提供的方法的实施方案中，培养或孵育包括提供对于NK细胞维持所需或有用的化学和物理条件(例如，温度、气体)。可以支持NK细胞增殖或扩增的化学条件的例子包括但不限于通常在生长(即，培养)培养基中提供的缓冲液、营养素、血清、维生素和抗生素。在一个实施方案中，NK培养基包括包含10％FCS的MEMα或包含5％人血清/
Figure BDA0003169946540000473
FBS替代物(Lifeblood产品)的CellGro SCGM(Cell Genix)。适用于本发明的其他介质包括但不限于Glascow培养基(Gibco Carlsbad Calif.)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich,St Louis Mo.)或DMEM(Sigma-Aldrich,St Louis Mo.)。应注意，许多培养基含有烟酰胺作为维生素补充剂，例如MEMα(8.19μM烟酰胺)、RPMI(8.19μM烟酰胺)、DMEM(32.78μM烟酰胺)和Glascow培养基(16.39μM烟酰胺)。
在一些实施方案中，如对于将细胞引入(或再引入)人受试者的应用，使用无血清配制品(如用于淋巴细胞培养的AIM VTM无血清培养基、MARROWMAXTM骨髓培养基或无血清干细胞生长培养基(SCGM)(例如
Figure BDA0003169946540000474
GMP SCGM))进行培养。此类培养基配制品和补充剂可从商业来源获得。所述培养物可以补充有氨基酸、抗生素和/或其他如所述的生长因子、细胞因子，以促进最佳活力、增殖、功能性和/或存活。在一些实施方案中，所述无血清培养基还可以补充有低百分比的人血清，如0.5％至10％人血清，如为或约5％人血清。在此类实施方案中，所述人血清可以是来自人AB血浆的人血清(人AB血清)或自体血清。
在一些实施方案中，用饲养细胞和任选细胞因子(例如重组IL-2)的培养是在如下条件下进行的，所述条件包括适合于人NK细胞生长或扩增的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度以及通常为或约摄氏37摄氏度。在一些实施方案中，所述培养是在37℃±2℃下在5％CO2中进行。
在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约2.50x108个g-NK细胞的扩增的时间。在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.0x108个g-NK细胞的扩增的时间。在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约1.0x109个g-NK细胞的扩增的时间。在一些任何所提供的实施方案中，进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.0x109个g-NK细胞的扩增的时间。
在一些任何所提供的实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。在一些实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约14天。在一些实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约21天。
在一些实施方案中，所提供的方法包括在分离、选择和/或富集之前或之后用于冷冻(例如，低温保存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，所提供的方法包括在孵育和/或培养之前或之后用于冷冻(例如，低温保存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在存在低温保护剂的情况下低温保存所述细胞，从而产生低温保存的组合物。在一些方面，在所述孵育之前和/或在向受试者施用之前，所述方法包括在减少或去除所述低温保护剂的条件下洗涤所述低温保存的组合物。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。在一些实施方案中，将所述细胞冷冻(例如低温冷冻或低温保存)在具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间或在6％与8％之间的DMSO的培养基和/或溶液中。在特定实施方案中，将所述细胞冷冻(例如低温冷冻或低温保存)在具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA的培养基和/或溶液中。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用介质1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以为或约1°/分钟的速率冷冻至为或约-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些任何所提供的实施方案中，根据任何所提供的方法的培养或孵育进行为或约或至少或至少约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。在一些实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约14天。在一些实施方案中，所述培养进行为或约或至少或至少约21天。在某些实施方案中，如果在所述培养开始时所述富集的NK细胞在先前冷冻或低温保存后已经解冻，则通常需要更长的培养持续时间。根据因素如所述培养开始时细胞的状态、所述培养开始或在所述培养期间细胞的健康或活力和/或所述培养结束时所需的阈值细胞数量(取决于例如所需的细胞应用，如用于治疗目的而向受试者施用的细胞的剂量)，凭经验确定培养细胞的最佳天数是在技术人员的水平之内。
在一些任何所提供的实施方案中，与所述培养开始时相比，所述方法在所述培养结束时产生增加数量的NKG2Cpos细胞。例如，与所述培养开始时相比，培养结束时NKG2Cpos细胞的增加可以是大于或大于约100倍、大于或大于约200倍、大于或大于约300倍、大于或大于约400倍、大于或大于约500倍、大于或大于约600倍、大于或大于约700倍或大于或大于约800倍。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约1000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2500倍大。在一些实施方案中，进行根据任何所提供的方法的培养或孵育直到所述方法实现如下细胞的扩增的时间：至少或至少约2.50x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约3.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约4.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约5.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约6.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约7.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约8.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约9.0x108个NKG2Cpos细胞、至少或至少约1.0x109个NKG2Cpos细胞、至少或至少约1.5x109个NKG2Cpos细胞、至少或至少约2.0x109个NKG2Cpos细胞、至少或至少约3.0x109个NKG2Cpos细胞、至少或至少约4.0x109个NKG2Cpos细胞、至少或至少约5.0x109个NKG2Cpos细胞、至少或至少约1.0x1010个NKG2Cpos细胞、至少或至少约1.5x1010个NKG2Cpos细胞、至少或至少约2.0x1010个NKG2Cpos细胞、至少或至少约2.5x1010个NKG2Cpos细胞或更多。
在一些任何所提供的实施方案中，与所述培养开始时相比，所述方法在所述培养结束时产生增加数量的g-NK细胞。例如，与所述培养开始时相比，培养结束时g-NK细胞的增加可以是大于或大于约100倍、大于或大于约200倍、大于或大于约300倍、大于或大于约400倍、大于或大于约500倍、大于或大于约600倍、大于或大于约700倍或大于或大于约800倍。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约1000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2500倍大。在一些实施方案中，进行根据任何所提供的方法的培养或孵育直到所述方法实现如下细胞的扩增的时间：至少或至少约2.50x108个g-NK细胞、至少或至少约3.0x108个g-NK细胞、至少或至少约4.0x108个g-NK细胞、至少或至少约5.0x108个g-NK细胞、至少或至少约6.0x108个g-NK细胞、至少或至少约7.0x108个g-NK细胞、至少或至少约8.0x108个g-NK细胞、至少或至少约9.0x108个g-NK细胞、至少或至少约1.0x109个g-NK细胞、至少或至少约1.5x109个g-NK细胞、至少或至少约2.0x109个g-NK细胞、至少或至少约3.0x109个g-NK细胞、至少或至少约4.0x109个g-NK细胞、至少或至少约5.0x109个g-NK细胞或更多、至少或至少约1.0x1010个g-NK细胞或更多、至少或至少约1.5x1010个g-NK细胞或更多、至少或至少约2.0x1010个g-NK细胞或更多、或至少或至少约2.5x1010个g-NK细胞或更多。
在一些实施方案中，所提供的方法导致g-NK细胞的优先扩增。在一些方面，通过一种或多种不同标记物的表面表达的存在、不存在或水平来鉴定g-NK细胞，所述一种或多种不同标记物的表面表达的存在、不存在或水平将NK细胞与其他淋巴细胞或免疫细胞区分开，并且将g-NK细胞与常规NK细胞区分开。在实施方案中，表面表达可以通过流式细胞术来测定，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体与所述标记物的结合来测定。可以进行类似的方法来评估细胞内标记物的表达，不同之处在于，此类方法通常包括在染色以通过流式细胞术检测细胞内蛋白质之前用于固定和透化的方法。在一些实施方案中，使用甲醛(例如0.01％)实现固定，接着使用洗涤剂(例如0.1％至1％洗涤剂，例如为或约0.5％洗涤剂)(如Triton、NP-50、Tween 20、皂苷、洋地黄皂苷或Leucoperm)破坏膜。
抗体和其他结合实体可以用于检测标记物蛋白质的表达水平，以鉴定、检测、富集和/或分离所述g-NK细胞。合适的抗体可以包括多克隆、单克隆、片段(如Fab片段)、单链抗体和其他形式的特异性结合分子。
在一些实施方案中，如果在细胞上或细胞中存在可检测到的特定标记物(其可以是细胞内标记物或表面标记物)，则所述细胞(例如NK细胞子集)对于所述特定标记物呈阳性(pos)。在实施方案中，如果染色是在如下水平下可检测到的，则表面表达呈阳性：显著高于在其他方面相同的条件下用同位素匹配的对照进行相同程序所检测到的染色的水平和/或显著类似于或在一些情况下高于已知对于所述标记物呈阳性的细胞的水平和/或高于已知对于所述标记物呈阴性的细胞的染色的水平。
在一些实施方案中，如果在细胞上或细胞中不可检测到特定标记物(其可以是细胞内标记物或表面标记物)的存在，则所述细胞(例如NK细胞子集)对于特定标记物呈阴性(neg)。在实施方案中，如果染色是在如下水平下不可检测到的，则表面表达是阴性的：显著高于在其他方面相同的条件下用同位素匹配的对照进行相同程序所检测到的染色的水平和/或显著低于已知对于所述标记物呈阳性的细胞的水平和/或显著类似于已知对于所述标记物呈阴性的细胞的水平。
在一些实施方案中，如果与已知对于特定标记物呈阳性的细胞相比，可检测到特定标记物在细胞上或细胞中以较低水平存在，则所述细胞(例如NK细胞子集)对于所述标记物是低的(lo或min)。在实施方案中，表面表达可以通过流式细胞术来测定，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体与所述标记物的结合来测定，其中如果染色是在低于已知对于所述标记物呈阳性的细胞的水平下，则表达(取决于所使用的方法，表面或细胞内表达)是低的。
在一些实施方案中，g-NK细胞是具有NK细胞表型(例如CD45pos、CD3neg和/或CD56pos)的细胞，并且表达鉴定g-NK细胞子集或与其相关的一种或多种标记物。
在一些实施方案中，g-NK细胞是如公开专利申请号US 2013/0295044或Zhang等人(2013)J.Immunol.,190:1402-1406中所述来鉴定的。
在一些实施方案中，g-NK细胞是不表达大量FcRγ但表达至少一种天然杀伤细胞标记物的细胞。FcRγ链(智人(Homo sapiens)，也称为高亲和力免疫球蛋白γFc受体I)的氨基酸序列可在NCBI数据库中以登录号NP—004097.1(GI:4758344)获得，并在以下复制为SEQ ID NO:1。
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ(SEQ ID NO:1)
在一些实施方案中，可以通过观察FcRγ是由NK细胞群体还是NK细胞亚群表达来检测NK细胞的g-NK细胞子集。在一些情况下，g-NK细胞被鉴定为不表达FcRγ的细胞。FcRγ蛋白是一种细胞内蛋白。因此，在一些方面，可以在例如通过固定和透化处理细胞以允许细胞内蛋白被检测到之后检测FcRγ的存在或不存在。在一些实施方案中，在细胞内检测之前，例如在细胞固定之前，还评估细胞的一种或多种表面标记物(CD45、CD3和/或CD56)。在一些实施方案中，g-NK细胞被鉴定、检测、富集和/或分离为呈CD45pos/CD3neg/CD56pos/FcRγneg的细胞。
在一些实施方案中，在不采用细胞内染色的情况下检测g-NK细胞的表达可能是有用的，例如像在所述样品的细胞要经受细胞分选或功能测定的情况下。虽然允许FcRγ的细胞内染色的处理(例如固定和透化)可以用于确认基本上纯的细胞群体的身份，但在许多情况下，当鉴定、检测或分离g-NK细胞时可以使用可在不损伤细胞的情况下检测到的细胞表面标记物。因此，在一些实施方案中，使用与NK细胞子集中的FcRγ的缺乏相关的替代标记物特征来鉴定g-NK细胞。在一些实施方案中，当细胞内蛋白(如FcRγ)的存在或不存在难以或不可能根据特定的细胞应用需要来评估时，替代标记物特征是特别有用的。
本文发现，细胞表面标记物的某些组合与g-NK细胞表型(即缺乏或缺少FcRγ的细胞内表达的细胞)相关，从而提供替代标记物特征，以不损伤细胞的方式鉴定或检测g-NK细胞。在一些实施方案中，本文提供的g-NK细胞的替代标记物特征是基于一种或多种标记物CD16(CD16pos)或CD57(CD57pos)的阳性表面表达和/或基于一种或多种标记物CD7(CD7dim /neg)、CD161(CD161neg)和/或NKG2A(NKG2Aneg)的低或阴性表面表达。在一些实施方案中，还评估细胞的一种或多种NK细胞表面标记物，如CD45、CD3和/或CD56。在一些实施方案中，可以用替代标记物特征CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg鉴定、检测、富集和/或分离g-NK细胞。在一些实施方案中，用替代标记物特征CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg鉴定、检测、富集和/或分离g-NK细胞。
本文提供了通过采用g-NK细胞的替代标记物特征鉴定或检测含有细胞群体的样品中的g-NK细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞样品与结合分子(如抗体或抗原结合片段)接触，所述结合分子对一种或多种标记物CD16、CD57、CD7、CD161和/或NKG2A具有特异性。在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞样品与对CD45、CD3和/或CD56具有特异性的结合分子(如抗体或抗原结合片段)接触。在所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种结合分子可以同时与所述样品接触。在所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种结合分子可以依序与所述样品接触。在一些实施方案中，在所述接触之后，所述方法可以包括在保留已经与所述一种或多种结合分子结合的细胞和/或从样品分离未结合的结合分子的条件下进行一次或多次洗涤。
在一些实施方案中，所述一种或多种结合分子(例如抗体)中的每一种可以直接或间接附接至用于检测对所述标记物呈阳性或阴性的细胞的标记。例如，所述结合分子(例如抗体)可以与所述标记缀合、偶联或连接。标记是本领域技术人员所熟知的。本文考虑的标记包括但不限于荧光染料、荧光蛋白、放射性同位素、发色团、金属离子、金颗粒(例如，胶体金颗粒)、银颗粒、具有强烈光散射特性的颗粒、磁性颗粒(例如，磁珠颗粒如
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磁珠)、多肽(例如，FLAGTM标签、人流感血球凝集素(HA)标签等)、酶(如过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)或磷酸酶(例如，碱性磷酸酶))、链霉亲和素、生物素、发光化合物(例如，化学发光底物)、寡核苷酸、特异性结合对的成员(例如，配体及其受体)和本领域熟知的用于当直接或间接附接至结合分子(例如，抗体)时可视化或检测所述抗体的其他标记。
可以使用许多熟知的用于评估表面标记物或蛋白质的表达水平的方法，如通过基于亲和力的方法，例如基于免疫亲和力的方法(例如在表面标记物的情境下，如通过流式细胞术)进行的检测。在一些实施方案中，所述标记是荧光团，并且用于检测或鉴定g-NK细胞的方法是通过流式细胞术。在一些实施方案中，不同的标记通过多色流式细胞术用于不同标记物中的每一种。
在一些实施方案中，所述方法包括使样品与对CD45、CD3、CD56、CD57、CD7和CD161具有特异性的结合分子接触。在一些此类实施方案中，g-NK细胞被鉴定或检测为具有所述g-NK细胞替代标记物特征CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括使样品与对CD45、CD3、CD56、NKG2A和CD161具有特异性的结合分子接触。在一些此类实施方案中，g-NK细胞被鉴定或检测为具有所述g-NK细胞替代标记物特征CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg的细胞。
在一些实施方案中，所提供的方法还可以包括分离或富集g-NK，如根据任何所提供的方法优先扩增的g-NK细胞。在一些此类实施方案中，可以获得基本上纯的g-NK细胞群体，如含有大于或大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的g-NK细胞的细胞群体，如使用任何所描述的标记物组或标记物组合所测定。抗体和其他结合分子可以用于检测标记物蛋白质的表达水平的存在或不存在，以用于分离或富集g-NK细胞。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FACs)进行分离或富集。在此类方法的例子中，使用如上所述的针对多种细胞表面标记物对细胞染色的方法，通过流式细胞术鉴定或检测g-NK细胞，并且将染色的细胞携带在流体流中，以用于收集对于与g-NK细胞相关的标记物呈阳性或阴性的细胞。
III.组合物和药物配制品
本文提供了含有扩增(如通过任何所提供的方法产生)的NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物含有NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，所述组合物含有g-NK细胞。特别地，所提供的组合物包括富集了g-NK细胞的细胞组合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含约5％-99％NKG2Cpos细胞或其子集，或在5％与99％(包含端值)之间的任何百分比的NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，与天然存在于从中分离细胞的受试者中的NKG2Cpos细胞或其子集相对于总NK细胞或总细胞的百分比相比，所述组合物可以包含NKG2Cpos细胞或其子集相对于总NK细胞或总细胞的增加或更大的百分比。在一些实施方案中，所述百分比增加至少或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多。
在一些实施方案中，所述组合物可以包含至少或至少约20％、至少或至少约30％、至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约81％、至少或至少约82％、至少或至少约83％、至少或至少约84％、至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％或基本上100％的NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，所述组合物包含多于50％的NKG2Cpos细胞或其子集。在另一个实施方案中，所述组合物包含多于70％的NKG2Cpos细胞或其子集。在另一个实施方案中，所述组合物包含多于80％的NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，所提供的组合物包括如下组合物，其中NKG2Cpos细胞或其子集构成所述组合物中所述细胞或所述组合物中NK细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％或更多。
在一些实施方案中，所述组合物包含约5％-99％g-NK细胞或在5％与99％之间的任何百分比的g-NK细胞。在一些实施方案中，与天然存在于从中分离细胞的受试者中的g-NK细胞相对于总NK细胞或总细胞的百分比相比，所述组合物可以包含g-NK细胞相对于总NK细胞或总细胞的增加或更大的百分比。在一些实施方案中，所述百分比增加至少或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多。
在一些实施方案中，所述组合物可以包含至少或至少约20％、至少或至少约30％、至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约81％、至少或至少约82％、至少或至少约83％、至少或至少约84％、至少或至少约85％、至少或至少约86％、至少或至少约87％、至少或至少约88％、至少或至少约89％、至少或至少约90％、至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％或基本上100％的g-NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含多于50％的g-NK细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含多于70％的g-NK细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含多于80％的g-NK细胞。在一些实施方案中，所提供的组合物包括如下组合物，其中g-NK细胞或其子集构成所述组合物中所述细胞或所述组合物中NK细胞的至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％或更多。
在一些实施方案中，所述组合物包含天然杀伤(NK)细胞子集群体，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞具有呈CD57pos的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述组合物中从或从约70％至为或约90％的细胞具有所述表型CD57pos。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约72％、至少或至少约74％、至少或至少约76％、至少或至少约78％、至少或至少约80％、至少或至少约82％、至少或至少约84％、至少或至少约86％、至少或至少约88％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约94％、至少或至少约96％或至少或至少约98％的细胞具有所述表型CD57pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含所述表型CD57pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含所述表型CD57pos。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD3neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于50％呈FcRγneg，任选地在为或约50％与90％之间呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
在一些实施方案中，所述组合物包含天然杀伤(NK)细胞子集群体，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞具有呈CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述组合物中从或从约70％至为或约90％的细胞具有所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约72％、至少或至少约74％、至少或至少约76％、至少或至少约78％、至少或至少约80％、至少或至少约82％、至少或至少约84％、至少或至少约86％、至少或至少约88％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约94％、至少或至少约96％或至少或至少约98％的细胞具有所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD3neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于50％呈FcRγneg，任选地在为或约50％与90％之间呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
在一些实施方案中，所述组合物包含天然杀伤(NK)细胞子集群体，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞具有呈CD38neg的表型。在一些实施方案中，所述组合物中从或从约70％至为或约90％的细胞具有所述表型CD38neg。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约72％、至少或至少约74％、至少或至少约76％、至少或至少约78％、至少或至少约80％、至少或至少约82％、至少或至少约84％、至少或至少约86％、至少或至少约88％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约94％、至少或至少约96％或至少或至少约98％的细胞具有所述表型CD38neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含所述表型CD38neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含所述表型CD38neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD3neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于50％呈FcRγneg，任选地在为或约50％与90％之间呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
在一些实施方案中，所述组合物包含天然杀伤(NK)细胞子集群体，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞具有呈CD16pos的表型。在一些实施方案中，所述组合物中从或从约70％至为或约90％的细胞具有所述表型CD16pos。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约72％、至少或至少约74％、至少或至少约76％、至少或至少约78％、至少或至少约80％、至少或至少约82％、至少或至少约84％、至少或至少约86％、至少或至少约88％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约94％、至少或至少约96％或至少或至少约98％的细胞具有所述表型CD16pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含所述表型CD16pos。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含所述表型CD16pos。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD3neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于50％呈FcRγneg，任选地在为或约50％与90％之间呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
在一些实施方案中，所述组合物包含天然杀伤(NK)细胞子集群体，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％或至少或至少约95％的细胞具有呈NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。在一些实施方案中，所述组合物中从或从约70％至为或约90％的细胞具有所述表型NKG2Aneg/CD161neg。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约72％、至少或至少约74％、至少或至少约76％、至少或至少约78％、至少或至少约80％、至少或至少约82％、至少或至少约84％、至少或至少约86％、至少或至少约88％、至少或至少约90％、至少或至少约92％、至少或至少约94％、至少或至少约96％或至少或至少约98％的细胞具有所述表型NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含所述表型NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含所述表型NKG2Aneg/CD161neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD3neg。在一些实施方案中，所述表型还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于50％呈FcRγneg，任选地在为或约50％与90％之间呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，在具有这种表型的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约106个细胞至为或约1012个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约106至为或约1011个细胞、从为或约106至为或约1010个细胞、从为或约106至为或约109个细胞、从为或约106至为或约108个细胞、从为或约106至为或约107个细胞、从为或约107至为或约1012个细胞、从为或约107至为或约1011个细胞、从为或约107至为或约1010个细胞、从为或约107至为或约109个细胞、或从为或约107至为或约108个细胞、从为或约108至为或约1012个细胞、从为或约108至为或约1011个细胞、从为或约108至为或约1010个细胞、从为或约108至为或约109个细胞、从为或约109至为或约1012个细胞、从为或约109至为或约1011个细胞、从为或约109至为或约1010个细胞、从为或约1010至为或约1012个细胞、从为或约1010至为或约1011个细胞或从为或约1011至为或约1012个细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约106个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含为或约106至为或约1010个细胞、为或约106至为或约109个细胞、为或约106至为或约108个细胞、为或约106至为或约107个细胞、为或约107至为或约1010个细胞、为或约107至为或约109个细胞、为或约107至为或约108个细胞、为或约108至为或约1010个细胞、为或约108至为或约109个细胞、或为或约109至为或约1010个细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约108个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约109个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约1010个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约1011个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约108至为或约1011个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约108至为或约1010个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约108至为或约109个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约109至为或约1011个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约109至为或约1010个细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含从为或约1010至为或约1011个细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含至少或至少约106个g-NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述组合物包含为或约106至为或约1010个g-NK细胞、为或约106至为或约109个g-NK细胞、为或约106至为或约108个g-NK细胞、为或约106至为或约107个g-NK细胞、为或约107至为或约1010个g-NK细胞、为或约107至为或约109个g-NK细胞、为或约107至为或约108个g-NK细胞、为或约108至为或约1010个g-NK细胞、为或约108至为或约109个g-NK细胞、或为或约109至为或约1010个g-NK细胞。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞呈FcRγneg。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。在一些实施方案中，所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。在一些任何所提供的实施方案中，所述g-NK细胞或具有g-NK替代标记物特征的细胞还包括所述表面表型CD45pos/CD3neg/CD56pos。
在任何所提供的组合物的特定实施方案中，所述组合物中的细胞来自同一供体。因此，所述组合物不包含来自一个或多个不同供体的混合细胞群体。如此处所提供，所述扩增的方法导致如下高产扩增：大于或等于500倍、大于或等于600倍、大于或等于700倍、大于或等于800倍、大于或等于900倍、大于或等于1000倍或更多的某些NK细胞子集、特别是g-NK细胞子集或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含其的NK细胞子集(如上述任何NK细胞子集)。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约1000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2000倍大。在一些任何实施方案中，所述增加是为或约2500倍大。在特定实施方案中，扩增导致某些NK细胞子集、特别是g-NK细胞子集或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含其的NK细胞子集(如上述任何NK细胞子集)的数量的为或约1,000倍增加。
在一些情况下，通过所提供的方法从获得自单一供体的NK细胞的初始来源实现的扩增可以产生细胞组合物，以提供用于施用至有需要的受试者的多个单独剂量。因此，所提供的方法特别适用于同种异体方法。在一些情况下，根据所提供的方法从分离自一个供体的NK细胞的起始群体的单次扩增可以导致用于施用至有需要的受试者的大于或大于约20个单独剂量，如为或约30个单独剂量、40个单独剂量、50个单独剂量、60个单独剂量、70个单独剂量、80个单独剂量、90个单独剂量、100个单独剂量或作为在任何前述值之间的值的单独剂量。在一些实施方案中，所述单独剂量是从为或约1x105个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg，如从为或约1x105个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约1x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约7.5x105个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约5x105个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约2.5x105个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约1x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约7.5x105个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约5x105个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约1x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约7.5x105个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约2.5x106个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x106个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约5x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约5x106个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg或从为或约7.5x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg。在一些实施方案中，所述单独剂量是从为或约5x107至为或约10x109，如从为或约5x107至为或约5x109、从约或约5x107至为或约1x109、从为或约5x107至为或约5x108、从约或约5x107至为或约1x108、1x108至为或约10x109、从为或约1x108至为或约5x109、从约或约1x108至为或约1x109、从为或约1x108至为或约5x108、从为或约5x108至为或约10x109、从为或约5x108至为或约5x109、从约或约5x108至为或约1x109、从为或约1x109至为或约10x109、从为或约1x109至为或约5x109、或从为或约5x109至为或约10x109。在任何上述实施方案中，所述剂量是以细胞g-NK细胞或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含其的NK细胞子集(如上述任何NK细胞子集)的数量或任何前述项的活细胞的数量来给予。在任何上述实施方案中，所述剂量是以通过所述方法产生的扩增细胞的组合物中的细胞数量或任何前述项的活细胞数量来给予。
所述组合物包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，将工程化细胞与药学上可接受的载体一起配制。
药学上可接受的载体可以包括与药物施用相容的所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(Gennaro,2000,Remington:The science andpractice of pharmacy,Lippincott,Williams&Wilkins,宾夕法尼亚州费城)。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，如固定油。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。药物载体应是适用于NK细胞的载体，如盐水溶液、右旋糖溶液或包含人血清白蛋白的溶液。
在一些实施方案中，用于此类组合物的药学上可接受的载体或媒介物是如下任何无毒的水溶液，在所述无毒的水溶液中NK细胞可以在足以允许施用活NK细胞的时间内维持或保持存活。例如，所述药学上可接受的载体或媒介物可以是盐溶液或缓冲盐溶液。药学上可接受的载体或媒介物还可以包括可提高NK细胞的效率的各种生物材料。细胞媒介物和载体可以例如包括多糖如甲基纤维素(M.C.Tate,D.A.Shear,S.W.Hoffman,D.G.Stein,M.C.LaPlaca,Biomaterials 22,1113,2001，将其通过引用以其整体并入本文)、壳聚糖(Suh J K F,Matthew H W T.Biomaterials,21,2589,2000；Lahiji A,Sohrabi A,Hungerford D S,等人,J Biomed Mater Res,51,586,2000，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、N-异丙基丙烯酰胺共聚物P(NIPAM-共-AA)(Y.H.Bae,B.Vernon,C.K.Han,S.W.Kim,J.Control.Release 53,249,1998；H.Gappa,M.Baudys,J.J.Koh,S.W.Kim,Y.H.Bae,Tissue Eng.7,35,2001，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、以及聚(氧乙烯)/聚(D,L-乳酸共乙醇酸)(B.Jeong,K.M.Lee,A.Gutowska,Y.H.An,Biomacromolecules3,865,2002，将其通过引用以其整体并入本文)、P(PF-共-EG)(Suggs LJ,Mikos A G.Cell Trans,8,345,1999，将其通过引用以其整体并入本文)、PEO/PEG(MannB K,Gobin A S,Tsai A T,Schmedlen R H,West J L.,Biomaterials,22,3045,2001；Bryant S J,Anseth K S.Biomaterials,22,619,2001，将其每一个通过引用以其整体并入本文)、PVA(Chih-Ta Lee,Po-Han Kung和Yu-Der Lee,Carbohydrate Polymers,61,348,2005，将其通过引用以其整体并入本文)、胶原蛋白(Lee C R,Grodzinsky A J,SpectorM.,Biomaterials 22,3145,2001，将其通过引用以其整体并入本文)、藻酸盐(Bouhadir KH,Lee K Y,Alsberg E,Damm K L,Anderson K W,Mooney D J.Biotech Prog 17,945,2001；Smidsrd O,Skjak-Braek G.,Trends Biotech,8,71,1990，将其每一个通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，所述NK细胞(如NKG2Cpos细胞)或其子集可以以有效量存在于所述组合物中。在一些实施方案中，所述组合物含有有效量的g-NK细胞，如FcRγneg细胞或具有其g-NK替代标记物特征的细胞。细胞的有效量可以根据患者以及疾病的类型、严重性和程度而变化。因此，医生可以在考虑受试者的健康、疾病的程度和严重性以及其他变量后确定有效量。
在某些实施方案中，所述组合物中此类细胞的数量是治疗有效量。在一些实施方案中，所述量是降低动物中与癌症、病毒感染、微生物感染或脓毒性休克相关的严重性、持续时间和/或症状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是细胞的剂量，其导致相对于未施用本文所述组合物的患者(或动物)或一组患者(或动物)中癌症的生长或扩散，施用所述组合物的患者或动物中癌症的生长或扩散减少至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，治疗有效量是导致细胞毒性活性的量，所述细胞毒性活性导致抑制或减少癌症、病毒和微生物细胞生长的活性。
在一些实施方案中，所述组合物包含如下量的NKG2Cpos细胞或其子集：从为或约105至为或约1012个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约105至为或约108个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约106至为或约1012个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约108至为或约1011个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约109至为或约1010个NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，所述组合物包含大于或大于约105个NKG2Cpos细胞或其子集、大于或大于约106个NKG2Cpos细胞或其子集、大于或大于约107个NKG2Cpos细胞或其子集、大于或大于约108个NKG2Cpos细胞或其子集、大于或大于约109个NKG2Cpos细胞或其子集、大于或大于约1010个NKG2Cpos细胞或其子集、大于或大于约1011个NKG2Cpos细胞或其子集、或大于或大于约1012个NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，可以将这种量施用至患有疾病或病症的受试者，如施用至癌症患者。
在一些实施方案中，所述组合物包含如下量的g-NK细胞：从为或约105至为或约1012个g-NK细胞、或从为或约105至为或约108个g-NK细胞、或从为或约106至为或约1012个g-NK细胞、或从为或约108至为或约1011个g-NK细胞、或从为或约109至为或约1010个g-NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含大于或大于约105个g-NK细胞、大于或大于约106个g-NK细胞、大于或大于约107个g-NK细胞、大于或大于约108个g-NK细胞、大于或大于约109个g-NK细胞、大于或大于约1010个g-NK细胞、大于或大于约1011个g-NK细胞或大于或大于约1012个g-NK细胞。在一些实施方案中，可以将这种量施用至患有疾病或病症的受试者，如施用至癌症患者。
在一些实施方案中，组合物的体积是至少或至少约10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL，如从或从约10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述组合物具有至少或至少约1x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案，所述组合物的细胞密度是在或在约1x105个细胞/mL至1x108个细胞/mL之间、1x105个细胞/mL至1x107个细胞/mL之间、1x105个细胞/mL至1x106个细胞/mL之间、1x106个细胞/mL至1x107个细胞/mL之间、1x106个细胞/mL至1x108个细胞/mL之间、1x106个细胞/mL至1x107个细胞/mL之间或1x107个细胞/mL至1x108个细胞/mL之间，每个都包含端值。
在一些实施方案中，包括药物组合物在内的所述组合物是无菌的。在一些实施方案中，在封闭或无菌环境中进行细胞分离或富集，例如，以最小化误差、用户操作和/或污染。在一些实施方案中，可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
本文还提供了适用于低温保存所提供的NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含低温保护剂。在一些实施方案中，所述低温保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于低温保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。
在一些实施方案中，所述组合物可以在施用至患者之前在超低温下保存。在一些方面，可以如根据所提供的方法分离、处理和扩增NK细胞子集(如g-NK细胞)，然后在施用至受试者之前将其在超低温下储存。
一种在超低温下小规模保存的典型方法描述于例如美国专利号6,0168,991中。对于小规模，细胞可通过在预先冷却的5％人白蛋白血清(HAS)中的低密度悬浮液(例如，浓度为约200×106/ml)在超低温下保存。可向HAS溶液中加入等量的20％DMSO。可将混合物的等分试样放入小瓶中，并在约-80℃的超低温室内冷冻过夜。
在一些实施方案中，所述低温保存的NK细胞通过解冻准备用于施用。在一些情况下，可将NK细胞在解冻后立即施用至受试者。在这种实施方案中，所述组合物无需任何进一步处理即可使用。在其他情况下，NK细胞在解冻后被进一步处理，如通过用药学上可接受的载体重悬、用激活剂或刺激剂孵育、或者在施用至受试者之前被激活洗涤并重悬在药学上可接受的缓冲液中。
IV.治疗方法
本文提供了与所提供的包含本文所述g-NK细胞的细胞组合物有关的组合物和方法，所述组合物和方法用于治疗受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用任何所提供的组合物，如包含g-NK细胞的组合物。在特定实施方案中，所述组合物通过本文提供的方法来制备。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如涉及向患有疾病、病症或障碍的受试者施用所述治疗性细胞或含有所述分子的组合物。在一些情况下，所述疾病或障碍是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，以有效量施用所述细胞或其药物组合物以实现所述疾病或障碍的治疗。用途包括所述细胞或其药物组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，该方法由此治疗该受试者的该疾病或病症或障碍。
在一些实施方案中，所述治疗方法或用途涉及将有效量的含有通过所提供的方法产生的扩增的NK细胞组合物的组合物施用至个体。在一些实施方案中，将从为或约105至为或约1012、或从为或约105至为或约108、或从为或约106至为或约1012、或从为或约108至为或约1011、或从为或约109至为或约1010个此类扩增的NK细胞施用至个体受试者。在一些实施方案中，将含有为或大于或大于约105、为或大于或大于约106、为或大于或大于约107、为或大于或大于约108、为或大于或大于约109、为或大于或大于约1010、为或大于或大于约1011、或为或大于或大于约1012个此类扩增的NK细胞的细胞剂量施用至所述个体。在一些实施方案中，将从或从约106至1010个此类扩增的NK细胞/kg施用至所述受试者。
在一些实施方案中，所述治疗方法或用途涉及将有效量的任何所提供的NK细胞组合物(包括如第III节中所述的任一种)施用至个体。在一些实施方案中，将从为或约105至为或约1012、或从为或约105至为或约108、或从为或约106至为或约1012、或从为或约108至为或约1011、或从为或约109至为或约1010个来自任何所提供的组合物的NK细胞施用至个体受试者。在一些实施方案中，将含有为或大于或大于约105、为或大于或大于约106、为或大于或大于约107、为或大于或大于约108、为或大于或大于约109、为或大于或大于约1010、为或大于或大于约1011、或为或大于或大于约1012个来自任何所提供的组合物的NK细胞的细胞剂量施用至所述个体。在一些实施方案中，将从或从约106至1010个任何所提供的组合物的NK细胞/kg施用至所述受试者。
在一些实施方案中，所述治疗方法或用途涉及将有效量的含有NKG2Cpos细胞群体或其子集的组合物施用至个体。在一些实施方案中，从为或约105至为或约1012个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约105至为或约108个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约106至为或约1012个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约108至为或约1011个NKG2Cpos细胞或其子集、或从为或约109至为或约1010个NKG2Cpos细胞或其子集。在一些实施方案中，将含有为或大于或大于约105个NKG2Cpos细胞或其子集、为或大于或大于约106个NKG2Cpos细胞或其子集、为或大于或大于约107个NKG2Cpos细胞或其子集、为或大于或大于约108个NKG2Cpos细胞或其子集、为或大于或大于约109个NKG2Cpos细胞或其子集、为或大于或大于约1010个NKG2Cpos细胞或其子集、为或大于或大于约1011个NKG2Cpos细胞或其子集、或为或大于或大于约1012个NKG2Cpos细胞或其子集的细胞剂量施用至所述个体。在一些实施方案中，将从或从约106至1010个gNKG2Cpos细胞或其子集/kg受试者体重施用至所述受试者。
在一些实施方案中，所述治疗方法包括向个体施用有效量的含有g-NK细胞的组合物。在一些实施方案中，从为或约105至为或约1012个g-NK细胞、或从为或约105至为或约108个g-NK细胞、或从为或约106至为或约1012个g-NK细胞、或从为或约108至为或约1011个g-NK细胞、或从为或约109至为或约1010个g-NK细胞。在一些实施方案中，将含有为或大于或大于约105个g-NK细胞、为或大于或大于约106个g-NK细胞、为或大于或大于约107个g-NK细胞、为或大于或大于约108个g-NK细胞、为或大于或大于约109个g-NK细胞、为或大于或大于约1010个g-NK细胞、为或大于或大于约1011个g-NK细胞、或为或大于或大于约1012个g-NK细胞的细胞剂量施用至所述个体。在一些实施方案中，将从或从约106至1010个g-NK细胞/kg施用至所述受试者。
在一些实施方案中，根据任何所提供的治疗方法或用途的施用剂量是从为或约1x105个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg，如从为或约1x105个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约1x106个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约7.5x105个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约5x105个细胞/kg、从为或约1x105个细胞/kg至为或约2.5x105个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约1x106个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约7.5x105个细胞/kg、从为或约2.5x105个细胞/kg至为或约5x105个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约1x106个细胞/kg、从为或约5x105个细胞/kg至为或约7.5x105个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约1x106个细胞/kg至为或约2.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约2.5x106个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg、从为或约2.5x106个细胞/kg至为或约5x106个细胞/kg、从为或约5x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg、从为或约5x106个细胞/kg至为或约7.5x106个细胞/kg或从为或约7.5x106个细胞/kg至为或约1x107个细胞/kg。在一些实施方案中，所述剂量是以g-NK细胞或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含其的NK细胞子集(如本文任何NK细胞子集)的数量或任何前述项的活细胞的数量来给予。在任何上述实施方案中，所述剂量是以通过所提供的方法产生的扩增细胞的组合物中的细胞数量或任何前述项的活细胞数量来给予。
在一些实施方案中，根据所述治疗方法或用途的施用剂量是从为或约5x107至为或约10x109，如从为或约5x107至为或约5x109、从约或约5x107至为或约1x109、从为或约5x107至为或约5x108、从约或约5x107至为或约1x108、1x108至为或约10x109、从为或约1x108至为或约5x109、从约或约1x108至为或约1x109、从为或约1x108至为或约5x108、从为或约5x108至为或约10x109、从为或约5x108至为或约5x109、从约或约5x108至为或约1x109、从为或约1x109至为或约10x109、从为或约1x109至为或约5x109、或从为或约5x109至为或约10x109。在一些实施方案中，所述剂量是以g-NK细胞或与g-NK细胞的替代标记物相关或包含其的NK细胞子集(如本文任何NK细胞子集)的数量或任何前述项的活细胞的数量来给予。在任何上述实施方案中，所述剂量是以通过所提供的方法产生的扩增细胞的组合物中的细胞数量或任何前述项的活细胞数量来给予。
在一些实施方案中，根据所提供的方法扩增后不久将含有扩增的NK细胞的组合物施用至个体。在其他实施方案中，在如通过上述方法施用之前，通过在培养物中生长来储存或扩增所述扩增的NK细胞。例如，在向所述个体施用之前，所述NK细胞可以储存大于6、12、18或24个月。
在一些实施方案中，可以将所提供的含有NK细胞及其子集(如g-NK细胞)的组合物通过任何方便的途径(包括肠胃外途径，如皮下、肌内、静脉内和/或硬膜外施用途径)施用至受试者。
所提供的NK细胞及其子集(如g-NK细胞)以及组合物可以用于治疗患有肿瘤或过度增殖性障碍或微生物感染如病毒感染、酵母感染、真菌感染、原生动物感染和/或细菌感染的个体的方法中。所公开的使用所提供的NK细胞及其子集(如g-NK细胞)以及组合物治疗受试者的方法可以与治疗性单克隆抗体(如抗肿瘤抗原或抗癌抗体、抗病毒抗体或抗细菌抗体)组合。可以施用所提供的NK细胞及其子集(如g-NK细胞)以及组合物以用于治疗动物，如哺乳动物，例如人受试者。
在一些例子中，所述方法包括治疗过度增殖性障碍，如血液恶性肿瘤或实体瘤。可以用本文所述的组合物治疗的癌症和增殖性障碍的类型的例子包括但不限于白血病(例如，成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、尤因氏肿瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肾细胞癌、肝癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非典型性增生和增生。癌症的治疗和/或预防包括但不限于减轻与癌症相关的一种或多种症状，抑制或减少癌症的进展，促进癌症的消退和/或促进免疫反应。
在一些例子中，所述方法包括治疗病毒感染，如由体内病毒的存在引起的感染。病毒感染包括慢性或持续性病毒感染，其是能够感染宿主并在证明致命之前在宿主的细胞内长时间(通常为数周、数月或数年)繁殖的病毒感染。可根据本发明治疗的引起慢性感染的病毒包括，例如，人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒和其他疱疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒以及其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和麻疹病毒，所有这些均可产生重要的临床疾病。长期感染可能最终导致疾病的诱发，例如在丙型肝炎病毒肝癌的情况下，对患者是致命的。可根据本发明治疗的其他慢性病毒感染包括爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)，以及其他病毒，如可能与肿瘤相关的那些病毒。
可用本文所述的组合物和方法治疗或预防的病毒感染的例子包括但不限于由以下引起的病毒感染：逆转录病毒(例如，I型和II型人T细胞淋巴细胞营养型病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，I型和II型单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦巴尔病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、角膜病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病病毒和日本脑炎病毒)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘液病毒(例如，仙台病毒以及甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳头病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)。病毒感染的治疗和/或预防包括但不限于减轻与所述感染相关的一种或多种症状，抑制、减少或抑制病毒复制，和/或增强免疫反应。
在一些实施方案中，所提供的NK细胞及其子集(如g-NK细胞)以及组合物用于治疗酵母或细菌感染的方法中。例如，所提供的g-NK细胞和本文所述的组合物和方法可以治疗与以下相关的感染：酿脓链球菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟氏菌、白喉棒状杆菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)、鼻硬结克雷伯氏菌(Klebsiella rhinoscleromotis)、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、胎儿弯曲杆菌(弧菌)、空肠弯曲杆菌、嗜水气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、迟钝爱德华氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、梅毒螺旋体、梅毒螺旋体、斑点病密螺旋体、奋森氏螺旋体、伯氏疏螺旋体、出血性黄疸钩端螺旋体、结核分支杆菌、弓形虫、卡氏肺孢子虫、土拉弗朗西斯菌、流产布氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、支原体属、立克次体、立克次体虫、衣原体属、幽门螺杆菌或其组合。
A.组合疗法
在一些实施方案中，含有如本文所提供的g-NK细胞的组合物可以在具有用于治疗受试者的疾病或病症的一种或多种其他药剂的组合疗法中施用。在此类实施方案中，含有如本文所提供的g-NK细胞的组合物可以在施用一种或多种其他药剂之前、与其同时或随后(之后)施用。例如，所述g-NK细胞可以与抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂同时或依序施用。示例性组合疗法在描述于以下小节中。
1.抗体组合
在一些实施方案中，如与常规NK细胞相比，含有如本文所提供的g-NK细胞的组合物当被抗体或含Fc的蛋白质激活或与其接触时展现出增强的活性。例如，可通过抗体介导的CD16的交联或通过抗体包被的肿瘤细胞激活g-NK细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的病症的方法，所述方法包括向受试者施用g-NK细胞或其组合物和抗体。如取决于个体的特定疾病或病症，本领域普通技术人员可选择适当的治疗性(例如抗癌)单克隆抗体，以与所提供的NK细胞和本文所述的组合物一起施用至所述受试者。合适的抗体可以包括多克隆、单克隆、片段(如Fab片段)、单链抗体和其他形式的特异性结合分子。
在一些实施方案中，所述抗体还可以包括人源化或人抗体。非人抗体的人源化形式是嵌合Ig、Ig链或片段(如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其他抗原结合子序列)，其含有来源于非人Ig的最小序列。在一些实施方案中，所述抗体包含Fc结构域。
通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来实现(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；Verhoeyen等人,1988)。此类“人源化”抗体是嵌合抗体(1989)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些Fc残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。人源化抗体包括人抗体(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的具有所希望特异性、亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，相应的非人残基替代人抗体的Fv框架残基。人源化抗体可以包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个(并且典型地两个)可变结构域的基本上全部，其中大多数(如果不是全部)CDR区与非人Ig的CDR区对应并且大多数(如果不是全部)FR区是人抗体共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含抗体恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人抗体恒定区(Jones等人,1986；Presta,1992；Riechmann等人,1988)。
人抗体还可使用各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom等人,1991；Marks等人,1991)和人mAb的制备(Boerner等人,1991；Reisfeld和Sell,1985)。类似地，可利用在其中内源抗体基因已经部分或完全失活的转基因动物中引入人Ig基因来合成人Ab。在激发后，观察到人抗体产生，这在各个方面均与在人中观察到的类似，包括基因重排、组装和抗体库(1997a；1997b；1997c；1997d；1997；1997；Fishwild等人,1996；1997；1997；2001；1996；1997；1997；1997；Lonberg和Huszar,1995；Lonberg等人,1994；Marks等人,1992；1997；1997；1997)。
特别地，本发明的细胞可通过与识别肿瘤相关抗原的抗体一起施用来靶向肿瘤。本领域普通技术人员将理解，本发明的g-NK细胞适合与识别肿瘤相关抗原的多种抗体一起使用。肿瘤相关抗原的非限制性例子包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。在一些情况下，所述抗体是抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)、抗HER2抗体(例如西妥昔单抗)、抗CD52抗体、抗EGFR抗体和抗CD38抗体(例如达雷木单抗)、抗SLAMF7抗体(例如埃罗妥珠单抗)。
在具有包含g-NK细胞的细胞组合物的组合疗法中的可用于所提供的方法中的非限制性抗体包括曲妥珠单抗
Figure BDA0003169946540000731
雷莫芦单抗
Figure BDA0003169946540000732
阿特朱单抗(TecentriqTM)、纳武单抗
Figure BDA0003169946540000733
度伐单抗(ImfinziTM)、阿维鲁单抗
Figure BDA0003169946540000734
派姆单抗
Figure BDA0003169946540000735
贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000736
依维莫司
Figure BDA0003169946540000737
帕妥珠单抗
Figure BDA0003169946540000738
曲妥珠单抗-美坦新偶联物
Figure BDA0003169946540000739
西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007310
地诺单抗
Figure BDA00031699465400007311
利妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007312
阿仑单抗
Figure BDA00031699465400007313
奥法木单抗
Figure BDA00031699465400007314
阿托珠单抗
Figure BDA00031699465400007315
耐昔妥珠单抗(PortrazzaTM)、替伊莫单抗
Figure BDA00031699465400007316
维汀-本妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007317
司妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007318
硼替佐米
Figure BDA00031699465400007319
达雷木单抗(DarzalexTM)、埃罗妥珠单抗(EmplicitiTM)、地努妥昔单抗(UnituxinTM)、奥拉木单抗(LartruvoTM)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、艾萨妥昔单抗(Isatuximab)、Truxima、Blitzima、Ritemvia、Rituzena、Herzuma、Ruxience、ABP 798、Kanjinti、Ogivry、BI 695500、Novex(RTXM83)、托西莫单抗或Ontruzant或其生物类似物。示例性抗体包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿洛珠单抗(aletuzumab)、阿仑单抗、达雷木单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗或埃罗妥珠单抗。
在一些实施方案中，所述抗体可以是抗PD-1或抗PD-L1抗体。靶向PD-1或PD-L1的抗体包括但不限于纳武单抗、派姆单抗或阿特朱单抗。
可选择对所选择癌症类型具有特异性的抗体，并且包括批准用于治疗癌症的任何抗体。例子包括乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin)、淋巴瘤的利妥昔单(Rituxan)和头颈部鳞状细胞癌的西妥昔单抗(Erbitux)。技术人员熟悉能够结合特定肿瘤或疾病抗原的经FDA批准的单克隆抗体，其中任一种均可根据所提供的治疗肿瘤或疾病的方法使用。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗胃或胃食管连接部的腺癌，并且所述抗体是曲妥珠单抗
Figure BDA0003169946540000741
或雷莫芦单抗
Figure BDA0003169946540000742
在一些实施方案中，所述方法用于治疗膀胱癌，并且所述抗体是阿特朱单抗(TecentriqTM)、纳武单抗
Figure BDA0003169946540000743
度伐单抗(ImfinziTM)、阿维鲁单抗
Figure BDA0003169946540000744
或派姆单抗
Figure BDA0003169946540000745
在一些实施方案中，所述方法用于治疗脑癌，并且所述抗体是贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000746
在一些实施方案中，所述方法用于治疗乳腺癌，并且所述抗体是曲妥珠单抗
Figure BDA0003169946540000747
在一些实施方案中，所述方法用于治疗宫颈癌，并且所述抗体是贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000748
在一些实施方案中，所述方法用于治疗结直肠癌，并且所述抗体是西妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000749
帕尼单抗
Figure BDA00031699465400007410
贝伐单抗
Figure BDA00031699465400007411
或雷莫芦单抗
Figure BDA00031699465400007412
在一些实施方案中，所述方法用于治疗内分泌/神经内分泌肿瘤，并且所述抗体是阿维鲁单抗
Figure BDA00031699465400007413
在一些实施方案中，所述方法用于治疗头颈癌，并且所述抗体是西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007414
派姆单抗
Figure BDA00031699465400007415
纳武单抗
Figure BDA00031699465400007416
曲妥珠单抗或雷莫芦单抗。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗骨癌，并且所述抗体是地诺单抗
Figure BDA00031699465400007417
在一些实施方案中，所述方法用于治疗肾癌，并且所述抗体是贝伐单抗
Figure BDA00031699465400007418
或纳武单抗
Figure BDA00031699465400007419
在一些实施方案中，所述方法用于治疗白血病，并且所述抗体是利妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007420
阿仑单抗
Figure BDA00031699465400007421
奥法木单抗
Figure BDA00031699465400007422
阿托珠单抗
Figure BDA00031699465400007423
或博纳吐单抗
Figure BDA00031699465400007424
在一些实施方案中，所述方法用于治疗肺癌，并且所述抗体是贝伐单抗
Figure BDA00031699465400007425
雷莫芦单抗
Figure BDA00031699465400007426
纳武单抗
Figure BDA00031699465400007427
耐昔妥珠单抗(PortrazzaTM)、派姆单抗
Figure BDA00031699465400007428
或阿特朱单抗(TecentriqTM)。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗淋巴瘤，并且所述抗体是替伊莫单抗
Figure BDA0003169946540000751
维汀-本妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000752
利妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000753
司妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000754
阿托珠单抗
Figure BDA0003169946540000755
纳武单抗
Figure BDA0003169946540000756
或派姆单抗
Figure BDA0003169946540000757
在一些实施方案中，所述方法用于治疗多发性骨髓瘤，并且所述抗体是硼替佐米
Figure BDA0003169946540000758
达雷木单抗(DarzalexTM)或埃罗妥珠单抗(EmplicitiTM)。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗神经母细胞瘤，并且所述抗体是地努妥昔单抗(UnituxinTM)。
在一些实施方案中，所述方法用于治疗卵巢上皮/输卵管/原发性腹膜癌，并且所述抗体是贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000759
在一些实施方案中，所述方法用于治疗胰腺癌，并且所述抗体是西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400007510
或贝伐单抗
Figure BDA00031699465400007511
在一些实施方案中，所述方法用于治疗皮肤癌，并且所述抗体是伊匹单抗
Figure BDA00031699465400007512
派姆单抗
Figure BDA00031699465400007513
阿维鲁单抗
Figure BDA00031699465400007514
或纳武单抗
Figure BDA00031699465400007515
在一些实施方案中，所述方法用于治疗软组织肉瘤，并且所述抗体是奥拉木单抗(LartruvoTM)。
可以依序或同时施用所述g-NK细胞和所述另外的药剂。在一些实施方案中，可以在施用所述g-NK细胞之前施用所述另外的药剂。在一些实施方案中，可以在施用所述g-NK细胞之后施用所述另外的药剂。例如，可以同时施用所述g-NK细胞与对所选择的癌症类型具有特异性的抗体。可替代地，可以在与施用对所选择癌症类型具有特异性的抗体的时间不同的选择时间施用所述g-NK细胞。
在特定例子中，在g-NK细胞群之前、之后或基本上同时向受试者施用有效剂量的抗体。在一些例子中，向受试者施用约0.1mg/kg至约100mg/kg的抗体(如约0.5-10mg/kg、约1-20mg/kg、约10-50mg/kg、约20-100mg/kg，例如约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约16mg/kg、约20mg/kg、约24mg/kg、约36mg/kg、约48mg/kg、约60mg/kg、约75mg/kg或约100mg/kg)。考虑到特定抗体、特定疾病或病症(例如肿瘤或其他障碍)、受试者的一般状况、受试者正在接受或先前已经接受的任何另外治疗以及其他相关因素，可由熟练的临床医生选择抗体的有效量。还向受试者施用本文所述的g-NK细胞群体。抗体和g-NK细胞群典型地两者均是肠道外施用的，例如静脉内施用的；然而，还可使用对肿瘤或肿瘤附近的注射或输注(局部施用)或对腹膜腔的施用。本领域技术人员可确定适当的施用途径。
2.细胞因子或生长因子
在本文所提供的一些实施方案中，可以将所述g-NK细胞与细胞因子和/或生长因子组合施用至个体。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21的生长因子。在特定实施方案中，将重组IL-2施用至所述受试者。在其他特定实施方案中，将重组IL-15施用至所述受试者。在一些实施方案中，依序施用所述g-NK细胞和细胞因子或生长因子。例如，可以首先施用所述g-NK细胞，接着施用所述细胞因子和/或生长因子。在一些实施方案中，将所述g-NK细胞与所述细胞因子或生长因子同时施用。
在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种细胞因子(如IL-2、IL-15、IL-21和/或IL-12)以支持NK细胞的存活和/或生长。可在NK细胞之前、之后或基本上同时施用所述一种或多种细胞因子。在一些例子中，可在NK细胞之后施用所述一种或多种细胞因子。在一个特定例子中，在施用NK细胞的约1-8小时内(如约1-4小时、约2-6小时、约4-6小时或约5-8小时内)向受试者施用所述一种或多种细胞因子。
3.化学治疗剂和多模式组合疗法
在一些实施方案中，所提供的方法还可以包括将g-NK细胞与癌症药物或治疗(如与化学治疗剂或细胞毒性剂或其他治疗)一起施用。
在一些实施方案中，所提供的方法还可以包括将g-NK细胞与化学治疗剂组合使用至个体。在一些实施方案中，所述化学治疗剂可包括环磷酰胺、氟达拉滨、甲基泼尼松。在一些实施方案中，所述化学治疗剂选自：沙利度胺、顺铂(顺式-DDP)、奥沙利铂、卡铂、蒽二酮、米托蒽醌；羟基脲、甲基肼衍生物、甲基苄肼(N-甲基肼，MM)、肾上腺皮质抑制剂、米托坦(.omicron..rho.'-DDD)、氨鲁米特、RXR激动剂、贝沙罗汀、酪氨酸激酶抑制剂、伊马替尼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-肌溶素)、苯丁酸氮芥、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、六甲基三聚氰胺、噻替帕、白消安、卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNTJ)、洛莫司汀(CCNU)、链脲霉素(脲佐菌素)、DNA合成拮抗剂、雌莫司汀磷酸盐、三嗪、达卡巴嗪(OTIC，二甲基三叠氮基咪唑甲酰胺)、替莫唑胺、叶酸类似物、甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、嘧啶类似物、氟尿嘧啶(fiuorouracin)(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，5-FU，5FTJ)、氟尿苷(氟脱氧>'尿苷，FUdR)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、吉西他滨、嘌呤类似物、巯基嘌呤(6-巯基嘌呤，6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤，TG)、喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素，脱氧助间型霉素)、克拉屈滨和氟达拉滨、拓扑异构酶抑制剂、安吖啶、长春花生物碱、长春碱(VLB)、长春新碱、紫杉烷、紫杉醇、纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)，结合蛋白的紫杉醇(Abraxane(R))、多西紫杉醇(Taxotere(R))；表鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、放线菌素D(放线菌素D)、道诺霉素(柔红霉素、红比霉素)、阿霉素、脂质体阿霉素(Doxil)、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星、布舍瑞林、肾上腺皮质激素、泼尼松、孕激素、己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、甲地孕酮、己烯雌酚、乙炔雌二醇、他莫昔芬、阿那曲唑；丙酸睾酮、氟甲睾酮、氟他胺、比卡鲁胺和亮丙瑞林。
在一些实施方案中，所述癌症药物是细胞毒性剂，如细胞毒性小分子。在一些实施方案中，所述癌症药物是免疫调节剂、Bcl2抑制剂、P13K抑制剂、小分子蛋白酶体抑制剂、小分子酪氨酸、小分子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、蒽环类药物(anthracyline)、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇或分化剂。
在一些实施方案中，所述癌症药物是免疫调节剂。在一些实施方案中，所述癌症药物是沙利度胺或其衍生物。例如，在一些情况下，所述癌症药物是来那度胺或泊马度胺。在一些情况下，所述癌症药物是来那度胺。
在一些实施方案中，所述癌症药物是Bcl-2抑制剂。例如，所述癌症药物可以是维奈妥拉(Venetoclax)。
在一些实施方案中，所述癌症药物是P13K抑制剂。例如，所述癌症药物可以是艾代拉利斯(Idelaisib)。
在一些实施方案中，所述癌症药物是小分子酪氨酸。例如，所述癌症药物可以是甲磺酸伊马替尼。
在一些实施方案中，所述癌症药物是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。例如，所述癌症药物可以是塞利西利类(Sekiciclib)。
在一些实施方案中，所述癌症药物是烷基化剂。烷基化剂的例子包括但不限于六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺或噻替帕。
在一些实施方案中，所述癌症药物是抗代谢物。抗代谢药通过取代正常的RNA和DNA结构单元来干扰DNA和RNA生长。在细胞的染色体被复制的时期这些药剂损害所述细胞。它们通常用于治疗白血病、乳腺癌、卵巢癌和肠道癌、以及其他类型的癌症。抗代谢物的例子包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨
Figure BDA0003169946540000786
阿糖胞苷
Figure BDA0003169946540000787
氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
Figure BDA0003169946540000788
羟基脲、甲氨蝶呤或培美曲塞
Figure BDA0003169946540000789
在一些实施方案中，所述癌症药物是蒽环类药物。蒽环类药物通过改变癌细胞内部的DNA来阻止它们生长和繁殖。蒽环类药物是抗肿瘤抗生素，其干扰参与细胞周期中复制DNA的酶。它们被广泛用于各种癌症。给予蒽环类药物时的一个主要问题是，如果以高剂量给予，它们可能对心脏造成永久性损害。为此，通常对蒽环类药物施加终身剂量限制。在一些情况下，当与FcεRIγ缺陷型NK细胞(G-NK)组合施用时，这些药物的剂量和时间表可以减少。可用于所提供的组合疗法的蒽环类药物的例子包括但不限于道诺霉素、阿霉素
Figure BDA00031699465400007810
表柔比星或伊达比星。
在一些实施方案中，所述癌症药物是抗肿瘤抗生素。抗肿瘤抗生素的例子包括但不限于放线菌素D、博来霉素、丝裂霉素C或米托蒽醌。
在一些实施方案中，所述癌症药物是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶药物干扰称为拓扑异构酶的酶，所述酶帮助分离DNA链，从而使它们可以被复制。拓扑异构酶抑制剂根据它们所影响的酶的类型进行分组。拓扑异构酶抑制剂用于治疗某些白血病、以及肺癌、卵巢癌、胃肠癌和其他癌症。拓扑异构酶抑制剂可以是拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂的例子包括但不限于拓扑替康或伊立替康(CPT-11)。拓扑异构酶II抑制剂的例子包括但不限于依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷或米托蒽醌。
在一些实施方案中，所述癌症药物是有丝分裂抑制剂。有丝分裂抑制剂是这样的化合物，其通过阻止细胞分裂形成新细胞而起作用，但可以在所有时期通过阻止酶制造细胞繁殖所需的蛋白质来损害细胞。它们用于治疗许多不同类型的癌症，包括乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。这些药物可能导致神经损害，这可能限制可以给予的量。在一些情况下，当与FcεRIγ缺陷型NK细胞(G-NK)组合施用时，这些药物的剂量和时间表可以减少。有丝分裂抑制剂的非限制性例子包括但不限于多西紫杉醇、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱或长春瑞滨。
在一些实施方案中，所述癌症药物是皮质类固醇。皮质类固醇(通常简称为类固醇)是天然激素和激素样药物，可用于治疗多种类型的癌症以及其他疾病。当这些药物被用作癌症治疗的一部分时，它们被认为是化学治疗药物。皮质类固醇的非限制性例子包括但不限于泼尼松、甲基泼尼松龙
Figure BDA0003169946540000791
或地塞米松
Figure BDA0003169946540000792
在一些实施方案中，所述癌症药物是分化剂。分化剂的非限制性例子包括但不限于类视黄醇、维甲酸(ATRA或
Figure BDA0003169946540000793
)、贝沙罗汀
Figure BDA0003169946540000794
或三氧化二砷
Figure BDA0003169946540000795
在一些实施方案中，所述癌症药物选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。在某些实施方案中，所述癌症药物选自紫杉醇、Abraxane(R)和Taxotere(R)。在一个实施方案中，所述化学治疗剂选自天冬酰胺酶、贝伐单抗、博来霉素、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、羟基脲、链脲霉素和6-巯基嘌呤、环磷酰胺、紫杉醇和吉西他滨。
用于与g-NK细胞组合使用的癌症药物的其他非限制性例子包括但不限于依维莫司
Figure BDA0003169946540000796
托瑞米芬
Figure BDA0003169946540000797
氟维司群
Figure BDA0003169946540000798
阿那曲唑
Figure BDA0003169946540000799
依西美坦
Figure BDA00031699465400007910
拉帕替尼
Figure BDA00031699465400007911
来曲唑
Figure BDA00031699465400007912
帕妥珠单抗
Figure BDA00031699465400007913
曲妥珠单抗-美坦新偶联物
Figure BDA00031699465400007914
帕博西尼
Figure BDA00031699465400007915
瑞博西尼
Figure BDA00031699465400007916
Ziv-阿柏西普
Figure BDA00031699465400007917
瑞戈非尼
Figure BDA00031699465400007918
醋酸兰瑞肽(
Figure BDA00031699465400007919
Depot)、索拉非尼
Figure BDA00031699465400007920
舒尼替尼
Figure BDA00031699465400007921
帕唑帕尼
Figure BDA00031699465400007922
替西罗莫司
Figure BDA00031699465400007923
阿西替尼
Figure BDA00031699465400007924
卡博替尼(caboometyxTM)、甲磺酸乐伐替尼
Figure BDA00031699465400007925
甲磺酸伊马替尼
Figure BDA00031699465400007926
达沙替尼
Figure BDA00031699465400007927
尼洛替尼
Figure BDA00031699465400007928
博舒替尼
Figure BDA00031699465400007929
维甲酸
Figure BDA0003169946540000801
依鲁替尼
Figure BDA0003169946540000802
艾代拉利斯
Figure BDA0003169946540000803
维奈妥拉(VenclextaTM)、盐酸帕纳替尼
Figure BDA0003169946540000804
米哚妥林
Figure BDA0003169946540000805
克唑替尼
Figure BDA0003169946540000806
埃罗替尼
Figure BDA0003169946540000807
吉非替尼
Figure BDA0003169946540000808
双马来酸盐阿法替尼
Figure BDA0003169946540000809
色瑞替尼(LDK378/ZykadiaTM)、奥希替尼(TagrissoTM)、阿来替尼
Figure BDA00031699465400008010
布加替尼(AlunbrigTM)、Cyramza、地尼白介素
Figure BDA00031699465400008011
伏立诺他
Figure BDA00031699465400008012
罗米地辛
Figure BDA00031699465400008013
贝沙罗汀
Figure BDA00031699465400008014
硼替佐米
Figure BDA00031699465400008015
普拉曲沙
Figure BDA00031699465400008016
艾代拉利斯
Figure BDA00031699465400008017
贝利司他
Figure BDA00031699465400008018
苯达莫司汀、卡非佐米
Figure BDA00031699465400008019
帕比司他
Figure BDA00031699465400008020
枸橼酸依沙佐米
Figure BDA00031699465400008021
奥拉帕尼(LynparzaTM)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐(RubracaTM)、尼拉帕尼甲苯磺酸盐一水合物(ZejulaTM)、长春瑞滨
Figure BDA00031699465400008022
埃罗替尼
Figure BDA00031699465400008023
舒尼替尼
Figure BDA00031699465400008024
维莫德吉
Figure BDA00031699465400008025
索尼德吉
Figure BDA00031699465400008026
维罗非尼
Figure BDA00031699465400008027
曲美替尼
Figure BDA00031699465400008028
达拉非尼
Figure BDA00031699465400008029
考比替尼(CotellicTM)、阿利维甲酸
Figure BDA00031699465400008030
帕唑帕尼
Figure BDA00031699465400008031
阿利维甲酸
Figure BDA00031699465400008032
曲贝替定
Figure BDA00031699465400008033
或艾瑞布林
Figure BDA00031699465400008034
在一些实施方案中，将所述含有g-NK细胞的组合物与放射疗法一起施用。
在一些实施方案中，所述组合疗法是多模式癌症疗法，其涉及含有如本文提供的g-NK细胞的组合物、如上述任何一种的抗体、加上细胞毒性小分子或细胞毒性放射疗法的组合。在一些实施方案中，将所述细胞毒性小分子或放射疗法单独地(如在施用含有g-NK细胞的组合物之前或之后)施用至所述受试者。在一些实施方案中，将所述细胞毒性小分子或放射疗法与所述含有g-NK细胞的组合物同时(如在同一时间或大约同一时间)施用至所述受试者。在一些情况下，多模式癌症疗法还可以包括施用一种或多种细胞因子或生长因子(如IL-2或IL-15)以提供进一步的细胞因子支持。
多模式癌症疗法是结合了多于一种治疗方法的疗法。多模式疗法也称为组合疗法。不同且有效的模式可用于多种癌症。肿瘤的不同生物学和多种模式的功效可以决定对于每一种的特定方法。基于抗体的疗法已经频繁地用于治疗癌症和其他疾病适应症。对抗体治疗的反应已经集中在这些抗体对肿瘤细胞的直接抑制作用上，但是已经显示这些抗体对宿主免疫系统具有影响。FcεRIγ缺陷型NK细胞(G-NK)是在抗体与Fc受体(CD16)结合时介导ADCC的免疫效应细胞。所提供的实施方案被设计为证明当与FcεRIγ缺陷型NK细胞(G-NK)加上添加小分子和/或放射疗法组合使用时抗体疗法的改善的功效。
在一些实施方案中，胃或胃食管连接部的腺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为曲妥珠单抗
Figure BDA0003169946540000811
或雷莫芦单抗
Figure BDA0003169946540000812
的单克隆抗体；和(2)作为放射疗法、卡培他滨或顺铂的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，胃或胃食管连接部的腺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与曲妥珠单抗
Figure BDA0003169946540000813
+顺铂的组合。
在一些实施方案中，膀胱癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为阿特朱单抗(TecentriqTM)、纳武单抗
Figure BDA0003169946540000814
度伐单抗(ImfinziTM)、阿维鲁单抗
Figure BDA0003169946540000815
或派姆单抗
Figure BDA0003169946540000816
的单克隆抗体；和(2)作为放射疗法或顺铂的癌症药物或细胞毒性剂加上氟尿嘧啶。在特定实施方案中，膀胱癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与阿特朱单抗(TecentriqTM)+顺铂+5-FU的组合。
在一些实施方案中，脑癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000817
的单克隆抗体；和(2)作为依维莫司
Figure BDA0003169946540000818
放射疗法、卡铂、依托泊苷或替莫唑胺的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，脑癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000819
+放射疗法的组合。
在一些实施方案中，乳腺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为曲妥珠单抗
Figure BDA00031699465400008110
的单克隆抗体；和(2)作为他莫昔芬(Nolvadex)、托瑞米芬
Figure BDA00031699465400008111
依维莫司
Figure BDA00031699465400008112
氟维司群
Figure BDA00031699465400008113
阿那曲唑
Figure BDA00031699465400008114
依西美坦
Figure BDA00031699465400008115
拉帕替尼
Figure BDA00031699465400008116
来曲唑
Figure BDA00031699465400008117
帕妥珠单抗
Figure BDA00031699465400008118
曲妥珠单抗-美坦新偶联物
Figure BDA00031699465400008119
帕博西尼
Figure BDA00031699465400008120
瑞博西尼
Figure BDA00031699465400008121
顺铂/卡铂、紫杉醇、阿霉素或放射疗法的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，乳腺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与曲妥珠单抗
Figure BDA00031699465400008122
+顺铂的组合。
在一些实施方案中，结直肠癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为西妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000821
帕尼单抗
Figure BDA0003169946540000822
贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000823
或雷莫芦单抗
Figure BDA0003169946540000824
的单克隆抗体；和(2)作为Ziv-阿柏西普
Figure BDA0003169946540000825
瑞戈非尼
Figure BDA0003169946540000826
放射疗法、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、伊立替康或奥沙利铂的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，结直肠癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400008221
+奥沙利铂的组合。
在一些实施方案中，内分泌/神经内分泌肿瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为阿维鲁单抗
Figure BDA0003169946540000827
的单克隆抗体；和(2)作为醋酸兰瑞肽(
Figure BDA0003169946540000828
Depot)的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，内分泌/神经内分泌肿瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与阿维鲁单抗
Figure BDA0003169946540000829
+奥沙利铂的组合。
在一些实施方案中，头颈癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400008210
派姆单抗
Figure BDA00031699465400008211
纳武单抗
Figure BDA00031699465400008212
曲妥珠单抗或雷莫芦单抗的单克隆抗体；和(2)作为放射疗法、卡铂、顺铂、卡培他滨、伊立替康、5-氟尿嘧啶或紫杉醇的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，头颈癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400008213
+顺铂的组合。
在一些实施方案中，骨的巨细胞瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为地诺单抗
Figure BDA00031699465400008214
的单克隆抗体；和(2)作为放射疗法、阿霉素、顺铂、依托泊苷、环磷酰胺或甲氨蝶呤的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，骨的巨细胞瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与地诺单抗
Figure BDA00031699465400008215
+阿霉素的组合。
在一些实施方案中，肾癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为贝伐单抗
Figure BDA00031699465400008216
或纳武单抗
Figure BDA00031699465400008217
的单克隆抗体；和(2)作为索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼
Figure BDA00031699465400008218
帕唑帕尼
Figure BDA00031699465400008219
替西罗莫司
Figure BDA00031699465400008220
依维莫司
Figure BDA0003169946540000831
阿西替尼
Figure BDA0003169946540000832
卡博替尼(caboometyxTM甲磺酸乐伐替尼
Figure BDA0003169946540000833
长春碱、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨或吉西他滨的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，肾癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000834
+索拉非尼
Figure BDA0003169946540000835
的组合。
在一些实施方案中，白血病的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为利妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000836
阿仑单抗
Figure BDA0003169946540000837
奥法木单抗
Figure BDA0003169946540000838
阿托珠单抗
Figure BDA0003169946540000839
或博纳吐单抗
Figure BDA00031699465400008310
的单克隆抗体；和(2)作为甲磺酸伊马替尼
Figure BDA00031699465400008311
达沙替尼
Figure BDA00031699465400008312
尼洛替尼
Figure BDA00031699465400008313
博舒替尼
Figure BDA00031699465400008314
维甲酸
Figure BDA00031699465400008315
依鲁替尼
Figure BDA00031699465400008316
艾代拉利斯
Figure BDA00031699465400008317
维奈妥拉(VenclextaTM)、盐酸帕纳替尼
Figure BDA00031699465400008318
米哚妥林
Figure BDA00031699465400008319
甲氨蝶呤、阿糖胞苷、长春新碱、阿霉素、道诺霉素或环磷酰胺的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，白血病的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与利妥昔单抗
Figure BDA00031699465400008320
+环磷酰胺的组合。
在一些实施方案中，肺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为贝伐单抗
Figure BDA00031699465400008321
雷莫芦单抗
Figure BDA00031699465400008322
纳武单抗
Figure BDA00031699465400008323
耐昔妥珠单抗(PortrazzaTM)、派姆单抗
Figure BDA00031699465400008324
阿特朱单抗(TecentriqTM)的单克隆抗体；和(2)作为克唑替尼
Figure BDA00031699465400008325
埃罗替尼
Figure BDA00031699465400008326
吉非替尼
Figure BDA00031699465400008327
双马来酸盐阿法替尼
Figure BDA00031699465400008328
色瑞替尼(LDK378/ZykadiaTM)、奥希替尼(TagrissoTM)、阿来替尼
Figure BDA00031699465400008329
布加替尼(AlunbrigTM)、Cyramza、放射疗法、顺铂、卡铂、紫杉醇(Taxol)、纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)、多西紫杉醇(Taxotere)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)、伊立替康(Camptosar)、依托泊苷(VP-16)、长春碱或培美曲塞(Alimta)的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，肺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与耐昔妥珠单抗(PortrazzaTM)+卡铂的组合。
在一些实施方案中，淋巴瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为替伊莫单抗
Figure BDA00031699465400008330
维汀-本妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000841
利妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000842
司妥昔单抗
Figure BDA0003169946540000843
阿托珠单抗
Figure BDA0003169946540000844
纳武单抗
Figure BDA0003169946540000845
或派姆单抗
Figure BDA0003169946540000846
的单克隆抗体；和(2)作为地尼白介素
Figure BDA0003169946540000847
伏立诺他
Figure BDA0003169946540000848
罗米地辛
Figure BDA0003169946540000849
贝沙罗汀
Figure BDA00031699465400008410
硼替佐米
Figure BDA00031699465400008411
普拉曲沙
Figure BDA00031699465400008412
伊鲁替尼
Figure BDA00031699465400008413
艾代拉利斯
Figure BDA00031699465400008414
贝利司他
Figure BDA00031699465400008415
环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、异环磷酰胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、阿霉素、长春新碱或依托泊苷(VP-16)的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，淋巴瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与利妥昔单抗
Figure BDA00031699465400008416
+环磷酰胺的组合。
在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为硼替佐米
Figure BDA00031699465400008417
达雷木单抗(DarzalexTM)或埃罗妥珠单抗(EmplicitiTM)的单克隆抗体；和(2)作为卡非佐米
Figure BDA00031699465400008418
帕比司他
Figure BDA00031699465400008419
枸橼酸依沙佐米
Figure BDA00031699465400008420
美法仑、长春新碱(Oncovin)、环磷酰胺(Cytoxan)、依托泊苷(VP-16)、阿霉素(多柔比星)、脂质体阿霉素(Doxil)、苯达莫司汀(Treanda)的癌症药物或细胞毒性剂。在特定的实施方案中，多发性骨髓瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与达雷木单抗(DarzalexTM)+环磷酰胺的组合。
在一些实施方案中，神经母细胞瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为地努妥昔单抗(UnituxinTM)的单克隆抗体；和(2)作为放射疗法、环磷酰胺、顺铂或卡铂、长春新碱、阿霉素(多柔比星)、依托泊苷、拓扑替康、白消安或噻替帕的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，神经母细胞瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与地努妥昔单抗(UnituxinTM)+阿霉素(多柔比星)的组合。
在一些实施方案中，卵巢上皮/输卵管/原发性腹膜癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为贝伐单抗
Figure BDA00031699465400008421
的单克隆抗体；和(2)作为奥拉帕尼(LynparzaTM)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐(RubracaTM)、尼拉帕尼甲苯磺酸盐一水合物(ZejulaTM)、顺铂、卡铂、紫杉醇
Figure BDA00031699465400008422
多西紫杉醇
Figure BDA00031699465400008423
卡培他滨
Figure BDA00031699465400008424
环磷酰胺
Figure BDA0003169946540000851
依托泊苷(VP-16)、吉西他滨
Figure BDA0003169946540000852
异环磷酰胺
Figure BDA0003169946540000853
伊立替康(CPT-11、
Figure BDA0003169946540000854
)、脂质体阿霉素
Figure BDA0003169946540000855
美法仑、培美曲塞
Figure BDA0003169946540000856
拓扑替康或长春瑞滨
Figure BDA0003169946540000857
的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，卵巢上皮/输卵管/原发性腹膜癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与贝伐单抗
Figure BDA0003169946540000858
+紫杉醇
Figure BDA0003169946540000859
的组合。
在一些实施方案中，胰腺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为西妥昔单抗
Figure BDA00031699465400008510
或贝伐单抗
Figure BDA00031699465400008511
的单克隆抗体；和(2)作为埃罗替尼
Figure BDA00031699465400008512
依维莫司
Figure BDA00031699465400008513
舒尼替尼
Figure BDA00031699465400008514
吉西他滨(Gemzar)，5-氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(Eloxatin)、白蛋白结合的紫杉醇(Abraxane)、卡培他滨(Xeloda)，顺铂，伊立替康(Camptosar)、紫杉醇(Taxol)、多西紫杉醇(Taxotere)或白蛋白结合的紫杉醇(Abraxane)的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，胰腺癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与埃罗替尼
Figure BDA00031699465400008515
+奥沙利铂(Eloxatin)的组合。
在一些实施方案中，皮肤癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为伊匹单抗
Figure BDA00031699465400008516
派姆单抗
Figure BDA00031699465400008517
阿维鲁单抗
Figure BDA00031699465400008518
或纳武单抗
Figure BDA00031699465400008519
的单克隆抗体；和(2)作为维莫德吉
Figure BDA00031699465400008520
索尼德吉
Figure BDA00031699465400008521
维罗非尼
Figure BDA00031699465400008522
曲美替尼
Figure BDA00031699465400008523
达拉非尼
Figure BDA00031699465400008524
考比替尼(CotellicTM)、阿利维甲酸
Figure BDA00031699465400008525
放射疗法、达卡巴嗪、替莫唑胺、纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、卡铂或长春碱的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，皮肤癌的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与阿维鲁单抗
Figure BDA00031699465400008526
+顺铂的组合。
在一些实施方案中，软组织肉瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与以下的组合：(1)作为奥拉木单抗(lartrutoTM)的单克隆抗体；和(2)作为帕唑帕尼
Figure BDA00031699465400008527
阿利维甲酸
Figure BDA00031699465400008528
放射疗法、异环磷酰胺
Figure BDA00031699465400008529
阿霉素
Figure BDA00031699465400008530
达卡巴嗪、表柔比星、替莫唑胺
Figure BDA00031699465400008531
多西紫杉醇
Figure BDA00031699465400008532
吉西他滨
Figure BDA00031699465400008533
长春瑞滨
Figure BDA00031699465400008534
曲贝替定
Figure BDA00031699465400008535
或艾瑞布林
Figure BDA00031699465400008536
的癌症药物或细胞毒性剂。在特定实施方案中，软组织肉瘤的多模式治疗包括施用如本文所提供的g-NK细胞的组合物与奥拉木单抗(LartruvoTM)+多西紫杉醇
Figure BDA0003169946540000861
的组合。
4.溶瘤病毒
在一些实施方案中，所提供的方法还可以包括将g-NK细胞与溶瘤病毒一起施用。g-NK细胞和溶瘤病毒的组合治疗还可以包括施用一种或多种如所述的其他药剂，如抗体。
预期g-NK细胞与溶瘤病毒的组合可以促进或增加所述疗法中之一或二者的活性。在一些实施方案中，溶瘤病毒的使用可以使肿瘤细胞对NK细胞敏感。从溶瘤病毒疗法得到的证据表明，在转移性黑色素瘤、卵巢癌和乳腺癌模型中，溶瘤病毒激活NK细胞(↑IFN-γ)并增强NK细胞向肿瘤的迁移(Miller等人,2003Mol Ther 7:741:747；Benencia等人,2005Mol Ther 12:789-802；Zhao等人,2014PLoS One 9:e93103)。在一期临床试验中，发现溶瘤呼肠孤病毒增加NK细胞的循环水平(White等人,2008Gene Ther 15:911-920)并且发现NK细胞在前列腺癌和A549肺癌的动物模型中介导溶瘤呼肠孤病毒和副痘病毒的抗肿瘤功效(Gujar等人,2011Mol Ther 19:797-804；Rintoul等人,2012Mol.Ther.20:1148-1157)。在腺癌和胶质母细胞瘤的动物模型中，也观察到在使用溶瘤柯萨奇病毒和麻疹病毒的情况下通过NK细胞增加的肿瘤浸润，其中NK细胞的瘤内浓度与存活率呈正相关(Miyamoto等人,2012Cancer Res.72:2609-2621；Allen et al.,2006Cancer re s.66:11840-11850)。溶瘤病毒活性与NK细胞介导的肿瘤细胞清除相关联的机制是增强的肿瘤免疫原性。特别地，如通过天然细胞毒性受体NKp30和NKp44介导的增加的细胞毒性以及细胞毒性细胞因子IFN-γ、TNF-α和MIP1α/β的增强的表达所证明，感染了溶瘤病毒的肿瘤更容易被NK细胞识别和杀伤(Bhat等人,2011Int J Cancer 128:908-919；Dempe等人,2012Cancer Immunol Res 61:2113-2123；Bhat等人,2013BMC Cancer 13:367)。已显示在体内吸引和激活NK细胞的其他溶瘤病毒包括流感病毒(Ogbomo等人,2010Med MicrobiolImmunol 199:93-101)、水疱性口炎病毒(Heiber等人,2011J Virol.85:10440-10450)和新城鸡瘟病毒(Jarahian等人,2009J Virol.83:810-821)。在对癌症手术患者的术后研究中，发现溶瘤痘苗病毒逆转术后免疫抑制并防止转移形成(Tai等人,2014Front Oncol 4:217)。因此，溶瘤病毒可能能够在原本免疫受损的个体中增强通过NK细胞的抗肿瘤免疫。
在一些实施方案中，所述溶瘤病毒靶向特定细胞，例如免疫细胞。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒靶向所述受试者中的肿瘤细胞和/或癌细胞。溶瘤病毒是在肿瘤细胞中积累并在肿瘤细胞中复制的病毒。通过在所述细胞中的复制，肿瘤细胞被裂解，并且肿瘤缩小且可以被消除。溶瘤病毒还可具有宽的宿主和细胞类型范围。例如，溶瘤病毒可在免疫豁免的细胞或免疫豁免的组织中积累，包括肿瘤和/或转移灶，并且还包括受伤组织和细胞，由此容许在宽范围的细胞类型中递送并表达异源蛋白质。溶瘤病毒还可以肿瘤细胞特异性方式复制，导致肿瘤细胞溶解和有效肿瘤消退。
示例性溶瘤病毒包括腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒、新城鸡瘟病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、柯萨奇病毒和痘苗病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以特异性地定植于实体瘤，而不感染其他器官。在一些情况下，溶瘤病毒可以用作感染原，以将异源蛋白质核酸递送至实体瘤。
溶瘤病毒可以是本领域技术人员已知的任一种，并且包括例如：水疱性口炎病毒，参见例如，美国专利号7,731,974、7,153,510、6,653,103，和美国专利公开号2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818，以及EP专利号1385466、1606411和1520175；单纯疱疹病毒，参见例如，美国专利号7,897,146、7,731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968，以及美国专利公开号2014/0154216、2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894、2004/0009604、2004/0063094，国际专利公开号WO 2007/052029、WO 1999/038955；逆转录病毒，参见例如，美国专利号6,689,871、6,635,472、5,851,529、5,716,826、5,716,613，以及美国专利公开号20110212530；痘苗病毒，参见例如，2016/0339066；以及腺相关病毒，参见例如，美国专利号8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670。
溶瘤病毒还包括已经遗传改变以减弱其毒力、改进其安全性特征、增强其肿瘤特异性的病毒，并且其还已配备有其他基因，例如细胞毒素、细胞因子、前药转化酶，以改进所述病毒的整体功效(参见例如Kirn等人，(2009)Nat Rev Cancer 9:64-71；Garcia-Aragoncillo等人，(2010)Curr Opin Mol Ther 12:403-411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221，以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650)。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒可以是已经修饰使得其在癌性细胞中选择性复制，并且因此是溶瘤的那些溶瘤病毒。例如，所述溶瘤病毒是腺病毒，其已经工程化以具有针对肿瘤疗法以及也作为基因疗法载体的改变的向性。所述溶瘤病毒的例子是ONYX-015、H101和Ad5ΔCR(Hallden和Portella(2012)Expert Opin Ther Targets,16:945-58)以及TNFerade(McLoughlin等人(2005)Ann.Surg.Oncol.,12:825-30)，或条件复制型腺病毒
Figure BDA0003169946540000881
在一些实施方案中，所述溶瘤病毒是经修饰的单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒是Talimogene laherparepvec(也称为T-Vec、Imlygic或OncoVex GM-CSF)。在一些实施方案中，所述感染原是例如描述于WO 2007/052029、WO 1999/038955、US 2004/0063094、US 2014/0154216中的经修饰的单纯疱疹病毒或其变体。
V.试剂盒和制品
本文提供了制品和试剂盒，所述制品和试剂盒包含所提供的含有富集了特定子集(如g-NK细胞)的NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是通过任何所提供的方法来产生的。在一些实施方案中，本文提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含任何所提供的组合物和另外的试剂。在一些实施方案中，所述另外的药剂包含Fc结构域。在一些实施方案中，所述另外的药剂是Fc融合蛋白或抗体。在一些实施方案中，所述另外的药剂是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在这些实施方案的一些中，所述另外的药剂是全长抗体。示例性抗体包括如所述的任一种。
本文还提供了制品或试剂盒，所述制品或试剂盒包含用于检测g-NK替代表面标记物特征的多种试剂，如本文所述。在一些实施方案中，所述试剂包括用于检测表面标记物组(如2、3、4或5种表面标记物)的试剂，所述表面标记物选自CD16、CD38、CD57、CD7、CD161和/或NKG2A。在一些实施方案中，所述试剂包括用于检测选自CD16、CD57、CD7和CD161的表面标记物组的试剂。在一些实施方案中，所述试剂包括用于检测选自CD161和NKG2A的表面标记物组的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含用于检测一种或多种其他NK细胞表面标记物的一种或多种另外的试剂。例如，所述试剂盒可以包含一种或多种另外的试剂，如1、2或3种另外的试剂，以用于检测一种或多种另外的表面标记物CD45、CD3和/或CD56。在一些实施方案中，所述试剂包括用于检测选自CD3、CD56和CD38的表面标记物组的试剂。在一些实施方案中，所述试剂中的每一种是用于检测所述组的特定表面标记物的结合分子。
在特定实施方案中，所述试剂包括对所述组的一种或多种表面标记物具有特异性的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，结合分子(如抗体或抗原结合片段)可以直接或间接与能够检测的部分缀合。在一些例子中，一种或多种所述抗体被修饰以允许检测结合。例如，抗体可以与可检测分子缀合，所述可检测分子允许直接检测或经由二级试剂检测。在一些实施方案中，抗体被直接标记，如用荧光团标记。在一些例子中，所述抗体可以使用二级试剂来检测，如通过与一抗结合并与可检测的蛋白质(如荧光探针或可检测的酶，如辣根过氧化物酶)偶联的二抗试剂来检测。在一些此类例子中，所述试剂盒还可以包含所述二抗。
试剂盒可以任选地包括一个或多个组件，如使用说明书、设备和另外的试剂(例如，用于稀释所述组合物和/或重构冻干蛋白质的无菌水或盐水溶液)；以及诸如用于实践所述方法的试管、容器和注射器等组件。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含用于样品的收集、样品的制备和处理的试剂，和/或用于定量样品中一种或多种表面标记物的量的试剂(如但不限于检测试剂，如抗体、缓冲液、用于酶染色的底物、铬或其他材料，如载玻片、容器、微量滴定板)，以及任选地用于执行所述方法的说明书。本领域技术人员将认识到可根据所提供的方法使用的许多其他可能的容器和板以及试剂。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以作为制品提供，所述制品包括用于包装所述细胞、抗体或试剂或其组合物或一种或多种其他组分的包装材料。例如，所述试剂盒可以含有容器、瓶子、管、小瓶以及适合用于分离或组织试剂盒的组件的任何包装材料。所述一个或多个容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)形成。在一些实施方案中，所述一个或多个容器容纳包含细胞或抗体或用于所述方法中的其他试剂的组合物。本文的制品或试剂盒可以在单独的容器中或在同一容器中包含所述细胞、抗体或试剂。
在一些实施方案中，容纳所述组合物的所述一个或多个容器可以是一次性使用的小瓶或多次使用的小瓶，其在一些情况下可以允许所述组合物的重复使用。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒还可以包含第二容器，所述第二容器包含合适的稀释剂。所述制品或试剂盒还可以包含从商业、治疗和用户角度来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射筒、治疗剂和/或印有使用说明书的包装插页。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以任选地包含说明书。说明书通常包括描述所述细胞组合物、试剂和/或抗体以及任选地包含在所述试剂盒中的其他组分的有形表达及其使用方法。在一些实施方案中，所述说明书指示了如根据任何所提供的实施方案使用所述细胞组合物和抗体施用至受试者以治疗疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所述说明书指示了如根据任何所提供的实施方案使用所述试剂(如抗体)作为用于检测g-NK替代标记物表型的组的方法。在一些实施方案中，所述说明书作为标签或包装插页提供，所述标签或包装插页位于所述容器上或与所述容器相关联。在一些实施方案中，所述说明书可以指示针对所述组合物的重构和/或使用的指导。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：
(a)分离富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述分离包括从来自人受试者的样品选择：(i)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(ii)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(iii)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，或(iv)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞；以及
(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
2.根据实施方案1所述的方法，其中在(a)之前，从所述人受试者收获所述样品。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述样品是或包含外周血单核细胞(PBMC)。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述样品是单采术或白细胞单采术样品。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述分离包括从所述样品选择呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。
7.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述分离包括从所述样品选择呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。
8.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述分离包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。
9.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述分离包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中在(a)之后，低温保存所述分离的富集NK细胞的群体，并且在(b)之前，解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
11.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g–NK)的方法，所述方法包括：
(a)获得富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集的NK细胞的群体包含选自以下的表型：(i)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(ii)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(iii)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，或(iv)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞；以及
(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述获得包括解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
13.根据实施方案11或实施方案12所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。
14.根据实施方案11或实施方案12所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。
15.根据实施方案11或实施方案12所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。
16.根据实施方案11或实施方案12所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。
17.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g–NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：
(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和
(ii)重组IL-2；
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
18.根据实施方案17所述的方法，其中在所述培养之前，从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：
(1)选择(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD57阳性的细胞，从而富集第一选择的群体；以及
(2)从所述第一选择的群体选择除(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD57阳性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞。
19.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g–NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：
(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和
(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
20.根据实施方案19所述的方法，其中在所述培养之前，从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：
(1)选择(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD16阳性的细胞，从而富集第一选择的群体；以及
(2)从所述第一选择的群体选择除(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD16阳性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞。
21.根据实施方案17-20中任一项所述的方法，其中所述样品包含外周血单核细胞(PBMC)。
22.根据实施方案17-21中任一项所述的方法，其中在所述培养之前，从所述人受试者收获所述样品。
23.根据实施方案17-22中任一项所述的方法，其中所述样品是单采术或白细胞单采术样品。
24.根据实施方案18和19-23中任一项所述的方法，其中所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
25.根据实施方案18-24中任一项所述的方法，其中所述富集的NK细胞来自先前已从来自所述受试者的样品分离的低温保存样品。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述培养还在存在以下项的情况下进行：(iii)原代人外周血单核细胞(PBMC)饲养细胞，其中所述PBMC饲养细胞是经辐照的。
27.根据实施方案26所述的方法，其中PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在为或约1:1与为或约5:1之间，包含端值。
28.根据实施方案26或实施方案27所述的方法，其中所述PBMC饲养细胞对所述受试者而言是自体的。
29.根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中所述培养的至少一部分是在存在至少一种刺激剂的情况下进行的，所述至少一种刺激剂能够刺激所述PBMC饲养细胞的一种或多种T细胞的激活。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述刺激剂与TCR复合物的成员特异性地结合，任选地其中所述药剂与CD3、任选CD3ε特异性地结合。
31.根据实施方案29或实施方案30所述的方法，其中所述至少一种刺激剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段。
32.根据实施方案31所述的方法，其中所述抗CD3抗体或其抗原结合片段是OKT3抗体或抗原结合片段。
33.根据实施方案31或实施方案32所述的方法，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是在为或约10ng/mL与为或约100ng/mL之间。
34.根据实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是为或约50ng/mL。
35.根据实施方案31-34中任一项所述的方法，其中所述至少一种刺激剂是在所述培养开始时或与经辐照的PBMC饲养细胞同时或大约同时开始添加。
36.根据实施方案26-37中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间，所述PBMC饲养细胞被激活。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与NK细胞的比率是为或约1:1或更大。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与NK细胞的比率是在1:1与5:1之间，包含端值。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在1:1与3:1之间，包含端值。
40.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是或是约2.5:1。
41.根据实施方案17-40中任一项所述的方法，其中PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是为或约5:1。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间，重组IL-2的浓度是在为或约10IU/mL与为或约500IU/mL之间。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间，重组IL-2的浓度是为或约100IU/mL重组IL-2。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述重组IL-2是在所述培养开始时或大约在所述培养开始时开始添加。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述培养期间更换所述培养基一次或多次。
46.根据实施方案45所述的方法，其中更换所述培养基是在所述培养开始后为或约3至7天内、任选地在所述培养开始后5天或大约5天进行。
47.根据实施方案46所述的方法，其中更换所述培养基是在所述培养的剩余持续时间内每两天或三天进行。
48.根据实施方案45-47中任一项所述的方法，其中所述培养基的更换从培养基减少或去除所述至少一种刺激剂。
49.根据实施方案45-48中任一项所述的方法，其中在所述培养基的每次更换时，将所述重组IL-2添加至所述培养物中。
50.根据实施方案44-49中任一项所述的方法，其中以在为或约10IU/mL与为或约500IU/mL之间的浓度添加所述重组IL-2，包含端值。
51.根据实施方案44-50中任一项所述的方法，其中以为或约100IU/mL重组IL-2的浓度添加所述重组IL-2。
52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体包含至少或至少约0.2x106个富集的NK细胞、至少或至少约1.0x106个富集的NK细胞、或为或约10x106个富集的NK细胞。
53.根据实施方案1-52中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体的浓度是在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体的浓度是在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.5x106个富集的NK细胞/mL之间。
55.根据实施方案1-54中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体具有为或约0.2x106个富集的NK细胞/mL的浓度。
56.根据实施方案1-55中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约2.50x108个g-NK细胞的扩增的时间。
57.根据实施方案1-56中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.00x108个g-NK细胞的扩增的时间。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约1.0x109个g-NK细胞的扩增。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.0x109个g-NK细胞的扩增的时间。
60.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述培养进行为或约或至少或至少约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。
61.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，其中所述培养进行为或约或至少或至少约14天。
62.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，其中所述培养进行为或约或至少或至少约21天。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中与所述培养开始时相比，所述方法在所述培养结束时产生增加数量的g-NK细胞。
64.根据实施方案63所述的方法，其中所述增加是大于或大于约100倍、大于或大于约200倍、大于或大于约300倍、大于或大于约400倍、大于或大于约500倍、大于或大于约600倍、大于或大于约700倍或大于或大于约800倍。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述g-NK细胞呈FcRγneg。
66.根据实施方案65所述的方法，其中所述g-NK细胞还呈CD45pos/CD3neg/CD56pos。
67.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。
68.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述扩增的细胞群体纯化或选择具有g-NK细胞替代表面标记物特征的细胞群体。
69.根据实施方案67或实施方案68所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。
70.根据实施方案67或实施方案68所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。
71.根据实施方案69或实施方案70所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征还是CD45pos/CD3neg/CD56pos。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述扩增的g-NK细胞群体配制在药学上可接受的赋形剂中。
73.根据实施方案72所述的方法，所述方法还包括在存在低温保护剂的情况下低温保存所述细胞和/或配制所述细胞。
74.一种组合物，所述组合物包含通过根据实施方案1-73中任一项所述的方法产生的g-NK细胞。
75.根据实施方案74-78中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少或至少约106个g-NK细胞。
76.根据实施方案74或实施方案75所述的组合物，其中所述组合物包含为或约106至为或约1010个g-NK细胞、为或约106至为或约109个g-NK细胞、为或约106至为或约108个g-NK细胞、为或约106至为或约107个g-NK细胞、为或约107至为或约1010个g-NK细胞、为或约107至为或约109个g-NK细胞、为或约107至为或约108个g-NK细胞、为或约108至为或约1010 个g-NK细胞、为或约108至为或约109个g-NK细胞、或为或约109至为或约1010个g-NK细胞。
77.根据实施方案75-76中任一项所述的组合物，其中所述g-NK细胞呈FcRγneg。
78.根据实施方案77所述的组合物，其中所述g-NK细胞还呈CD45pos/CD3neg/CD56pos。
79.根据实施方案75-76中任一项所述的组合物，其中所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。
80.根据实施方案79所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。
81.根据实施方案79所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。
82.一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有选自CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg和NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
83.根据实施方案80-91中任一项所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征还包括CD45pos/CD3neg/CD56pos。
84.根据实施方案82或实施方案83所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约60％的细胞包含选自CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg和NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
85.根据实施方案82-84中任一项所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含选自CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg和NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
86.根据实施方案83-85中任一项所述的组合物，其中在包含所述g-NK细胞替代标记物特征的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
87.根据实施方案83-86中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少或至少约106个细胞。
88.根据实施方案83-87中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含为或约106至为或约1010个细胞、为或约106至为或约109个细胞、为或约106至为或约108个细胞、为或约106至为或约107个细胞、为或约107至为或约1010个细胞、为或约107至为或约109个细胞、为或约107至为或约108个细胞、为或约108至为或约1010个细胞、为或约108至为或约109个细胞、或为或约109至为或约1010个细胞。
89.根据实施方案74-88中任一项所述的组合物，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
90.根据实施方案74-89中任一项所述的组合物，所述组合物包含低温保护剂。
91.根据实施方案74-90中任一项所述的组合物，所述组合物是无菌的。
92.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案74-91中任一项所述的组合物和用于治疗疾病的另外的药剂。
93.根据实施方案92所述的试剂盒，所述试剂盒还包含用于施用所述组合物和用于治疗疾病或病症的另外的药剂的说明书。
94.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案74-91中任一项所述的组合物和用于施用所述组合物与用于治疗疾病的另外的药剂的组合疗法的说明书。
95.根据实施方案92-94中任一项所述的试剂盒，其中所述另外的药剂是抗体或Fc融合蛋白。
96.根据实施方案95所述的试剂盒，其中所述抗体识别或特异性地结合肿瘤相关抗原。
97.根据实施方案95或实施方案96所述的试剂盒，其中所述抗体识别或结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。
98.根据实施方案95-97中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体是全长抗体和/或包含Fc结构域。
99.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用根据实施方案74-91中任一项所述的组合物。
100.根据实施方案99所述的方法，所述方法包括向所述个体施用从或从约1x108至1x1010个细胞/m2，或施用从或从约1x106至1x1010个NK细胞/kg。
101.根据实施方案99或实施方案100所述的方法，所述方法还包括施用另外的药剂。
102.根据实施方案101所述的方法，其中所述另外的药剂是抗体或Fc融合蛋白。
103.根据实施方案102所述的方法，其中所述抗体识别肿瘤相关抗原。
104.根据实施方案102或实施方案103所述的方法，其中所述抗体识别或特异性地结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。
105.根据实施方案101-104中任一项所述的方法，其中所述抗体包含Fc结构域和/或是全长抗体。
106.根据实施方案101-105中任一项所述的方法，其中依序施用所述另外的药剂和所述组合物。
107.根据实施方案106所述的方法，其中在施用所述组合物之前施用所述另外的药剂。
108.根据实施方案101-105中任一项所述的方法，其中同时施用所述另外的药剂和所述组合物。
109.根据实施方案101-108中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症选自炎性病症、感染和癌症。
110.根据实施方案109所述的方法，其中所述感染是病毒感染或细菌感染。
111.根据实施方案110所述的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
112.根据实施方案110所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
113.根据实施方案101-112中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
114.根据实施方案101-113中任一项所述的方法，其中所述组合物中的NK细胞对所述个体而言是同种异体的。
115.根据实施方案101-113中任一项所述的方法，其中所述组合物中的NK细胞对所述受试者而言是自体的。
116.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组选自CD16、CD57、CD7和CD161或者NKG2A和CD161。
117.根据实施方案116所述的试剂盒，其中所述表面标记物组还包含CD3、CD45和CD56。
118.根据实施方案116或实施方案117所述的试剂盒，其中所述多种试剂中的每一种是对所述表面标记物组中的一种标记物具有特异性的结合分子。
119.根据实施方案118所述的试剂盒，其中所述结合分子是抗体或抗原结合片段。
120.根据实施方案118或实施方案119所述的试剂盒，其中所述结合分子被可检测地标记。
121.一种使用根据实施方案116-120中任一项所述的试剂盒检测包含天然杀伤(NK)细胞的样品中的g-NK替代表面标记物特征的方法。
122.一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：
(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测选自CD16、CD57、CD7和CD161或者NKG2A和CD161的表面标记物组的试剂接触；以及
(b)检测所述样品中具有所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg或NKG2Aneg/CD161neg的细胞的存在或不存在。
123.根据实施方案122所述的方法，其中所述表面标记物组还包含CD45、CD3和CD56，并且其中所述表型还包含CD45pos/CD3neg/CD56pos。
124.根据实施方案122或实施方案123所述的方法，其中所述多种试剂中的每一种是对所述表面标记物组中的一种标记物具有特异性的结合分子。
125.根据实施方案124所述的方法，其中所述结合分子是抗体或抗原结合片段。
126.根据实施方案124或实施方案125所述的方法，其中所述结合分子被可检测地标记。
127.根据实施方案122-126中任一项所述的方法，其中所述检测是通过流式细胞术。
VII.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：g-NK替代表面标记物的鉴定
进行了一项鉴定细胞外表面标记物的组合的研究，所述组合可以用作鉴定g-NK细胞的替代表面标记物，所述g-NK细胞对细胞内标记物Fce RIγ呈阴性(FcRγneg)。通过针对FceRIγ的细胞内染色和针对CD45、CD3和CD56的细胞外染色以鉴定g-NK细胞子集CD45pos/CD3neg/CD56pos/FcRγneg，通过流式细胞术测定人外周血样品中g-NK细胞的百分比。如图1所示，在样品中的g-NK细胞中，具有NK细胞表型CD45pos/CD3neg/CD56pos且具有细胞外表面表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg或NKG2Aneg/CD161neg的细胞与样品中g-NK细胞的存在高度相关。特别地，CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg或NKG2Aneg/CD161neg NK细胞子集内g-NK细胞的百分比均大于80％。
实施例2：FcRγ缺陷型NK细胞(g–NK)的优先扩增方法
按照制造商的说明书通过
Figure BDA0003169946540001021
密度离心从来自CMV阳性人供体的全血分离人外周血单核细胞(PBMC)，或与CMV血清反应阴性供体进行比较。从血沉棕黄层收获PBMC，将其洗涤并通过流式细胞术评估活的CD45+细胞(以从残留的红细胞辨别PBMC)。大约2/3的自体PBMC用于通过使用Miltenyi MACSTM磁珠的基于免疫亲和力的磁珠分离以如下任一种方式来富集天然杀伤(NK)细胞：耗尽CD3+细胞以去除T细胞(CD3耗尽)；CD3耗尽，接着对CD57进行阳性选择以富集CD57+NK细胞；或对CD16进行阳性选择(富集CD16+NK细胞和单核细胞)。作为替代方法，NK富集可以通过CD3耗尽，接着CD56富集来进行(去除T细胞并富集NK细胞)。
通过用细胞外表面标记物CD45、CD3、CD56、CD16、CD57、CD7和CD161的组合对细胞染色或使用抗FceRI抗体进行细胞内染色来测定分离的g-NK细胞的百分比。g-NK细胞的百分比被鉴定为呈CD45pos/CD3neg/CD56pos/FceRIneg(FcRγneg)的活细胞。如果细胞分选是在扩增或功能测定之前(或之后)进行的，则仅可以使用细胞外表面染色，并使用替代表面标记物特征如CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg淋巴细胞或CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg或其活细胞来鉴定g-NK细胞的百分比。
新鲜分离的NK细胞立即用于NK细胞扩增，或低温保存并在扩增之前解冻。所述NK细胞扩增方案可以用于已冷冻/解冻的富集的NK细胞以及从冷冻/解冻的PBMC富集的NK细胞。
在扩增之前，通过测定活的CD71pos(靶细胞标记物)细胞的数量，制备HLA-E亮221.AEH淋巴瘤细胞作为饲养细胞。221.AEH是源自721.221细胞系的转染子，其高度表达HLA-E(HLA-E亮)(Lee等人1998,J Immunol 160:4951–60)。在如上所述的对PBMC进行磁珠分离后，将富集的NK细胞数量的约2.5倍的221.AEH靶细胞重悬于RPMI-1640+10％胎牛血清(FBS)中，达到1x106个细胞/mL。将重悬的221.AEH细胞在100Gy下辐照。另外，还辐照(100Gy)上述分离的自体PBMC的剩余1/3，以用作用于扩增的饲养细胞。在扩增期间不需要使用经辐照的PBMC作为饲养细胞，但研究表明其改善NK细胞扩增的功效。
将新鲜或解冻的磁性富集的NK细胞以约10x106个NK细胞以0.2x106个NK细胞/mL的浓度接种在由补充有5％人AB(或自体)血清和100IU/mL重组IL-2的95％无血清培养基(例如CellGenix GMP干细胞生长培养基(SCGM))构成的培养基中。从第0天开始，将接种的NK细胞与经辐照的自体PBMC以5:1PBMC与NK细胞比率共培养以及与经辐照的221.AEH饲养细胞以2.5:1 221.AEH与NK细胞的比率共培养。任选地，所述扩增可以在没有经辐照的PBMC饲养细胞的情况下进行。将共培养的细胞在37℃且5％CO2下培育14天(新鲜细胞)或21天(解冻的细胞)。在类似的研究中，如上所述共培养解冻的NK细胞，不同之处在于所述共培养包括以1:1AEH与NK细胞的比率的经辐照的221AEH饲养细胞，并且共培养14天而不是21天。
对于扩增的前5天，通过以50ng/mL添加抗CD3单克隆抗体(OKT3)激活充当饲养细胞的PBMC。对于新鲜或解冻的细胞，在5天后洗出抗CD3抗体，并在此之后每2-3天(对于经历14天扩增的新鲜细胞或解冻的细胞，d5、d7、d9、d11和d14；对于经历21天扩增的解冻的细胞，d5、d7、d9、d11、d14、d16、d18和d21)重装100IU/mL重组IL-2。在一些情况下，对于14天扩增，在第5、7和10天重装具有新鲜重组IL-2的培养基。每次更换或重装培养基时，对细胞计数。在d7和d14通过流式细胞术评估g-NK的百分比。
14天扩增过程的示例性概述示于图2A中。
为了进行比较，通过被设计用于扩增NKG2Cpos NK细胞的替代方法(描述于Bigley等人2016,Clin Exp Immunol 185:239-251)扩增NK细胞。在替代方法中，通过CD3耗尽，接着使用CD56微珠(Miltenyi Biotec)进行阳性选择来富集NK细胞(但在如上所述的扩增之前不包括CD16或CD57磁性富集)。将富集的NK细胞在37℃下与30ng/ml重组IL-15和未辐照的饲养细胞721.221(HLA-Eneg淋巴瘤)或221.AEH(HLA-E高淋巴瘤)靶细胞以10:1NK细胞与靶细胞比率培养14天。所述替代方法不包括抗CD3激活的自体PBMC作为饲养细胞。所述替代方法还包括含有胎牛血清的培养基。
在第0天和扩增结束时(第14天或第21天)通过流式细胞术测定g-NK(CD45pos/CD3neg/CD56pos/FceRIneg)的百分比。特别地，使用从Millipore(美国马萨诸塞州伯灵顿)购买的FcRγ抗体通过细胞内流式细胞术测定g-NK百分比。
图2B和图2C描绘了对于14天扩增(新鲜细胞)和解冻的细胞的21天扩增，在扩增结束时通过上述方法观察到的NK细胞扩增。图2D和图2E描绘了类似的结果，不同之处在于其还描绘了涉及CD3耗尽，接着CD16富集(CD3negCD16pos)的过程的结果，并且还描绘了从解冻的细胞扩增14天的结果。当通过所提供的方法以仅通过CD3耗尽(CD3neg)富集的NK细胞开始进行扩增时，在14天后从1000万个NK细胞实现了12亿个g-NK细胞的平均扩增，这代表通过该方法扩增的21亿个NKG2Cpos的子集。所观察到的扩增是类似的，无论所述方法是用新鲜富集的NK细胞(14天)还是用先前已经冷冻和解冻的NK细胞进行，如图2B所示的21天扩增(比较CMVpos CD3neg 14d相比于CMVpos CD3neg解冻21d)或如图2D所示的14天扩增(比较CMVpos CD3neg 14d相比于CMVpos CD3neg解冻14d)。对于图2D中所描绘的数据集，解冻的NK细胞的扩增较优，因为使用了较低的221.AEH与NK细胞比率(1:1相比于在图2B中解冻的NK细胞的扩增的2.5:1)。特别地，在一个实验中，对于最初通过单独的CD3耗尽富集的NK细胞，从新鲜的NK细胞扩增了约12亿个g-NK，相比之下，对于冷冻的NK细胞，扩增了约7亿个g-NK。如图2D所示，与仅CD3耗尽相比，当在扩增之前通过最初富集CD3-CD16+细胞来进行所提供的方法时，平均产量略有增加。当在扩增之前通过最初富集CD3-/CD57+细胞来进行所提供的方法时，在14天后平均产量从最初的1000万个富集的NK细胞开始显著增加至约80亿个g-NK细胞。相比之下，所述替代方法(Bigley等人2016)从相同的起始群体仅产生约2300万个g-NK(或约4500万个NKG2Cpos NK细胞)。
如图2C和图2E所示，与扩增前在富集的NK细胞群体中的g-NK细胞的百分比相比，从CMVpos供体扩增后的g-NK细胞的百分比增加。当所述共培养以2.5:1 221AEH与NK细胞的相同比率进行时，与先前冷冻过并扩增21天的NK细胞相比，先前未冷冻并扩增14天的新鲜NK细胞的富集更大(图2C，比较CMVpos CD3neg 14d相比于CMVpos CD3neg解冻21d)。如图2E所示，当所述共培养用较高比率的冷冻的NK细胞(1:1 221.AEH与NK细胞的比率)进行时，在扩增结束时g-NK细胞的百分比在起始NK细胞(它们是新鲜的或冷冻的)之间是类似的。这些结果证明，平均而言，解冻的PBMC在14天后可以实现与新鲜样品类似的扩增。
在扩增前通过CD3消耗而富集的NK细胞中，g-NK的百分比从最初NK细胞的6％增加至扩增后的28％。在最初通过CD3耗尽接着CD16选择而富集了NK细胞的细胞中观察到更大的增加。然而，当在扩增前最初的NK细胞富集了CD3neg/CD57pos细胞时，比例增加特别大，这与通过单独CD3耗尽或富集CD16pos细胞来富集NK细胞形成对照。特别地，当NK细胞通过CD3耗尽接着CD57阳性选择而富集时，观察到g-NK的百分比从最初NK细胞的28％增加至扩增后的82％。这些结果支持了所提供的过程可以导致具有大于1000倍扩增率的高产量。
在这项研究中，鉴定了“超级供体”，其具有高于其他供体的显著更高的g-NK产量。在这一“超级供体”中，当在扩增前通过CD3耗尽接着CD57阳性选择来富集NK细胞时，1000万个NK细胞在14天后产生了276亿个g-NK，并且g-NK的百分比从静止时的31％增加至扩增后的85％。
在CMV血清反应阴性供体中，观察到g-NK的扩增要小得多，其中用来自CMV血清反应阴性供体的1000万个NK细胞开始，平均产量为2600万个g-NK(图2B和图2D)。在CMV血清反应阴性供体中，没有观察到g-NK子集的优先扩增(在第0天2.1％相比于在第14天1.7％)(图2C和图2E)。这些结果表明，在感染了CMV的人中g-NK具有记忆样特性，并且该特性被221.AEH细胞激活。CMV感染的细胞像221.AEH细胞一样具有上调的HLA-E(Tomasec等人(2000)Science,287:1031)。此外，这些发现与先前的研究一致，其表明g-NK是“记忆样”NK细胞(Zhang等人,2013,J Immunol 190:1402-1406)，并且NKG2Cpos NK细胞(来自CMV血清反应阳性供体)在同种异体HSCT受体中响应于CMV再激活而扩增，但来自CMV血清反应阴性供体的那些则不扩增(Foley等人,2012,Blood 119:2665-2674)。
通过如下所述的基因组分析确定EBV的存在。简言之，将细胞在37℃水浴中解冻并转移至5ml温暖的培养基中，然后离心并重悬于新鲜培养基中。将来自每个样品的4x106个细胞等分至2ml管中，并将其余细胞在90％FBS+10％DMSO中冷冻并在-80℃下储存。使用Pure Link基因组DNA迷你试剂盒(目录号K1820-00 Invitrogen)从所述细胞提取基因组DNA(gDNA)，并使用Qubit(DNA BR)进行定量，并且使用TapeStation(gDNA带)测定质量。在qPCR中的每个反应中使用50ng gDNA(Brilliant III Ultra-Fast
Figure BDA0003169946540001061
绿色主混合物，目录号600883，Agilent)。EBNA1和GAPDH的引物(IDT)用于检测和定量EBV。结果表明，用经辐照的221.AEH饲养细胞扩增的细胞中没有发现EBV。
实施例3：扩增的NK细胞的细胞毒性活性评估
通过评价靶特异性细胞毒性活性来评估通过实施例2中所述方法相比于所述替代方法扩增的NK细胞的功能活性。
将来自实施例1中所述扩增的冷冻的NK细胞解冻，并通过将14天扩增的NK细胞与HLA缺陷型K562和HLA-E亮221.AEH细胞系以1:1的效应物与靶细胞比率共培养来评价NK细胞的细胞毒性。在37℃下孵育4h后，添加碘化丙啶(PI)，并使用四色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量。NK细胞的细胞毒性被量化为特异性裂解的百分比(总裂解％-自发性细胞死亡％)。如图3所示，通过实施例1中所述的替代方法扩增的NK细胞能够使NK细胞对HLA缺陷型K562和HLA-E亮221.AEH细胞系的杀伤分别从15％增加至40％以及从5％增加至20％(相比于未扩增的细胞)。然而，实施例1中所述的从富集的CD3negCD57pos NK细胞开始的方法导致扩增的NK细胞，其能够分别杀伤80％(相比于对于替代方法的40％)和53％(相比于对于替代方法的20％)的K562和221.AEH细胞系(参见图3)。
实施例4：与抗CD20抗体组合的扩增的NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)的评估
通过评价与抗CD20抗体组合时抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评估通过实施例2中所述方法扩增的NK细胞的功能活性。
对于ADCC细胞毒性测定，将来自实施例2中所述扩增的冷冻的NK细胞解冻并在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中在37℃下孵育1小时。然后将NK细胞与RAJI靶细胞(1.0x104个细胞，CD20+B细胞肿瘤细胞系)以0.5:1、1:1、2.5:1、5:1和10:1NK细胞与靶细胞比率在存在10μg/mL利妥昔单抗(抗CD20)的情况下在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中一起孵育。通过基于用可鉴定肿瘤靶细胞的抗CD71抗体和作为细胞死亡的标记物的碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术来测定ADCC(Bigley等人,(2014)Brain Behav Immun.,39:160-71)。如图4A所示，ADCC在g-NK高受试者中[扩增前g-NK平均值＝24％，n＝4]显著高于g-NK低受试者中(在10:1比率下杀伤94％)[扩增前g-NK平均值＝2％，n＝4]。
为了比较不同子集的活性，通过针对活的NK细胞和细胞外表面标记物的流式细胞术将扩增的NK细胞分为3类：常规[cNK；CD45+/CD3-/CD56+/NKG2C-]、适应性(NKG2C+)[CD45+/CD3-/CD56+/NKG2C+/NKG2A-]和g-NK[CD45+/CD3-/CD56+/CD16+/CD57+/CD7-/CD161-]。所述g-NK也可以使用细胞外表型[CD45+/CD3-/CD56+/CD161-/NKG2A-]来分类。在该实验中，从具有最高g-NK细胞(g-NK平均值＝25.3％±8.5％)的四名受试者获得常规、适应性(NKG2Cpos)和g-NK。如图4B所示，g-NK在1:1NK细胞与靶细胞比率下具有与NKG2Cpos或常规NK细胞(分别为30％或24％)好得多的ADCC杀伤(76％)。此外，所述g-NK的功能是类似的，无论它们是源自新鲜的还是先前冷冻的NK细胞(图4B)。上述“超级供体”具有扩增的g-NK，其在1:1NK细胞与靶细胞比率下比其NKG2Cpos或常规NK细胞(分别为55％或38％)更好地杀伤(97％)。
这些结果证明，所提供的方法能够在仅2周内产生数十亿个g-NK，它们是比NKG2Cpos或常规NK细胞更优的ADCC杀手。
实施例5：与ERBB家族特异性抗体组合的扩增的NK细胞的抗体依赖性细胞介导的 细胞毒性(ADCC)的评估
通过评价与抗HER2抗体组合时抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评估通过实施例2中所述方法相比于所述替代方法扩增的NK细胞的功能活性。
供体呈CMV血清反应阳性(n＝4)，并使用实施例2中所述的方法扩增磁性分选的NK细胞(扩增前g-NK百分比＝18.3％±2.9％)。然后使用CD57微珠将扩增的NK细胞磁性分选为CD57+“g-NK”和CD57-“cNK”级分，并低温保存用于以后的ADCC测定。CD57+和CD57-级分的实际g-NK百分比分别为82.2％±1.6％和2.4％±0.7％。特别地，使用从Millipore(美国马萨诸塞州伯灵顿)购买的FcRγ抗体通过细胞内流式细胞术测定CD57+和CD57-级分内的g-NK百分比。对于ADCC细胞毒性测定，将来自先前扩增的冷冻的NK细胞解冻，并在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中在37℃下孵育1小时。使用乳腺癌细胞系SKBR3和头/颈癌细胞系CAL27作为靶标进行ADCC测定。正如我们先前所描述的(Bigley等人,2014)，将扩增的NK细胞与CD71标记的SKBR3和CAL27靶细胞(1.0x104个细胞)以1:1、5:1、10:1和20:1NK细胞:靶细胞比率在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中共培养。用于SKBR3测定的培养基是具有2.5μg/mL曲妥珠单抗(抗HER2)的补充10％FBS的McCoy's 5A培养基，并且用于CAL27测定的培养基是具有10μg/mL西妥昔单抗(抗EGFR)的补充10％FBS的DMEM。在每种情况下，还在不存在治疗抗体的情况下测量基础细胞毒性。使用仅靶细胞的管来对照自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。还存在靶细胞+抗体管(未添加NK细胞)以解释单独归因于抗体的细胞死亡。在37℃下孵育4h后，洗涤所述细胞并用抗CD3和CD56抗体对其染色，以定量管中NK细胞的数量。在最终洗涤之后，添加碘化丙啶(PI)，并且使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。通过如下方式测定细胞毒性：在每个NK细胞剂量下从总死亡％减去自发性细胞死亡％(基础细胞毒性＝总死亡％-自发性细胞死亡％)。所述SKBR3和CAL27细胞系购自ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。
如图5A和图5B所示，发现g-NK杀伤SKBR3和CAL27靶标远好于常规NK细胞。特别地，当存在曲妥珠单抗时，g-NK以20:1NK:靶标比率杀伤46％的SKBR3细胞，这远远大于以相同比率通过cNK杀伤的18％的SKBR3细胞(n＝4)(图5A)。在20:1NK:靶标比率下基础细胞毒性(在没有曲妥珠单抗的情况下)对于g-NK为18％并且对于cNK为14％。常规NK细胞的ADCC与g-NK细胞的基础细胞毒性相同。类似地，图5B描绘了当存在西妥昔单抗时在20:1NK:靶标比率下g-NK杀伤CAL27细胞的80％，这远大于在相同比率下被cNK杀伤的CAL27细胞的50％(n＝4)。在20:1NK:靶标比率下g-NK和cNK二者的基础细胞毒性(在没有西妥昔单抗的情况下)是12％。
在使用与上述相同的供体NK细胞的另一系列实验中，将NK细胞与结直肠癌细胞系HT-29和SW-480或肺癌细胞系A-549靶细胞以1:1、5:1、10:1和20:1NK细胞与靶细胞比率一起孵育。用于HT-29测定的培养基是具有5μg/mL西妥昔单抗的补充10％FBS的McCoy's 5A培养基；用于SW-480测定的培养基是具有5μg/mL西妥昔单抗的补充10％FBS的Leibovitz'sL-15培养基；并且用于A-549测定的培养基是具有5μg/mL西妥昔单抗的补充10％FBS的F-12K培养基。通过基于用可鉴定肿瘤靶细胞的抗CD71抗体和作为细胞死亡的标记物的PI染色的流式细胞术来测定ADCC。还在不存在治疗抗体的情况下测量基础细胞毒性。
图6A-图6C中的结果表明，发现g-NK杀伤HT-29、SW-480和A-549靶标远好于cNK(使用与上述相同的供体NK细胞)。特别地，如图6A所示，当存在西妥昔单抗时在20:1NK:靶标比率下g-NK杀伤HT-29细胞的35％，这优于在相同比率下被cNK杀伤的HT-29细胞的14％(n＝4)。在20:1NK:靶标比率下基础细胞毒性(在没有西妥昔单抗的情况下)对于g-NK为14％并且对于常规NK细胞为11％。类似地，图6B描绘了当存在西妥昔单抗时在20:1NK:靶标比率下g-NK杀伤SW-480细胞的56％，这远大于在相同比率下被cNK杀伤的SW-480细胞的23％(n＝4)。在20:1NK:靶标比率下基础细胞毒性(在没有西妥昔单抗的情况下)对于g-NK为24％并且对于cNK为18％。此外，图6C显示当存在西妥昔单抗时在20:1NK:靶标比率下g-NK杀伤A-549的62％，这显著优于在相同比率下被cNK杀伤的A-549细胞的23％(n＝4)。在20:1NK:靶标比率下基础细胞毒性(在没有西妥昔单抗的情况下)对于g-NK为23％并且对于常规NK细胞为17％。对于所有3种细胞系，cNK的ADCC与g-NK细胞的基础细胞毒性相同。
总之，结果表明，扩增的g-NK能够类似地增强针对液体肿瘤和实体瘤的ADCC，以及增强对NK细胞ADCC高度或轻度易感的肿瘤的ADCC。
实施例6：扩增的NK细胞的体内持久性的评估
如实施例2中所述扩增NK细胞。驯化1周后，将单剂量的1x107个扩增的g-NK(新鲜或冷冻/解冻的)或cNK(冷冻/解冻的)与IL-15补充剂(每3天腹膜内2μg)一起注射至雌性NOD scidγ(NSG)小鼠中(参见表E1)。所述g-NK是从单一CMV血清反应阳性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前61％且扩增后90％)，而所述cNK是从单一CMV血清反应阴性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前和扩增后0％)。使用细胞内流式细胞术确认g-NK的百分比。对于在扩增后冷冻并解冻用于该项研究中的细胞，用于冷冻的细胞的冷冻培养基是90％FBS和10％DMSO。将冷冻的细胞产物在施用至所述小鼠之前在热水浴(37℃)中快速解冻。
从各个小鼠收集血液样品以在体内确定各个NK细胞的体内持久性。对于血液收集，在输注后第5、8、14、15和22天使用EDTA真空采血管(vacutainer)获得50μL抽血，并冷冻(添加10％DMSO)以用于随后的流式细胞术(图7A)。在第22天，处死所有小鼠，并有生存力地冷冻骨髓和脾脏(90％FBS和10％DMSO)(分别参见图7B、图7C)。
表E1.持久性研究设计
Figure BDA0003169946540001101
如图7A所示，如在所有时间点(第5、8、14、15和22天)所观察到的，在NSG小鼠的血流中，新鲜分离或冷冻-解冻的g-NK的持续时间显著长于冷冻-解冻的cNK的持续时间。特别地，在22天后，发现几乎没有cNK在脾脏中持续存在，而检测到大量的g-NK(图7B)。g-NK在骨髓中的持久性也优于cNK(图7C)。
实施例7：与抗CD20抗体组合的扩增的NK细胞的抗肿瘤活性的评估
通过评价当与抗CD20抗体组合注射时在体内对肿瘤的抑制来评估通过实施例2中所述的方法扩增的NK细胞的功能活性。
将5x105个萤光素酶标记的Raji人淋巴瘤细胞系静脉内注射至雌性NOD scidγ(NSG)小鼠中，并使其生长2天。将单克隆抗体利妥昔单抗单独或与15x106个扩增的g-NK细胞(实施例2)组合腹膜内施用至小鼠，所述扩增的g-NK细胞是在21天内静脉内施用3个剂量(参见表E2)。每周使用生物发光成像监测肿瘤负荷，并且每2天或每3天记录一次存活率。所述g-NK是从单一CMV血清反应阳性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前61％且扩增后90％)，而所述cNK是从单一CMV血清反应阴性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前和扩增后0％)。使用细胞内流式细胞术确认g-NK的百分比。表E2.Raji功效研究设计
Figure BDA0003169946540001111
相对于未治疗的小鼠或单独用利妥昔单抗治疗的小鼠，g-NK的过继转移大大地增强了利妥昔单抗在Raji淋巴瘤异种移植模型中的功效，并且输注g-NK能够提高NSG小鼠的存活率。如图8A和图8B所示，未接受治疗的小鼠在注射后7天展现出快速的肿瘤生长，并且所有未治疗的小鼠在第25天之前死亡。仅接受利妥昔单抗的小鼠在第28天后显示出延迟但仍快速的肿瘤生长，并且在第30天后存活率开始下降。接受g-NK与利妥昔单抗组合施用的小鼠仅在第28天后展现出轻微的肿瘤生长，并且所有小鼠存活至第35天。
这些结果表明，当与单克隆抗体组合时，g-NK的抗淋巴瘤作用可以在体内得到利用。
实施例8：与抗CD38抗体或抗CD319抗体组合的扩增的NK细胞的抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性(ADCC)的评估
通过评价与达雷木单抗(抗CD38)或埃罗妥珠单抗(抗CD319)组合时抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评估通过实施例2中所述方法相比于所述替代方法扩增的NK细胞的功能活性。
扩增前(新鲜分离的)ADCC：供体是CMV血清反应阳性(n＝14)和CMV血清反应阴性(n＝2)。将所有供体针对g-NK细胞百分比进行预筛选，并基于g-NK细胞的比例分类为“g-NK”供体(n＝10CMV+)或“常规”供体(n＝4CMV+，n＝2CMV-)。g-NK在“g-NK”供体中的比例为30.0％±2.1％，而g-NK在“常规”供体中的比例仅为1.6％±0.4％。从“g-NK”供体磁性分选CD57+NK细胞，并且从“常规”供体磁性分选大量NK细胞(CD3-/CD56+)。来自“g-NK”和“常规”供体的磁性分选级分的实际g-NK百分比分别为84.3％±2.4％和1.6％±0.4％。特别地，使用从Millipore(美国马萨诸塞州伯灵顿)购买的FcRγ抗体通过细胞内流式细胞术测定每种级分内的g-NK百分比。
对于ADCC细胞毒性测定，将冷冻的PBMC解冻并在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中在37℃下孵育1小时。然后进行磁珠分离，以分别从“g-NK”和“常规”供体分离CD57+NK细胞和大量NK细胞。使用多发性骨髓瘤细胞系MM.1S(ATCC，维吉尼亚州马纳萨斯)作为靶标进行ADCC测定。将NK细胞与CD71标记的MM.1S靶细胞(1.0x104个细胞)以0.5:1、1:1、2.5:1和5:1NK细胞:靶细胞比率在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中共培养，这类似于Bigley等人2014中所述的方法。用于ADCC测定的培养基是具有1μg/mL达雷木单抗(抗CD38)或1μg/mL埃罗妥珠单抗(抗CD319)的补充10％FBS的RPMI-1640培养基。在每种情况下，还在不存在治疗抗体的情况下测量基础细胞毒性。使用仅靶细胞的管来对照自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，洗涤所述细胞并用抗CD3和CD56抗体对其染色，以定量管中NK细胞的数量。在最终洗涤之后，添加碘化丙啶(PI)，并且使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。
扩增后(扩增的)ADCC：将五个供体针对g-NK细胞百分比进行预筛选，并基于g-NK细胞的比例分类为“g-NK”供体(n＝3)或“常规”供体(n＝2)。g-NK在“g-NK”供体中的比例为30.3％±2.0％，而g-NK在“常规”供体中的比例仅为1.6％±0.4％。从“g-NK”供体磁性分选CD57+NK细胞，并且从“常规”供体磁性分选大量NK细胞(CD3-/CD56+)。来自“g-NK”和“常规”供体的磁性分选级分的实际g-NK百分比分别为84.0％±2.5％和1.6％±0.4％。然后如实施例2中所述将g-NK和cNK级分扩增，并低温保存以用于随后的如上所述ADCC测定。
当与达雷木单抗或埃罗妥珠单抗组合时，与cNK相比，g-NK具有对MM.1S多发性骨髓瘤细胞的更大ADCC。特别地，当存在达雷木单抗或埃罗妥珠单抗时，与cNK相比，在所有4个NK细胞剂量下，新鲜分离的g-NK具有对MM.1S细胞的显著更高的细胞毒性(参见图9A)。类似地，当与达雷木单抗或埃罗妥珠单抗组合时，与扩增的cNK相比，扩增的g-NK具有更大的抗骨髓瘤ADCC(参见图9B)。当不存在抗体时，在g-NK和cNK(未扩增的或扩增的)对MM.1S细胞的细胞毒性之间没有差异(参见图9A和图9B)。总体而言，该数据表明g-NK对多发性骨髓瘤具有强烈的抗体依赖性细胞毒性活性。
实施例9：与抗CD38抗体或抗CD319抗体组合的扩增的NK细胞的抗肿瘤活性的评估
通过评价当与抗CD38抗体或抗CD319抗体组合注射时在体内对肿瘤的抑制来评估通过实施例2中所述的方法扩增的NK细胞的功能活性。
将1x106个萤光素酶标记的MM.1S人骨髓瘤细胞系静脉内注射至雌性NOD scidγ(NSG)小鼠中，并使其生长7天。将单克隆抗体达雷木单抗或埃罗妥珠单抗单独或与扩增的g-NK细胞或生理水平的比较物cNK细胞组合腹膜内施用至小鼠，后者是在31天内静脉内施用6个剂量(参见表E3)。每周使用生物发光成像监测肿瘤负荷。在研究完成时，从g-NK和cNK臂中的各3只小鼠收获骨髓和脾脏样品，并有生存力地冷冻以用于随后的流式细胞术分析，从而测定各个NK群体的持久性。所述g-NK是从单一CMV血清反应阳性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前61％且扩增后90％)，而所述cNK是从单一CMV血清反应阴性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前和扩增后0％)。使用细胞内流式细胞术确认g-NK的百分比。
如实施例2中所述扩增g-NK细胞并将其在每个剂量下以2x107个细胞施用，而将未扩增的cNK在每个剂量下以3x105个细胞施用。所述cNK剂量相当于人的NK细胞/kg的生理水平(Cooley等人,2019)。
表E3.MM功效研究设计
Figure BDA0003169946540001131
Figure BDA0003169946540001141
在接种MM.1S并用达雷木单抗或埃罗妥珠单抗治疗的NSG小鼠中，过继转移的g-NK对肿瘤负荷和存活率的益处描述于图10和图11中。与使用单独的达雷木单抗或达雷木单抗加生理水平的cNK细胞治疗的小鼠相比，用达雷木单抗和g-NK治疗的小鼠具有显著更低的肿瘤负荷(BLI)(参见图10A)。另外，与用单独的埃罗妥珠单抗或埃罗妥珠单抗加生理水平的cNK细胞治疗的小鼠相比，用埃罗妥珠单抗和g-NK治疗的小鼠具有更低的肿瘤负荷(参见图10B)。此外，当与用媒介物、单独mAb、单独g-NK或mAb加生理水平的cNK治疗的小鼠相比时，g-NK与达雷木单抗或埃罗妥珠单抗的组合产生了更优的存活率，如图11A(达雷木单抗)和图11B(埃罗妥珠单抗)所示。总体而言，该数据表明，当与单克隆抗体组合时，g-NK的抗骨髓瘤作用可以在体内得到利用。
在接种MM.1S并用达雷木单抗或埃罗妥珠单抗治疗的NSG小鼠中，g-NK的优异的持久性描述于图12A-图12C中。与cNK相比，g-NK在达雷木单抗治疗的小鼠的脾脏和骨髓中以更高水平持续存在(参见图12A和图12B)，而在血液中g-NK与cNK持久性之间没有差异(参见图12C)。此外，达雷木单抗治疗的小鼠的骨髓和脾脏中g-NK的数量高于所有其他组(参见图12A和图12B)。与cNK相比，g-NK在埃罗妥珠单抗治疗的小鼠的脾脏和血液中以更高水平持续存在(图12A和图12C)，而在骨髓中g-NK与cNK持久性之间没有差异(参见图12B)。仅用g-NK治疗(没有达雷木单抗或埃罗妥珠单抗)的小鼠的血液中g-NK的数量显著高于所有其他组(参见图12C)。
实施例10：g-NK细胞的细胞表面标记物的评估
该实施例部分地证明了由于缺乏靶表面标记物而保护g-NK细胞免遭抗体。
将大约2.0x105个NK细胞和/或MM.1S或Raji细胞等分至流式管中，并如表E4所述用2μL 7-AAD活力染料和2μL抗CD45、2μL抗CD20、2μL抗CD38、2μL抗CD3、10μL抗SLAMF7和2μL抗CD56抗体染色。在4℃下孵育10分钟后，洗涤细胞并使用抗FceRI抗体(Millipore)进行细胞内染色。染色过程完成后，通过8色流式细胞术(Miltenyi MACSQuant分析仪10)评估表达CD20、CD38和SLAMF7的g-NK、cNK和MM.1S或Raji细胞的百分比。
表E4.用于测定NK、MM和Raji细胞上CD20、CD38和SLAMF7表达的流式细胞术检测组。
Figure BDA0003169946540001151
*FcRg是细胞内表位
g-NK、cNK和MM.1S细胞上CD20、CD38和SLAMF7的表达呈现于图13A-图13D中。g-NK和cNK均缺乏CD20的表达，CD20在Raji淋巴瘤细胞上高度表达(图13A)。g-NK对CD38的表达远低于cNK和MM.1S细胞(参见图13B)。在g-NK与cNK之间SLAMF7的表达没有差异，而g-NK和cNK二者均展现出远低于MM.1S细胞的SLAMF7表达(参见图13C)。与扩增的cNK相比，在扩增的g-NK上还观察到降低的CD38表达(参见图13D)。g-NK缺乏CD20、CD38或SLAMF7表达使得能够免于由利妥昔单抗(抗CD20)、达雷木单抗(抗CD38)或埃罗妥珠单抗(抗SLAMF7)导致的mAb诱导的自相残杀。总体而言，该数据进一步说明了当与cNK相比时，g-NK如何具有持久性优势，尤其是在存在治疗性抗体(例如达雷木单抗)的情况下。
g-NK细胞相比于常规NK细胞上降低的或较低的CD38表达的观察结果支持了这样的策略，其中CD38可以用作用于富集g-NK细胞的标记物。CD38与g-NK细胞表型的反向关联与实施例2中所述的扩增方法中CD57富集的替代策略一致。这些发现支持了扩增g-NK细胞的方法，其中通过基于免疫亲和力的分离以如下方式从PBMC富集NK细胞：耗尽CD3+细胞以去除T细胞(CD3耗尽)，接着进行CD56选择以富集CD56+NK细胞，接着针对CD38进行阴性选择以去除或耗尽CD38+细胞，即CD3-CD56+CD38-。分离和富集该NK细胞子集之后，CD3-CD56+CD38-NK细胞子集可以被冷冻或新鲜使用，然后根据实施例2或图2中所述的方法进行扩增，例如通过在存在重组IL-2(例如100IU/mL)的情况下用经辐照的221.AEH靶细胞(例如2.5:1221.AEH与NK细胞)以及任选地经辐照的PBMC饲养细胞(例如5:1PBMC与NK细胞)培养约14天进行扩增。如果在扩增中使用经辐照的PBMC饲养细胞，则扩增的至少一部分包括与抗CD3单克隆抗体(OKT3)一起孵育以激活细胞，如实施例2中所述。
实施例11：与曲妥珠单抗或西妥昔单抗组合的扩增的NK细胞对卵巢癌细胞的抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的评估
通过评价与曲妥珠单抗或西妥昔单抗组合时抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评估通过实施例2中所述方法相比于所述替代方法扩增的NK细胞的功能活性。
扩增前(新鲜分离的)ADCC：供体是CMV血清反应阳性(n＝14)和CMV血清反应阴性(n＝2)。将所有供体针对g-NK细胞百分比进行预筛选，并基于g-NK细胞的比例分类为“g-NK”供体(n＝10CMV+)或“常规”供体(n＝4CMV+，n＝2CMV-)。g-NK在“g-NK”供体中的比例为30.0％±2.1％，而g-NK在“常规”供体中的比例仅为1.6％±0.4％。从“g-NK”供体磁性分选CD57+NK细胞，并且从“常规”供体磁性分选大量NK细胞(CD3-/CD56+)。来自“g-NK”和“常规”供体的磁性分选级分的实际g-NK百分比分别为84.3％±2.4％和1.6％±0.4％。特别地，使用从Millipore(美国马萨诸塞州伯灵顿)购买的FcRγ抗体通过细胞内流式细胞术测定每种级分内的g-NK百分比。
对于ADCC细胞毒性测定，将冷冻的PBMC解冻并在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中在37℃下孵育1小时。然后进行磁珠分离，以分别从“g-NK”和“常规”供体分离CD57+NK细胞和大量NK细胞。使用卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC)作为靶标进行ADCC测定。使用Bigley等人2014中所述的方法，将NK细胞与CD71标记的SKOV3靶细胞(1.0x104个细胞)以0.5:1、1:1、2.5:1和5:1NK细胞:靶细胞比率在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中共培养。用于ADCC测定的培养基是具有1μg/mL曲妥珠单抗(抗Her2)的10％McCoy's 5A培养基。在每种情况下，还在不存在治疗抗体的情况下测量基础细胞毒性。使用仅靶细胞的管来对照自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，洗涤所述细胞并用抗CD3和CD56抗体对其染色，以定量管中NK细胞的数量。在最终洗涤之后，添加碘化丙啶(PI)，并且使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。
扩增后(扩增的)ADCC：将5个供体针对g-NK细胞百分比进行预筛选，并基于g-NK细胞的比例分类为“g-NK”供体(n＝3)或“常规”供体(n＝2)。g-NK在“g-NK”供体中的比例为30.3％±2.0％，而g-NK在“常规”供体中的比例仅为1.6％±0.4％。从“g-NK”供体磁性分选CD57+NK细胞，并且从“常规”供体磁性分选大量NK细胞(CD3-/CD56+)。来自“g-NK”和“常规”供体的磁性分选级分的实际g-NK百分比分别为84.0％±2.5％和1.6％±0.4％。然后如实施例2中所述将g-NK和cNK级分扩增，并低温保存以用于随后的如上所述ADCC测定。
当与曲妥珠单抗或西妥昔单抗组合时，与cNK相比，g-NK具有对SKOV3卵巢癌细胞的更大ADCC。特别地，当存在曲妥珠单抗时，与cNK相比，在所有4个NK细胞剂量下，新鲜分离的g-NK具有对SKOV3细胞的显著更高的细胞毒性(参见图14A)。类似地，当与曲妥珠单抗或西妥昔单抗组合时，与扩增的cNK相比，扩增的g-NK具有远远更大的抗SKOV3 ADCC(参见图14B和图14C)。当不存在抗体时，在g-NK和cNK(未扩增的或扩增的)对SKOV3细胞的细胞毒性之间没有差异(参见图14A和图14B)。总体而言，该数据表明g-NK对实体瘤恶性肿瘤如卵巢癌具有强烈的抗体依赖性细胞毒性活性。
实施例12：与抗HER2抗体组合的扩增的NK细胞的抗肿瘤活性和持久性的评估
通过评价当与抗HER2抗体(曲妥珠单抗)组合注射时在体内对肿瘤的抑制来评估通过实施例2中所述的方法扩增的NK细胞的功能活性。
将5x106个SKOV3人卵巢癌细胞系静脉内注射至雌性NOD scidγ(NSG)小鼠中，并使其生长30天。将单克隆抗体曲妥珠单抗单独或与扩增的g-NK或cNK细胞组合腹膜内施用至小鼠，所述扩增的g-NK或cNK细胞是在72天内静脉内施用3-6个剂量(参见表E5)。每周使用卡尺测量监测肿瘤负荷。在研究完成时，从g-NK和cNK臂中的小鼠收获骨髓和脾脏样品，并有生存力地冷冻以用于随后的流式细胞术分析。所述g-NK是从单一CMV血清反应阳性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前61％且扩增后90％)，而所述cNK是从单一CMV血清反应阴性供体扩增的(g-NK的百分比是扩增前和扩增后0％)。使用细胞内流式细胞术确认g-NK的百分比。
表E5.SKOV3功效研究设计
Figure BDA0003169946540001181
在接种SKOV3并用曲妥珠单抗治疗的NSG小鼠中，过继转移的g-NK对肿瘤负荷和存活率的益处描述于图15A-图15B中。与用单独的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗加cNK细胞治疗的小鼠相比，用曲妥珠单抗和相等数量的g-NK治疗的小鼠具有更小的肿瘤大小(参见图15A)。另外，当与用媒介物、单独的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗加cNK治疗的小鼠相比时，g-NK与曲妥珠单抗的组合导致存活率增加的趋势(参见图15B)。总体而言，该数据表明，当与单克隆抗体组合时，g-NK的抗肿瘤作用可以在体内用于抵抗实体恶性肿瘤。
在接种SKOV3并用曲妥珠单抗治疗的NSG小鼠中，血液样品、骨髓和脾脏样品显示出g-NK的优异的持久性。与cNK相比，g-NK在曲妥珠单抗治疗的小鼠的血液(参见图16A)、脾脏(参见图16B)和骨髓(参见图16C)中以更高的水平持续存在。
实施例13：与达雷木单抗组合的扩增的NK细胞对多发性骨髓瘤细胞的抗体依赖性 细胞介导的细胞毒性(ADCC)的评估
通过评价与达雷木单抗或埃罗妥珠单抗组合时抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评估通过实施例2中所述方法相比于所述替代方法扩增的NK细胞的功能活性。
供体呈CMV血清反应阳性(n＝5)，并使用实施例2中所述的方法扩增磁性分选的NK细胞(扩增前g-NK百分比＝34.6％±12.6％)。然后使用CD57微珠将扩增的NK细胞磁性分选为CD57+“g-NK”和CD57-“cNK”级分，并低温保存用于以后的ADCC测定。CD57+和CD57-级分的实际g-NK百分比分别为83.1％±1.6％和1.8％±0.5％。特别地，使用从Millipore(美国马萨诸塞州伯灵顿)购买的FcRγ抗体通过细胞内流式细胞术测定CD57+和CD57-级分内的g-NK百分比。
对于ADCC细胞毒性测定，将来自先前扩增的冷冻的NK细胞解冻，并在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中在37℃下孵育1小时。使用多发性骨髓瘤细胞系ARH-77和MM.1R作为靶标(各自来自ATCC)进行ADCC测定。使用Bigley等人2014中所述的方法，将扩增的NK细胞与CD71标记的ARH-77和MM.1R靶细胞(1.0x104个细胞)以1:1、2.5:1、5:1和10:1NK细胞:靶细胞比率在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中共培养。用于所述测定的培养基是具有1μg/mL达雷木单抗(抗CD38)的补充10％FBS的RPMI-1640培养基。在每种情况下，还在不存在治疗抗体的情况下测量基础细胞毒性。使用仅靶细胞的管来对照自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，洗涤所述细胞并用抗CD3和CD56抗体对其染色，以定量管中NK细胞的数量。在最终洗涤之后，添加碘化丙啶(PI)，并且使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。
当与达雷木单抗组合时，g-NK具有对多发性骨髓瘤细胞系的更大ADCC。特别地，当存在达雷木单抗时，与扩增的cNK相比，在所有4个NK细胞剂量下，扩增的g-NK具有对ARH-77细胞的显著更高的细胞毒性(参见图17A)。当存在达雷木单抗时，与扩增的cNK相比，在所有4个NK细胞剂量下，扩增的g-NK还具有对MM.1R细胞的更高的细胞毒性(参见图17B)。总体而言，该数据表明g-NK对MM.1S以外的多发性骨髓瘤细胞系具有强烈的抗体依赖性细胞毒性活性。
实施例14：与西妥昔单抗组合的扩增的g-NK细胞对多发性骨髓瘤细胞的抗体依赖 性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的评估
通过评价与西妥昔单抗组合时抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来评估通过实施例2中所述方法相比于所述替代方法扩增的NK细胞的功能活性。
扩增前(新鲜分离的)ADCC：供体是CMV血清反应阳性(n＝14)和CMV血清反应阴性(n＝2)。将所有供体针对g-NK细胞百分比进行预筛选，并基于g-NK细胞的比例分类为“g-NK”供体(n＝10CMV+)或“常规”供体(n＝4CMV+，n＝2CMV-)。g-NK在“g-NK”供体中的比例为30.0％±2.1％，而g-NK在“常规”供体中的比例仅为1.6％±0.4％。从“g-NK”供体磁性分选CD57+NK细胞，并且从“常规”供体磁性分选大量NK细胞(CD3-/CD56+)。来自“g-NK”和“常规”供体的磁性分选级分的实际g-NK百分比分别为82.2％±1.6％和2.4％±0.7％。特别地，使用从Millipore(美国马萨诸塞州伯灵顿)购买的FcRγ抗体通过细胞内流式细胞术测定每种级分内的g-NK百分比。
对于ADCC细胞毒性测定，将冷冻的PBMC解冻并在补充10％FBS的RPMI-1640培养基中在37℃下孵育1小时。然后进行磁珠分离，以分别从“g-NK”和“常规”供体分离CD57+NK细胞和大量NK细胞。使用结直肠癌细胞系SW-480作为靶标进行ADCC测定。使用Bigley等人2014中所述的方法，将NK细胞与CD71标记的SW-480(ATCC)靶细胞(1.0x104个细胞)以0.5:1、1:1、2.5:1和5:1NK细胞:靶细胞比率在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中共培养。用于SW-480测定的培养基是具有5μg/mL西妥昔单抗(抗EGFR)的补充10％FBS的Leibovitz's L-15培养基。在每种情况下，还在不存在治疗抗体的情况下测量基础细胞毒性。使用仅靶细胞的管来对照自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，洗涤所述细胞并用抗CD3和抗CD56抗体对其染色，以定量管中NK细胞的数量。在最终洗涤之后，添加碘化丙啶(PI)，并且使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。
扩增后(扩增的)ADCC：将5个供体针对g-NK细胞百分比进行预筛选，并基于g-NK细胞的比例分类为“g-NK”供体(n＝3)或“常规”供体(n＝2)。g-NK在“g-NK”供体中的比例为30.3％±2.0％，而g-NK在“常规”供体中的比例仅为1.6％±0.4％。从“g-NK”供体磁性分选CD57+NK细胞，并且从“常规”供体磁性分选大量NK细胞(CD3-/CD56+)。来自“g-NK”和“常规”供体的磁性分选级分的实际g-NK百分比分别为84.0％±2.5％和1.6％±0.4％。然后如实施例2中所述将g-NK和cNK级分扩增，并低温保存以用于随后的如上所述ADCC测定。
当与西妥昔单抗组合时，与cNK相比，g-NK具有对SW-480结直肠癌细胞的更大ADCC(参见图18A和图18B)。当存在西妥昔单抗时，与cNK相比，在所有4个NK细胞剂量下，新鲜分离的g-NK具有对SW-480细胞的显著更高的细胞毒性(参见图18A)。类似地，当与西妥昔单抗组合时，与扩增的cNK相比，扩增的g-NK具有远远更大的抗SW480 ADCC(参见图18B)。当不存在抗体时，在g-NK和cNK(未扩增的或扩增的)对SW-480细胞的细胞毒性之间没有差异(参见图18A和图18B)。总体而言，该数据表明g-NK对实体瘤恶性肿瘤如结直肠癌具有强烈的抗体依赖性细胞毒性活性。
实施例15：CD16158V多态性关于g-NK介导的ADCC功效的评估
158V是CD16的遗传多态性，其中氨基酸缬氨酸(V)代替更常见的苯丙氨酸(F)存在于蛋白质的第158个氨基酸位置(Koene等人,1997)。这导致CD16的更高表达和抗体亲和力，其导致CD16158V+NK细胞增强的ADCC(Hatjiharissi等人,2007)。已经观察到来自158V/V和158V/F供体的NK细胞经由ADCC杀伤ARH-77骨髓瘤和Daudi淋巴瘤细胞，这远远优于来自158F/F供体的NK细胞产生的杀伤，其中158V/V供体表现最佳(Hatjiharissi等人,2007)。该实施例至少部分地证明了携带158V多态性的g-NK的ADCC功效的相关性。
筛选40个CMV血清反应阳性供体，以确定g-NK比例最高的12个供体。通过磁珠分离富集这些供体的g-NK(CD3-/CD57+)，并针对以下肿瘤/抗体组合测试ADCC：1)SW-480/西妥昔单抗；2)SKOV3/曲妥珠单抗；3)SKOV3/西妥昔单抗；4)MM.1S/达雷木单抗；和5)MM.1S/埃罗妥珠单抗。将所述g-NK的ADCC与来自没有g-NK的供体(n＝4)的常规NK细胞(cNK)进行比较。在这12个供体中，有5个供体被分类为“超级供体”，因为它们一致具有较高的NK细胞ADCC活性。
对来自所有供体的NK细胞进行多态性测试和分组，以确定关于CD16的158V多态性(V/V、V/F和F/F)，每个供体属于哪个亚组。预期分布为35％V/V、25％V/F和40％F/F(Hatjiharissi等人,2007；Somboonyostdech等人,2012)，因此与该预期的任何偏差都可能表明158V多态性可能在这些供体所观察到的高ADCC中起作用。对于多态性测试，将冷冻的NK细胞解冻并用PBS洗涤并以100g离心。将NK细胞悬浮液收集至流式管中，并用2μL的针对CD45的荧光抗体(以从残留的红细胞中辨别白细胞)和2μL的7-AAD(活性染料)染色。在黑暗中室温下孵育10分钟后，用500μL PBS稀释细胞，并通过流式细胞术对7-AADneg/CD45pos白细胞的数量进行定量。细胞计数后，进行磁珠分离(Miltenyi MACSTMCD16微珠)以分离CD16posNK细胞群体。磁珠分离后，使用10X Genomics单细胞RNA测序来确定每个供体属于哪个CD16多态性组(V/V、V/F或F/F)。对于ADCC测定，158V g-NK和缺乏多态性的g-NK的实际g-NK百分比分别为82.2％±2.1％和82.8％±1.9％。通过细胞内流式细胞术测定g-NK的百分比。
结果表明，所有5个具有一致显示高ADCC活性的g-NK细胞的“超级供体”均展现出CD16 158V多态性。此外，如图19所示，当存在各种抗体时，158V g-NK在代表性癌症组(结直肠：SW-480；卵巢：SVOV3、SKOV3；和多发性骨髓瘤：MM.1S)之间平均而言也显示出显著更高的ADCC活性。另外，CD16基因的表达也与对所有测试的血液肿瘤和实体瘤细胞系的ADCC功效正相关(图20)。总之，这些结果与以下观察结果一致：携带158V基因型的g-NK由于CD16(g-NK细胞的ADCC的主要介体)的增强的表达和亲和力而在消除血液肿瘤和实体瘤方面更有效。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列表
<110> 因达普塔治疗公司
<120> 扩增天然杀伤 (NK) 细胞子集的方法以及相关组合物和方法
<130> 77603-20005.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/770,686
<151> 2018-11-21
<160> 18
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 高亲和力免疫球蛋白γFc受体I
<400> 1
Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val
50 55 60
Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys
65 70 75 80
His Glu Lys Pro Pro Gln
85
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 2
atatttacag aatggcacag g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 3
gacttggtac ccaggttgaa 20
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 4
atcagattcg atcctacttc tgcagggggc at 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 5
acgtgctgag cttgagtgat ggtgatgttc ac 32
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 6
cccaactcaa cttcccagtg tgat 24
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 7
gaaatctacc ttttcctcta atagggcaat 30
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 8
gaaatctacc ttttcctcta atagggcaa 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR 引物
<400> 9
gaaatctacc ttttcctcta atagggca 28
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 有义引物
<400> 10
ccaaaagcca cactcaaaga c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD16 反义引物
<400> 11
acccaggtgg aaagaatgat g 21
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaqMan 探针
<400> 12
aacatcacca tcactcaagg tttgg 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V 等位基因正向引物
<400> 13
ctgaagacac atttttactc ccaaa 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> V 等位基因反向引物
<400> 14
tccaaaagcc acactcaaag ac 22
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F 等位基因正向引物
<400> 15
ctgaagacac atttttactc ccaac 25
<210> 16
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD16 (F158)
<400> 16
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
195 200 205
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
210 215 220
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
225 230 235
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 17
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
<210> 18
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD16 VAR_003960
<400> 18
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
20 25 30
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
85 90 95
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
130 135 140
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
145 150 155 160
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
165 170 175
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
180 185 190
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
195 200 205
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
210 215 220
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
225 230 235

Claims (174)

1.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：
(a)分离富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述分离包括从来自人受试者的样品选择：(i)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，(ii)呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞，(iii)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(iv)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(v)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞，或(vi)呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞；以及
(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
2.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：
(a)分离富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述分离包括从来自人受试者的样品选择：(i)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，(ii)呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞，(iii)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(iv)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(v)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞，或(vi)呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞；
(b)将所述富集NK细胞的群体与经辐照的221.AEH饲养细胞和经辐照的外周血单核(PBMC)饲养细胞组合，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1，并且PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在为或约1:1与为或约5:1之间，包含端值，任选地其中所述PBMC饲养细胞对所述受试者而言是自体的；
(c)在存在重组IL-2和抗CD3抗体或抗原结合片段的情况下培养(b)的所述群体，其中在所述培养开始的7天内，用含有重组IL-2的新鲜培养基更换所述细胞培养基，并且任选地此后在所述培养的持续时间内每2或3天进一步用含有重组IL-2的新鲜培养基更换所述细胞培养基，其中所述培养产生扩增的g-NK细胞群体；以及
(d)收集所述扩增的细胞群体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在(a)之前，从所述人受试者收获所述样品。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述人受试者呈CMV血清反应阳性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述人受试者具有CD16158V+NK细胞基因型。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品是或包含外周血单核细胞(PBMC)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述样品是单采术或白细胞单采术样品。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分离属于(i)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分离属于(ii)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分离属于(iii)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分离属于(iv)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分离属于(v)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述分离属于(vi)，并且包括从所述样品选择呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中在(a)之后，低温保存所述分离的富集NK细胞的群体，并且在(b)之前，解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
16.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括：
(a)获得富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，其中所述富集NK细胞的群体包含选自以下的表型：(i)呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞，(ii)呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞，(iii)呈CD3阴性(CD3neg)的细胞，(iv)呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞，(v)呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞，或(vi)呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞；以及
(b)在存在以下项的情况下培养所述富集NK细胞的群体：(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的富集了g-NK细胞的NK细胞群体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述获得包括解冻包含所述富集的NK细胞的低温保存样品。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体属于(i)，并且包含呈CD3阴性且呈CD57阳性(CD3negCD57pos)的细胞。
19.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体属于(ii)，并且包含呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性(CD3negCD56posCD38neg)的细胞。
20.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体属于(iii)，并且包含呈CD3阴性(CD3neg)的细胞。
21.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体属于(iv)，并且包含呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性(CD3negCD56pos)的细胞。
22.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体属于(v)，并且包含呈CD3阴性且呈CD16阳性(CD3negCD16pos)的细胞。
23.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体属于(vi)，并且包含呈CD3阴性(CD3neg)且呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)的细胞。
24.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：
(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和
(ii)重组IL-2；
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在所述培养之前，从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：
(1)选择(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD57阳性的细胞，从而富集第一选择的群体；以及
(2)从所述第一选择的群体选择除(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD57阳性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞。
26.根据权利要求9、权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述分离包括：
(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；以及
(2)从所述第一选择的群体选择呈CD57阳性的细胞以富集呈CD3阴性且呈CD57阳性的细胞。
27.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性、呈CD56阳性且呈CD38阴性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：
(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和
(ii)重组IL-2；
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中在所述培养之前，从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：
(1)选择呈CD3阴性的细胞，从而富集第一选择的群体；
(2)从所述第一选择的群体选择(a)呈CD56阳性的细胞或(b)呈CD38阴性的细胞，从而富集第二选择的群体；以及
(3)从所述第二选择的群体选择除(a)呈CD56阳性的细胞或(b)呈CD38阴性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD56阳性且呈CD38阴性的细胞。
29.根据权利要求10、权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述分离包括：
(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；
(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；以及
(3)从所述第二选择的群体选择呈CD38阴性的细胞以富集呈CD3阴性且呈CD56阳性且呈CD38阴性的细胞。
30.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：
(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和
(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在所述培养之前，从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：
(1)选择(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD16阳性的细胞，从而富集第一选择的群体；以及
(2)从所述第一选择的群体选择除(a)呈CD3阴性的细胞或(b)呈CD16阳性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞。
32.根据权利要求13、权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述分离包括：
(1)从所述样品选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；以及
(2)从所述第一选择的群体选择呈CD16阳性的细胞以富集呈CD3阴性且呈CD16阳性的细胞。
33.一种用于扩增FcRγ缺陷型NK细胞(g-NK)的方法，所述方法包括培养从来自人受试者的样品富集了天然杀伤(NK)细胞的原代人细胞群体，所述富集NK细胞的群体包含呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞，其中所述培养是在存在以下项的情况下进行的：
(i)经辐照的221.AEH饲养细胞，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与富集的NK细胞的比率为1:10至10:1；和
(ii)重组IL-2，
其中所述方法产生扩增的g-NK细胞群体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在所述培养之前，从所述样品分离所述富集NK细胞的群体，所述分离包括：
(1)选择呈CD3阴性的细胞，从而富集第一选择的群体；
(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞，从而富集第二选择的群体；
(3)从所述第二选择的群体选择(a)呈NKG2A阴性的细胞或(b)呈CD161阴性的细胞，从而富集第三选择的群体；以及
(4)从所述第三选择的群体选择除(a)呈NKG2A阴性的细胞或(b)呈CD161阴性的细胞以外的细胞，从而富集呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞。
35.根据权利要求14、权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述分离包括：
(1)选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；
(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；
(3)从所述第二选择的群体选择呈NKG2A阴性的细胞以产生第三选择的群体；以及
(4)从所述第三选择的群体选择呈CD161阴性的细胞，以富集呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞。
36.根据权利要求14、权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述分离包括：
(1)选择呈CD3阴性的细胞以产生第一选择的群体；
(2)从所述第一选择的群体选择呈CD56阳性的细胞以产生第二选择的群体；
(3)从所述第二选择的群体选择呈CD161阴性的细胞以产生第三选择的群体；以及
(4)从所述第三选择的群体选择呈NKG2A阴性的细胞，以富集呈CD3阴性、呈CD56阳性、呈NKG2A阴性且呈CD161阴性的细胞。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的方法，其中所述样品包含外周血单核细胞(PBMC)。
38.根据权利要求24-37中任一项所述的方法，其中在所述培养之前，从所述人受试者收获所述样品。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述人受试者呈CMV血清反应阳性。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述人受试者具有CD16 158V+NK细胞基因型。
41.根据权利要求24-40中任一项所述的方法，其中所述样品是单采术或白细胞单采术样品。
42.根据权利要求25、26、28、29、31、32、34和35-41中任一项所述的方法，其中所述选择包括基于免疫亲和力的选择。
43.根据权利要求25-42中任一项所述的方法，其中所述富集的NK细胞来自先前已从来自所述受试者的样品分离的低温保存样品。
44.根据权利要求1和3-43中任一项所述的方法，其中所述培养还在存在以下项的情况下进行：(iii)原代人外周血单核细胞(PBMC)饲养细胞，其中所述PBMC饲养细胞是经辐照的。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在所述培养之前，将所述富集NK细胞的群体与经辐照的221.AEH饲养细胞和经辐照的PBMC饲养细胞组合。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的方法，其中PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在为或约1:1与为或约5:1之间，包含端值。
47.根据权利要求2和44-46中任一项所述的方法，其中所述PBMC饲养细胞对所述受试者而言是自体的。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述培养的至少一部分是在存在至少一种刺激剂的情况下进行的，所述至少一种刺激剂能够刺激所述PBMC饲养细胞的一种或多种T细胞的激活。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述刺激剂与TCR复合物的成员特异性地结合，任选地其中所述药剂与CD3、任选CD3ε特异性地结合。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述至少一种刺激剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段。
51.根据权利要求2或权利要求50所述的方法，其中所述抗CD3抗体或其抗原结合片段是OKT3抗体或抗原结合片段。
52.根据权利要求2、权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是在为或约10ng/mL与为或约100ng/mL之间。
53.根据权利要求2和50-52中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段的浓度是为或约50ng/mL。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述至少一种刺激剂是在所述培养开始时或与经辐照的PBMC饲养细胞同时或大约同时开始添加。
55.根据权利要求2和44-54中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间，所述PBMC饲养细胞被激活。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与NK细胞的比率是为或约1:1或更大。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中经辐照的221.AEH饲养细胞与NK细胞的比率是在1:1与5:1之间，包含端值。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是在1:1与3:1之间，包含端值。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是或是约2.5:1。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述NK细胞是新鲜分离的或先前尚未冷冻和解冻的。
61.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中经辐照的AEH.221饲养细胞与富集的NK细胞的比率是或是约1:1。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述NK细胞在冷冻后已被解冻。
63.根据权利要求2和44-62中任一项所述的方法，其中PBMC饲养细胞与富集的NK细胞的比率是为或约5:1。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间，重组IL-2的浓度是在为或约10IU/mL与为或约500IU/mL之间。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中在所述培养的至少一部分期间，重组IL-2的浓度是为或约100IU/mL重组IL-2。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述重组IL-2是在所述培养开始时或大约在所述培养开始时开始添加。
67.根据权利要求1和3-66中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述培养期间更换所述培养基一次或多次。
68.根据权利要求2或权利要求45所述的方法，其中更换所述培养基是在所述培养开始后为或约3至7天内、任选地在所述培养开始后5天或大约5天进行。
69.根据权利要求68所述的方法，其中更换所述培养基是在所述培养的剩余持续时间内每两天或三天进行。
70.根据权利要求2和67-69中任一项所述的方法，其中所述培养基的更换从所述培养基减少或去除所述至少一种刺激剂。
71.根据权利要求67-70中任一项所述的方法，其中在每次更换所述培养基时，将含有重组IL-2的新鲜培养基添加至所述培养物。
72.根据权利要求2和71中任一项所述的方法，其中以在为或约10IU/mL与为或约500IU/mL之间的浓度添加所述重组IL-2，包含端值。
73.根据权利要求2、权利要求71或权利要求72所述的方法，其中以为或约100IU/mL重组IL-2的浓度添加所述重组IL-2。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述富集NK细胞的群体包含至少或至少约0.2x106个富集的NK细胞、至少或至少约1.0x106个富集的NK细胞、或为或约10x106个富集的NK细胞。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体的浓度是在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约1.0x106个富集的NK细胞/mL之间。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体的浓度是在为或约0.05x106个富集的NK细胞/mL与为或约0.5x106个富集的NK细胞/mL。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中在所述培养开始时所述富集NK细胞的群体具有为或约0.2x106个富集的NK细胞/mL的浓度。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约2.50x108个g-NK细胞的扩增的时间。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.00x108个g-NK细胞的扩增的时间。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约1.0x109个g-NK细胞的扩增。
81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中进行所述培养直到所述方法实现至少或至少约5.0x109个g-NK细胞的扩增的时间。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述培养进行为或约或至少或至少约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述培养进行为或约或至少或至少约14天。
84.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述培养进行为或约或至少或至少约21天。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中与所述培养开始时相比，所述方法在所述培养结束时产生增加数量的g-NK细胞。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述增加是大于或大于约100倍、大于或大于约200倍、大于或大于约300倍、大于或大于约400倍、大于或大于约500倍、大于或大于约600倍、大于或大于约700倍或大于或大于约800倍。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述增加是为或约1000倍或更多。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中在所述培养后收集通过所述方法产生的扩增的g-NK细胞群体。
89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法，其中所述g-NK细胞呈FcRγneg。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述g-NK细胞还呈CD45pos/CD3neg/CD56pos。
91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。
92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述扩增的细胞群体纯化或选择具有g-NK细胞替代表面标记物特征的细胞群体。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。
94.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。
95.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD38neg。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的方法，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征还是CD45pos/CD3neg/CD56pos。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述扩增的g-NK细胞群体配制在药学上可接受的赋形剂中。
98.根据权利要求97所述的方法，所述方法还包括在存在低温保护剂的情况下低温保存所述细胞和/或配制所述细胞。
99.一种组合物，所述组合物包含通过根据权利要求1-98中任一项所述的方法产生的g-NK细胞。
100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物包含至少或至少约108个g-NK细胞。
101.根据权利要求99或权利要求100所述的组合物，其中所述组合物中g-NK细胞的数量是为或约108至为或约1012个细胞、为或约108至为或约1011个细胞、为或约108至为或约1010个细胞、为或约108至为或约109个细胞、为或约109至为或约1012个细胞、为或约109至为或约1011个细胞、为或约109至为或约1010个细胞、为或约1010至为或约1012个细胞、为或约1010至为或约1011个细胞、或为或约1011至为或约1012个细胞。
102.根据权利要求99-101中任一项所述的组合物，其中所述g-NK细胞呈FcRγneg。
103.根据权利要求102所述的组合物，其中所述g-NK细胞还呈CD45pos/CD3neg/CD56pos。
104.根据权利要求99-101中任一项所述的组合物，其中所述g-NK细胞是具有g-NK替代表面标记物特征的细胞。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg。
106.根据权利要求104所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是NKG2Aneg/CD161neg。
107.根据权利要求104所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征是CD38neg。
108.一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
109.根据权利要求108所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
110.根据权利要求108所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约80％的细胞包含作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
111.根据权利要求108所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞包含作为CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
112.一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
113.根据权利要求112所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
114.根据权利要求112所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约80％的细胞包含作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
115.根据权利要求112所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞包含作为NKG2Aneg/CD161neg的g-NK细胞替代标记物特征。
116.一种包含天然杀伤(NK)细胞子集的组合物，其中所述组合物中至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约80％、或至少或至少约90％的细胞具有作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。
117.根据权利要求116所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约70％的细胞包含作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。
118.根据权利要求116所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约80％的细胞包含作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。
119.根据权利要求116所述的组合物，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞包含作为CD38neg的g-NK细胞替代标记物特征。
120.根据权利要求105-119中任一项所述的组合物，其中所述g-NK细胞替代表面标记物特征还包括CD45pos/CD3neg/CD56pos。
121.根据权利要求104-120中任一项所述的组合物，其中在包含所述g-NK细胞替代标记物特征的细胞中大于70％呈FcRγneg，任选地在为或约70％与90％之间呈FcRγneg。
122.根据权利要求108-121中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少或至少约108个细胞。
123.根据权利要求108-122中任一项所述的组合物，其中所述组合物中g-NK细胞的数量是为或约108至为或约1012个细胞、为或约108至为或约1011个细胞、为或约108至为或约1010个细胞、为或约108至为或约109个细胞、为或约109至为或约1012个细胞、为或约109至为或约1011个细胞、为或约109至为或约1010个细胞、为或约1010至为或约1012个细胞、为或约1010至为或约1011个细胞、或为或约1011至为或约1012个细胞。
124.根据权利要求99-123中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的细胞来自单一供体受试者，所述细胞已经从相同样品扩增。
125.根据权利要求99-124中任一项所述的组合物，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
126.根据权利要求99-125中任一项所述的组合物，所述组合物包含低温保护剂。
127.根据权利要求99-126中任一项所述的组合物，所述组合物是无菌的。
128.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求99-127中任一项所述的组合物和用于治疗疾病的另外的药剂。
129.根据权利要求128所述的试剂盒，所述试剂盒还包含用于施用所述组合物和用于治疗疾病或病症的另外的药剂的说明书。
130.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求99-127中任一项所述的组合物和用于施用所述组合物与用于治疗疾病的另外的药剂的组合疗法的说明书。
131.根据权利要求128-130中任一项所述的试剂盒，其中所述另外的药剂是抗体或Fc融合蛋白。
132.根据权利要求131所述的试剂盒，其中所述抗体识别或特异性地结合肿瘤相关抗原。
133.根据权利要求131或权利要求132所述的试剂盒，其中所述抗体识别或结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。
134.根据权利要求131-133中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体是全长抗体和/或包含Fc结构域。
135.根据权利要求131-134中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含作为细胞毒性剂或癌症药物的另外的药剂。
136.根据权利要求128-130中任一项所述的试剂盒，其中所述另外的药剂是细胞毒性剂或癌症药物。
137.根据权利要求128-130中任一项所述的试剂盒，其中所述另外的药剂是溶瘤病毒。
138.一种制品，所述制品包含根据权利要求128-137中任一项所述的试剂盒。
139.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用根据权利要求99-127中任一项所述的组合物。
140.根据权利要求139所述的方法，所述方法包括向所述个体施用从为或约1x105个NK细胞/kg至为或约1x107个NK细胞/kg。
141.根据权利要求139所述的方法，所述方法包括向所述个体施用从为或约5x107个NK细胞/kg至为或约10x109个NK细胞。
142.根据权利要求139-141中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用另外的药剂以用于治疗所述疾病或病症。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述另外的药剂是抗体或Fc融合蛋白。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述抗体识别与所述癌症相关的肿瘤抗原。
145.根据权利要求143或权利要求144所述的方法，其中所述抗体识别或特异性地结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或肌腱蛋白。
146.根据权利要求143-145中任一项所述的方法，其中所述抗体包含Fc结构域和/或是全长抗体。
147.根据权利要求143-146中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用癌症药物或细胞毒性剂以用于治疗所述疾病或病症。
148.根据权利要求142所述的方法，其中所述另外的药剂是溶瘤病毒。
149.根据权利要求142-148中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症选自炎性病症、感染和癌症。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述疾病或病症是感染，并且所述感染是病毒感染或细菌感染。
151.根据权利要求149所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
152.根据权利要求149所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症包括实体瘤。
153.根据权利要求149或权利要求152所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症选自胃或胃食管连接部的腺癌、膀胱癌、乳腺癌、脑癌、宫颈癌、结直肠癌、内分泌/神经内分泌癌、头颈癌、胃肠道间质癌、骨巨细胞瘤、肾癌、肝癌、肺癌、神经母细胞瘤、卵巢上皮/输卵管/原发性腹膜癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌和软组织癌。
154.根据权利要求139-153中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
155.根据权利要求139-154中任一项所述的方法，其中所述组合物中的NK细胞对于所述个体而言是同种异体的。
156.根据权利要求139-154中任一项所述的方法，其中所述组合物中的NK细胞对于所述受试者而言是自体的。
157.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组包含CD16、CD57、CD7和CD161。
158.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组包含NKG2A和CD161。
159.根据权利要求157或权利要求158所述的试剂盒，其中所述表面标记物组还包含CD3、CD45和CD56。
160.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测表面标记物组的多种试剂，所述表面标记物组包含CD3、CD56和CD38。
161.根据权利要求160所述的试剂盒，其中所述组还包含CD45。
162.根据权利要求157-161中任一项所述的试剂盒，其中所述多种试剂中的每一种是对所述表面标记物组中的一种标记物具有特异性的结合分子。
163.根据权利要求162所述的试剂盒，其中所述结合分子是抗体或抗原结合片段。
164.根据权利要求162或权利要求163所述的试剂盒，其中所述结合分子被可检测地标记。
165.根据权利要求157-164中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于使用所述表面标记物组作为用于检测细胞样品中g-NK细胞数量的替代标记物的说明书。
166.一种使用根据权利要求157-165中任一项所述的试剂盒检测包含天然杀伤(NK)细胞的样品中的g-NK替代表面标记物特征的方法。
167.一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：
(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测包含CD16、CD57、CD7和CD161的表面标记物组的试剂接触；以及
(b)检测所述样品中具有所述表型CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg的细胞的存在或不存在。
168.一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：
(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测包含NKG2A和CD161的表面标记物组的试剂接触；以及
(b)检测所述样品中具有所述表型NKG2Aneg/CD161neg的细胞的存在或不存在。
169.根据权利要求267或权利要求168所述的方法，其中所述表面标记物组还包含CD45、CD3和CD56，并且其中所述表型还包含CD45pos/CD3neg/CD56pos。
170.一种检测样品中g-NK替代表面标记物特征的方法，所述方法包括：
(a)使包含天然杀伤(NK)细胞的样品与用于检测包含CD3、CD56和CD38的表面标记物组的试剂接触；以及
(b)检测所述样品中具有所述表型CD38neg/CD56pos/CD38neg的细胞的存在或不存在。
171.根据权利要求167-170中任一项所述的方法，其中所述多种试剂中的每一种是对所述表面标记物组中的一种标记物具有特异性的结合分子。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述结合分子是抗体或抗原结合片段。
173.根据权利要求171或权利要求172所述的方法，其中所述结合分子被可检测地标记。
174.根据权利要求167-173中任一项所述的方法，其中所述检测是通过流式细胞术进行的。
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