KR20210123289A - 자연 살해 세포 서브세트의 증식을 위한 방법 및 관련 조성물 및 방법 - Google Patents

자연 살해 세포 서브세트의 증식을 위한 방법 및 관련 조성물 및 방법 Download PDF

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오스틴 비글리
로날드 마르텔
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인답타 세라뷰틱스 인코포레이티드
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Abstract

본원에서는 자연 살해 (NK) 세포의 특화된 서브세트의 생체 외 증식 (ex vivo expansion) 방법 및 이러한 NK 세포를 함유하는 조성물이 제공된다. 또한 NK 세포의 특화된 서브세트를 식별하거나 검출하는 방법이 제공된다. 또한 종양 세포 또는 감염된 세포와 같은 질환 관련 세포 또는 조직에 결합할 수 있는 항체와의 병용을 포함하는, 제공된 조성물을 사용하여 암과 같은 질환 및 병태를 치료하는 방법이 제공된다.

Description

자연 살해 세포 서브세트의 증식을 위한 방법 및 관련 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 11월 21일에 출원된 “자연 살해 (NK) 세포 서브세트의 증식을 위한 방법 및 관련 조성물 및 방법"을 발명의 명칭으로 하는 미국 가출원 제62/770,686호로부터 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 포함된다.
서열목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 전자 형식의 서열목록과 함께 제출된다. 서열목록은 크기가 7.8KB 인 2019년 11월 21일에 생성된 776032000540SeqList.txt라는 파일로 제공된다. 전자 형식의 서열목록내 정보는 그 전체가 참조로서 통합된다.
본 개시(disclosure)는 자연 살해 (NK) 세포의 특화된 서브세트(specialized subset)의 생체 외 증식 (ex vivo expansion) 방법 및 이러한 NK 세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 또한 NK 세포의 특화된 서브세트를 식별하거나 검출하는 방법이 제공된다. 또한, 종양 세포 또는 감염된 세포와 같은 질환 관련 세포 또는 조직에 결합할 수 있는 항체와의 병용(combination)을 포함하는, 본 개시의 조성물을 사용하여 암과 같은 질환 및 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
항체 기반 요법은 암 및 기타 질환을 치료하기 위해 빈번하게 사용되고 있다. 항체 요법에 대한 반응은 일반적으로 종양 세포에 대한 이들 항체의 직접적인 억제 효과 (예: 성장 인자 수용체의 억제 및 후속 세포 자멸사 유도)에 초점을 맞추었지만, 이들 항체의 생체 내 효과는 더 복잡할 수 있으며 숙주 면역 체계를 포함할 수 있다. 자연 살해 (Natural killer, NK) 세포는 Fc 수용체 (CD16; Fcγ가 항원 보유 세포에 결합되어 있는 항체의 Fc 부분에 결합할 때 항체 의존성 세포 독성을 매개하는 면역 이펙터 세포(immune effector cell)이다. 이들의 특이적 특화된 서브세트를 포함하여, NK 세포는 항체 요법에 대한 반응 개선을 포함하여 치료 방법에 사용될 수 있다. 그러나 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)과 같은 세포 요법에서 NK 세포의 적용에 대한 주요 장애는 인간 말초 혈액에서 상대적으로 낮은 풍부도(abunndance)와 특정 특화된 서브세트의 표면 표현형 특징이 없다는 것이다. 치료용 NK 세포 조성물을 얻기 위해서는 개선된 방법이 필요하다. 본 출원에서는 그러한 요구를 충족하는 구현예가 제공된다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 분리하는 단계로, 상기 분리하는 단계는 인간 대상체 유래 샘플로부터 (i) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos); (ii) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posCD38neg); (iii) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg), (iv) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (v) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos); 또는 (vi) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)의 선별을 포함하는 것인 단계; 및 (b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포(irradiated 221.AEH feeder cell), 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법이 제공된다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 분리하는 단계로, 상기 분리하는 단계는 인간 대상체 유래 샘플로부터 (i) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg), (ii) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (iii) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos), 또는, (iv) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos)의 선별을 포함하는 것인 단계; 및 (b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포(irradiated 221.AEH feeder cell), 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법이 제공된다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 분리하는 단계로, 상기 분리하는 단계는 인간 대상체 유래 샘플로부터 (i) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos), (ii) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posCD38neg); (iii) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg); (iv) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (v) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos); 또는 (vi) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg); 의 선별을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 농축된 NK 세포 집단을 조사된 221.AEH 영양 세포 및 조사된 말초 혈액 단핵 (PBMC) 영양 세포와 조합하는 단계(combining)로, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 이고 PBMC 영양 세포 대 농축 NK 세포의 비율은 1:1 또는 약 1:1 과 5:1 또는 약 5:1 사이 (포함)인, 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 선택적으로 상기 PBMC 영양 세포는 상기 대상체에 대해 자가(autologous)이다. 상기 방법은 또한 (c) 재조합 IL-2 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 하에 (b)의 집단을 배양하는 단계로, 여기서, 배양 개시 7 일 이내에, 재조합 IL-2를 함유하는 신선한 배지로 세포 배양 배지를 교환하고, 선택적으로 그 후 배양 기간 동안 2 일 또는 3 일마다 세포 배양 배지를 재조합 IL-2를 함유하는 신선한 배지로 추가로 교환하며, 여기서 상기 배양하는 단계는 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 단계; 및 (d) 상기 세포의 증식된 집단을 수집하는 단계;를 포함한다.
제공되는 구현예 중 임의의 것에서, 상기 제공되는 방법은, 상기 NK 세포가 농축된 세포 집단을 분리 또는 선별하기 전에, 인간 대상체 유래 샘플을 수확하는 단계를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 인간 대상체는 CMV 혈청 양성이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 인간 대상체는 CD16 158V+ NK 세포 유전자형을 갖는다. 제공된 방법의 구현예에서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukaphereis) 샘플이다.
제공되는 구현예 중 임의의 것에서, 상기 방법은 대상체 유래 샘플로부터 NK 세포가 풍부한 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리하는 단계는 상기 샘플로부터 NK 세포가 농축된 세포 집단을 선별하는 것에 의한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별에 의한 것이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 분리하는 단계는 (i)이고, 샘플로부터 CD3에 대해 음성이고 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포의 선별을 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 분리하는 단계는 (ii)이고, 샘플로부터 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, 및 CD38에 대해 음성(CD3negCD57posCD28neg) 인 세포의 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리하는 단계는 (iii)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포의 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리하는 단계는 (iv)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성 (CD3negCD56pos)인 세포의 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리하는 단계는 샘플로부터 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD57에 대해 양성 (CD3negCD57pos)인 세포의 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리하는 단계는 (v)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성 (CD3negCD16pos)인 세포의 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리하는 단계는 (vi)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)인 세포의 선별을 포함한다.
상기 임의의 제공되는 방법의 일부의 NK 세포가 농축된 세포 집단의 분리 및 선별에서, 상기 방법은 예를 들어 세포 집단을 증식하기 위해, 예를 들어 세포 배양하는 단계를 수행하기 전, 농축된 NK 세포의 분리된 집단을 동결 보존하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 세포를 배양하는 단계 전, 예를 들어, 상기 세포 집단을 증식하기 위해, 상기 제공된 방법은 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함한다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 수득하는 단계로, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (i) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg), (ii) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (iii) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos), 또는, (iv) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos)로부터 선택되는 표현형을 포함하는 것인 단계; 및 (b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 g-NK 세포가 농축된 NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 NK 세포가 농축된 세포의 집단을 수득하는 단계은 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함한다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 수득하는 단계로, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (i) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos); (ii) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posCD38neg); (iii) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg), (iv) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (v) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos); 또는 (vi) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)로부터 선택되는 표현형을 포함하는 것인 단계; 및 (b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 g-NK 세포가 농축된 NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 NK 세포가 농축된 세포의 집단을 수득하는 단계은 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함한다.
임의의 이러한 구현예의 일부서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (i)이고 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (ii)이고 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성 인 세포(CD3negCD56posCD38neg)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (iii)이고 CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (iv)이고 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (v)이고 CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (vi)이고 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)를 포함한다.
임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos)를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos)를 포함한다.
본원에서는 인간 대상체 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1 차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는 FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포를 포함하고, 상기 배양하는 단계는 (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 수행되고, 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법을 제공한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD57에 대해 양성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및 (2) 첫 번째 선별된 집단 세포로부터 (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD57에 대해 양성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성이고 CD57에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) 첫 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; 및 (2) 첫 번째 선별된 집단 세포로부터 CD57에 대해 양성인 세포를 선별하여 CD4에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로, 인간 대상체의 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포를 포함하고, 여기서 상기 배양하는 단계는 (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 수행되고, 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는, 방법이 제공된다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) CD3에 대해 음성인 세포를 샘플로부터 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; (2) 첫 번째 선별된 집단으로부터 (a) CD56에 대해 양성인 세포 또는 (b) CD38에 대해 음성인 세포를 선별하여 두 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및 (3) 두 번째 선별된 집단으로부터 (a) CD56에 대해 양성인 세포 또는 (b) CD38에 대해 음성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) 첫 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 CD3에 대해 음성인 세포를 샘플로부터 선별하는 단계; (2) 두 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 대해 양성인 세포를 선별하는 단계; 및 (3) 두 번째 선별된 집단으로부터 CD38에 대해 음성인 세포를 선별하여 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서, 인간 대상체의 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1 차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 포함화고, 상기 배양하는 단계는 (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 수행되고, 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법이 제공된다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포의 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD16에 대해 양성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및 (2) 상기 첫 번째 농축된 선별된 세포로부터 (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD16에 대해 양성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포의 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) 첫 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; 및 (2) 상기 첫 번째 농축된 선별된 세포로부터 CD16에 대해 양성인 세포를 선별하여, CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함한다.
본원에서는 FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서, 상기 방법은 인간 대상체의 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 포함하고, 상기 배양하는 단계는 (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 수행되고, 여기서 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인 방법을 제공한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) 첫 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; (2) 두 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 대해 양성인 세포를 선별하는 단계; (3) 두 번째 선별된 집단으로부터 (a) NKG2A에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD161에 대해 음성인 세포를 선별하여, 세 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및 (4) 세 번째 선별된 집단으로부터 (a) NKG2A에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD161에 대해 음성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) 첫 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; (2) 두 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 대해 양성인 세포를 선별하는 단계; (3) 세 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 두 번째 선별된 집단으로부터 NKG2A에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; 및 (4) 세 번째 선별된 집단으로부터 CD161에 대해 음성인 세포를 선별하여, CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함한다.
상기 구현예의 임의의 일부에 있어서, 상기 방법은, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는 (1) 첫 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; (2) 두 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 대해 양성인 세포를 선별하는 단계; (3) 세 번째 선별된 집단을 생산하기 위하여 두 번째 선별된 집단으로부터 CD161에 대해 음성인 세포를 선별하는 단계; 및 (4) 세 번째 선별된 집단으로부터 NKG2A에 대해 음성인 세포를 선별하여, CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 상기 배양 전, 인간 대상체 유래 샘플을 수확하는 단계를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 인간 대상체는 CMV 혈청 양성이다. 일부 구현예에서, 상기 인간 대상체는 CD16 158V+ NK 세포 유전자형을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포는 대상체 유래 샘플로부터 이전에 분리되어 동결 보존된 샘플로부터 유래된 것이다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양은 (iii) 1 차 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 영양 세포의 존재 하에 추가로 수행되고, 여기서 상기 PBMC 영양 세포는 조사된(irradiated) 것이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기배양은 상기 농축된 NK 세포 집단을 조사된 221.AEH 영양 세포 및 조사된 PBMC 영양 세포와 조합한 후에 수행된다. 일부 이러한 구현예에서, 상기 PBMC 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비는 1:1 또는 약 1:1 내지 5:1 또는 약 5:1 (포함)이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 PBMC 영양 세포는 대상체에 대해 자가(autologuous)이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양의 적어도 일부는 상기 PBMC 영양 세포의 하나 이상의 T 세포의 활성화를 자극할 수 있는 적어도 하나의 자극제(stimulatory agent)의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 TCR 복합체의 일 멤버(member)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 상기 자극제는 CD3, 선택적으로 CD3 엡실론(CD3epsilon)에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 10ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL 이다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 배양 개시 시 또는 조사된 PBMC 영양 세포와 동시에 또는 거의 동시에 첨가된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 PBMC 영양 세포가 활성화된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율은 1:1 또는 약 1:1 이상이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율은 1:1 내지 5:1 (포함)이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:1 내지 3:1 (포함)이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 2.5:1 또는 약 2.5:1 이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:1 또는 약 1:1 이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 5:1 또는 약 5:1 이다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 NK 세포는 신선하게 분리되거나 이전에 동결 및 해동되지 않은 것이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 NK 세포는 동결 후 해동된 것이다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2의 농도는 10 IU/mL 또는 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL 이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2의 농도는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 재조합 IL-2이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 재조합 IL-2는 배양 개시 시점 또는 그 근처에 첨가된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 배양 동안 배양 배지를 1회 이상 교환하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 배양 개시 후 3 또는 약 3일 내지 7 일 또는 약 7 일 내에, 선택적으로 배양 개시 후 5일 또는 약 5 일에 시작하여 수행된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 남은 배양 기간 동안 2 일 또는 3 일마다 수행된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 배양 배지로부터 상기 적어도 하나의 자극제를 감소시키거나 제거한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 상기 배양 배지의 각각의 교환에서 재조합 IL-2를 함유하는 신선한 배지가 배양물에 첨가되는 단계를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 재조합 IL-2는 10 IU/mL 또는 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL (포함)의 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 IL-2는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 재조합 IL-2의 농도로 첨가된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 0.2 x 106 농축된 NK 세포 또는 약 0.2 x 106 농축된 NK 세포, 적어도 1.0 x 106 농축된 NK 세포 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포, 또는 10 x 106 농축된 NK 세포 또는 약 10 x 106 농축된 NK 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포의 집단은 0.2 x 106 농축 NK 세포/mL 또는 약 0.2 x 106 농축 NK 세포/mL 농도를 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양은 상기 방법이 적어도 2.50 x 108 또는 적어도 약 2.50 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양은 상기 방법이 적어도 5.00 x 108 또는 적어도 약 5.0 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양은 상기 방법이 적어도 1.0 x 109 또는 적어도 약 1.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양은 적어도 5.0 x 109 또는 적어도 약 5.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 배양은 5일 또는 약 5일 또는 적어도 5일 또는 적어도 약 5일, 6일 또는 약 6일 또는 적어도 6일 또는 적어도 약 6일, 7일 또는 약 7일 또는 적어도 7일 또는 적어도 약 7일, 8일 또는 약 8일 또는 적어도 8일 또는 적어도 약 8일, 9일 또는 약 9일 또는 적어도 9일 또는 적어도 약 9일, 10일 또는 약 10일 또는 적어도 10일 또는 적어도 약 10일, 11일 또는 약 11일 또는 적어도 11일 또는 적어도 약 11일, 12일 또는 약 12일 또는 적어도 12일 또는 적어도 약 12일, 13일 또는 약 13일 또는 적어도 13일 또는 적어도 약 13일, 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일, 15일 또는 약 15일 또는 적어도 15일 또는 적어도 약 15일, 16일 또는 약 16일 또는 적어도 16일 또는 적어도 약 16일, 17일 또는 약 17일 또는 적어도 17일 또는 적어도 약 17일, 18일 또는 약 18일 또는 적어도 18일 또는 적어도 약 18일, 19일 또는 약 19일 또는 적어도 19일 또는 적어도 약 19일, 20일 또는 약 20일 또는 적어도 29일 또는 적어도 약 20일, 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일, 22일 또는 약 22일 또는 적어도 22일 또는 적어도 약 22일, 23일 또는 약 23일 또는 적어도 23일 또는 적어도 약 23일, 24일 또는 약 24일 또는 적어도 24일 또는 적어도 약 24일, 또는 25일 또는 약 25일 또는 적어도 25일 또는 적어도 약 25일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 증가된 수의 g-NK 세포를 생산한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 증가는 100 배 이상 또는 약 100 배 이상, 200 배 이상 또는 약 200 배 이상, 300 배 이상 또는 약 300 배 이상, 400 배 이상 또는 약 400 배 이상, 500 배 이상 또는 약 500 배 이상, 600 배 이상 또는 약 600 배 이상, 700 배 이상 또는 약 700 배 이상 또는 800 배 이상 또는 약 800 배 이상이다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 증가는 1000 배 이상 또는 약 1000 배 이상이다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 증가는 2000 배 이상 또는 약 2000 배 이상이다. 임의의 구현예의 일부에서, 상기 증가는 2500 배 이상 또는 약 2500 배 이상이다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 본원에서 제공되는 방법에 의해 생산되는 g-NK 세포의 증식된 집단은 배양 후 수집(collect)된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg이다. 일부 이러한 구현예에서, 상기 g-NK 세포는 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg//CD45pos/CD3neg/CD56pos표현형을 갖는다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 가지는 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg 이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD38neg 이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos 를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD38neg를 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은, 상기 배양 후, 상기 세포의 증식된 집단으로부터 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포 집단을 정제하거나 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg 이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos을 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 약제학상 허용되는 부형제(pharmaceutically acceptable excipient)에서 g-NK 세포 증식된 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 동결 보호제(cryoprotectant)의 존재 하에서 상기 세포를 동결 보존하는 단계 및/또는 상기 세포를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서는 또한 상기 제공되는 임의의 방법에 의해 생산된 g-NK 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 108 또는 약 108 g-NK 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물 중의 g-NK 세포의 수는 108 또는 약 108 내지 1012 또는 약 1012 세포, 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포, 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 세포, 109 또는 약 109 내지 1012 또는 약 1012 세포, 109 또는 약 109 내지 1011 또는 약 1011 세포, 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포, 1010 또는 약 1010 내지 1012 또는 약 1012 세포, 1010 또는 약 1010 내지 1011 또는 약 1011 세포, 또는 1011 또는 약 1011 내지 1012 또는 약 1012 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 가지는 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은NKG2Aneg/CD161neg 이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포 또는 g-NK 대리 마커 프로파일을 가지는 세포는 추가로 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD38neg 이다.
본원에서는 또한 상기 제공되는 임의의 방법에 의해 생산된 g-NK 세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 106 는 적어도 약 106 개의 g-NK 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 g-NK 세포, 106 또는 약 106 내지 109 또는 약 109 g-NK 세포, 106 또는 약 106 내지 108 또는 약 108 g-NK 세포, 106 또는 약 106 내지 107 또는 약 107 g-NK 세포, 107 또는 약 107 내지 1010 또는 약 1010 g-NK 세포, 107 또는 약 107 내지 109 또는 약 109 g-NK 세포, 107 또는 약 107 내지 108 또는 약 108 g-NK 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 g-NK 세포, 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 g-NK 세포, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 g-NK 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg 이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 가지는 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 g-NK 세포 또는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 가지는 세포는 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos 을 추가로 포함한다.
본원에서는 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물이 제공된다. 본원에서는 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 및 NKG2Aneg/CD161neg로부터 선택되는 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 80% 또는 적어도 약 80%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다.
본원에서는 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물이 제공된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서세포의 적어도 80% 또는 적어도 약 80%가 NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서세포의 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다.
본원에서는 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물이 제공된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 80% 또는 적어도 약 80%가 CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 90% 또는 적어도 약 90%가 CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 및 NKG2Aneg/CD161neg 로부터 선택되는 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 및 NKG2Aneg/CD161neg 로부터 선택되는 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일을 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 세포 중 70% 이상이 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%가 FcRγneg이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 적어도 108 또는 적어도 약 108 개의 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 적어도 106 또는 적어도 약 106 개의 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 108 또는 약 108 내지 1012 또는 약 1012 세포, 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포, 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 세포, 109 또는 약 109 내지 1012 또는 약 1012 세포, 109 또는 약 109 내지 1011 또는 약 1011 세포, 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포, 1010 또는 약 1010 내지 1012 또는 약 1012 세포, 1010 또는 약 1010 내지 1011 또는 약 1011 세포, 또는 1011 또는 약 1011 내지 1012 또는 약 1012 세포를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 세포, 106 또는 약 106 내지 109 또는 약 109 세포, 106 또는 약 106 내지 108 또는 약 108 세포, 106 또는 약 106 내지 107 또는 약 107 세포, 107 또는 약 107 내지 1010 또는 약 1010 세포, 107 또는 약 107 내지 109 또는 약 109 세포, 107 또는 약 107 내지 108 또는 약 108 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포, 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 세포, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포인를 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물 중의 세포는 동일한 샘플로부터 증식된 단일 공여자 대상체로부터 유래된 것이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 약제학상 허용되는 부형제를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 동결 보호제를 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물은 멸균되어 있다.
본원에서는 상기 제공되는 임의의 조성물 및 질환의 치료를 위한 추가 작용제를 포함하는 키트가 제공된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 키트는 상기 조성물 및 질환 또는 병태를 치료하기 위한 추가 작용제를 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
본원에서는 상기 제공되는 임의의 조성물 및 질환 치료를 위한 추가 작용제와의 병용 요법으로 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 추가 작용제는 항체 또는 Fc-융합 단백질이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 항체는 종양 관련 항원을 인식하거나 특이적으로 결합한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린(mesothelin), α-태아단백질(α-fetoprotein), 뮤신(Mucin), PDGFR-alpha, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린(Integrin) αVβ인테그린(integrin) α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-alpha, 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 신데칸(Syndecan) 1, SLAMF7 (CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 인식하거나 결합한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 항체는 전장 항체이고/이거나 Fc 도메인을 포함한다.
임의의 상기 제공되는 방법의 일부에서, 상기 추가 작용제는 세포 독성제 또는 암 치료제이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 추가 작용제는 종양 용해성 바이러스이다.
본원에서는 상기 제공되는 임의의 구현예의 키트를 포함하는 제조 물품(article of manufacture)이 제공된다.
본원에서는 이를 필요로하는 개체(individual)에게 상기 제공되는 임의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 병태의 치료방법이 제공된다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 방법은 상기 개체에게 1 x 105 NK 세포/kg 또는 약 1 x 105 NK 세포/kg 내지 1 x 107 NK 세포/kg 또는 약 1 x 107 NK 세포/kg를 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 방법은 5 x 107 NK 세포 또는 약 5 x 107 NK 세포 내지 10 x 109 NK 세포 또는 약 10 x 109 NK 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 방법은 1 x 108 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010 세포/m2를 개체에게 투여하는 단계 또는 1 x 106 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010 NK 세포/kg를 투여하는 단계를 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 상기 질환 또는 병태를 치료하기 위하여 상기 개체에게 추가 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 추가 작용제는 항체 또는 Fc-융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 항체는 암 관련 종양 항원(tumor antigen associated with the cancer)을 인식한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린(mesothelin), α-태아단백질(α-fetoprotein), 뮤신(Mucin), PDGFR-alpha, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린(Integrin) αVβ인테그린(integrin) α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-alpha, 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 신데칸(Syndecan) 1, SLAMF7 (CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 인식하거나 특이적으로 결합한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함하거나/하고 전장항체이다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 방법은 질환 또는 병태를 치료하기 위하여 암 치료제(cancer drug) 또는 세포독성제(cytotoxic agent)를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 제공되는 임의의 방법의 일부에서, 상기 추가 작용제는 종양 용해성 바이러스이다.
상기 제공되는 임의의 방법의 일부에서, 상기 추가 작용제 및 상기 조성물은 순차적으로(sequentially) 투여된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 추가 작용제는 상기 조성물의 투여에 선행하여 투여된다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 추가 작용제와 상기 조성물은 동시에 투여된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 염증 병태, 감염 및 암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 감염이고, 상기 감염은 바이러스 감염 또는 박테리아 감염이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 백혈병, 림프종 또는 골수종이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 고형 종양을 포함한다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 감염이고, 상기 감염은 바이러스 감염 또는 박테리아 감염이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 백혈병, 림프종 또는 골수종이다. 임의의 이러한 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 고형 종양을 포함한다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 질환 또는 병태는 암이고 상기 암은 위 또는 위식도 접합부의 선암(adenocarcinoma of the stomach or gastroesophageal junction), 방광암, 유방암, 뇌암, 자궁 경부암, 결장암(colorectal cancer), 내분비/신경내분비 암(endocrine/neuroendocrine cancer), 두경부암, 위장기질암(gastrointestinal stromal cancer), 골의 거대 세포 종양(giant cell tumor of the bone), 신장암, 간암, 폐암, 신경모세포종(neuroblastoma), 난소상피/나팔관/원발성 복막암(ovarian epithelial/fallopian tube/primary peritoneal cancer), 췌장암, 전립선 암, 피부암 및 연조직 암종(soft tissue carcinoma) 중에서 선택된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 개체는 인간이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물 내의 NK 세포는 상기 개체에 대해 동종(allogenic)이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 조성물 내의 NK 세포는 상기 대상체에 대해 자가(autologous)이다.
본원에서는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로, 상기 표면 마커 패널은 CD16, CD57, CD7 및 CD161 또는 NKG2A 및 CD161에서 선택되는 것인 키트가 제공된다.
본원에서는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로, 상기 표면 마커 패널은 NKG2A 및 CD161를 포함하는 키트가 제공된다.
본원에서는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로, 상기 표면 마커 패널은 CD3, CD56 및 CD38을 포함하는 키트가 제공된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 표면 마커 패널은 CD3, CD45 및 CD56을 추가로 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 패널은 CD45를 추가로 포함한다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 복수의 시약 각각은 표면 마커 패널의 하나의 마커에 특이적인 결합 분자이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 분자는 검출 가능하도록 표지되어 있다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 키트는 세포 샘플에서 g-NK 세포의 수를 검출하기 위한 대리 마커로서 표면 마커 패널의 사용을 위한 설명서를 추가로 포함한다.
본원에서는 상기 제공되는 임의의 키트를 사용하여 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법이 제공된다.
본원에서는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일(surrogate surface marker profile)을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 CD16, CD57, CD7 및 CD161을 포함하는 표면 마커 패널(a panel of surface markers)을 검출하기 위한 시약(reagents)과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본원에서는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일(surrogate surface marker profile)을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 CD16, CD57, CD7 및 CD161 또는 NKG2A 및 CD161로부터 선택되는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 또는 NKG2Aneg/CD161neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 본원에서는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 NKG2A 및 CD161을 포함하는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 표현형 NKG2Aneg/CD161neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
임의의 이러한 구현예의 일부에 있어서, 상기 표면 마커 패널은 CD45, CD3 및 CD56을 추가로 포함하고, 상기 표현형은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다.
본원에서는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 CD3, CD56 및 CD38을 포함하는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 표현형 phenotype CD38pos CD56pos /CD38neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 복수의 시약 각각은 상기 표면 마커 패널의 하나의 마커에 특이적인 결합 분자이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 결합 분자는 검출 가능하도록 표지되어 있다. 상기 제공되는 임의의 구현예의 일부에서, 상기 검출은 유세포 분석에 의한다.
도 1은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 또는 CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg의 대리 세포외 표면 표현형을 가지는 세포 서브세트 내의 g-NK (CD45pos/CD3neg/CD56pos/ FcRγneg)의 백분율을 도시한다. 값은 평균 ± 표준오차이다.
도 2a는 실시예 2에 기술된 바와 같이 CD3 고갈(depletion)에 이어 CD57 농축을 포함하는 예시적인 증식 프로토콜의 흐름도를 도시한다. 이 도식에서, 조사된 PBMC가 또한 증식 단계 동안 조사된 221.AEH 세포에 추가하여 영양 세포로 포함될 수 있다.
도 2b 및 도 2c는 CMV+ 공여자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리된 농축된 NK 세포로부터의 g-NK의 증식을 도시한다. 제시된 모든 결과는 CD3 고갈에 의해 농축된 해동 된 NK 세포에서 21 일 증식을 수행한 것을 제외하고는 다양한 방법으로 농축된 신선한 NK 세포로부터 14 일 동안 증식한 결과이다. 도 2b는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다양한 방법에 의한 증식 후 g-NK 세포의 총 수를 도시한다. 도 2c는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다양한 방법에 의한 증식 전후의 g-NK 세포의 백분율을 도시한다. 값은 평균 ± 표준오차이다.
도 2d 및 2e는 CMV+ 공여자로부터 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리된 농축 NK 세포로부터 g-NK의 증식을 도시한다. 제시된 모든 결과는 다양한 방법으로 농축 된 신선한 NK 세포 또는 CD3 고갈로 농축된 해동된 NK 세포의 14 일 증식에서 얻은 결과이다. 도 2d는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다양한 방법에 의한 증식 후 g-NK 세포의 총 수를 도시한다. 도 2e는 실시예 2에 기술된 바와 같은 다양한 방법에 의한 증식 전후의 g-NK 세포의 백분율을 도시한다. 값은 평균 ± 표준오차이다.
도 3은 CD3negCD57pos NK-세포의 농축을 포함하는 실시예 2에 기술된 방법 EH는 대체방법에 의해 증식된 NK 세포의 221.AEH 및 K562 세포주 (n = 8)에 대한 NK- 세포의 세포 독성 활성 (5:1의 NK-세포 대 표적 비율)을 도시한다. 값은 평균 ± 표준오차이다.
도 4a 및 4b는 림프종 세포주 RAJI에 대한 항-CD20 항체(리툭시맙(Rituximab))와 병용되는 기존 NK 세포와 비교한 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 4a는 낮은 g-NK 비율을 가지는 공여자 (n = 4)에 비해 높은 g-NK를 가지는 공여자에서 농축된 CD3negCD57pos 세포로 시작하는 과정에 의해 증식된 g-NK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 4b는 동일한 공여자로부터 농축된 신선하거나 이전에 동결(및 해동)된 NK 세포로부터 증식된 g-NK 세포, 기존 NK 세포 (cNK) 및 NKG2Cpos (적응) NK-세포의 ADCC (1:1의 NK-세포 대 표적 비율) 활성을 보여준다 (n = 4). 값은 평균 ± 표준오차이다.
도 5a 및 5b는 기존 (cNK) NK 세포와 비교한 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 5a는 유방암 세포주 SKBR3에 대한 항-HER2(트라스투주맙(Trastuzumab)와 병용된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 5b는 두경부암 세포주 CAL27에 대한 항-EGFR(세툭시맙(Cetuximab))과 병용된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 값은 평균 ± SE이다.
도 6a-6c는 기존 NK 세포 (cNK)와 비교한 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 6a는 결장암 세포주 HT29에 대한 항-EGFR(세툭시맙)과 병용된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 6b는 결장암 세포주 SW480에 대한 항-EGFR(세툭시맙)과 병용된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 6c는 폐암 세포주 A549에 대한 항-EGFR(세툭시맙)과 병용된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 값은 평균 ± SE이다.
도 7a-7c는 1 x 107 g-NK 또는 cNK 세포의 주입 후 NSG 마우스에서 g-NK (신선 또는 동결) 및 cNK (동결)의 지속성을 도시한다. 도 7a는 주입 후 5, 8, 14, 15 및 22 일에 NSG 마우스의 전혈에 존재하는 인간 NK-세포의 수를 보여준다. 도 7b는 NK-세포 주입 22 일 후 NSG 마우스의 비장에 존재하는 인간 NK-세포의 수를 보여준다. 도 7c는 NK-세포 주입 22 일 후 NSG 마우스의 골수에 존재하는 인간 NK-세포의 수를 보여준다. 3 개의 특정 처리군(arm) 모두에 대해 N = 3. 값은 평균 ± SE이다.
도 8a 및 8b는 림프종의 이종 이식 모델에서 종양 크기(tumor burden) 및 생존에 대한 g-NK 및 리툭시맙의 효과를 도시한다. 도 8a는 리툭시맙 단독 처리 또는 미처리 마우스와 비교하여 NSG 마우스에서 생물 발광 (BLI)에 의해 측정된 Raji 종양 크기에 대한 g-NK 및 리툭시맙 (리툭시맙 + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 값은 평균 ± SE이다. 도 8b는 리툭시맙 단독 처리 또는 미처리 마우스와 비교하여 Raji-접종된 NSG 마우스에서의 생존에 대한 g-NK 및 리툭시맙 (리툭시맙 + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 모든 처리군(arm)에 대해 N = 8.
도 9a 및 9b는 기존 NK 세포 (cNK)와 비교한 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 9a는 다발성 골수종 세포주 MM.1S (n = 16)에 대한 항-CD38(다라투무맙(daratumumab; Dara)) 또는 항-SLAMF7 (엘로투주맙(elotuzumab; Elo))과 병용된 신선하게 분리된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 9b는 다발성 골수종 세포주 MM.1S (n = 5)에 대한 항-CD38 (다라투무맙(daratumumab; Dara)) 또는 항-SLAMF7 (엘로투주맙(elotuzumab); Elo)과 병용된 증식된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 값은 평균 ± SE이다.
도 10a 및 10b는 각각의 다발성 골수종의 이종 이식 모델에서 다라투무맙 (Dara) 및 엘로토주맙 (Elo) 생체 내 효능에 대한 g-NK의 효과를 도시한다. 도 10a는 미처리 마우스 또는 cNK 및 다라투무맙 (Dara + cNK)으로 처리된 마우스, Dara 단독, 운반체(vehicle) 또는 g-NK 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 NSG 마우스에서 MM.1S 종양 크기 (BLI)에 대한 g-NK 및 다라투무맙 (Dara + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 도 10b는 미처리 마우스 또는 cNK 및 엘로투주맙 (Elo + cNK), Elo 단독, 운반체(vehicle) 또는 g-NK 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 NSG 마우스에서 MM.1S 종양 크기 (BLI)에 대한 g-NK 및 엘로투주맙 (Elo + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 모든 처리군에 대해 N = 6. 값은 평균 ± SE이다.
도 11a 및 11b는 다라투무맙 (Dara) 또는 엘로투주맙 (Elo)으로 처리된 MM.1S-접종 NSG 마우스의 생존에 대한 g-NK의 효과를 도시한다. 도 11a는 미처리 마우스 또는 cNK 및 다라투무맙 (Dara + cNK), Dara 단독, 운반체, 또는 g-NK 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 MM.1S 접종된 NSG 마우스에서 생존에 대한 g-NK 및 다라투무맙 (Dara + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 도 11b는 미처리 마우스 또는 cNK 및 엘로투주맙 (Elo + cNK), Elo 단독, 운반체 또는 g-NK 단독으로 처리된 마우스와 비교하여 MM.1S 접종된 NSG 마우스에서의 생존에 대한 g-NK 및 엘로투주맙 (Elo + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 모든 처리군에 대해 N = 6.
도 12a-12c는 다발성 골수종의 이종 이식 모델에서 다라투무맙 (Dara) 또는 엘로투주맙 (elo)과 병용될 때 g-NK 및 cNK의 골수 및 비장으로의 귀소(homing) 및 지속성(persistenc)을 도시한다. 도 12a는 다라투무맙 또는 엘로투주맙으로 처리 된 MM.1S-접종 NSG 마우스의 비장에서 g-NK 및 cNK의 수를 보여준다. 도 12b는 다라투무맙 또는 엘로투주맙으로 처리된 MM.1S-접종 NSG 마우스의 골수에서 g-NK 및 cNK의 수를 보여준다. 도 12c는 다라투무맙 또는 엘로투주맙으로 처리된 MM.1S-접종 NSG 마우스의 혈액 내 g-NK 및 cNK의 수를 보여준다. 모든 처리군에 대해 N = 6. 값은 평균 ± SE이다.
도 13a-13d는 g-NK 및 cNK에서 CD20 (리툭시맙의 표적), CD38 (다라투무맙의 표적) 및 SLAMF7 (엘로투주맙의 표적)의 발현을 도시한다. 도 13a는 증식된 g-NK 세포, 증식되지 않은 NK-세포 (CD3-/CD56+) 및 CD20을 발현하는 MM.1S 세포의 백분율을 보여준다. 도 13b는 증식된 g-NK 세포, 증식되지 않은 NK-세포 (CD3-/CD56+) 및 CD38을 발현하는 MM.1S 세포의 백분율을 보여준다. 도 13c는 증식된 g-NK 세포, 증식되지 않은 NK 세포 (CD3-/CD56+) 및 SLAMF7을 발현하는 MM.1S 세포의 백분율을 보여준다. 도 13d는 증식 전후의 CD38을 발현하는 cNK 및 g-NK의 백분율을 보여준다. 모든 처리군에 대해 N = 3. 값은 평균 ± SE이다.
도 14a-14c는 기존 NK 세포 (cNK)와 비교하여 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 14a는 난소암 세포주 SKOV3 (n = 16)에 대한 항-Her2 (트라스투주맙(trastuzumab); Tras)와 병용된 신선하게 분리된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 14b는 난소암 세포주 SKOV3 (n = 5)에 대한 항-Her2 (트라스투주맙; Tras)와 병용된 증식된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 14c는 난소암 세포주 SKOV3 (n = 4)에 대한 항-EGFR (세툭시맙)과 병용된 증식된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 값은 평균 ± SE이다.
도 15a-15c는 난소암의 이종 이식 모델에서 트라스투주맙 (Tras)의 생체 내 효능에 대한 g-NK의 효과를 도시한다. 도 15a는 트라스투주맙 단독으로 처리된 마우스 (Tras 단독)와 비교하여 NSG 마우스에서 SKOV3 종양 크기에 대한 g-NK 및 트라스투주맙 (Tras + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 도 15b는 cNK 및 트라스투주맙 (Tras + cNK)으로 처리된 마우스와 비교하여 SKOV3 접종된 NSG 마우스에서 생존에 대한 g-NK 및 트라스투주맙 (Tras + g-NK) 처리의 효과를 보여준다. 모든 처리군에 대해 N = 10. 도 15c는 cNK 및 트라스투주맙 (Tras + cNK), Tras 단독 또는 운반체로 처리된 마우스와 비굣하여 SKOV3 접종된 NSG 마우스에서 생존에 대한 g-NK 및 트라 스투주맙 (Tras + g-NK) 처리의 효과를 보여준다.
도 16a-16c는 난소암의 이종 이식 모델에서 트라스투주맙과 병용될 때 g-NK 및 cNK의 지속성을 도시한다. 도 16a는 트라스투주맙으로 처리된 SKOV3- 접종 NSG 마우스의 혈액에서 g-NK 및 cNK의 수를 보여준다. 도 16b는 트라스투주맙으로 처리 된 SKOV3-접종 NSG 마우스의 비장에서 g-NK 및 cNK의 수를 보여준다. 도 16c는 트라스투주맙으로 처리된 SKOV3-접종 NSG 마우스의 골수에서 g-NK 및 cNK의 수를 보여준다. 모든 처리군에 대해 N = 6. 값은 평균 ± SE이다.
도 17a 및 17b는 기존 NK 세포 (cNK)와 비교한 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 17a는 다발성 골수종 세포주 ARH-77 (n = 4)에 대한 항-CD38 (다라투 무맙; Dara)과 병용된 증식된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 17b는 다발성 골수종 세포주 MM.1R (n = 4)에 대한 항-CD38 (다라투무맙; Dara)과 병용된 증식된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 값은 평균 ± SE이다.
도 18a 및 18b는 기존 NK 세포 (cNK)와 비교한 g-NK 세포의 ADCC 활성을 도시한다. 도 18a는 결장암 세포주 SW-480 (n = 16)에 대한 항-EGFR (세툭시맙; Cet)과 병용된 신선하게 분리된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 도 18b는 결장암 세포주 SW-480 (n = 5)에 대한 항-EGFR (세툭시맙)과 병용된 증식된 g-NK 및 cNK 세포의 ADCC 활성을 보여준다. 값은 평균 ± SE이다.
도 19는 NK (n = 4), g-NK (n = 7) 및 CD16 158V g-NK 세포 (n = 5) 사이의 W-480 (세툭시맙, Cet 사용), SKOV3 (트라스투주맙, Tras 또는 세툭시맙, Cet 사용) 및 MM.1S 세포 (다라투무맙, Dara 또는 엘로투주맙, Elo 사용)에 대한 ADCC를 비교한 것이다. 값은 평균 ± SE이다.
도 20a-20d는 다발성 골수종 및 고형 종양 세포주에 대해 CD16 유전자의 g-NK 세포 발현 및 ADCC 사이의 관계를 도시한다. 도 20a는 MM.1S 세포 (다라투무맙, Dara 사용)에 대한 g-NK CD16 발현과 ADCC 사이의 양의 상관 관계를 보여준다. 도 20b는 MM.1S 세포 (엘로투주맙, Elo 사용)에 대한 g-NK CD16 발현과 ADCC 사이의 양의 상관 관계를 보여준다. 도 20c는 난소암 SKOV3 (트라스투주맙, Tras 사용)에 대한 g-NK CD16 발현과 ADCC 사이의 양의 상관 관계를 보여준다. 도 20d는 결장암 SW-480 세포 (세툭시맙, Cet 사용)에 대한 g-NK CD16 발현과 ADCC 사이의 양의 상관 관계를 보여준다
본원에서는 FceRIγ(FcRγ사슬이 없거나 결핍된 자연 살해 (NK) 세포의 특화된 서브세트(g-NK 세포로 지칭됨)를 포함하여, NKG2C에 대해 양성(NKG2Cpos)인 NK 세포의 생체 외 증식(expansion)을 위한 방법이 제공된다. 또한 대리 표면 마커 프로파일에 기초하여 세포의 g-NK 서브세트를 검출하기 위한 키트 및 방법이 본원에서 제공된다. 따라서, 본 개시에서 g-NK 세포에 대한 참조(reference)는 일부 경우에 FcRγ사슬이 결핍된 NK 세포 또는 이러한 세포의 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포를 포함할 수 있다.
자연 살해 (NK) 세포는 사이토카인 및 케모카인 분비 및 세포 독성 과립의 방출을 통해 항 바이러스 및 항암 면역을 매개하는 데 중요한 선천성 림프구이다(Vivier et al. Science 331(6013):44-49 (2011); Caligiuri, Blood 112(3):461-469 (2008); Roda et al., Cancer Res. 66(1):517-526 (2006)). NK 세포는 림프구 중 세 번째로 큰 집단을 구성하는 이펙터 세포이며 종양 및 병원체에 감염된 세포에 대한 숙주 면역 감시에 중요(host immuno-surveillance)하다. 그러나 T 및 B 림프구와 달리 NK 세포는 생식 계열 인코딩된 활성화 수용체를 사용한 표적 인식 능력이 제한적이라고 생각된다 (Bottino et al., Curr Top Microbiol Immunol. 298:175-182 (2006); Stewart et al., Curr Top Microbiol Immunol. 298:1-21 (2006)).
NK 세포의 활성화는 직접적인 종양 세포 사멸에서 볼 수 있듯이 NK 세포 수용체가 표적 세포의 리간드에 직접 결합함으로써, 또는 항원 보유 세포에 결합된 항체의 Fc 부분에 결합하여 Fc 수용체 (CD16; CD16a 또는 Fcγ라고도 함)의 가교를 통해 발생할 수 있다. 활성화 되면, NK 세포는 사이토카인과 케모카인을 풍부하게 생산하고 동시에 강력한 세포 용해 활성을 나타낸다. NK 세포는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 통해 종양 세포를 죽일 수 있다. 일부 경우에, ADCC는 NK 세포 표면의 수용체(예: CD16)가 세포 표면에 결합된 IgG1 또는 IgG3 항체를 인식할 때 촉발된다. 이것은 퍼포린(perforin)과 그랜자임(granzyme)을 포함하는 세포질 과립의 방출을 유발하여 표적 세포 사멸을 유도한다. NK 세포는 IgG 코팅된 표적 세포를 인식하는 활성화 Fc 수용체 CD16을 발현하기 때문에 표적 인식이 넓어진다 (Ravetch & Bolland, Annu Rev Immunol. 19:275-290 (2001); Lanier Nat. Immunol. 9(5):495-502 (2008); Bryceson & Long, Curr Opin Immunol. 20(3):344-352 (2008)). ADCC 및 항체 의존성 사이토카인/케모카인 생산은 주로 NK 세포에 의해 매개된다.
항체 의존적 반응 (예를 들어, NK 세포 매개 ADCC)에 관여하는 NK 세포에서 발현되는 CD16에 더하여, CD16은 또한 글리코실포스파티딜이노시톨 고정 형태 (Fcγ또는 CD16B로도 알려짐)로 존재한다. 본원에서 CD16에 대한 참조는 NK 세포에서 발현되는 CD16a 형태를 참조하는 것이며 글리코실포스파티딜이노시톨-고정 된 형태를 의미하지 않는 것으로 이해된다. CD16 수용체는 TCR-CD3 복합체의 ζ사슬 (CD3ζ및/또는 FcRγ사슬인 어댑터와 결합하여 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM)를 통해 신호를 전달할 수 있다. 일부 측면에서, CD16 결합 (CD16 가교)은 CD16 관련 어댑터 사슬인 FcRγ또는 CD3ζ중 하나 또는 둘 모두를 통해 생성되는 세포 내 신호를 통해 NK 세포 반응을 개시한다. CD16의 트리거링은 γ또는 ζ사슬의 인산화로 이어지며, 이는 차례로 티로신 키나제, syk 및 ZAP-70을 동원하여(recruiting) 신호 전달의 캐스캐이드를 시작하여 빠르고 강력한 이펙터 기능을 유도한다. 가장 잘 알려진 이펙터 기능은 항체 의존성 세포 독성 과정을 통해 근처의 표적 세포를 죽이기 위해 독성 단백질을 운반하는 세포질 과립의 방출이다. CD16 가교는 또한 일련의 면역 반응을 활성화하고 조율하는 사이토카인과 케모카인의 생산을 일으킨다.
이러한 사이토카인 및 케모카인의 방출은 생체 내 NK 세포의 항암 활성에 역할을 할 수 있다. NK 세포는 또한 퍼포린과 프로테아제(그랜자임)를 포함하는 세포질에 작은 과립을 가지고 있다. NK 세포에서 방출되면 퍼포린은 그랜자임과 관련 분자가 들어갈 수 있는 표적 세포의 세포막에 구멍을 형성하여 세포 사멸을 유도한다. NK 세포가 표적 세포의 괴사(necrosis)보다는 세포 사멸(apoptosis)을 유도한다는 사실이 중요하다-바이러스에 감염된 세포의 괴사는 비리온을 방출하는 반면, 세포 사멸은 세포 내부의 바이러스를 파괴한다.
g-NK 세포로도 알려진 FcRγ어댑터 단백질이 결여된 NK 세포의 특화된 서브세트는 강력한 ADCC 반응을 매개할 수 있다 (예를 들어 공개된 특허 출원번호 US 2013/0295044 참조). 증가된 반응의 기전은 FcRγ의 발현에 영향을 미치는 후성 유전적 변형(epigenetic modification)의 변화 때문일 수 있다. g-NK 세포는 시그널링 어댑터 ζ사슬을 풍부하게 발현하지만, 시그널링 어댑터 γ사슬의 발현이 부족하다. 기존의 NK 세포와 비교하여 이러한 γ결핍된 g-NK 세포는 항체에 의해 활성화될 때 극적으로 향상된 활성을 나타낸다. 예를 들어, g-NK 세포는 CD16의 항체 매개 가교 또는 항체 코팅 종양 세포에 의해 활성화 될 수 있다. 일부 관점에서, g-NK 세포는 더 많은 양의 사이토카인 (예: IFN-γ또는 TNF-α) 및 케모카인 (예: MIP-1α, MIP-1β및 RANTES)을 생산 및/또는 γ사슬을 발현하는 통상적인 NK 세포보다 더 높은 탈과립화 반응을 나타낸다. g-NK 세포는 자연 살해 세포의 세포 독성 기구(cytotoxic machinery)의 구성 요소인 Granzyme B의 높은 발현을 제공한다. 또한, g-NK 세포는 기존의 NK 세포에 비해 수명이 길고 그 존재가 장기간 유지된다. 일부 구현예에서, g-NK 세포는 기능적으로 그리고 표현형적으로 안정하다.
일부 구현예에서, g-NK 세포는 기존 NK 세포(conventional NK cell), 예컨대 예: γ사슬이 결핍되지 않은 NK 세포보다 ADCC 반응을 유도하는 데 더 효과적이다. 일부 경우에 ADCC는 항암 항체를 포함한 치료용 항체의 작용 메커니즘이다. 일부 관점에서, NK 세포를 투여하는 세포 요법은 치료 및 관련 목적을 위해 항체와 함께 사용될 수 있다. g-NK 세포를 함유하는 조성물, 예컨대 상기 제공되는 방법에 의해 생산된 것과 같은 조성물 및 항체, 예컨대 항암 항체의 병용 투여(combined administration)를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, g-NK 세포의 항체 지향적 표적화는 g-NK 세포 서브세트의 개선된 친화성, 세포 독성 및/또는 사이토카인 매개 효과 기능으로 인해 환자에 대한 개선된 결과를 유도한다.
일부 구현예에서, g-NK 세포는 FcRγ를 발현하는 자연 살해 세포보다 현저히 더 많은 양의 사이토카인을 생산한다. 또 다른 구현예에서, 상기 사이토카인은 인터페론-감마 (IFN-γ종양괴사인자-α (TNF-α), 또는 이들의 조합이다. 일 구체 예에서, g-NK 세포는 상당히 많은 양의 케모카인을 생산한다. 일 구현예에서, 상기 케모카인은 MIP-1α, MIP-1β또는 이들의 조합이다. 또 다른 구현예에서, 상기 g-NK 세포는 Fc 수용체 CD16을 통한 자극에 따른 사이토카인 또는 케모카인을 생산한다.
g-NK 세포는 말초 혈액에서 상대적으로 작은 NK 세포 비율을 나타내므로 치료 방법에서 이러한 세포를 사용하는 능력이 제한된다. 특히, 임상(clinic)에서 g-NK 세포를 활용하기 위해서는 g-NK 세포가 일반적으로 드문 집단이기 때문에 높은 우선적 증식률이 필요하다. NK 세포를 증식하는 다른 방법들은 14일 NK 세포 증식율을 1,000 배로 늘릴 수 있지만 낮은 분화, NKG2Cneg, FceRIγpos (FcRγpos) NK 세포를 생성한다 (Fujisaki et al. (2009) Cancer Res., 69:4010-4017; Shah et al. (2013) PLoS One, 8:e76781). 또한, 본원에서는 g-NK 세포와 표현형적으로 겹치는 NK 세포를 증식하기 위해 최적화된 증식은 g-NK 세포를 치료적 사용을 지원할 수 있는 양으로 우선적으로 증식하지 않는 것으로 밝혀졌다. 특히, g-NK 세포와 표현형 중첩을 보이는 NKG2Cpos NK 세포는 HLA-E 형질 감염된 221.AEH 세포를 사용하여 우선적으로 증식될 수 있다는 보고가 있었다 (Bigley et al. (2016) Clin. Exp. Immunol., 185:239-251). HLA-E를 구성적으로 발현하는 HLA-발현 세포와의 배양은 NK-세포를 NKG2Cpos/NKG2Aneg 표현형 (NKG2C는 HLA-E에 대한 활성화 수용체이고 NKG2A는 HLA-E에 대한 억제 수용체임)의 방향으로 유도한다(push). 이러한 세포는 그 안에 g-NK를 포함하기 때문에 이러한 방법은 g-NK 세포를 증식하기에 충분할 것이라고 생각되었다. 그러나 본원의 실시예에 나타난 바와 같이, 이 방법은 g-NK 세포의 강력한 증식을 달성하지 못한다.
상기 제공되는 방법은 이러한 한계를 극복한다. 상기 제공되는 방법은 이전 방법에 비해 221.AEH 세포 대 NK 세포의 더 큰 비율을 사용한다. 특히, 이전의 방법들은 10:1 NK 세포 대 221.AEH 비율과 같이 221.AEH 세포의 낮은 비율을 사용하였다. 본원에서 221.AEH 세포와 같은 HLA-E-발현 영양 세포 (feeder cell)의 더 큰 비율은 g-NK 표현형쪽으로 더 크고 더 치우친 전체적인 증식을 초래한다는 것이 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 221.AEH 세포의 더 큰 비율이 영양 세포를 조사(irradiating)함으로써 가능하다. 더욱이, 활성화 된 (예를 들어, 항-CD3 활성화 된) 자가(autologous) PBMC, 예를 들어 조사되어 활성화 된 PBMC의 포함이 증식을 과급하기 위한 추가 영양 세포로 사용될 수 있다는 것도 발견되었다. 일부 관점에서, 조사된 영양 세포주의 사용은 또한 GMP 호환 가능한 방법을 제공하기 때문에 유리하다. 증식 동안 재조합 IL-2의 포함하는 것이 또한 강력한 증식을 지원하는 것으로 밝혀졌다
또한, 증식에 앞서 CD16 또는 CD57 세포에 대한 농축에 의한 것과 같이, 증식 방법 이전에 세포 샘플로부터의 NK 세포의 농축이, CD3 고갈(depletion)만을 기초로 초기에 NK 세포를 농축하는 방법에 비해, 달성될 수 있는 g-NK 세포 증식의 양을 추가로 실질적으로 증가시킨다는 것이 발견되었다. 또 다른 구현예에서, 증식 전 수행될 수 있는 또 다른 농축은 CD56에 대한 양성 선택 및 CD38에 대한 음성 선택 또는 고갈에 의해 NK 세포를 농축하는 것이다. 추가적인 구현예에서, 증식 전에 수행될 수 있는 또 다른 농축은 CD56에 대한 양성 선택에 이어 NKG2Aneg에 대한 음성 선별 또는 고갈 및 CD161neg에 대한 음성 선택 또는 고갈에 의해 NK 세포를 강화하는 것이다. 임의의 이러한 구현예에서, 농축된 NK 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 같은 NK 세포를 함유하는 세포 샘플로부터 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 샘플로부터 NK 세포를 농축하기 전, T 세포는 CD3에 대한 음성 선택 또는 고갈에 의해 제거될 수 있다.
또한, g-NK 세포를 증식하기 위해 상기 제공되는 접근법은 10 억 개 이상의 세포를 초과하는 NK 세포의 증식을 달성할 수 있으며, 일부 경우에는 배양 시작시 초기 1,000 만 개의 농축 NK 세포에서 최대 80 억 개 또는 그 이상을 달성할 수 있다. 특히, 상기 제공되는 방법은 증식 후 g-NK 세포의 기능이 유지되거나, 일부 경우 증가된 기능으로 고수율 (> 1000 배) 증식 속도를 초래할 수 있다. 또한, 상기 제공되는 방법은 이전에 동결된 NK 세포를 증식하기에 충분하며, 이는 해동된 NK 세포의 구조(rescue)를 포함하는 많은 기존 방법에 의해 일반적으로 달성되지 않는 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 이것은 증식 프로토콜의 기간을 증가시킴으로써 달성된다. 일부 구현예에서, 이것은 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율을 감소시킴으로써, 예컨대, 221.AEH. 영양 세포 대 NK 세포의 비율을 약 1:1로 감소시킴으로써, 달성된다. 본원에 제시된 바와 같이, 상기 제공되는 방법은 강력한 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 나타내는 g-NK 세포를 생성하여, 치료적 적용을 위한 이러한 세포의 유용성을 지원한다.
특허 출원, 특허 공개, 과학 문헌 및 데이터베이스를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 각 개별 참조가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 통합 된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
제한이 아닌 개시의 명확성을 위해, 상세한 설명은 다음의 서브 섹션으로 나누어진다. 여기에 사용된 섹션 제목은 구조화 목적으로만 사용되며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Ⅰ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 이러한 정의의 본원에의 포함이 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "분자(a molecule)"에 대한 언급은 선택적으로 둘 이상의 이러한 분자 등의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은 이 기술 분야의 숙련자에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오류 범위(error range)를 의미한다. 본원에서 값 또는 매개 변수에 대한 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 매개 변수 그 자체에 관한 구현예를 포함 (및 설명)한다.
본원에 기술된 본 발명의 관점 및 구현예는 관점 및 구현예를 "포함하는(comprising)", "구성되는(consisting)" 및 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같은, "선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 후속적으로 설명되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않음을 의미하고, 해당 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 그룹은 그룹이 비치환되거나 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체(antibodyt)"는 항원 결합 부위를 형성하기에 충분하고 조립될 때 항원에 특이적으로 결합하기에 충분한 면역 글로불린 분자의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 영역의 적어도 일부를 포함하는 이의 임의의 단편을 포함하여 자연적 또는 부분적이든 전체적으로든 합성되어, 예를 들어 재조합적으로, 생산된 면역 글로불린 및 면역 글로불린 단편을 지칭한다. 따라서, 항체는 면역 글로불린 항원 결합 도메인 (항체 결합 부위)과 상동성 또는 실질적으로 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 전형적으로, 항체는 최소한 가변 중쇄 (VH) 및/또는 가변 경쇄 (VL)의 전부 또는 적어도 일부를 포함한다. 일반적으로 VH와 VL의 쌍은 항원 결합 부위를 형성하지만, 경우에 따라 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합에 충분하다. 항체는 또한 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수있다. 본원에서 항체에 대한 언급은 전장 항체 및 항원 결합 단편을 포함한다. 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"(Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "전장 항체(full-length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)"또는 "전체 항체"(whole antibody)"는 항체 단편과 반대되는 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 전장 항체는 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 등의 포유류 종에서 항체 분지 B 세포에 의해 생성된 항체와 합성으로 생성되는 동일한 도메인을 가진 항체와 같이 일반적으로 2 개의 전장 중쇄 (예: VH-CH1-CH2-CH3 또는 VH-CH1-CH2-CH3-CH4) 및 2 개의 전장 경쇄 (VL-CL) 및 힌지 영역을 갖는 항체이다. 구체적으로 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예컨대, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체 일 수 있다. 일부 경우에, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편(antibody fragment)"은 온전한 항체의 일부, 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화 결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd' 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체 (미국 특허번호 5,641,870, 실시예 2 참조; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); 단일 사슬 Fv (scFv) 또는 단일 사슬 Fab (scFab)를 포함하는 단일 사슬 항체 분자; 상기 중 임의의 항원 결합 단편 및 항체 단편으로부터의 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원의 목적을 위해, 항체 단편은 전형적으로 NK 세포의 표면에서 CD16과 결합하거나 가교하기에 충분한 것을 포함한다.
용어 "자가(autologous)"는 개체 자신의 조직(individual's own tissue) 내에서 유래하거나 그로부터 취한 세포 또는 조직을 의미한다. 예를 들어, NK 세포의자가 이전(transfer) 또는 이식(transplantation)에서 공여자와 수여자는 동일한 사람이다.
용어 "동종(allogeneic)"은 동일한 종에 속하거나 그로부터 수득되지만 유 전적으로 다르고 따라서 일부 경우에 면역학적으로 양립할 수 없는 세포 또는 조직을 지칭한다. 일반적으로, "동종"이라는 용어는 공여자로부터 동일한 종의 수여자에게 이식되는 세포를 정의하는 데 사용된다.
세포 조성물과 관련하여 용어 "농축된(enriched)"은 예를 들어, 대상체로부터 직접 얻거나 분리한 출발 조성물과 같은 동일 부피의 출발 조성물에서의 세포 유형의 수 또는 백분율과 비교하여 세포 또는 집단의 유형 또는 백분율이 증가되어 있는 조성물을 지칭한다. 이 용어는 조성물로부터 다른 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 요구하지 않으며, 이와 같이 농축된 세포가 농축된 조성물에 100% 또는 이에 근접하여 존재할 것을 요구하지 않는다.
용어 "발현(expression)"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예를 들어 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 암호화 된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물(gene product)"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA에서 유래된 경우, 상기 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 용어 "이종(heterologous)"은 상이한 유전적 공급원으로부터 유래된 단백질 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 세포에 대해 이종인 단백질 또는 핵산은 그것이 발현되는 세포가 아닌 유기체 또는 개체에서 유래된 것이다.
본원에 사용된 용어 "도입(introducing)"은 형질 전환(transformation), 형질 도입(transduction), 형질 감염(transfection) (예를 들어, 전기 천공) 및 감염(infection.)을 포함하는 방법과 같은 시험관 내 또는 생체 내에서 DNA를 세포에 도입하는 다양한 방법을 포함한다. 벡터는 DNA 암호화 분자를 세포에 도입하는데 유용하다. 가능한 벡터에는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터가 포함된다. 바이러스 벡터에는 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 또는 아데노 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 벡터와 같은 다른 벡터들을 포함한다.
용어 "조성물(composition)"은 세포 또는 항체를 포함하는 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 제제(preparation)는 일반적으로 활성 성분 (예를 들어, 항체)의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이다.
"약제학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 활성 성분 이외의 약제학적 제형의 성분을 지칭하며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제(buffer), 부형제(excipient), 안정화제(stabilizer) 또는 보존제(preservative)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조합(combination)은 둘 이상의 아이템 사이(between or among)의 임의의 관련을 의미한다. 조합은 2개 이상의 개별 아이템, 예를 들어 2 개의 조성물 또는 2 개의 컬렉션 일 수 있으며, 2 개 이상의 아이템의 단일 혼합물 또는 이의 임의의 변형과 같은 이들의 혼합물 일 수 있다. 조합의 요소는 일반적으로 기능적으로 연관되거나 관련된다.
본원에 사용된 바와 같이, 키트는 치료적 용도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 목적을 위해 패키징된 조합으로, 선택적으로 추가 작용제(additional agent)와 그 조합 또는 이의 요소의 사용을 위한 설명서(instruction)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 임상 병리 과정 동안 치료되는 개체 또는 세포의 자연 과정(natural course)을 변경하도록 설계된 임상적 개입을 의미한다. 치료의 바람직한 효과에는 질환 진행률 감소, 질환 병태 개선(ameliorating) 또는 완화(palliating), 차도(remission) 또는 예후 개선이 포함된다. 예를 들어, 장애 (예를 들어, 호산구 매개 질환)와 관련된 하나 이상의 증상이 완화(mitigated)되거나 제거(eliminated)되는 경우 그 개체은 성공적으로 "치료"된 것이다. 예를 들어, 치료 결과 질환을 앓고 있는 사람들의 삶의 질 향상, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물의 용량 감소, 질환의 재발 빈도 감소, 질환의 중증도 감소, 질환의 발달 또는 진행 지연, 및/또는 개인의 생존 연장을 일으키면, 그 개체은 성공적으로 "치료"된 것이다.
"유효량(effective amount)"은 필요한 기간 동안 투여하여 치료 또는 예방 결과를 포함하여 원하는 또는 지시된 효과를 달성하기 위한 최소한의 효과적인 양을 지칭한다. 유효량은 일 회 이상의 투여로 제공될 수 있다. "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 특정 장애의 측정 가능한 개선을 수행하는데 필요한 최소한의 세포 용량이다. 일부 구현예에서, 상기 치료 유효량은 동물에서 암, 바이러스 감염, 미생물 감염 또는 패혈성 쇼크와 관련된 중증도, 기간 및/또는 증상을 감소시키는 조성물의 양이다. 본원에서 치료적 유효량은 환자의 질환 병태, 연령, 성별 및 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 항체의 독성 또는 해로운 효과에 비해 치료학적으로 유익한 효과가 더 큰 것일 수 있다. "예방적 유효량(prophylactically effective amount)"은 원하는 예방 적 결과를 달성하기 위하여 필요한 기간동안 투여되는 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로 반드시 그런 것은 아니지만, 예방적 용량이 질환의 이전 단계 또는 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 수 있다.
본원에 사용된 "개체(individual)" 또는 "대상체(subject)"는 포유동물이다. 치료 목적의 "포유동물(mammal)"에는 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물 (예:개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌, 생쥐, 흰 족제비, 쥐, 고양이 등)이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 개체 또는 대상체는 인간이다.
Ⅱ. 자연 살해 세포 서브세트 증식 방법
본원에서는 인간 대상체의 생물학적 샘플로부터 NK 세포의 서브세트를 증식하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 대상체 유래 생물학적 샘플로부터 NKG2Cpos인 NK 세포의 서브세트를 증식하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 대상체 유래 생물학적 샘플로부터 FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)인 세포의 서브세트를 증식하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 대상체의 생물학적 샘플에서 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 세포 집단을 분리하는 단계 및 g-NK 세포 대상체 및/또는 세포 외 표면 마커가 g-NK 세포 서브세트와 겹치거나 공유되는 NK 세포 서브세트의 우선적 성장 및/또는 증식 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 NK 세포는 g-NK 세포 대상체 및/또는 세포 외 표면 마커가 g-NK 세포 서브세트와 겹치거나 공유되는 NK 세포 서브세트의 성장 및/또는 증식을 향상시키기 위하여 영양 세포를 사용하거나 사이토카인이있는 병태에서 배양할 수 있다. 일부 관점에서, 상기 제공되는 방법은 또한 NKG2Cpos인 임의의 NK 세포와 같은 NK 세포의 다른 서브세트를 증식할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 샘플, 예컨대, 생물학적 샘플은 NK 세포 집단을 포함하는 다수의 세포 집단을 포함하는 것이다. 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 혈액 세포, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포이거나 이를 포함한다. 일부 관점에서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 성분채집술 생성물(apheresis product) 또는 백혈구성분채집술 생성물(leukapheresis product)이다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플이다. 따라서, 제공되는 방법의 일부 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 집단이 수득될 수 있다. NK 세포 집단을 포함하여 다수의 세포 집단을 함유하는 샘플은 제공된 방법에 따라 증식을 위한 NK 세포 서브세트를 농축 또는 선별하기 위한 세포로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 건강한 대상체인 대상체 유래의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 질환 병태, 예컨대 암을 가지는 대상체 유래의 것이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 생물학적 샘플과 같은 샘플, 예컨대, 특정 질환 또는 병태가 있거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체로부터 수득되거나 유래된 샘플로부터 분리되거나 선택된다. 일부 관점에서, 상기 대상체는 세포가 분리, 처리 및/또는 조작되는 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)과 같은 특정 치료적 개입이 필요한 환자인 대상체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 상기 세포는 1차 세포(priamry cell), 예를 들어 1차 인간 세포이다. 상기 샘플에는 조직, 체액 및 대상체로부터 직접 채취한 기타 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원에서 직접 얻은 샘플 또는 처리된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 기관 샘플 (그로부터 유래된 처리된 샘플 포함)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 관점에서, 상기 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집술 생성물 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 유래한다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터 세포가 획득된다. 일부 관점에서 상기 샘플은 NK 세포, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 포함하고, 일부 관점에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체로부터 수집된 혈액 세포는 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치하기 위하여 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여된다. 특정 구현예에서, 상기 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 세포가 배양 배지에 직접 재현탁된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해하고, 예를 들어 Histopaque® 밀도 원심 분리를 사용함으로써 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리하는 말초 혈액으로부터 백혈구 제조를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 정상 말초 혈액으로부터 수집된 류 코팍(leukopak) 농축 백혈구성분채집술 생성물(leukapheresis product)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 류코팍은 신선한 세포를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 류코팍은 제공되는 방법에 사용하기 위하여 해동된 동결 보존된 샘플이다.
일부 구현예에서, 상기 생물학적 세포의 공급원은 5 x 105 또는 약 5 x 105 개 내지 5 x 108 또는 약 5 x 108 개의 NK 세포 또는 g-NK 세포 서브세트 또는 g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포 서브세트를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플에서 NK 세포, 또는 g-NK 세포 서브세트 또는 g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포 서브세트의 수는 5 x 105 또는 약 5 x 105에서 1 x 108 또는 약 1 x 108, 5 x 105 또는 약 5 x 105에서 5 x 107 또는 약 5 x 107, 5 x 105 또는 약 5 x 105에서 1 x 107 또는 약 1 x 107, 5 x 105 또는 약 5 x 105에서 5 x 106 또는 약 5 x 106, 5 x 105 또는 약 5 x 105에서 1 x 106 또는 약 1 x 106, 1 x 106 또는 약 1 x 106에서 1 x 108 또는 약 1 x 108, 1 x 106 또는 약 1 x 106에서 5 x 107 또는 약 5 x 107, 1 x 106 또는 약 1 x 106에서 1 x 107 또는 약 1 x 107, 1 x 106 또는 약 1 x 106에서 5 x 106 또는 약 5 x 106, 5 x 106 또는 약 5 x 106에서 1 x 108 또는 약 1 x 108, 5 x 106 또는 약 5 x 106에서 1 x 107 또는 약 1 x 107, 1 x 107 또는 약 1 x 107에서 1 x 108 또는 약 1 x 108, 1 x 107 또는 약 1 x 107에서 5 x 107 또는 약 5 x 107, 또는 5 x 107 또는 약 5 x 107에서 1 x 108 또는 약 1 x 108이다.
일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 CMV 혈청 양성인 대상체 유래의 것이다. CMV 감염은 강화된 항 바이러스 활성을 나타내는 NKG2C를 발현하는 NK 세포의 높은 분획의 개발을 포함하여 NK 세포의 표현형 및 기능적 분화를 초래할 수 있다. NKG2C를 발현하는 CMV 관련 NK 세포는 변경된 DNA 메틸화 패턴 및 감소된 신호 분자, 예컨대 FcRγ의 발현 (Schlums et al., Immunity (2015) 42:443-56)을 나타낸다. 이러한 NK 세포는 기존 NK 세포 서브세트에 비해 더 강력한 항체 의존적 활성화, 증식 및 기능과 연결되어 있다. 일부 경우에, 상기 생물학적 샘플은 일반적으로 더 낮은 수준이기는 하지만, FcRγ의 발현이 감소된 NK 세포가 CMV 혈청 음성 개체에서도 검출될 수 있기 때문에 CMV 혈청 음성인 대상체로부터 유래될 수 있다. 어떤 경우에는 상기 생물학적 샘플이 CMV 혈청 양성 개체로부터 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체로부터의 NK 세포는 CD16 유전자에서 뉴클레오티드 526[티미딘(T) →구아닌(G)]에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP rs396991)을 보유하여 단백질의 성숙한(가공된) 형태의 위치 158에서 페닐알라닌(F)에 대한 발린(V)의 아미노산 (aa) 치환 (F158V, 본원에서 158V+라고도 함)을 초래한다. CD16 F158V 다형성은 IgG1 항체에 대해 실질적으로 더 높은 친화성과 연관되어 있으며 보다 강력한 NK 세포 매개 ADCC 반응을 일으키는 능력을 가지고 있음이 밝혀졌다 (Mellor et al. (2013) Journal of Hematology & Oncology, 6:1; Musolino et al. (2008) Journal of Clinical Oncology, 26:1789-1796 and Hatjiharissi et al. (2007) Blood, 110:2561-2564). 일부 구현예에서, CD16 158V+/g-NK 세포의 항체 지향적 표적화는 CD16 158V+/g-NK 세포 서브세트의 개선된 친화성, 세포 독성 및/또는 사이토카인 매개 효과 기능으로 인해 환자에 대한 개선된 결과를 유도한다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 CD16 158V+ NK 세포 유전자형을 갖는 것으로 확인된 대상체의 생물학적 샘플로부터 NK 세포 또는 이의 서브세트를 농축 또는 분리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD16 158V+ NK 세포 유전자형의 존재에 대해 대상체를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA는 혈액 샘플 또는 골수 샘플과 같은 NK 세포이거나 이를 포함하는 대상체의 샘플로부터 추출된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 혈액 세포, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 분리 된 NK 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 건강한 공여자 대상체의 샘플이다. 샘플에서 DNA를 추출하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어 핵산은 구아니듐 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출과 같은 표준 기술을 사용하여, 예컨대 세포와 같은 샘플로부터 용이하게 분리할 수 있다(Chomocyznski et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156). Wizard 게놈 DNA 정제 키트 (Promega, Madison, WI)와 같은 게놈 DNA 추출을 위해 시판되는 키트도 용이하게 이용할 수 있다.
유전자형 분석은 임의의 적합한 샘플에서 수행할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 구현예에서, 상기 유전자형 분석 반응은 예를 들어 파이로시퀀싱 반응, DNA 서열 분석 반응, MassARRAY MALDI-TOF, RFLP, 대립 유전자 특이적 PCR, 실시간 대립 유전자 식별 또는 마이크로어레이 일 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA의 PCR 기반 기술, 예컨대 RT-PCR은 다형성에 대한 대립 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 수행된다. 샘플에서 표적 핵산 서열을 증폭하기 위한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 Innis et al. (eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: basic principles and automation, in PCR: A Practical Approach, McPherson et al. (eds.) IRL Press, Oxford; Saiki et al. (1986) Nature 324: 163; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 4,683,195, 4,683,202 및 4,889,818에 기술되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
158V+ 다형성을 검출하기 위한 프라이머는 알려져 있거나 숙련된 기술자에 의해 쉽게 설계될 수 있으며, 예컨대, 국제적으로 출판된 International published PCT Appl. No. WO2012/061814; Kim et al. (2006) Blood, 108:2720-2725; Cartron et al. (2002) Blood, 99:754-758; Koene et al. (1997) Blood, 90:1109-1114; Hatijiharissi et al. (2007) Blood, 110:2561-2564; Somboonyosdech et al. (2012) Asian Biomedicine, 6:883-889)를 보라. 일부 구현예에서, PCR은 네스티드 프라이머에 이어 대립 유전자 특이적 제한 효소 분해를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 PCR 프라이머는 핵산 서열 5'-ATA TTT ACA GAA TGG CAC AGG -3'(서열번호 2) 및 5-GAC TTG GTA CCC AGG TTG AA-3' (서열번호 3)이고, 제2 PCR 프라이머는 5'-ATC AGA TTC GAT CCT ACT TCT GCA GGG GGC AT-3' (서열번호 4) 및 5'-ACG TGC TGA GCT TGA GTG ATG GTG ATG TTC AC-3' (서열번호 5)이며, 이는 어떤 경우 대립 유전자의 특성에 따라 94-bp 단편을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 6 (CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT) 및 서열번호 7 (GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCAAT)로 표시되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 6 (CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT) 및 서열번호 8 (GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCAA)로 표시되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 6 (CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT) 및 서열번호 9 (GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCA)로 표시되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자형 분석은 RNA를 추출한 후 다음과 같은 프라이머 서열을 사용하여 정량적 실시간 RT-PCR에 의해 수행될 수 있다: CD16의 서열번호 10 (5′′으로 표시되는 센스 및 서열번호 11 (5′′로 표시되는 안티센스 및 서열번호 12 (5′′로 표시되는 TaqMan 프로브.
유전자형을 확인하기 위해 V 대립 유전자 특이적 프라이머 세트 (예컨대, 서열번호 13, 5'-CTG AAG ACA CAT TTT TAC TCC CAAA-3'로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 14, 5'-TCC AAA AGC CAC ACT CAA AGA C-3'로 표시되는 역방향 프라이머) 또는 F 대립 유전자 특이적 프라이머 세트(예컨대, 서열번호 15, 5'-CTG AAG ACA CAT TTT TAC TCC CAAC-3'로 표시되는 정방향 프라이머; 및 서열번호 14, 5'-TCC AAA AGC CAC ACT CAA AGA C-3'로 표시되는 역방향 프라이머)를 이용한 대립 유전자 특이적 증폭이 사용될 수 있다.
CD16A에 대한 게놈 서열은 NG_009066.1의 NCBI 데이터베이스에서 이용 가능하다. CD16A의 유전자 ID는 2214이다. 유전자 다형성을 포함한 CD16의 서열 정보는 UniProt Acc No. P08637에서 확인할 수 있다. CD16 (F158)의 서열은 서열번호 16에 표시되어 있다 (잔기 F158은 굵게 표시되고 밑줄이 그어져있다). 일부 구현예에서, CD16 (F158)은 MWQLLLPTALLLLVSA (서열번호 17)로 표시되는 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGL F GSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK (서열번호 16)
CD16 158V+ (F158V를 초래하는 다형성)의 서열은 VAR_003960으로 알려져 있으며 서열번호 18에 표시되는 서열을 갖는다 (158V+ 다형성은 굵은 글씨체 및 밑줄로 표시됨). 일부 구현예에서, MWQLLLPTALLLLVSA (서열번호 17)로 표시되는 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGL V GSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK (서열번호 18)
일부 구현예에서, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석은 특정 SNP 표적을 탐지하기 위하여, 5'말단에 형광 염료 라벨 (예: FAM 또는 VIC)을 포함하고 3'말단에 MGB (Minor groove binder) 및 NFQ (nonfluorescent quencher)를 포함하는 대립 유전자 특이적 프로브와 표지가 없는 PCR 프라이머를 사용하여 게놈 데옥시리보핵산 (DNA) 샘플에 채용된다. 일부 구현예에서, 상기 분석은 프로브와 관련된 염료의 형광 변화에 의해 SNP의 존재를 측정하거나 검출한다. 이러한 구현예에서, 프로브는 2개의 표지되지 않은 프라이머 사이의 표적 DNA에 혼성화하고 5' 말단의 형광 염료로부터의 신호는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 3'말단의 NFQ에 의해 켄칭된다. PCR 동안 Taq 중합효소는 주형을 가이드로 사용하여 표지되지 않은 프라이머를 증식하고 중합 효소가 표지된 프로브에 도달하면 퀀처에서 염료를 분리하는 분자를 절단한다. 일부 관점에서, qPCR 기기는 켄칭되지 않은 표지로부터 형광을 검출할 수 있다. 예시적인 시약은 시판 중인 SNP Assays, 예컨대 code C_25815666_10 for rs396991 (Applied Biosystems, Cat No. 4351379 for SNP genotyping of V158F in CD16)이다.
일부 구현예에서, CD16 158V+ (V158F) 다형성에 대해 이형 접합 또는 동종 접합 대상체가 확인된다. 일부 구현예에서, CD16 158V+ (V158F) 다형성에 대해 동형 접합인 대상체가 확인된다. 일부 구현예에서, NK 세포 또는 NK 세포 서브세트는 CD16 158 V+ 다형성에 대해 이형 접합 또는 동형 접합인 것으로 확인된 대상체 유래의 생물학적 샘플로부터 분리되거나 농축된다. 일부 구현예에서, NK 세포 또는 NK 세포 서브세트는 CD16 158 V+ 다형성에 대해 동형 접합인 것으로 확인된 대상체의 생물학적 샘플로부터 분리되거나 농축된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 분리되거나 수득된 집단 PBMC로부터와 같은 생물학적 샘플로부터 NK 세포를 농축하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포가 농축된 세포 집단은 하나 이상의 자연 살해 세포 특이적 마커에 기초한 분리 또는 선별에 의해 강화된다. 특정 마커 또는 표면 마커 조합을 선택하는 것은 숙련된 기술자의 수준 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 표면 마커(들)는 다음 표면 항원 중 임의의 하나 이상이다: CD11a, CD3, CD7, CD14, CD16, CD19, CD25, CD27, CD38 CD56, CD57, CD161, CD226, NKB1, CD62L; CD244, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2A, NKG2C, SLAMF7 (CD319), KIR2DL1 및/또는 KIR2DL3. 특정 구현예에서, 하나 이상의 표면 항원은 CD3 및 다음 표면 항원 CD16, CD56 또는 CD57 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 표면 항원은 CD3 및 CD57이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 표면 항원은 CD3, CD56 및 CD16이다. 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 표면 항원은 CD3, CD56 및 CD38이다. 추가 구현예에서, 상기 하나 이상의 표면 항원은 CD3, CD56, NKG2A 및 CD161이다. 이러한 표면 항원을 검출하기 위한 형광 색소-접합 항체(fluorochrome-conjugated antibody)를 포함하는 시약은 잘 알려져 있고 숙련된 기술자에게 이용 가능하다.
일부 구현예에서, 상기 NK 세포 집단은 상기 제공되는 방법에 의해 샘플로부터 분리 또는 선별에 의한 것과 같이 농축되어 있는, 표면 마커와 같은 하나 이상의 특정 마커에 대해 양성 (marker+) 또는 높은 수준(markerhigh)으로 발현하거나 하나 이상의 마커에 대해 음성 (marker-) 또는 상대적으로 낮은 수준 (markerlow)으로 발현하는 세포이다. 일부 경우에, 이러한 마커는 NK 세포의 특정 집단에서는 부재하거나 상대적으로 낮은 수준으로 발현되지만 다른 특정 림프구 집단 (예: T 세포)에서는 상대적으로 높은 수준으로 존재하거나 발현되는 마커이다. 일부 경우에, 이러한 마커는 NK 세포의 특정 집단에서 상대적으로 더 높은 수준으로 존재하거나 발현되지만 특정 다른 림프구 집단 (예: T 세포 또는 이의 서브세트)에서는 부재하거나 상대적으로 낮은 수준으로 발현되는 마커이다.
일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 친화성 또는 면역 친화성 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 관점에서의 분리(isolation)는 하나 이상의 마커, 일반적으로 세포 표면 마커의 발현 또는 발현 수준에 기반한 세포 및 세포 집단의 분리(separataion), 예를 들어 이러한 마커에 특이 적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션과 일반적으로 이어지는 세척단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 분리하는 것에 의한 분리가 포함된다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지(retain)되는 양성 선별(positive selection) 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 유지되는 음성 선별(negative selection)을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선별 또는 농축은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 의미하지만 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포의 음성 선별, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만 이러한 모든 세포를 완전히 제거 할 필요는 없다. 예를 들어, 일부 관점에서, CD3에 대한 음성 선별은 CD3-인 세포 집단을 농축하지만 일부 잔류 또는 작은 비율의 다른 선별되지 않은 세포를 포함할 수 있으며, 이는 일부 경우에 있어서 CD3+인 농축된 집단에 여전히 존재하는 작은 비율의 세포를 포함할 수 있다. 일부 예에서, CD57+ 또는 CD16+ 집단 중 하나의 양성 선별은 상기 집단 (CD57+ 또는 CD16+ 집단)을 농축하지만, 또한 일부 잔류 또는 작은 비율의 다른 비선별 세포를 함유할 수 있으며, 일부 경우에, 농축된 집단에 여전히 존재하는 그 다른 (the other) CD57 또는 CD16 집단을 포함한다.
일부 예에서, 여러 라운드의 분리 단계가 수행되며, 여기서 한 단계로부터 양성 또는 음성으로 선별된 분획은 후속 양성 또는 음성 선별과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예를 들어 음성 선별을 위해 표적화된 마커에 대해 각각 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 다중 마커를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다양한 세포 유형에서 발현되는 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 배양함으로써 다수의 세포 유형을 동시에 양성으로 선택할 수 있다.
일부 관점에서, 상기 선별은 PBMC 샘플로부터의 세포에서와 같이 하나 이상의 표면 항원의 발현에 기초한 양성 및/또는 음성 선별 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 CD56을 발현하는 세포, CD16을 발현하는 세포 또는 CD57을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 및/또는 CD38을 발현하는 세포에 대한 음성 선별 및/또는 예를 들어, T 세포 마커, 예를 들어 CD3 (CD3neg)를 발현하는 세포에 대한 음성 선별과 같은 비-NK 세포 마커를 발현하는 세포에 대한 음성 선별을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 분리는 CD56을 발현하는 세포, CD16을 발현하는 세포 또는 CD57을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 및/또는 예를 들어, T 세포 마커, 예를 들어 CD3 (CD3neg)를 발현하는 세포에 대한 음성 선별과 같은 비-NK 세포 마커를 발현하는 세포에 대한 음성 선별을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 CD56을 발현하는 세포, CD16을 발현하는 세포 또는 CD57을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 및/또는 CD38 (CD38neg), CD161 (CD161neg), NKG2A (NKG2Aneg)를 발현하는 세포에 대한 음성 선별 및/또는 CD3 (CD3neg)을 발현하는 세포에 대한 음성 선별을 발현하는 세포에 대한 음성 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선별은 CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg)의 분리를 포함한다.
일부 구쳬예에서, 상기 분리는 CD3를 발현하는 세포에 대한 음성 선별 (CD3neg) 및 CD56을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 (CD56pos)을 포함한다. 일부 구현예에서, 선별은 CD38 (CD38neg)을 발현하는 세포에 대한 음성 선별을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 분리되거나 선별된 세포는 CD3negCD56posCD38neg이다.
일부 구현예에서, 상기 선별은 CD3를 발현하는 세포에 대한 음성 선별 (CD3neg), CD56을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 (CD56pos), 이어서 NKG2A (NKG2Aneg) 및 CD161 (CD161neg)을 발현하는 세포에 대한 음성 선별을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 분리되거나 선별된 세포는 CD3negCD56posNKG2Aneg CD161neg이다.
일부 구현예에서, 상기 선별은 CD3를 발현하는 세포에 대한 음성 선별 (CD3neg) 및 CD57을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 (CD57pos)을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 분리되거나 선별된 세포는 CD3negCD57pos이다.
일부 구현예에서, 상기 선별은 CD3를 발현하는 세포에 대한 음성 (CD3neg) 및 CD16을 발현하는 세포에 대한 양성 (CD16pos) 선별을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 분리되거나 선별된 세포는 CD3negCD16pos이다. 제공되는 구현예 중 일부에서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg이다. 이러한 임의의 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD38neg이다. 이러한 임의의 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD38neg를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 표면 마커 또는 마커의 발현에 기초한 양성 또는 음성 선별에 의해 세포를 분리, 선별 및/또는 농축하는 방법은 면역 친화성 기반 선별을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 면역 친화성 기반 선별은 PBMC와 같은 세포를 함유하는 샘플을 세포 표면 마커 또는 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선별을 위한 세포의 선별을 위하여 구형 또는 비드, 예를 들어 마이크로 비드, 아가로스, 자기 비드 또는 상자성 비드를 포함한 나노 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 구형 또는 비드는 PBMC와 같은 세포를 함유하는 샘플이 컬럼의 매트릭스와 접촉하고이어서 그로부터 용리되거나 방출되는 면역 친화성 크로마토그래피를 수행하기 위해 컬럼에 패킹될 수 있다.
인큐베이션은 일반적으로 자기 입자 또는 비드에 부착된 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너가 샘플 내 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에서 수행된다.
일부 관점에서, 상기 샘플은 자기장에 배치되고, 자기적으로 반응하거나 자화 가능한 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려 표지되지 않은 세포와 분리된다. 양성 선별을 위해 자석에 끌리는 세포가 유지된다. 음성 선별의 경우 끌리지 않는 세포(표지되지 않은 세포)가 유지된다. 일부 관점에서, 양성 및 음성 선별의 조합은 동일한 선별 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가로 처리되거나 추가 분리 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 상기 자기 반응성 입자는 후속적으로 인큐베이션 및/또는 배양될 세포에 부착된 채로 남아 있고; 일부 관점에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 상기 자화 가능하거나 자기적으로 반응하는 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 경쟁하는 비 표지 항체, 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 링커에 접합된 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 상기 친화성 기반 선별은 자기 활성화 세포 분류 (Magnetic Activated Cell Sorting, MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. MACS 시스템은 자화된 입자가 부착된 세포를 고순도로 선별할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장의 인가 후에 비표적 및 표적 종이 순차적으로 용리되는 모드에서 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 제자리에 고정되고 부착되지 않은 종은 용리된다. 이후, 이 첫 번째 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 갇혀 용출이 방지된 종은 용출 및 회수될 수 있도록 어떤 방식으로든 해방된다. 특정 구현예에서, 비표적 세포는 표지되고 이종 세포 집단으로부터 고갈된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 상기 방법은 NK 세포 또는 이의 서브세트를 선별 및/또는 분리하는 것과 같은 농축 전 IL-12, IL-15, IL-18, IL-2 및/또는 CCL5를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 제공되는 방법의 구현예에서, 상기 농축된 NK 세포는 예를 들어 NK 세포 서브세트, 특히 g-NK 세포 서브세트의 증식 및 증식을 지원하는 조건 하에서와 같이 영양 세포의 존재하에 배양되거나 인큐베이션 된다.
특정 관점에서, 상기 영양 세포는 NKG2C+의 증식을 자극 또는 촉진 및/또는 NKG2A+ 세포의 증식을 억제하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 영양 세포는 HLA-E 또는 HLA-A2 신호 서열을 함유하는 하이브리드 HLA-E를 발현하거나 형질 감염시킨 세포이다. 예를 들어, 이러한 하이브리드의 예는 HLA-A2와 같은 MHC 클래스 I, 프로모터 및 신호 서열을 포함하는 AEH 하이브리드 유전자 및, 일부 경우에 HLA-E 유전자에 의해 암호화 된 것과 동일한 성숙한 단백질을 생성할 수 있지만 세포 표면에서 안정적으로 발현될 수 있는, HLA-E 성숙 단백질 서열이다 (예를 들어 Lee et al. (1998) Journal of Immunology, 160: 4951-4960 참조). 일부 구현예에서, 상기 세포는 HLA-A2, 리더 서열과 같은 MHC 클래스 I의 존재하에 안정화 된 MHC-E 분자를 발현하도록 형질 감염된 LCL 721.221, K562 세포 또는 RMA-S 세포이다. MHC 클래스 I, 예컨대 HLA-A2, 리더 서열 펩티드의 존재 하에 안정화된 세포 표면 HLA-E를 발현하도록 조작된 세포주는 당업계에 공지되어 있다 (Lee et al. (1998) Journal of Immunology, 160: 4951-4960; Zhongguo et al. (2005) 13: 464-467; Garcia et al. (2002) Eur J. Immunol., 32: 936-944). 일부 구현예에서, 조사된 221.AEH 세포는 영양 세포 또는 K562와 같이 HLA 음성인 다른 HLA-E 형질 감염된 세포주로서 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 세포주의 예는 221-AEH 세포이다.
특정 구현예에서, HLA-E-발현 영양 세포, 예를 들어 221.AEH 세포는 감마선 같은 조사에 의해 분열되지 않는다(non-dividing). 일부 구현예에서, HLA-E-발현 영양 세포는 세포 분열을 방지하기 위해 약 1000 내지 10000 rad, 예컨대 1000-5000 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 구현예에서, HLA-E-발현 영양 세포는 세포 분열을 방지하기 위해 약 10 Gy 내지 100 Gy, 예컨대 10-50 Gy 범위의 감마선으로 조사된다.
일부 구현예에서, 농축, 선별 및/또는 분리된 NK 세포는 이의 조사된 집단과 같은, HLA-E-발현 영양 세포 (예: 221.AEH 세포)의 존재하에 1:10 또는 약 1:10 이상의, 예컨대 1:10 또는 약 1:10에서 10:1 또는 약 10:1의 영양 세포 대 농축된 NK 세포와 같은, HLA-E 영양 세포 (예: 221.AEH 세포) 인 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율로, 배양되거나 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, HLA-E-발현 영양 세포 (예를 들어, 221.AEH 세포), 예를 들어 이의 조사된 집단의 비율은 1:10 또는 약 1:10 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:10 또는 약 1:10 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:10 또는 약 1:10 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1:10 또는 약 1:10 내지 1:1 또는 약 1:1, 1:10 또는 약 1:10 내지 1:2.5 또는 약 1:2.5, 1:10 또는 약 1:10 내지 1:5 또는 약 1:5, 1:5 또는 약 1:5 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 2. 5 또는 약 2.5:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 1:1 또는 약 1:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 1:2.5 또는 약 1:2.5, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:2.5 또는 약 1: 2.5 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 1:1 또는 약 1:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 10:1 또는 약 10:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 5:1 또는 약 5:1, 5:1 또는 약 5:1 또는 10:1 또는 약 10:1 (각각 포함)의 이러한 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율이다.
일부 구현예에서, HLA-발현 영양 세포 (예를 들어, 221.AEH 세포), 예를 들어 이의 조사된 집단의 비율은 1.25:1 또는 약 1.25:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1, 1.75:1 또는 약 1.75:1, 2.0:1 또는 약 2.0:1, 2.25:1 또는 약 2.25:1, 2:5:1 또는 약 2:5:1, 2.75:1 또는 약 2.75:1, 3.0:1 또는 약 3.0:1, 3.25:1 또는 약 3.25:1, 3.5:1 또는 약 3.5.:1, 3.75:1 또는 약 3.75:1, 4.0:1 또는 약 4.0:1, 4.25:1 또는 약 4.25:1, 4.5:1 또는 약 4.5:1, 4.75:1 또는 약 4.75:1 또는 5:1 또는 약 5:1, 또는 상기 기재들 사이의 임의의 값의 이러한 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율이다. 일부 구현예에서, HLA-발현 영양 세포 (예를 들어, 221.AEH 세포), 예를 들어 이의 조사된 집단의 비율은 1:1 또는 약 1:1 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1 (포함)의 비율이다. 일부 구현예에서, HLA-발현 영양 세포 (예를 들어, 221.AEH 세포), 예를 들어 이의 조사된 집단의 비율은 2.5:1 또는 약 2.5:1의 비율이다.
일부 경우에, 출발하는 NK 세포 집단이 증식 전 동결 보존된 경우, 즉 동결/해동되는 경우, 신선한 NK 세포를 사용하는 방법보다 낮은 221.AEH 대 NK-세포 비율이 사용될 수 있다. 여기에서 221.AEH 대 동결/해동된 NK-세포의 1:1 의 비율은 221.AEH 대 신선한 NK 세포의 2.5:1의 비율을 포함하는 배양에서와 유사한 증식을 초래한다는 것이 확인되었다. 일부 관점에서, 더 낮은 비율은 초기 성장 및 증식을 촉진하는 역할을 할 수 있도록 배양물에서 더 많은 수의 NK 세포가 더 많은 세포 대 세포 접촉을 할 수 있도록 보장한다. 일부 구현예에서, 샘플로부터의 초기 농축된 NK 세포 집단이 동결/해동된 경우, 221.AEH 대 동결/해동된 NK-세포는 2:1 또는 약 2:1 내지 1:2 또는 약 1:2의 비율이 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 비율은 1:1이다. 221.AEH 대 동결/해동된 NK-세포에 대해 2.5:1과 같은 더 높은 비율이 사용될 수 있지만, 원하는 임계 밀도 또는 수에 도달하기 위하여 더 긴 배양, 예컨대 21일 또는 약 21일의 배양이 요구될 수 있음이 이해된다.
일부 구현예에서, 상기 NK 세포는 배양물에 비-분열(non-dividing) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 추가로 첨가함으로써 증식된다. 일부 관점에서, 비분열 영양 세포는 감마선 조사 PBMC 영양 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 1000 내지 10000 rad, 예컨대 1000-5000, rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 10 Gy 내지 100 Gy, 예컨대 10-50 Gy 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 관점에서, 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 상기 조사된 영양 세포는 비분열 (예컨대, 조사된) HLA-E-발현 영양 세포와 동시에 배양 배지에 존재한다. 일부 관점에서, 상기 비분열 (예컨대, 조사된) PBMC 영양 세포, HLA-E-발현 영양 세포 및 농축된 NK 세포는 인큐배이션 개시일과 같이 동일한 날, 예컨대 동시에 또는 거의 동시에 배양물에 첨가된다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 또는 배양은 영양 세포로서 조사된 PBMC의 존재하에 추가로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조사된 PBMC 영양 세포는 농축된 NK 세포가 분리되거나 선별되는 것과 동일한 대상체에 대해 또는 동일한 대상체로부터 자가(autologous)이다. 특정 구현예에서, 상기 PBMC는 동일한 생물학적 샘플, 예컨대, NK 세포를 농축하는데 사용되는 전혈 또는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 수득된다. 일단 수득되면, PBMC의 일부는 전술한 바와 같이 NK 세포의 농축 이전에 조사를 위해 예약된다.
일부 구현예에서, 조사된 PBMC는 1:10 또는 약 1:10 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:10 또는 약 1:10 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:10 또는 1:10 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1:10 또는 약 1:10 내지 또는 약 1:5, 1:5 또는 약 1:5 내지 또는 10:1또는 약 10:1, 1:5 또는 약 1:5에서 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 1:1 또는 약 1:1, 1:5 또는 약 1:5 내지 1:2.5 또는 약 1:2.5, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1:2.5 또는 약 1:2.5 내지 1:1 또는 약 1:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 10:1 또는 약 10:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 5:1 또는 약 5:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 10:1 또는 약 10:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 5:1 또는 약 5:1, 또는 5:1 또는 약 5:1 내지 10:1 또는 약 10:1인 이러한 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율로 영양 세포로서 존재한다.
일부 구현예에서, 조사된 PBMC는 1:1 또는 약 1:1 내지 5:1 또는 약 5:1, 예컨대 1.25:1 또는 약 1.25:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1, 1.75:1 또는 약 1.75:1, 2.0:1 또는 약 2.0:1, 2.25:1 또는 약 2.25:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1, 2.75:1 또는 약 2.75:1, 3.0:1 또는 약 3.0:1, 3.25:1 또는 약 3.25:1, 3.5:1 또는 약 3.5:1, 3.75:1 또는 약 3.75:1, 4.0:1 또는 약 4.0:1 , 4.25:1 또는 약 4.25:1, 4.5:1 또는 약 4.5:1, 4.75:1 또는 약 4.75:1, 또는 5:1 또는 약 5:1, 또는 앞의 임의의 것 사이의 임의의 값인 이러한 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율로 영양 세포로서 존재한다. 일부 구현예에서, 조사된 PBMC는 이러한 영양 세포 대 농축 세포의 비율이 5:1 이거나 약 5:1인 비율로 존재한다.
특정 구현예에서, 인큐베이션 또는 배양의 적어도 일부 동안 조사된 PBMC의 하나 이상의 세포 또는 세포 유형, 예컨대 T 세포, 가 활성화되고/되거나, 상기 인큐베이션 또는 배양이 PBMC 영양 세포의 하나 이상의 T 세포의 활성화를 자극할 수 있는 적어도 하나의 자극제(stimulatory agent)의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 CD3, 선택적으로 CD3 엡실론에 특이적으로 결합한다. 일부 관점에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이다. 예시적인 항-CD3 항체는 마우스 항-인간 CD3 (OKT3)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원-결합 단편은 조사된 PBMC 영양 세포를 포함하는 배양의 적어도 일부 동안 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 항 -CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 조사된 PBMC와 동시에 또는 거의 동시에 배양 또는 인큐베이션에 첨가된다. 예를 들어, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 인큐베이션 또는 배양 개시 시점 또는 그 부근에 첨가된다. 특정 관점에서, 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편은 배양 또는 배양 과정 동안, 예를 들어 배양 배지를 교환하거나 세척함으로써 제거되거나 그 농도가 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 교환 또는 세척 후, 상기 방법은 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편으로 배양 배지를 다시 첨가하거나 보충하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편이 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 2 μg/mL 또는 약 2 μg/mL, 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 1 μg/mL 또는 약 1 μg/mL, 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL, 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL, 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL와 같은, 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 5 μg/mL 또는 약 5 μg/mL, 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 내지 2 μg/mL 또는 약 2 μg/mL, 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 내지 1 μg/mL 또는 약 1 μg/mL, 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 내지 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL, 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 내지 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL, 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL 내지 5 μg/mL 또는 약 5 μg/mL, 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL 내지 2 μg/mL 또는 약 2 μg/mL, 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL 내지 1 μg/mL 또는 약 1 μg/mL, 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL 내지 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL, 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL 내지 5 μg/mL 또는 약 5 μg/mL, 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL 내지 2 μg/mL 또는 약 2 μg/mL, 500 ng/mL 또는 약 500 ng/mL 내지 1 μg/mL 또는 약 1 μg/mL, 1 μg/mL 또는 약 1 μg/mL 내지 5 μg/mL 또는 약 5 μg/mL, 1 μg/mL 또는 약 1 μg/mL 내지 2 μg/mL 또는 약 2 μg/mL, 또는 2 μg/mL 또는 약 2 μg/mL 내지 5 μg/mL 또는 약 5 μg/mL와 같은, 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL 내지 5 μg/mL 또는 약 5 μg/mL, (각각 포함)의 농도로 첨가되거나, 배양 또는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 10 ng/mL 또는 약 10 ng/mL, 20 ng/mL 또는 약 20 ng/mL, 30 ng/mL 또는 약 30 ng/mL, 40 ng/mL 또는 약 40 ng/mL, 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL, 60 ng/mL 또는 약 60 ng/mL, 70 ng/mL 또는 약 70 ng/mL, 80 ng/mL 또는 약 80 ng/mL, 90 ng/mL 또는 약 90 ng/mL, 또는 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL, 또는 앞의 임의의 것 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 50 ng/mL 또는 약 50ng/mL이다.
일부 구현예에서, 용어 "항체(antibody)"는 면역 글로불린 분자 및 면역 글로불린 (Ig) 분자의 항원-결합 부위 또는 단편, 즉 항원에 특이적으로 결합 (면역 반응)하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 용어 항체는 온전한 폴리 클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬 (scFv) 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)와 같은 이의 단편도 포함한다. 전형적으로, "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"은 관심 항원의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 면역 글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 CDR을 함유한다. 이와 관련하여, 항원 결합 단편은 일반적으로 VH 및 VL을 함유하는 항체에 대한 6 개의 CDR (중쇄 및 경쇄 각각에 대해 "CDR1," "CDR2"및 "CDR3"), 또는 단일 가변 도메인을 함유하는 항체에 대한 3 개의 CDR과 같이, 항원에 결합하는 항체로부터 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 서열의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 모두의 CDR을 포함할 수 있다.
"항체 단편(antibody fragment)"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄 (VH) 영역, scFv 및 단일 도메인 VH 단일 항체와 같은 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대 scFv를 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 또는 배양은 선별 및/또는 분리된 NK 세포와 같이 이러한 농축된 NK 세포가 적어도 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.1 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.1 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.2 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.2 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL, 또는 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도로 존재 하에 개시된다. 상기 제공되는 방법의 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 또는 배양은 선별 및/또는 분리된 NK 세포와 같이 이러한 농축된 NK 세포가 0.05 x 106 또는 약 0.05 x 106 내지 0.75 x 106 또는 약 0.75 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.05 x 106 또는 약 0.05 x 106 내지 0.5 x 106 또는 약 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.05 x 106 또는 0.05 x 106 내지 0.20 x 106 또는 약 0.20 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.05 x 106 또는 0.05 x 106 내지0.1 x 106 또는 약 0.1 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.1 x 106 또는 약 0.1 x 106 내지 1.0 x 106 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL,, 0.1 x 106 또는 약 0.1 x 106 내지 0.75 x 106 또는 약 0.75 x 106 NK 세포/mL, 0.1 x 106 또는 약 0.1 x 106 내지 0.5 x 106 또는 약0.5 x 106, 0.1 x 106 또는 약0.1 x 106 내지 0.20 x 106 또는 약0.20 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.20 x 106 또는 약 0.20 x 106 내지 1.0 x 106 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL, 0.20 x 106 또는 약 0.20 x 106 내지 0.75 x 106 또는 약 0.75 x 106, 0.20 x 106 또는 약 0.20 x 106 내지 0.5 x 106 또는 약 0.5 x 106, 0.5 x 106 또는 약 0.5 x 106 내지1.0 x 106 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL,, 0.5 x 106 또는 약 0.5 x 106 내지 0.75 x 106 또는 약 0.75 x 106 농축된 NK 세포/mL,, 0.75 x 106 또는 약 0.75 x 106 내지 1.0 x 106 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL과 같이 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL (각각 포함)의 농도로 존재 하에 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 또는 배양은 선별 및/또는 분리된 NK 세포와 같이 이러한 농축된 NK 세포가 0.2 x 106 또는 약 0.2 x 106의 농도로 존재하에 개시된다. 이러한 임의의 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이 인큐베이션 또는 배양의 개시에 첨가되거나 존재하는 PBMC로부터 선별 또는 분리된 것과 같은 농축된 NK 세포의 양은 적어도 1 x 105 세포 또는 적어도 약 1 x 105 세포, 적어도 2 x 105 세포 또는 적어도 약 2 x 105 세포, 적어도 3 x 105 세포 또는 적어도 약 3 x 105 세포, 적어도 4 x 105 세포 또는 적어도 약 4 x 105 세포, 적어도 5 x 105 세포 또는 적어도 약 5 x 105 세포, 적어도 6 x 105 세포 또는 적어도 약 6 x 105 세포, 적어도 7 x 105 세포 또는 적어도 약 7 x 105 세포, 적어도 8 x 105 세포 또는 적어도 약 8 x 105 세포, 적어도 9 x 105 세포 또는 적어도 약 9 x 105 세포, 적어도 1 x 106 세포 또는 적어도 약 1 x 106 세포 또는 그 이상이다. 특정 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이 PBMC로부터 선택되거나 분리된 것과 같은 농축된 NK 세포의 양은 1 x 106 세포, 약 1 x 106 세포, 적어도 1 x 106 세포, 또는 적어도 약 1 x 106 세포이다.
이들 구현예 중 일부에서, 상기 NK 세포는 성장 인자와 함께 배양될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 성장 인자는 SCF, GSK3i, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택된 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 성장 인자는 IL-2 또는 IL-7 및 IL-15이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 성장 인자는 IL-2, IL-21 또는 IL-7 및 IL-15이다. 일부 구현예에서, 상기 성장 인자는 재조합 IL-2, 재조합 IL-7, 재조합 IL-21 또는 재조합 IL-15와 같은 재조합 사이토카인이다.
특정 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 재조합 IL-2의 존재하에 농축된 NK 세포 및 영양 세포의 인큐베이션 또는 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2는 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL, 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 또는 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL와 같은 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL (각각 포함)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안 IL-2의 농도는 50 IU/mL, 약 50 IU/mL, 60 IU/mL, 약 60 IU/mL, 70 IU/mL, 약 70 IU/mL, 80 IU/mL, 약 80 IU/mL, 90 IU/mL, 약 90 IU/mL, 100 IU/mL, 약 100 IU/mL, 125 IU/mL, 약 125 IU/mL, 150 IU/mL, 약 150 IU/mL, 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 또는 앞의 것들 사이의 임의의 값이다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 IL-2의 농도는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL이다.
특정 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 재조합 IL-21의 존재하에 농축된 NK 세포 및 영양 세포의 인큐베이션 또는 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안 재조합 IL-21는 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL, 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 또는 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL와 같은 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL (각각 포함)의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안 IL-21의 농도는 50 IU/mL, 약 50 IU/mL, 60 IU/mL, 약 60 IU/mL, 70 IU/mL, 약 70 IU/mL, 80 IU/mL, 약 80 IU/mL, 90 IU/mL, 약 90 IU/mL, 100 IU/mL, 약 100 IU/mL, 125 IU/mL, 약 125 IU/mL, 150 IU/mL, 약 150 IU/mL, 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 또는 앞의 것들 사이의 임의의 값이다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 IL-21의 농도는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 배지를 교환하는 단계를 포함하며, 일부 관점에서 세포를 세척하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인큐베이션 또는 배양의 적어도 일부 동안 상기 배양 배지는 매일, 격일로, 3일마다 또는 매주 1회와 같이 간헐적으로 교환되거나 세척될 수있다. 특정 구현예에서, 상기 배양 배지는 배양 개시 후 3일, 약 3일, 4일, 약 4일, 5일, 약 5일, 6일, 약 6일 또는 7일 또는 약 7일 내와 같이, 3일 또는 약 3일 내지 7일 또는 약 7일 내에 시작하여 교환 또는 세척된다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 5일 또는 약 5일째 시작하여 교환되거나 세척된다.
일단 배양 배지가 제거되거나 세척되면, 이는 보충된다. 일부 구현예에서, 보충된 배양 배지는 재조합 IL-2와 같은 하나 이상의 성장 인자 또는 사이토카인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 재조합 IL-2와 같은 성장 인자 또는 사이토 카인은 인큐베이션 또는 배양 동안 간헐적으로 첨가된다. 이러한 일부 관점에서, 재조합 IL-2와 같은 성장 인자 또는 사이토카인은 배양 또는 인큐베이션의 개시 시점 또는 그 부근에 첨가된 다음, 배양 또는 인큐베이션 중에 간헐적으로, 예컨대 배양 배지를 교한하거나 세척할 때 매번 첨가된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2와 같은 성장 인자 또는 사이토카인은 0일 (인큐베이션 개시)에 시작하여 배양 또는 인큐베이션에 첨가되고, 배양 배지를 교환 또는 세척할 때마다 추가로 재조합 IL-2와 같은 성장 인자 또는 사이토카인이 배양 또는 인큐베이션을 보충하기 위해 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 배양 개시 (0일) 및 배양 기간 동안 배양 배지의 각 세척 또는 교환시 2일 또는 3일마다, 예컨대 배양 또는 인큐베이션의 5일 또는 약 5일, 7일 또는 약 7일, 9일 또는 약 9일, 11일 또는 약 11일, 및 14일 또는 약 14일에 재조합 IL-2를 첨가하는 것을 포함한다. 임의의 이러한 구현예에서, 상기 재조합 IL-2는 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 50 IU/mL 또는 약 50 IU/mL 내지 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL, 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL, 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL, 또는 250 IU/mL 또는 약 250 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL와 같은 1 IU/mL 또는 약 1 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL (각각 포함)의 농도로 배양 또는 인큐베이션에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 IL-2는 배양 또는 인큐베이션에 50 IU/mL, 약 50 IU/mL, 60 IU/mL, 약 60 IU/mL, 70 IU/mL, 약 70 IU/mL, 80 IU/mL, 약 80 IU/mL, 90 IU/mL, 약 90 IU/mL, 100 IU/mL, 약 100 IU/mL, 125 IU/mL, 약 125 IU/mL, 150 IU/mL, 약 150 IU/mL, 200 IU/mL, 약 200 IU/mL 또는 앞의 것들 사이의 임의의 값의 농도로 첨가된다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 IL-2의 농도는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL이다.
일부 구현예에서, IL-21, IL-18, IL-7, IL-15 및/또는 IL-12를 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 추가 사이토카인이 NK 세포의 증식에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-21, 재조합 IL-18, 재조합 IL-7, 재조합 IL-15 및/또는 재조합 IL-12를 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 추가 사이토 카인이 NK 세포의 증식에 사용될 수 있다.
상기 제공되는 방법의 구현예에서, 배양 또는 인큐베이션은 NK 세포 유지에 필요하거나 유용한 화학적 및 물리적 조건(예를 들어, 온도, 가스)을 제공하는 것을 포함한다. NK 세포 증식 또는 증식을 지원할 수 있는 화학적 조건의 예는 일반적으로 성장(즉, 배양) 배지에 제공되는 완충제, 영양소, 혈청, 비타민 및 항생제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 상기 NK 배양 배지는 10% FCS를 포함하는 MEMα 또는 5% 인간 혈청/LiforCell®FBS 대체물 (Lifeblood Products)을 포함하는 CellGro SCGM (Cell Genix)을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 배지는 Glascow 배지 (Gibco Carlsbad Calif.), RPMI 배지 (Sigma-Aldrich, St Louis Mo.) 또는 DMEM (Sigma-Aldrich, St Louis Mo.)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 많은 배양 배지에는 MEMα(8.19μM 니코틴아미드), RPMI(8.19μM 니코틴아미드), DMEM(32.78μM 니코틴아미드) 및 Glascow 배지 (16.39μM 니코틴아미드)와 같이 비타민 보충제로 니코틴아미드가 포함되어 있다.
세포가 인간 대상체에게 도입 (또는 재도입)되는 적용에서와 같이 일부 구현예에서, 림프구 배양을 위한 AIM V™무혈청 배지, MARROWMAXTM 골수 배지 또는 무혈청 줄기 세포 성장 배지(SCGM) (예: CellGenix® GMP SCGM)와 같은 무혈청 제형 사용하여 배양이 수행된다. 이러한 중간 제형 및 보충제는 상업적 출처에서 입수할 수 있다. 최적의 생존력, 증식, 기능성 및/또는 생존을 촉진하기 위하여 기재된 바와 같이 배양물에 아미노산, 항생제 및/또는 기타 성장 인자 사이토카인이 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 또한 0.5% 내지 10%의 인간 혈청, 예컨대 약 5%의 인간 혈청과 같은 낮은 백분율의 인간 혈청으로 보충될 수 있다. 이러한 구현예에서, 인간 혈청은 인간 AB 혈장 (인간 AB 혈청) 또는 자가 혈청으로부터의 인간 혈청일 수 있다.
일부 구현예에서, 영양 세포 및 임의로 사이토카인 (예: 재조합 IL-2)을 사용한 배양은 인간 NK 세포의 성장 또는 증식에 적합한 온도, 예를 들어 적어도 약 섭씨 25도 이상, 일반적으로 적어도 약 30도 이상 및 일반적으로 섭씨 37도 또는 약 37도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 37 ℃± 2, 5% CO2에서 수행된다.
제공되는 구현예 중 일부에서, 상기 배양은 적어도 또는 적어도 약 2.50 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다. 제공되는 일부 임의의 구현예에서, 상기 배양은 적어도 또는 적어도 약 5.0 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다. 제공되는 일부 임의의 구현예에서, 상기 배양은 적어도 또는 적어도 약 1.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다. 제공되는 일부의 구현예에서, 상기 배양은 적어도 또는 적어도 약 5.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행된다.
제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 배양은 5일 또는 약 5일 또는 적어도 5일 또는 적어도 약 5일, 6일 또는 약 6일 또는 적어도 6일 또는 적어도 약 6일, 7일 또는 약 7일 또는 적어도 7일 또는 적어도 약 7일, 8일 또는 약 8일 또는 적어도 8일 또는 적어도 약 8일, 9일 또는 약 9일 또는 적어도 9일 또는 적어도 약 9일, 10일 또는 약 10일 또는 적어도 10일 또는 적어도 약 10일, 11일 또는 약 11일 또는 적어도 11일 또는 적어도 약 11일, 12일 또는 약 12일 또는 적어도 12일 또는 적어도 약 12일, 13일 또는 약 13일 또는 적어도 13일 또는 적어도 약 13일, 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일, 15일 또는 약 15일 또는 적어도 15일 또는 적어도 약 15일, 16일 또는 약 16일 또는 적어도 16일 또는 적어도 약 16일, 17일 또는 약 17일 또는 적어도 17일 또는 적어도 약 17일, 18일 또는 약 18일 또는 적어도 18일 또는 적어도 약 18일, 19일 또는 약 19일 또는 적어도 19일 또는 적어도 약 19일, 20일 또는 약 20일 또는 적어도 29일 또는 적어도 약 20일, 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일, 22일 또는 약 22일 또는 적어도 22일 또는 적어도 약 22일, 23일 또는 약 23일 또는 적어도 23일 또는 적어도 약 23일, 24일 또는 약 24일 또는 적어도 24일 또는 적어도 약 24일, 또는 25일 또는 약 25일 또는 적어도 25일 또는 적어도 약 25일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 분리, 선별 및/또는 농축 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어 동결 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 인큐베이션 및/또는 배양 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어 동결 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 보호제의 존재하에 세포를 동결 보존하는 단계를 포함함으로써 동결 보존된 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 관점에서, 상기 인큐베이션 전 및/또는 대상체에게 투여하기 전에, 상기 방법은 동결 보존된 조성물을 동결 보호제를 감소 또는 제거하기 위한 조건 하에서 세척하는 단계를 포함한다. 일부 관점에서 다양한 공지된 동결 용액(freezing solutions) 및 파라미터 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 배지 및/또는 용액에서 최종 농도 12.5% 또는 약 12.5%, 12.0%, 또는 약 12.0%, 11.5% 또는 약 11.5%, 11.0% 또는 약 11.0%, 10.5% 또는 약 10.5%, 10.0% 또는 약 10.0%, 9.5% 또는 약 9.5%, 9.0% 또는 약 9.0%, 8.5% 또는 약 8.5%, 8.0% 또는 약 8.0%, 7.5% 또는 약 7.5%, 7.0% 또는 약 7.0%, 6.5% 또는 약 6.5%, 6.0% 또는 약 6.0%, 5.5% 또는 약 5.5%, 또는 5.0% 또는 약 5.5%의 DMSO, 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10% 또는 6% 내지 8%의 DMSO와 함께 냉동, 예를 들어 동결(cryoforzen) 또는 동결보존(cryopreserved) 된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 상기 세포는 배지 및/또는 용액에서 최종 농도 5.0% 또는 약 5.0%, 4.5% 또는 약 4.5%, 4.0% 또는 약 4.0%, 3.5% 또는 약 3.5%, 3.0% 또는 약 3.0%, 2.5% 또는 약 2.5%, 2.0% 또는 약 2.0%, 1.5% 또는 약 1.5%, 1.25% 또는 약 1.25%, 1.0% 또는 약 1.0%, 0.75% 또는 약 0.75%, 0.5% 또는 약 0.5%, 또는 0.25% 또는 약 0.25%의 HSA, 또는 0.1% 내지 5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2% 또는 1% 내지 2%의 HSA와 함께 냉동, 예를 들어 동결(cryoforzen) 또는 동결보존(cryopreserved) 된다. 일 예는 20% DMSO 및 80% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 PBS 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지와 1:1로 희석된다. 그후 세포는 일반적으로 분당 약 1°의 속도로 80℃또는 약 -80℃까지 냉동되고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다.
제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 배양 또는 인큐베이션은 5일 또는 약 5일 또는 적어도 5일 또는 적어도 약 5일, 6일 또는 약 6일 또는 적어도 6일 또는 적어도 약 6일, 7일 또는 약 7일 또는 적어도 7일 또는 적어도 약 7일, 8일 또는 약 8일 또는 적어도 8일 또는 적어도 약 8일, 9일 또는 약 9일 또는 적어도 9일 또는 적어도 약 9일, 10일 또는 약 10일 또는 적어도 10일 또는 적어도 약 10일, 11일 또는 약 11일 또는 적어도 11일 또는 적어도 약 11일, 12일 또는 약 12일 또는 적어도 12일 또는 적어도 약 12일, 13일 또는 약 13일 또는 적어도 13일 또는 적어도 약 13일, 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일, 15일 또는 약 15일 또는 적어도 15일 또는 적어도 약 15일, 16일 또는 약 16일 또는 적어도 16일 또는 적어도 약 16일, 17일 또는 약 17일 또는 적어도 17일 또는 적어도 약 17일, 18일 또는 약 18일 또는 적어도 18일 또는 적어도 약 18일, 19일 또는 약 19일 또는 적어도 19일 또는 적어도 약 19일, 20일 또는 약 20일 또는 적어도 29일 또는 적어도 약 20일, 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일, 22일 또는 약 22일 또는 적어도 22일 또는 적어도 약 22일, 23일 또는 약 23일 또는 적어도 23일 또는 적어도 약 23일, 24일 또는 약 24일 또는 적어도 24일 또는 적어도 약 24일, 또는 25일 또는 약 25일 또는 적어도 25일 또는 적어도 약 25일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 배양 개시 시 농축된 NK 세포가 이전에 동결되거나 동결 보존된 후 해동된 경우라면, 전형적으로 더 긴 배양 기간이 필요하다. 배양 개시 시 세포의 병태, 배양 개시 또는 배양 중 세포의 건강 또는 생존력 및/또는 배양 종료시 원하는 임계 세포 수와 같은 인자, 예를 들어, 치료 목적을 위해 대상체에게 투여될 세포의 용량과 같은 세포의 원하는 적용에 따라 세포를 배양하기 위한 최적의 일수를 경험적으로 결정하는 것은 숙련된 기술자의 수준 내에 있다.
상기 제공되는 임의의 일부에서, 상기 방법은 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 증가된 수의 NKG2Cpos 세포를 생산한다. 예를 들면, NKG2Cpos 세포의 증가는 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 100 배 이상 또는 약 100 배 이상, 200 배 이상 또는 약 200 배 이상, 300 배 이상 또는 약 300 배 이상, 400 배 이상 또는 약 400 배 이상, 500 배 이상 또는 약 500 배 이상, 600 배 이상 또는 약 600 배 이상, 700 배 이상 또는 약 700 배 이상 또는 800 배 이상 또는 약 800 배 이상일 수 있다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 1000 배 이상 또는 약 1000 배 이상이다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 2000 배 이상 또는 약 2000 배 이상이다. 상기 증가는 2500 배 이상 또는 약 2500 배 이상이다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 임의의 방법에 따른 배양 또는 인큐베이션은 상기 방법이 적어도 2.50 x 108 또는 적어도 약 2.50 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 3.0 x 108 또는 적어도 약 3.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 4.0 x 108 또는 적어도 약 4.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 5.0 x 108 또는 적어도 약 5.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 6.0 x 108 또는 적어도 약 6.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 7.0 x 108 또는 적어도 약 7.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 8.0 x 108 또는 적어도 약 8.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 9.0 x 108 또는 적어도 약 9.0 x 108 NKG2Cpos 세포, 적어도 1.0 x 109 또는 적어도 약 1.0 x 109 NKG2Cpos 세포, 적어도 1.5 x 10 또는 적어도 약 1.5 x 109 NKG2Cpos 세포, 적어도 2.0 x 109 또는 적어도 약 2.0 x 109 NKG2Cpos 세포, 적어도 3.0 x 109 또는 적어도 약 3.0 x 109 NKG2Cpos 세포, 적어도 4.0 x 109 또는 적어도 약 4.0 x 109 NKG2Cpos 세포, 적어도 5.0 x 109 또는 적어도 약 5.0 x 109 NKG2Cpos 세포, 적어도 1.0 x 1010 또는 적어도 약 1.0 x 1010 NKG2Cpos 세포, 적어도 1.5 x 1010 또는 적어도 약 1.5 x 1010 NKG2Cpos 세포, 적어도 2.0 x 1010 또는 적어도 약 2.0 x 1010 NKG2Cpos 세포, 적어도 2.5 x 1010 또는 적어도 약 2.5 x 1010 NKG2Cpos 세포 또는 그 이상의 증식을 달성할 때까지 수행된다.
제공되는 임의의 방법 중 일부에서, 상기 방법은 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 증가된 수의 g-NK 세포를 생산한다. 예를 들어, 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 g-NK 세포의 증가는 100 배 이상 또는 약 100 배 이상, 200 배 이상 또는 약 200 배 이상, 300 배 이상 또는 약 300 배 이상, 400 배 이상 또는 약 400 배 이상, 500 배 이상 또는 약 500 배 이상, 600 배 이상 또는 약 600 배 이상, 700 배 이상 또는 약 700 배 이상 또는 800 배 이상 또는 약 800 배 이상일 수 있다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 1000 배 이상 또는 약 1000 배 이상이다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 2000 배 이상 또는 약 2000 배 이상이다. 상기 증가는 2500 배 이상 또는 약 2500 배 이상이다. 일부 구현예에서, 제공되는 임의의 방법에 따른 상기 배양 또는 인큐베이션은 그 방법이 적어도 5.0 x 108 또는 적어도 약 5.0 x 108 g-NK 세포, 적어도 6.0 x 108 또는 적어도 약 6.0 x 108 g-NK 세포, 적어도 7.0 x 108 또는 적어도 약 7.0 x 108 g-NK 세포, 적어도 8.0 x 108 또는 적어도 약 8.0 x 108 g-NK 세포, 적어도 9.0 x 108 또는 적어도 약 9.0 x 108 g-NK 세포, 적어도 1.0 x 109 또는 적어도 약 1.0 x 109 g-NK 세포, 적어도 1.5 x 109 또는 적어도 약 1.5 x 109 g-NK 세포, 적어도 2.0 x 109 또는 적어도 약 2.0 x 109 g-NK 세포, 적어도 3.0 x 109 또는 적어도 약 3.0 x 109 g-NK 세포, 적어도 4.0 x 109 또는 적어도 약 4.0 x 109 g-NK 세포, 적어도 5.0 x 109 또는 적어도 약 5.0 x 109 g-NK 세포 이상, 적어도 1.0 x 1010 또는 적어도 약 1.0 x 1010 g-NK 세포 이상, 적어도 1.5 x 1010 또는 적어도 약 1.5 x 1010 g-NK 세포 이상, 적어도 2.0 x 1010 또는 적어도 약 2.0 x 1010 g-NK 세포 또는 그 이상, 또는 적어도 2.5 x 1010 또는 적어도 약 2.5 x 1010 g-NK 세포 또는 그 이상의 증식을 달성할 때까지 수행된다
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 g-NK 세포의 우선적 증식을 초래한다. 일부 관점에서, g-NK 세포는 NK 세포를 다른 림프구 또는 면역 세포와 구별하고 g-NK 세포를 기존 NK 세포와 구별하는 하나 이상의 다양한 마커의 표면 발현의 존재, 부재 또는 수준에 의해 확인된다. 구현예에서, 표면 발현은 유세포 분석법에 의해 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 마커에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 결정될 수 있다. 일반적으로 유세포 분석에 의해 세포 내 단백질을 검출하기 위한 염색 전에 고정 및 투과화를 위한 방법을 포함한다는 점을 제외하고는, 유사한 방법이 세포 내 마커의 발현을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 포름알데히드(예: 0.01%)를 사용하여 고정한 다음 계면활성제(예: 0.1% 내지 1% 계면활성제, 예컨대, 0.5% 또는 약 0.5%), 예를 들어 Triton, NP-50, Tween 20, Saponin, Digitonin 또는 Leucoperm을 사용하여 막을 파괴한다.
항체 및 기타 결합 엔티티를 사용하여 마커 단백질의 발현 수준을 검출하여 g-NK 세포를 확인, 검출, 농축 및/또는 분리할 수 있다. 적합한 항체는 폴리클로 날, 모노클로날, 단편 (예: Fab 단편), 단일 사슬 항체 및 기타 형태의 특이적 결합 분자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 (예를 들어, NK 세포 서브세트)는 세포 상 또는 세포 내에 세포 내 마커 또는 표면 마커일 수 있는 특정 마커의 검출 가능한 존재가 있는 경우 특정 마커에 대해 양성 (pos)이다. 구현예에서, 염색이 다른 조건은 동일한 상황에서 이소타입-매치 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 훨씬 높은 수준 및/또는 마커에 양성인 것으로 알려진 세포와 실질적으로 유사하거나 일부 경우 더 높은 수준 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포보다 높은 수준에서 검출될 때, 표면 발현은 양성이다.
일부 구현예에서, 세포 (예를 들어, NK 세포 서브세트)는 세포 상 또는 세포 내에 세포 내 마커 또는 표면 마커일 수 있는 특정 마커의 검출 가능한 존재가 없는 경우 특정 마커에 대해 음성(neg)이다. 구현예에서, 염색이 다른 조건은 동일한 상황에서 이소타입-매치 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 훨씬 높은 수준 및/또는 마커에 양성인 것으로 알려진 세포보다 상당히 낮은 수준 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포와 실질적으로 유사한 수준에서 검출되지 않을 때, 표면 발현은 음성이다.
일부 구현예에서, 특정 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포와 비교하여 세포 상 또는 세포 내에 특정 마커의 검출 가능한 존재 수준이 더 낮다면, 세포 (예: NK 세포 서브세트)는 특정 마커에 대해 낮다 (lo 또는 min). 구현예에서, 표면 발현은 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 마커에 대한 항체의 결합을 검출함으로써, 결정될 수 있으며, 염색이 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포보다 낮은 수준이면 발현, 여기서 발현은 사용된 방법에 따라 표면 또는 세포 내 중 하나임,은 낮다.
일부 구현예에서, g-NK 세포는 NK 세포의 표현형 (예를 들어, CD45pos, CD3neg 및/또는 CD56pos)을 갖는 세포이고 g-NK 세포 서브세트를 식별하거나 그와 연관된 하나 이상의 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, g-NK 세포는 공개된 특허 출원 US2013/0295044 또는 Zhang et al. (2013) J. Immunol., 190:1402-1406에 기재된 바와 같이 확인된다
일부 구현예에서, g-NK 세포는 실질적인 FcRγ를 발현하지 않지만 자연 살해 세포에 대한 적어도 하나의 마커를 발현하는 세포이다. FcRγ사슬에 대한 아미노산 서열 (Homo sapiens, 고친화성 면역글로불린 감마 Fc 수용체 I이라고도 함)은 NCBI 데이터베이스에서 수탁 번호 NP-004097.1 (GI: 4758344)로 이용 가능하며 하기 서열번호 1로 재현된다.
MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (서열번호 1)
일부 구현예에서, 상기 NK 세포의 g-NK 세포 서브세트는 FcRγ가 NK 세포의 집단 또는 NK 세포의 서브세트에 의해 발현되는지를 관찰함으로써 검출될 수 있다. 일부 경우에, g-NK 세포는 FcRγ를 발현하지 않는 세포로 확인된다. FcRγ단백질은 세포 내 단백질이다. 따라서, 일부 관점에서, FcRγ의 존재 또는 부재는 세포 처리 후, 예를 들어 고정 및 투과화에 의해 검출되어 세포 내 단백질이 검출되도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 세포 내 검출 전, 예를 들어 세포 고정 전, 하나 이상의 표면 마커 (CD45, CD3 및/또는 CD56)에 대해 추가로 평가된다. 일부 구현예에서, g-NK 세포는 CD45pos/CD3neg/CD56pos/ FcRγneg인 세포로서 확인, 검출, 농축 및/또는 분리된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 샘플의 세포가 세포 분류 또는 기능 분석을받는 경우와 같이, 세포 내 염색을 사용하지 않고 g-NK 세포의 발현을 검출하는 것이 유용할 수 있다. 치료 중, 예: 고정 및 투과성, FcRγ의 세포 내 염색을 허용하기 위하여 실질적으로 순수한 세포 집단의 정체성(identity)을 확인하는데 사용할 수 있으며, 많은 경우 g-NK 세포를 식별, 검출 또는 분리할 때 세포를 손상시키지 않고 검출할 수 있는 세포 표면 마커를 사용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, g-NK 세포는 NK 세포의 서브세트 중에서 FcRγ의 결핍과 상관 관계가 있는 대리 마커 프로파일을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에서, FcRγ와 같은 세포 내 단백질의 존재 또는 부재가 세포의 특정 적용에 따라 평가하기 어렵거나 불가능할 때 대리 마커 프로파일이 특히 사용된다.
세포 표면 마커의 특정 조합이 g-NK 세포 표현형, 즉, FcRγ의 세포 내 발현이 결여되거나 결핍된 세포와 상관 관계가 있고, 따라서 세포를 손상시키지 않는 방식으로 g-NK 세포를 확인하거나 검출하기위한 대리 마커 프로파일을 제공할 수 있음이 본원에서 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 g-NK 세포에 대한 대리 마커 프로파일은 하나 이상의 마커 CD16 (CD16pos) 또는 CD57 (CD57pos)의 양성 표면 발현을 기반으로 하고/하거나 하나 이상의 마커 CD7 (CD7dim/neg), CD161 (CD161neg) 및/또는 NKG2A (NKG2Aneg)의 낮은 또는 음성 표면 발현을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 세포는 CD45, CD3 및/또는 CD56과 같은 NK 세포의 하나 이상의 표면 마커에 대해 추가로 평가된다. 일부 구현예에서, g-NK 세포는 대리 마커 프로파일 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg로 확인, 검출, 농축 및/또는 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, g-NK 세포는 대리 마커 프로파일 CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg로 확인, 검출, 농축 및/또는 분리된다.
본원에서는 g-NK 세포의 대리 마커 프로파일을 사용하여 세포 집단을 함유하는 샘플에서 g-NK 세포를 식별하거나 검출하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 샘플을 하나 이상의 마커 CD16, CD57, CD7, CD161 및/또는 NKG2A에 특이적인 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 항원 결합 단편, 과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 샘플을 CD45, CD3 및/또는 CD56에 특이적인 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원 결합 단편, 과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 결합 분자는 샘플과 동시에 접촉될 수 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 결합 분자는 샘플과 순차적으로 접촉될 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉 후, 상기 방법은 하나 이상의 결합 분자에 결합된 세포를 보유하고/하거나 샘플로부터 결합되지 않은 결합 분자를 분리하기 위한 조건 하에서 1회 이상의 세척을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 하나 이상의 결합 분자, 예를 들어, 항체, 는 마커에 대해 양성 또는 음성 세포의 검출을 위해 표지자(label)에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자, 예컨대, 항체, 는 표지자에 커플링 또는 연결된다. 표지자는 당업자에게 잘 알려져있다. 본원에서 고려되는 표지자는, 이에 제한되지는 않으나, 형광 염료, 형광 단백질, 방사성 동위 원소, 발색단, 금속 이온, 금 입자 (예: 콜로이드 금 입자), 은 입자, 광 산란 특성을 가진 입자, 자성 입자 (예: Dynabeads® 자기 비드와 같은 자기 비드 입자), 폴리 펩타이드 (예: FLAGTM 태그, 인간 인플루엔자 혈구 응집소 (HA) 태그 등), 과산화 효소 (예: 홀스래디쉬 과산화효소) 또는 포스파타제 (예: 알칼리성 포스파타제), 스트렙타비딘, 비오틴, 발광 화합물 (예: 화학 발광 기질), 올리고뉴클레오티드, 특정 결합 쌍의 구성원 (예: 리간드 및 그 수용체) 및 결합 분자를 시각화하거나 검출하기 위해 사용되는 당업계에 잘 알려진 다른 표지, 예를 들어, 항체, 상기 항체에 직접 또는 간접적으로 부착된 경우,를 포함한다.
표면 마커 또는 단백질의 발현 수준을 평가하기 위하여, 예를 들어 친화성 기반 방법, 예를 들어 면역 친화성 기반 방법에 의한 검출, 예를 들어, 표면 마커의 맥락에서 유세포 분석에 의한 방법과 같은 다수의 잘 알려진 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표지자는 형광단이고 g-NK 세포의 검출 또는 동정을위한 방법은 유세포 분석에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 다색 유세포 분석에 의해 상이한 마커들 각각에 대해 상이한 표지자가 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 CD45, CD3, CD56, CD57, CD7 및 CD161에 특이적인 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, g-NK 세포는 g-NK 세포 대리 마커 프로파일 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 를 갖는 세포로서 확인되거나 검출된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 CD45, CD3, CD56, NKG2A 및 CD161에 특이적인 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, g-NK 세포는 g-NK 세포 대리 마커 프로파일 CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg를 갖는 세포로서 확인되거나 검출된다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 또한 상기 제공되는 방법 중 임의의 방법에 따라, 우선적으로 증식된 g-NK 세포와 같은 g-NK를 분리 또는 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 상기 설명된 임의의 패널 또는 마커 조합을 사용하여 결정되는 것과 같이, 예를 들어 90% 또는 약 90%, 91% 또는 약 91%, 92% 또는 약 92%, 93% 또는 약 93%, 94% 또는 약 94%, 95% 또는 약 95%, 96% 또는 약 96%, 97% 또는 약 97%, 98% 또는 약 98%, 99% 또는 약 99% 또는 그 이상의 g-NK 세포를 함유하는 세포 집단과 같은, 실질적으로 순수한 g-NK 세포 집단을 수득할 수 있다. 항체 및 기타 결합 분자는 g-NK 세포를 분리하거나 농축하는데 사용하기 위해 마커 단백질의 발현 수준의 존재 또는 부재를 검출하는 데 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 분리 또는 농축은 형광 활성화 세포 분류(FACs)에 의해 수행된다. 이러한 방법의 예에서, g-NK 세포는 다중 세포 표면 마커에 대해 세포를 염색하기 위한 위에서 설명한 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 확인 또는 검출되고 염색된 세포는 g-NK 세포와 관련된 마커에 대해 양성 또는 음성인 세포 수집을 위해 유체 흐름으로 운반된다.
Ⅲ. 조성물 및 약학적 제형
본원에서는 상기 제공되는 방법 중 임의의 방법에 의해 생산되는 것과 같은 증식된 NK 세포를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 g-NK 세포를 포함한다. 특히, 제공되는 조성물 중에는 g-NK 세포가 농축된 세포 조성물이 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 5-99% NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 5 내지 99% (포함)의 임의의 백분율의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 총 NK 세포 또는 세포가 분리된 대상체에 자연적으로 존재하는 총 세포에 대한 NKG2Cpos 세포 또는 그 서브세트의 비율과 비교하여 전체 NK 세포 또는 전체 세포에 비해 증가된 또는 더 큰 비율의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 백분율은 적어도 2배 또는 약 2배, 3배 또는 약 3배, 4배 또는 약 4배, 5배 또는 약 5배, 10배 또는 약 10배, 20배 또는 약 20배, 30배 또는 약 30배, 40배 또는 약 40배, 50배 또는 약 50배, 60배 또는 약 60배, 70배 또는 약 70배, 80배 또는 약 80배, 90배 또는 약 90배, 100배 또는 약 100배, 150배 또는 약 150배, 200배 또는 약 200배 또는 그 이상 증가된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 20% 또는 약 20%, 적어도 30% 또는 약 30%, 적어도 40% 또는 약 40%, 적어도 50% 또는 약 50%, 적어도 60% 또는 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 81% 또는 적어도 약 81%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 83% 또는 적어도 약 83%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 87% 또는 적어도 약 87%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 89% 또는 적어도 약 89%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 91% 또는 적어도 약 91%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 93% 또는 적어도 약 93%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 95% 또는 적어도 약 95%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 97% 또는 적어도 약 97%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%, 적어도 99% 또는 적어도 약 99%, 또는 실질적으로 100% NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 50% 초과의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 70% 초과의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 80% 초과의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 조성물은 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트가 조성물의 세포 또는 조성물의 NK 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 95% 또는 적어도 약 95% 또는 그 이상를 구성하는 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 5-99% g-NK 세포 또는 5 내지 99% (포함)의 임의의 백분율의 g-NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 총 NK 세포 또는 세포가 분리된 대상체에 자연적으로 존재하는 총 세포에 대한 g-NK세포의 비율과 비교하여 전체 NK 세포 또는 전체 세포에 비해 증가된 또는 더 큰 비율의 g-NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 백분율은 적어도 2배 또는 약 2배, 3배 또는 약 3배, 4배 또는 약 4배, 5배 또는 약 5배, 10배 또는 약 10배, 20배 또는 약 20배, 30배 또는 약 30배, 40배 또는 약 40배, 50배 또는 약 50배, 60배 또는 약 60배, 70배 또는 약 70배, 80배 또는 약 80배, 90배 또는 약 90배, 100배 또는 약 100배, 150배 또는 약 150배, 200배 또는 약 200배 또는 그 이상 증가된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 20% 또는 약 20%, 적어도 30% 또는 약 30%, 적어도 40% 또는 약 40%, 적어도 50% 또는 약 50%, 적어도 60% 또는 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 81% 또는 적어도 약 81%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 83% 또는 적어도 약 83%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 87% 또는 적어도 약 87%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 89% 또는 적어도 약 89%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 91% 또는 적어도 약 91%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 93% 또는 적어도 약 93%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 95% 또는 적어도 약 95%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 97% 또는 적어도 약 97%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%, 적어도 99% 또는 적어도 약 99%, 또는 실질적으로 100%의 g-NK 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 50% 초과의 g-NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 70% 초과의 g-NK 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 80% 초과의 g-NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 조성물은 g-NK 세포가 조성물의 세포 또는 조성물의 NK 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 95% 또는 적어도 약 95% 또는 그 이상를 구성하는 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 자연 살해 (NK) 세포 서브세트의 집단을 포함하고, 여기서 조성물 내 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 55% 또는 적어도 약 55%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 약 95%가 CD57pos인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 표현형 CD57pos를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 적어도 72% 또는 적어도 약 72%, 적어도 74% 또는 적어도 약 74%, 적어도 76% 또는 적어도 약 76%, 적어도 78% 또는 적어도 약 78%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%는 표현형 CD57pos를 갖는다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%가 표현형 CD57pos를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 표현형 CD57pos를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD3neg를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 50% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 50% 또는 약 50% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 70% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 자연 살해 (NK) 세포 서브세트의 집단을 포함하고, 여기서 조성물 내 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 55% 또는 적어도 약 55%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 약 95%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일이 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 적어도 72% 또는 적어도 약 72%, 적어도 74% 또는 적어도 약 74%, 적어도 76% 또는 적어도 약 76%, 적어도 78% 또는 적어도 약 78%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%는 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 갖는다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%가 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD3neg를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 50% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 50% 또는 약 50% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 70% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 자연 살해 (NK) 세포 서브세트의 집단을 포함하고, 여기서 조성물 내 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 55% 또는 적어도 약 55%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 약 95%가 CD38neg인 표현형을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 표현형 CD38neg를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 적어도 72% 또는 적어도 약 72%, 적어도 74% 또는 적어도 약 74%, 적어도 76% 또는 적어도 약 76%, 적어도 78% 또는 적어도 약 78%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%는 표현형 CD38neg를 갖는다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%가 표현형 CD38neg를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 표현형 CD38neg를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD3neg를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 50% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 50% 또는 약 50% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 70% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 자연 살해 (NK) 세포 서브세트의 집단을 포함하고, 여기서 조성물 내 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 55% 또는 적어도 약 55%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 약 95%가 CD16pos인 표현형을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 표현형 CD16pos를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 적어도 72% 또는 적어도 약 72%, 적어도 74% 또는 적어도 약 74%, 적어도 76% 또는 적어도 약 76%, 적어도 78% 또는 적어도 약 78%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%는 표현형 CD16pos를 갖는다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%가 표현형 CD16pos를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 표현형 CD16pos를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD3neg를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 50% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 50% 또는 약 50% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 70% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 자연 살해 (NK) 세포 서브세트의 집단을 포함하고, 여기서 조성물 내 세포의 적어도 40% 또는 적어도 약 40%, 적어도 50% 또는 적어도 약 50%, 적어도 55% 또는 적어도 약 55%, 적어도 60% 또는 적어도 약 60%, 적어도 65% 또는 적어도 약 65%, 적어도 70% 또는 적어도 약 70%, 적어도 75% 또는 적어도 약 75%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 85% 또는 적어도 약 85%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 95% 또는 적어도 약 95%가 NKG2Aneg/CD161neg인 표현형을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 표현형 NKG2Aneg/CD161neg를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포의 적어도 72% 또는 적어도 약 72%, 적어도 74% 또는 적어도 약 74%, 적어도 76% 또는 적어도 약 76%, 적어도 78% 또는 적어도 약 78%, 적어도 80% 또는 적어도 약 80%, 적어도 82% 또는 적어도 약 82%, 적어도 84% 또는 적어도 약 84%, 적어도 86% 또는 적어도 약 86%, 적어도 88% 또는 적어도 약 88%, 적어도 90% 또는 적어도 약 90%, 적어도 92% 또는 적어도 약 92%, 적어도 94% 또는 적어도 약 94%, 적어도 96% 또는 적어도 약 96%, 적어도 98% 또는 적어도 약 98%는 표현형 NKG2Aneg/CD161neg를 갖는다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 60% 또는 적어도 약 60%가 표현형 NKG2Aneg/CD161neg를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물 내의 세포의 적어도 70% 또는 적어도 약 70%가 표현형 NKG2Aneg/CD161neg를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD3neg를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 50% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 50% 또는 약 50% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 이러한 표현형을 가지는 세포 중 70% 이상의 세포는 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%는 FcRγneg이다.
제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 106 또는 약 106 세포 내지 1012 또는 약 1012 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 106 또는 약 106 내지 1011 또는 약 1011 세포, 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 세포, 106 또는 약 106 내지 109 또는 약 109 세포, 106 또는 약 106 내지 108 또는 약 108 세포, 106 또는 약 106 내지107 또는 약 107 세포, 107 또는 약 107 내지 1012 또는 약 1012 세포, 107 또는 약 107 내지 1011 또는 약 1011 세포, 107 또는 약 107 내지 1010 또는 약 1010 세포, 107 또는 약 107 내지 109 또는 약 109 세포, 107 또는 약 107 내지 108 또는 약 108 세포, 108 또는 약 108 내지 1012 또는 약 1012 세포, 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포, 108 또는 약 108 내지109 또는 약 109 세포, 109 또는 약 109 내지 1012 또는 약 1012 세포, 109 또는 약 109 내지 1011 또는 약 1011 세포, 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포, 1010 또는 약 1010 내지 1012 또는 약 1012 세포, 1010 또는 약 1010 내지 1011 또는 약 1011 세포, 또는 1011 또는 약 1011 내지 1012 또는 약 1012 세포를 포함한다.
제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 106 또는 적어도 약 106 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 세포, 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 109 또는 적어도 약 109 세포, 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 108 또는 적어도 약 108 세포, 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 107 또는 적어도 약 107 세포, 적어도 107 또는 적어도 약 107 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 세포, 적어도 107 또는 적어도 약 107 내지 적어도 109 또는 적어도 약 109 세포, 적어도 107 또는 적어도 약 107 내지 적어도 108 또는 적어도 약 108 세포, 적어도 108 또는 적어도 약 108 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 세포, 적어도 108 또는 적어도 약 108 내지 적어도 109 또는 적어도 약 109 세포, 또는 적어도 109 또는 적어도 약 109 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 세포를 포함한다.
제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 108 또는 적어도 약 108 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 109 또는 적어도 약 109 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 1011 또는 적어도 약 1011 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 109 또는 약 109 내지 1011 또는 약 1011 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 1010 또는 약 1010 내지 1011 또는 약 1011 세포를 포함한다.
제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 106 또는 적어도 약 106 g-NK 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 조성물은 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 g-NK 세포, 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 109 또는 적어도 약 109 g-NK 세포, 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 108 또는 적어도 약 108 g-NK 세포, 적어도 106 또는 적어도 약 106 내지 적어도 107 또는 적어도 약 107 g-NK 세포, 적어도 107 또는 적어도 약 107 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 g-NK 세포, 적어도 107 또는 적어도 약 107 내지 적어도 109 또는 적어도 약 109 g-NK 세포, 적어도 107 또는 적어도 약 107 내지 적어도 108 또는 적어도 약 108 g-NK 세포, 적어도 108 또는 적어도 약 108 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 g-NK 세포, 적어도 108 또는 적어도 약 108 내지 적어도 109 또는 적어도 약 109 g-NK 세포, 또는 적어도 109 또는 적어도 약 109 내지 적어도 1010 또는 적어도 약 1010 g-NK 세포를 포함한다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg이다. 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg이다. 제공되는 임의의 구현예 중 일부에서, g-NK 세포 또는 g-NK 대리 마커 프로파일을 갖는 세포는 표면 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함한다.
제공되는 임의의 조성물 중 특정 구현예에서, 상기 조성물 내의 세포는 동일한 공여자로부터 유래된다. 따라서, 상기 조성물은 하나 이상의 상이한 공여자로부터의 혼합된 세포 집단을 포함하지 않는다. 본원에서 제공된 바와 같이, 상기 증식 방법은 500 배 또는 500 배 이상, 600 배 또는 600 배 이상, 700 배 또는 700 배 이상, 800 배 또는 800 배 이상, 900 배 또는 900 배 이상, 1000 배 또는 1000 배 이상 또는 그 이상의 특정 NK 세포 서브세트, 특히 g-NK 서브세트 또는 상기 기재된 임의의 NK 세포 서브세트와 같은 g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포 서브세트의 높은 수준의 증식을 초래한다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 1000배 또는 약 1000배 이상이다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 2000배 또는 약 2000배 이상이다. 일부 임의의 구현예에서, 상기 증가는 2500배 또는 약 2500배 이상이다. 특정 구현예에서, 특정 NK 세포 서브세트, 특히 g-NK 서브세트 또는 상기 기재된 임의의 NK 세포 서브세트와 같은 g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포 서브세트의 수를 1000배 또는 약 1000배 증가시킨다.
일부 경우에, 단일 공여자로부터 수득된 NK 세포의 초기 공급원으로부터 제공된 방법에 의해 달성된 증식은 세포 조성물을 생성하여 필요로하는 대상체에게 투여하기 위한 복수의 개별 용량을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 제공되는 방법은 동종 이계(allogeneic)인 방법에 특히 적합하다. 일부 경우에 상기 제공되는 방법에 따라 한 공여자로부터 분리된 NK 세포의 출발 집단으로부터의 단일 증식은 30 또는 약 30의 개별 용량, 40 또는 약 40의 개별 용량, 50 또는 약 50의 개별 용량, 60 또는 약 60의 개별 용량, 70 또는 약 70의 개별 용량, 80 또는 약 80의 개별 용량, 90 또는 약 90의 개별 용량, 100 또는 약 100의 개별 용량, 또는 앞의 것들 사이의 임의의 값인 개별 용량과 같이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 20 또는 약 20 이상의 개별 용량을 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 개별 용량은 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg, 예컨대 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg, 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 106 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg, 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 105 또는 약 7.5 x 105 세포/kg, 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg, 1 x 105 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 106 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 105 또는 약 7.5 x 105 세포/kg, 2.5 x 105 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg, 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg, 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg, 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 106 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg, 5 x 105 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 105 또는 약 7.5 x 105 세포/kg, 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg, 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg, 1 x 106 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 2.5 x 106 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 106 또는 약 2.5 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg, 2.5 x 106 세포/kg 내지 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 106 세포/kg 내지 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg, 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg, 5 x 106 또는 약 5 x 106 세포/kg 내지 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 7.5 x 106 또는 약 7.5 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 또는 약 1 x 107 세포/kg이다. 일부 구현예에서, 상기 개별 용량은 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 예컨대, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 5 x 108 또는 약 5 x 108, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 1 x 108 또는 약 1 x 108, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 5 x 108 또는 약 5 x 108, 5 x 108 또는 약 5 x 108 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 5 x 108 또는 약 5 x 108 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 5 x 108 또는 약 5 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 5 x 109 또는 약 5 x 109 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109 이다. 임의의 상기 구현예에서, 상기 용량은 g-NK 세포 또는 상기 기재된 임의의 NK 세포 서브세트와 같이, g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포의 수, 또는 전술한 임의의 것들 중의 생존한 세포의 수로 제공된다. 임의의 상기 구현예에서, 상기 용량은 상기 방법에 의해 생산된 증식된 세포의 조성물에서 세포의 수, 또는 전술한 임의의 것들 중의 생존한 세포의 수로서 제공된다.
상기 조성물 중에는 입양 세포 요법과 같은 투여를 위한 약제학적 조성물 및 제형이 있다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 세포는 약제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된다.
약제학적으로 허용되는 담체는 약제학적 투여에 적합한 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다 (Gennaro, 2000, Remington: The science and practice of pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 이러한 담체 또는 희석제의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 리포솜 및 고정 오일과 같은 비수성 운반체도 사용될 수 있다. 보조 활성 화합물도 상기 조성물에 포함될 수 있다. 약제학적 담체는 식염수, 덱 스트로스 용액 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액과 같이 NK 세포에 적합한 것이어야 한다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물에 대한 약제학상 허용되는 담체 또는 운반체는 살아있는 NK 세포의 투여를 허용하기에 충분한 시간 동안 NK 세포가 유지되거나 생존할 수있는 임의의 무독성 수용액이다. 예를 들어, 약제학상 허용되는 담체 또는 운반체는 식염수 또는 완충 식염수 일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 운반체는 또한 NK 세포의 효율을 증가시킬 수 있는 다양한 생 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어 세포 운반체 및 담체에는 폴리(옥시에틸렌)/폴리(D, L-젖산-코-글리코산)(Poly(oxyethylene)/poly(D, L- lactic acid-co-glycolic acid))(B. Jeong, KM Lee, A. Gutowska, YH An, Biomacromolecules 3, 865, 2002, 이는 전체가 본원에 참고로 포함됨), P(PF-co-EG) (Suggs L J, Mikos A G. Cell Trans, 8, 345, 1999, 이는 전체가 본원에 참조로 포함됨), PEO/PEG (Mann BK, Gobin AS, Tsai AT, Schmedlen RH, West J L., Biomaterials, 22, 3045, 2001; Bryant SJ, Anseth K S. Biomaterials, 22, 619, 2001, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), PVA (Chih-Ta Lee, Po-Han Kung and Yu-Der Lee, Carbohydrate Polymers, 61, 348, 2005, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 콜라겐 (Lee C R, Grodzinsky A J, Spector M., Biomaterials 22, 3145, 2001, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 알지네이트 (Bouhadir KH, Lee KY, Alsberg E, Damm KL, Anderson KW, Mooney D J. Biotech Prog 17, 945, 2001; Smidsrd O, Skjak-Braek G., Trends Biotech, 8, 71, 1990, 이들 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 뿐만 아니라, 메틸 셀룰로스 (M.C. Tate, D. A. Shear, S.W. Hoffman, D.G. Stein, M.C. LaPlaca, Biomaterials 22, 1113, 2001, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), 키토산 (Suh JKF, Matthew HW T. Biomaterials, 21, 2589, 2000; Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford DS, et al., J Biomed Mater Res, 51, 586, 2000, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), N-이소프로필아크릴아미드공중합체 P (N-isopropylacrylamide copolymer P, NIPAM-co-AA) (Y. H. Bae, B. Vernon, C. K. Han, S. W. Kim, J. Control. Release 53, 249, 1998; H. Gappa, M. Baudys, J. J. Koh, S. W. Kim, Y. H. Bae, Tissue Eng. 7, 35, 2001, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함됨)와 같은 다당류가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트와 같은 NK 세포는 유효량으로 조성물에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 유효량의 g-NK 세포, 예컨대 FcRγneg 세포 또는 이의 g-NK 대리 마커 프로파일을 갖는 세포를 함유한다. 세포의 유효량은 환자뿐만 아니라 질환의 유형, 중증도 및 정도에 따라 달라질 수 있다. 따라서 의사는 대상체의 건강, 질환의 정도와 중증도 및 기타 변수를 고려한 후 유효량을 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 조성물 중 이러한 세포의 수는 치료적 유효량(therapeutically effective amount)이다. 일부 구현예에서, 상기 양(amount)은 동물에서 암, 바이러스 감염, 미생물 감염 또는 패혈성 쇼크와 관련된 중증도, 기간 및/또는 증상을 감소시키는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 상기 조성물을 투여하지 않은 환자 (또는 동물) 또는 환자 그룹 (또는 동물들)에서 암의 성장 또는 확산과 비교하여 본원에 기술된 조성물이 투여된 환자 또는 동물에서 암의 성장 또는 확산을 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 25%, 적어도 35%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, by 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지 감소시키는 용량이다. 일부 구현예에서, 상기 치료적 유효량은 암, 바이러스 및 미생물 세포의 성장을 억제 또는 감소시키는 활성을 초래하는 세포 독성 활성을 초래하는 양이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 105 또는 약 105 내지 1012 또는 약 1012의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 105 또는 약 105 내지 108 또는 약 108의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 106 또는 약 106 내지 1012 또는 약 1012의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트인 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세포의 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 105 또는 약 105 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 106 또는 약 106 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 107 또는 약 107 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 108 또는 약 108 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 109 또는 약 109 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 1010 또는 약 1010 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 1011 또는 약 1011 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 1012 또는 약 1012 이상의 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 양은 질환 또는 병태를 갖는 대상체, 예컨대 암 환자에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 105 또는 약 105 내지 1012 또는 약 1012 g-NK 세포, 또는 105 또는 약 105 내지 108 또는 약 108 g-NK 세포, 또는 106 또는 약 106 내지 1012 또는 약 1012 g-NK 세포, 또는 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 g-NK 세포, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 g-NK 세포인 g-NK 세포량을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 구현예는 105 이상 또는 약 105 이상의 g-NK 세포, 106 이상 또는 약 106 이상의 g-NK 세포, 이상 또는 107 약 107 이상의 g-NK 세포, 108 이상 또는 약 108 이상의 g-NK 세포, 109 이상 또는 약 109 이상의 g-NK 세포, 1010 이상 또는 약 1010 이상의 g-NK 세포, 1011 이상 또는 약 1011 이상의 g-NK 세포, 또는 1012 이상 또는 약 1012 이상의 g-NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 양은 질환 또는 병태를 갖는 대상체, 예컨대 암 환자에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 부피는 적어도 또는 적어도 약 10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL 또는 500 mL, 예컨대 10 mL 내지 500mL, 약 10 mL 내지 500mL, 10mL 내지 200mL, 약 10mL 내지 200mL, 10mL 내지 100mL, 약 10mL 내지 100mL, 10mL 내지 50mL, 약 10mL 내지 50mL, 50mL 내지 500mL, 약 50mL 내지 500mL, 50mL 내지 200mL, 약 50mL 내지 200mL, 50mL 내지 100mL, 약 50mL 내지 100mL, 100mL 내지 500mL, 약 100mL 내지 500mL, 100mL 내지 200mL, 약 100mL 내지 200mL, 200 mL 내지 500 mL, 또는 약 200 mL 내지 500 mL (각각 포함)이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 또는 적어도 약 1 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL의 세포 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포 밀도는 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 106 세포/mL, 약 1 x 105 세포/mL 내지 1 x 106 세포/mL, 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 1 x 107 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL, 또는 약 1 x 107 세포/mL 내지 1 x 108 세포/mL (각각 포함)이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물을 포함하는 상기 조성물은 멸균된다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 분리 또는 농축은 예를 들어 오류, 사용자 취급 및/또는오염을 최소화하기 위하여 폐쇄 또는 멸균 환경에서 수행된다. 일부 구현예에서, 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
또한 제공된 NK 세포를 동결 보존하기에 적합한 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결 보호제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 동결 보호제는 DMSO 및/또는 s 글리세롤이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 보존을 위해 제형화된 조성물은 저온, 예컨대, 초저온, 예를 들어 -40 ℃내지 -150 ℃의 온도 범위, 예를 들어 80 ℃± 6.0 ℃ 또는 약 80 ℃± 6.0 ℃로 저장될 수있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 환자에게 투여되기 전에 초저온에서 보존 될 수 있다. 일부 관점에서, 상기 g-NK 세포와 같은 NK 세포 서브세트는, 예컨대 상기 제공되는 방법에 따라, 분리, 처리 및 증식될 수 있고, 이어서 대상체에게 투여되기 전에 초저온에서 저장될 수 있다.
초저온에서 소규모로 보존하기 위한 전형적인 방법이 예를 들어 미국특허번호 6,0168,991에 기재되어 있다. 소규모의 경우, 세포는 미리 냉각된 5% 인간 알부민 혈청 (HAS)에 저밀도 현탁액 (예: 약 200 x 106/ml 농도)으로 초저온에서 보존 할 수 있다. 동일한 양의 20% DMSO를 HAS 솔루션에 추가될 수 있다. 혼합물의 분취량을 바이알에 넣고 약 -80℃의 초저온 챔버에서 밤새 동결시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 동결 보존된 NK 세포가 해동에 의한 투여를 위해 제조된다. 일부 경우에, 상기 NK 세포는 해동 직후 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 상기 조성물은 추가 처리없이 즉시 사용 가능하다. 다른 경우에, 상기 NK 세포는 해동 후, 예를 들어 약제학상 허용되는 담체를 사용한 재현탁, 활성화 또는 자극제와의 인큐베이션에 의해 추가로 처리되거나, 대상체에게 투여되기 전에 활성화되어 세척되고 약제학상 허용되는 완충액에 재현탁된다.
Ⅳ. 치료방법
본원에서는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위하여 본원에 기재된 g-NK 세포를 포함하는 상기 제공되는 세포 조성물에 관한 방법 및 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 조성물, 예컨대 g-NK 세포를 포함하는 조성물 중 임의의 것을 이를 필요로하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 병태를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본원에서 제공되는 방법에 의해 생산된다. 이러한 방법 및 용도는 예를 들어, 질환(disease), 병태(condition) 또는 장애(disorder)를 갖는 대상체에게 치료 세포 또는 이를 함유하는 조성물의 투여를 포함하는 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 경우에, 상기 질환이나 장애는 종양이나 암이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 또는 이의 약제학적 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 효과가 있는 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에서, 그리고 이러한 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 세포 또는 이의 약제학적 조성물의 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이로써 대상체의 질환 또는 병태 또는 장애를 치료한다.
일부 구현예에서, 상기 치료 방법 또는 용도는 상기 제공되는 방법에 의해 생산된 증식된 NK 세포의 조성물을 함유하는 조성물의 유효량을 개체로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 105 또는 약 105 내지 1012 또는 약 1012, 또는 105 또는 약 105 내지 108 또는 약 108, 또는 106 또는 약 106 내지 1012 또는 약 1012, 또는 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 의 이러한 증식된 NK 세포가 개별 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 이러한 증식된 NK 세포의 105 또는 105 이상 또는 약 105 이상, 106 또는 106 이상 또는 약 106 이상, 107 또는 107 이상 또는 약 107 이상, 106 또는 106 이상 또는 약 106 이상, 109 또는 109 이상 또는 약 109 이상, 1010 또는 1010 이상 또는 약 1010 이상, 1011 또는 1011 이상 또는 약 1011 이상, 또는 1012 또는 1012 이상 또는 약 1012 이상를 함유하는 세포의 용량이 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, kg 당 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 의 이러한 증식된 NK 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 치료 방법 또는 용도는 섹션 III에 기재된 임의의 것을 포함하여 상기 제공되는 임의의 NK 세포 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 임의의 조성물로부터 105 또는 약 105 내지 1012 또는 약 1012, 또는 105 또는 약 105 내지 108 또는 약 108, 또는 106 또는 약 106 내지 1012 또는 약 1012, 또는 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 의 NK 세포가 개별 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 임의의 조성물로부터 105 또는 105 이상 또는 약 105 이상, 106 또는 106 이상 또는 약 106 이상, 107 또는 107 이상 또는 약 107 이상, 106 또는 106 이상 또는 약 106 이상, 109 또는 109 이상 또는 약 109 이상, 1010 또는 1010 이상 또는 약 1010 이상, 1011 또는 1011 이상 또는 약 1011 이상, 또는 1012 또는 1012 이상 또는 약 1012 이상의 NK 세포를 함유하는 세포 용량이 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, kg 당 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 의 상기 제공되는 임의의 NK 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 치료 방법 또는 용도는 NKG2Cpos 세포 집단 또는 이의 서브세트를 함유하는 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 105 또는 약 105 내지 1012 또는 약 1012 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 105 또는 약 105 내지 108 또는 약 108 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 106 또는 약 106 내지 1012 또는 약 1012 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 NKG2Cpos 세포 또는 이의 서브세트가 투여된다. 일부 구현예에서, 108 또는 108 또는 약 108 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 108 또는 108 또는 약 108 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 106 또는 106 또는 약 106 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 107 또는 107 또는 약 107 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 108 또는 108 또는 약 108 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 109 또는 109 또는 약 109 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 1010 또는 1010 또는 약 1010 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 1011 또는 1011 또는 약 1011 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트, 또는 1012 또는 1012 또는 약 1012 이상의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트를 함유하는 세포 용량이 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, kg 당 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 의 NKG2Cpos 또는 이의 서브세트가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 치료 방법 또는 용도는 g-NK 세포를 함유하는 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 105 또는 약 105 내지 1012 또는 약 1012 g-NK 세포, 또는 105 또는 약 105 내지 108 또는 약 108 g-NK 세포, 106 또는 약 106 내지 1012 또는 약 1012 g-NK 세포, 또는 108 또는 약 108 내지 1011 또는 약 1011 g-NK 세포, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 g-NK 세포가 투여된다. 일부 구현예에서, 108 또는 108 또는 약 108 이상의 g-NK 세포, 108 또는 108 또는 약 108 이상의 g-NK 세포, 106 또는 106 또는 약 106 이상의 g-NK 세포, 107 또는 107 또는 약 107 이상의 g-NK 세포, 108 또는 108 또는 약 108 이상의 g-NK 세포, 109 또는 109 또는 약 109 이상의 g-NK 세포, 1010 또는 1010 또는 약 1010 이상의 g-NK 세포, 1011 또는 1011 또는 약 1011 이상의 g-NK 세포, 또는 1012 또는 1012 또는 약 1012 이상의 g-NK 세포를 함유하는 세포 용량이 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, kg 당 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 의 g-NK 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 임의의 치료방법 또는 용도에 따른 투여 용량은 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg, 예컨대, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 105 세포/kg 또는 약 7.5 x 105 세포/kg, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg, 1 x 105 세포/kg 또는 약 1 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 105 세포/kg 또는 약 7.5 x 105 세포/kg, 2.5 x 105 세포/kg 또는 약 2.5 x 105 세포/kg 내지 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg, 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg, 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg, 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg, 5 x 105 세포/kg 또는 약 5 x 105 세포/kg 내지 7.5 x 105 세포/kg 또는 약 7.5 x 105 세포/kg, 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg, 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg, 1 x 106 세포/kg 또는 약 1 x 106 세포/kg 내지 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg, 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg 내지 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 2.5 x 106 세포/kg 또는 약 2.5 x 106 세포/kg 내지 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg, 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg, 5 x 106 세포/kg 또는 약 5 x 106 세포/kg 내지 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg, 7.5 x 106 세포/kg 또는 약 7.5 x 106 세포/kg 내지 1 x 107 세포/kg 또는 약 1 x 107 세포/kg이다. 일부 구현예에서, 상기 용량은 g-NK 세포 또는 g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포 서브세트, 예컨대 본원에 기재된 임의의 NK 세포 서브세트, 의 수 또는 전술한 임의의 것들 중의 생존한 세포의 수로 제공된다. 임의의 상기 구현예에서, 상기 용량은 상기 제공되는 방법에 의해 생산된 증식된 세포의 조성물 내의 세포의 수, 또는 전술한 임의의 것들 중의 생존한 세포의 수로 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 임의의 치료방법 또는 용도에 따른 투여 용량은 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 예컨대, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 5 x 108 또는 약 5 x 108, 5 x 107 또는 약 5 x 107 내지 1 x 108 또는 약 1 x 108, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 5 x 108 또는 약 5 x 108, 5 x 108 또는 약 5 x 108 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 5 x 108 또는 약 5 x 108 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 5 x 108 또는 약 5 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 5 x 109 또는 약 5 x 109, 또는 5 x 109 또는 약 5 x 109 내지 10 x 109 또는 약 10 x 109이다. 일부 구현예에서, 상기 용량은 g-NK 세포 또는 g-NK 세포에 대한 대리 마커와 연관되거나 이를 포함하는 NK 세포 서브세트, 예컨대 본원에 기재된 임의의 NK 세포 서브세트,의 수 또는 전술한 임의의 것들 중의 생존한 세포의 수로 제공된다. 임의의 상기 구현예에서, 상기 용량은 상기 제공되는 방법에 의해 생산된 증식된 세포의 조성물 내의 세포의 수, 또는 전술한 임의의 것들 중의 생존한 세포의 수로 제공된다.
일부 구현예에서, 증식된 NK 세포를 함유하는 조성물은 상기 제공된 방법에 따라 증식 직후에 개체에게 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 증식된 NK 세포는 투여 전 배양에서의 성장, 예컨대 상기 기재된 방법에 의해 저장 또는 증식된다. 예를 들어, NK 세포는 개체에게 투여하기 전 6, 12, 18 또는 24 개월 이상 동안 저장 될 수 있다.
일부 구현예에서, g-NK 세포와 같은 NK 세포 및 그의 서브세트를 함유하는 상기 제공되는 조성물은 피하, 근육 내, 정맥 내 및/또는 경막 외(epidural) 투여 경로와 같은 비경구 경로를 포함하는 임의의 편리한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수있다.
상기 제공되는 NK 세포 및 이의 서브세트, 예컨대 g-NK 세포, 및 조성물은 종양 또는 과다증식성 장애(hyperproliferative disorder) 또는 바이러스 감염, 효모 감염, 진균 감염, 원생동물 감염 및/또는 박테리아 감염과 같은 미생물 감염을 가진 개체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 제공되는 NK 세포 및 이의 서브세트, 예컨대 g-NK 세포, 및 조성물로 대상체를 치료하는 개시된 방법은 항종양 항원(anti-tumor antigen) 또는 항암 항체, 항바이러스 항체, 항박테리아 항체와 같은 치료용 단일클론 항체와 병용(combination)될 수 있다. 상기 제공되는 NK 세포 및 이의 서브세트, 예컨대, g-NK 세포, 및 조성물은 예컨대, 포유동물, 예를 들어 인간 대상체와 같은 동물의 치료를 위해 투여될 수 있다.
일부 예에서, 상기 방법은 혈액 악성 종양 또는 고형 종양과 같은 과다증식성 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 조성물로 치료할 수 있는 암 및 증식성 장애 유형의 예는 백혈병(예: 골수모세포(myeloblastic), 전골수구(promyelocytic), 골수단핵구(myelomonocytic), 단핵구(monocytic), 적혈구 백혈병(erythroleukemia), 만성 골수구 (과립구) 백혈병(chronic myelocytic (granulocytic) leukemia) 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)), 림프종 (예: 호치킨병(Hodgkin's disease) 및 비호치킨병(non-Hodgkin's disease), 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종( myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골육종(osteogenic sarcoma) 혈관육종(angiosarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 결장암(colon carcinoma), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(breast cancer), 난소 암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 간종(hepatoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁 경부암(cervical cancer), 자궁암(uterine cancer), 고환 종양(testicular tumor), 폐암종(lung carcinoma), 소세포 폐암종(small cell lung carcinoma), 방광암종(bladder carcinoma), 상피암종(epithelial carcinoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 희소돌기교종(oligodendroglioma), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 이형성증(dysplasia) 및 과증식증(hyperplasia)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 암의 치료 및/또는 예방에는 암과 관련된 하나 이상의 증상 완화, 암 진행의 억제 또는 감소, 암 퇴행 촉진, 및/또는 면역 반응 촉진이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 예에서, 상기 방법은 체내 바이러스의 존재로 인한 감염과 같은 바이러스 감염을 치료하는 것을 포함한다. 바이러스 감염에는 만성 또는 지속적인 바이러스 감염이 포함되며, 이는 숙주를 감염시키고 치명성을 나타내기 전 장기간 (보통 몇 주, 몇 달 또는 몇 년)에 걸쳐 숙주의 세포 내에서 번식할 수 있는 바이러스 감염이다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 만성 감염을 일으키는 바이러스는 예를 들어 인간 유두종 바이러스 (HPV), 단순 헤르페스 및 기타 헤르페스 바이러스, B 형 및 C 형 간염 바이러스 및 기타 간염 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 및 홍역 바이러스, 중요한 임상 질환을 일으킬 수 있는 모든 바이러스를 포함한다. 장기간의 감염은 궁극적으로 환자에게 치명적일 수 있는 질환, 예를 들어 C 형 간염 바이러스의 경우 간암,으로 이어질 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 만성 바이러스 감염은 Epstein Barr 바이러스 (EBV) 뿐만 아니라 종양과 관련될 수 있는 것과 같은 다른 바이러스를 포함한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법으로 치료 또는 예방될 수 있는 바이러스 감염의 예는 레트로 바이러스 (예: 인간 T-세포 림프 영양 바이러스 (human T-cell lymphotrophic virus , HTLV) 유형 I 및 II 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)), 헤르페스 바이러스 (예: 단순 포진 바이러스 (HSV) 유형 I 및 II, 엡스타인-반 바이러스(Epstein-Ban virus) 및 거대 세포 바이러스(cytomegalovirus)), 아레나 바이러스(arenaviruses) (예: 라사 열 바이러스(lassa fever virus)), 파라믹소 바이러스(paramyxoviruses) (예: 모빌리 바이러스(morbillivirus), 인간 호흡기 세포 융합 바이러스(human respiratory syncytial virus) 및 뉴모바이러스(pneumovirus)), 아데노바이러스(adenoviruses), 부냐 바이러스(bunyaviruses) (예: 한타 바이러스(hantavirus)), 코로나 바이러스(cornaviruses), 필로 바이러스(filoviruses) (예: 에볼라 바이러스(Ebola virus)), 플라비 바이러스(flaviviruses) (예: C형 간염 바이러스 (HCV), 황열병 바이러스(yellow fever virus) 및 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)), 헤파드나 바이러스(hepadnaviruses) (예: B형 간염 바이러스 (HBV)), 오르토미오 바이러스(orthomyoviruses ) (예: 센다이 바이러스(Sendai virus) 및 인플루엔자 바이러스 A, B 및 C), 파포바바이러스(papovaviruses) (예: 유두종 바이러스(papillomaviruses)), 피코르나바이러스(picornaviruses) (예: 리노바이러스(rhinoviruses), 엔테로바이러스(enteroviruses) 및 A형 간염 바이러스), 폭스 바이러스(poxviruses), 레오바이러스(reoviruses) (예: 로타바이러스(rotaviruses)), 토가바이러스(togaviruses) (예: 풍진 바이러스(rubella virus)) 및 랍도바이러스(rhabdoviruses) (예: 광견병 바이러스(rabies virus))에 의해 야기되는 바이러스 감염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방은 상기 감염과 관련된 하나 이상의 증상 완화, 바이러스 복제의 저해, 감소 또는 억제, 및/또는 면역 반응의 향상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 NK-세포 및 이의 서브세트, 예컨대 g-NK 세포, 및 조성물은 효모 또는 박테리아 감염의 치료방법에 사용된다. 예를 들어, 본원에 기술되는 상기 제공되는 g-NK 세포 및 조성물 및 방법은 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니에 (Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 고노로데아 (Neisseria gonorrhoea), 네이세리아 레닌기티디스 (Neisseria meningitidis), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 오카에네 (Klebsiella ozaenae), 클라시엘라 리노스클레로모티스 (Klebsiella rhinoscleromotis), 스타필로코커스 마우레우스 (Staphylococcus aureus), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 캠필로박터 (비브리오) 피터스 (Campylobacter (Vibrio) fetus), 캠필로박터 레루니(Campylobacter jejuni), 아에로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 에드와드시엘라 타르다 (dwardsiella tarda), 예르시니아 엔테로코리티카 (Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 예르시니아 슈도투베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 시겔라 디센테리에 (Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 소네이 (Shigella sonnei), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 트레포네마 페르테뉴 (Treponema pertenue), 트레포네마 카라테네움 (Treponema carateneum), 보렐리아 빈센티 (Borrelia vincentii), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 렙토스피라 익테로헤모라지에 (Leptospira icterohemorrhagiae), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii), 뉴모시스티스 카리니 (Pneumocystis carinii), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 브루셀라 아보cm (Brucella aborts), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis), 미코플라스마 spp. (Mycoplasma spp.), 리켓시아 프로와제키 (Rickettsia prowazeki), 리켓시아 쯔쯔가무시 (Rickettsia tsutsugumushi), 클라미디아 spp. (Chlamydia spp.), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 또는 이의 조합과 관련된 감염을 치료할 수 있다.
A. 병용 요법(Combination Therapy)
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 g-NK 세포를 함유하는 조성물은 대상체의 질환 또는 병태를 치료하기 위한 하나 이상의 다른 제제(agent)와 병용 요법으로 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 g-NK 세포를 함유하는 조성물은 하나 이상의 다른 제제의 투여 전, 동시에 또는 후속으로 (후에) 투여될 수 있다. 예를 들어, g-NK 세포는 항 미생물제, 항 바이러스제 및 기타 치료제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예시적인 병용 요법은 다음 하위 섹션에 설명되어 있다.
1. 항체 병용 (Antibody Combination)
일부 구현예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 g-NK 세포를 함유하는 조성물은 기존 NK 세포와 비교하여 항체 또는 Fc 함유 단백질에 의해 활성화되거나 접촉될 때 향상된 활성을 나타낸다. 예를 들어, g-NK 세포는 CD16의 항체 매개 가교되거나 항체 코팅된 종양 세포에 의해 활성화 될 수 있다.
일부 구현예에서, g-NK 세포 또는 이의 조성물 및 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 개체의 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 당업자는 개체의 특정 질환이나 병태에 따라, 본원에 기재된 상기 제공되는 g-NK 세포 및 조성물과 함께 대상체에게 투여하기 위한 적절한 치료적 (예를 들어, 항암) 단일클론 항체를 선택할 수 있다. 적합한 항체는 다중클론, 단일클론, 단편(예: Fab 단편), 단일 사슬 항체 및 기타 형태의 특이적 결합 분자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 항체는 인간화 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비인간 항체의 인간화 형태는 비인간 Ig에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 Ig들, Ig 사슬 또는 단편(예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서브 서열)이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함한다.
일반적으로, 인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입(import)" 잔기로 지칭되며, 일반적으로 "수입(import)" 가변 도메인에서 가져온다. 인간화는 인간 항체의 해당 서열을 설치류 CDR들 또는 CDR 서열로 대체하여 수행된다 (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988). 이러한 "인간화(humanized)" 항체는 키메라 항체 (1989)이며, 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 수가 비인간 종의 상응하는 서열로 대체되었다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하면 일부 Fc 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 인간화 항체에는 수여자의 상보적 결정 영역 (CDR)의 잔기가 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 원하는 특이성, 친 화성 및 능력(capacity)을 갖는, 비인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 항체 (수여자 항체)가 포함된다. 일부 경우에, 상응하는 비-인간 잔기는 인간 항체의 Fv 프레임워크 잔기를 대체한다. 인간화 항체는 수여자 항체나 수입 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모두 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함하며, CDR 영역의 전부는 아니더라도 대부분은 비인간 Ig의 영역에 대응하고 FR 영역의 전부는 아니지만 대부분은 인간 항체 컨센서스 서열의 영역이다. 인간화 항체는 또한 항체 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 항체의 부분을 최적으로 포함한다 (Jones et al., 1986; Presta, 1992; Riechmann et al., 1988).
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리 (Hoogenboom et al., 1991; Marks et al., 1991) 및 인간 mAb의 제조 (Boerner et al., 1991; Reisfeld and Sell, 1985)를 포함한 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 유사하게, 내재적 항체 유전자(endogenous antibody gene)가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 트랜스제닉 동물에 인간 Ig 유전자를 도입하여 인간 Ab를 합성할 수 있다. 공격(challenge) 하에서, 인간 항체 생산이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 측면에서 인간에서 볼 수 있는 것과 매우 유사하다 (1997a; 1997b; 1997c; 1997d; 1997; 1997; Fishwild et al., 1996; 1997; 1997; 2001; 1996; 1997; 1997; 1997; Lonberg and Huszar, 1995; Lonberg et al., 1994; Marks et al., 1992; 1997; 1997; 1997).
구체적으로, 본 발명의 세포는 종양 관련 항원을 인식하는 항체를 투여함으로써 종양을 표적으로 할 수 있다. 당업자는 본 g-NK 세포가 종양 관련 항원을 인식하는 다양한 항체와 함께 사용하기에 적합하다는 것을 이해할 것이다. 종양 관련 항원의 비제한적인 예는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린( mesothelin), α-태아 단백질(α-fetoprotein), 뮤신, PDGFR-알파, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-알파, 포스파티딜 세린(phosphatidylserine), 신데칸 1(Syndecan 1), SLAMF7(CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 포함한다. 일부 경우에, 상기 항체는 항-CD20 항체 (예: 리툭시맙), 항-HER2 항체 (예: 세툭시맙), 항-CD52 항체, 항-EGFR 항체 및 항 -CD38 항체 (예: 다라투무맙)이고, 항-SLAMF7 항체 (예: 엘로투주맙)이다.
g-NK 세포를 포함하는 세포 조성물과의 병용 요법에서 상기 제공되는 방법에 사용될 수 있는 비제한적 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab, Herceptin®), 라무시루맙(Ramucirumab, Cyramza®), 아테졸리주맙(Atezolizumab, Tecentriq™), 니볼루맙(Nivolumab, Opdivo®), 두르발루맙(Durvalumab, Imfinzi™), 아벨루맙(Avelumab, Bavencio®), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab, Keytruda®), 베바시주맙(Bevacizumab, Avastin®), 에베로리무스(Everolimus, Afinitor®), 페르투주맙(Pertuzumab, Perjeta®), 아도-트라스투주맙 엠타신(ado-Trastuzumab emtansine, Kadcyla®), 세툭시맙(Cetuximab, Erbitux®), 데노수맙(Denosumab, Xgeva®), 리툭시맙(Rituximab, Rituxan®), 알렘투주맙(Alemtuzumab, Campath®), 오파투무맙(Ofatumumab, Arzerra®), 오비누투주맙(Obinutuzumab, Gazyva®), 네시투무맙(Necitumumab, Portrazza™), 이브리투모맙 티우세탄(Ibritumomab tiuxetan, Zevalin®), 브렌투시맙 베도틴(Brentuximab vedotin, Adcetris®), 실툭시맙(Siltuximab, Sylvant®), 보르테조밉(Bortezomib, Velcade®), 다라투무맙(Daratumumab, Darzalex™), 엘로투주맙(Elotuzumab, Empliciti™), 디누툭시맙(Dinutuximab, Unituxin™), 올라라투맙(Olaratumab, Lartruvo™), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 이자툭시맙(Isatuximab), 트룩시마(Truxima), 블리트지마(Blitzima), 리템비아(Ritemvia), 리투제나(Rituzena), 헤르제마(Herzuma), 룩시엔스(Ruxience), ABP 798, 칸진티(Kanjinti), 오기브리(Ogivry), BI 695500, 노벡스(Novex, RTXM83), 토시투모맙(Tositumomab) 또는 온트루잔트 (Ontruzant), 또는 이의 바이오시밀러를 포함한다. 예시적인 항체는 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 알레투주맙(aletuzumab), 세르툭시맙(certuximab), 다라투무맙(daratumumab), 벨투주맙(veltuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 유블리툭시맙(ublituximab), 오카라투주맙(ocaratuzumab) 또는 엘로투주맙(elotuzumab)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항체는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체일 수 있다. PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 항체는 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab) 또는 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
선택되는 암 유형에 특이적인 항체가 선택될 수 있으며, 암 치료용으로 승인 된 임의의 항체를 포함한다. 그 예로는 유방암의 경우 트라스투주맙 (trastuzumab, Herceptin), 림프종의 경우 리툭시맙 (rituximab, Rituxan), 두경부 편평세포 암종의 경우 세툭시맙 (cetuximab, Erbitux)이 있다. 숙련된 기술자는 특정 종양 또는 질환 항원에 결합 할 수있는 FDA 승인 단일클론 항체에 익숙하며, 이들 중 임의의 것이 종양 또는 질환을 치료하기 위해 제공된 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 위 또는 위식도 접합부(gastroesophageal junction)의 선암(adenocarcinoma)을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab, Herceptin®) 또는 라무시루맙(Ramucirumab, Cyramza®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 방광암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab, Tecentriq™), 니볼루맙(Nivolumab, Opdivo®), 두르발루맙(Durvalumab, Imfinzi™), 아벨루맙(Avelumab, Bavencio®) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab, Keytruda®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 뇌암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 베바시주맙 (Bevacizumab, Avastin®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 유방암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 트라스투주맙 (Trastuzumab, Herceptin®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 자궁 경부암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 베바시주맙 (Bevacizumab, Avastin®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 결장암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 세툭시맙 (Cetuximab, Erbitux®), 파니투무맙 (Panitumumab, Vectibix®), 베바시주맙 (Bevacizumab, Avastin®) 또는 라무시루맙 (Ramucirumab, Cyramza®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 내분비/신경내분비 종양을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 아벨루맙(Avelumab, Bavencio®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 두경부암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 세툭시맙 (Cetuximab, Erbitux®), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab, Keytruda®), 니볼루맙 (Nivolumab, Opdivo®), 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 라무시루맙(Ramucirumab)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 골암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 데노수맙 (Denosumab, Xgeva®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 신장암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 베바시주맙 (Bevacizumab, Avastin®) 또는 니볼루맙 (Nivolumab, Opdivo®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 백혈병을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 리툭시맙 (Rituximab, Rituxan®), 알레무투주맙(Alemtuzumab, Campath®), 오파투무맙(Ofatumumab, Arzerra®), 오비누투주맙(Obinutuzumab, Gazyva®) 또는 블리나투모맙(Blinatumomab, Blincyto®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 폐암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 베바시주맙 (Bevacizumab, Avastin®), 라무시루맙 (Ramucirumab, Cyramza®), 니볼루맙 (Nivolumab, Opdivo®네시투무맙 (Necitumumab, Portrazza™), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab, Keytruda®) 또는 아테졸리주맙(Atezolizumab, Tecentriq ™)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 림프종을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 이브리투모맙 티우세탄 (Ibritumomab tiuxetan, Zevalin®), 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin, Adcetris®), 리툭시맙(Rituximab, Rituxan®), 실툭시맙(Siltuximab, Sylvant®), 오비누투주맙(Obinutuzumab, Gazyva®), 니볼루맙(Nivolumab, Opdivo®) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab, Keytruda®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 다발성 골수종을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 보르테조밉(Bortezomib, Velcade®), 다라투무맙(Daratumumab, Darzalex™) 또는 엘로투주맙(Elotuzumab, Empliciti™)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 신경 모세포종을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 디누툭시맙 (Dinutiximab, Unituxin™)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 난소상피/나팔관/원발성 복막암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 베바시주맙 (Bevacizumab, Avastin®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 췌장암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 세툭시맙(Cetuximab, Erbitux®또는 베바시주맙(Bevacizumab, Avastin®이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 피부암을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 이필리무맙(Ipilimumab, Yervoy®), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab, Keytruda®), 아벨루맙(Avelumab, Bavencio®) 또는 니볼루맙 (Nivolumab, Opdivo®)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 연조직 육종을 치료하기 위한 것이고, 상기 항체는 올라라투맙(Olaratumab, Lartruvo™)이다.
상기 g-NK 세포 및 추가 작용제는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 추가 작용제는 g-NK 세포의 투여 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 추가 작용제는 g-NK 세포의 투여 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 g-NK 세포는 선택된 암 유형에 특이적인 항체와 동시에 투여 될 수 있다. 대안적으로, g-NK 세포는 선택된 암 유형에 특이적인 항체가 투여되는 시간과 구별되는 선택된 시간에 투여될 수 있다.
특정 예에서, 상기 대상체는 g-NK 세포 집단 전, 후 또는 실질적으로 동시에 유효량의 항체를 투여받는다. 일부 예에서, 상기 대상체는 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mgg/gkg의 항체 (예컨대, 약 0.5-10 mg/kg, 약 1-20 mg/kg, 약 10-50 mg/kg, 약 20-100mg/kg, 예를 들어 약 0.5mg/kg, 약 1mg/kg, 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 약 5mg/kg, 약 8mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 16 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 24 mg/kg, 약 36 mg/kg, 약 48 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 75 mg/kg, 또는 약 100mg/kg)의 항체를 투여받는다. 항체의 유효량은 특정 항체, 특정 질환 또는 병태 (예: 종양 또는 기타 장애), 대상체의 일반적인 병태, 대상체가 받고 있거나 이전에 받은 임의의 추가 치료 및 다른 관련 인자를 고려하여 숙련된 임상의에 의해 선택될 수 있다. 대상체에게 또한 본원에 기재된 g-NK 세포 집단이 투여된다. 항체 및 g-NK 세포 집단 모두는 전형적으로 비경구, 예를 들어 정맥 내로 투여된다; 그러나, 종양 또는 종양에 가까운 주사 또는 주입 (국소 투여) 또는 복강으로의 투여도 사용될 수 있다. 당업자는 적절한 투여 경로를 결정할 수 있다.
2. 사이토카인 또는 성장 인자
본원에서 제공되는 일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포는 사이토카인 및/또는 성장 인자와 병용하여 개체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 적어도 하나의 성장 인자는 SCF, FLT3, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택되는 성장 인자를 포함한다. 특정 구현예에서 재조합 IL-2가 대상체에게 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 재조합 IL-15가 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, g-NK 세포 및 사이토카인 또는 성장 인자는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, g-NK 세포를 먼저 투여한 다음 사이토카인 및/또는 성장 인자를 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, g-NK 세포는 사이토카인 또는 성장인자와 동시에 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 NK 세포의 생존 및/또는 성장을 지원하기 위해 하나 이상의 사이토카인(예: IL-2, IL-15, IL-21 및/또는 IL-12)이 투여된다. 상기 사이토카인(들)은 NK 세포 전, 후 또는 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 상기 사이토카인(들)은 NK 세포 후에 투여 될 수있다. 하나의 특정 예에서, 사이토카인(들)은 NK 세포 투여 약 1-8 시간 이내에 (예를 들어, 약 1-4 시간, 약 2-6 시간, 약 4-6 시간 또는 약 5-8 시간) 대상체에게 투여된다. .
3. 화학요법제 및 다중양식 병용 요법
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 또한, 예컨대 화학요법제(Chemotherapeutic Agents) 또는 세포독성제 또는 다른 치료와 같은, 암 치료제 또는 치료와 함께 g-NK 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 또한 화학요법제와 병용하여 g-NK 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 화학요법제는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 플루다라빈(fludarabine), 메틸 프레드나손(methyl prednasone)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 화학요법 제는 탈리도마이드(thalidomide), 시스플라틴(cisplatin, cis-DDP), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 카보플라틴(carboplatin), 안트라센디온(anthracenediones), 미 톡산트론(mitoxantrone), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메틸히드라진 유도체(methylhydrazine derivatives), 프로카르바진(procarbazine, (N-메틸히드라진, MM((N-methylhydrazine, MM))), 부신피질 억제제(adrenocortical suppressants), 미토탄(mitotane, .omicron..rho.'- DDD), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), RXR 작용제(agonists), 벡사로텐(bexarotene), 티로신 키나제 억제제(tyrosine kinase inhibitors), 이마티닙(imatinib), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드( ifosfamide), 멜팔란 (melphalan, (L-사르콜리신(L- sarcolysin))), 클로람부실(chlorambucil), 에틸렌이민(ethylenimines), 메틸멜라민(methylmelamines), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 티오테파(thiotepa), 부설판(busulfan), 카르 무스틴(carmustine, BCNU), 세무스틴 (semustine, 메틸-CCNTJ), 로무스틴 (lomustine, CCNU), 스트렙토조신 (streptozocin, (스트렙토조토신(streptozotocin))), DNA 합성 길항제(DNA synthesis antagonists), 에스트라무 스틴 인산(estramustine phosphate), 트리아진(triazines), 다카르바진 (dacarbazine, OTIC, 디메틸-트리아제노이미다졸카르복사미드(dimethyl-triazenoimidazolecarboxamide)), 테모졸로미드(temozolomide), 엽산 유사체(folic acid analogs), 메토트렉세이트(methotrexate, (아메토프테린(amethopterin)), 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs), 플루오로우라신(fiuorouracin, (5-플루오로 우라실(5-fluorouracil), 5-FU, 5FTJ), 플록수리딘(floxuridine)(플루오로데옥스>' 우리딘(fluorodeox>'uridine), FUdR), 시타라빈(cytarabine, (사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside)), 젬시타빈(gemcitabine), 퓨린 유사체(purine analogs), 머캅토퓨린(mercaptopurine)(6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-MP), 티오구아닌 (thioguanine, 6-티오구아닌(6-thioguanine, TG), TG), 펜토스타틴 (pentostatin) (2'-데옥시코포르마이신(2'-deoxycoformycin), 데옥시코포마이신(deoxycoformycin)), 클라드리빈(cladribine) 및 플루다라빈(fludarabine), 토포 아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitors), 암사크린(amsacrine), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 빈블라스틴(vinblastin, VLB), 빈크리스틴(vincristine), 탁산(taxanes), 파클리탁셀(paclitaxel), 나브-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 아브락산(Abraxane), 단백질 결합 파클리탁셀 (Abraxane(R)), 도세탁셀 (docetaxel)(Taxotere(R)),; 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 캄프토테신(camptothecins), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 닥티노마이신(dactinomycin) (악티노마이신 D(actinomycin D)), 다우노루비신(daunorubicin (다우노미신 (daunomycin), 루비도마이신(rubidomycin)), 독소루비신(doxorubicin), 리포좀 독소루비신 (독실)(Liposomal doxorubicin (Doxil)), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신(mitomycin)(미토마이신 C (mitomycin C)), 이다루비신(idarubicin), 에피루비 신(epirubicin), 부세렐린(buserelin), 아드레노코르티코스테로이드(adrenocorticosteroids), 프레드니손(prednisone), 프로게스틴(progestins), 하이드록시 프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 타목시펜(tamoxifen), 아나스트로졸(anastrozole); 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 플루타마이드(flutamide), 비칼루타마이드(bicalutamide) 및 류프롤라이드(leuprolide)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제은 세포 독성 소분자와 같은 세포 독성제(cytotoxic agent)이다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 면역 조절제, Bcl2 억제제, P13K 억제제, 소분자 프로테아좀 억제제, 소분자 티로신, 소분자 사이클린 의존성 키나제 억제제, 알킬화제, 항대사산물, 안트라실린, 항종양 항생제, 토포 아이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 코르티코스테로이드(corticosteroid) 또는 분화제(differentiating agent)이다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 면역 조절제이다. 일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 탈리도마이드(thalidomide) 또는 이의 유도체이다. 예를 들어, 일부 경우, 상기 항암제는 레날리도마이드(lenalidomide) 또는 포말리도마이드(Pomalidomide)이다. 일부 경우, 상기 암 치료제는 레날리도마이드(lenalidomide)이다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 Bcl-2 억제제이다. 예를 들어, 상기 암 치료제는 베네토클락스(Venetoclax) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 P13K 억제제이다. 예를 들어, 상기 암 치료제는 이델라이십(Idelaisib) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 소분자 티로신(small molecule tyrosie) 이다. 예를 들어, 상기 암 치료제는 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 사이클린 의존성 키나제 억제제(cyclein-dependent kinase inhibitor) 이다. 예를 들어, 상기 암 치료제는 세키시클립(Sekiciclib) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 알킬화제이다. 상기 알킬화제의 예는 알 트레타민(Altretamine), 부술판(Busulfan), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 다카르바진(Dacarbazine), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 테모졸로미드(Temozolomide) 또는 티오테파(Thiotepa)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 항 대사산물이다. 항 대사산물은 RNA와 DNA의 정상적인 빌딩 블록을 대체하여 DNA와 RNA 성장을 방해한다. 이 치료제는 세포의 염색체가 복제되는 단계에서 세포를 손상시킨다. 이들은 일반적으로 백혈병, 유방, 난소, 장관(intestinal tract)의 암 뿐만 아니라 다른 유형의 암을 치료하는 데 사용된다. 항 대사산물의 예는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 6-머 캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 케이프시타빈 (Capecitabine, Xeloda®), 시타라빈 (Cytarabine, Ara-C®), 플록수리딘 (Floxuridine), 플루다라빈(Fludarabine), 젬시타빈 (Gemcitabine, Gemzar®), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 메토트렉세이트(Methotrexate) 또는 페메트렉세드(Pemetrexed, Alimta®)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 안트라사이클린(antracycline)이다. 안트라사이클린 약물은 암 세포 내부의 DNA를 변경하여 암세포가 성장하고 증식하지 못하도록 한다. 안트라사이클린은 세포 주기 동안 DNA 복제와 관련된 효소를 방해하는 항 종양 항생제이다. 이들은 다양한 암에 널리 사용된다. 안트라사이클린 약물을 투여할 때의 주요 관심사는 고용량 투여시 심장에 영구적인 손상을 줄 수 있다는 것이다. 이러한 이유로 안트라사이클린 약물의 평생 복용량 제한이 적용되는 경우가 많다. 일부 경우에, Fcεγ결핍 NK 세포 (G-NK)와 함께 투여하면 이러한 약물의 용량과 일정을 줄일 수 있다. 상기 제공되는 병용 요법에 사용될 수 있는 안트라사이클린의 예에는 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신 (Doxorubicin, Adriamycin®), 에피루비신(Epirubicin) 또는 이다루비신(Idarubicin)이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 항 종양 항생제이다. 항 종양 항생제의 예는 액티노마이신-D(Actinomycin-D), 블레오마이신(Bleomycin), 미토마이신-C(Mitomycin-C) 또는 미톡산트론(Mitoxantrone)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 토포아이소머라제 억제제이다. 토포아이소머라제 약물은 DNA 가닥을 분리하여 복제할 수 있도록 도와주는 토포아이소머라제라고 하는 효소를 방해한다. 토포아이소머라제 억제제는 영향을 미치는 효소의 유형에 따라 분류다. 토포아이소머라제 억제제는 폐암, 난소암, 위장암 및 기타 암 뿐만 아니라 특정 백혈병을 치료하는데 사용된다. 토포아이소머라제 억제제는 토포아이소머라제 I 억제제 또는 토포아이소머라제 II 억제제일 수 있다. 토포아이소머라제 I 억제제의 예는 토포테칸(Topotecan) 또는 이리노테칸 (Irinotecan, CPT-11)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 토포아이소머라제 II 억제제의 예는 에토포사이드 (Etoposide, VP-16), 테니포사이드(Teniposide) 또는 미톡산트론(Mitoxantrone)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제는 유사분열 억제제이다. 유사분열 억제제는 새로운 세포를 형성하기 위하여 세포가 분열하는 것을 막아 효소가 세포 재생에 필요한 단백질을 생성하지 못하도록 하여 모든 단계에서 세포를 손상시킬 수 있는 화합물이다. 이들은 유방암, 폐암, 골수종, 림프종 및 백혈병을 포함한 다양한 유형의 암을 치료하는 데 사용된다. 이러한 약물은 신경 손상을 유발할 수 있어, 투여할 수 있는 양이 제한될 수 있다. 일부 경우에, Fcεγ결핍 NK 세포 (G-NK)와 함께 투여하면 이러한 약물의 용량과 일정을 줄일 수 있다. 유사분열 억제제의 비제한적인 예로는 도세탁셀(Docetaxel), 에스트라무스틴(Estramustine), 익사베필론(Ixabepilone), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine) 또는 비노렐빈(Vinorelbine)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제은 코르티코스테로이드(corticosteroid)이다. 종종 단순히 스테로이드라고 하는 코르티코스테로이드는 천연 호르몬 및 호르몬 유사 약물로, 여러 유형의 암 및 기타 질환 치료에 유용하다. 이러한 약물이 암 치료의 일부로 사용될 때, 이들은 화학요법제로 간주된다. 코르티코 스테로이드의 비제한적인 예는 프레드니손(Prednisone), 메틸프레드니솔론 (Methylprednisolone, Solumedrol®) 또는 덱사메타손(Dexamethasone, Decadron®)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제은 분화제(differentiating agent)이다. 분화제의 비제한적인 예는 레티노이드 (Retinoids), 트레티노인 (Tretinoin, ATRA 또는 Atralin®), 벡사로텐 (Bexarotene, Targretin®) 또는 비소 삼산화물 (Arsenic trioxide, Arsenox®)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 암 치료제은 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 암 치료제은 파클리탁셀(paclitaxel), 아브락산(Abraxane)(R) 및 탁소테레(Taxotere)(R)로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서, 상기 화학요법제는 아스파라기나제(asparaginase), 베바시주맙(bevacizumab), 블레오마이신(bleomycin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 히드록시우레아(hydroxyurea), 스트렙토조신(streptozocin) 및 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 젬시타빈(gemcitabine)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
g-NK 세포와 함께 사용하기 위한 암 치료제의 다른 비제한적인 예는 에베롤리무스(Everolimus (Afinitor®)), 토레미펜(Toremifene (Fareston®)), 펠베스트란트(Fulvestrant (Faslodex®)), 아나스트로졸(Anastrozole (Arimidex®)), 엑세메스탄(Exemestane (Aromasin®)), 라파티닙(Lapatinib (Tykerb®)), 레트로졸(Letrozole (Femara®)), 페르투주맙(Pertuzumab (Perjeta®)), 아도-트라스투주맙 엠타신(ado-Trastuzumab emtansine (Kadcyla®)), 팔보시클립(Palbociclib (Ibrance®)), 리보시크립(Ribociclib (Kisqali®)), 지브-아프리베르셉트(Ziv-aflibercept (Zaltrap®)), 레고라페닙(Regorafenib (Stivarga®)), 란레오티드 아세테이트(Lanreotide acetate (Somatuline®Depot)), 소라페닙(Sorafenib (Nexavar®)), 수니티닙(Sunitinib (Sutent®)), 파조파닙(Pazopanib (Votrient®)), 템시롤리무스(Temsirolimus (Torisel®)), 아시티닙(Axitinib (Inlyta®)), 카보잔티닙(Cabozantinib (Cabometyx™)), 렌바티닙 메실레이트(Lenvatinib mesylate (Lenvima®)), 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate (Gleevec®)), 다사티닙(Dasatinib (Sprycel®)), 닐로티닙(Nilotinib (Tasigna®)), 보수티닙(Bosutinib (Bosulif®)), 트레티노인(Tretinoin (Vesanoid®)), 이브루티닙(Ibrutinib (Imbruvica®)), 이델라리십(Idelalisib (Zydelig®)), 베네토클락스(Venetoclax (Venclexta™)), 포나티닙 하이드로클로라이드(Ponatinib hydrochloride (Iclusig®)), 미도스타우린(Midostaurin (Rydapt®)), 크리조티닙(Crizotinib (Xalkori®)), 에를로티닙(Erlotinib (Tarceva®)), 게피티닙(Gefitinib (Iressa®)), 아파티닙 디말레이트(Afatinib dimaleate (Gilotrif®)), 세리티닙(Ceritinib (LDK378/Zykadia™)), 오시머티닙(Osimertinib (Tagrisso™)), 알레티닙(Alectinib (Alecensa®)), 브리가티닙(Brigatinib (Alunbrig™)), 시람자(Cyramza), 데니루킨 디프티톡스(Denileukin diftitox (Ontak®)), 보리노스타트(Vorinostat (Zolinza®)), 로미뎁신(Romidepsin (Istodax®)), 벡사로텐(Bexarotene (Targretin®)), 보르테조밉(Bortezomib (Velcade®)), 프랄라트렉세이트(Pralatrexate (Folotyn®)), 이델랄리십(Idelalisib (Zydelig®)), 벨리노스타트(Belinostat (Beleodaq®)), 벤타무스틴(Bendamustine), 카르피조밉(Carfilzomib (Kyphosis®)), 파노비노스타트(Panobinostat (Farydak®)), 익사조밉 사이트레이트(Ixazomib citrate (Ninlaro®)), 올라파립(Olaparib (Lynparza™)), 루카파립 캄실레이트(Rucaparib camsylate (Rubraca™)), 니라파립 토실레이트 모노하이드레이트(Niraparib tosylate monohydrate (Zejula™)), 비노렐빈(Vinorelbine (Navelbine®)), 에를로티닙(Erlotinib (Tarceva®)), 수니티닙( Sunitinib (Sutent®)), 비스모데깁(Vismodegib (Erivedge®)), 소니데깁(Sonidegib (Odomzo®)), 베무라페닙(Vemurafenib (Zelboraf®)), 트라메티닙(Trametinib (Mekinist®)), 다브라페닙(Dabrafenib (Tafinlar®)), 코비메티닙(Cobimetinib (Cotellic™)), 알리트레티노인(Alitretinoin (Panretin®)), 파조파닙(Pazopanib (Votrient®)), 알리트레티노인(Alitretinoin (Panretin®)), 트라벡테딘(Trabectedin (Yondelis®)) 또는 에리불린(Eribulin (Halaven®))을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 g-NK 세포를 함유하는 조성물은 방사선 요법(adiation therapy)과 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 병용 요법은 본원에서 제공되는 바와 같은 g-NK 세포를 함유하는 조성물, 상기 기재된 임의의 항체와 같은 항체 및 세포 독성 소분자 또는 세포 독성 방사선 요법의 조합을 포함하는 복합 암 치료요법(multimodality cancer therapy)이다. 일부 구현예에서, 세포 독성 소분자 또는 방사선 요법은 g-NK 세포를 함유하는 조성물의 투여 전 또는 후와 같이 개별적으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 독성 소분자 또는 방사선 요법은 g-NK 세포를 함유하는 조성물과 동시에, 예를 들어 함께 또는 거의 동시에, 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 복합 암 치료요법은 추가 사이토카인 지원을 제공하기 위하여 하나 이상의 사이토카인 또는 IL-2 또는 IL-15와 같은 성장 인자의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
다중양식 암 치료요법(multimodality cancer therapy)은 하나 이상의 치료 방법을 결합한 요법이다. 다중양식 요법(multimodality therapy)은 병용 요법이라고도 한다. 다양한 암에 대하여 다양하고 효과적인 양식(modality)을 사용할 수 있다. 종양의 상이한 생물학과 다양한 용법의 효능은 각각에 대한 특정 접근 방식을 지시한다. 항체 기반 요법은 암 및 기타 질환 징후를 치료하는데 자주 사용된다. 항체 요법에 대한 반응은 종양 세포에 대한 이러한 항체의 직접적인 억제 효과에 초점을 맞추었지만, 이러한 항체가 숙주 면역 체계에 영향을 미치는 것으로 나타났다. Fcεγ결핍 NK 세포 (G-NK)는 항체의 Fc 수용체 (CD16)에 결합 될 때 ADCC를 매개하는 면역 이펙터 세포이다. 제공되는 구현예는 Fcεγ결핍 NK 세포 (G-NK)가 소분자 및/또는 방사선 요법의 첨가와 함께 병용되어 사용될 때 항체 요법의 개선된 효능을 입증하도록 설계되었다.
일부 구현예에서, 위 또는 위식도 접합부의 선암의 다중양식 치료는 (1) 트라스투주맙 (Herceptin®) 또는 라무시루맙 (Cyramza®)인 단일클론 항체와 (2) 방사선 요법인 암 치료제 또는 세포 독성제로, 카페시타빈(capecitabine) 또는 시스플라틴(cisplatin)과 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 위 또는 위식도 접합부의 선암의 다중양식 치료는 트라스투주맙 (Herceptin®) + 시스플라틴과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방광암의 다중양식 치료는 (1) 아테졸리주맙(Atezolizumab (Tecentriq™)), 니볼루맙(Nivolumab (Opdivo®)), 두르발루맙(Durvalumab (Imfinzi™)), 아벨루맙(Avelumab (Bavencio®)) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab (Keytruda®))인 단일클론 항체와 (2) 방사선 요법 또는 시스플라틴 + 플루오로 우라실인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방광암의 다중양식 치료는 아테졸리주맙 (Tecentriq™) + 시스플라틴 + 5-FU과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 뇌암의 다중양식 치료는 (1) 베바시주맙(Bevacizumab (Avastin®))인 단일클론 항체와 (2) 에베롤리무스(Everolimus (Afinitor®)), 방사선 요법, 카르보플라틴(Carboplatin), 에토포사이드(Etoposide) 또는 테모졸로미드(Temozolomide)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 뇌암의 다중양식 치료는 베바시주맙 (Avastin®) + 방사선 요법과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 유방암의 다중양식 치료는 (1) 트라스투주맙(Trastuzumab (Herceptin®))인 단일클론 항체와 (2) 타목시펜(Tamoxifen (Nolvadex)), 토레미펜(Toremifene (Fareston®)), 에베롤리무스(Everolimus (Afinitor®)), 풀베스트란트(Fulvestrant (Faslodex®)), 아나스트로졸(Anastrozole (Arimidex®)), 엑세메스테인(Exemestane (Aromasin®)), 라파티닙(Lapatinib (Tykerb®)), 레트로졸(Letrozole (Femara®)), 페르투주맙(Pertuzumab (Perjeta®)), 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-Trastuzumab emtansine (Kadcyla®)), 팔보시클립(Palbociclib (Ibrance®)), 리보시클립(Ribociclib (Kisqali®)), 시스플라틴/파라플라틴(Cisplatin/Paraplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 독소루비신(Doxorubicin) 또는 방사선 요법인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 유방암의 다중양식 치료는 트라스투주맙 (Herceptin®) + 시스플라틴과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 결장암의 다중양식 치료는 (1) 세툭시맙(Cetuximab (Erbitux®)), 파니투무맙(Panitumumab (Vectibix®)), 베바시주맙(Bevacizumab (Avastin®)) 또는 라무시루맙(Ramucirumab (Cyramza®))인 단일클론 항체와 (2) 지브-아플리베르셉트(Ziv-aflibercept (Zaltrap®)), 레고라페닙(Regorafenib (Stivarga®)), 방사선 요법, 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil (5-FU)), 카페시타빈(Capecitabine), 이리노테칸(Irinotecan) 또는 옥살리플라틴(Oxaliplatin)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 결장암의 다중양식 치료는 세툭시맙 (Erbitux®) + 옥살리플라틴과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 내분비/신경내분비 종양의 다중양식 치료는 (1) 아벨루맙(Avelumab (Bavencio®))인 단일클론 항체와 (2) 란레오타이드 아세테이트(Lanreotide acetate (Somatuline® Depot))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 내분비/신경내분비 종양의 다중양식 치료는 아벨루맙 (Bavencio®) + 옥살리플라틴과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 두경부암의 다중양식 치료는 (1) 세툭시맙(Cetuximab (Erbitux®)), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab (Keytruda®)), 니볼루맙(Nivolumab (Opdivo®)), 트라스투주맙(Trastuzumab) 또는 라무시루맙(Ramucirumab)인 단일클론 항체와 (2) 방사선 요법, 카보플라틴(Carboplatin), 시스플라틴(Cisplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 이리노테칸(Irinotecan), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 또는 파클리탁셀(Paclitaxel)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 두경부암의 다중양식 치료는 세툭시맙(Erbitux®) + 시스플라틴과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 골의 거대세포 종양(giant cell tumor of the bone)의 다중양식 치료는 (1) 데노수맙(Denosumab (Xgeva®))인 단일클론 항체와 (2) 방사선 요법, 독소루비신(Doxorubicin), 시스플라틴(Cisplatin), 에토포사이드(Etoposide), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide) 또는 메토트렉세이트(Methotrexate)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 두경부암의 다중양식 치료는 데노수맙 (Xgeva®) + 독소루비신과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 신장암의 다중양식 치료는 (1) 베바시주맙(Bevacizumab (Avastin®)) 또는 니볼루맙(Nivolumab (Opdivo®))인 단일클론 항체와 (2) 소라페닙(Sorafenib (Nexavar®)), 수니티닙(Sunitinib (Sutent®)), 파조파닙(Pazopanib (Votrient®)), 테시롤리무스(Temsirolimus (Torisel®)), 에베롤리무스(Everolimus (Afinitor®)), 악시티닙(Axitinib (Inlyta®)), 카보잔티닙(Cabozantinib (Cabometyx™)), 렌바티닙 메실레이트(Lenvatinib mesylate (Lenvima®)), 빈블라스틴(Vinblastine), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil (5-FU)), 카페시타빈(Capecitabine) 또는 젬시타빈(Gemcitabine)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 신장암의 다중양식 치료는 베바시주맙(Avastin®) + 소라페닙(Nexavar®)과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 백혈병의 다중양식 치료는 (1) 리툭시맙(Rituximab (Rituxan®)), 알렘투주맙(Alemtuzumab (Campath®)), 오파투무맙(Ofatumumab (Arzerra®)), 오비누투주맙(Obinutuzumab (Gazyva®)) 또는 블리나투모맙(Blinatumomab (Blincyto®))인 단일클론 항체와 (2) 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate (Gleevec®)), 다사티닙(Dasatinib (Sprycel®)), 닐로티닙(Nilotinib (Tasigna®)), 보수티닙(Bosutinib (Bosulif®)), 트레티노인(Tretinoin (Vesanoid®)), 이브루티닙(Ibrutinib (Imbruvica®)), 이델라리십(Idelalisib (Zydelig®)), 베네토클락스(Venetoclax (Venclexta™)), 포나티닙 하이드로클로라이드(Ponatinib hydrochloride (Iclusig®)), 미도스타우린(Midostaurin (Rydapt®)), 메토트렉세이트(Methotrexate), 시타라빈(Cytarabine), 빈크리스틴(Vincristine), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin) 또는 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 백혈병의 다중양식 치료는 리툭시맙 (Rituxan®) + 사이클로포스파미드와 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 폐암의 다중양식 치료는 (1) 베바시주맙(Bevacizumab (Avastin®)), 라무시루맙(Ramucirumab (Cyramza®)), 니볼루맙(Nivolumab (Opdivo®)), 네시투무맙(Necitumumab (Portrazza™)), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab (Keytruda®)), 아테졸리주맙(Atezolizumab (Tecentriq™))인 단일클론 항체와 (2) 크리조티닙(Crizotinib (Xalkori®)), 에를로티닙(Erlotinib (Tarceva®)), 게피티닙(Gefitinib (Iressa®)), 아파티닙 디말리에이트(Afatinib dimaleate (Gilotrif®)), 세리티닙(Ceritinib (LDK378/Zykadia™)), 오시메르티닙(Osimertinib (Tagrisso™)), 알렉티닙(Alectinib (Alecensa®)), 브리가티닙(Brigatinib (Alunbrig™)), 시람자(Cyramza), 방사선 요법, 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel (탁솔(Taxol)), 나브-파클리탁셀(nab-paclitaxel, (암브락산(Abraxane))), 도세탁셀(Docetaxel 탁소테레((Taxotere)), 겜시타빈(Gemcitabine (겜자(Gemzar)), 비노렐빈(Vinorelbine (나벨빈(Navelbine))), 이리노테칸(Irinotecan (캄프토사(Camptosar)), 에토포사이드(Etoposide (VP-16)), 빈블라스틴(Vinblastine) 또는 페메트렉세드(Pemetrexed (알티마(Alimta)))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 폐암의 다중양식 치료는 네시투무맙 (Portrazza™) + 카보플라틴와 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프종의 다중양식 치료는 (1) 이브리투모맙 티우제탄(Ibritumomab tiuxetan (Zevalin®)), 브렌툭시맙 제도틴(Brentuximab vedotin (Adcetris®)), 리툭시맙(Rituximab (Rituxan®)), 실툭시맙(Siltuximab (Sylvant®)), 오비누투주맙(Obinutuzumab (Gazyva®)), 니볼루맙(Nivolumab (Opdivo®)) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab (Keytruda®))인 단일클론 항체와 (2) 데닐루킨 디프티톡스(Denileukin diftitox (Ontak®)), 보리노스타트(Vorinostat (Zolinza®)), 로미뎁신(Romidepsin (Istodax®)), 벡사로텐(Bexarotene (Targretin®)), 보테조밉(Bortezomib (Velcade®)), 프랄라트렉세이트(Pralatrexate (Folotyn®)), 이브루티닙(Ibrutinib (Imbruvica®)), 이델라리십(Idelalisib (Zydelig®)), 벨리노스타트(Belinostat (Beleodaq®)), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 클로람부실(Chlorambucil), 벤다무스틴(Bendamustine), 이포스파미드(Ifosfamide), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 플루다라빈(Fludarabine), 젬시타빈(Gemcitabine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine) 또는 에토포사이드(Etoposide (VP-16))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 림프종의 다중양식 치료는 리툭시맙 (Rituxan®) + 사이클로포스파미드와 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 다발성 골수종의 다중양식 치료는 (1) 보르테조밉(Bortezomib (Velcade®)), 다라투무맙(Daratumumab (Darzalex™) 또는 엘로투주맙(Elotuzumab (Empliciti™)인 단일클론 항체와 (2) 카르필조밉(Carfilzomib (Kyphosis®), 파노비노스타트(Panobinostat (Farydak®), 익사조밉 사이트레이트(Ixazomib citrate (Ninlaro®)), 멜판란(Melphalan), 빈크리스틴(Vincristine (온코빈(Oncovin))), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide 시톡산((Cytoxan)), 에토포사이드(Etoposide (VP-16)), 독소루비신(Doxorubicin (아드리아미신(Adriamycin))), 리포좀 독소루비신(Liposomal doxorubicin (독실(Doxil)), 벤다무스틴(Bendamustine (트레안다(Treanda)))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 다발성 골수종의 다중양식 치료는 다라투무맙 (Darzalex™) + 사이클로포스파미드와 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 신경모세포종(neuroblastoma)의 다중양식 치료는 (1) 디누툭시맙(Dinutuximab (Unituxin™))인 단일클론 항체와 (2) 방사선 요법, 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시스플라틴(Cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin), 빈크리스틴(Vincristine), 독소루비신(Doxorubicin (아드리아마이신(Adriamycin))), 에토포사이드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 부설판(Busulfan) 또는 티오테파(Thiotepa)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 신경모세포종의 다중양식 치료는 디누툭시맙(Unituxin™) + 독소루비신(아드리아마이신)와 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 난소상피/나팔관/원발성 복막암(ovarian epithelial/fallopian tube/primary peritoneal cancer)의 다중양식 치료는 (1) 베바시주맙(Bevacizumab (Avastin®))인 단일클론 항체와 (2) 올라파립(Olaparib (Lynparza™)), 루카파립 캄실레이트(Rucaparib camsylate (Rubraca™)), 니라파립 토실레이트 모노하이드레이트(Niraparib tosylate monohydrate (Zejula™)), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel (Taxol®)), 도세탁셀(Docetaxel (Taxotere®)), 카페시타빈(Capecitabine (Xeloda®)), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide (Cytoxan®)), 에토포사이드(Etoposide (VP-16)), 겜시타빈(Gemcitabine (Gemzar®)), 이포스파미드(Ifosfamide (Ifex®)), 이리노테칸(Irinotecan (CPT-11, Camptosar®)), 리포좀 독소루비신(Liposomal doxorubicin (Doxil®)), 멜팔란(Melphalan), 페메트렉세드(Pemetrexed (Alimta®)), 토포테칸(Topotecan) 또는 비노렐빈(Vinorelbine (Navelbine®))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 난소상피/나팔관/원발성 복막암의 다중양식 치료는 베바시주맙 (Avastin®) + 파클리탁셀 (Taxol®)과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 췌장암의 다중양식 치료는 (1) 세툭시맙(Cetuximab (Erbitux®)) 또는 베바시주맙(Bevacizumab (Avastin®))인 단일클론 항체와 (2) 에를로티닙(Erlotinib (Tarceva®)), 에베롤리무스(Everolimus (Afinitor®)), 수니티닙(Sunitinib (Sutent®)), 겜시타빈(Gemcitabine (Gemzar)), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil (5-FU)), 옥살리플라틴(Oxaliplatin (엘록사틴(Eloxatin)), 알부민-결합 파클리탁셀(Albumin-bound paclitaxel (아브락산(Abraxane))), 카페시타빈(Capecitabine (젤로다(Xeloda))), 시스플라틴(Cisplatin), 이리노테칸(Irinotecan (캄프토사(Camptosar))), 파클리탁셀 (Paclitaxel (탁솔(Taxol))), 도세탁셀(Docetaxel (탁사테레(Taxotere))) 또는 알부민-결합 파클리탁셀(Albumin-bound paclitaxel (암브락산(Abraxane)))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 췌장암의 다중양식 치료는 에를로티닙 (Tarceva®) + 옥살리플라틴 (엘록사틴)과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 피부암의 다중양식 치료는 (1) 이필리무맙(Ipilimumab (Yervoy®)), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab (Keytruda®)), 아벨루맙(Avelumab (Bavencio®)) 또는 니볼루맙(Nivolumab (Opdivo®))인 단일클론 항체와 (2) 비스모데깁(Vismodegib (Erivedge®)), 소니데깁(Sonidegib (Odomzo®)), 베무라페닙(Vemurafenib (Zelboraf®)), 트라메티닙(Trametinib (Mekinist®)), 다브라페닙(Dabrafenib (Tafinlar®)), 코비메티닙(Cobimetinib (Cotellic™)), 알리트레티노인(Alitretinoin (Panretin®)), 방사선 요법, 다카르바진(Dacarbazine), 테모졸로미드(Temozolomide), 나브-파클리탁셀(Nab-paclitaxel), 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 피부암의 다중양식 치료는 아벨루맙 (Bavencio®) + 시스플라틴과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 연조직 육종(soft tissue sarcoma)의 다중양식 치료는 (1) 올라라투맙(Olaratumab (Lartruvo™))인 단일클론 항체와 (2) 파조파닙(Pazopanib (Votrient®)), 알리트레티노인(Alitretinoin (Panretin®)), 방사선 요법, 이포스파미드(Ifosfamide (Ifex®)), 독소루비신(Doxorubicin (Adriamycin®)), 다카르바진(Dacarbazine), 에피루비신(Epirubicin), 테모졸로미드(Temozolomide (Temodar®도세탁셀(Docetaxel (Taxotere®)), 겜시타빈(Gemcitabine (Gemzar®)), 비노렐빈(Vinorelbine (Navelbine®)), 트라벡테딘(Trabectedin (Yondelis®)) 또는 에리불린(Eribulin (Halaven®))인 암 치료제 또는 세포 독성제와 병용하는 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 연조직 육종의 다중양식 치료는 올라라투맙 (Lartruvo™) + 도세탁셀 (Taxotere®)과 조합한 본원에서 제공되는 g-NK 세포 조성물의 투여를 포함한다.
4. 종양 용해성 바이러스(Oncolytic Virus)
일부 구현예에서, 상기 제공되는 방법은 또한 종양 용해성 바이러스와 함께 g-NK 세포를 투여하는 단계를 포함할 수있다. g-NK 세포 및 종양 용해성 바이러스의 병용 치료는 항체와 같이, 기재된 바와 같은 하나 이상의 다른 제제의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
종양 용해성 바이러스와 g-NK 세포의 조합은 치료 요법 중 하나 또는 둘 모두의 활성을 촉진하거나 증가시킬 수 있는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스의 사용은 종양 세포를 NK 세포에 민감화시킬 수 있다. 종양 용해성 바이러스 치료의 증거에 따르면 종양 용해성 바이러스는 NK 세포 (↑IFN-γ)를 활성화하고 전이성 흑색종, 난소암 및 유방암 모델에서 NK 세포의 종양으로의 이동을 향상시킨다 (Miller et al., 2003 Mol Ther 7: 741: 747; Benencia et al., 2005 Mol Ther 12: 789-802; Zhao et al., 2014 PLoS One 9: e93103). 1 상 임상 시험에서 종양 용해성 레오바이러스(reovirus)는 NK 세포의 순환 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 (White et al., 2008 Gene Ther 15: 911-920), NK-세포는 전립선 암 및 A549 폐암 동물 모델에서 종양 용해성 레오바이러스 및 파라폭스 바이러스의 항 종양 효능을 매개하는 것으로 밝혀졌다 (Gujar et al., 2011 Mol Ther 19: 797-804; Rintoul et al., 2012 Mol. Ther. 20: 1148-1157). 종양 내 NK 세포 농도가 생존과 양의 상관 관계가 있는 선암 및 교모세포종 동물 모델에서 종양 용해성 콕사키 바이러스(Coxsackievirus) 및 홍역 바이러스(Measles virus)와 함께 NK 세포에 의한 종양 침윤 증가가 관찰되었다 (Miyamoto et al., 2012 Cancer Res. 72: 2609-2621; Allen et al., 2006 Cancer res. 66: 11840-11850). 종양 용해성 바이러스 활성과 NK 세포 매개 종양 세포의 제거를 연결하는 메커니즘은 종양 면역원성을 강화시킨다. 특히, 종양 용해성 바이러스에 감염된 종양은 자연 세포 독성 수용체 NKp30 및 NKp44에 의해 매개되는 증가된 세포 독성뿐만 아니라 세포 독성 사이토카인 IFN-γTNF-α 및 MIP1α/β의 강화된 발현에 의해 입증된 바와 같이 NK 세포에 의해 더 쉽게 인식되고 사멸된다(Bhat et al., 2011 Int J Cancer 128:908-919; Dempe et al., 2012 Cancer Immunol Res 61:2113-2123; Bhat et al., 2013 BMC Cancer 13:367). 생체 내에서 NK 세포를 유인하고 활성화하는 것으로 밝혀진 다른 종양 용해 바이러스는 인플루엔자 바이러스 (Ogbomo et al., 2010 Med Microbiol Immunol 199: 93-101), 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) (Heiber et al., 2011 J Virol. 85: 10440-10450), 뉴캐슬병 바이러스 (Jarahian et al., 2009 J Virol. 83: 810-821)를 포함한다. 수술 후 암 환자를 대상으로 한 연구에서 종양 용해성 백시니아 바이러스는 수술 후 면역 억제를 역전시키고 전이 형성을 예방하는 것으로 밝혀졌다 (Tai et al., 2014 Front Oncol 4: 217). 따라서 종양 용해성 바이러스는 면역이 약화된 개체에서 NK 세포에 의한 항 종양 면역을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 특정 세포, 예컨대 면역 세포를 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 대상체에서 종양 세포 및/또는 암 세포를 표적으로 한다. 종양 용해성 바이러스는 종양 세포에 축적되고 종양 세포에서 복제되는 바이러스이다. 세포의 복제로 인해 종양 세포가 용해되고 종양이 축소되어 제거될 수 있다. 종양 용해성 바이러스는 또한 광범위한 숙주 및 세포 유형 범위를 가질 수 있다. 예를 들어 종양 용해성 바이러스는 종양 및/또는 전이를 포함하는, 그리고 또한 상처 조직 및 세포도 포함하는 면역 특권 세포(immunoprivileged cells)나 면역권한 조직(immunoprivileged tissues)에 축적될 수 있고, 따라서 광범위한 세포 유형에서 이종 단백질의 전달 및 발현을 허용한다. 종양 용해성 바이러스는 또한 종양 세포 특이적 방식으로 복제하여 종양 세포 용해 및 효율적인 종양 퇴행(tumor regression)을 초래할 수 있다.
예시적인 종양 용해성 바이러스는 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레오 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 콕사키 바이러스 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 다른 기관을 감염시키지 않으면서 고형 종양을 특이적으로 집락화(colonize) 할 수있다. 일부 경우에는 종양 용해성 바이러스가 이종 단백질 핵산을 고형 종양에 전달하는 감염원으로 사용할 수 있다.
종양 용해성 바이러스는 당업자에게 공지된 임의의 것일 수 있으며, 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 예컨대, 미국특허번호 7,731,974, 7,153,510, 6,653,103 및 미국특허 공개번호 2010/0178684, 2010/0172877, 2010/0113567, 2007/0098743, 20050260601, 20050220818 및 유럽특허번호 1385466, 1606411 및 1520175를 참조; 단순 포진 바이러스, 예컨대, 미국특허번호 7,897,146, 7,731,952, 7,550,296, 7,537,924, 6,723,316, 6,428,968 및 미국특허 공개번호 2014/0154216, 2011/0177032, 2011/0158948, 2010/0092515, 2009/0274728, 2009/0285860, 2009/0215147, 2009/0010889, 2007/0110720, 2006/0039894, 2004/0009604, 2004/0063094, 국제특허 공개번호 WO 2007/052029, WO 1999/038955 참조; 레트로 바이러스, 예컨대, 미국특허번호 6,689,871, 6,635,472, 5,851,529, 5,716,826, 5,716,613 및 미국특허 공개번호 20110212530 참조; 백시니아 바이러스, 예컨대 2016/0339066, 및 아데노 연관 바이러스, 예컨대 미국특허번호 8,007,780, 7,968,340, 7,943,374, 7,906,111, 7,927,585, 7,811,814, 7,662,627, 7,241,447, 7,238,526, 7,172,893, 7,033,826, 7,001,765, 6,897,045, 및 6,632,670 참조;를 포함한다.
종양 용해성 바이러스는 또한 독성을 약화시키고, 안전성 프로파일을 개선하고, 종양 특이성을 향상시키기 위해 유전적으로 변경된 바이러스를 포함하고, 또한 바이러스의 전반적인 효능을 향상시키기 위해 세포 독소, 사이토 카인, 전구 약물 전환 효소와 같은 추가 유전자를 갖추고 있다 (예컨대, Kirn et al., (2009) Nat Rev Cancer 9:64-71; Garcia-Aragoncillo et al., (2010) Curr Opin Mol Ther 12:403-411 참조; 미국특허번호 7,588,767, 7,588,771, 7,662,398 및 7,754,221, 및 미국특허 공개번호 2007/0202572, 2007/0212727, 2010/0062016, 2009/0098529, 2009/0053244, 2009/0155287, 2009/0117034, 2010/0233078, 2009/0162288, 2010/0196325, 2009/0136917 및 2011/0064650 참조). 일부 구현예에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 암성 세포에서 선택적으로 복제되도록 변형되고, 이로 인해 종양 용해성인, 종양 용해성 바이러스 일 수 있다. 예를 들어, 종양 용해성 바이러스는 종양 치료 및 유전자 치료 벡터를 위해 변형된 방향성을 갖도록 설계된 아데노 바이러스이다. 이러한 예는 ONYX-015, H101 및 Ad5Δ(Hallden and Portella (2012) Expert Opin Ther Targets, 16: 945-58) 및 TNFerade (McLoughlin et al. (2005) Ann. Surg. Oncol., 12: 825- 30) 또는 조건부 복제성 아데노 바이러스 Oncorine®이다.
일부 구현예에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 변형된 단순 헤르페스 바이러스이다. 일부 구현예에서, 상기 종양 용해성 바이러스는 Talimogene laherparepvec (T-Vec, Imlygic 또는 OncoVex GM-CSF 로도 알려짐)이다. 일부 구현예에서, 상기 감염원은 예컨대, WO 2007/052029, WO 1999/038955, US 2004/0063094, US 2014/0154216 에 기재된 변형된 단순 포진 바이러스, 또는 이의 변이체이다.
Ⅴ. 키트 및 제조 물품
본원에서는 g-NK 세포와 같은 특정 서브세트가 농축된 NK 세포를 함유하는 상기 제공되는 조성물을 포함하는 제조 물품 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 상기 제공되는 임의의 방법에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 상기 제공되는 임의의 조성물 및 추가 작용제를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 추가 작용제는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 상기 추가 작용제는 Fc 융합 단백질 또는 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 추가 작용제는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 이들 구현예 일부에서, 상기 추가 작용제는 전장 항체이다. 예시적인 항체는 상기 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다.
또한, 본원에 기술된 바와 같은 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 CD16, CD38, CD57, CD7, CD161 및/또는 NKG2A로부터 선택되는 2, 3, 4 또는 5 개의 표면 마커와 같은 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 CD16, CD57, CD7 및 CD161로부터 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 CD161 및 NKG2A로부터 표면 마커의 패널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 하나 이상의 다른 NK 세포 표면 마커를 검출하기 위한 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 추가 표면 마커 CD45, CD3 및/또는 CD56을 검출하기 위한 1, 2 또는 3개의 추가 시약과 같은 하나 이상의 추가 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 CD3, CD56 및 CD38로부터 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 상기 시약은 패널의 특정 표면 마커를 검출하기 위한 결합 분자이다.
특정 구현예에서, 상기 시약은 상기 패널의 하나 이상의 표면 마커에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 같은 결합 분자는 검출할 수 있는 모이어티에 직접 또는 간접적으로 접합될 수있다. 일부 예에서, 하나 이상의 항체가 결합의 검출을 허용하도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 2 차 작용제를 통한 직접 검출 또는 검출을 허용하는 검출 가능한 분자에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 형광단과 같이 직접 표지된다. 일부 예에서, 항체는 1차 항체에 결합하고 형광 프로브와 같은 검출 가능한 단백질 또는 홀스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 검출 가능한 효소에 결합되는 2 차 항체 시약과 같은 2차 시약을 사용하여 검출될 수있다. 이러한 일부 예에서, 키트는 2차 항체를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 하나 이상의, 사용 설명서, 장치 및 추가 시약 (예: 조성물의 희석 및/또는 동결 건조된 단백질의 재구성을 위한 멸균수 또는 식염수)과 같은 구성 요소, 및 방법의 실시를 위한 용기 및 주사기, 튜브와 같은 구성 요소를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 샘플 수집, 샘플의 제조 및 처리를위한 시약 및/또는 샘플에서 하나 이상의 표면 마커의 양을 정량화하기 위한 시약, 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 항체, 완충액, 효소 염색용 기질, 크로마겐과 같은 검출 시약 또는 슬라이드, 용기, 마이크로타이터 플레이트와 같은 기타 재료 및 선택적으로 상기 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 당업자는 상기 제공되는 방법에 따라 사용될 수 있는 많은 다른 가능한 용기 및 플레이트 및 시약을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 세포, 항체 또는 시약, 또는 이의 조성물, 또는 하나 이상의 다른 성분의 패키징을 위한 패키징 재료를 포함하는 제조 물품으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트에는 용기, 병, 튜브, 바이알 및 키트 구성 요소를 분리하거나 구성하는데 적합한 패키징 재료가 포함될 수 있다. 하나 이상의 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 용기는 상기 방법에 사용하기 위한 세포 또는 항체 또는 다른 시약을 포함하는 조성물을 보유한다. 본원의 제조 물품 또는 키트는 별도의 용기 또는 동일한 용기에 세포, 항체 또는 시약을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 조성물을 보유하는 하나 이상의 용기는 일회용 바이알 또는 다용도 바이알 일 수 있으며, 일부 경우에는 조성물의 반복 사용을 허용 할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제조 물품 또는 키트는 적합한 희석제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수있다. 제조 물품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 치료제 및/또는 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적, 치료적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 선택적으로 설명서(instructions)를 포함할 수 있다. 설명서는 일반적으로 세포 조성, 시약 및/또는 항체 및 선택적으로 키트에 포함된 기타 구성 요소를 설명하는 유형의 표현 및 이를 사용하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 설명서는 제공된 구현예 중 임의의 것에 따라 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여하기 위해 세포 조성물 및 항체를 사용하는 방법을 지시한다. 일부 구현예에서, 상기 설명서는 제공된 구현예 중 임의의 것에 따라 g-NK 대리 마커 표현형을 검출하기 위한 패널로서 항체와 같은 시약을 사용하는 방법을 지시한다. 일부 구현예에서, 상기 설명서는 용기 상에 있거나 용기와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물로서 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 설명서는 조성물의 재구성 및/또는 사용을 위한 지침(directions)을 나타낼 수 있다.
Ⅵ. 예시적 구현예
제공되는 구현예는 다음과 같다:
1. FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 분리하는 단계로, 상기 분리하는 단계는 인간 대상체 유래의 샘플로부터 (i) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg), (ii) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (iii) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos), 또는 (iv) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos)의 선별을 포함하는 단계; 및
(b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
2. 구현예 1의 방법에 있어서, (a) 단계 전, 인간 대상체 유래 샘플을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2의 방법에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이거나 이를 포함하는 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukaphereis) 샘플인 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별(immunoaffinity-based selection)을 포함하는 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계는 샘플로부터 CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포의 선별을 포함하는 방법.
7. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계는 샘플로부터 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성 (CD3negCD56pos)인 세포의 선별을 포함하는 방법.
8. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계는 샘플로부터 CD3에 대해 음성이고 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포의 선별을 포함하는 방법.
9. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 분리하는 단계는 샘플로부터 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성 (CD3negCD16pos)인 세포의 선별을 포함하는 방법.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, (a) 단계 후 농축된 NK 세포의 분리된 집단을 동결 보존하는 단계 및 (b) 단계 전 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함하는 방법.
11. FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서, (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 수득하는 단계로, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (i) CD3에 대해 음성인 세포 (CD3neg), (ii) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성인 세포 (CD3negCD56pos); (iii) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포 (CD3negCD57pos), 또는 (iv) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성인 세포 (CD3negCD16pos)로부터 선택되는 표현형을 포함하는 단계; 및
(b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고,
상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
12. 구현예 11에 있어서, 상기 수득하는 단계는 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함하는 방법.
13. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 (CD3neg)인 세포를 포함하는 방법.
14. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성 (CD3negCD56pos)인 세포를 포함하는 방법.
15. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성 (CD3negCD57pos)인 세포를 포함하는 방법.
16. 구현예 11 또는 구현예 12에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성 (CD3negCD16pos)인 세포를 포함하는 방법.
17. 인간 대상체 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1 차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는 FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포를 포함하고, 상기 배양하는 단계는
(i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및
(ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 수행되고,
상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는
(1) (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD57에 대해 양성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및
(2) 첫 번째 선별된 집단 세포로부터 (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD57에 대해 양성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성이고 CD57에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함하는, 방법.
19. FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서, 인간 대상체의 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 포함화고, 상기 배양하는 단계는
(i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및
(ii) 재조합 IL-2의 존재 하에 수행되고,
상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
20. 구현예 19에 있어서, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포의 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는
(1) (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD16에 대해 양성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및
(2) 상기 첫 번째 농축된 선별된 세포로부터 (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD16에 대해 양성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함하는, 방법.
21. 구현예 17 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는 방법.
22. 구현예 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 전, 인간 대상체 유래 샘플을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
23. 구현예 17 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플인 방법.
24. 구현예 18 및 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함하는 것인 방법.
25. 구현예 18 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 농축된 NK 세포는 대상체 유래의 샘플로부터 이전에 분리되어 동결 보존된 샘플로부터 유래된 것인 방법.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 (iii) 1 차 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 영양 세포의 존재 하에 추가로 수행되고, 여기서 PBMC 영양 세포는 조사된(irradiated) 것인 방법.
27. 구현예 26에 있어서, PBMC 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비가 1:1 또는 약 1:1 내지 5:1 또는 약 5:1 (포함)인 방법.
28. 구현예 26 또는 구현예 27에 있어서, 상기 PBMC 영양 세포는 대상체에 대해 자가(autologuous)인 방법.
29. 구현예 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부는 PBMC 영양 세포의 하나 이상의 T 세포의 활성화를 자극할 수 있는 적어도 하나의 자극제(stimulatory agent)의 존재 하에 수행되는 방법.
30. 구현예 29에 있어서, 상기 자극제는 TCR 복합체의 일 멤버(member)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 상기 자극제는 CD3, 선택적으로 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는, 방법.
31. 구현예 29 또는 구현예 30에 있어서, 상기 적어도 하나의 자극제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
33. 구현예 31 또는 구현예 32에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 10ng/mL 또는 약 10 ng/mL 내지 100 ng/mL 또는 약 100 ng/mL 인 방법.
34. 구현예 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 50 ng/mL 또는 약 50 ng/mL인 방법.
35. 구현예 31 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 자극제는 배양 개시 시 또는 조사된 PBMC 영양 세포와 동시에 또는 거의 동시에 첨가되는 방법.
36. 구현예 26 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 PBMC 영양 세포가 활성화되는 방법.
37. 구현예 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율이 1:1 또는 약 1:1 이상인 방법.
38. 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율은 1:1 내지 5:1 (포함)인 방법.
39. 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:1 내지 3:1 (포함)인 방법.
40. 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 2.5:1 또는 약 2.5:1 인 방법.
41. 구현예 17 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 PBMC 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 5:1 또는 약 5:1인 방법.
42. 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2의 농도는 10 IU/mL 또는 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL 인 방법.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2의 농도는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 재조합 IL-2인 방법.
44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 IL-2는 배양 개시 시점 또는 그 근처에 첨가되는 것인 방법.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 배양 동안 배양 배지를 1회 이상 교환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
46. 구현예 45에 있어서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 배양 개시 후 3 또는 약 3일 내지 7 일 또는 약 7 일 내에, 선택적으로 배양 개시 후 5 일 또는 약 5 일에 시작하여 수행되는 것인 방법.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 남은 배양 기간 동안 2 일 또는 3 일마다 수행되는 방법.
48. 구현예 45 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 배양 배지로부터 상기 적어도 하나의 자극제를 감소시키거나 제거하는 것 인 방법.
49. 구현예 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지의 각각의 교환에서 재조합 IL-2가 배양물에 첨가되는 방법.
50. 구현예 44 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 IL-2는 10 IU/mL 또는 약 10 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 약 500 IU/mL (포함)의 농도로 첨가되는 방법.
51. 구현예 44 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 IL-2는 100 IU/mL 또는 약 100 IU/mL 재조합 IL-2의 농도로 첨가되는 방법.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 0.2 x 106 농축된 NK 세포 또는 약 0.2 x 106 농축된 NK 세포, 적어도 1.0 x 106 농축된 NK 세포 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포, 또는 10 x 106 농축된 NK 세포 또는 약 10 x 106 농축된 NK 세포를 포함하는 방법.
53. 구현예 1 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도인 방법.
54. 구현예 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 또는 약 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 약 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도인 방법.
55. 구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포의 집단은 0.2 x 106 농축 NK 세포/mL 또는 약 0.2 x 106 농축 NK 세포/mL 농도를 포함하는 방법.
56. 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 적어도 2.50 x 108 또는 적어도 약 2.50 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
57. 구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 적어도 5.00 x 108 또는 적어도 약 5.00 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
58. 구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 적어도 1.0 x 109 또는 적어도 약 1.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
59. 구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 적어도 5.0 x 109 또는 적어도 약 5.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
60. 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 5일 또는 약 5일 또는 적어도 5일 또는 적어도 약 5일, 6일 또는 약 6일 또는 적어도 6일 또는 적어도 약 6일, 7일 또는 약 7일 또는 적어도 7일 또는 적어도 약 7일, 8일 또는 약 8일 또는 적어도 8일 또는 적어도 약 8일, 9일 또는 약 9일 또는 적어도 9일 또는 적어도 약 9일, 10일 또는 약 10일 또는 적어도 10일 또는 적어도 약 10일, 11일 또는 약 11일 또는 적어도 11일 또는 적어도 약 11일, 12일 또는 약 12일 또는 적어도 12일 또는 적어도 약 12일, 13일 또는 약 13일 또는 적어도 13일 또는 적어도 약 13일, 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일, 15일 또는 약 15일 또는 적어도 15일 또는 적어도 약 15일, 16일 또는 약 16일 또는 적어도 16일 또는 적어도 약 16일, 17일 또는 약 17일 또는 적어도 17일 또는 적어도 약 17일, 18일 또는 약 18일 또는 적어도 18일 또는 적어도 약 18일, 19일 또는 약 19일 또는 적어도 19일 또는 적어도 약 19일, 20일 또는 약 20일 또는 적어도 29일 또는 적어도 약 20일, 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일, 22일 또는 약 22일 또는 적어도 22일 또는 적어도 약 22일, 23일 또는 약 23일 또는 적어도 23일 또는 적어도 약 23일, 24일 또는 약 24일 또는 적어도 24일 또는 적어도 약 24일, 또는 25일 또는 약 25일 또는 적어도 25일 또는 적어도 약 25일 동안 수행되는 방법.
61. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 14일 또는 약 14일 또는 적어도 14일 또는 적어도 약 14일 동안 수행되는 방법.
62. 구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 21일 또는 약 21일 또는 적어도 21일 또는 적어도 약 21일 동안 수행되는 방법.
63. 구현예 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 증가된 수의 g-NK 세포를 생산하는 것인 방법.
64. 구현예 63에 있어서, 상기 증가는 100 배 이상 또는 약 100 배 이상, 200 배 이상 또는 약 200 배 이상, 300 배 이상 또는 약 300 배 이상, 400 배 이상 또는 약 400 배 이상, 500 배 이상 또는 약 500 배 이상, 600 배 이상 또는 약 600 배 이상, 700 배 이상 또는 약 700 배 이상 또는 800 배 이상 또는 약 800 배 이상인 방법.
65. 구현예 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg인 방법.
66. 구현예 65에 있어서, 상기 g-NK 세포는 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos인 방법.
67. 구현예 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포인 방법.
68. 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 증식된 집단으로부터 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포 집단을 정제하거나 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
69. 구현예 67 또는 구현예 68에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 인 방법.
70. 구현예 67 또는 구현예 68에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg 인 방법.
71. 구현예 69 또는 구현예 70에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos인 방법.
72. 구현예 1 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 약제학상 허용되는 부형제에서 g-NK 세포의 증식된 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
73. 구현예 72에 있어서, 동결 보호제의 존재 하에서 상기 세포를 동결 보존하는 단계 및/또는 상기 세포를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
74. 구현예 1 내지 73 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 g-NK 세포를 포함하는 조성물.
75. 구현예 74 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 적어도 106 또는 약 106 g-NK 세포를 포함하는 조성물.
76. 구현예 74 또는 구현예 75에 있어서, 상기 조성물 중의 g-NK 세포의 수는 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 세포, 106 또는 약 106 내지 109 또는 약 109 세포, 106 또는 약 106 내지 108 또는 약 108 세포, 106 또는 약 106 내지 107 또는 약 107 세포, 107 또는 약 107 내지 1010 또는 약 1010 세포, 107 또는 약 107 내지 109 또는 약 109 세포, 107 또는 약 107 내지 108 또는 약 108 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포, 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 세포, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포인, 조성물.
77. 구현예 75 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg인 조성물.
78. 구현예 77에 있어서, 상기 g-NK 세포는 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos인 조성물.
79. 구현예 75 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 가지는 세포인 조성물.
80. 구현예 79에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 조성물.
81. 구현예 79에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은NKG2Aneg/CD161neg인 조성물.
82. 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 40% 또는 약 40%, 적어도 50% 또는 약 50%, 적어도 60% 또는 약 60%, 적어도 70% 또는 약 70%, 적어도 80% 또는 약 80%, 또는 적어도 90% 또는 약 90%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 및 NKG2Aneg/CD161neg로부터 선택되는 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는, 조성물.
83. 구현예 80 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함하는 조성물.
84. 구현예 82 또는 구현예 83에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 60% 또는 약 60%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 및 NKG2Aneg/CD161neg 로부터 선택되는 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
85. 구현예 82 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 70% 또는 약 70%가 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 및 NKG2Aneg/CD161neg 로부터 선택되는 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
86. 구현예 83 내지 85 중 어느 하나에 있어서, g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 세포 중 70% 이상이 FcRγneg이고, 선택적으로 70% 또는 약 70% 내지 90%가 FcRγneg인 조성물.
87. 구현예 83 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 적어도 106 또는 적어도 약 106 개의 세포를 포함하는 조성물.
88. 구현예 83 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중의 g-NK 세포의 수는 106 또는 약 106 내지 1010 또는 약 1010 세포, 106 또는 약 106 내지 109 또는 약 109 세포, 106 또는 약 106 내지 108 또는 약 108 세포, 106 또는 약 106 내지 107 또는 약 107 세포, 107 또는 약 107 내지 1010 또는 약 1010 세포, 107 또는 약 107 내지 109 또는 약 109 세포, 107 또는 약 107 내지 108 또는 약 108 세포, 108 또는 약 108 내지 1010 또는 약 1010 세포, 108 또는 약 108 내지 109 또는 약 109 세포, 또는 109 또는 약 109 내지 1010 또는 약 1010 세포인 조성물.
89. 구현예 74 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약제학상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
90. 구현예 74 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 동결 보호제(cyroprotectant)를 포함하는, 조성물.
91. 구현예 74 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 멸균되어 있는 조성물.
92. 구현예 74 내지 91 중 어느 하나의 조성물 및 질환의 치료를 위한 추가 작용제를 포함하는 키트.
93. 구현예 92에 있어서, 상기 조성물 및 질환 또는 병태를 치료하기 위한 추가 작용제를 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함하는 키트.
94. 구현예 74 내지 91 중 어느 하나의 조성물 및 질환 치료를 위한 추가 작용제와의 병용 요법으로 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
95. 구현예 92 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 작용제는 항체 또는 Fc-융합 단백질인 키트.
96. 구현예 95에 있어서, 상기 항체는 종양 관련 항원을 인식하거나 특이적으로 결합하는 키트.
97. 구현예 95 또는 구현예 96에 있어서, 상기 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린(mesothelin), α-태아단백질(α-fetoprotein), 뮤신(Mucin), PDGFR-alpha, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린(Integrin) αVβ인테그린(integrin) α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-alpha, 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 신데칸(Syndecan) 1, SLAMF7 (CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 인식하거나 결합하는 키트.
98. 구현예 95 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 전장 항체이고/이거나 Fc 도메인을 포함하는, 키트.
99. 구현예 74 내지 91 중 어느 하나의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 치료방법.
100. 구현예 99에 있어서, 상기 방법은 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010 세포/m2 를 개체에게 투여하는 단계 또는 1 x 106 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010 NK 세포/kg 를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
101. 구현예 99 또는 구현예 100에 있어서, 상기 방법은 추가 작용제(additional agent)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
102. 구현예 101에 있어서, 상기 추가 작용제는 항체 또는 Fc-융합 단백질인 방법.
103. 구현예 102에 있어서, 상기 항체는 종양 관련 항원을 인식하는 방법.
104. 구현예 102 또는 구현예 103에 있어서, 상기 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린(mesothelin), α-태아단백질(α-fetoprotein), 뮤신(Mucin), PDGFR-alpha, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린(Integrin) αVβ인테그린(integrin) α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-alpha, 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 신데칸(Syndecan) 1, SLAMF7 (CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 인식하거나 특이적으로 결합하는 방법.
105. 구현예 101 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함하거나/하고 전장항체(full-length antibody)인 방법.
106. 구현예 101 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 작용제 및 상기 조성물은 순차적으로 투여되는 방법.
107. 구현예 106에 있어서, 상기 추가 작용제는 상기 조성물의 투여 전에 투여되는 방법.
108. 구현예 101 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 작용제 및 상기 조성물은 동시에 투여되는 방법.
109. 구현예 101 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 염증성 병태, 감염 및 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
110. 구현예 109에 있어서, 상기 감염은 바이러스 감염 또는 박테리아 감염인 방법.
111. 구현예 110에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종 또는 골수종인 방법.
112. 구현예 110에 있어서, 상기 암은 고형 종양을 포함하는, 방법.
113. 구현예 101 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 개체는 인간인 방법.
114. 구현예 101 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 내의 NK 세포는 상기 개체에 대해 동종(allogenic)인 방법.
115. 구현예 101 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 내의 NK 세포는 상기 대상체에 대해 자가(autologous)인 방법.
116. 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로, 상기 표면 마커 패널은 CD16, CD57, CD7 및 CD161 또는 NKG2A 및 CD161로부터 선택되는 키트.
117. 구현예 116에 있어서, 상기 표면 마커 패널은 CD3, CD45 및 CD56을 추가로 포함하는 키트.
118. 구현예 116 또는 구현예 117에 있어서, 상기 복수의 시약 각각은 표면 마커 패널의 하나의 마커에 특이적인 결합 분자인 키트.
119. 구현예 118에 있어서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편인 키트.
120. 구현예 118 또는 구현예 119에 있어서, 상기 결합 분자는 검출 가능하도록 표지되어 있는 키트.
121. 구현예 116 내지 120 중 어느 하나의 키트를 사용하여 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법.
122. 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일(surrogate surface marker profile)을 검출하는 방법으로, 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 CD16, CD57, CD7 및 CD161 또는 NKG2A 및 CD161로부터 선택되는 표면 마커 패널(a panel of surface markers)을 검출하기 위한 시약(reagents)과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 샘플에서 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 또는 NKG2Aneg/CD161neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
123. 구현예 122에 있어서, 상기 표면 마커 패널은 CD45, CD3 및 CD56을 추가로 포함하고, 상기 표현형은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함하는 방법.
124. 구현예 122 또는 구현예 123에 있어서, 상기 복수의 시약 각각은 상기 표면 마커 패널의 하나의 마커에 특이적인 결합 분자인 방법.
125. 구현예 124에 있어서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
126. 구현예 124 또는 구현예 125에 있어서, 상기 결합 분자는 검출 가능하도록 표지되어 있는 방법.
127. 구현예 122 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 검출하는 단계는 유세포 분석에 의한 것인 방법.
Ⅶ. 실시예
다음 실시예는 예시 목적으로만 포함되며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1: g-NK 대리 표면 마커의 식별
세포 내 마커 FceRIγ(FcRγneg)에 대해 음성인 g-NK 세포를 식별하기 위한 대리 표면 마커로 사용될 수 있는 세포 외 표면 마커의 조합을 확인하기 위한 연구가 수행되었다. g-NK 세포의 백분율은 g-NK 세포 서브세트 CCD45pos/CD3neg/CD56pos/ FcRγneg를 식별하기 위해 FceRIγ에 대한 세포 내 염색 및 CD45, CD3 및 CD56에 대한 세포 외 염색에 의해 유세포 분석에 의해 인간 말초 혈액 샘플에서 결정되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 샘플의 g-NK 세포 중 NK 세포 표현형 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 가지고 세포 외 표면 표현형이 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 또는 NKG2Aneg/CD161neg인 세포는 샘플의 g-NK 세포의 존재와 높은 상관관계가 있다. 구체적으로, CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 또는 NKG2Aneg/CD161neg NK 세포 서브세트 내의 g-NK 세포의 백분율은 둘 다 80% 이상이었다.
실시예 2: FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)의 우선적 증식 방법
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 CMV 양성 인간 공여자로부터의 전혈로부터 Histopaque®밀도 원심 분리에 의해 또는 제조업체의 지침에 따라 CMV 혈청 음성 공여자를 비교하기 위해 분리되었다. PBMC를 버피 코트(buffy coat)에서 수확하여 세척하고, 생존 가능한 CD45+ 세포에 대한 유세포 분석법으로 평가하였다 (잔류 적혈구에서 PBMC를 구별하기 위해). 약 2/3의 자가 PBMC가, T 세포를 제거하기 위한 CD3+ 세포의 고갈 (CD3 고갈), CD57+ NK 세포를 농축하기 위한 CD57에 대한 양성 선별 또는 CD16에 대한 양성 선별 (CD16+ NK 세포 및 단핵구 농축)에 따른 CD3 고갈에 의한 Miltenyi MACS ™Microbeads를 사용한 면역 친화성 기반 자기 비드 분리에 의한 자연 살해 (NK) 세포의 농축에 사용되었다. 대안적으로, NK 농축은 CD3 고갈에 이어 CD56 농축 (T 세포 제거 및 NK 세포 농축)으로 수행할 수 있다.
분리된 g-NK 세포의 백분율은 세포 외 표면 마커 CD45, CD3, CD56, CD16, CD57, CD7 및 CD161의 조합으로 세포를 염색하거나 항-FceRI 항체를 사용하여 세포 내 염색으로 측정하였다. g-NK 세포의 백분율은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/FceRIneg (FcRγneg)인 생존 가능한 세포로 확인되었다. 세포 분류가 증식 또는 기능 분석 전 (또는 후에) 수행되는 경우, 세포 외 표면 염색만 사용할 수 있으며 g-NK 세포의 백분율은 CD45pos/CD3neg/CD56pos/CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg 림프구 또는 CD45pos/CD3neg/CD56pos/NKG2Aneg/CD161neg, 또는 이의 생존 가능한 세포와 같은 대리 표면 마커 프로파일을 사용하여 식별된다.
갓(Freshly) 분리된 NK 세포를 즉시 NK 세포 증식에 사용하거나 증식 전 동결 보존하고 해동시켰다. NK 세포 증식 프로토콜은 동결/해동되어 농축되어 있는 NK 세포 및 동결/해동된 PBMC로부터 농축된 NK 세포 모두에 사용될 수 있다.
증식에 앞서, HLA-Ebright 221.AEH 림프종 세포는 생존 가능한 CD71pos (표적 세포 마커) 세포의 수를 측정하여 영양 세포로 준비되었다. 221.AEH는 HLA-E(HLA-Ebright)를 고도로 발현하는 721.221 세포주에서 파생된 형질 전환체이다 (Lee et. Al 1998, J Immunol 160:4951-60). 전술한 바와 같이 PBMC의 포스트-자기 비드 분리 후 농축된 NK 세포 수의 약 2.5 배인 다수의 221.AEH 표적 세포를 RPMI-1640 + 10% 소태아 혈청에서 1 x 106 세포/mL로 재현탁시켰다(FBS). 재현탁 된 221.AEH 세포를 100 Gy에서 조사하였다. 또한, 상기 분리된 나머지 1/3의 자가 PBMC도 증식을위한 영양 세포로 사용하기 위해 조사되었다 (100 Gy). 증식 중 영양 세포로 조사 된 PBMC를 사용할 필요는 없지만 연구 결과는 이로 인해 NK 세포 증식의 효능이 향상되었음을 나타내었다.
신선하거나 해동된 자기적으로 농축된 NK 세포를 5% 인간 AB (또는 자가) 혈청 및 100 IU/mL 재조합 IL-2가 보충된 95% 무혈청 배지 (예: CellGenix GMP 줄기 세포 성장 배지 (SCGM))로 구성된 배양 배지에 0.2 x 106 NK 세포/mL의 농도로 약 10 x 106 NK 세포를 접종하였다. 0 일에 시작하여, 접종된 NK 세포를 5:1의 PBMC 대 NK 세포 비율로 조사된 자가 PBMC 및 2.5:1의 221.AEH 대 NK 세포의 비율로 조사된 221.AEH 영양 세포와 공동 배양하였다. 선택적으로, 상기 증식은 조사된 PBMC 영양 세포 없이 수행될 수 있다. 공동 배양된 세포는 37 ℃및 5% CO2에서 14일 (신선한 세포) 또는 21일 (해동된 세포) 동안 배양되었다. 유사한 연구에서는 공동 배양에서 1:1의 NK 세포에 대한 AEH의 비율로 조사된 221.AEH 피더 세포가 포함되는 것을 제외하고 해동된 NK 세포를 상기와 같이 공동 배양하였으며, 21 일이 아닌 14 일 동안 공동 배양하였다.
증식의 처음 5일 동안, 50 ng/mL의 항-CD3 단일클론 항체 (OKT3)를 첨가하여 영양 세포 역할을 하는 PBMC를 활성화시켰다. 신선하거나 해동된 세포의 경우, 항-CD3 항체는 5일 후에 세척하고 그 후 2 ~ 3 일마다 100 IU/mL 재조합 IL-2를 보충하였다 (14일 증식을 진행하는 신선한 세포 또는 해동된 세포의 경우 d5, d7, d9, d11 및 d14; 21일 증식을 진행하는 해동된 세포의 경우 d5, d7, d9, d11, d14, d16, d18 및 d21). 어떤 경우에는 14 일 증식을 위해, 5일, 7일 및 10일에 새로운 재조합 IL-2가 있는 배지를 보충하였다. 배지를 변경하거나 보충 할 때마다 세포 수를 카운팅하였다. g-NK의 백분율은 d7 및 d14에 유세포 분석에 의해 평가되었다.
14일 증식 프로세스의 예시적인 요약이 도 2a에 도시되어 있다.
비교를 위하여, NK 세포는 NKG2Cpos NK 세포를 증식하도록 설계된 대체방법에 의해 증식되었다 (Bigley et al. 2016, Clin Exp Immunol 185: 239-251에 설명됨). 대체방법에서, NK 세포는 CD3 고갈 이후 CD56 MicroBeads (Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성 선별 (그러나 위에서 설명한 바와 같이 증식 전에는 CD16 또는 CD57 자기 농축(magnetic enrichment)을 포함하지 않음)에 의해 농축되었다. 농축된 NK 세포는 30 ng/ml 재조합 IL-15 및 조사되지 않은 영양 세포인, 721.221 (HLA-Eneg 림프종) 또는 221.AEH (HLA-Ehigh 림프종) 표적 세포와 함께 10:1 NK 세포 대 표적 세포 비율로 37 ℃에서 14 일 동안 배양되었다. 상기 대체방법은 영양 세포로서 항-CD3 활성화 된 자가 PBMC를 포함하지 않았다. 상기 대체방법은 또한 소 태아 혈청을 함유하는 배양 배지를 포함하였다.
g-NK (CD45pos/CD3neg/CD56pos/FceRIneg)의 백분율은 0 일 및 증식 말기 (14 일 또는 21 일)에 유세포 분석에 의해 결정되었다. 구체적으로, g-NK의 백분율은 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입한 FcRγ항체를 사용하여 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다.
도 2b 및 2c는 14 일 증식 (신선한 세포) 및 해동된 세포의 21 일 증식에 대해 증식 말기에 상기 방법에 의해 관찰된 NK 세포 증식을 도시한다. 도 2d 및 2e는 CD3 고갈 후 CD16 농축 (CD3negCD16pos)을 수반하는 과정에 대한 결과를 나타내고 해동된 세포로부터 14 일 증식에 대한 결과를 나타내는 것을 제외하고 유사한 결과를 나타낸다. CD3 고갈 만이 농축된 NK 세포 (CD3neg)로 시작하여 제공된 방법으로 증식을 수행한 경우, 14 일 후에 1000만 NK 세포로부터 평균 12억 g-NK 세포로 증식되었으며, 이는 이 방법으로 증식된 21 억 NKG2Cpos의 서브세트를 나타낸다. 관찰된 증식은 21일 증식의 경우 도 2b (CMVpos CD3neg 14d 대 CMVpos CD3neg 해동 21d 비교)에 도시된 바와 같이, 또는 14 일 증식의 경우 도 2d에 도시된 바와 같이 (CMVpos CD3neg 14d 대 CMVpos CD3neg 해동 14d 비교), 이 방법이 신선하게 농축된 NK 세포 (14 일)로 수행되었는지 또는 이전에 동결 및 해동된 NK 세포로 수행되었는지에 상관없이 유사하였다. NK-세포에 대한 더 낮은 221.AEH 비율이사용 되었기 때문에 (도 2b에서 해동된 NK-세포의 증식에 대해 1:1 대 2.5:1) 해동된 NK- 세포의 증식은 도 2d에 도시된 데이터 세트에 비해 우수하였다. 구체적으로, 한 실험에서 초기에 CD3 고갈 만으로 농축된 NK 세포의 경우, 약 12 억 g-NK가 신선한 NK 세포에서 증식 된 반면, 동결 NK 세포의 경우 7 억 g-NK가 증식되었다. 도 2d에 도시된 바와 같이, 제공된 방법은 증식에 선행하여 CD3-CD16+ 세포를 초기에 농축하여 수행되었을 때, 평균 수율은 CD3 고갈 에만 의할 때에 비해 다소 증가하였다. 제공된 방법이 증식에 선행하여 CD3-/CD57+ 세포를 초기에 농축하여 수행한 경우, 평균 수율은 14 일 후 초기 1000 만 농축 NK 세포에서 시작하여 약 80 억 g-NK 세포로 실질적으로 증가하였다. 대조적으로, 대체방법 (Bigley et al. 2016)은 동일한 시작 집단에서 약 2,300 만 g-NK (또는 약 4천 5백만 NKG2Cpos NK 세포)를 산출하였다.
도 2c 및 2e에 도시된 바와 같이, CMVpos 공여자로부터 증식 후 g-NK 세포의 백분율은 증식 이전에 농축된 NK 세포 집단에서 g-NK 세포의 백분율과 비교하여 증가되었다. NK 세포 대 221.AEH를 2.5:1의 동일한 비율로 공동 배양을 수행했을 때, 이전에 동결되지 않았고 14일 동안 증식된 신선한 NK 세포의 농축이 이전에 동결되고 21일 동안 증식된 NK 세포에 비해 더 크게 나타났다 (도 2c, CMVpos CD3neg 14d 대 CMVpos CD3neg 해동 21d 비교). 도 2e에 도시된 바와 같이 동결된 NK 세포의 비율을 더 높게 하여 (221.AEH 대 NK 세포의 1:1 비율) 공동 배양을 수행한 경우, 증식 말기의 g-NK 세포의 비율은 신선하거나 동결되어 시작된 NK 세포 사이에서 유사하였다. 이러한 결과는 평균적으로 해동된 PBMC가 14 일 후에 신선한 샘플과 유사한 증식을 달성할 수 있음을 보여준다.
CD3 고갈 전-증식에 의해 농축된 NK 세포 중에서, g-NK의 백분율은 초기 NK- 세포의 6%에서 증식 후 28%로 증가하였다. CD3 고갈 후 CD16을 선별에 의해 NK 세포를 초기 농축한 경우 더 큰 증가가 관찰되었다. 그러나, CD3 고갈 단독 또는 CD16pos 세포의 농축에 의해 NK 세포를 농축하는 것과 대조적으로, 초기 NK 세포가 증식 전에 CD3neg/CD57pos 세포에 대해 농축되었을 때 비례 증가가 특히 컸다. 구체적으로, NK 세포가 CD3 고갈 후 CD57 양성 선별에 의해 농축되었을 때 NK 세포의 초기 28%에서 증식 후 82%로 g-NK의 백분율 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 제공된 프로세스가 1000 배 이상의 증식률로 높은 수율을 가져올 수 있음을 뒷받침한다.
이 연구에서, 다른 공여자보다 훨씬 더 높은 g-NK 수율을 가진 '수퍼 공여자(super donor)'가 확인되었다. 이 '슈퍼 공여자'에서, CD3 고갈에 이은 CD57 양성 선별 전-증식에 의해 NK 세포를 농축하였을 때, 1000 만 NK 세포는 14 일 후 276 억 g-NK를 생산하였으며 g-NK의 비율은 휴지 상태의 31%에서 증식 후 85%로 증가하였다.
CMV-혈청 음성 공여자에서, g-NK의 훨씬 더 작은 증식이 관찰되었으며, CMV- 혈청 음성 공여자로부터의 1000 만 NK 세포로 시작하여 평균 2,600 만 g-NK의 수율이 관찰되었다 (도 2b 및 2d). CMV-혈청 음성 공여자에서, g-NK 서브세트에 대해 선호적인 증식이 보이지는 않았다 (0 일에 2.1% 대 14 일에 1.7%)(도 2c 및 2e). 더욱이, 이러한 발견은 g-NK가 "기억 유사(memory-like)" NK 세포이고 (cells (Zhang et al., 2013, J Immunol 190:1402-1406) NKG2Cpos NK 세포 (CMV 혈청 양성 공여자로부터)가 동종 HSCT 수용자에서 CMV 재활성화에 반응하여 증식되고 CMV-혈청 음성 공여자는 그렇지 않는다는 이전 연구 (Foley et al., 2012, Blood 119:2665-2674)와 일치한다.
EBV의 존재는 하기 기재된 바와 같이 게놈 분석에 의해 결정되었다. 간략히 서술하면, 세포를 37℃수조에서 해동하고 5ml 따뜻한 배지로 옮긴 다음 원심 분리하고 신선한 배지에 재현탁하였다. 각 샘플로부터 4 x 106 세포를 2ml 튜브에 분취하고 나머지 세포를 90% FBS + 10% DMSO에서 동결시키고 -80℃에 보관하였다. Pure Link 게놈 DNA 미니 키트 (Cat # K1820-00 Invitrogen)를 사용하여 세포에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출하고 Qubit (DNA BR)을 사용하여 정량화하고 TapeStation (gDNA 테이프)을 사용하여 품질을 확인하였다. qPCR에서는 반응 당 50ng의 gDNA를 사용하였다 (Brilliant III Ultra-Fast SYBR®Green mastermix, Cat # 600883, Agilent). EBNA1 및 GAPDH (IDT) 용 프라이머를 사용하여 EBV를 검출하고 정량화하였다. 그 결과는 조사된 221.AEH 영양 세포로 증식된 세포에서 EBV가 발견되지 않음을 보여주었다.
실시예 3: 증식된 NK 세포의 세포 독성 활성 평가
실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성이 대체방법과 비교하여 표적 특이적인 세포 독성 활성을 평가함으로써 확인되었다.
실시예 1에 기술된 증식으로부터 동결된 NK-세포를 해동하고 NK 세포 독성을 이펙터 대 표적세포 비율을 1:1로 HLA-결핍 K562 및 HLA-Ebright 221.AEH 세포주와 함께 14 일 증식된 NK 세포의 공동 배양에 의해 평가되었다. 37 ℃에서 4 시간 배양한 후, 프로피듐 요오드화물 (PI)을 추가하고 NK 세포, 살아있는 표적세포 및 죽은 표적세포의 수를 4 색 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. NK 세포 세포 독성은 특정 용해의 백분율로 정량화되었다 (총 용해 % - 자연 세포 사멸 %). 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 기재된 대체방법에 의해 증식된 NK 세포는 (비증식 세포 대비) HLA-결핍 K562 및 HLA-Ebright 221.AEH 세포주의 NK-세포 사멸을 각각 15%에서 40% 및 5%에서 20%로 향상시킬 수 있었다. 그러나, 농축된 CD3negCD57pos NK 세포로부터 시작하는 실시예 1에 기재된 방법은 K562 및 221.AEH 세포의 각각 80% (대체방법의 경우 40%) 및 53% (대체방법의 경우 20%)를 죽일 수있는 증식 된 NK 세포를 생성하였다 (도 3).
실시예 4: 항-CD20 항체와 병용된 증식된 NK 세포의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)의 평가
실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성은 항-CD20 항체와 병용된 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 평가함으로써 확인되었다.
ADCC 세포 독성 분석을 위해, 실시예 2에 기술된 증식으로부터 동결된 NK 세포를 해동하고 37 ℃에서 1 시간 동안 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. NK 세포를 0.5:1, 1:1, 2.5:1, 5:1 및 10:1 NK 세포 대 표적세포 비율로 RAJI 표적 세포 (1.0 x 104 세포, CD20+ B 세포 종양 세포주)와 함께 10 μg/mL Rituximab (anti-CD20)의 존재 하에 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. ADCC는 종양 표적세포를 식별하기 위해 항-CD71 항체와 세포 사멸의 마커로서 요오드화 프로피듐 (PI)를 사용한 염색에 기반한 유세포 분석법에 의해 결정되었다 (Bigley et al., (2014) Brain Behav Immun., 39: 160 -71). 도 4a에 도시된 바와 같이, ADCC는 g-NK가 낮은 대상체 [g-NK평균 = 2% 증식 전, n = 4] (10:1 비율에서 31% 사멸)보다 g-NK가 높은 대상체 [g-NK 평균 = 24% 증식 전, n = 4]에서 상당히 더 높게 나타났다 (10:1 비율에서 94% 사멸).
상이한 서브세트의 활성을 비교하기 위해, 증식된 NK 세포를 생존 가능한 NK 세포 및 세포 외 표면 마커에 대한 유세포 분석법에 의해 3 가지 범주로 분류 하였다: 기존(conventional) [cNK; CD45+/CD3-/CD56+/NKG2C-], 적응(adaptive) (NKG2C+) [CD45+/CD3-/CD56+/ NKG2C+/NKG2A-], 및 g-NK [CD45+/CD3-/CD56+/CD16+/CD57+/CD7-/CD161-]. g-NK는 세포 외 표현형 [[CD45+/CD3-/CD56+/CD161-/NKG2A-]를 사용하여 분류할 수도 있다. 이 실험에 서는 기존, 적응 (NKG2Cpos) 및 g-NK를 g-NK 세포가 가장 높은 4 명의 대상체(g-NK평균 = 25.3 ±8.5%)로부터 얻었다. 도 4b에 도시된 바와 같이 g-NK는 NKG2Cpos 또는 기존 NK 세포 (각각 30% 또는 24%)보다 1:1의 NK-세포 대 표적세포 비율에서 훨씬 더 나은 ADCC 사멸 (76%)을 가졌다. 더욱이, g-NK의 기능은 그들이 신선하거나 이전에 동결된 NK- 세포로부터 유래되었는지에 관계없이 유사했다 (도 4b). 위에서 설명한 '슈퍼 공여자'는 NKG2Cpos 또는 기존 NK 세포 (각각 55% 또는 38%)보다 1:1의 NK 세포 대 표적세포 비율에서 훨씬 더 잘 사멸시키는 (97%) 증식된 g-NK를 가졌다.
이러한 결과는 제공된 방법이 NKG2Cpos 또는 기존 NK-세포보다 훨씬 우수한 ADCC 사멸자(killer)인 g-NK를 단 2 주만에 수십억 개 생성할 수 있음을 입증한다.
실시예 5: ERBB 패밀리 특이적 항체와 병용한 증식된 NK 세포의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) 평가
대체방법과 비교하여 실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성은 항-HER2 항체와 병용된 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 평가함으로써 확인되었다.
공여자는 CMV 혈청 양성 (n = 4)이었고 자기적으로 분류된 NK 세포 (증식 전 g-NK 백분율 = 18.3 ± 2.9%)는 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 증식되었다. 증식된 NK 세포는 CD57 마이크로 비드를 사용하여 자기적으로 CD57+ 'g-NK' 및 CD57- 'cNK' 분획으로 분류되고 이후의 ADCC 분석을 위해 동결 보존되었다. CD57+ 및 CD57- 분획의 실제 g-NK 백분율은 각각 82.2 ± 1.6% 및 2.4 ± 0.7%였다. CD57+ 및 CD57- 분획 내의 g-NK 백분율은 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입한 FcRγ항체를 사용하여 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다. ADCC 세포 독성 분석의 경우, 이전 증식에서 얻은 동결 NK 세포를 해동하고 37 ℃에서 1 시간 동안 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. ADCC 분석은 유방암 세포주 SKBR3 및 두경부암 세포주 CAL27을 표적으로 사용하여 수행되었다. 앞서 설명했듯이 (Bigley et al., 2014), 증식된 NK 세포는 2.2 mL의 표적세포 특이적 배지의 최종 부피에서 1:1, 5:1, 10:1 및 20:1의 NK 세포:표적세포 비율로 CD71 표지된 SKBR3 및 CAL27 표적 세포 (1.0 x 104 세포)와 공동 배양되었다. SKBR3 분석에 사용된 배지는 2.5 μg/mL 트라스투주맙 (trastuzumab) (항-HER2)과 함께 10% FBS 보충된 McCoy's 5A 배지였고, CAL27 분석에 사용된 배지는 10 μg/mL 세툭시 맙(cetuximab) (항-EGFR)과 함께 10% FBS가 보충된 DMEM 이었다. 각각의 경우, 항체 처리없이 기초 세포 독성도 측정되었다. 자발적인 세포 사멸을 제어하기 위해 (모든 분석에 대해 10% 미만) 표적세포 전용 튜브를 사용하였다. 항체 단독으로 인한 세포 사멸(cell death)을 설명하기 위한 표적세포 + 항체 튜브 (NK 세포가 추가되지 않음)도 있었다. 37 ℃에서 4 시간 배양한 후, 세포를 세척하고 항-CD3 및 CD56 항체로 염색하여 튜브 내 NK 세포의 수를 정량화하였다. 최종 세척 후, 프로피듐 요오드화물 (PI)을 첨가하고 NK 세포, 살아있는 표적세포 및 죽은 표적세포의 수를 4 색 유세포 분석을 사용하여 분석하였다 (Bigley et al., 2018). 세포 독성은 각 NK 세포 용량에서 총 사망률 (%)에서 자발적 세포 사망률 (%)을 빼서 결정하였다 (기초 세포 독성 = 총 사망률 (%)-자발적 세포 사망률 (%)). SKBR3 및 CAL27 세포주는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.
도 5a 및 5b에 도시된 바와 같이, g-NK는 기존 NK 세포보다 SKBR3 및 CAL27 표적을 훨씬 더 잘 죽이는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, g-NK는 트라스투주맙이 존재할 때 20:1의 NK:표적 비율에서 SKBR3 세포의 46%를 사멸시켰으며, 이는 동일한 비율에서 cNK에 의해 사멸된 SKBR3 세포의 18%보다 훨씬 컸다 (n = 4) (도 5a). 기초 세포 독성(트라스투주맙 제외)은 20:1의 NK:표적 비율에서 g-NK의 경우 18%, cNK의 경우 14%였다. 기존 NK 세포의 ADCC는 g-NK 세포의 기초 세포 독성과 동일하였다. 유사하게, 도 5b는 세툭시맙이 존재할 때 20:1의 NK:표적 비율에서 g-NK가 CAL27 세포의 80%를 사멸시켰음을 보여주는 결과를 도시하며, 이는 동일한 비율에서 cNK에 의해 사멸된 CAL27 세포의 50% 보다 훨씬 컸다 (n = 4). 기초 세포 독성 (세툭시맙 제외)은 20:1의 NK:표적 비율에서 g-NK 및 cNK 모두에 대해 12%였다.
상기와 동일한 공여자 NK 세포를 사용한 또 다른 일련의 실험에서, NK 세포를 대장암 세포주 HT-29 및 SW-480 또는 폐암 세포주 A-549 표적 세포와 1:1, 5:1, 10:1 및 20:1의 NK 세포 대 표적세포 비율로 배양하였다. HT-29 분석에 사용된 배지는 5 μg/mL 세툭시맙이 포함된 10% FBS 보충된 McCoy's 5A 배지였고; SW-480 분석에 사용된 배지는 5μg/mL 세툭시맙이 포함된 10% FBS 보충된 Leibovitz's L-15 배지였으며, A-549 분석에 사용된 배지는 5μg/mL 세툭시맙이 포함된 10% FBS 보충된 F-12K 배지였다. ADCC는 종양 표적 세포를 식별하기 위한 항-CD71 항체 및 세포 사멸의 마커로 PI를 사용한 염색에 기반한 유세포 분석법에 의해 결정되었다. 치료 항체가 없는 상태의 기초 세포 독성을 측정하였다.
도 6a-6c에서의 결과는 g-NK가 HT-29, SW-480 및 A-549 표적을 cNK보다 훨씬 더 잘 죽이는 것으로 밝혀졌음을 보여준다 (상기와 동일한 공여자 NK-세포 사용). 구체적으로, 도 6a에 도시된 바와 같이, g-NK는 세툭시맙이 존재할 때 20:1 NK: 표적 비율로 HT-29 세포의 35%를 사멸시켰으며, 이는 동일한 비율에서 cNK에 의해 사멸된 HT-29 세포의 14%보다 우수했다(n = 4). 기초 세포 독성(세툭시맙 없이)은 20:1 NK:표적 비율에서 g-NK의 경우 14%, 기존 NK-세포의 경우 11%였다. 유사하게, 도 6b는 세툭시맙이 존재할 때 20:1 NK:표적 비율에서 g-NK가 SW-480 세포의 56 %를 사멸시켰음을 보여주는 결과를 도시하며, 이는 동일한 비율에서 cNK에 의해 사멸된 SW-480 세포의 23%보다 훨씬 컸다(n = 4). 기초 세포 독성 (세툭시맙 없이)은 20:1 NK:표적 비율에서 g-NK의 경우 24%, cNK의 경우 18%였다. 또한, 도 6c는 세툭시맙이 존재할 때 g-NK가 20:1 NK:표적 비율로 A-549의 62%를 사멸시켰음을 보여 주며, 이는 동일한 비율로 cNK에 의해 사멸된 A-549 세포의 23%보다 현저하게 우수했다(n = 4). 기초 세포 독성 (세툭시맙 없이)은 20:1 NK:표적 비율에서 g-NK의 경우 23% 및 기존 NK-세포의 경우 17 %였다. cNK의 ADCC는 3개 세포주 모두에서 g-NK 세포의 기초 세포 독성과 동일하였다.
이를 종합하면, 상기 결과는 증식된 g-NK가 액체 및 고형 종양뿐만 아니라 NK- 세포 ADCC에 매우 또는 경미하게 감수성인 종양에 대해서도 ADCC를 향상시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 6: 증식된 NK 세포의 생체 내 지속성 평가
NK-세포는 실시예 2에 기술된 바와 같이 증식되었다. 1주 순응(acclimation) 후, 1x107 증식된 g-NK (신선 또는 동결/해동) 또는 cNK (동결/해동)의 단일 용량을 IL-15 보충제 (3 일마다 2 μg I.P.)와 함께 암컷 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 주입하였다 (표 1 참조). g-NK는 단일 CMV-혈청 양성 공여자로부터 증식되었고 (g-NK의 백분율은 증식 전 61% 및 증식 후 90% 임), cNK는 단일 CMV-혈청 음성 공여자로부터 증식되었다 (g-NK의 백분율은 증식 전 및 증식 후 0%). g-NK의 백분율은 세포 내 유세포 분석을 사용하여 확인되었다. 본 연구에서 사용하기 위해 증식 후 동결되고 해동된 세포의 경우 동결된 세포의 동결 배지는 90% FBS 및 10% DMSO였다. 동결 세포 산물은 마우스에 투여하기 전 온수 욕조 (37℃에서 빠르게 해동하였다.
각각의 NK 세포의 생체 내 지속성을 결정하기 위해 각각의 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 수집을 위해, 50 μL 혈액 채취는 EDTA 진공 채혈기를 사용하여 얻어졌고 추후 유세포 분석을 위해 주입 후 5, 8, 14, 15 및 22 일에 동결 (10% DMSO 첨가)되었다 (도 7a). 22 일에 모든 마우스를 희생시키고 골수 및 비장을 생존 가능하게 동결시켰다 (90% FBS 및 10% DMSO) (각각 도 7b, 7c).
지속성 연구 설계
그룹 넘버 처리군 (Arm) 마우스 수 NK 투여일 혈액 수집일
1 IL-15 + 신선 g-NK 3 1 1, 5, 8, 14, 15, 22 (sac)
2 IL-15 + 동결 g-NK 3 1 1, 5, 8, 14, 15, 22 (sac)
3 IL-15 + 동결 cNK 3 1 1, 5, 8, 14, 15, 22 (sac)
도 7a에 도시된 바와 같이, 모든 시점 (5 일, 8 일, 14 일, 15 일 및 22 일)에 대해 관찰된 바와 같이, 새로 분리되거나 동결-해동 된 g-NK 둘 다 NSG 마우스의 혈류에서 동결-해동된 cNK보다 실질적으로 더 오래 지속되었다. 특히, 22일 후 비장에 cNK가 거의 남아 있지 않은 반면, g-NK는 상당수가 검출되었다 (도 7b). 골수에서 g-NK의 지속성은 cNK의 지속성보다 우수했다 (도 7c).
실시예 7: 항-CD20 항체와 병용한 증식된 NK 세포에 의한 항 종양 활성 평가
실시예 2에 기술된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성은 항-CD20 항체와 병용하여 주입될 때 생체 내 종양에 대한 억제를 평가함으로써 확인되었다.
5 x 105 루시페라제 표지된 Raji 인간 림프종 세포주를 암컷 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 정맥 내 주사하고 2일 동안 성장시켰다. 단일클론 항체 리툭시맙은 I.P.로 마우스에, 단독으로 또는 I.V.로 15 x 106의 증식된 g-NK 세포 (실시예 2)와 병용하여 21일 동안 3회 투여하였다 (표 2 참조). 생물 발광 이미징을 사용하여 매주 종양 크기를 모니터링하고 생존율을 2 또는 3 일마다 기록하였다. g-NK는 단일 CMV-혈청 양성 공여자로부터 증식되었고 (g-NK의 백분율은 증식 전 61% 및 증식 후 90% 임), cNK는 단일 CMV-혈청 음성 공여자로부터 증식되었다 (g-NK의 백분율은 증식 전 및 증식 후 0% 임). g-NK의 백분율은 세포 내 유세포 분석을 사용하여 확인하였다
Raji 효능 연구 설계
그룹 넘버 처리군 (Arm) 마우스 수 항체 투여일 NK 세포 투여일
1 미처리 8 N/A N/A
2 리툭시맙(Rituximab) 200 μg I.P. 8 1, 8, 15 N/A
3 15e6 신선한 g- NK I.V. + 200 μg 리툭시맙(rituximab) I.P. 8 1, 8, 15 1, 8, 15
g-NK의 입양 전달(adoptive transfer)은 Raji 림프종의 이종 이식 모델에서 리툭시맙의 효능을 크게 향상시켰고, g-NK의 주입은 처리되지 않은 마우스 또는 리툭시맙 단독으로 처리 마우스에 비해 NSG 마우스의 생존을 향상시킬 수 있었다. 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, 미처리 마우스는 주사 7 일 후 급속한 종양 성장을 보였고 모든 미처리 마우스는 25 일 이전에 사망하였다. 리툭시맙만 투여받은 마우스는 28 일 이후에도 지연되었지만 여전히 빠른 종양 성장을 보였고, 30 일 이후 생존이 감소하기 시작하였다. 리툭시맙과 함께 g-NK를 투여받은 마우스는 28 일 후에 약간의 종양 성장을 보였고 모든 마우스는 35 일까지 생존하였다.
이러한 결과는 단일클론 항체와 병용될 때 g-NK의 항 림프종 효과를 생체 내에서 이용할 수 있음을 입증한다.
실시예 8: 항-CD38 항체 또는 항-CD319 항체와 병용한 증식된 NK 세포의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC) 평가
대체방법과 비교하여 실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성은 다라투마맙(Daratumamab) (항-CD38) 또는 엘로투자맙(Elotuzamab) (항 -CD319)과 병용하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 평가함으로써 확인되었다.
증식 전 (신선하게 분리된) ADCC: 공여자는 CMV-혈청 양성 (n = 14) 및 CMV-혈청 음성 (n = 2)이었다. 모든 공여자는 g-NK 세포의 백분율에 대해 사전 선별되었고, g-NK 세포의 비율을 기준으로 'g-NK' 공여자 (n = 10 CMV+) 또는 '기존' 공여자 (n = 4 CMV+, n = 2 CMV-)로 분류되었다.. 'g-NK' 공여자의 g-NK 비율은 30.0 ± 2.1% 였고, '기존' 공여자의 g-NK 비율은 1.6 ± 0.4%에 불과했다. CD57+ NK 세포는 'g-NK' 공여자로부터 자기적으로 분류되었고 벌크 NK 세포 (CD3-/CD56+)는 '기존' 공여자로부터 자기적으로 분류되었다. 'g-NK'및 '기존' 공여자의 자기적으로 분류된 분획의 실제 g-NK 비율은 각각 84.3 ± 2.4% 및 1.6 ± 0.4%였다. 각 분획 내의 g-NK 백분율은 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입한 FcRγ항체를 사용하여 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다.
ADCC 세포 독성 분석을 위해, 동결된 PBMC를 해동시키고 37 ℃에서 1 시간 동안 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 그런 다음 자기적 비드 분리를 수행하여 CD57+ NK 세포와 벌크 NK 세포를 각각 'g-NK' 및 '기존' 공여자로부터 분리하였다. ADCC 분석은 다발성 골수종 세포주 MM.1S (ATCC, Manassas, VA)를 표적으로 사용하여 수행되었고, NK 세포는 Bigley et al. 2014에 설명된 방법과 유사하게 CD71 표지된 MM.1S 표적 세포 (1.0 x 104 세포)와 0.5:1, 1:1, 2.5:1 및 5:1의 NK 세포:표적세포 비율로 2.2 mL의 표적 세포 특이적 배지의 최종 부피에서 공동 배양되었다. ADCC 분석에 사용된 배지는 1μg/mL 다라투무맙(daratumumab) (항-CD38) 또는 1 μg/mL 엘로투주맙(elotuzumab) (항-CD319)이 포함된 10% FBS 보충된 RPMI-1640 배지였다. 각각의 경우, 치료적 항체 없이 기초 세포 독성도 측정되었다. 자발적인 세포 사멸을 제어하기 위해 (모든 분석에 대해 10% 미만) 표적세포 전용 튜브를 사용하였다. 37 ℃에서 4 시간 배양한 후, 세포를 세척하고 항-CD3 및 CD56 항체로 염색하여 튜브 내 NK 세포의 수를 정량화하였다. 최종 세척 후, 프로피듐 요오드화물 (PI)을 첨가하고 NK 세포, 살아있는 표적세포 및 죽은 표적세포의 수를 4 색 유세포 분석을 사용하여 분석하였다 (Bigley et al., 2018).
증식 후 (증식된) ADCC: 5 명의 공여자를 g-NK 세포의 백분율에 대해 사전 스크리닝하고 g-NK 세포의 비율에 따라 'g-NK'공여자 (n = 3) 또는 '기존' 공여자 (n = 2)로 분류하였다. 'g-NK' 공여자의 g-NK 비율은 30.3 ± 2.0% 이었고, '기존'공여자의 g-NK 비율은 1.6 ± 0.4%에 불과하였다. CD57+ NK 세포는 'g-NK' 공여자로부터 자기적으로 분류되었고 벌크 NK 세포 (CD3-/CD56 +)는 '기존' 공여자로부터 자기적으로 분류되었다. 'g-NK' 및 '기존' 공여자의 자기 분류 분획의 실제 g-NK 백분율은 각각 84.0 ± 2.5% 및 1.6 ± 0.4%였다. 이어서, g-NK 및 cNK 분획을 실시예 2에 기재된 바와 같이 증식시키고 상기 기재된 바와 같이 이후의 ADCC 검정을 위해 동결 보존하였다.
g-NK는 다라투무맙 또는 엘로투주맙과 병용될 때 cNK보다 MM.1S 다발성 골수종 세포에 대해 더 큰 ADCC를 갖는다. 구체적으로, 신선하게 분리된 g-NK는 다라 투무맙 또는 엘로투주맙이 존재할 때 모든 4 개의 NK-세포 용량에서 cNK보다 MM.1S 세포에 대해 현저하게 더 높은 세포 독성을 가졌다 (도 9a 참조). 유사하게, 증식 된 g-NK는 다라투무맙 또는 엘로투주맙과 병용될 때 증식된 cNK보다 더 큰 항 골수종 ADCC를 가졌다 (도 9b 참조). 항체가 존재하지 않을 때 MM.1S 세포에 대한 g-NK 및 cNK (비증식 또는 증식된)의 세포 독성 사이에는 차이가 없었다 (도 9a 및 9b 참조). 전반적으로, 이 데이터는 g-NK가 다발성 골수종에 대해 강한 항체 의존적 세포 독성 활성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 9: 항-CD38 항체 또는 항-CD319 항체와 병용한 증식된 NK 세포에 의한 항-종양 활성 평가
실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성을 항-CD38 항체 또는 항-CD319 항체와 병용하여 주사될 때 생체 내 종양에 대한 억제를 평가함으로써 확인하였다.
1 x 106 개의 루시페라제 표지된 MM.1S 인간 골수종 세포주를 암컷 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 정맥 내 주사하고 7 일 동안 성장시켰다. 단일클론 항체 다라투무맙 또는 엘로투주맙이 I.P. 단독으로 또는 증식된 g-NK 세포 또는 생리학적 수준의 비교 cNK 세포와 병용하여 마우스에게 31 일에 걸쳐 6 회 투여로 I.V. 투여되었다 (표 3 참조). 생물발광이미징을 사용하여 매주 종양 크기를 모니터링하였다. 연구 완료시, 각 NK 집단의 지속성을 결정하기 위한 추후 유세포 분석을 위해 각각 3 마리 마우스로부터 g-NK 및 cNK 처리군 (arm)에서 골수 및 비장 샘플을 수확하고 생존 가능하게 냉동하였다. g-NK는 단일 CMV-혈청 양성 공여자로부터 증식되었고 (g-NK의 백분율은 증식 전 61% 및 증식 후 90% 임), cNK는 단일 CMV-혈청 음성 공여자로부터 증식되었다 (g-NK의 백분율은 증식 전 및 증식 후 0% 임). g-NK의 백분율은 세포 내 유세포 분석을 사용하여 확인되었다.
g-NK 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 증식하고 각 투여량에서 2 x 107 세포로 투여한 반면, 비증식 cNK는 각 투여량에서 3 x 105 세포로 투여하였다. cNK 투여량은 인간에서 NK 세포/kg의 생리학적 수준과 균등하다 (Cooley et al., 2019).
MM 효능 연구 설계
그룹 넘버 처리군 (Arm) 마우스 수 항체 투여일 NK 세포 투여일
1 운반체 대조군 6 N/A
2 다라투무맙 10 ug I.P. 6 1, 7, 13, 19, 25, 31 N/A
3 2e7 신선한 g- NK I.V. + 10 ug 다라투무맙 I.P. 6 1, 7, 13, 19, 25, 31 1, 7, 13, 19, 25, 31
4 3e5 신선한 cNK I.V. + 10 ug 다라투무맙 I.P. 6 1, 7, 13, 19, 25, 31 1, 7, 13, 19, 25, 31
5 엘로투주맙 10 ug I.P. 6 1, 7, 13, 19, 25, 31 N/A
6 2e7 동결 g- NK I.V. + 10 ug 엘로투주맙 I.P. 6 1, 7, 13, 19, 25, 31 1, 7, 13, 19, 25, 31
7 3e5 동결n cNK I.V. + 10 ug 엘로투주맙 I.P. 6 1, 7, 13, 19, 25, 31 1, 7, 13, 19, 25, 31
8 2e7 동결 g- NK 단독 I.V. 6 N/A 1, 7, 13, 19, 25, 31
MM.1S를 접종하고 다라투무맙 또는 엘로투주맙으로 처리한 NSG 마우스에서 종양 크기 및 생존에 대한 입양 전달된 g-NK의 이점은 도 10 및 도 11에 기재되어있다. 다라투무맙 및 g-NK로 처리된 마우스는 다라투무맙 단독 또는 다라투무맙 + cNK 세포의 생리학적 수준으로 처리된 마우스보다 현저히 낮은 종양 크기 (BLI)를 가졌다 (도 10a 참조). 또한, 엘로투주맙 및 g-NK로 처리된 마우스는 엘로투주맙 단독 또는 엘로투주맙 + cNK 세포의 생리학적 수준으로 처리된 마우스보다 더 낮은 종양 크기를 가졌다 (도 10b 참조). 더욱이, 도 11a (다라투무맙) 및 도 11b (엘로투주맙)에서 볼 수 있듯이, g-NK와 다라투무맙 또는 엘로투주맙의 조합은 운반체, mAb 단독, g-NK 단독, 또는 mAb + cNK의 생리학적 수준으로 처리 된 마우스와 비교할 때 우수한 생존을 이끌었다. 전반적으로 이러한 결과는 단일클론 항체와 병용될 때 g-NK의 항 골수종 효과를 생체 내에서 이용할 수 있음을 입증한다.MM.1S를 접종하고 다라투무맙 또는 엘로토주맙으로 처리한 NSG 마우스에서 g-NK의 우수한 지속성은 도 12a-c에 기재되어 있다. 혈액에서 g-NK와 cNK 지속성 사이에는 차이가 없는 반면 (도 12c 참조), g-NK는 cNK보다 다라투무맙 처리 마우스의 비장 및 골수에서 더 높은 수준으로 지속되었다 (도 12a 및 12b 참조). 더욱이, 다라투무맙 처리 마우스의 골수 및 비장에서 g-NK의 수는 다른 모든 그룹보다 더 높았다 (도 12a 및 12b 참조). g-NK는 cNK보다 엘로투주맙-처리된 마우스의 비장 및 혈액에서 더 높은 수준으로 지속된 반면(도 12a 및 12c), 골수에서 g-NK와 cNK 지속성 사이에는 차이가 없었다 (도 12b 참조). g-NK 만으로 처리된 마우스 (다라투무맙 또는 엘로투주맙 제외)의 혈액 내 g-NK의 수는 다른 모든 그룹에 비해 현저하게 높았다 (도 12c 참조).
실시예 10: g-NK 세포에 대한 세포 표면 마커의 평가
이 실시예는 부분적으로 표적 표면 마커의 부족으로 인한 항체로부터 g-NK 세포의 보호를 입증한다.
약 2.0 x 105 개의 NK 세포 및/또는 MM.1S 또는 Raji 세포를 유동 튜브로 분취하고 표 4에 기재된 바와 같이 2 μL의 7-AAD 생존성 염료 및 2 μL의 항-CD45, 2 μL의 항-CD20, 2 μL의 항-CD38, 2 μL의 항-CD3, 10 μL의 항-SLAMF7, 및 2 μL의 항-CD56 항체로 염색하였다. 4 ℃에서 10 분간 배양한 후 세포를 세척하고 항-FceRI 항체 (Millipore)를 사용하여 세포 내 염색을 수행하였다. 염색 과정이 완료된 후, CD20, CD38 및 SLAMF7를 발현하는 g-NK, cNK 및 MM.1S 또는 Raji 세포의 백분율을 8 색 유세포 분석 (Miltenyi MACSQuant Analyzer 10)으로 평가하였다.
NK, MM 및 Raji 세포에서 CD20, CD38 및 SLAMF7 발현을 결정하기 위한 유세포 분석 패널
조건 V1 V2 B1 B2 B3 B4 R1 R2
NK 단독 CD45 CD20 *FcRg CD38 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
NK 단독 CD20 FMO CD45 *FcRg CD38 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
NK 단독 CD38 FMO CD45 CD20 *FcRg 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
NK 단독 SLAMF7 FMO CD45 CD20 *FcRg CD38 7-AAD CD3 CD56
NK + MM CD45 CD20 *FcRg CD38 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
NK + MM CD38 FMO CD45 CD20 *FcRg 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
NK + MM SLAMF7 FMO CD45 CD20 *FcRg CD38 7-AAD CD3 CD56
MM 단독 CD45 CD20 CD38 7-AAD SLAMF7
MM 단독CD38 FMO CD45 CD20 7-AAD SLAMF7
MM 단독 SLAMF7 FMO CD45 CD20 CD38 7-AAD
NK + Raji CD45 CD20 *FcRg CD38 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
NK + RajiCD20 FMO CD45 *FcRg CD38 7-AAD CD3 SLAMF7 CD56
Raji 단독 CD45 CD20 7-AAD
Raji 단독 CD20 FMO CD45 7-AAD
* FcRg 은 세포 내 에피토프이다.
g-NK, cNK 및 MM.1S 세포에 대한 CD20, CD38 및 SLAMF7의 발현이 도 13a-13d에 제시되어 있다. g-NK 및 cNK는 둘 다 Raji 림프종 세포에서 고도로 발현 된 CD20의 발현이 없었다 (도 13a). g-NK에 의한 CD38의 발현은 cNK 및 MM.1S 세포에 대한 것보다 훨씬 적었다 (도 13b 참조). SLAMF7의 발현은 g-NK와 cNK간에 차이가 없었지만, g-NK와 cNK 모두 MM.1S 세포보다 훨씬 낮은 SLAMF7 발현을 나타냈다 (도 13c 참조). 증식된 cNK와 비교할 때 증식된 g-NK에서 CD38의 감소된 발현이 또한 확인되었다 (도 13d 참조). g-NK에 의한 CD20, CD38 또는 SLAMF7 발현의 결여는 리툭시맙 (항-CD20), 다라투무맙 (항-CD38) 또는 엘로투주맙 (항-SLAMF7)에 의한 mAb- 유도된 동종살해(fratricide)로부터 보호를 제공했다. 전반적으로, 이 데이터는 특히 다라투마맙과 같은 치료용 항체가 존재할 때 cNK와 비교하여 g-NK가 어떻게 지속성 이점을 갖는지를 추가로 보여준다.
CD38 발현이 기존의 NK 세포에 비해 g-NK 세포에서 감소하거나 더 낮다는 관찰은 CD38이 g-NK 세포의 농축을 위한 마커로 사용될 수있는 전략을 뒷받침한다. CD38과 g-NK 세포 표현형의 역결합은 실시예 2에 기술된 증식 방법에서 CD57 농축에 대한 대안 전략과 일치한다. 이러한 발견은 T 세포를 제거하기 위한 CD3+ 세포의 고갈 (CD3 고갈)에 이어, CD56+ NK 세포를 농축하기 위한 CD56 선별, 이어서 CD38+ 세포를 제거하거나 고갈시키기 위해 CD38에 대한 음성 선별에 의한 면역 친화성 기반 분리에 의해 NK 세포가 PBMC로부터 농축되는 g-NK 세포, 즉 CD3-CD56+CD38-의 증식을 위한 방법을 서포팅한다. 이러한 NK 세포 서브세트의 분리 및 농축 후, CD3-CD56+CD38- NK 세포 서브세트는 냉동되거나 신선하게 사용될 수 있고 이후 실시예 2 또는 도 2에 기술된 방법에 따라, 예컨대 조사된 221.AEH 표적 세포(예: NK 세포 대 221.AEH가 2.5:1) 및 선택적으로 조사된 PBMC 영양 세포 (예: PBMC 대 NK 세포가 5:1)과 함께 재조합 IL-2 (예: 100 IU/mL)의 존재하에 약 14 일 동안 배양하여, 증식될 수 있다. 조사된 PBMC 영양 세포가 증식에 사용되는 경우, 증식의 적어도 일부는 실시예 2에 기술 된 바와 같이 세포를 활성화하기 위해 항-CD3 단일클론 항체 (OKT3)와의 인큐베이션을 포함한다.
실시예 11: 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 병용한 증식된 NK 세포에 의한 난소암 세포에 대한 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)의 평가
대체방법과 비교하여 실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성을 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 병용된 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 평가함으로써 확인하였다.
증식 전 (신선하게 분리된) ADCC: 공여자는 CMV-혈청 양성 (n = 14) 및 CMV-혈청 음성 (n = 2)이었다. 모든 공여자는 g-NK 세포의 비율에 대해 사전 선별되었고, g-NK 세포의 비율을 기준으로 'g-NK'공여자 (n = 10 CMV+) 또는 '기존' 공여자 (n = 4 CMV+, n = 2 CMV-)로 분류되었다. 'g-NK' 공여자의 g-NK 비율은 30.0 ± 2.1% 였고, '기존' 공여자의 g-NK 비율은 1.6 ± 0.4%에 불과했다. CD57 + NK 세포는 'g-NK' 공여자로부터 자기적으로 분류되었고 벌크 NK 세포 (CD3-/CD56 +)는 '기존' 공여자로부터 자기적으로 분류되었다. 'g-NK' 및 '기존' 공여자의 자기 분류 분획의 실제 g-NK 비율은 각각 84.3 ± 2.4% 및 1.6 ± 0.4% 였다. 각 분획 내의 g-NK 백분율은 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입한 FcRγ항체를 사용하여 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다.
ADCC 세포 독성 분석을 위해, 동결된 PBMC를 해동하고 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 이후 자기적 비드 분리를 수행하여 각각 'g-NK' 및 '기존' 공여자로부터 CD57+ NK-세포 및 벌크 NK-세포를 분리하였다. ADCC 분석은 난소암 세포주 SKOV3 (ATCC)를 표적으로 사용하여 수행되었다. NK 세포는 CD71 표지된 SKOV3 표적 세포 (1.0 x 104 세포)와 0.5:1, 1:1, 2.5:1 및 5:1의 NK 세포:표적세포 비율로 2.2 mL의 표적 세포 특이 적 배지의 최종 부피에서, Bigley et al. 2014에 기재된 방법을 사용하여 공동 배양하였다. ADCC 분석에 사용된 배지는 1μg/mL 트라스투주맙 (항-Her2)가 함유된 10% McCoy's 5A 배지였다. 각각의 경우, 치료적 항체 없이 기초 세포 독성도 측정되었다. 자발적인 세포 사멸을 제어하기 위해(모든 분석에 대해 10% 미만) 표적 세포 전용 튜브를 사용하였다. 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후, 세포를 세척하고 항-CD3 및 CD56 항체로 염색하여 튜브 내 NK 세포의 수를 정량화하였다. 최종 세척 후, 프로피듐 요오드화물 (PI)을 첨가하고 NK 세포, 살아있는 표적세포 및 죽은 표적세포의 수를 4 색 유세포 분석을 사용하여 분석하였다 (Bigley et al., 2018).
증식 후 (증식된) ADCC: 5 명의 공여자를 g-NK 세포의 백분율에 대해 사전 스크리닝하고 g-NK 세포의 비율에 따라 'g-NK' 공여자 (n = 3) 또는 '기존' 공여자 (n = 2)로 분류하였다. 'g-NK' 공여자의 g-NK 비율은 30.3 ± 2.0% 였고, '기존'공여자의 g-NK 비율은 1.6 ± 0.4%에 불과하였다. CD57+ NK 세포가 'g-NK' 공여자로부터 자기적으로 분류되었고 벌크 NK 세포 (CD3-/CD56+)는 '기존' 공여자로부터 자기적으로 분류되었다. 'g-NK' 및 '기존' 공여자의 자기적 분류 분획의 실제 g-NK 백분율은 각각 84.0 ± 2.5% 및 1.6 ± 0.4%였다. 이어서, g-NK 및 cNK 분획을 실시예 2에 기재된 바와 같이 증식시키고 상기 기재된 바와 같이 이후의 ADCC 검정을 위해 동결 보존하였다.
g-NK는 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 병용될 때 cNK 보다 SKOV3 난소암 세포에 대해 더 큰 ADCC를 갖는다. 구체적으로, 신선하게 분리된 g-NK는 트라스투주맙이 존재할 때 모든 4 개의 NK-세포 투여량에서 cNK 보다 SKOV3 세포에 대해 현저하게 더 높은 세포 독성을 가졌다 (도 14a 참조). 유사하게, 증식된 g-NK는 트라스투주맙 또는 세툭시맙과 병용될 때 증식된 cNK보다 훨씬 더 큰 항-SKOV3 ADCC를 가졌다 (도 14b 및 14c 참조). 항체가 존재하지 않을 때 SKOV3 세포에 대한 g-NK 및 cNK (비증식 또는 증식된)의 세포 독성 사이에는 차이가 없었다 (도 14a 및 14b 참조). 전반적으로, 이 데이터는 g-NK가 난소암과 같은 고형 종양 악성(solid tumor malignancy)에 대해 강력한 항체 의존성 세포 독성 활성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 12: 항-HER2 항체와 병용한 증식된 NK 세포의 항-종양 활성 및 지속성의 평가
실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성을 항-HER2 항체 (트라스투주맙)와 병용하여 주사될 때 생체 내 종양에 대한 억제를 평가함으로써 확인하였다.
5 x 106 SKOV3 인간 난소암 세포주를 암컷 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 정맥 내 주사하고 30 일 동안 성장시켰다. 단일클론 항체 트라스투주맙은 단독으로 또는 72 일에 걸쳐 3-6 회 투여량으로 I.V.로 투여되는 증식된 g-NK 또는 cNK 세포와 병용하여 마우스에게 I.P. 투여하였다 (표 5 참조). 캘리퍼 측정을 사용하여 매주 종양 크기를 모니터링하였다. 연구 완료시, 골수 및 비장 샘플을 수확하고 이후 유세포 분석을 위해 g-NK 및 cNK 처리군의 마우스로부터 생존 가능하게 동결하였다. g-NK는 단일 CMV-혈청 양성 공여자로부터 증식되었된 반면 (g-NK의 백분율은 증식 전 61% 및 증식 후 90% 임), cNK는 단일 CMV-혈청 음성 공여자로부터 증식되었다 (g-NK의 백분율은 증식 전 및 증식 후 0%). g-NK의 백분율은 세포 내 유세포 분석을 사용하여 확인되었다.
SKOV3 효능 연구 설계
그룹 넘버 처리군 (Arm) 마우스 수 항체 투여일 NK 세포 투여일
1 운반체 대조군 6 N/A N/A
2 트라스트주맙 10 g/kg I.P 6 1, 7, 13, 19 N/A
3 2e7 신선한 g- NK I.V. + 트라스트주맙 10 mg/kg I.P. 6 1, 7, 13, 19 1, 7, 13, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 43, 46, 52, 55, 61, 64, 70
4 2e7 신선한 cNK I.V. + 트라스트주맙 10 mg/kg I.P. 6 1, 7, 13, 19 1, 7, 13, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 43, 46, 52, 55, 61, 64, 70
SKOV3를 접종하고 트라스투주맙으로 처리한 NSG 마우스에서 종양 크기 및 생존에 대한 입양 전달된 g-NK의 이점을 도 15a-b에 도시하였다. 트라스투주맙 및 g-NK로 처리된 마우스는 트라스투주맙 단독 또는 트라스투주맙 + 동일한 수의 cNK 세포로 처리된 마우스보다 종양 크기가 더 작았다 (도 15a 참조). 또한, g-NK와 트라스투주맙의 병용은 운반체, 트라스투주맙 단독 또는 트라스투주맙 + cNK로 처리된 마우스와 비교할 때 증가된 생존성 경향을 나타냈다 (도 15b 참조). 전반적으로,이 데이터는 단일클론 항체와 병용될 때 고형 악성 종양에 대한 g-NK의 항 종양 효과가 생체 내에서 활용될 수 있음을 보여준다.
혈액 샘플, 골수 및 비장 샘플은 SKOV3를 접종하고 트라스투주맙과 함께 처리한 NSG 마우스에서 우수한 g-NK 지속성을 나타내었다. g-NK는 cNK보다 트라스투 주맙-처리된 마우스의 혈액 (도 16a 참조), 비장 (도 16b 참조) 및 골수 (도 16c 참조)에서 더 높은 수준으로 지속되었다.
실시예 13: 다라투마맙과 병용한 증식된 NK 세포에 의한 다발성 골수종 세포에 대한 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)의 평가
대체방법과 비교하여, 다라투무맙 또는 엘로투자맙과 병용한 실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식된 NK 세포의 기능적 활성을 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 평가함으로써 확인하였다.
공여자는 CMV-혈청 양성 (n = 5)이었고 자기적으로 분류된 NK 세포 (증식 전 g-NK 백분율 = 34.6 ± 12.6%)를 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 증식시켰다. 그 다음 증식된 NK-세포를 자기적으로 CD57 마이크로 비드를 사용하여 CD57+ 'g-NK' 및 CD57- 'cNK' 분획으로 분류하고 추후 ADCC 분석을 위해 동결 보존하였다. CD57+ 및 CD57- 분획의 실제 g-NK 백분율은 각각 83.1 ± 1.6% 및 1.8 ±0.5% 이었다. CD57+ 및 CD57- 분획 내의 g-NK 백분율은 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입한 FcRγ항체를 사용하여 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다.
ADCC 세포 독성 분석을 위해, 이전에 증식하여 동결된 NK-세포를 해동하고 37 ℃에서 1 시간 동안 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. ADCC 분석은 다발성 골수종 세포주 ARH-77 및 MM.1R을 표적으로 사용하여 수행되었다 (각각 ATCC로부터). 증식된 NK 세포는 Bigley et al. 2014에 설명된 방법으르 사용하여 2.2 mL의 표적세포 특이적 배지의 최종 부피에서 CD71 표지된 ARH-77 및 MM.1R 표적 세포 (1.0 x 104 세포)와 1:1, 2.5:1, 5:1 및 10:1의 NK 세포:표적 세포 비율로 공동 배양하였다. 분석에 사용된 배지는 1μg/mL 다라투무맙 (항 -CD38)이 포함된 10% FBS 보충된 RPMI-1640 배지였다. 각각의 경우, 치료 항체가 존재하지 않는 상태의 기초 세포 독성도 측정되었다. 자발적인 세포 사멸을 제어하기 위해(모든 분석에 대해 10% 미만) 표적세포 전용 튜브를 사용하였다. 37 ℃에서 4 시간 배양한 후, 세포를 세척하고 항-CD3 및 CD56 항체로 염색하여 튜브 내 NK 세포의 수를 정량화하였다. 최종 세척 후, 프로피듐 요오드화물 (PI)을 첨가하고 NK 세포, 살아있는 표적세포 및 죽은 표적세포의 수를 4 색 유세포 분석을 사용하여 분석하였다 (Bigley et al., 2018).
g-NK는 다라투무맙과 병용될 때 다발성 골수종 세포주에 대해 더 큰 ADCC를 갖는다. 구체적으로, 증식된 g-NK는 다라투무맙이 존재할 때 모든 4 개의 NK-세포 용량에서 증식된 cNK보다 ARH-77 세포에 대해 현저하게 더 높은 세포 독성을 가졌다 (도 17a 참조). 증식된 g-NK는 또한 다라투무맙이 존재할 때 모든 4 개의 NK- 세포 용량에서 증식된 cNK보다 MM.1R 세포에 대해 더 높은 세포 독성을 가졌다 (도 17b 참조). 전반적으로, 이 데이터는 g-NK가 MM.1S 이상의 다발성 골수종 세포주에 대해 강력한 항체 의존적 세포 독성 활성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 14: 세툭시맙과 병용된 증식된 g-NK 세포에 의한 다발성 골수종 세포에 대한 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)의 평가
센툭시맙과 병용된 실시예 2에 기재된 방법에 의해 증식 된 NK 세포의 기능적 활성을 대체방법과 비교하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 평가함으로써 확인하였다.
증식 전 (신선하게 분리된) ADCC: 공여자는 CMV-혈청 양성 (n = 14) 및 CMV-혈청 음성 (n = 2)이었다. 모든 공여자는 g-NK 세포의 비율에 따라 사전 선별되었고, g-NK 세포의 비율을 기준으로 'g-NK' 공여자 (n = 10 CMV+) 또는 '기존'공여자 (n = 4 CMV+, n = 2 CMV-)로 분류되었다. 'g-NK' 공여자의 g-NK 비율은 30.0 ± 2.1% 였고, '기존' 공여자의 g-NK 비율은 1.6 ± 0.4%에 불과하였다. CD57+ NK 세포는 'g-NK' 공여자로부터 자기적으로 분류되었고 벌크 NK 세포 (CD3-/CD56+)는 '기존' 공여자로부터 자기적으로 분류되었다. 'g-NK' 및 '기존' 공여자의 자기적 분류 분획의 실제 g-NK 비율은 각각 82.2 ± 1.6% 및 2.4 ± 0.7%이었다. 각 분획 내의 g-NK 백분율은 Millipore (Burlington, MA, USA)에서 구입한 FcRγ항체를 사용하여 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다.
ADCC 세포 독성 분석을 위해, 동결된 PBMC를 해동하고 37 ℃에서 1 시간 동안 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 이후 자기적 비드 분리를 수행하여 CD57+ NK 세포와 벌크 NK 세포를 각각 'g-NK' 및 '기존' 공여자로부터 분리하였다. ADCC 분석은 결장암 세포주 SW-480을 표적으로 사용하여 수행되었다. NK 세포는 Bigley et al. 2014에 기재된 방법을 사용하여, CD71 표지된 SW-480 (ATCC) 표적 세포 (1.0 x 104 세포)와 0.5:1, 1:1, 2.5:1 및 5:1의 NK 세포:표적 세포 비율로 2.2 mL의 표적 세포 특이적 배지의 최종 부피에서 공동 배양하였다. SW-480 분석에 사용된 배지는 5 μg/mL 세툭시맙 (항-EGFR)이 포함된 10% FBS 보충된 Leibovitz's L-155 배지였다. 각각의 경우, 치료 항체가 존재하지 않는 상태의 기초 세포 독성도 측정되었다. 자발적인 세포 사멸을 제어하기 위해 (모든 분석에 대해 10% 미만) 표적세포 전용 튜브를 사용하였다. 37 ℃에서 4 시간 배양한 후, 세포를 세척하고 항-CD3 및 항-CD56 항체로 염색하여 튜브 내 NK 세포의 수를 정량화하였다. 최종 세척 후, 프로피듐 요오드화물 (PI)을 첨가하고 NK 세포, 살아있는 표적 세포 및 죽은 표적 세포의 수를 4 색 유세포 분석을 사용하여 분석하였다 (Bigley et al., 2018).
증식 후 (증식된) ADCC: 5 명의 공여자를 g-NK 세포의 백분율에 대해 사전 스크리닝하고 g-NK 세포의 비율에 따라 'g-NK'공여자 (n = 3) 또는 '기존' 공여자 (n = 2)로 분류하였다. 'g-NK' 공여자의 g-NK 비율은 30.3 ± 2.0% 였고 '기존' 공여자의 g-NK 비율은 1.6 ± 0.4%에 불과하였다. CD57+ NK 세포는 'g-NK' 공여자로부터 자기적으로 분류되었고 벌크 NK 세포 (CD3-/CD56+)는 '기존' 공여자로부터 자기적으로 분류되었다. 'g-NK' 및 '기존' 공여자의 자기 분류 분획의 실제 g-NK 백분율은 각각 84.0 ± 2.5% 및 1.6 ± 0.4% 이었다. 이어서, g-NK 및 cNK 분획을 실시예 2에 기재된 바와 같이 증식시키고 상기 기재된 바와 같이 이후의 ADCC 검정을 위해 동결보존하였다.
g-NK는 세툭시맙과 병용될 때 cNK보다 SW-480 결장암 세포에 대해 더 큰 ADCC를 갖는다 (도 18a 및 18b 참조). 신선하게 분리된 g-NK는 세툭시맙이 존재할 때 모든 4 개의 NK-세포 용량에서 cNK보다 SW-480 세포에 대해 현저하게 더 높은 세포 독성을 가졌다 (도 18a 참조). 유사하게, 증식된 g-NK는 세툭시맙과 병용될 때 증식된 cNK보다 훨씬 더 큰 항-SW480 ADCC를 가졌다 (도 18b 참조). 항체가 존재하지 않을 때 SW-480 세포에 대한 g-NK 및 cNK (비증식 또는 증식된)의 세포 독성 사이에는 차이가 없었다 (도 18a 및 18b 참조). 전반적으로 이 데이터는 g-NK가 결장암과 같은 고형 종양 악성 종양에 대해 강력한 항체 의존적 세포 독성 활성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 15: g-NK 매개 ADCC의 효능에 대한 CD16 158V 다형성의 평가
158V는 단백질의 158 번째 아미노산 위치에 보다 일반적인 페닐알라닌 (F) 대신 아미노산 발린(V)이 존재하는 CD16의 유전적 다형성이다 (Koene et al., 1997). 이는 CD16의 더 큰 발현 및 항체 친화성을 유도하고, 그 결과 CD16 158V+ NK- 세포는 향상된 ADCC를 초래한다 (Hatjiharissi et al., 2007). 158 V/V 공여자가 최상의 효과를 보이고, 158 V/V 및 158 V/F 공여자의 NK 세포가 158 F/F 공여자의 NK 세포보다 ADCC를 통해 ARH-77 골수종 및 Daudi 림프종 세포를 훨씬 더 사멸시킨다는 것이 관찰되었다 (Hatjiharissi et al., 2007). 이 예는 적어도 부분적으로 158V 다형성을 지닌 g-NK와 ADCC 효능의 상관 관계를 보여준다.
40 명의 CMV-혈청 양성 공여자를 선별하여 g-NK 비율이 가장 높은 12명의 공여자를 결정하였다. 이들 공여자의 g-NK는 자기 비드 분리 (CD3-/CD57 +)를 통해 농축되었고 다음의 종양/항체 조합에 대한 ADCC에 대해 테스트되었다: 1) SW-480 /세툭시맙; 2) SKOV3/트라스투주맙; 3) SKOV3/세툭시맙; 4) MM.1S/다라투무맙; 및 5) MM.1S/엘로투주맙. g-NK의 ADCC는 g-NK가 없는 공여자 (n = 4)의 기존 NK 세포 (cNK)와 비교되었다. 이 12명의 공여자 중 5명의 공여자는 NK 세포에 의해 지속적으로 높은 ADCC 활성을 나타내는 '슈퍼 공여자'로 분류되었다.
모든 공여자로부터의 NK 세포는 CD16의 158V 다형성 (V/V, V/F 및 F/F)과 관련하여 각 공여자가 어느 하위 군에 속하는지를 결정하기 위해 다형성 테스트 및 비닝(binning)을 받았다. 예상 분포는 35% V/V, 25% V/F 및 40% F/F 였으며 (Hatjiharissi et al., 2007; Somboonyosdech et al., 2012), 따라서 이러한 예상치에서 벗어나면 158V 다형성이 이러한 공여자에서 볼 수 있는 높은 ADCC에서의 어떤 역할을 할 수 있음을 시사할 수 있다. 다형성 시험을 위해, 동결된 NK 세포를 해동하고 PBS로 세척하고 100g에서 원심 분리하였다. NK 세포 현탁액을 유동관에 모아 CD45용 형광 항체 2μL (잔류 적혈구에서 백혈구 식별) 및 7-AAD (생존성 염료) 2μL로 염색하였다. 암실의 실온에서 10 분 동안 인큐베이션 한 후, 세포를 500 μL의 PBS로 희석하고 7-AADneg/CD45pos 백혈구의 수를 유세포 분석으로 정량화하였다. 세포 계수 후, 자기 비드 분리 (Miltenyi MACS ™CD16 Microbeads)를 수행하여 CD16pos NK 세포 집단을 분리하였다. 자기 비드 분리 후, 10X Genomics 단일 세포 RNA 시퀀싱을 사용하여 각 공여자가 속한 CD16 다형성 그룹 (V/V, V/F 또는 F/F)을 결정하였다. ADCC 분석 결과, 158V에 대한 실제 g-NK 백분율과 및 해당 다형성이 없는 g-NK 백분율은 각각 82.2 ± 2.1% 및 82.8% ± 1.9% 였다. g-NK의 백분율은 세포 내 유세포 분석에 의해 결정되었다.
상기 결과는 일관되게 높은 ADCC 활성을 나타내는 g-NK 세포를 가지는 모든 5 개의 "슈퍼 공여자"가 CD16 158V 다형성을 나타냄을 보여준다. 또한, 도 19에 도시된 바와 같이, 158V g-NK는 또한 각 항체가 존재할 때 대표적인 암 패널 (결장 (직장): SW-480; 난소: SVOV3, SKOV3; 다발성 골수종: MM.1S)에서 평균적으로 상당히 높은 ADCC 활성을 나타내었다. 또한, CD16 유전자의 발현은 시험된 모든 혈액 및 고형 종양 세포주에 대한 ADCC 효능과도 양의 상관 관계를 보였다 (도 20). 종합하면, 이와 같은 결과는 g-NK 세포에 대한 ADCC의 1차 매개체인 CD16의 향상된 발현과 친화력으로 158V 유전자형을 보유한 g-NK가 혈액 및 고형 종양을 제거하는 데 더 효과적이라는 관찰과 일치한다.
본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 관점을 설명하기 위해 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위가 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 기재 및 교시로부터 명백할 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Indapta Therapeutics, Inc Bigley, Austin <120> METHODS FOR EXPANSION OF NATURAL KILLER (NK) CELL SUBSET AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS <130> IP21113US <140> PCT/US2019/0062695 <141> 2019-11-21 <150> US 62/770,686 <151> 2018-11-21 <160> 18 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I <400> 1 Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu 20 25 30 Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile 35 40 45 Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val 50 55 60 Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 65 70 75 80 His Glu Lys Pro Pro Gln 85 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 atatttacag aatggcacag g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gacttggtac ccaggttgaa 20 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 atcagattcg atcctacttc tgcagggggc at 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 acgtgctgag cttgagtgat ggtgatgttc ac 32 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cccaactcaa cttcccagtg tgat 24 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gaaatctacc ttttcctcta atagggcaat 30 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 gaaatctacc ttttcctcta atagggcaa 29 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 gaaatctacc ttttcctcta atagggca 28 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD16 sense primer <400> 10 ccaaaagcca cactcaaaga c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD16 antisense primer <400> 11 acccaggtgg aaagaatgat g 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan probe <400> 12 aacatcacca tcactcaagg tttgg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V allele forward primer <400> 13 ctgaagacac atttttactc ccaaa 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V allele reverse primer <400> 14 tccaaaagcc acactcaaag ac 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F allele forward primer <400> 15 ctgaagacac atttttactc ccaac 25 <210> 16 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD16 (F158) <400> 16 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 50 55 60 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 85 90 95 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 145 150 155 160 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 195 200 205 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 210 215 220 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 225 230 235 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 17 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 <210> 18 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD16 VAR_003960 <400> 18 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 50 55 60 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 85 90 95 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 145 150 155 160 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 195 200 205 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 210 215 220 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 225 230 235

Claims (174)

  1. FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 분리하는 단계로, 상기 분리하는 단계는 인간 대상체 유래 샘플로부터
    (i) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포;
    (ii) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성(CD3negCD56posCD38neg)인 세포;
    (iii) CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포,
    (iv) CD3에 대해 음성 및 CD56에 대해 양성(CD3negCD56pos)인 세포;
    (v) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성(CD3negCD16pos)인 세포; 또는
    (vi) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)인 세포의 선별을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포(irradiated 221.AEH feeder cell), 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에, 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
  2. FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 분리하는 단계로, 상기 분리하는 단계는 인간 대상체 유래 샘플로부터
    (i) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포;
    (ii) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성(CD3negCD56posCD38neg)인 세포;
    (iii) CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포,
    (iv) CD3에 대해 음성(CD3neg) 및 CD56에 대해 양성(CD3negCD56pos)인 세포;
    (v) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성(CD3negCD16pos)인 세포; 또는
    (vi) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)인 세포;의 선별을 포함하는 것인 단계:
    (b) 농축된 NK 세포 집단을 조사된 221.AEH 영양 세포 및 조사된 말초 혈액 단핵 (PBMC) 영양 세포와 조합하는 단계로, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 이고, PBMC 영양 세포 대 농축 NK 세포의 비율은 (약) 1:1 내지 (약) 5:1 (포함)이며, 선택적으로 상기 PBMC 영양 세포는 상기 대상체에 대해 자가(autologous)인, 단계;
    (c) 재조합 IL-2 및 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 존재 하에 (b)의 집단을 배양하는 단계로, 여기서, 배양 개시 7 일 이내에, 재조합 IL-2를 함유하는 신선한 배지로 세포 배양 배지를 교환하고, 선택적으로 그 후 배양 기간 동안 2 일 또는 3 일마다 세포 배양 배지를 재조합 IL-2를 함유하는 신선한 배지로 추가로 교환하며, 여기서 상기 배양하는 단계는 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 단계; 및
    (d) 상기 세포의 증식된 집단을 수집하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 단계 전, 인간 대상체 유래 샘플을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 CMV 혈청 양성(seropositive)인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 CD16 158V+ NK 세포 유전자형을 갖는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이거나 이를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukaphereis) 샘플인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별(immunoaffinity-based selection)을 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 (i)이고, 샘플로부터 CD3에 대해 음성이고 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포의 선별을 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 (ii)이고, 샘플로부터 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성(CD3negCD56posCD38neg)인 세포의 선별을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 (iii)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포의 선별을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 (iv)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성 (CD3negCD56pos)인 세포의 선별을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 (v)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성 (CD3negCD16pos)인 세포의 선별을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 (vi)이고 샘플로부터 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)인 세포의 선별을 포함하는 것인 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계 후 농축된 NK 세포의 분리된 집단을 동결 보존하는 단계 및 (b) 단계 전 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함하는 방법.
  16. FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    (a) 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 수득하는 단계로, 상기 농축된 NK 세포의 집단은
    (i) CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포;
    (ii) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성(CD3negCD56posCD38neg)인 세포;
    (iii) CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포,
    (iv) CD3에 대해 음성 (CD3neg) 및 CD56에 대해 양성(CD3negCD56pos)인 세포;
    (v) CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성(CD3negCD16pos)인 세포; 또는
    (vi) CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성(CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)인 세포로부터 선택되는 표현형을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) (i) 조사된 221.AEH 영양 세포(irradiated 221.AEH feeder cell), 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및 (ii) 재조합 IL-2의 존재 하에, 상기 농축된 NK 세포 집단을 배양하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 방법은 g-NK 세포가 농축된 NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 수득하는 단계는 농축된 NK 세포를 포함하는 동결 보존된 샘플을 해동하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (i)이고 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성(CD3negCD57pos)인 세포를 포함하는 방법.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (ii)이고 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성(CD3negCD56posCD38neg)인 세포를 포함하는 방법.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (iii)이고 CD3에 대해 음성(CD3neg)인 세포를 포함하는 방법.
  21. 제16항 또는 제17항에있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (iv)이고 CD3에 대해 음성(CD3neg) 및 CD56에 대해 양성 (CD3negCD56pos)인 세포를 포함하는 방법.
  22. 제16항 또는 제17항에있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (v)이고 CD3에 대해 음성 및 CD16에 대해 양성 (CD3negCD16pos)인 세포를 포함하는 방법.
  23. 제16항 또는 제17항에있어서, 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (vi)이고 CD3에 대해 음성(CD3neg) 및 CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포 (CD3negCD56posNKG2AnegCD161neg)인 세포를 포함하는 방법.
  24. FcRγ결핍 NK 세포(g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    인간 대상체 유래 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1 차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포를 포함하고,
    상기 배양하는 단계는
    (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및
    (ii) 재조합 IL-2;의 존재 하에 수행되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는
    (1) (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD57에 대해 양성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및
    (2) 첫 번째 선별된 집단 세포로부터 (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD57에 대해 양성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  26. 제9항, 제24항 또는 제25항에 있어서,
    상기 분리하는 단계는
    (1) 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 생산하는 단계; 및
    (2) 첫 번째 선별된 집단 세포로부터 CD57에 대해 양성인 세포를 선별하여 CD3에 대해 음성 및 CD57에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  27. FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    인간 대상체 유래 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포를 포함하고,
    상기 배양하는 단계는
    (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및
    (ii) 재조합 IL-2;의 존재 하에 수행되고,
    상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는
    (1) CD3에 대해 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계;
    (2) 첫 번째 선별된 집단으로부터 (a) CD56에 대해 양성인 세포 또는 (b) CD38에 대해 음성인 세포를 선별하여 두 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및
    (3) 두 번째 선별된 집단 세포로부터 (a) CD56에 대해 양성인 세포 또는 (b) CD38에 대해 음성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성 및 CD38에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제10항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 다음을 포함하는 방법:
    (1) 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 생산하는 단계;
    (2) 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 양성인 세포를 선별하여 두 번째 선별된 집단을 생산하는 단계; 및
    (3) 두 번째 선별된 집단으로부터 CD38에 대해 음성인 세포를 선별하여 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, 및 CD38에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계.
  30. FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    인간 대상체 유래 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1 차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 포함하고,
    상기 배양하는 단계는
    (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및
    (ii) 재조합 IL-2;의 존재 하에 수행되고,
    상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포의 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는
    (1) (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD16에 대해 양성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및
    (2) 상기 첫 번째 농축된 선별된 세포로부터 (a) CD3에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD16에 대해 양성인 세포에 대해 그 다른 것(the other)을 선별하여, CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제13항, 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 분리하는 단계는:
    (1) 샘플로부터 CD3에 대해 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 생산하는 단계; 및
    (2) 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD16에 양성인 세포를 선별하여 CD3에 대해 음성이고 CD16에 대해 양성인 세포를 농축하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  33. FcRγ결핍 NK 세포 (g-NK)를 증식하는 방법으로서,
    인간 대상체 유래 샘플로부터 자연 살해 (NK) 세포가 농축된 1차 인간 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하되,
    상기 농축된 NK 세포의 집단은 CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 포함하며,
    상기 배양은
    (i) 조사된 221.AEH 영양 세포, 여기서 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:10 내지 10:1 임; 및
    (ii) 재조합 IL-2;의 존재 하에 수행되고,
    상기 방법은 g-NK 세포의 증식된 집단을 생산하는 것인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 배양 전, 샘플로부터 농축된 NK 세포 집단을 분리하는 단계를 포함하고, 상기 분리하는 단계는
    (1) CD3에 대해 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 농축하는 단계;
    (2) 상기 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 대해 양성인 세포를 선별하여 두 번째 선별된 집단을 농축하는 단계;
    (3) 상기 두 번째 선별된 집단으로부터 (a) NKG2A에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD161에 대해 음성인 세포를 선별하여, 세 번째 선별된 집단을 농축하는 단계; 및
    (4) 상기 세 번째 선별된 집단 세포로부터 (a) NKG2A에 대해 음성인 세포 또는 (b) CD161에 대해 음성인 세포에 대해 그 다른 것을 선별하여, CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  35. 제14항, 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 분리하는 단계는
    (1) CD3에 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 생산하는 단계;
    (2) 상기 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 양성인 세포를 선별하여 두 번째 선별된 집단을 생산하는 단계;
    (3) 상기 두 번째 선별된 집단으로부터 NKG2A에 대해 음성인 세포를 선별하여 세 번째 선별된 집단을 생산하는 단계; 및
    (4) 상기 세 번째 선별된 집단으로부터 CD161에 대해 음성인 세포를 선별하여, CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계;를 포함하는, 방법.
  36. 제14항, 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 분리하는 단계는
    (1) CD3에 음성인 세포를 선별하여 첫 번째 선별된 집단을 생산하는 단계;
    (2) 상기 첫 번째 선별된 집단으로부터 CD56에 양성인 세포를 선별하여 두 번째 선별된 집단을 생산하는 단계;
    (3) 상기 두 번째 선별된 집단으로부터 CD161에 대해 음성인 세포를 선별하여 세 번째 선별된 집단을 생산하는 단계; 및
    (4) 상기 세 번째 선별된 집단으로부터 NKG2A에 대해 음성인 세포를 선별하여, CD3에 대해 음성, CD56에 대해 양성, NKG2A에 대해 음성 및 CD161에 대해 음성인 세포를 농축하는 단계;를 포함하는, 방법.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 포함하는 방법.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 전, 인간 대상체 유래 샘플을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 인간 대상체는 CMV 혈청 양성인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 인간 대상체는 CD16 158V+ NK 세포 유전자형을 갖는, 방법.
  41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플인 방법.
  42. 제25항, 제26항, 제28항, 제29항, 제31항, 제32항, 제34항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선별은 면역 친화성 기반 선별을 포함하는 것인 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축된 NK 세포는 대상체 유래 샘플로부터 이전에 분리되어 동결 보존된 샘플로부터 유래된 것인 방법.
  44. 제1항 및 제3항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 (iii) 1 차 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 영양 세포의 존재 하에 추가로 수행되고, 여기서 상기 PBMC 영양 세포는 조사된(irradiated) 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 배양 전, 농축된 NK 세포 집단을 조사된 221.AEH 영양 세포 및 조사된 PBMC 영양 세포와 조합하는 단계(combining)를 포함하는, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 PBMC 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비는 (약) 1:1 내지 (약) 5:1 (포함)인 방법.
  47. 제2항 및 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PBMC 영양 세포는 대상체에 대해 자가(autologuous)인 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부는 상기 PBMC 영양 세포의 하나 이상의 T 세포의 활성화를 자극할 수 있는 적어도 하나의 자극제(stimulatory agent)의 존재 하에 수행되는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 자극제는 TCR 복합체의 일 멤버(member)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 상기 자극제는 CD3, 선택적으로 CD3엡실론(CD3epsilon)에 특이적으로 결합하는, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 적어도 하나의 자극제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  51. 제2항 또는 제50항에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
  52. 제2항, 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 (약) 10 ng/mL 내지 (약) 100 ng/mL 인 방법.
  53. 제2항 및 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD3 항체 또는 항원 결합 단편의 농도는 (약) 50 ng/mL인 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 자극제는 배양 개시 시 또는 조사된 PBMC 영양 세포와 동시에 또는 거의 동시에 첨가되는 방법.
  55. 제2항 및 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 PBMC 영양 세포가 활성화되는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율은 (약) 1:1 이상인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사된 221.AEH 영양 세포 대 NK 세포의 비율은 1:1 내지 5:1 (포함)인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 1:1 내지 3:1 (포함)인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 (약) 2.5:1 인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 NK 세포는 갓(freshly) 분리되거나 이전에 동결 및 해동되지 않은 것인, 방법.
  61. 제1항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사된 AEH.221 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 (약) 1:1 인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 NK 세포는 동결 후 해동된 것인 방법.
  63. 제2항 및 제44항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PBMC 영양 세포 대 농축된 NK 세포의 비율은 (약) 5:1인 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2의 농도는 (약) 10 IU/mL 내지 (약) 500 IU/mL 인 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양의 적어도 일부 동안 재조합 IL-2의 농도는 (약) 100 IU/mL 재조합 IL-2인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 IL-2는 (대략) 배양 개시 시에 첨가되는 것인 방법.
  67. 제1항 및 제3항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 배양 동안 배양 배지를 1회 이상 교환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  68. 제2항 또는 제45항에 있어서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 배양 개시 후 (약) 3일 내지 (약) 7 일 내에, 선택적으로 배양 개시 후 (약) 5 일에 시작하여 수행되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 남은 배양 기간 동안 2 일 또는 3 일마다 수행되는 방법.
  70. 제2항 및 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지를 교환하는 단계는 배양 배지로부터 상기 적어도 하나의 자극제를 감소시키거나 제거하는 것인 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지의 각각의 교환에서 재조합 IL-2를 함유하는 신선한 배지가 배양물에 첨가되는 방법.
  72. 제2항 및 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 IL-2는 (약) 10 IU/mL 내지 (약) 500 IU/mL (포함)의 농도로 첨가되는 방법.
  73. 제2항, 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 재조합 IL-2는 (약) 100 IU/mL 재조합 IL-2의 농도로 첨가되는 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 (약) 0.2 x 106 농축된 NK 세포, 적어도 (약) 1.0 x 106 농축된 NK 세포, 또는 (약) 10 x 106 농축된 NK 세포를 포함하는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 (약) 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 (약) 1.0 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도인 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포 집단은 적어도 (약) 0.05 x 106 농축된 NK 세포/mL 내지 (약) 0.5 x 106 농축된 NK 세포/mL의 농도인 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 개시 시 상기 농축된 NK 세포의 집단은 (약) 0.2 x 106 농축 NK 세포/mL 농도를 포함하는 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 적어도 (약) 2.50 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 적어도 (약) 5.00 x 108 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 적어도 (약) 1.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 적어도 (약) 5.0 x 109 g-NK 세포의 증식을 달성할 때까지 수행되는 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 (약) 5일 또는 적어도 (약) 5일, (약) 6일 또는 적어도 (약) 6일, (약) 7일 또는 적어도 (약) 7일, (약) 8일 또는 적어도 (약) 8일, (약) 9일 또는 적어도 (약) 9일, (약) 10일 또는 적어도 (약) 10일, (약) 11일 또는 적어도 (약) 11일, (약) 12일 또는 적어도 (약) 12일, (약) 13일 또는 적어도 (약) 13일, (약) 14일 또는 적어도 (약) 14일, (약) 15일 또는 적어도 (약) 15일, (약) 16일 또는 적어도 (약) 16일, (약) 17일 또는 적어도 (약) 17일, (약) 18일 또는 적어도 (약) 18일, (약) 19일 또는 적어도 (약) 19일, (약) 20일 또는 적어도 (약) 20일, (약) 21일 또는 적어도 (약) 21일, (약) 22일 또는 적어도 (약) 22일, (약) 23일 또는 적어도 (약) 23일, (약) 24일 또는 적어도 (약) 24일, 또는 (약) 25일 또는 적어도 (약) 25일 동안 수행되는 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 (약) 14일 또는 적어도 (약) 14일 동안 수행되는 방법.
  84. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 (약) 21일 또는 적어도 (약) 21일 동안 수행되는 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 배양 개시 시와 비교하여 배양 말기에 증가된 수의 g-NK 세포를 생산하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 증가는 (약) 100 배 이상, (약) 200 배 이상, (약) 300 배 이상, (약) 400 배 이상, (약) 500 배 이상, (약) 600 배 이상, (약) 700 배 이상 또는 (약) 800 배 이상인 방법.
  87. 제85항에 있어서, 상기 증가는 (약) 1000 배 이상인 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 후 상기 방법에 의해 생산된 g-NK 세포의 증식된 집단을 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 g-NK 세포는 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos인 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포인 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 증식된 집단으로부터 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일을 갖는 세포 집단을 정제하거나 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 방법.
  94. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg 인 방법.
  95. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD38neg 인 방법.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos인 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학상 허용되는 부형제에서 g-NK 세포의 증식된 집단을 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 동결 보호제의 존재 하에서 상기 세포를 동결 보존하는 단계 및/또는 상기 세포를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 g-NK 세포를 포함하는 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 (약) 108 g-NK 세포를 포함하는 조성물.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 상기 조성물 중의 g-NK 세포의 수는 (약) 108 내지 (약) 1012 세포, (약) 108 내지 (약) 1011 세포, (약) 108 내지 (약) 1010 세포, (약) 108 내지 (약) 109 세포, (약) 109 내지 (약) 1012 세포, (약) 109 내지 (약) 1011 세포, (약) 109 내지 (약) 1010 세포, (약) 1010 내지 (약) 1012 세포, (약) 1010 내지 (약) 1011 세포, 또는 (약) 1011 내지 (약) 1012 세포인 조성물.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포는 FcRγneg인 조성물.
  103. 제102항에 있어서, 상기 g-NK 세포는 추가로 CD45pos/CD3neg/CD56pos인 조성물.
  104. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포는 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 가지는 세포인, 조성물.
  105. 제104항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 조성물.
  106. 제104항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 NKG2Aneg/CD161neg인 조성물.
  107. 제104항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD38neg인 조성물.
  108. 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 또는 적어도 (약) 90%가, CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물.
  109. 제108항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 70%가, CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  110. 제108항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 80%가, CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  111. 제108항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 90%가, CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  112. 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 또는 적어도 (약) 90%가, NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물.
  113. 제112항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 70%가, NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  114. 제112항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 80%가, NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  115. 제112항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 90%가, NKG2Aneg/CD161neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  116. 자연 살해 (NK) 세포 서브세트를 포함하는 조성물로서,
    상기 조성물에서 상기 세포의 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 또는 적어도 (약) 90%가, CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 가지는 조성물.
  117. 제116항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 70%가, CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  118. 제116항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 80%가, CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  119. 제116항에 있어서, 상기 조성물 내의 상기 세포의 적어도 (약) 90%가, CD38neg인 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 조성물.
  120. 제105항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 표면 마커 프로파일은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함하는 조성물.
  121. 제104항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 g-NK 세포 대리 마커 프로파일을 포함하는 세포 중 70% 이상이 FcRγneg이고, 선택적으로 (약) 70% 내지 (약) 90%가 FcRγneg인 조성물.
  122. 제108항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 (약) 108 개의 세포를 포함하는 조성물.
  123. 제108항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중의 g-NK 세포의 수는 (약) 108 내지 (약) 1012 세포, (약) 108 내지 (약) 1011 세포, (약) 108 내지 (약) 1010 세포, (약) 108 내지 (약) 109 세포, (약) 109 내지 (약) 1012 세포, (약) 109 내지 (약) 1011 세포, (약) 109 내지 (약) 1010 세포, (약) 1010 내지 (약) 1012 세포, (약) 1010 내지 (약) 1011 세포, 또는 (약) 1011 내지 (약) 1012 세포인 조성물.
  124. 제99항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 중의 세포는 동일한 샘플로부터 증식된 단일 공여자 대상체로부터 유래된 것인 조성물.
  125. 제99항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  126. 제99항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 동결 보호제(cyroprotectant)를 포함하는 조성물.
  127. 제99항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 멸균되어 있는 조성물.
  128. 제99항 내지 제127항 중 어느 한 항의 조성물 및 질환의 치료를 위한 추가 작용제(additional agent)를 포함하는 키트.
  129. 제128항에 있어서, 상기 조성물 및 질환 또는 병태를 치료하기 위한 추가 작용제를 투여하기 위한 설명서(instruction)를 추가로 포함하는, 키트.
  130. 제99항 내지 제127항 중 어느 한 항의 조성물 및 질환 치료를 위해 추가 작용제와의 병용 요법으로 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 작용제는 항체 또는 Fc-융합 단백질인 키트.
  132. 제131항에 있어서, 상기 항체는 종양 관련 항원(tumor associated antigen)을 인식하거나 특이적으로 결합하는 키트.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, 상기 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린(mesothelin), α-태아단백질(α-fetoprotein), 뮤신(Mucin), PDGFR-alpha, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린(Integrin) αVβ인테그린(integrin) α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-alpha, 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 신데칸(Syndecan) 1, SLAMF7 (CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 인식하거나 결합하는 키트.
  134. 제131항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 전장 항체이고/이거나 Fc 도메인을 포함하는 키트.
  135. 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 세포 독성제(cytotoxic agent) 또는 암 치료제(cancer drug)인 추가 작용제를 추가로 포함하는 키트.
  136. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 작용제는 세포 독성제 또는 암 치료제인, 키트.
  137. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가 작용제는 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus)인 키트.
  138. 제128항 내지 제137항 중 어느 한 항의 키트를 포함하는 제조 물품.
  139. 제99항 내지 제127항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 치료방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 방법은 상기 개체에게 (약) 1 x 105 NK 세포/kg 내지 (약) 1 x 107 NK 세포/kg를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  141. 제139항에있어서, 상기 방법은 (약) 5 x 107 NK 세포 내지 (약) 10 x 109 NK 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  142. 제139항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태를 치료하기 위하여 상기 개체에게 추가 작용제(additional agent)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  143. 제142항에 있어서, 상기 추가 작용제는 항체 또는 Fc-융합 단백질인 방법.
  144. 제143항에있어서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 항체는 암 관련 종양 항원을 인식하는, 방법.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 상기 항체는 CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD56, CD70, CD74, CD140, EpCAM, CEA, gpA33, 메조텔린(mesothelin), α-태아단백질(α-fetoprotein), 뮤신(Mucin), PDGFR-alpha, TAG-72, CAIX, PSMA, 엽산 결합 단백질(folate-binding protein), 산란 인자 수용체 키나아제(scatter factor receptor kinase), 강글리오사이드(ganglioside), 사이토케라인(cytokerain), 프리즐드 수용체(frizzled receptor), VEGF, VEGFR, 인테그린(Integrin) αVβ인테그린(integrin) α5βEGFR, EGFL7, ERBB2 (HER2), ERBB3, 피브로넥틴(fibronectin), HGF, HER3, LOXL2, MET, IGF1R, IGLF2, EPHA3, FR-alpha, 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 신데칸(Syndecan) 1, SLAMF7 (CD319), TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, 비멘틴(vimentin) 또는 테나신(tenascin)을 인식하거나 특이적으로 결합하는 방법.
  146. 제143항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함하거나/하고 전장항체(full-length antibody)인 방법.
  147. 제143항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태를 치료하기 위하여 암 치료제(cancer drug) 또는 세포독성제(cytotoxic agent)를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  148. 제142항에 있어서, 상기 추가 작용제는 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus)인 방법.
  149. 제142항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 염증성 병태, 감염 및 암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 감염이고, 상기 감염은 바이러스 감염 또는 박테리아 감염인 방법.
  151. 제149항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 또는 골수종(myeloma)인 방법.
  152. 제149항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 고형 종양을 포함하는 방법.
  153. 제149항 또는 제152항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 암이고, 상기 암은 위 또는 위식도 접합부의 선암(adenocarcinoma of the stomach or gastroesophageal junction), 방광암, 유방암, 뇌암, 자궁 경부암, 결장암(colorectal cancer), 내분비/신경내분비 암(endocrine/neuroendocrine cancer), 두경부암, 위장기질암(gastrointestinal stromal cancer), 골의 거대 세포 종양(giant cell tumor of the bone), 신장암, 간암, 폐암, 신경모세포종(neuroblastoma), 난소상피/나팔관/원발성 복막암(ovarian epithelial/fallopian tube/primary peritoneal cancer), 췌장암, 전립선암, 피부암 및 연조직 암종(soft tissue carcinoma) 중에서 선택되는 방법.
  154. 제139항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간인 방법.
  155. 제139항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내의 NK 세포는 상기 개체에 대해 동종인(allogenic) 방법.
  156. 제139항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 내의 NK 세포는 상기 대상체에 대해 자가(autologous)인, 방법.
  157. 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로서,
    상기 표면 마커 패널은 CD16, CD57, CD7 및 CD161을 포함하는 키트.
  158. 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로서,
    상기 표면 마커 패널은 NKG2A 및 CD161을 포함하는 키트.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, 상기 표면 마커 패널은 CD3, CD45 및 CD56을 추가로 포함하는 키트.
  160. 표면 마커 패널을 검출하기 위한 복수의 시약을 포함하는 키트로서,
    상기 표면 마커 패널은 CD3, CD56 및 CD38을 포함하는, 키트.
  161. 제160항에 있어서, 상기 패널은 CD45를 추가로 포함하는 키트.
  162. 제157항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 시약 각각은 표면 마커 패널의 하나의 마커에 특이적인 결합 분자인 키트.
  163. 제162항에 있어서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편인 키트.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, 상기 결합 분자는 검출 가능하도록 표지되어 있는 키트.
  165. 제157항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 세포 샘플에서 g-NK 세포의 수를 검출하기 위한 대리 마커로서 표면 마커 패널의 사용을 위한 설명서(instructions)를 추가로 포함하는, 키트.
  166. 제157항 내지 제165항 중 어느 한 항의 키트를 사용하여 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법.
  167. 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일(surrogate surface marker profile)을 검출하는 방법으로서,
    (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 CD16, CD57, CD7 및 CD161을 포함하는 표면 마커 패널(a panel of surface markers)을 검출하기 위한 시약(reagents)과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 표현형 CD16pos/CD57pos/CD7dim/neg/CD161neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  168. 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법으로서,
    (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 NKG2A 및 CD161을 포함하는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 표현형 NKG2Aneg/CD161neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  169. 제267항 또는 제168항에 있어서, 상기 표면 마커 패널은 CD45, CD3 및 CD56을 추가로 포함하고, 상기 표현형은 CD45pos/CD3neg/CD56pos를 추가로 포함하는 방법.
  170. 샘플에서 g-NK 대리 표면 마커 프로파일을 검출하는 방법으로서,
    (a) 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는 샘플을 CD3, CD56 및 CD38을 포함하는 표면 마커 패널을 검출하기 위한 시약과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 표현형 CD38neg/CD56pos/CD38neg를 가지는 세포의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  171. 제167항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 시약 각각은 상기 표면 마커 패널의 하나의 마커에 특이적인 결합 분자인 방법.
  172. 제171항에 있어서, 상기 결합 분자는 항체 또는 항원 결합 단편인 방법.
  173. 제171항 또는 제172항에 있어서, 상기 결합 분자는 검출 가능하도록 표지되어 있는 방법.
  174. 제167항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출은 유세포 분석에 의한 것인 방법.
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