JP2024516619A - 治療方法及びナチュラルキラー細胞組成物の投与方法 - Google Patents
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Abstract
ＮＫ細胞を含有する組成物の投与を伴う、治療のための方法及び使用が、本明細書で提供される。提供される方法及び使用の中には、がんに対する抗体治療薬との組み合わせを含む、多発性骨髄腫又はリンパ腫などのがんを治療するための方法及び使用がある。【選択図】図１４Ｂ
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２１日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＡＮＤ ＤＯＳＩＮＧ ＯＦ ＮＡＴＵＲＡＬ ＫＩＬＬＥＲ ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ」と題された米国特許仮出願第６３／１７７，９５６号の優先権を主張し、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月２１日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＡＮＤ ＤＯＳＩＮＧ ＯＦ ＮＡＴＵＲＡＬ ＫＩＬＬＥＲ ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ」と題された米国特許仮出願第６３／１７７，９５６号の優先権を主張し、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、７７６０３２００１２４０＿ＳＥＱＬＩＳＴ．Ｔｘｔと題され、２０２２年４月２０日に作成され、７，８５２バイトのサイズであるファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、７７６０３２００１２４０＿ＳＥＱＬＩＳＴ．Ｔｘｔと題され、２０２２年４月２０日に作成され、７，８５２バイトのサイズであるファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
分野
本開示は、ＮＫ細胞を含有する組成物の投与を伴う、治療方法及び使用を提供する。提供される方法及び使用の中には、がんに対する抗体治療薬との組み合わせを含む、多発性骨髄腫又はリンパ腫などのがんを治療するための方法及び使用がある。
本開示は、ＮＫ細胞を含有する組成物の投与を伴う、治療方法及び使用を提供する。提供される方法及び使用の中には、がんに対する抗体治療薬との組み合わせを含む、多発性骨髄腫又はリンパ腫などのがんを治療するための方法及び使用がある。
背景
抗体ベースの療法は、がん及び他の疾患を治療するために頻繁に使用されるようになっている。抗体療法に対する応答は、典型的には、腫瘍細胞に対するこれらの抗体の直接的な阻害効果（例えば、増殖因子受容体の阻害及びその後のアポトーシスの誘発）に焦点を当ててきたが、これらの抗体のインビボ効果は、より複雑であり得、宿主免疫系に関与し得る。ナチュラルキラー（Natural Killer、ＮＫ）細胞は、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩ）が、抗原保有細胞に結合された抗体のＦｃ部分に結合するときに、抗体依存性細胞傷害を媒介する免疫エフェクター細胞である。ＮＫ細胞は、その特定の特殊化されたサブセットを含めて、抗体療法に対する応答の改善を含む治療方法で使用され得る。抗体との組み合わせを含む、ＮＫ細胞を伴う治療的使用のための改善された方法が必要とされている。本明細書では、そのような必要性を満たす実施形態が提供される。
抗体ベースの療法は、がん及び他の疾患を治療するために頻繁に使用されるようになっている。抗体療法に対する応答は、典型的には、腫瘍細胞に対するこれらの抗体の直接的な阻害効果（例えば、増殖因子受容体の阻害及びその後のアポトーシスの誘発）に焦点を当ててきたが、これらの抗体のインビボ効果は、より複雑であり得、宿主免疫系に関与し得る。ナチュラルキラー（Natural Killer、ＮＫ）細胞は、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩ）が、抗原保有細胞に結合された抗体のＦｃ部分に結合するときに、抗体依存性細胞傷害を媒介する免疫エフェクター細胞である。ＮＫ細胞は、その特定の特殊化されたサブセットを含めて、抗体療法に対する応答の改善を含む治療方法で使用され得る。抗体との組み合わせを含む、ＮＫ細胞を伴う治療的使用のための改善された方法が必要とされている。本明細書では、そのような必要性を満たす実施形態が提供される。
概要
多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得る、方法が、本明細書に提供される。多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象を治療する方法で使用するための、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物であって、週１回、所定の回数の用量で投与され得る、組成物が、本明細書に提供される。
多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得る、方法が、本明細書に提供される。多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象を治療する方法で使用するための、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物であって、週１回、所定の回数の用量で投与され得る、組成物が、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫抗原に対抗する抗体を対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫抗原は、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、及びＢＣＭＡからなる群から選択される抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＳＬＡＭＦ７抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＢＣＭＡ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＣＤ３８抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６及びＢＣＭＡに対抗する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６及びＳＬＡＭＦ７に対抗する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６及びＣＤ３８に対抗する。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。
いくつかの実施形態では、抗体が、４週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、３週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、２週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、１週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、１週間に２回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、１週間に２回超投与される。
多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に提供される。多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象を治療する方法で使用するための、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物であって、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の前投与を受けている、組成物もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され得、１４日周期が、１～３回繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブである。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）の各用量が、８ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇ～約３２ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に、１６ｍｇ／ｋｇ又は約１６ｍｇ／ｋｇであり得る量で投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ３８抗体組成物で投与され得、任意選択的に、抗ＣＤ３８抗体組成物が、ダラツムマブ及び組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、約１８００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、約３０，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む。いくつかの実施形態では、方法が、抗ＣＤ３８抗体、任意選択的に、抗ＣＤ３８抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ３８抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、ＣＤ３８の低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＣＤ３８に対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＣＤ３８発現を低減又は排除するように操作されていない。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＣＤ３８誘発フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）を呈し、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈する。
リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法が本明細書に提供される。リンパ腫を有する対象を治療する方法で使用するための、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物であって、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得る、組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法が、リンパ腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法であり得る。いくつかの実施形態では、方法が、リンパ腫抗原に対抗する抗体を対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、リンパ腫抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗体は完全長の抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＣＤ１９抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＣＤ３０抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される第２の抗原に対するものである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ１９に対するものである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ２０に対するものである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ３０に対するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。
いくつかの実施形態では、抗体が、４週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、３週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、２週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、１週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、１週間に２回投与される。いくつかの実施形態では、抗体が、１週間に２回超投与される。
リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に提供される。リンパ腫を有する対象を治療する方法で使用するための、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物であって、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の前投与を受けている、組成物もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫（Non-Hodgkin’s Lymphoma、ＮＨＬ）であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され得、１４日周期が、１～３回繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブであり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、４回又は８回の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体の各用量が、２５０ｍｇ／ｍ２又は約２５０ｍｇ／ｍ２～５００ｍｇ／ｍ２、任意選択的に、３７５ｍｇ／ｍ２又は約３７５ｍｇ／ｍ２であり得る量で投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、皮下投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ２０抗体組成物で投与され得、任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体組成物が、リツキシマブ及びヒト組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、４回若しくは８回の用量で、又は任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体の静脈内の週１回の用量に続いて、３回若しくは７回の用量で、投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２３，４００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１６００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２６，８００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法が、抗ＣＤ２０抗体、任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、細胞の６０％超若しくは約６０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の７０％超若しくは約７０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の８０％超若しくは約８０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の９０％超若しくは約９０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、又は細胞の９５％超若しくは約９５％超がｇ－ＮＫ細胞である。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％が、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγｎｅｇ）ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、パーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、グランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、（ｉ）ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、（ｉｉ）ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、又は（ｉｉｉ）ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である。
いくつかの実施形態では、パーフォリンに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（mean fluorescence intensity、ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのパーフォリンを発現する、及び／又はグランザイムＢに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのグランザイムＢを発現する。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、腫瘍標的細胞に対する脱顆粒が可能であり、任意選択的に、脱顆粒が、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定され得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、脱顆粒を呈する。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、腫瘍標的細胞に対するインターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができ、任意選択的に、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファが、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの実施形態では、エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－アルファであり得る。いくつかの実施形態では、エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファであり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、照射されたＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞とともに培養されたＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞のエクスビボ拡大によって産生されたものであり、ＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞が、ドナー対象由来の生体サンプルから濃縮される。
いくつかの実施形態では、ドナー対象が、ＣＭＶ－血清陽性であり得る。いくつかの実施形態では、ドナー対象が、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型を有し、任意選択的に、生体サンプルが、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来し得る。いくつかの実施形態では、ドナー対象由来の末梢血サンプル中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも２０％又は約２０％が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性（positive for NKG2C、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）であり、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７０％が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い（negative or low for NKG2A、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）。いくつかの実施形態では、照射されたフィーダー細胞が、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩを欠損している。いくつかの実施形態では、照射されたフィーダー細胞が、２２１．ＡＥＨ細胞である。
いくつかの実施形態では、培養が、２つ以上の組換えサイトカインの存在下で実施され得、少なくとも１つの組換えサイトカインが、インターロイキン（interleukin、ＩＬ）－２であり得、少なくとも１つの組換えサイトカインが、ＩＬ－２１であり得る。いくつかの実施形態では、組換えサイトカインが、ＩＬ－２１及びＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、組換えサイトカインが、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、組成物中のｇ－ＮＫ細胞が、同じ生体サンプルから拡大された単一のドナー対象に由来する。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地中で製剤化され得、任意選択的に、凍結保護剤が、ＤＭＳＯであり得、凍結保存培地が、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、抗原受容体で操作されておらず、任意選択的に、抗原受容体が、キメラ抗原受容体であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、分泌性サイトカインで、任意選択的に、ＩＬ－１５受容体融合物（IL-15 receptor fusion、ＩＬ－１５ＲＦ）などのサイトカイン受容体融合タンパク質で、操作されていない。いくつかの実施形態では、方法が、ＮＫ細胞の生存又は拡大を支持するための対象への外因性サイトカイン投与を含まず、外因性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１のうちの１つ以上であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１×１０８個又は約１×１０８個の細胞～５０×１０９個又は約５０×１０９個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０８個の細胞であり得るか、又は約５×１０８個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０９個の細胞であり得るか、又は約５×１０９個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量は、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１０×１０９個の細胞であり得るか、又は約１０×１０９個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、用量のｇ－ＮＫ細胞の投与前に、対象が、リンパ球除去療法を受けている。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法が、フルダラビン及び／又はシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球除去が、２～４日間、毎日、２０～４０ｍｇ／ｍ２若しくは約２０～４０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３０ｍｇ／ｍ２若しくは約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン、及び／又は２～４日間、毎日、２００～４００ｍｇ／ｍ２若しくは約２００～４００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３００ｍｇ／ｍ２若しくは約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドの投与を含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法が、毎日、３０ｍｇ／ｍ２又は約３０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のフルダラビンと、毎日、３００ｍｇ／ｍ２又は約３００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のシクロホスファミドとの各々２～４日間、任意選択的に、３日間の投与を含む。
いくつかの実施形態では、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、リンパ球除去療法の開始後２週間以内又は２週間若しくは約２週間で開始され得る。いくつかの実施形態では、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、リンパ球除去療法の開始後７日以内又は７日若しくは約７日で開始され得る。いくつかの実施形態では、個体が、ヒトであり得る。いくつかの実施形態では、組成物中のＮＫ細胞が、個体に対して同種異系である。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインサポートを投与して、対象におけるインビボのｇ－ＮＫ細胞の拡大又は持続を容易にすることを更に含み、任意選択的に、外因性サイトカインが、ＩＬ－１５であるか、又はＩＬ－１５を含み得る。
詳細な説明
多発性骨髄腫を治療する方法であって、がんを有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供される方法は、多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するための、方法及びｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物の使用に関する。いくつかの実施形態では、提供される方法は、リンパ腫を治療するための、方法及びｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物の使用に関する。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の組成物は、週１回、所定の回数の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の組成物は、がんを治療するための抗体治療薬、例えば、多発性骨髄腫を治療するための抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）、若しくは抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）、又はリンパ種を治療するための抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ若しくはロンカスツキシマブ）、若しくは抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）と組み合わせて投与され得る。
多発性骨髄腫を治療する方法であって、がんを有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、提供される方法は、多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するための、方法及びｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物の使用に関する。いくつかの実施形態では、提供される方法は、リンパ腫を治療するための、方法及びｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物の使用に関する。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の組成物は、週１回、所定の回数の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の組成物は、がんを治療するための抗体治療薬、例えば、多発性骨髄腫を治療するための抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）、若しくは抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）、又はリンパ種を治療するための抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ若しくはロンカスツキシマブ）、若しくは抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）と組み合わせて投与され得る。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、サイトカイン及びケモカイン分泌を通じて、かつ細胞傷害顆粒の放出を通じて、抗ウイルス及び抗がん免疫を媒介するのに重要な自然リンパ球である（Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３１（６０１３）：４４－４９（２０１１）；Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｂｌｏｏｄ １１２（３）：４６１－４６９（２００８）；Ｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（１）：５１７－５２６（２００６））。ＮＫ細胞は、リンパ球の３番目に大きい集団を含むエフェクター細胞であり、腫瘍及び病原体感染細胞に対する宿主免疫監視にとって重要である。しかしながら、Ｔ及びＢリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、生殖細胞系列にコードされた活性化受容体を使用し、標的認識のための限定された能力のみを有すると考えられている（Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９８：１７５－１８２（２００６）；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９８：１－２１（２００６））。
ＮＫ細胞の活性化は、直接腫瘍細胞死滅で見られるように、標的細胞上のリガンドへのＮＫ細胞受容体の直接結合を通じて、又は抗原保有細胞に結合された抗体のＦｃ部分に結合することによるＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ１６ａ又はＦｃγＲＩＩＩａとしても知られる）の架橋を通じて、起こり得る。活性化時、ＮＫ細胞は、サイトカイン及びケモカインを豊富に産生し、同時に強力な細胞溶解活性を呈する。ＮＫ細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（antibody dependent cell mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を介して腫瘍細胞を死滅させることができる。いくつかの場合、ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞表面上の受容体（ＣＤ１６など）が、細胞の表面に結合されたＩｇＧ１又はＩｇＧ３抗体を認識するときにトリガされる。これは、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞質顆粒の放出をトリガし、標的細胞死につながる。ＮＫ細胞が、ＩｇＧ被覆標的細胞を認識する活性化Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現するため、標的認識が拡大される（Ｒａｖｅｔｃｈ＆Ｂｏｌｌａｎｄ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２７５－２９０（２００１）；Ｌａｎｉｅｒ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（５）：４９５－５０２（２００８）；Ｂｒｙｃｅｓｏｎ＆Ｌｏｎｇ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（３）：３４４－３５２（２００８））。ＡＤＣＣ及び抗体依存性サイトカイン／ケモカイン産生は、主にＮＫ細胞によって媒介される。
ＣＤ１６はまた、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型（ＦｃγＲＩＩＩＢ又はＣＤ１６Ｂとしても知られる）で存在する。本明細書におけるＣＤ１６への言及は、ＮＫ細胞上で発現され、抗体依存性応答（ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣなど）に関与するＣＤ１６ａ形態への言及に関するものであり、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型を指すことを意味しないことが理解される。
ＣＤ１６受容体は、アダプター、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体（ＣＤ３ζ）のζ鎖及び／又はＦｃＲγ鎖と会合して、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を通じてシグナルを形質導入することができる。いくつかの態様では、ＣＤ１６結合（ＣＤ１６架橋）は、ＣＤ１６会合アダプター鎖である、ＦｃＲγ又はＣＤ３ζのうちの一方又は両方を通じて生成される細胞内シグナルを介してＮＫ細胞応答を開始する。ＣＤ１６のトリガは、γ又はζ鎖のリン酸化につながり、これは、次に、チロシンキナーゼ、ｓｙｋ、及びＺＡＰ－７０を動員し、シグナル形質導入のカスケードを開始して、迅速及び強力なエフェクター機能につながる。最も良く知られているエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害のプロセスを通じて近くの標的細胞を死滅させるための毒性タンパク質を担持する細胞質顆粒の放出である。ＣＤ１６架橋はまた、サイトカイン及びケモカインの産生を結果的にもたらし、これは、次に、一連の免疫応答を活性化し、組織化する。
このサイトカイン及びケモカインの放出は、インビボにおけるＮＫ細胞の抗がん活性で役割を果たし得る。ＮＫ細胞はまた、パーフォリン及びプロテアーゼ（グランザイム）を含有する小さい顆粒をそれらの細胞質中に有する。ＮＫ細胞からの放出時、パーフォリンは、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、この孔を通じてグランザイム及び関連分子が侵入し、アポトーシスを誘発し得る。ＮＫ細胞が標的細胞の壊死ではなくアポトーシスを誘発するという事実は重要であり、ウイルス感染細胞の壊死がビリオンを放出するのに対して、アポトーシスは、細胞内のウイルスの破壊につながる。
ｇ－ＮＫ細胞としても知られる、ＦｃＲγアダプタータンパク質を欠くＮＫ細胞の特殊化されたサブセットは、堅牢なＡＤＣＣ応答を媒介することができる（例えば、公開された米国特許出願公開第２０１３／０２９５０４４号を参照されたい）。増加した応答についての機構は、ＦｃＲγの発現に影響するエピジェネティック修飾における変化に起因し得る。ｇ－ＮＫ細胞は、シグナル伝達アダプターζ鎖を豊富に発現するが、シグナル伝達アダプターγ鎖の発現が欠損している。従来のＮＫ細胞と比較して、これらのγ欠損ｇ－ＮＫ細胞は、抗体によって活性化されたときに劇的に増強された活性を呈する。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ１６の抗体媒介性架橋によって、又は抗体被覆腫瘍細胞によって活性化され得る。いくつかの態様では、ｇ－ＮＫ細胞は、γ鎖を発現する従来のＮＫ細胞よりも、多量のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α）及びケモカイン（例えば、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、及びＲＡＮＴＥＳ）を産生し、かつ／又はより高い脱顆粒応答を示す。ｇ－ＮＫ細胞は、ナチュラルキラー細胞傷害機構の成分であるグランザイムＢの高発現を提供する。更に、ｇ－ＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞と比較して、延長された寿命を有し、それらの存在は、長期間維持される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、機能的及び表現型的に安定である。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞、例えば、γ鎖が欠損していないＮＫ細胞よりも、ＡＤＣＣ応答を誘発するのに有効である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、抗体の非存在下であっても従来のＮＫ細胞よりも細胞媒介性細胞傷害を誘発するのに有効である。いくつかの場合、ＡＤＣＣは、抗がん抗体を含む治療用抗体の作用機序である。いくつかの態様では、ＮＫ細胞を投与することによる細胞療法は、治療目的及び関連する目的のために抗体と併せて使用され得る。
例えば、ＣＤ３８を標的化するダラツムマブ、ＳＬＡＭＦ７を標的化するエロツズマブ、ＢＣＭＡを標的化するベランタマブなどの、特定の治療用モノクローナル抗体は、多発性骨髄腫（ＭＭ）などの疾患を治療するためにＦＤＡ承認されている。他の治療用モノクローナル抗体、ＣＤ２０を標的化するリツキシマブ、ＣＤ１９を標的化するタファシタマブ又はロンカスツキシマブ、及びＣＤ３０を標的化するブレンツキシマブは、リンパ種などの疾患を治療するためにＦＤＡ承認されている。治療用抗体の臨床応答は有望であるが、それらは、多くの場合、理想的ではない。例えば、特にダラツムマブについて、初期臨床応答は、一般的に有望であったが、本質的に全ての患者が最終的に進行性疾患を発症する。したがって、より深い寛解を推進するか、又はこれらの薬剤に対する耐性を克服するかのいずれかのための新たな戦略が大いに必要とされている。組成物を含む、提供される実施形態は、これらの必要性に対処する。
本明細書に提供されるのは、例えば、提供される方法によって産生されるようなｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物と、抗体、例えば、抗がん抗体との併用投与を伴う方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の抗体指向性標的化は、ｇ－ＮＫ細胞サブセットの改善された親和性、細胞傷害及び／又はサイトカイン媒介性効果機能に起因して、患者に対する改善された転帰につながる。
いくつかの実施形態では、治療薬としてのモノクローナル抗体の潜在的な作用機序は、補体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞貪食、及び／又は抗体依存性細胞傷害に起因する抗腫瘍作用によるものである。いくつかの場合、ＮＫ細胞によって媒介されるＡＤＣＣは、特に多発性骨髄腫（ＭＭ）腫瘍の場合に、抗体結合腫瘍細胞を強力に排除し得ることが企図される。
ＮＫ細胞は、抗体のＦｃ部分がそのＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ又はＣＤ１６ａ）に結合し、アダプタータンパク質ＣＤ３ζ及びＦｃεＲ１γが関与するプロセスを通じて活性化及び脱顆粒をトリガするときに、活性化される。ＭＭ抗体を含む抗体に対する臨床ＡＤＣＣ応答を増強する努力は、ＮＫ細胞がＣＤ３８及びＳＬＡＭＦ７（例えば、それぞれ、ダラツムマブ及びエロツズマブの標的）も発現するため、困難であった。高いＣＤ３８発現は、特に、ダラツムマブ治療過程の初期にＮＫ細胞の急速な枯渇を結果的にもたらし、更により完全な腫瘍根絶を潜在的に駆動し得る、この自然免疫細胞源を大幅に排除する。
提供される方法によって産生されるような、提供されるｇ－ＮＫ細胞及びそれを含有する組成物は、これらの問題を克服するいくつかの特徴を呈する。ｇ－ＮＫ細胞は、ＣＭＶ血清陽性個体のわずか２５～３０％において総ＮＫ細胞の約３～１０％のレベルでのみ検出可能であるため、比較的稀なサブセットである。提供される方法は、ｇ－ＮＫ細胞を拡大及び濃縮する能力において特に堅牢であり、したがって、インビボの使用に必要とされる十分な拡大を可能にする方法に関する。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ＦｃＲγを発現するナチュラルキラー細胞よりも有意に多い量のサイトカインを産生する。別の実施形態では、サイトカインは、インターフェロン－ガンマ（interferon-gamma、ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（tumor necrosis factor-α、ＴＮＦ－α）、又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、有意により多くの量のケモカインを産生する。一実施形態では、ケモカインは、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、又はそれらの組み合わせである。別の実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を通じた刺激時にサイトカイン又はケモカインを産生する。
ｇ－ＮＫ細胞は、末梢血中のＮＫ細胞の比較的小さいパーセンテージを表し、それによって、治療方法においてこれらの細胞を使用する能力を制限する。具体的には、ｇ－ＮＫ細胞が一般的に稀な集団であるため、ｇ－ＮＫ細胞を臨床で利用するためには、高い優先的拡大速度が必要である。ＮＫ細胞を拡大させるための他の方法は、１０００倍の１４日ＮＫ細胞拡大速度を達成することができるが、それらは低分化、ＮＫＧ２Ｃｎｅｇ、ＦｃｅＲＩγｐｏｓ（ＦｃＲγｐｏｓ）ＮＫ細胞をもたらす（Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６９：４０１０－４０１７；Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ７６７８１）。更に、本明細書では、ｇ－ＮＫ細胞と表現型的に重複するＮＫ細胞を拡大させるために最適化された拡大が、治療的使用を支持する量までｇ－ＮＫ細胞を優先的に拡大させないことが見出される。具体的には、ｇ－ＮＫ細胞との表現型の重複を呈するＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫ細胞が、ＨＬＡ－Ｅトランスフェクト２２１．ＡＥＨ細胞及び培養培地中のＩＬ－１５の包含を使用して優先的に拡大され得ることが以前に報告されている（Ｂｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８５：２３９－２５１）。ＨＬＡ－Ｅを構成的に発現するそのようなＨＬＡ発現細胞との培養は、ＮＫ細胞をＮＫＧ２Ｃｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ表現型の方向に押し出す（ＮＫＧ２Ｃは、ＨＬＡ－Ｅに対する活性化受容体であるが、一方、ＮＫＧ２Ａは、ＨＬＡ－Ｅに対する阻害性受容体である）。そのような細胞は、その中にｇ－ＮＫを含むため、そのような方法は、ｇ－ＮＫ細胞を拡大させるのに十分であると考えられた。しかしながら、この方法は、ｇ－ＮＫ細胞の堅牢な拡大を達成しない。
本明細書に説明される方法は、これらの制限を克服する、ｇ－ＮＫ細胞に富むＮＫ細胞組成物を産生することができる。提供される方法は、以前の方法と比較して、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩが欠損しているＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞、例えば、２２１．ＡＥＨ細胞の、ＮＫ細胞に対するより大きい比を利用する。具体的には、以前の方法は、１０：１のＮＫ細胞対２２１．ＡＥＨ比の比など、２２１．ＡＥＨ細胞のより低い比を使用してきた。本明細書では、２２１．ＡＥＨ細胞などのＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞の大きい比が、より大きく、ｇ－ＮＫ表現型に向かってより歪められる全体的な拡大を結果的にもたらすことが見出されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞、例えば、２２１．ＡＥＨ細胞のより大きい比は、フィーダー細胞を照射することによって可能である。いくつかの態様では、照射されたフィーダー細胞株の使用はまた、ＧＭＰ適合性である方法を提供するため、有利である。拡大中、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、又はそれらの組み合わせのうちのいずれかの包含はまた、堅牢な拡大を支持することが見出される。提供される方法の特定の実施形態では、少なくとも１つの組換えサイトカインは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、２つ以上の組換えサイトカインが存在し、少なくとも１つの組換えサイトカインは、ＩＬ－２であり、少なくとも１つの組換えサイトカインは、ＩＬ－２１である。
本明細書で提供される方法は、ＩＬ－２１の存在下における拡大のためのＮＫ細胞の培養が、ＮＫ細胞をスーパーチャージして、サイトカイン、又はパーフォリン及びグランザイムＢなどのエフェクター分子を産生するという発見に基づく。本明細書の拡大されたプロセスによって産生されるＮＫ細胞を含有する組成物は、高度に機能的であり、堅牢な増殖を呈し、それらがレスキューなしで低温凍結された後であっても良好に機能する。例えば、提供されるプロセスによって産生されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたとき、強いＡＤＣＣ活性を呈するのみならず、抗体非依存性細胞傷害活性も呈する。例えば、エフェクター分子（例えば、パーフォリン及びグランザイム）は、提供される方法によって拡大されたＮＫ細胞中に自発的に存在し、それによって、高い細胞傷害能を呈する細胞を提供する。本明細書に示されるように、ＩＬ－２１（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１）を含む、提供されるプロセスによって産生されるＮＫ細胞組成物は、ＩＬ－２１の追加なしでＩＬ－２のみを含むプロセスによって産生されるＮＫ細胞組成物よりも高いパーセンテージのパーフォリン又はグランザイムＢに対して陽性のＮＫ細胞を呈するのみならず、それらはまた、細胞における分子の発現のより高い平均レベル又は程度を呈する。更に、ＩＬ－２１（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２）を含む、本明細書に提供される方法によって産生されるＮＫ細胞組成物はまた、標的抗原（例えば、ＣＤ３８）に対する抗体（例えば、ダラツムマブ）と組み合わせたときに、標的細胞に応答して、脱顆粒、並びにより多くのＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファを発現する能力を含む、実質的なエフェクター活性を呈するｇ－ＮＫ細胞組成物を結果的にもたらす。この機能的活性は、拡大されたＮＫ細胞の凍結保存及び解凍後であっても高度に保存される。細胞溶解酵素の顕著な増加、並びにより堅牢な活性化表現型は、ＣＤ１６架橋を介して抗体と結合したとき、拡大されたｇ－ＮＫ細胞が腫瘍標的のアポトーシスを誘発する増強された能力を裏付ける。顕著な抗体非依存性エフェクター表現型はまた、単剤療法としてのｇ－ＮＫ細胞の潜在的有用性を支持する。
更に、本明細書における発見はまた、ＩＬ－２１の存在下で拡大された提供されるＮＫ細胞が、例えば、ＩＬ－２１の追加なしでＩＬ－２の存在下のみで拡大された細胞よりも長い、延長された期間にわたって良好に持続及び増殖する潜在性を実証する。更に、結果は、凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞が、新鮮なｇ－ＮＫ細胞に匹敵するレベルで持続したことを示した。この有意に改善された持続性は、抗体媒介性ＡＤＣＣを増強するための既製の細胞療法としての新鮮な又は凍結保存されたｇ－ＮＫの潜在的有用性を強調する。多くのＮＫ細胞療法の臨床的有用性が、限られたＮＫ細胞持続性によって妨げられてきたため、改善された持続性のこの発見は有利である。
更に、本明細書における結果は、ｇ－ＮＫ細胞が、ダラツムマブなどの治療用抗体の標的である低レベルのＣＤ３８を発現するという驚くべき発見を実証する。ＣＤ３８などの特定の標的抗原に対する多くの既存のＮＫ細胞療法に伴う問題は、ＮＫ細胞が標的抗原を発現し得、それによって、「フラトリサイド」を結果的にもたらし、それによって、ＡＤＣＣ活性が、腫瘍に加えてＮＫ細胞の排除につながることである。実際、他の報告されたＮＫ細胞組成物は、高いパーセンテージ（例えば、＞９０％）のＣＤ３８ｈｉｇｈ ＮＫ細胞を発現することが報告されている。対照的に、本明細書における発見は、ＣＤ３８ｐｏｓ細胞のパーセンテージが、従来のＮＫ細胞又はＭＭ標的細胞株よりも、ドナー単離ｇ－ＮＫ細胞及びそれから拡大されたｇ－ＮＫ細胞で顕著に低かったことを実証する。より低いＣＤ３８発現は、従来のＮＫ細胞に関連するｇ－ＮＫ細胞による、顕著に低減した抗ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ）媒介性フラトリサイドにつながる。これらの結果は、フラトリサイドに関連した枯渇の犠牲になることなく、ＭＭにおいて増強された抗体抗腫瘍活性を付与するために、提供されるｇ－ＮＫ細胞組成物の有用性を支持する。結果は、拡大されたｇ－ＮＫ細胞がダラツムマブ誘発フラトリサイドに対して抵抗性であり、ＣＤ３８をわずかに発現する骨髄腫細胞に対してさえ、ダラツムマブ特異的細胞傷害を増強するため、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、ダラツムマブ不応性患者に最適であり得ることを更に示唆する。
更に、ｇ－ＮＫ細胞によって実証される上記の活性は、抗体効力を増強するために細胞を更に操作する必要なく達成され得る。例えば、ＣＤ３８－ノックアウトＮＫ細胞株は、ダラツムマブフラトリサイドを回避するために作成されており、非切断型ＣＤ１６を有するＮＫ細胞株は、抗腫瘍ＡＤＣＣを増強するために開発されている。しかしながら、臨床的使用の潜在的な欠点としては、遺伝子操作及び不死化細胞株の照射の必要性が挙げられる。
提供される方法によって産生されるものを含む、提供されるｇ－ＮＫ細胞組成物の優位性は、ｇ－ＮＫ細胞のインビボ活性を評価する研究において更に実証された。ＭＭの例示的なマウスモデルにおける活性は、抗体（例えば、ダラツムマブ）と組み合わせたｇ－ＮＫ細胞が、マウスの大部分において骨髄腫腫瘍量を排除し、持続的及び有意な腫瘍退縮を有することを示した。これらの結果は、インビボの抗体効果を増強するために、特にＦｃεＲ１γ＋である従来のＮＫ細胞と比較して、ｇ－ＮＫ細胞の優位性を強調し、このＮＫ細胞療法の治療潜在性を支持する。このモデルにおけるＮＫ細胞の高い持続性及び増強された生存、並びにそれらのフラトリサイドに対する抵抗性は、ｇ－ＮＫ細胞の優れた抗腫瘍効果及び持続性を支持し得る。
拡大前のＣＤ１６又はＣＤ５７細胞の濃縮によるなどの、拡大方法の前の細胞サンプルからのＮＫ細胞の濃縮は、ＣＤ３枯渇のみに基づいてＮＫ細胞を最初に濃縮する方法と比較して、達成され得るｇ－ＮＫ細胞拡大の量を更に実質的に増加させることもまた見出される。別の実施形態では、拡大前に実施され得る別の濃縮は、ＣＤ５６に対する正の選択及びＣＤ３８に対する負の選択又は枯渇によるＮＫ細胞に対する濃縮である。更なる実施形態では、拡大前に実施され得る別の濃縮は、ＣＤ５６に対する正の選択、それに続くＮＫＧ２Ａｎｅｇに対する負の選択又は枯渇、及びＣＤ１６１ｎｅｇに対する負の選択又は枯渇による、ＮＫ細胞に対する濃縮である。別の実施形態では、拡大前に実施され得る別の濃縮は、ＣＤ５７に対する正の選択、それに続くＮＫＧ２Ａに対する負の選択若しくは枯渇、及び／又はＮＫＧ２Ｃに対する正の選択による、ＮＫ細胞に対する濃縮である。別の実施形態では、拡大前に実施され得る別の濃縮は、ＣＤ５６に対する正の選択、それに続くＮＫＧ２Ａに対する負の選択若しくは枯渇、及び／又はＮＫＧ２Ｃに対する正の選択による、ＮＫ細胞に対する濃縮である。そのような実施形態のいずれかでは、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ及び／又はＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞に対する濃縮は、拡大後に実施され得る。
そのような実施形態のいずれかでは、濃縮されたＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）からなど、ＮＫ細胞を含有する細胞サンプルから濃縮され得る。いくつかの実施形態では、細胞サンプルからのＮＫ細胞の濃縮前に、Ｔ細胞は、ＣＤ３に対する負の選択又は枯渇によって除去され得る。そのような実施形態のいずれかでは、濃縮されたＮＫ細胞は、比較的高い割合のｇ－ＮＫ細胞を有するＮＫ細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を含有するヒト対象由来の、例えば、ＮＫ細胞の中で高いパーセンテージのｇ－ＮＫ細胞を有するように選択されたヒト対象由来の生体サンプルから濃縮され得る。そのような実施形態のいずれかでは、濃縮されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含有するヒト対象由来の生体サンプルから濃縮され得、サンプルは、比較的高い割合のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫ細胞（例えば、２０％若しくは約２０％若しくは２０％超のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫ細胞）、及び／又はＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞（例えば、７０％若しくは約７０％若しくは７０％超のＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞）を含有する。そのような実施形態のいずれかでは、濃縮されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含有するヒト対象由来の生体サンプルから濃縮され得、サンプルは、比較的高い割合のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫ細胞（例えば、２０％又は約２０％又は２０％超のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫ細胞）、及びＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞（例えば、７０％又は約７０％又は７０％超のＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞）を含有する。
まとめると、ｇ－ＮＫ細胞を拡大させるための提供されるアプローチは、培養開始時の最初の１０００万個の濃縮されたＮＫ細胞から、１０億個を超える細胞、場合によっては最大８０億個以上のＮＫ細胞の拡大を達成し得る。具体的には、提供される方法は、拡大後のｇ－ＮＫ細胞の機能性を維持するか、又は場合によっては増加させた、高収率（＞１０００倍）拡大速度を結果的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、提供される方法は、高レベルのパーフォリン及びグランザイムＢを発現するｇ－ＮＫ細胞集団を結果的にもたらし得る。更に、提供される方法は、解凍されたＮＫ細胞のレスキューを伴う多くの既存の方法によって一般的に達成されない、以前に凍結されたＮＫ細胞を拡大させるのに十分であることが見出される。いくつかの実施形態では、これは、拡大プロトコルの持続期間を増加させることによって達成される。いくつかの実施形態では、これは、ＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞対ＮＫ細胞の比を、例えば、約１：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞に減少させることによって達成される。いくつかの実施形態では、これは、拡大中の組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、又はそれらの組み合わせのうちのいずれかの包含によって達成される。特定の実施形態では、少なくとも１つの組換えサイトカインが、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、拡大は、少なくとも１つが組換えＩＬ－２１であり、少なくとも１つが組換えＩＬ－２である、２つ以上の組換えサイトカインの存在下で実施される。本明細書に示されるように、提供される方法は、強力な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を呈するｇ－ＮＫ細胞をもたらし、治療用途のためのそのような細胞の有用性を支持する。
本明細書に示されるように、提供される方法によって産生されるような、提供されるｇ－ＮＫ細胞及びそれを含有する組成物は、がん療法に使用され得る。いくつかの態様では、提供される研究は、ｇ－ＮＫ細胞が、腫瘍抗原（例えば、抗骨髄腫）に対する標的抗体と組み合わせられたときに顕著に増強されたＡＤＣＣ／エフェクター機能を有し、拡大されたｇ－ＮＫ細胞の養子移入が、治療用抗体（例えば、ダラツムマブ）と組み合わせられたときにインビボで腫瘍量を排除することを実証する。重要なことに、同種異系ＮＫ細胞の養子移入は、重度の移植片対宿主（graft-versus-host、ＧＶＨＤ）を結果的にもたらさず、したがって、抗体指向性ＮＫ細胞療法として抗体との組み合わせを含むそのような細胞療法は、臨床的使用のために「既製の」様式で与えられ得る。
特許出願、特許公開、並びに科学文献及びデータベースを含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、各個別の参考文献が参照により組み込まれるように具体的及び個別に示されるかのように、全ての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示を明確にするために、限定としてではなく、詳細な説明が以下のサブセクションに分割される。本明細書で使用されるセクションの見出しは、編成目的のみのためであり、説明される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
Ｉ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語、表記法、並びに他の技術的及び科学的用語又は専門用語は、特許請求の範囲の主題が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。いくつかの場合、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さのために、及び／又は容易な参照のために本明細書に定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語、表記法、並びに他の技術的及び科学的用語又は専門用語は、特許請求の範囲の主題が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。いくつかの場合、一般的に理解される意味を有する用語は、明確さのために、及び／又は容易な参照のために本明細書に定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から単数であることが明確に読み取れる場合を除き、対象の複数形も含まれるものとする。したがって、例えば、「分子（a molecule）」への言及は、任意選択的に、２つ以上のそのような分子の組み合わせを含み、他も同様である。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値又はパラメータの「約」への言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含む（及び説明する）。
本明細書に説明される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、「任意選択の」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が起こるか、又は起こらないこと、並びにその説明が、当該事象又は状況が起こる場合及び起こらない場合を含むことを意味する。例えば、任意選択的に置換される基は、その基が置換されていないか、又は置換されていることを意味する。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、天然であるか、又は組換え的に産生されるなどの部分的若しくは完全に合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメントを指し、抗原結合部位を形成するのに十分であり、かつ構築されたときに抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子の可変重鎖及び／又は軽鎖領域の少なくとも一部分を含有する、その任意のフラグメントを含む。したがって、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（抗体結合部位）と相同又は実質的に相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。典型的には、抗体は、最小限に、可変重鎖（variable heavy、ＶＨ）鎖及び／又は可変軽鎖（variable light、ＶＬ）の全部又は少なくとも一部分を含む。一般に、ＶＨ及びＶＬの対合は、一緒になって抗原結合部位を形成するが、場合によっては、単一のＶＨ又はＶＬドメインが抗原結合に十分である。抗体はまた、定常領域の全部又は一部分を含み得る。本明細書における抗体への言及は、完全長抗体及び抗原結合フラグメントを含む。本明細書では、用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、「抗体」と互換的に使用される。
「完全長抗体」「無傷抗体」又は「全抗体」は、互換的に使用され、抗体フラグメントに対して実質的に完全な形の抗体を指す。完全長抗体は、抗体分泌Ｂ細胞によって哺乳動物種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類など）から産生される抗体及び合成的に産生される同じドメインを有する抗体などの、典型的には、２つの完全長重鎖（例えば、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４）と、２つの完全長軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）と、ヒンジ領域とを有する抗体である。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。いくつかの場合において、無傷抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有してよい。
「抗体フラグメント」は、無傷抗体の一部分、無傷抗体の抗原結合及び／又は可変領域を含む。抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（disulfide-linked Fv、ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、二重特異性抗体、直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照されたい）、単鎖Ｆｖ（single-chain Fv、ｓｃＦｖ）又は単鎖Ｆａｂ（single-chain Fab、ｓｃＦａｂ）を含む、単鎖抗体分子、上記のいずれかの抗原結合フラグメント及び抗体フラグメント由来の多重特異性抗体が挙げられる。本明細書における目的のために、抗体フラグメントは、典型的には、ＮＫ細胞の表面上のＣＤ１６と結合又は架橋するのに十分であるものを含む。
「自家性」という用語は、個体自身の組織内に由来するか又は個体自身の組織から採取された細胞又は組織を指す。例えば、ＮＫ細胞の自家移入又は移植では、ドナー及びレシピエントは、同じ人物である。
「同種異系」という用語は、同じ種に属するか、又は同じ種から得られるが、遺伝的に異なり、したがって、場合によっては免疫学的に不適合である、細胞又は組織を指す。典型的には、「同種異系」という用語は、ドナーから同じ種のレシピエントに移植される細胞を定義するために使用される。
細胞組成物に関して「濃縮された」という用語は、対象から直接得られたか、又は単離された出発組成物などの、同じ体積の出発組成物中の細胞型の数又はパーセンテージと比較して、細胞型又は集団の数又はパーセンテージの増加がある組成物を指す。この用語は、組成物からの他の細胞、細胞型、又は集団の完全な除去を必要とせず、そのように富化された細胞が、富化された組成物中に１００％又は１００％近くで存在することも必要としない。
「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、続いてペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
タンパク質又は核酸に関する「異種」という用語は、異なる遺伝子源に由来するタンパク質又は核酸を指す。例えば、細胞に対して異種であるタンパク質又は核酸は、それが発現される細胞以外の生物又は個体に由来する。
本明細書で使用される場合、「導入する」という用語は、インビトロ又はインビボのいずれかで、ＤＮＡを細胞に導入する種々の方法を包含し、そのような方法としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）、及び感染が挙げられる。ベクターは、分子をコードするＤＮＡを細胞に導入するのに有用である。考えられるベクターとしては、プラスミドベクター及びウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルスベクター若しくはアデノ随伴ベクターなどの他のベクターが挙げられる。
「組成物」という用語は、細胞又は抗体を含む、２つ以上の産物、物質、又は化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。調製物は、一般に、活性成分（例えば、抗体）の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態である。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤が挙げられる。
本明細書で使用される場合、組み合わせは、２つ以上の項目の間又はそれらの中の任意の関連付けを指す。組み合わせは、２つの組成物又は２つの収集物などの、２つ以上の別個の項目であり得るか、２つ以上の項目の単一混合物などの、それらの混合物であり得るか、又はそれらの任意の変形であり得る。組み合わせの要素は、一般に、機能的に関連付けられるか、又は関連する。
本明細書で使用される場合、キットは、限定されるものではないが、治療用途を含む目的のために、追加の薬剤などの他の要素、及び組み合わせ又はその要素の使用のための説明書を任意選択的に含むパッケージ化された組み合わせである。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する」という用語は、臨床病理的過程で治療される個体又は細胞の自然経過を変更するように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果として、疾患進行率の低下、疾患状態の寛解又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。個体は、例えば、障害（例えば、好酸球媒介性疾患）と関連付けられた１つ以上の症状が軽減又は排除される場合、成功裏に「治療」される。例えば、個体は、治療が、疾患に罹患している個体の生活の質の増加、疾患を治療するために必要とされる他の薬物の用量の減少、疾患の再発頻度の低減、疾患の重症度の軽減、疾患の発症若しくは進行の遅延、及び／又は個体の生存の延長を結果的にもたらす場合、成功裏に「治療」される。
「有効量」とは、治療又は予防結果を含む、所望の又は示された効果を達成するために必要な用量及び期間において、少なくとも有効な量を指す。有効量は、１回以上の投与で提供され得る。「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすのに必要とされる細胞の少なくとも最小用量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、動物におけるがん、ウイルス感染、微生物感染、又は敗血症性ショックと関連付けられた重症度、持続期間、及び／又は症状を低減する組成物の量である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子に応じて変動し得る。治療有効量はまた、治療の有益な影響が抗体の任意の毒性又は有害な影響を上回る量であり得る。「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するために、必要な用量及び期間において、有効な量を指す。典型的には、必ずしもそうではないが、予防用量は、疾患の前又は疾患の初期段階で対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量未満であり得る。
本明細書で使用される場合、「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。治療の目的のための「哺乳動物」としては、ヒト、家畜及び産業動物、並びにイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどの、動物園、スポーツ、又はペットの動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
ＩＩ．治療の方法
対象における疾患又は状態の治療における使用のための、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞を含む、提供される細胞組成物に関する組成物及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、個体における状態を治療する方法であって、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物などの提供される組成物のいずれかを必要とする個体にそれを投与することを含む方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、組成物は、本明細書で提供される方法によって産生される。そのような方法及び使用は、例えば、疾患、状態、又は障害を有する対象への治療用細胞又はそれを含有する組成物の投与を伴う、治療方法及び使用を含む。いくつかの場合、疾患又は障害は、腫瘍又はがんである。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス感染である。いくつかの実施形態では、細胞又はその薬学的組成物は、疾患又は障害の治療をもたらすのに有効な量で投与される。使用は、そのような方法及び治療における、並びにそのような治療方法を実施するための医薬の調製における細胞又はその薬学的組成物の使用を含む。いくつかの実施形態では、方法は、それによって、対象における疾患又は状態又は障害を治療する。
対象における疾患又は状態の治療における使用のための、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞を含む、提供される細胞組成物に関する組成物及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、個体における状態を治療する方法であって、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物などの提供される組成物のいずれかを必要とする個体にそれを投与することを含む方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、組成物は、本明細書で提供される方法によって産生される。そのような方法及び使用は、例えば、疾患、状態、又は障害を有する対象への治療用細胞又はそれを含有する組成物の投与を伴う、治療方法及び使用を含む。いくつかの場合、疾患又は障害は、腫瘍又はがんである。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス感染である。いくつかの実施形態では、細胞又はその薬学的組成物は、疾患又は障害の治療をもたらすのに有効な量で投与される。使用は、そのような方法及び治療における、並びにそのような治療方法を実施するための医薬の調製における細胞又はその薬学的組成物の使用を含む。いくつかの実施形態では、方法は、それによって、対象における疾患又は状態又は障害を治療する。
一態様では、多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得る、方法が本明細書に開示される。
一態様では、リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、週一回の所定の回数の用量が、１回の用量、２回の用量、３回の用量、４回の用量、５回の用量、６回の用量、７回の用量、８回の用量、９回の用量、１０回の用量、１１回の用量、又は１２回の用量である。いくつかの実施形態では、週１回の用量が、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって投与される。いくつかの実施形態では、週１回、６回の用量のｇ－ＮＫ細胞組成物が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、週１回の用量は、サイクリングレジメンで投与される。いくつかの実施形態では、サイクリングレジメンは、１４日周期である。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、１４日周期に２回投与される。いくつかの実施形態では、１４日周期が、２回繰り返される。いくつかの実施形態では、１４日周期が、３回繰り返される。
いくつかの実施形態では、治療の方法又は使用は、個体への、提供される方法によって産生された拡大されたＮＫ細胞の組成物を含有する有効量の組成物の投与を伴う。いくつかの実施形態では、１０５個若しくは約１０５個～約１０１２個、又は１０５個若しくは約１０５個～１０８個若しくは約１０８個、又は１０６個若しくは約１０６個～１０１２個若しくは約１０１２個、又は１０８個若しくは約１０８個～１０１１個若しくは約１０１１個、又は１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個のそのような拡大されたＮＫ細胞が、個々の対象に投与される。いくつかの実施形態では、１０５個以上若しくは約１０５個以上、１０６個以上若しくは約１０６個以上、１０７個以上若しくは約１０７個以上、１０８個以上若しくは約１０８個以上、１０９個以上若しくは約１０９個以上、１０１０個以上若しくは約１０１０個以上、１０１１個以上若しくは約１０１１個以上、又は１０１２個以上若しくは約１０１２個以上のそのような拡大されたＮＫ細胞を含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの実施形態では、１ｋｇ当たり１０６個又は約１０６個～１０１０個のそのような拡大されたＮＫ細胞が、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、治療又は使用の方法は、個体への、本明細書に説明されるいずれかを含む、有効量の提供されるＮＫ細胞組成物のうちのいずれかの投与を伴う。いくつかの実施形態では、１０５個若しくは約１０５個～約１０１２個、又は１０５個若しくは約１０５個～１０８個若しくは約１０８個、又は１０６個若しくは約１０６個～１０１２個若しくは約１０１２個、又は１０８個若しくは約１０８個～１０１１個若しくは約１０１１個、又は１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個の提供される組成物のうちのいずれかに由来するＮＫ細胞が、個々の対象に投与される。いくつかの実施形態では、１０５個以上若しくは約１０５個以上、１０６個以上若しくは約１０６個以上、１０７個以上若しくは約１０７個以上、１０８個以上若しくは約１０８個以上、１０９個以上若しくは約１０９個以上、１０１０個以上若しくは約１０１０個以上、１０１１個以上若しくは約１０１１個以上、又は１０１２個以上若しくは約１０１２個以上の提供される組成物のうちのいずれかに由来するＮＫ細胞が、個体に投与される。いくつかの実施形態では、１ｋｇ当たり１０６個又は約１０６個～１０１０個の提供される組成物のうちのいずれかのＮＫ細胞が、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１×１０８個又は約１×１０８個の細胞～５０×１０９個又は約５０×１０９個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０８個の細胞であり得るか、又は約５×１０８個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０９個の細胞であり得るか、又は約５×１０９個の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の各用量は、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１０×１０９個の細胞であり得るか、又は約１０×１０９個の細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、治療の方法は、有効量のｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、１０５個若しくは約１０５個～約１０１２個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０５個若しくは約１０５個～１０８個若しくは約１０８個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０６個若しくは約１０６個～１０１２個若しくは約１０１２個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０８個若しくは約１０８個～１０１１個若しくは約１０１１個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個のｇ－ＮＫ細胞。いくつかの実施形態では、１０５個以上若しくは約１０５個以上のｇ－ＮＫ細胞、１０６個以上若しくは約１０６個以上のｇ－ＮＫ細胞、１０７個以上若しくは約１０７個以上のｇ－ＮＫ細胞、１０８個以上若しくは約１０８個以上のｇ－ＮＫ細胞、１０９個以上若しくは約１０９個以上のｇ－ＮＫ細胞、１０１０個以上若しくは約１０１０個以上のｇ－ＮＫ細胞、１０１１個以上若しくは約１０１１個以上のｇ－ＮＫ細胞、又は１０１２個以上若しくは約１０１２個以上のｇ－ＮＫ細胞を含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの実施形態では、１０６個又は約１０６個～１０１０個／ｋｇのｇ－ＮＫ細胞が、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、提供される治療の方法又は使用のうちのいずれかによる投与のための用量は、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、例えば、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、又は７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投与のための用量は、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、例えば、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、２．５×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、５×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇ、又は７．５×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０８個の細胞／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、用量は、ｇ－ＮＫ細胞、又は本明細書に説明されるＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどの、ｇ－ＮＫ細胞の代理マーカーと関連付けられるか若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数、あるいは上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。上記の実施形態のいずれかでは、用量は、提供される方法によって産生される拡大された細胞の組成物中の細胞の数、又は上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。
いくつかの実施形態では、治療の方法又は使用のうちのいずれかによる投与のための用量は、５×１０７若しくは約５×１０７～１０×１０９若しくは約１０×１０９、例えば、５×１０７若しくは約５×１０７～５×１０９若しくは約５×１０９、約若しくは約５×１０７～１×１０９若しくは約１×１０９、５×１０７若しくは約５×１０７～５×１０８若しくは約５×１０８、約若しくは約５×１０７～１×１０８若しくは約１×１０８、１×１０８～１０×１０９若しくは約１０×１０９、１×１０８若しくは約１×１０８～５×１０９若しくは約５×１０９、約若しくは約１×１０８～１×１０９若しくは約１×１０９、１×１０８若しくは約１×１０８～５×１０８若しくは約５×１０８、５×１０８若しくは約５×１０８～１０×１０９若しくは約１０×１０９、５×１０８若しくは約５×１０８～５×１０９若しくは約５×１０９、約若しくは約５×１０８～１×１０９若しくは約１×１０９、１×１０９若しくは約１×１０９～１０×１０９若しくは約１０×１０９、１×１０９若しくは約１×１０９～５×１０９若しくは約５×１０９、又は５×１０９若しくは約５×１０９～１０×１０９若しくは約１０×１０９である。いくつかの実施形態では、投与のための用量は、５×１０８個又は約５×１０８個の細胞である。いくつかの実施形態では、投与のための用量は、１×１０９個又は約１×１０９個の細胞である。いくつかの実施形態では、投与のための用量は、５×１０９個又は約５×１０９個の細胞である。いくつかの実施形態では、投与のための用量は、１×１０１０個又は約１×１０１０個の細胞である。いくつかの実施形態では、用量は、ｇ－ＮＫ細胞、又は本明細書に説明されるＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどの、ｇ－ＮＫ細胞の代理マーカーと関連付けられるか若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数、あるいは上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。上記の実施形態のいずれかでは、用量は、提供される方法によって産生される拡大された細胞の組成物中の細胞の数、又は上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。
いくつかの実施形態では、拡大されたＮＫ細胞を含有する組成物は、提供される方法による拡大の直後に個体に投与される。他の実施形態では、拡大されたＮＫ細胞は、上記に説明された方法などによって、投与前の培養中の成長によって貯蔵又は拡大される。例えば、ＮＫ細胞は、個体への投与前に６、１２、１８、又は２４か月を超えて貯蔵され得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞などの、ＮＫ細胞及びそのサブセットを含有する提供される組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、及び／又は硬膜外投与経路などの非経口経路を含む任意の好都合な経路によって対象に投与され得る。
特定の実施形態では、提供される組成物は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、１０×１０６個若しくは約１０×１０６個の細胞～１０×１０９個の細胞が、１ｍＬ～１００ｍＬの体積で静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、５０×１０６個又は約５０×１０６個の細胞が投与される。いくつかの実施形態では、１×１０９個又は約１×１０９個の細胞が投与される。いくつかの実施形態では、５×１０９個又は約５×１０９個の細胞が投与される。いくつかの実施形態では、１０×１０９個又は約１０×１０９個の細胞が投与される。細胞数を投与するために注入する細胞の体積を決定することは、当業者のレベルの範囲内である。一例では、０．５×１０９個の細胞は、２．５×１０７個又は約２．５×１０７個の細胞／ｍＬの濃度（例えば、２００ｍＬ中に５×１０９個又は約５×１０９個の細胞）で製剤化された、解凍された凍結保存された組成物などの、組成物から約２０ｍＬの体積の静脈内注入によって投与される。
上記の実施形態のうちのいずれかでは、提供されるｇ－ＮＫ細胞及びその組成物は、疾患又は障害の治療のための単剤療法として使用され得る。
Ａ．組成物及び医薬製剤
いくつかの実施形態では、提供される方法で使用するための組成物が、ｇ－ＮＫ細胞を含有する。具体的には、提供される組成物の中には、ｇ－ＮＫ細胞について濃縮される細胞の組成物がある。いくつかの実施形態では、提供される方法で使用するための組成物は、提供される方法のうちのいずれかによって産生されるものなどの拡大されたＮＫ細胞であるｇ－ＮＫ細胞を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含有する。
いくつかの実施形態では、提供される方法で使用するための組成物が、ｇ－ＮＫ細胞を含有する。具体的には、提供される組成物の中には、ｇ－ＮＫ細胞について濃縮される細胞の組成物がある。いくつかの実施形態では、提供される方法で使用するための組成物は、提供される方法のうちのいずれかによって産生されるものなどの拡大されたＮＫ細胞であるｇ－ＮＫ細胞を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、約５～９９％のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、又は５～９９％（両端含む）の任意のパーセンテージのＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞が単離された対象に自然に存在する総ＮＫ細胞又は総細胞に対するＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットのパーセンテージと比較して、総ＮＫ細胞又は総細胞に対するＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットの増加したか、又はより大きいパーセンテージを含み得る。いくつかの実施形態では、パーセンテージは、少なくとも又は少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍以上増加する。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２０％若しくは約２０％、少なくとも３０％若しくは約３０％、少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８１％若しくは約８１％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８３％若しくは約８３％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８７％若しくは約８７％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも８９％若しくは約８９％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９１％若しくは約９１％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９３％若しくは約９３％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９５％若しくは約９５％、少なくとも９６％若しくは約９６％、少なくとも９７％若しくは約９７％、少なくとも９８％若しくは約９８％、少なくとも９９％若しくは約９９％、又は実質的に１００％のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５０％超のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、６０％超のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、７０％超のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、８０％超のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットが、組成物中の細胞又は組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９５％若しくは約９５％以上を構成する組成物を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、約５～９９％のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞若しくはそのサブセット、又は５～９９％（両端含む）の任意のパーセンテージのＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞若しくはそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞が単離された対象に自然に存在する総ＮＫ細胞又は総細胞に対するＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットのパーセンテージと比較して、総ＮＫ細胞又は総細胞に対するＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットの増加したか、又はより大きいパーセンテージを含み得る。いくつかの実施形態では、パーセンテージは、少なくとも又は少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍以上増加する。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２０％若しくは約２０％、少なくとも３０％若しくは約３０％、少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８１％若しくは約８１％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８３％若しくは約８３％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８７％若しくは約８７％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも８９％若しくは約８９％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９１％若しくは約９１％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９３％若しくは約９３％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９５％若しくは約９５％、少なくとも９６％若しくは約９６％、少なくとも９７％若しくは約９７％、少なくとも９８％若しくは約９８％、少なくとも９９％若しくは約９９％、又は実質的に１００％のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５０％超のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、６０％超のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、７０％超のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、８０％超のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットが、組成物中の細胞又は組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９５％若しくは約９５％以上を構成する組成物を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、約５～９９％のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞若しくはそのサブセット、又は５～９９％（両端含む）の任意のパーセンテージのＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞若しくはそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞が単離された対象に自然に存在する総ＮＫ細胞又は総細胞に対するＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットのパーセンテージと比較して、総ＮＫ細胞又は総細胞に対するＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットの増加したか、又はより大きいパーセンテージを含み得る。いくつかの実施形態では、パーセンテージは、少なくとも又は少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍以上増加する。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２０％若しくは約２０％、少なくとも３０％若しくは約３０％、少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８１％若しくは約８１％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８３％若しくは約８３％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８７％若しくは約８７％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも８９％若しくは約８９％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９１％若しくは約９１％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９３％若しくは約９３％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９５％若しくは約９５％、少なくとも９６％若しくは約９６％、少なくとも９７％若しくは約９７％、少なくとも９８％若しくは約９８％、少なくとも９９％若しくは約９９％、又は実質的に１００％のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５０％超のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、６０％超のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、７０％超のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。別の実施形態では、組成物は、８０％超のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、ＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞又はそのサブセットが、組成物中の細胞又は組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９５％若しくは約９５％以上を構成する組成物を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、約５～９９％のｇ－ＮＫ細胞、又は５～９９％（両端含む）の任意のパーセンテージのｇ－ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞が単離された対象に自然に存在する総ＮＫ細胞又は総細胞に対するｇ－ＮＫのパーセンテージと比較して、総ＮＫ細胞又は総細胞に対するｇ－ＮＫ細胞の増加したか、又はより大きいパーセンテージを含み得る。いくつかの実施形態では、パーセンテージは、少なくとも又は少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍以上増加する。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２０％若しくは約２０％、少なくとも３０％若しくは約３０％、少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８１％若しくは約８１％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８３％若しくは約８３％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８７％若しくは約８７％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも８９％若しくは約８９％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９１％若しくは約９１％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９３％若しくは約９３％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９５％若しくは約９５％、少なくとも９６％若しくは約９６％、少なくとも９７％若しくは約９７％、少なくとも９８％若しくは約９８％、少なくとも９９％若しくは約９９％、又は実質的に１００％のｇ－ＮＫ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、５０％超のｇ－ＮＫ細胞を含む。別の実施形態では、組成物は、７０％超のｇ－ＮＫ細胞を含む。別の実施形態では、組成物は、８０％超のｇ－ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、ｇ－ＮＫ細胞が、組成物中の細胞又は組成物中のＮＫ細胞の少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９５％若しくは約９５％以上を構成する組成物を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも５５％若しくは約５５％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、又は少なくとも９５％若しくは約９５％が、ＣＤ５７ｐｏｓであるｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の７０％又は約７０％～９０％又は約９０％は、表現型ＣＤ５７ｐｏｓを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも７２％若しくは約７２％、少なくとも７４％若しくは約７４％、少なくとも７６％若しくは約７６％、少なくとも７８％若しくは約７８％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９６％若しくは約９６％、又は少なくとも９８％若しくは約９８％は、表現型ＣＤ５７ｐｏｓを有する。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも６０％又は約６０％は、表現型ＣＤ５７ｐｏｓを含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも７０％又は約７０％は、表現型ＣＤ５７ｐｏｓを含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ３ｎｅｇを更に含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の５０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、５０％又は約５０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の７０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、７０％又は約７０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、組成物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも５５％若しくは約５５％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、又は少なくとも９５％若しくは約９５％が、ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇであるｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の７０％又は約７０％～９０％又は約９０％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも７２％若しくは約７２％、少なくとも７４％若しくは約７４％、少なくとも７６％若しくは約７６％、少なくとも７８％若しくは約７８％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９６％若しくは約９６％、又は少なくとも９８％若しくは約９８％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを有する。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも６０％又は約６０％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも７０％又は約７０％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ３ｎｅｇを更に含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の５０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、５０％又は約５０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の７０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、７０％又は約７０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、組成物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも５５％若しくは約５５％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、又は少なくとも９５％若しくは約９５％が、ＣＤ３８ｐｏｓである表現型を有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の７０％又は約７０％～９０％又は約９０％は、表現型ＣＤ３８ｎｅｇを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも７２％若しくは約７２％、少なくとも７４％若しくは約７４％、少なくとも７６％若しくは約７６％、少なくとも７８％若しくは約７８％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９６％若しくは約９６％、又は少なくとも９８％若しくは約９８％は、表現型ＣＤ３８ｎｅｇを有する。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも６０％又は約６０％は、表現型ＣＤ３８ｎｅｇを含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも７０％又は約７０％は、表現型ＣＤ３８ｎｅｇを含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ３ｎｅｇを更に含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の５０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、５０％又は約５０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の７０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、７０％又は約７０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、組成物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも５５％若しくは約５５％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、又は少なくとも９５％若しくは約９５％が、ＣＤ１６ｎｅｇである表現型を有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の７０％又は約７０％～９０％又は約９０％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも７２％若しくは約７２％、少なくとも７４％若しくは約７４％、少なくとも７６％若しくは約７６％、少なくとも７８％若しくは約７８％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９６％若しくは約９６％、又は少なくとも９８％若しくは約９８％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓを有する。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも６０％又は約７０％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓを含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも７０％又は約７０％は、表現型ＣＤ１６ｐｏｓを含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ３ｎｅｇを更に含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の５０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、５０％又は約５０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の７０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、７０％又は約７０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、組成物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも４０％若しくは約４０％、少なくとも５０％若しくは約５０％、少なくとも５５％若しくは約５５％、少なくとも６０％若しくは約６０％、少なくとも６５％若しくは約６５％、少なくとも７０％若しくは約７０％、少なくとも７５％若しくは約７５％、少なくとも少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８５％若しくは約８５％、少なくとも９０％若しくは約９０％、又は少なくとも９５％若しくは約９５％が、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇであるｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の７０％又は約７０％～９０％又は約９０％が、表現型ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを有する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも７２％若しくは約７２％、少なくとも７４％若しくは約７４％、少なくとも７６％若しくは約７６％、少なくとも７８％若しくは約７８％、少なくとも８０％若しくは約８０％、少なくとも８２％若しくは約８２％、少なくとも８４％若しくは約８４％、少なくとも８６％若しくは約８６％、少なくとも８８％若しくは約８８％、少なくとも９０％若しくは約９０％、少なくとも９２％若しくは約９２％、少なくとも９４％若しくは約９４％、少なくとも９６％若しくは約９６％、又は少なくとも９８％若しくは約９８％は、表現型ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを有する。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも６０％又は約６０％は、表現型ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも７０％又は約７０％は、表現型ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ３ｎｅｇを更に含む。いくつかの実施形態では、表現型は、表面表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の５０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、５０％又は約５０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞の７０％超がＦｃＲγｎｅｇであり、任意選択的に、７０％又は約７０％～９０％がＦｃＲγｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の５０％超又は約５０％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の５５％超又は約５５％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の６０％超又は約６０％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の６５％超又は約６５％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の７５％超又は約７５％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の８０％超又は約８０％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の８５％超又は約８５％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の９０％超又は約９０％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中のＮＫ細胞の９５％超又は約９５％超が、ｇ－ＮＫ細胞（ＦｃＲγｎｅｇ）又はその代理マーカープロファイルを発現するＮＫ細胞である、ＮＫ細胞の集団を含む。代理マーカープロファイルは、本明細書に説明される任意のものであり得る。例えば、代理マーカープロファイルは、ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇであり得る。他の例では、代理マーカープロファイルは、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇであり得る。更なる例では、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルは、ＣＤ３８ｎｅｇである。代理表面マーカープロファイルは、表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞、又はその特定のパーセンテージ、例えば、約７０％超は、パーフォリン及び／又はグランザイムＢに対して陽性である。パーフォリン又はグランザイムＢに対して陽性の細胞の数を測定するための方法は、当業者に既知である。方法としては、例えば、細胞内フローサイトメトリーが挙げられる。一例では、パーフォリン又はグランザイムＢに対して陽性の細胞のパーセンテージ又は数は、パーフォリン及びグランザイムＢに対する抗体で染色する前に、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＩｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを使用して、細胞の透過処理によって決定され得る。次いで、細胞染色が、例えば、フローサイトメトリーを使用して解明され得る。
いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超がパーフォリンに対して陽性であり、組成物のｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞の７５％超又は約７５％超がパーフォリンに対して陽性であり、組成物のｇ－ＮＫ細胞の７５％超又は約７５％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞の８０％超又は約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、組成物のｇ－ＮＫ細胞の８０％超又は約８０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞の８５％超又は約８５％超がパーフォリンに対して陽性であり、組成物のｇ－ＮＫ細胞の８５％超又は約８５％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞の９０％超又は約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、組成物のｇ－ＮＫ細胞の９０％超又は約９０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、組成物のｇ－ＮＫ細胞の９５％超又は約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、組成物のｇ－ＮＫ細胞の９５％超又は約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞、例えばｇ－ＮＫ細胞によるパーフォリン及びグランザイムＢの発現レベルは、細胞内フローサイトメトリー及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）のレベルに基づいて測定されたレベルによって測定され得る。いくつかの実施形態では、ＭＦＩに基づくパーフォリン及びグランザイムＢの発現レベルは、ｇ－ＮＫ細胞とＦｃＲγｐｏｓである細胞との間で異なることになる。いくつかの実施形態では、パーフォリンに対して陽性である組成物のｇ－ＮＫ細胞は、ＭＦＩレベルに基づいて、ＦｃＲγｐｏｓＮＫ細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍のパーフォリンの平均レベルを発現する。いくつかの実施形態では、パーフォリンに対して陽性である組成物のｇ－ＮＫ細胞は、ＭＦＩレベルに基づいて、ＦｃＲγｐｏｓＮＫ細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも３倍又は約３倍のパーフォリンの平均レベルを発現する。いくつかの実施形態では、パーフォリンに対して陽性である組成物のｇ－ＮＫ細胞は、ＭＦＩレベルに基づいて、ＦｃＲγｐｏｓＮＫ細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも４倍又は約４倍のパーフォリンの平均レベルを発現する。いくつかの実施形態では、グランザイムＢに対して陽性である組成物のｇ－ＮＫ細胞は、ＭＦＩレベルに基づいて、ＦｃＲγｐｏｓＮＫ細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍のグランザイムＢの平均レベルを発現する。いくつかの実施形態では、グランザイムＢに対して陽性である組成物のｇ－ＮＫ細胞は、ＭＦＩレベルに基づいて、ＦｃＲγｐｏｓＮＫ細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも３倍又は約３倍のグランザイムＢの平均レベルを発現する。いくつかの実施形態では、グランザイムＢに対して陽性である組成物のｇ－ＮＫ細胞は、ＭＦＩレベルに基づいて、ＦｃＲγｐｏｓＮＫ細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも４倍又は約４倍のグランザイムＢの平均レベルを発現する。
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％が、ＦｃＲγ欠損ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、パーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、グランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、ＦｃＲγｎｅｇである。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、パーフォリンに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。任意の実施形態のうちのいくつかでは、グランザイムＢに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのグランザイムＢを発現する。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、組成物中の細胞の１０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、腫瘍標的細胞に対する脱顆粒が可能であり、任意選択的に、脱顆粒が、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される。任意の実施形態のうちのいくつかでは、組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、脱顆粒を呈する。任意のそのような実施形態のうちのいくつかでは、組成物中の細胞の１０％超が、腫瘍標的細胞に対するインターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができ、任意選択的に、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファが、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される。
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＳＬＡＭＦ７を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ又はロンカスツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）である。
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＳＬＡＭＦ７を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ又はロンカスツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）である。
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％は、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγｎｅｇ）ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、組成物中の細胞の１５％超又は約１５％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下でエフェクターサイトカインを産生する。いくつかの実施形態では、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＳＬＡＭＦ７を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ又はロンカスツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）である。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－アルファである。任意の実施形態のうちのいくつかでは、エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファである。
任意の実施形態のうちのいくつかでは、組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、脱顆粒を呈する。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＳＬＡＭＦ７を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ又はロンカスツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）である。
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％は、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγｎｅｇ）ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、組成物中の細胞の１５％超又は約１５％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、脱顆粒を呈する。いくつかの実施形態では、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、脱顆粒を呈する。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３８を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＳＬＡＭＦ７を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、ベランタマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ又はロンカスツキシマブ）である。いくつかの実施形態では、例えば、標的細胞は、ＣＤ３０を発現する腫瘍細胞株であり得、抗体は、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）である。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の６０％超又は約６０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の７０％超又は約７０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の８０％超又は約８０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の９０％超又は約９０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物中の細胞の９５％超又は約９５％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルを呈する。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルは、ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルは、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルは、ＣＤ３８ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、更に、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓである。
上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の６０％超又は約６０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の７０％超又は約７０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の８０％超又は約８０％超が、ｇ－ＮＫ細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の９０％超又は約９０％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の９５％超又は約９５％超は、ｇ－ＮＫ細胞である。
上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の８０％超又は約８０％超は、パーフォリンに対して陽性である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の９０％超又は約９０％超は、パーフォリンに対して陽性である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、パーフォリンに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。
上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の８０％超又は約８０％超が、グランザイムＢに対して陽性である。上記の実施形態のうちのいずれかの一部では、細胞の９０％超又は約９０％超が、グランザイムＢに対して陽性である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、グランザイムＢに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのグランザイムＢを発現する。
提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０６個又は約１０６個の細胞～１０１２個又は約１０１２個の細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０６個若しくは約１０６個～１０１１個若しくは約１０１１個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０９個若しくは約１０９個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０８個若しくは約１０８個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０７個若しくは約１０７個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０１２個若しくは約１０１２個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０１１個若しくは約１０１１個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０９個若しくは約１０９個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０８個若しくは約１０８個の細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０１２個若しくは約１０１２個の細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０１１個若しくは約１０１１個の細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０９個若しくは約１０９個の細胞、１０９個若しくは約１０９個～１０１２個若しくは約１０１２個の細胞、１０９個若しくは約１０９個～１０１１個若しくは約１０１１個の細胞、１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０１０個若しくは約１０１０個～１０１２個若しくは約１０１２個の細胞、１０１０個若しくは約１０１０個～１０１１個若しくは約１０１１個の細胞、又は１０１１個若しくは約１０１１個～１０１２個若しくは約１０１２個の細胞を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、少なくとも又はおよそ少なくとも１０６個の細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０６個若しくは約１０６個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０９個若しくは約１０９個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０８個若しくは約１０８個の細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０７個若しくは約１０７個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０９個若しくは約１０９個の細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０８個若しくは約１０８個の細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０９個若しくは約１０９個の細胞、１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個の細胞を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、少なくとも又はおよそ少なくとも１０８個の細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、少なくとも１０９個又は約１０９個の細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、少なくとも１０１０個又は約１０１０個の細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、少なくとも１０１１個又は約１０１１個の細胞を含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０８個又は約１０８個～１０１１個又は約１０１１個の細胞を含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０８個又は約１０８個～１０１０個又は約１０１０個の細胞を含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０８個又は約１０８個～１０９個又は約１０９個の細胞を含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０９個又は約１０９個～１０１１個又は約１０１１個の細胞を含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０９個又は約１０９個～１０１０個又は約１０１０個の細胞を含む。提供される態様のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０１０個又は約１０１０個～１０１１個又は約１０１１個の細胞を含む。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、少なくとも１０６個又は約１０６個のｇ－ＮＫ細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、組成物は、１０６個若しくは約１０６個～１０１０個若しくは約１０１０個のｇ－ＮＫ細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０９個若しくは約１０９個のｇ－ＮＫ細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０８個若しくは約１０８個のｇ－ＮＫ細胞、１０６個若しくは約１０６個～１０７個若しくは約１０７個のｇ－ＮＫ細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０１０個若しくは約１０１０個のｇ－ＮＫ細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０９個若しくは約１０９個のｇ－ＮＫ細胞、１０７個若しくは約１０７個～１０８個若しくは約１０８個のｇ－ＮＫ細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０１０個若しくは約１０１０個のｇ－ＮＫ細胞、１０８個若しくは約１０８個～１０９個若しくは約１０９個のｇ－ＮＫ細胞、１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個のｇ－ＮＫ細胞を含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、ｇ－ＮＫ細胞は、ＦｃＲγｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、ｇ－ＮＫ細胞は、ｇ－ＮＫ代理表面マーカープロファイルを有する細胞である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇである。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、ｇ－ＮＫ細胞又はｇ－ＮＫ代理マーカープロファイルを有する細胞は、表面表現型ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、ｇ－ＮＫ細胞又はｇ－ＮＫ代理マーカープロファイルを有する細胞は、表面表現型ＣＤ３８ｎｅｇを更に含む。
提供される組成物のうちのいずれかの特定の実施形態では、組成物中の細胞は、同じドナーに由来する。したがって、組成物は、１つ以上の異なるドナーからの細胞の混合された集団を含まない。本明細書で提供されるように、拡大の方法は、特定のＮＫ細胞サブセット、特にｇ－ＮＫ細胞サブセット、又は上記に説明されたＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどの、ｇ－ＮＫ細胞に対する代理マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの５００倍以上、６００倍以上、７００倍以上、８００倍以上、９００倍以上、１０００倍以上の高収率拡大を結果的にもたらす。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１０００倍超又は約１０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２０００倍超又は約２０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５００倍超又は約２５００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３０００倍超又は約３０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、５０００倍超又は約５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１００００倍超又は約１００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１５０００倍超又は約１５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２００００倍超又は約２００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５０００倍超又は約２５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３００００倍超又は約３００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３５０００倍超又は約３５０００倍超である。特定の実施形態では、拡大は、特定のＮＫ細胞サブセット、特に、ｇ－ＮＫ細胞サブセット、又は上記に説明されたＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどのｇ－ＮＫ細胞に対する代理マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数の１，０００倍又は約１，０００倍の増加を結果的にもたらす。特定の実施形態では、拡大は、特定のＮＫ細胞サブセット、特に、ｇ－ＮＫ細胞サブセット、又は上記に説明されたＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどのｇ－ＮＫ細胞に対する代理マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数の３，０００倍又は約３，０００倍の増加を結果的にもたらす。特定の実施形態では、拡大は、特定のＮＫ細胞サブセット、特に、ｇ－ＮＫ細胞サブセット、又は上記に説明されたＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどのｇ－ＮＫ細胞に対する代理マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数の３５，０００倍又は約３５，０００倍の増加を結果的にもたらす。
いくつかの場合、単一ドナーから得られたＮＫ細胞の最初の供給源から提供される方法によって達成される拡大は、必要とする対象への投与のための複数の個々の用量を提供するための細胞の組成物を産生し得る。したがって、提供される方法は、同種異系方法に特に好適である。いくつかの場合、提供される方法による１人のドナーから単離されたＮＫ細胞の出発集団からの単回拡大は、必要とする対象への投与のために、約２０超の個別用量、例えば、３０若しくは約３０の個別用量、４０の個別用量、５０の個別用量、６０の個別用量、７０の個別用量、８０の個別用量、９０の個別用量、１００の個別用量、又は上記のいずれかの間の値である個別用量を結果的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、個別用量は、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、例えば、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０５個の細胞／ｋｇ～７．５×１０５個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０６個の細胞／ｋｇ～２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約５×１０６個の細胞／ｋｇ～７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ、又は７．５×１０６個の細胞／ｋｇ若しくは約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０７個の細胞／ｋｇ若しくは約１×１０７個の細胞／ｋｇである。いくつかの実施形態では、個別用量は、１×１０５個の細胞／ｋｇ又は約１×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、例えば、２．５×１０５個の細胞／ｋｇ又は約２．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、５×１０５個の細胞／ｋｇ又は約５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、７．５×１０５個の細胞／ｋｇ又は約７．５×１０５個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、１×１０６個の細胞／ｋｇ又は約１×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、２．５×１０６個の細胞／ｋｇ又は約２．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ又は約５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、７．５×１０６個の細胞／ｋｇ又は約７．５×１０６個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、１×１０７個の細胞／ｋｇ又は約１×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、２．５×１０７個の細胞／ｋｇ又は約２．５×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、５×１０７個の細胞／ｋｇ又は約５×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇ、７．５×１０７個の細胞／ｋｇ又は約７．５×１０７個の細胞／ｋｇ～１×１０８個の細胞／ｋｇ又は約１×１０８個の細胞／ｋｇである。いくつかの実施形態では、個別用量は、５×１０７若しくは約５×１０７～１０×１０９若しくは約１０×１０９、例えば、５×１０７若しくは約５×１０７～５×１０９若しくは約５×１０９、約若しくは約５×１０７～１×１０９若しくは約１×１０９、５×１０７若しくは約５×１０７～５×１０８若しくは約５×１０８、約若しくは約５×１０７～１×１０８若しくは約１×１０８、１×１０８～１０×１０９若しくは約１０×１０９、１×１０８若しくは約１×１０８～５×１０９若しくは約５×１０９、約若しくは約１×１０８～１×１０９若しくは約１×１０９、１×１０８若しくは約１×１０８～５×１０８若しくは約５×１０８、５×１０８若しくは約５×１０８～１０×１０９若しくは約１０×１０９、５×１０８若しくは約５×１０８～５×１０９若しくは約５×１０９、約若しくは約５×１０８～１×１０９若しくは約１×１０９、１×１０９若しくは約１×１０９～１０×１０９若しくは約１０×１０９、１×１０９若しくは約１×１０９～５×１０９若しくは約５×１０９、又は５×１０９若しくは約５×１０９～１０×１０９若しくは約１０×１０９である。いくつかの実施形態では、個別用量は、５×１０８個又は約５×１０８個の細胞である。いくつかの実施形態では、個別用量は、１×１０９個又は約１×１０９個の細胞である。いくつかの実施形態では、個別用量は、５×１０９個又は約５×１０９個の細胞である。いくつかの実施形態では、個別用量は、１×１０１０個又は約１×１０１０個の細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかでは、用量は、細胞ｇ－ＮＫ細胞、又は上記に説明されるＮＫ細胞サブセットのうちのいずれかなどの、ｇ－ＮＫ細胞の代理マーカーと関連付けられるか若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数、あるいは上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。上記の実施形態のいずれかでは、用量は、方法によって
産生される拡大された細胞の組成物中の細胞の数、又は上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。
産生される拡大された細胞の組成物中の細胞の数、又は上記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。
組成物の中には、養子細胞療法のためのものなどの、投与のための薬学的組成物及び製剤がある。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される。
薬学的に許容される担体は、薬学的投与と適合する全ての溶媒、分散媒、被覆、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。そのような担体又は希釈剤の例としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルもまた、使用され得る。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。薬学的担体は、生理食塩水、デキストロース溶液、又はヒト血清アルブミンを含む溶液などの、ＮＫ細胞に好適であるものであるべきである。
いくつかの実施形態では、そのような組成物のための薬学的に許容される担体又はビヒクルは、任意の非毒性水溶液であり、ＮＫ細胞は、生存ＮＫ細胞の投与を可能にするのに十分な時間にわたって維持され得るか、又は生存したままであり得る。例えば、薬学的に許容される担体又はビヒクルは、生理食塩水溶液又は緩衝生理食塩水溶液であり得る。薬学的に許容される担体又はビヒクルはまた、ＮＫ細胞の効率を増加させ得る様々な生体材料を含み得る。細胞ビヒクル及び担体は、例えば、メチルセルロース（Ｍ．Ｃ．Ｔａｔｅ，Ｄ．Ａ．Ｓｈｅａｒ，Ｓ．Ｗ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｄ．Ｇ．Ｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｃ．ＬａＰｌａｃａ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２２，１１１３，２００１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、キトサン（Ｓｕｈ Ｊ Ｋ Ｆ，Ｍａｔｔｈｅｗ Ｈ Ｗ Ｔ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１，２５８９，２０００、Ｌａｈｉｊｉ Ａ，Ｓｏｈｒａｂｉ Ａ，Ｈｕｎｇｅｒｆｏｒｄ Ｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ，５１，５８６，２０００、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドコポリマーＰ（ＮＩＰＡＭ－ｃｏ－ＡＡ）（Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ，Ｂ．Ｖｅｒｎｏｎ，Ｃ．Ｋ．Ｈａｎ，Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ５３，２４９，１９９８、Ｈ．Ｇａｐｐａ，Ｍ．Ｂａｕｄｙｓ，Ｊ．Ｊ．Ｋｏｈ，Ｓ．Ｗ．Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．Ｂａｅ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．７，３５，２００１、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びポリ（オキシエチレン）／ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（Ｂ．Ｊｅｏｎｇ，Ｋ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ａ．Ｇｕｔｏｗｓｋａ，Ｙ．Ｈ．Ａｎ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３，８６５，２００２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｐ（ＰＦ－ｃｏ－ＥＧ）（Ｓｕｇｇｓ Ｌ Ｊ，Ｍｉｋｏｓ Ａ Ｇ．Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓ，８，３４５，１９９９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＰＥＯ／ＰＥＧ（Ｍａｎｎ Ｂ Ｋ，Ｇｏｂｉｎ Ａ Ｓ，Ｔｓａｉ Ａ Ｔ，Ｓｃｈｍｅｄｌｅｎ Ｒ Ｈ，Ｗｅｓｔ Ｊ Ｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２，３０４５，２００１、Ｂｒｙａｎｔ Ｓ Ｊ，Ａｎｓｅｔｈ Ｋ Ｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２，６１９，２００１、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＰＶＡ（Ｃｈｉｈ－Ｔａ Ｌｅｅ，Ｐｏ－Ｈａｎ Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｙｕ－Ｄｅｒ Ｌｅｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，６１，３４８，２００５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、コラーゲン（Ｌｅｅ Ｃ Ｒ，Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ Ａ Ｊ，Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｍ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２２，３１４５，２００１、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、アルギネート（Ｂｏｕｈａｄｉｒ Ｋ Ｈ，Ｌｅｅ Ｋ Ｙ，Ａｌｓｂｅｒｇ Ｅ，Ｄａｍｍ Ｋ Ｌ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｋ Ｗ，Ｍｏｏｎｅｙ Ｄ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｒｏｇ１７，９４５，２００１、Ｓｍｉｄｓｒｄ Ｏ，Ｓｋｊａｋ－Ｂｒａｅｋ Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，８，７１，１９９０、各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）などの多糖類を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットなどのＮＫ細胞は、有効量で組成物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ＦｃＲγｎｅｇ細胞又はそのｇ－ＮＫ代理マーカープロファイルを有する細胞などの、有効量のｇ－ＮＫ細胞を含有する。有効量の細胞は、患者、並びに疾患のタイプ、重症度、及び程度に応じて変化し得る。したがって、医師は、対象の健康、疾患の程度及び重症度、並びに他の変数を考慮した後に、有効量を決定し得る。
ある特定の実施形態では、組成物中のそのような細胞の数は、治療有効量である。いくつかの実施形態では、量は、動物におけるがん、ウイルス感染、微生物感染、又は敗血症性ショックと関連付けられた重症度、持続期間、及び／又は症状を低減する量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、本明細書に説明される組成物を投与された患者又は動物において、組成物を投与されていない患者（若しくは動物）又は患者（若しくは動物）群におけるがんの成長又は拡散と比較して、少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％だけ、がんの成長又は拡散の低減を結果的にもたらす細胞の用量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、がん、ウイルス、及び微生物細胞の成長を阻害又は低減する活性を結果的にもたらす細胞傷害活性を結果的にもたらす量である。
いくつかの実施形態では、組成物は、１０５個若しくは約１０５個～１０１２個若しくは１０１２個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、又は１０５個若しくは約１０５個～１０８個若しくは１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、又は１０６個若しくは約１０６個～１０１２個若しくは１０１２個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、又は１０８個若しくは約１０８個～１０１１個若しくは１０１１個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、又は１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは１０１０個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセットである、ある量のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞又はそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１０５個超若しくは約１０５個超のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、１０６個若しくは約１０６個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、１０７個若しくは約１０７個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、１０８個若しくは約１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、１０９個若しくは約１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、１０１０個若しくは約１０１０個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、１０１１個若しくは約１０１１個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセット、又は１０１２個若しくは約１０１２個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞若しくはそのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、そのような量は、がん患者などの、疾患又は状態を有する対象に投与され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、１０５個若しくは約１０５個～１０１２個若しくは約１０１２個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０５個若しくは約１０５個～１０８個若しくは約１０８個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０６個若しくは約１０６個～１０１２個若しくは約１０１２個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０８個若しくは約１０８個～１０１１個若しくは約１０１１個のｇ－ＮＫ細胞、又は１０９個若しくは約１０９個～１０１０個若しくは約１０１０個のｇ－ＮＫ細胞である、ある量のｇ－ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１０５個超若しくは約１０５個超のｇ－ＮＫ細胞、１０６個超若しくは約１０６個超のｇ－ＮＫ細胞、１０７個超若しくは約１０７個超のｇ－ＮＫ細胞、１０８個超若しくは約１０８個超のｇ－ＮＫ細胞、１０９個超若しくは約１０９個超のｇ－ＮＫ細胞、１０１０個超若しくは約１０１０個超のｇ－ＮＫ細胞、１０１１個超若しくは約１０１１個超のｇ－ＮＫ細胞、又は１０１２個超若しくは約１０１２個超のｇ－ＮＫ細胞、又はそれを超えるｇ－ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、そのような量は、がん患者などの、疾患又は状態を有する対象に投与され得る。
いくつかの実施形態では、組成物の体積は、少なくとも又は少なくとも約１０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、又は５００ｍＬであり、例えば、１０ｍＬ若しくは約１０ｍＬ～５００ｍＬ、１０ｍＬ若しくは約１０ｍＬ～２００ｍＬ、１０ｍＬ若しくは約１０ｍＬ～１００ｍＬ、１０ｍＬ若しくは約１０ｍＬ～５０ｍＬ、５０ｍＬ若しくは約５０ｍＬ～５００ｍＬ、５０ｍＬ若しくは約５０ｍＬ～２００ｍＬ、５０ｍＬ若しくは約５０ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ若しくは約１００ｍＬ～５００ｍＬ、１００ｍＬ若しくは約１００ｍＬ～２００ｍＬ、又は２００ｍＬ若しくは約２００ｍＬ～５００ｍＬ（各々両端含む）である。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも又は少なくとも約１×１０５個の細胞／ｍＬ、５×１０５個の細胞／ｍＬ、１×１０６個の細胞／ｍＬ、５×１０６個の細胞／ｍＬ、１×１０７個の細胞／ｍＬ、５×１０７個の細胞／ｍＬ、又は１×１０８個の細胞／ｍＬの細胞密度を有する。いくつかの実施形態では、組成物の細胞密度は、１×１０５個の細胞／ｍＬ～１×１０８個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０５個の細胞／ｍＬ～約１×１０８個の細胞／ｍＬ、１×１０５個の細胞／ｍＬ～１×１０７個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０５個の細胞／ｍＬ～約１×１０７個の細胞／ｍＬ、１×１０５個の細胞／ｍＬ～１×１０６個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０５個の細胞／ｍＬ～約１×１０６個の細胞／ｍＬ、１×１０６個の細胞／ｍＬ～１×１０７個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０６個の細胞／ｍＬ～約１×１０７個の細胞／ｍＬ、１×１０６個の細胞／ｍＬ～１×１０８個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０６個の細胞／ｍＬ～約１×１０８個の細胞／ｍＬ、１×１０６個の細胞／ｍＬ～１×１０７個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０６個の細胞／ｍＬ～約１×１０７個の細胞／ｍＬ、又は１×１０７個の細胞／ｍＬ～１×１０８個の細胞／ｍＬ若しくは約１×１０７個の細胞／ｍＬ～約１×１０８個の細胞／ｍＬ（各々両端含む）である。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物を含む組成物は、無菌である。いくつかの実施形態では、細胞の単離、濃縮、又は培養は、エラー、使用者の取り扱い、及び／又は汚染を最小限に抑えるために、閉鎖環境又は無菌環境、例えば、無菌培養バッグ中で実施される。いくつかの実施形態では、無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成され得る。いくつかの実施形態では、培養は、ガス透過性培養容器を使用して実施される。いくつかの実施形態では、培養は、バイオリアクターを使用して実施される。
提供されるＮＫ細胞を凍結保存するのに好適である組成物も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、無血清凍結保存培地中で凍結保存される。いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保護剤を含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、ＤＭＳＯ及び／又はグリセロールであるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％又は約５％～１０％又は約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％又は約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、６％又は約６％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、７％又は約７％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、８％又は約８％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、９％又は約９％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、１０％又は約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、市販の凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０）を含有する。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０は、１０％ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide、ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地である。いくつかの実施形態では、凍結保存のために製剤化された組成物は、超低温などの低温で貯蔵され得、例えば、８０℃±６．０℃又は約８０℃±６．０℃などの、－４０℃～－１５０℃の範囲の温度による貯蔵であり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、患者への投与前に超低温で保存され得る。いくつかの態様では、ｇ－ＮＫ細胞などのＮＫ細胞サブセットが、提供される方法によるなどの、単離、処理、及び拡大を行われ、次いで、対象への投与前に超低温で貯蔵され得る。
小規模の超低温の保存のための典型的な方法は、例えば、米国特許第６，０１６８，９９１号に説明されている。小規模の場合、細胞は、予め冷却された５％ヒトアルブミン血清（human albumin serum、ＨＡＳ）中の低密度懸濁液（例えば、約２００×１０６／ｍｌの濃度）によって超低温で保存され得る。等量の２０％ＤＭＳＯがＨＡＳ溶液に追加され得る。混合物のアリコートがバイアルに入れられ、約－８０℃の超低温チャンバ内で一晩凍結され得る。
いくつかの実施形態では、凍結保存されたＮＫ細胞は、解凍によって投与のために調製される。いくつかの場合、ＮＫ細胞は、解凍直後に対象に投与され得る。そのような実施形態では、組成物は、いかなる更なる処理も伴わずに即座に使用することができる。他の場合、ＮＫ細胞は、解凍後に、薬学的に許容される担体による再懸濁、活性化剤若しくは刺激剤とのインキュベーションなどによって更に処理されるか、又は対象への投与前に活性化され、洗浄され、薬学的に許容される緩衝液中に再懸濁される。
Ｂ．併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物は、対象における疾患又は状態を治療するための１つ以上の他の薬剤との併用療法において投与され得る。そのような実施態様では、本明細書に提供されるｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物は、１つ以上の他の薬剤の投与の前に、それと同時に、又はそれに続いて（その後に）投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び他の治療剤と同時に又はそれらと連続して投与され得る。例示的な併用療法が以下のサブセクションに説明される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物は、対象における疾患又は状態を治療するための１つ以上の他の薬剤との併用療法において投与され得る。そのような実施態様では、本明細書に提供されるｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物は、１つ以上の他の薬剤の投与の前に、それと同時に、又はそれに続いて（その後に）投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び他の治療剤と同時に又はそれらと連続して投与され得る。例示的な併用療法が以下のサブセクションに説明される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇ－ＮＫ細胞を含有する組成物は、例えば、従来のＮＫ細胞と比較して、抗体又はＦｃ含有タンパク質によって活性化したか、又はそれらと接触したとき、増強された活性を呈する。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ１６の抗体媒介性架橋によって、又は抗体被覆腫瘍細胞によって活性化され得る。
いくつかの実施態様では、個体における状態を治療する方法であって、ｇ－ＮＫ細胞又はその組成物及び抗体を対象に投与することを含む、方法が本明細書に提供される。当業者は、例えば、個体の特定の疾患又は状態に応じて、提供されるｇ－ＮＫ細胞及び本明細書に説明される組成物とともに対象に投与するための適切な治療用（例えば、抗がん）モノクローナル抗体を選択することができる。好適な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）、単鎖抗体、及び他の形態の特異的結合分子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体を更に含み得る。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒトＩｇ由来の最小限の配列を含む、キメラＩｇｓ、Ｉｇ鎖又はフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は他の抗体の抗原結合サブ配列など）である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。
一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入」可変ドメインから取り込まれた「移入」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって達成される（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（１９８９）であり、完全なものより実質的に小さいヒト可変ドメインが、非ヒト種の対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦｃ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置換された、ヒト抗体である。ヒト化抗体としては、レシピエントの相補性決定領域（complementary determining region、ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置換されている、ヒト抗体（レシピエント抗体）が挙げられる。いくつかの事例では、対応する非ヒト残基は、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基を置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列においても見られない、残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、ＣＤＲ領域の全てではない場合、大部分が、非ヒトＩｇのものと対応し、ＦＲ領域の全てではない場合、大部分が、ヒト抗体コンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、典型的にはヒト抗体のものである、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｐｒｅｓｔａ，１９９２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）及びヒトｍＡｂの調製（Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ，１９８５）を含む、様々な技術を使用して産生され得る。同様に、内因性抗体遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているトランスジェニック動物にヒトＩｇ遺伝子を導入することが、ヒトＡｂを合成するために利用され得る。誘発時、遺伝子再配列、集合、及び抗体レパートリーなどの全ての点において、ヒトで見られるものとよく似たヒト抗体産生が観察される（１９９７ａ、１９９７ｂ、１９９７ｃ、１９９７ｄ、１９９７、１９９７、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６、１９９７、１９９７、２００１、１９９６、１９９７、１９９７、１９９７、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、１９９７、１９９７、１９９７）。
１．多発性骨髄腫
ａ．抗ＣＤ３８抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ３８である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ３８抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体が、ダラツムマブ（例えば、Ｄａｒｚａｌｅｘ（商標））である。
ａ．抗ＣＤ３８抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ３８である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ３８抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体が、ダラツムマブ（例えば、Ｄａｒｚａｌｅｘ（商標））である。
ｇ－ＮＫ細胞及び追加の薬剤は、連続して又は同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与前に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与後に投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与され得る。代替的には、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがん型に特異的な抗体が投与される時間とは異なる選択された時間に投与され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。一態様では、多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブである。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
特定の例では、対象は、ｇ－ＮＫ細胞の集団の前、後、又は実質的に同時に、有効用量の抗体を投与される。抗体の有効量は、特定の抗体、特定の疾患又は状態（例えば、腫瘍又は他の障害）、対象の全身状態、対象が受けている又は以前に受けた任意の追加の治療、及び他の関連因子を考慮に入れて、熟練した臨床医によって選択され得る。対象は、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞の集団を投与される。抗体及びｇ－ＮＫ細胞の集団の両方は、典型的には、非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、しかしながら、腫瘍又は腫瘍の近くへの注射又は注入（局所投与）又は腹膜腔への投与もまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、サイクリングレジメンで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、２８日周期で投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、各サイクルなどの、少なくとも１サイクルで週１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって、週１回投与される。いくつかの実施形態では、週１回、８回の用量の抗体が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、静脈内投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）の各用量が、８ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇ～約３２ｍｇ／ｋｇであり得る量で投与され得る。いくつかの実施形態では、各用量は、１６ｍｇ／ｋｇ又は約１６ｍｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体が、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）は、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ３８抗体組成物で投与され得る。例えば、抗体は、ダラツムマブ及び組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）を含む抗ＣＤ３８抗体組成物として投与され得る。そのような組成物の例は、米国特許出願公開第２０１７／０１２１４１４号に説明されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、約１８００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、約３０，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む。
いくつかの実施形態では、方法が、抗ＣＤ３８抗体を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ３８抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。
いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、ＣＤ３８の低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、例えば、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＣＤ３８に対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＣＤ３８発現を低減又は排除するように操作されていない。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈し、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈する。
ｂ．抗ＳＬＡＭＦ７抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＳＬＡＭＦ７である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、エロツズマブ（例えば、ＥＭＰＬＩＣＩＴＩ（登録商標））である。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＳＬＡＭＦ７である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＳＬＡＭＦ７抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、エロツズマブ（例えば、ＥＭＰＬＩＣＩＴＩ（登録商標））である。
ｇ－ＮＫ細胞及び追加の薬剤は、連続して又は同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与前に投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与され得る。代替的には、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがん型に特異的な抗体が投与される時間とは異なる選択された時間に投与され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。一態様では、多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、エロツズマブであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
特定の例では、対象は、ｇ－ＮＫ細胞の集団の前、後、又は実質的に同時に、有効用量の抗体を投与される。抗体の有効量は、特定の抗体、特定の疾患又は状態（例えば、腫瘍又は他の障害）、対象の全身状態、対象が受けている又は以前に受けた任意の追加の治療、及び他の関連因子を考慮に入れて、熟練した臨床医によって選択され得る。対象は、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞の集団を投与される。抗体及びｇ－ＮＫ細胞の集団の両方は、典型的には、非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、しかしながら、腫瘍又は腫瘍の近くへの注射又は注入（局所投与）又は腹膜腔への投与もまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、サイクリングレジメンで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、２８日周期で投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、各サイクルなどの、少なくとも１サイクルで週１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって、週１回投与される。いくつかの実施形態では、週１回、８回の用量の抗体が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、皮下投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）の各用量が、２サイクルにわたって毎週、その後、２週間毎に、１０ｍｇ／ｋｇ又は約１０ｍｇ／ｋｇであり得る量で投与され得る。いくつかの実施態様では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、レナリドミド及びデキサメタゾンとともに投与される。いくつかの実施態様では、抗ＳＬＡＭＦ７抗体は、デキサメタゾン、ジフェンヒドラミン、ラニチジン、及びアセトアミノフェンの後に投与される。
いくつかの実施形態では、方法が、抗ＳＬＡＭＦ７抗体を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＳＬＡＭＦ７抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。
いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、ＳＬＡＭＦ７の低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、例えば、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＳＬＡＭＦ７に対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＳＬＡＭＦ７発現を低減又は排除するように操作されていない。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＳＬＡＭＦ７誘発フラトリサイドを呈し、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＳＬＡＭＦ７誘発フラトリサイドを呈する。
ｃ．抗ＢＣＭＡ抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＢＣＭＡである腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＢＣＭＡ抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、ベランタマブ（例えば、Ｂｌｅｎｒｅｐ）である。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＢＣＭＡである腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＢＣＭＡ抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、多発性骨髄腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、ベランタマブ（例えば、Ｂｌｅｎｒｅｐ）である。
ｇ－ＮＫ細胞及び追加の薬剤は、連続して又は同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与前に投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与され得る。代替的には、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがん型に特異的な抗体が投与される時間とは異なる選択された時間に投与され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＢＣＭＡ抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。一態様では、多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＢＣＭＡ抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体が、ベランタマブであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＢＣＭＡ抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＢＣＭＡ抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＢＣＭＡ抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
特定の例では、対象は、ｇ－ＮＫ細胞の集団の前、後、又は実質的に同時に、有効用量の抗体を投与される。抗体の有効量は、特定の抗体、特定の疾患又は状態（例えば、腫瘍又は他の障害）、対象の全身状態、対象が受けている又は以前に受けた任意の追加の治療、及び他の関連因子を考慮に入れて、熟練した臨床医によって選択され得る。対象は、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞の集団を投与される。抗体及びｇ－ＮＫ細胞の集団の両方は、典型的には、非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、しかしながら、腫瘍又は腫瘍の近くへの注射又は注入（局所投与）又は腹膜腔への投与もまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、サイクリングレジメンで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、２８日周期で投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、各サイクルなどの、少なくとも１サイクルで週１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって、週１回投与される。いくつかの実施形態では、週１回、８回の用量の抗体が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体が、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体が、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、Ｂｌｅｎｒｅｐ）は、２．５ｍｇ／ｋｇ又は約２．５ｍｇ／ｋｇで、３０分又は約３０分にわたって静脈内注入として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、Ｂｌｅｎｒｅｐ）は、３週間に１回投与される。
いくつかの実施形態では、方法が、抗ＢＣＭＡ抗体を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＢＣＭＡ抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。
いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫であり得る。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞が、ＢＣＭＡの低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、例えば、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＢＣＭＡに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＢＣＭＡ発現を低減又は排除するように操作されていない。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＢＣＭＡ誘発フラトリサイドを呈し、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＢＣＭＡ誘発フラトリサイドを呈する。
２．リンパ腫
ａ．抗ＣＤ２０抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ２０である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ２０抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、リツキシマブ（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））である。
ａ．抗ＣＤ２０抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ２０である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ２０抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、リツキシマブ（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））である。
ｇ－ＮＫ細胞及び追加の薬剤は、連続して又は同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与前に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与後に投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与され得る。代替的には、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがん型に特異的な抗体が投与される時間とは異なる選択された時間に投与され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。一態様では、リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブであり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
特定の例では、対象は、ｇ－ＮＫ細胞の集団の前、後、又は実質的に同時に、有効用量の抗体を投与される。抗体の有効量は、特定の抗体、特定の疾患又は状態（例えば、腫瘍又は他の障害）、対象の全身状態、対象が受けている又は以前に受けた任意の追加の治療、及び他の関連因子を考慮に入れて、熟練した臨床医によって選択され得る。対象は、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞の集団を投与される。抗体及びｇ－ＮＫ細胞の集団の両方は、典型的には、非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、しかしながら、腫瘍又は腫瘍の近くへの注射又は注入（局所投与）又は腹膜腔への投与もまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、サイクリングレジメンで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、２８日周期で投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、各サイクルなどの、少なくとも１サイクルで週１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって、週１回投与される。いくつかの実施形態では、週１回、８回の用量の抗体が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、静脈内投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体の各用量が、２５０ｍｇ／ｍ２又は約２５０ｍｇ／ｍ２～約５００ｍｇ／ｍ２であり得る量で投与され得る。いくつかの実施形態では、各用量は、３７５ｍｇ／ｍ２又は約３７５ｍｇ／ｍ２で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体が、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ２０抗体組成物で投与され得る。例えば、抗体は、リツキシマブ及び組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０を含む抗ＣＤ２０抗体組成物として投与され得る。そのような組成物の例示的な例は、公開されたＰＣＴ刊行物、国際公開第２０１１／０２９８９２号に説明される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２３，４００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１６００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２６，８００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体組成物が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、４又は８回の用量として投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０抗体の週１回の静脈内投与に続いて、３又は７回の用量で皮下投与される。いくつかの実施形態では、方法が、抗ＣＤ２０抗体を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。
ｂ．抗ＣＤ１９抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ１９である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ１９抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、タファシタマブ（例えば、ＭＯＮＪＵＶＩ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、抗体は、ロンカスツキシマブ（例えば、ＺＹＮＬＯＮＴＡ（登録商標））である。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ１９である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ１９抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、タファシタマブ（例えば、ＭＯＮＪＵＶＩ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、抗体は、ロンカスツキシマブ（例えば、ＺＹＮＬＯＮＴＡ（登録商標））である。
ｇ－ＮＫ細胞及び追加の薬剤は、連続して又は同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与前に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与後に投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与され得る。代替的には、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがん型に特異的な抗体が投与される時間とは異なる選択された時間に投与され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ１９抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。一態様では、リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、抗ＣＤ１９抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ１９は、タファシタマブであり得る。他の実施形態では、ＣＤ１９抗体は、ロンカスツキシマブであり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ１９抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ１９抗体が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ１９抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
１つの特定の例では、対象は、ｇ－ＮＫ細胞の集団の前、後、又は実質的に同時に、有効用量の抗体を投与される。抗体の有効量は、特定の抗体、特定の疾患又は状態（例えば、腫瘍又は他の障害）、対象の全身状態、対象が受けている又は以前に受けた任意の追加の治療、及び他の関連因子を考慮に入れて、熟練した臨床医によって選択され得る。対象は、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞の集団を投与される。抗体及びｇ－ＮＫ細胞の集団の両方は、典型的には、非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、しかしながら、腫瘍又は腫瘍の近くへの注射又は注入（局所投与）又は腹膜腔への投与もまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、サイクリングレジメンで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、２８日周期で投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、各サイクルなどの、少なくとも１サイクルで週１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって、週１回投与される。いくつかの実施形態では、週１回、８回の用量の抗体が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体が、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体が、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ）は、１２ｍｇ／ｋｇ又は約１２ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ）は、４サイクルにわたって投与される。いくつかの実施形態では、第１のサイクルは、２８日周期の１、４、８、１５、及び２２日目の投与を含む。いくつかの実施形態では、第２及び第３のサイクルは、２８日周期の１、８、１５、及び２２日目の投与を含む。いくつかの実施形態では、第４のサイクル以降は、２８日周期の１及び１５日目の投与を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、タファシタマブ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２サイクルにわたって投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、ロンカスツキシマブ）は、２サイクルにわたって３週間毎に０．１５ｍｇ／ｋｇ又は約０．１５ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、ロンカスツキシマブ）は、その後のサイクルにわたって３週間毎に０．０７５ｍｇ／ｋｇ又は約０．０７５ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、抗ＣＤ１９抗体（例えば、ロンカスツキシマブ）の投与前に投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体組成物が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、４又は８回の用量として投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体の週１回の静脈内投与に続いて、３又は７回の用量で皮下投与される。いくつかの実施形態では、方法が、抗ＣＤ１９抗体を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ１９抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。
例示的な例は、国際公開第２０２０／２４９５２８（Ａ１）号及び米国特許第８，５２４，８６７号に説明されている。
ｃ．抗ＣＤ３０抗体
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ３０である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ３０抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、ブレンツキシマブ（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））である。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ＣＤ３０である腫瘍関連抗原を認識する抗体とともに投与することによって腫瘍に標的化され得る。いくつかの実施形態では、方法は、対象に抗ＣＤ３０抗体を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、抗体は、ブレンツキシマブ（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））である。
ｇ－ＮＫ細胞及び追加の薬剤は、連続して又は同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与前に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ｇ－ＮＫ細胞の投与後に投与され得る。例えば、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与され得る。代替的には、ｇ－ＮＫ細胞は、選択されたがん型に特異的な抗体が投与される時間とは異なる選択された時間に投与され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３０抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている。一態様では、リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され得、対象が、抗ＣＤ３０抗体の前投与を受けている、方法もまた、本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３０抗体は、ブレンツキシマブであり得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始され得る。
１つの特定の例では、対象は、ｇ－ＮＫ細胞の集団の前、後、又は実質的に同時に、有効用量の抗体を投与される。抗体の有効量は、特定の抗体、特定の疾患又は状態（例えば、腫瘍又は他の障害）、対象の全身状態、対象が受けている又は以前に受けた任意の追加の治療、及び他の関連因子を考慮に入れて、熟練した臨床医によって選択され得る。対象は、本明細書に説明されるｇ－ＮＫ細胞の集団を投与される。抗体及びｇ－ＮＫ細胞の集団の両方は、典型的には、非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、しかしながら、腫瘍又は腫瘍の近くへの注射又は注入（局所投与）又は腹膜腔への投与もまた、使用され得る。当業者は、適切な投与経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は、サイクリングレジメンで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、２８日周期で投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、各サイクルなどの、少なくとも１サイクルで週１回投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間、２０週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間以上にわたって、週１回投与される。いくつかの実施形態では、週１回、８回の用量の抗体が投与される。いくつかの実施形態では、週１回の用量は、連続した週で投与される。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体が、静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体が、皮下投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）は、１．８ｍｇ／ｋｇ又は約１．８ｍｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ）は、最大１８０ｍｇまで投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０（例えば、ブレンツキシマブ）は、３週間毎に投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体組成物が、週１回の用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３０抗体は、４又は８回の用量として投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ３０抗体の週１回の静脈内投与に続いて、３又は７回の用量で皮下投与される。いくつかの実施形態では、方法が、抗ＣＤ３０抗体を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ３０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与され得る。
例示的な例は、米国特許第７，６５９，２４１号に説明されている。
３．二重特異性抗体（Bi-Specific Antibody、ＢｓＡｂ）
本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）と組み合わせて個体に投与され得る。ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原又はエピトープを認識して結合するように設計される。ＢｓＡｂの例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T cell engager、ＢｉＴＥ）及び二重特異性ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（bispecific Natural Killer cell engager、ＢｉＫＥ）である。ＢｉＫＥは、ナチュラルキラー細胞上のＣＤ１６と第２の腫瘍抗原とを結合するように生成されており、ＣＤ１６及び第２の腫瘍抗原を標的化するＢｉＫＥの様々な例が文献に説明されている（Ｆｅｌｉｃｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１４４１：３３３－３４６）。例えば、ＢｉＫＥは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫において、ＣＤ１９又はＣＤ２０を伴うＣＤ１６のために（Ｇｌｏｒｉｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２７：１９０－２０１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９：１３７－１４４，Ｐｏｒｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ６１：１８６９－１８７５）、混合形質性白血病に対して、ＣＤ１９又はＣＤ３３を伴うＣＤ１６のために（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＭＡｂｓ，３：２１－３０）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫に対して、ＣＤ１９／ＣＤ２２を伴うＣＤ１６のために（Ｇｌｅａｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１１：２６７４－２６８４）、ホジキンリンパ腫に対して、ＣＤ３０を伴うＣＤ１６のために（Ｈｏｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５５：８３０－８３６）、及び多発性骨髄腫に対して、ＢＣＭＡを伴うＣＤ１６のために（Ｋａｋｉｕｃｈｉ－Ｋｉｙｏｔａ，ｅｔ ａｌ．（２０２２），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，３６：１００６－１０１４）、開発されている。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）と組み合わせて個体に投与され得る。ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原又はエピトープを認識して結合するように設計される。ＢｓＡｂの例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T cell engager、ＢｉＴＥ）及び二重特異性ナチュラルキラー細胞エンゲージャー（bispecific Natural Killer cell engager、ＢｉＫＥ）である。ＢｉＫＥは、ナチュラルキラー細胞上のＣＤ１６と第２の腫瘍抗原とを結合するように生成されており、ＣＤ１６及び第２の腫瘍抗原を標的化するＢｉＫＥの様々な例が文献に説明されている（Ｆｅｌｉｃｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１４４１：３３３－３４６）。例えば、ＢｉＫＥは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫において、ＣＤ１９又はＣＤ２０を伴うＣＤ１６のために（Ｇｌｏｒｉｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２７：１９０－２０１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９：１３７－１４４，Ｐｏｒｔｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ６１：１８６９－１８７５）、混合形質性白血病に対して、ＣＤ１９又はＣＤ３３を伴うＣＤ１６のために（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＭＡｂｓ，３：２１－３０）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫に対して、ＣＤ１９／ＣＤ２２を伴うＣＤ１６のために（Ｇｌｅａｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１１：２６７４－２６８４）、ホジキンリンパ腫に対して、ＣＤ３０を伴うＣＤ１６のために（Ｈｏｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５５：８３０－８３６）、及び多発性骨髄腫に対して、ＢＣＭＡを伴うＣＤ１６のために（Ｋａｋｉｕｃｈｉ－Ｋｉｙｏｔａ，ｅｔ ａｌ．（２０２２），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，３６：１００６－１０１４）、開発されている。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンハンサーである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性ＮＫ細胞エンハンサーである。いくつかの実施形態では、二重特異性ＮＫ細胞エンハンサー（bispecific NK cell enhancer、ＢｉＫＥ）の第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、腫瘍抗原に対するものである。いくつかの実施形態では、ＢｉＫＥの第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、ＣＤ１９である。いくつかの実施形態では、ＢｉＫＥの第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、ＣＤ２０である。いくつかの実施形態では、ＢｉＫＥの第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、ＣＤ３０である。いくつかの実施形態では、ＢｉＫＥの第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、ＣＤ３８である。いくつかの実施形態では、ＢｉＫＥの第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、ＳＬＡＭＦ７である。いくつかの実施形態では、ＢｉＫＥの第１の腫瘍標的は、ＣＤ１６であり、ＢｉＫＥの第２の腫瘍標的は、ＢＣＭＡである。
４．サイトカイン又は成長因子
本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、サイトカイン及び／又は成長因子と組み合わせて個体に投与され得る。いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの成長因子は、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７からなる群から選択される成長因子を含む。特定の実施形態では、組換えＩＬ－２が、対象に投与される。他の特定の実施形態では、組換えＩＬ－１５が、対象に投与される。他の特定の実施形態では、組換えＩＬ－２１が、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞、及びサイトカイン又は成長因子が、連続的に投与される。例えば、ｇ－ＮＫ細胞が最初に投与され、サイトカイン及び／又は成長因子の投与に続く。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、サイトカイン又は成長因子と同時に投与される。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、サイトカイン及び／又は成長因子と組み合わせて個体に投与され得る。いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの成長因子は、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７からなる群から選択される成長因子を含む。特定の実施形態では、組換えＩＬ－２が、対象に投与される。他の特定の実施形態では、組換えＩＬ－１５が、対象に投与される。他の特定の実施形態では、組換えＩＬ－２１が、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞、及びサイトカイン又は成長因子が、連続的に投与される。例えば、ｇ－ＮＫ細胞が最初に投与され、サイトカイン及び／又は成長因子の投与に続く。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、サイトカイン又は成長因子と同時に投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＫ細胞の生存及び／又は成長を支持するために、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、及び／又はＩＬ－１２など）を投与される。サイトカインは、ＮＫ細胞の前、後、又は実質的に同時に投与され得る。いくつかの例では、サイトカインは、ＮＫ細胞の後に投与され得る。１つの具体例では、サイトカインは、ＮＫ細胞の投与の約１～８時間以内（約１～４時間、約２～６時間、約４～６時間、又は約５～８時間以内など）に対象に投与される。
５．リンパ球除去療法
いくつかの実施形態では、提供される方法はまた、ｇ－ＮＫ細胞を、化学療法剤若しくは細胞傷害剤又は他の治療などの、別の治療とともに投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、提供される方法はまた、ｇ－ＮＫ細胞を、化学療法剤若しくは細胞傷害剤又は他の治療などの、別の治療とともに投与することを含み得る。
いくつかの態様では、提供される方法は、例えば、ｇ－ＮＫ細胞組成物の投与の開始前又は開始と同時に、１つ以上のリンパ球除去療法を投与することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法は、シクロホスファミドなどのホスファミドの投与を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法は、フルダラビンの投与を含み得る。
いくつかの態様では、対象を免疫除去（例えば、リンパ球除去）療法でプレコンディショニングすることは、養子細胞療法（adoptive cell therapy、ＡＣＴ）の効果を改善し得る。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法は、シクロスポリン及びフルダラビンの組み合わせを含む。
そのようなプレコンディショニングは、治療の有効性を弱め得る様々な転帰のうちの１つ以上のリスクを低減する目的で実施され得る。これらは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－１５などの恒常性及び活性化サイトカインについてＴＩＬと競合する「サイトカインシンク」として知られる現象、制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は免疫系の他の細胞によるＴＩＬの抑制、腫瘍微小環境における負の制御因子の影響を含む。Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；３（１２）：６６８－６８１（２００６）。
したがって、いくつかの実施形態では、提供される方法は、対象にリンパ球除去療法を投与することを更に伴う。いくつかの実施形態では、方法は、ある用量の細胞の投与前に対象にリンパ球除去療法を投与することを伴う。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法は、フルダラビン及び／又はシクロホスファミドなどの化学療法剤を含有する。いくつかの実施形態では、細胞の投与及び／又はリンパ球除去療法は、外来患者送達を介して実施される。
いくつかの実施形態では、方法は、ある用量の細胞の投与前に、シクロホスファミド、フルダラビン、又はそれらの組み合わせなどの、リンパ球除去剤又は化学療法剤などの、プレコンディショニング剤を対象に投与することを含む。例えば、対象は、第１の用量又は後続の用量の少なくとも２日前、例えば、少なくとも３、４、５、６、又は７日前に、シクロホスファミド、フルダラビン、又はそれらの組み合わせなどの、リンパ球除去剤又は化学療法剤などの、プレコンディショニング剤を投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、ある用量の細胞の投与の７日前以内、例えば、６、５、４、３、又は２日前以内に、シクロホスファミド、フルダラビン、又はそれらの組み合わせなどの、リンパ球除去剤又は化学療法剤などの、プレコンディショニング剤を投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ある用量の細胞の投与の１４日前以内、例えば、１３、１２、１１、１０、９、又は８日前以内に、シクロホスファミド、フルダラビン、又はそれらの組み合わせなどの、リンパ球除去剤又は化学療法剤などの、プレコンディショニング剤を投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、２０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又は約２０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、４０ｍｇ／ｋｇ～８０ｍｇ／ｋｇ又は約４０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇの用量のシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの態様では、対象は、６０ｍｇ／ｋｇ又は約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、単回用量で投与され得るか、又は毎日、１日置き、若しくは３日毎などの複数回用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、１日１回、１日又は２日間投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤がフルダラビンを含む場合、対象が、フルダラビンを１ｍｇ／ｍ２～１００ｍｇ／ｍ２、若しくは約１ｍｇ／ｍ２～約１００ｍｇ／ｍ２、例えば、１０ｍｇ／ｍ２～７５ｍｇ／ｍ２、若しくは約１０ｍｇ／ｍ２～約７５ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２～５０ｍｇ／ｍ２、若しくは約１５ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２～３０ｍｇ／ｍ２、若しくは約２０ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、又は２４ｍｇ／ｍ２～２６ｍｇ／ｍ２、若しくは約２４ｍｇ／ｍ２～約２６ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。いくつかの事例では、対象は、２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンを投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、単回用量で投与され得るか、又は毎日、１日置き、若しくは３日毎などの複数回用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、毎日、例えば、１～５日間、例えば、３～５日間投与される。
いくつかの実施形態では、リンパ球除去剤は、シクロホスファミド及びフルダラビンの組み合わせなどの、薬剤の組み合わせを含む。したがって、薬剤の組み合わせは、上記に説明されるものなどの任意の用量又は投与スケジュールのシクロホスファミドと、上記に説明されるものなどの任意の用量又は投与スケジュールのフルダラビンとを含み得る。例えば、いくつかの態様では、対象が、細胞の投与前に、６０ｍｇ／ｋｇ（約２ｇ／ｍ２）のシクロホスファミドと、３～５回の用量の２５ｍｇ／ｍ２フルダラビンとを投与される。
いくつかの実施形態では、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与前に、対象は、リンパ球除去療法を受けている。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法が、フルダラビン及び／又はシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球除去が、２～４日間、毎日、２０～４０ｍｇ／ｍ２若しくは約２０～４０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３０ｍｇ／ｍ２若しくは約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン、及び／又は２～４日間、毎日、２００～４００ｍｇ／ｍ２若しくは約２００～４００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３００ｍｇ／ｍ２若しくは約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドの投与を含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法が、毎日、３０ｍｇ／２又は約３０ｍｇ／２（対象の体表面積）のフルダラビンと、毎日、３００ｍｇ／ｍ２又は約３００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のシクロホスファミドとの各々２～４日間、任意選択的に、３日間の投与を含む。
いくつかの実施形態では、ある用量の細胞の注入前のプレコンディショニング剤の投与は、治療の転帰を改善する。例えば、いくつかの態様では、シクロホスファミド、フルダラビン、又はそれらの組み合わせなどの、リンパ球除去剤又は化学療法剤、プレコンディショニングは、用量による治療の有効性を改善するか、又は対象におけるＮＫ細胞の持続性を増加させる。いくつかの実施形態では、プレコンディショニング治療は、生存し、かつ細胞の投与後の所与の期間後に最小限の残存又は分子的に検出可能な疾患を呈さない対象のパーセントなどの、無病生存期間を増加させる。いくつかの実施形態では、無病生存期間中央値までの時間が増加する。
細胞が対象（例えば、ヒト）に投与されると、いくつかの態様における操作された細胞集団の生物学的活性は、いくつかの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するためのパラメータとしては、例えば、イメージングによる、インビボにおける、又は、例えば、ＥＬＩＳＡ若しくはフローサイトメトリーによる、エクスビボにおける、抗原への、操作されたか、又は天然のＴ細胞又は他の免疫細胞の特異的結合を含む。ある特定の実施形態では、標的細胞を破壊するＮＫ細胞の能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９－７０２（２００９）、及びＨｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５－４０（２００４）に説明されている細胞傷害アッセイなどの、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して測定され得る。ある特定の実施形態では、細胞の生物学的活性はまた、特定のサイトカイン又はＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、及びＴＮＦなどの他のエフェクター分子の発現及び／又は分泌をアッセイすることによって測定され得る。いくつかの態様では、生物学的活性は、腫瘍量又は腫瘍負荷の低減などの、臨床転帰を評価することによって測定される。いくつかの態様では、毒性転帰、細胞の持続及び／若しくは拡大、並びに／又は宿主免疫応答の存在若しくは非存在が評価される。
ＩＩＩ．ナチュラルキラー細胞サブセットを拡大させるための方法
いくつかの実施形態では、提供される方法で使用するためのｇ－ＮＫ細胞組成物は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＮＫ細胞のサブセットからエクスビボで拡大される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物を拡大及び産生するための方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＦｃＲγ欠損ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）である細胞のサブセットを拡大させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＮＫＧ２ＣｐｏｓであるＮＫ細胞のサブセットを拡大させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＮＫＧ２ＡｎｅｇであるＮＫ細胞のサブセットを拡大させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからナチュラルキラー（ＮＫ）細胞について濃縮された細胞の集団を単離することと、ｇ－ＮＫ細胞対象及び／又はｇ－ＮＫ細胞サブセットと重複するか、若しくは細胞外表面マーカーを共有するＮＫ細胞サブセットの優先的な成長及び／又は拡大の条件下で細胞を培養することと、を含む。例えば、ＮＫ細胞は、フィーダー細胞を使用して、又はサイトカインの存在下で培養されて、ｇ－ＮＫ細胞対象及び／又はｇ－ＮＫ細胞サブセットと重複するか、若しくは細胞外表面マーカーを共有するＮＫ細胞サブセットの成長及び／又は拡大を増強し得る。いくつかの態様では、提供される方法はまた、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ及び／又はＮＫＧ２Ａｎｅｇである任意のＮＫ細胞などの、ＮＫ細胞の他のサブセットを拡大させ得る。
いくつかの実施形態では、提供される方法で使用するためのｇ－ＮＫ細胞組成物は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＮＫ細胞のサブセットからエクスビボで拡大される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞組成物を拡大及び産生するための方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＦｃＲγ欠損ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）である細胞のサブセットを拡大させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＮＫＧ２ＣｐｏｓであるＮＫ細胞のサブセットを拡大させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからのＮＫＧ２ＡｎｅｇであるＮＫ細胞のサブセットを拡大させることを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、ヒト対象由来の生体サンプルからナチュラルキラー（ＮＫ）細胞について濃縮された細胞の集団を単離することと、ｇ－ＮＫ細胞対象及び／又はｇ－ＮＫ細胞サブセットと重複するか、若しくは細胞外表面マーカーを共有するＮＫ細胞サブセットの優先的な成長及び／又は拡大の条件下で細胞を培養することと、を含む。例えば、ＮＫ細胞は、フィーダー細胞を使用して、又はサイトカインの存在下で培養されて、ｇ－ＮＫ細胞対象及び／又はｇ－ＮＫ細胞サブセットと重複するか、若しくは細胞外表面マーカーを共有するＮＫ細胞サブセットの成長及び／又は拡大を増強し得る。いくつかの態様では、提供される方法はまた、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ及び／又はＮＫＧ２Ａｎｅｇである任意のＮＫ細胞などの、ＮＫ細胞の他のサブセットを拡大させ得る。
いくつかの実施形態では、サンプル、例えば、生体サンプルは、ＮＫ細胞集団を含む複数の細胞集団を含有するものである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、血液細胞、例えば、末梢血単核細胞であるか、又はそれを含む。いくつかの態様では、生体サンプルは、全血サンプル、アフェレーシス産物又は白血球アフェレーシス産物である。いくつかの実施形態では、サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルである。したがって、提供される方法のいくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団が得られ得る。ＮＫ細胞集団を含む複数の細胞集団を含有するサンプルは、提供される方法による拡大のためにＮＫ細胞サブセットを濃縮又は選択するための細胞として使用され得る。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、健常対象である対象に由来する。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、疾患又は状態、例えば、がんを有する対象に由来する。
いくつかの実施形態では、細胞は、生体サンプルなどのサンプル、例えば、特定の疾患若しくは状態を有する対象、又は細胞療法を必要とする対象、又は細胞療法が投与されることになる対象から得られるか、又はその対象に由来するサンプルから単離又は選択される。いくつかの態様では、対象は、細胞が単離され、処理され、及び／又は操作される養子細胞療法などの、特定の治療的介入を必要とする患者である対象などの、ヒトである。したがって、いくつかの実施形態における細胞は、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。サンプルとしては、対象から直接採取された組織、体液、及び他のサンプルが挙げられる。生体サンプルは、生体供給源から直接得られたサンプル又は処理されるサンプルであり得る。生体サンプルとしては、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、及び汗などの体液、組織及び器官サンプルであって、それらに由来する処理されたサンプルを含む、組織及び器官サンプルが挙げられる。いくつかの態様では、サンプルは、血液若しくは血液由来サンプルであるか、又はアフェレーシス若しくは白血球アフェレーシス産物であるか、若しくはそれに由来する。
いくつかの例では、対象の循環血液由来の細胞が得られる。サンプルは、いくつかの態様では、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び／又は血小板を含むリンパ球を含有し、いくつかの態様では、赤血球及び血小板以外の細胞を含有する。いくつかの実施形態では、対象から収集された血液細胞が洗浄されて、血漿画分を除去し、後続の処理工程に適切な緩衝液又は培地中に細胞を配置する。いくつかの実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）で細胞を洗浄する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、カルシウム及び／若しくはマグネシウム、並びに／又は多くの若しくは全ての二価カチオンを欠く。ある特定の実施形態では、血液細胞サンプルの成分が除去され、細胞が培養培地中に直接再懸濁される。いくつかの実施形態では、方法は、赤血球を溶解すること、及びＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度遠心分離を使用することによるなどのＰｅｒｃｏｌｌ又はＦｉｃｏｌｌ勾配による遠心分離による、末梢血からの白血球の調製などの、密度ベースの細胞分離方法を含む。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、正常な末梢血から収集された濃縮された白血球除去産物に由来する。いくつかの実施形態において、濃縮された白血球除去産物は、新鮮な細胞を含有し得る。いくつかの実施形態では、濃縮された白血球除去産物は、提供される方法における使用のために解凍される凍結保存されたサンプルである。
いくつかの実施形態では、生体細胞の供給源は、５×１０５個又は約５×１０５個～５×１０８個又は約５×１０８個のＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞サブセット、又はｇ－ＮＫ細胞の代理マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットを含有する。いくつかの実施形態では、生体サンプル中の、ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞サブセット、又はｇ－ＮＫ細胞に対する代理マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットの数は、５×１０５個若しくは約５×１０５個～１×１０８個若しくは約１×１０８個、５×１０５個若しくは約５×１０５個～５×１０７個若しくは約５×１０７個、５×１０５個若しくは約５×１０５個～１×１０７個若しくは約１×１０７個、５×１０５個若しくは約５×１０５個～５×１０６個若しくは約５×１０６個、５×１０５個若しくは約５×１０５個～１×１０６個若しくは約１×１０６個、１×１０６個若しくは約１×１０６個～１×１０８個若しくは約１×１０８個、１×１０６個若しくは約１×１０６個～５×１０７個若しくは約５×１０７個、１×１０６個若しくは約１×１０６個～１×１０７個若しくは約１×１０７個、１×１０６個若しくは約１×１０６個～５×１０６個若しくは約５×１０６個、５×１０６個若しくは約５×１０６個～１×１０８個若しくは約１×１０８個、５×１０６個若しくは約５×１０６個～５×１０７個若しくは約５×１０７個、５×１０６個若しくは約５×１０６個～１×１０７個若しくは約１×１０７個～１×１０８個若しくは約１×１０８個、１×１０７個若しくは約１×１０７個～５×１０７個若しくは約５×１０７個、又は５×１０７若しくは約５×１０７個～１×１０８個若しくは約１×１０８個である。
いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、３％超又は約３％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、５％超又は約５％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１０％超又は約１０％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１２％超又は約１２％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１４％超又は約１４％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１６％超又は約１６％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１８％超又は約１８％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２０％超又は約２０％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２２％超又は約２２％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２４％超又は約２４％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２６％超又は約２６％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２８％超又は約２８％超である。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、３０％超又は約３０％超である。
いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、３％超又は約３％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、５％超又は約５％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１０％超又は約１０％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１２％超又は約１２％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１４％超又は約１４％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１６％超又は約１６％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、１８％超又は約１８％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２０％超又は約２０％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２２％超又は約２２％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２４％超又は約２４％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２６％超又は約２６％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、２８％超又は約２８％超である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、生体サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞、又はｇ－ＮＫ細胞の代替マーカーと関連付けられるか、若しくはそれを含むＮＫ細胞サブセットのパーセンテージは、３０％超又は約３０％超である場合に選択される。
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、ＣＭＶ血清陽性である対象に由来する。ＣＭＶ感染は、増強された抗ウイルス活性を呈するＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞の高い画分の発生を含む、ＮＫ細胞の表現型及び機能的分化を結果的にもたらし得る。ＮＫＧ２Ｃを発現するＣＭＶ関連ＮＫ細胞は、変化したＤＮＡメチル化パターン及びＦｃＲγなどのシグナル伝達分子の低減された発現を示す（Ｓｃｈｌｕｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１５）４２：４４３－５６）。これらのＮＫ細胞は、従来のＮＫ細胞サブセットと比較して、より強力な抗体依存性活性化、拡大、及び機能に関連している。いくつかの場合、ＦｃＲγの低減された発現を有するＮＫ細胞が、一般的にはより低いレベルであるが、ＣＭＶ血清陰性個体においても検出され得るため、生体サンプルは、ＣＭＶ血清陰性である対象由来であり得る。いくつかの場合、生体サンプルは、ＣＭＶ血清陽性個体由来であり得る。
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＫＧ２Ｃについて陽性である末梢血サンプル中のＮＫ細胞のパーセンテージに基づいて選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも２０％又は少なくとも約２０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも２５％又は少なくとも約２５％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも３０％又は少なくとも約３０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも３５％又は少なくとも約３５％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも４０％又は少なくとも約４０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも４５％又は少なくとも約４５％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも５０％又は少なくとも約５０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも５５％又は少なくとも約５５％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも６０％又は少なくとも約６０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性である場合に選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＫＧ２Ａについて陰性であるか又は低い末梢血サンプル中のＮＫ細胞のパーセンテージに基づいて選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７０％又は約７０％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７５％又は約７５％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも８０％又は約８０％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも８５％又は約８５％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも９０％又は約９０％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性である末梢血サンプル中のＮＫ細胞のパーセンテージと、ＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い末梢血サンプル中のＮＫ細胞のパーセンテージとの両方に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも２０％又は約２０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７０％又は約７０％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも３０％又は約３０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７５％又は約７５％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも４０％又は約４０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも８０％又は約８０％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも５０％又は約５０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも８５％又は約８５％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも６０％又は約６０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも９０％又は約９０％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。いくつかの実施形態では、対象は、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも６０％又は約６０％がＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも９５％又は約９５％がＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い場合に選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、対象がＣＭＶ血清陽性である場合、及び対象由来の末梢血サンプル中のＮＫ細胞のうち、ｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージが３０％超又は約３０％超であり、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞のパーセンテージが２０％超又は約２０％超であり、かつＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞のパーセンテージが７０％超又は約７０％超である場合、提供される方法による細胞の拡大のために選択される。
いくつかの実施形態では、対象由来のＮＫ細胞は、ＣＤ１６遺伝子のヌクレオチド５２６［チミジン（thymidine、Ｔ）→グアニン（guanine、Ｇ）］に一塩基多型（ＳＮＰ ｒｓ３９６９９１）を有し、その結果、成熟（処理された）型タンパク質（Ｆ１５８Ｖ）において１５８位のフェニルアラニン（phenylalanine、Ｆ）に対するバリン（valine、Ｖ）のアミノ酸（amino acid、ａａ）置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、両方の対立遺伝子にＣＤ１６ １５８ Ｖ多型（本明細書では１５８Ｖ／Ｖと呼ばれる）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、単一対立遺伝子にＣＤ１６ １５８ Ｖ多型（本明細書では１５８Ｖ／Ｆと呼ばれる）を有する。本明細書における１５８Ｖ＋遺伝子型への言及は、１５８Ｖ／Ｖ遺伝子型及び１５８Ｖ／Ｆ遺伝子型の両方を指すことが理解される。ＣＤ１６ Ｆ１５８Ｖ多型は、ＩｇＧ１抗体に対する実質的により高い親和性と関連付けられ、より堅牢なＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ応答を開始する能力を有することが見出されている（Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６：１、Ｍｕｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６：１７８９－１７９６、及びＨａｔｊｉｈａｒｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：２５６１－２５６４）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ １５８Ｖ＋／ｇ－ＮＫ細胞の抗体指向性標的化は、ＣＤ１６ １５８Ｖ＋／ｇ－ＮＫ細胞サブセットの改善された親和性、細胞傷害及び／又はサイトカイン媒介性効果機能に起因して、患者に対する改善された転帰につながる。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、ＣＤ１６ １５８Ｖ＋ＮＫ細胞遺伝子型を有すると同定された対象の生体サンプルから、ＮＫ細胞又はそのサブセットを濃縮又は単離することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ１６ １５８Ｖ＋ＮＫ細胞遺伝子型の存在について対象をスクリーニングすることを含む。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、血液サンプル又は骨髄サンプルなどの、ＮＫ細胞であるか又はＮＫ細胞を含む対象由来のサンプルから抽出される。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液細胞、例えば、末梢血単核細胞であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、単離されたＮＫ細胞であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、健常ドナー対象からのサンプルである。サンプルからＤＮＡを抽出するための任意の方法を用いられ得る。例えば、核酸は、グアニジンチオシアネート－フェノール－クロロホルム抽出などの標準技術を使用して、サンプル、例えば、細胞から容易に単離され得る（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６）。ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの市販のキットもまた、ゲノムＤＮＡを抽出するために容易に利用可能である。
遺伝子型決定は、任意の好適なサンプルに対して実施され得る。本明細書に説明される実施形態のうちのいずれかでは、遺伝子型決定反応は、例えば、パイロシーケンシング反応、ＤＮＡシーケンシング反応ＭａｓｓＡＲＲＡＹ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、ＲＦＬＰ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、リアルタイム対立遺伝子識別、又はマイクロアレイであり得る。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲなどのＰＣＲベースの技術は、多型に対する対立遺伝子特異的プライマーを使用して実施される。サンプル中の標的核酸配列を増幅するためのＰＣＲ法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９９０）、Ｔａｙｌｏｒ（１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３、並びに米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，８８９，８１８号に説明されており、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１５８Ｖ＋多型を検出するためのプライマーは、公知であるか、又は当業者によって容易に設計され得、例えば、国際公開されたＰＣＴ出願、国際公開第２０１２／０６１８１４号、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ，１０８：２７２０－２７２５、Ｃａｒｔｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ，９９：７５４－７５８、Ｋｏｅｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ，９０：１１０９－１１１４、Ｈａｔｉｊｉｈａｒｉｓｓｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ，１１０：２５６１－２５６４、Ｓｏｍｂｏｏｎｙｏｓｄｅｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｓｉａｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：８８３－８８９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲが、ネステッドプライマーを使用して実施され、その後、対立遺伝子特異的制限酵素消化が実施され得る。いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲプライマーは、５’－ＡＴＡ ＴＴＴ ＡＣＡ ＧＡＡ ＴＧＧ ＣＡＣ ＡＧＧ－３’（配列番号２）及び５’－ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＣＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＡＡ－３’（配列番号３）を含むが、一方で、第２のＰＣＲプライマーは、５’－ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＡＴ－３’（配列番号４）及び５’－ＡＣＧ ＴＧＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＴＣ ＡＣ－３’（配列番号５）であり、これは、いくつかの場合、対立遺伝子の性質に依存して９４ｂｐのフラグメントを生成する。いくつかの実施形態では、プライマー対は、配列番号６（ＣＣＣＡＡＣＴＣＡＡ ＣＴＴＣＣＣＡＧＴＧ ＴＧＡＴ）及び配列番号７（ＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣ ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡ ＡＴＡＧＧＧＣＡＡＴ）に記載される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー対は、配列番号６（ＣＣＣＡＡＣＴＣＡＡ ＣＴＴＣＣＣＡＧＴＧ ＴＧＡＴ）及び配列番号８（ＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣ ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡ ＡＴＡＧＧＧＣＡＡ）に記載される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー対は、配列番号６（ＣＣＣＡＡＣＴＣＡＡ ＣＴＴＣＣＣＡＧＴＧ ＴＧＡＴ）及び配列番号９（ＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣ ＴＴＴＴＣＣＴＣＴＡ ＡＴＡＧＧＧＣＡ）に記載される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子型決定は、配列番号１０に記載されるＣＤ１６センス（５’－ＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣ－３’）、及び配列番号１１に記載されるアンチセンス（５’－ＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧ－３’）、及び配列番号１２に記載されるＴａｑＭａｎプローブ（（５’－ＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＴＴＴＧＧ－３’）のプライマー配列を使用して、ＲＮＡの抽出後の定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって実施され得る。
遺伝子型決定を確認するために、対立遺伝子特異的増幅が、Ｖ対立遺伝子特異的プライマーのセット（例えば、配列番号１３に記載されるフォワードプライマー、５’－ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＡＡ－３’、及び配列番号１４に記載されるリバースプライマー、５’－ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＧＡ Ｃ－３’）、又はＦ対立遺伝子特異的プライマーのセット（例えば、配列番号１５に記載されるフォワードプライマー、５’－ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＣＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＡＣ－３’、及び配列番号１４に記載されるリバースプライマー、５’－ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＡＡ ＡＧＡ Ｃ－３’）とともに使用され得る。
ＣＤ１６ａのゲノム配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてＮＧ＿００９０６６．１で入手可能である。ＣＤ１６Ａの遺伝子ＩＤは、２２１４である。遺伝子多型を含むＣＤ１６の配列情報は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７で入手可能である。ＣＤ１６（Ｆ１５８）の配列は、配列番号１６に記載されている（残基Ｆ１５８は、太字で下線付きである）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６（Ｆ１５８）は、ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡ（配列番号１７）として記載されるシグナルペプチドを更に含む。
ＣＤ１６ １５８Ｖ＋の配列（Ｆ１５８Ｖを結果的にもたらす多型）は、ＶＡＲ＿００３９６０として公知であり、配列番号１８に記載される配列を有する（１５８Ｖ＋多型は、太字及び下線付きである）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６（１５８Ｖ＋）は、ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡ（配列番号１７）として記載されるシグナルペプチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、特異的一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）標的を検出するために、５’末端に蛍光色素標識（例えば、ＦＡＭ又はＶＩＣ）と、３’末端にマイナーグルーブバインダー（minor groove binder、ＭＧＢ）及び非蛍光クエンチャー（nonfluorescent quencher、ＮＦＱ）を含有する対立遺伝子特異的プローブと、非標識ＰＣＲプライマーとを使用して、ゲノムデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）サンプルに対してＳＮＰ分析が用いられる。いくつかの実施形態では、アッセイは、プローブと会合した色素の蛍光の変化によって、ＳＮＰの存在を測定又は検出する。そのような実施形態では、プローブは、２つの非標識プライマー間で標的ＤＮＡにハイブリダイズし、５’末端上の蛍光色素からのシグナルは、蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）によって、その３’末端上のＮＦＱによってクエンチされる。ＰＣＲの間、Ｔａｑポリメラーゼは、ガイドとして鋳型を使用して非標識プライマーを伸長し、ポリメラーゼが標識プローブに到達したとき、それは、クエンチャーから色素を分離する分子を切断する。いくつかの態様では、ｑＰＣＲ機器は、クエンチされていない標識からの蛍光を検出し得る。例示的な試薬は、市販のＳＮＰアッセイ、例えば、ｒｓ３９６９９１に対するコードＣ＿２５８１５６６６＿１０である（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＤ１６におけるＦ１５８ＶのＳＮＰ遺伝子型決定に関するカタログ番号４３５１３７９）。
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ １５８Ｖ（Ｆ１５８Ｖ）多型についてヘテロ接合性又はホモ接合性の対象が同定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ １５８Ｖ（Ｆ１５８Ｖ）多型についてホモ接合性の対象が同定される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞サブセットは、ＣＤ１６ １５８Ｖ多型についてヘテロ接合性又はホモ接合性であると同定された対象由来の生体サンプルから単離又は濃縮される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞又はＮＫ細胞サブセットは、ＣＤ１６ １５８Ｖ多型についてホモ接合性であると同定された対象由来の生体サンプルから単離又は濃縮される。
いくつかの実施形態では、方法は、対象から単離又は取得された集団ＰＢＭＣなどの生体サンプルからＮＫ細胞を濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞について濃縮された細胞の集団は、１つ以上のナチュラルキラー細胞特異的マーカーに基づく単離又は選択によって濃縮される。特定のマーカー又は表面マーカーの組み合わせを選択することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの実施形態では、表面マーカーは、以下の表面抗原、ＣＤ１１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ１６１、ＣＤ２２６、ＮＫＢ１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＫＩＲ２ＤＬ１、及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３からの任意の１つ以上である。いくつかの実施形態では、表面マーカーは、以下の表面抗原、ＣＤ１１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ１６１、ＣＤ２２６、ＮＫＢ１、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７（ＣＤ３１９）、ＫＩＲ２ＤＬ１、及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３からの任意の１つ以上である。特定の実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３と、以下の表面抗原、ＣＤ１６、ＣＤ５６、又はＣＤ５７のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３及びＣＤ５７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ１６である。他の実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ３８である。更なる実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ａ、及びＣＤ１６１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５７、及びＮＫＧ２Ｃである。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５７、及びＮＫＧ２Ａである。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｃ、及びＮＫＧ２Ａである。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３及びＣＤ５６である。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＮＫＧ２Ｃである。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＮＫＧ２Ａである。いくつかの実施形態では、１つ以上の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｃ、及びＮＫＧ２Ａである。そのような表面抗原を検出するための、蛍光色素コンジュゲート抗体を含む試薬は、周知であり、当業者に利用可能である。
いくつかの実施形態では、提供される方法によってサンプルから、単離又は選択などによって濃縮されるＮＫ細胞集団は、表面マーカーなどの１つ以上の特定のマーカーに対して陽性であるか（マーカー＋若しくはマーカーｐｏｓ）若しくはその高レベルを発現する（マーカーｈｉｇｈ）か、又は１つ以上のマーカーに対して陰性であるか若しくはその比較的低いレベルを発現する（マーカー－若しくはマーカーｎｅｇ）細胞である。したがって、細胞上又は細胞内で発現されるマーカー又はタンパク質に関する陽性、ｐｏｓ又は＋という用語は、本明細書において互換的に使用されることが理解される。したがって、細胞上又は細胞内で発現されるマーカー又はタンパク質に関する陰性、ｎｅｇ又は－という用語は、本明細書において互換的に使用されることが理解される。更に、本明細書におけるマーカーｎｅｇである細胞への言及は、マーカーに対して陰性である細胞、及び対照又はバックグラウンドレベルと比較して容易に検出可能ではない低レベルなどの比較的低いレベルのマーカーを発現する細胞を指し得ることが理解される。いくつかの場合、そのようなマーカーは、ＮＫ細胞の特定の集団上には存在しないか、又は比較的低いレベルで発現されるが、リンパ球の特定の他の集団（Ｔ細胞など）上に存在するか、又は比較的高いレベルで発現されるものである。いくつかの場合、そのようなマーカーは、ＮＫ細胞の特定の集団上には存在するか、又は比較的高いレベルで発現されるが、リンパ球の特定の他の集団（Ｔ細胞又はそのサブセットなど）上に存在しないか、又は比較的低いレベルで発現されるものである。
いくつかの実施形態では、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、分離は、親和性又は免疫親和性ベースの分離である。例えば、いくつかの態様における単離は、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーとのインキュベーションによる、１つ以上の複数のマーカー、典型的には、細胞表面マーカーの発現又は発現レベルに基づく細胞及び細胞集団の分離、続いて、一般に、洗浄工程、及び抗体又は結合パートナーに結合した細胞の、抗体又は結合パートナーに結合しなかった細胞からの分離を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、静的である（混合なし）。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、動的である（混合を伴う）。
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞が更なる使用のために保持される正の選択、及び／又は抗体若しくは結合パートナーに結合しなかった細胞が保持される負の選択に基づき得る。いくつかの例では、両方の画分が更なる使用のために保持される。分離は、特定の細胞集団又は特定のマーカーを発現する細胞の１００％濃縮又は除去を結果的にもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現するものなどの、特定の型の細胞の正の選択又は濃縮は、そのような細胞の数又はパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在を結果的にもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現するものなどの、特定の型の細胞の負の選択、除去、又は枯渇は、そのような細胞の数又はパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞の完全な除去を結果的にもたらす必要はない。例えば、いくつかの態様では、ＣＤ３についての負の選択は、ＣＤ３ｎｅｇである細胞の集団について濃縮するが、いくつかの場合、濃縮された集団中に依然として存在するＣＤ３ｐｏｓである細胞の小さいパーセンテージを含み得る、ある程度の残りの又は小さいパーセンテージの他の非選択細胞も含有し得る。いくつかの例では、ＣＤ５７ｐｏｓ又はＣＤ１６ｐｏｓ集団のうちの１つの正の選択は、当該集団、ＣＤ５７ｐｏｓ又はＣＤ１６ｐｏｓ集団のいずれかを濃縮するが、いくつか場合、濃縮された集団中に依然として存在するＣＤ５７又はＣＤ１６集団のうちの他方を含み得る、ある程度の残りの又は小さいパーセンテージの他の非選択細胞も含有し得る。
いくつかの例では、複数回の分離工程が実施され、１つの工程からの正又は負に選択された画分は、後続の正又は負の選択などの別の分離工程に供される。いくつかの例では、単一の分離工程は、各々、負の選択のために標的化されたマーカーに特異的である、細胞を複数の抗体又は結合パートナーとともにインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させ得る。同様に、種々の細胞型上で発現される複数の抗体又は結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型が同時に正に選択され得る。
いくつかの態様では、選択は、ＰＢＭＣサンプル由来の細胞などにおける、表面抗原のうちの１つ以上の発現に基づく正及び／又は負の選択工程を含む。いくつかの実施形態では、単離は、ＣＤ５６を発現する細胞、ＣＤ１６を発現する細胞、若しくはＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択、及び／又はＣＤ３８を発現する細胞に対する負の選択、及び／又はＴ細胞マーカーなどの非ＮＫ細胞マーカーを発現する細胞に対する負の選択、例えば、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、単離は、ＣＤ５６を発現する細胞、ＣＤ１６を発現する細胞、若しくはＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択、及び／又はＴ細胞マーカーなどの非ＮＫ細胞マーカーを発現する細胞に対する負の選択、例えば、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）を含む。いくつかの実施形態では、単離は、ＣＤ５６を発現する細胞、ＣＤ１６を発現する細胞、若しくはＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択、及び／又はＣＤ３８（ＣＤ３８ｎｅｇ）、ＣＤ１６１（ＣＤ１６１ｎｅｇ）、ＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）を発現する細胞に対する負の選択、及び／又はＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）を含む。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３に対して陰性の細胞（ＣＤ３ｎｅｇ）の単離を含む。
いくつかの実施形態では、単離は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）及びＣＤ５６を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５６ｐｏｓ）を含む。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３８を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３８ｎｅｇ）を更に含み得る。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５６を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５６ｐｏｓ）、続いて、ＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）及びＣＤ１６１を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ１６１ｎｅｇ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＮＫＧ２ＡｎｅｇＣＤ１６１ｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）及びＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５７ｐｏｓ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓである。
いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）及びＣＤ１６を発現する細胞に対する陽性（ＣＤ１６ｐｏｓ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ１６ｐｏｓである。
いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）及びＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５７ｐｏｓ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓである。例えば、ＮＫ細胞は、ＣＤ３ｐｏｓ細胞の枯渇（ＣＤ３ｐｏｓ細胞に対する負の選択）、続いて、ＣＤ５７ｐｏｓ細胞選択、それによって、ＣＤ５７ｐｏｓＮＫ細胞を単離及び濃縮することによって濃縮され得る。分離は、ＭＡＣＳ（商標）マイクロビーズを使用するなどの、免疫親和性ベースの方法によって実施され得る。例えば、ＣＤ３マイクロビーズが、ＣＤ３ｎｅｇ細胞に対する負の選択においてＣＤ３ｐｏｓ細胞を枯渇させるために使用され得る。続いて、ＣＤ５７マイクロビーズが、ＣＤ３細胞枯渇ＰＢＭＣのＣＤ５７濃縮のために使用され得る。次いで、ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ濃縮ＮＫ細胞が、提供される方法における拡大において使用され得る。
いくつかの実施形態では、選択は、ＮＫＧ２Ｃを発現する細胞に対する正の選択（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）及び／又は細胞ＮＫＧ２Ａに対する負の選択（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５７ｐｏｓ）、及びＮＫＧ２Ｃを発現する細胞に対する正の選択（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＮＫＧ２Ｃｐｏｓである。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５７ｐｏｓ）、及びＮＫＧ２Ａを発現する細胞に対する負の選択（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇである。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５７を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５７ｐｏｓ）、ＮＫＧ２Ｃを発現する細胞に対する正の選択（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）、及びＮＫＧ２Ａを発現する細胞に対する負の選択（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇである。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、選択は、ＣＤ３８を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３８ｎｅｇ）を更に含み得る。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇである。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇＮＫＧ２Ｃｐｏｓである。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇＮＫＧ２Ａｎｅｇである。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇである。
いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）及びＣＤ５６を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５６ｐｏｓ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓである。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５６を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５６ｐｏｓ）、及びＮＫＧ２Ｃを発現する細胞に対する正の選択（ＮＫＧ２Ｃｎｅｇ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＮＫＧ２Ｃｐｏｓである。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５６を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５６ｐｏｓ）、及びＮＫＧ２Ａを発現する細胞に対する負の選択（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇである。いくつかの実施形態では、選択は、ＣＤ３を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３ｎｅｇ）、ＣＤ５６を発現する細胞に対する正の選択（ＣＤ５６ｐｏｓ）、ＮＫＧ２Ｃを発現する細胞に対する正の選択（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）、及びＮＫＧ２Ａを発現する細胞に対する負の選択（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）を含む。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇである。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、選択は、ＣＤ３８を発現する細胞に対する負の選択（ＣＤ３８ｎｅｇ）を更に含み得る。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇである。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇＮＫＧ２Ｃｐｏｓである。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇＮＫＧ２Ａｎｅｇである。特定の実施形態では、単離又は選択された細胞は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６ｐｏｓＣＤ３８ｎｅｇＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇである。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、ｇ－ＮＫ細胞は、ｇ－ＮＫ代理表面マーカープロファイルを有する細胞である。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇである。任意のそのような態様の一部では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ３８ｎｅｇである。任意のそのような態様の一部では、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓは、ＮＫ細胞に対する代理表面マーカープロファイルとして使用される。任意のそのような実施形態の一部では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルを更に含む。任意のそのような実施形態の一部では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓを更に含む。特定の実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを含む。他の特定の実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを含む。他の特定の実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞代理表面マーカープロファイルは、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＣＤ３８ｎｅｇを含む。
いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーの発現に基づく正又は負の選択などによって細胞を単離、選択、及び／又は濃縮する方法は、免疫親和性ベースの選択を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫親和性ベースの選択は、ＰＢＭＣなどの細胞を含有するサンプルを、細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、抗体又は結合パートナーは、正及び／又は負の選択のための細胞の分離を可能にするために、球体又はビーズ、例えば、アガロース、磁気ビーズ、又は常磁性ビーズを含む、マイクロビーズ、ナノビーズなどの、固体支持体又はマトリックスに結合される。いくつかの実施形態では、球体又はビーズは、免疫親和性クロマトグラフィーを行うためにカラムに充填され得、ＰＢＭＣなどの細胞を含有するサンプルが、カラムのマトリックスと接触し、続いて、そこから溶出又は放出される。
インキュベーションは、一般に、磁性粒子又はビーズに付着する抗体又は結合パートナーに特異的に結合する抗体又は結合パートナーが、サンプル内の細胞上に存在する場合、細胞表面分子に特異的に結合する条件下で実施される。
いくつかの態様では、サンプルは、磁場に配置され、磁気応答性粒子又は磁化可能な粒子が付着している細胞が、磁石に引き寄せられ、非標識細胞から分離されることになる。正の選択では、磁石に引き寄せられた細胞が保持され、負の選択では、引き寄せられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの態様では、正及び負の選択の組み合わせは、同じ選択工程の間に実施され、正及び負の画分が保持され、更に処理されるか、又は更なる分離工程に供される。
いくつかの実施形態では、磁気応答性粒子は、その後にインキュベート及び／又は培養される細胞に付着したままであり、いくつかの態様では、粒子は、患者への投与のために細胞に付着したままである。いくつかの実施形態では、磁化可能な又は磁気応答性粒子は、細胞から除去される。磁化可能な粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、磁化可能な粒子、又は切断可能なリンカーにコンジュゲートされた抗体などの使用を含む。いくつかの実施形態では、磁化可能な粒子は、生分解性である。
いくつかの実施形態では、親和性ベースの選択は、磁気活性化細胞選別（magnetic-activated cell sorting、ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によるものである。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムは、磁化された粒子が付着している細胞の高純度選択が可能である。ある特定の実施形態では、ＭＡＣＳは、外部磁場の印加後に非標的種及び標的種が順次溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化された粒子に付着した細胞は、適所に保持されるが、一方で、付着していない種は、溶出される。次いで、この第１の溶出工程が完了した後、磁場内に捕捉され、かつ溶出が防止された種は、それらが溶出及び回収され得るように、何らかの様式で解放される。ある特定の実施形態では、非標的細胞は、標識され、不均一な細胞集団から枯渇される。
そのような実施形態のうちのいずれかの一部では、方法は、ＮＫ細胞又はそのサブセットを選択及び／又は単離するなどの、濃縮する前に、対象にＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、及び／又はＣＣＬ５を投与することを含む。
提供される方法の実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞サブセット、具体的にはｇ－ＮＫ細胞サブセットの増殖及び拡大を支持する条件下などの、フィーダー細胞の存在下でインキュベート又は培養される。
特定の態様では、フィーダー細胞は、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓの拡大を刺激若しくは促進し、かつ／又はＮＫＧ２Ａｐｏｓ細胞の拡大を阻害する細胞を含む。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞は、ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ａ２シグナル配列を含有するハイブリッドＨＬＡ－Ｅを発現するか、又はそれによってトランスフェクトされる細胞である。例えば、そのようなハイブリッドの例は、ＨＬＡ－Ａ２などのＭＨＣクラスＩ、プロモーター及びシグナル配列、並びにＨＬＡ－Ｅ成熟タンパク質配列を含有するＡＥＨハイブリッド遺伝子であり、いくつかの場合、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子によってコードされる成熟タンパク質と同一であるが、細胞表面上で安定して発現され得る成熟タンパク質を結果的にもたらし得る（例えば、Ｌｅｅら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６０：４９５１－４９６０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ａ２などのＭＨＣクラスＩ、リーダー配列の存在下で安定化されたＭＨＣ－Ｅ分子を発現するようにトランスフェクトされるＬＣＬ７２１．２２１、Ｋ５６２細胞、又はＲＭＡ－Ｓ細胞である。ＨＬＡ－Ａ２などのＭＨＣクラスＩ、リーダー配列ペプチドの存在下で安定化された細胞表面ＨＬＡ－Ｅを発現するように操作される細胞株は、当技術分野で公知である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６０：４９５１－４９６０、Ｚｈｏｎｇｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）１３：４６４－４６７、Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：９３６－９４４）。いくつかの実施形態では、照射された２２１．ＡＥＨ細胞などの２２１．ＡＥＨ細胞が、フィーダー細胞、又は任意の他のＨＬＡ－Ｅ発現細胞株若しくはＫ５６２などの別様にＨＬＡ陰性である照射されたＨＬＡ－Ｅ発現細胞株として使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞株は、ＨＬＡ－Ｅを発現するようにトランスフェクトされ得る。いくつかの実施形態では、膜結合型ＩＬ－１５（Ｋ５６２－ｍｂ１５）又は膜結合型ＩＬ－２１（Ｋ５６２－ｍｂ２１）を発現するＫ５６２細胞がフィーダー細胞として使用され得る。本明細書で提供される方法における使用のためのそのような細胞株の例は、２２１－ＡＥＨ細胞である。
実施形態では、ＨＬＡ発現フィーダー細胞は、凍結保存され、使用前に解凍される。いくつかの実施形態では、細胞が２２１．ＡＥＨ細胞などのＨＬＡ－Ｅを発現するようにトランスフェクトされている場合、細胞は、方法におけるそれらの使用の前に、例えば、血清又は他の適切な血清代替物、及び選択剤を含む、適切な栄養素の存在下で成長され得る。例えば、２２１．ＡＥＨ細胞の場合、細胞に対する選択圧を維持して高レベルのプラスミドＨＬＡ－Ｅを維持するために、ハイグロマイシンＢ（例えば、０．１％～１０％、例えば、１％又は約１％）を補充した細胞培養培地中で細胞が培養され得る。細胞は、使用するまで１×１０５細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬの密度で維持され得る。
特定の実施形態では、培養に追加されるＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞、例えば、２２１．ＡＥＨ細胞は、Ｘ線照射又はガンマ線照射などによって非分裂である。ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞、例えば、２２１．ＡＥＨは、提供される方法におけるそれらの使用の当日又は直前に照射され得る。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞は、細胞分裂を防止するために、約１０００～１００００ｒａｄ、例えば、１０００～５０００ｒａｄの範囲のガンマ線で照射される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞は、細胞分裂を防止するために、約１０Ｇｙ～１００Ｇｙ、例えば、１０～５０Ｇｙの範囲のガンマ線で照射される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００Ｇｙで照射される。他の実施形態では、照射は、Ｘ線照射によって実施される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞は、細胞分裂を防止するために、約１０Ｇｙ～１００Ｇｙ、例えば、１０～５０Ｇｙの範囲のＸ線で照射される。いくつかの実施形態では、Ａ Ｒａｄ－Ｓｕｒｅ（商標）血液照射インジケータが、照射の肯定的な視覚的検証を提供するために使用され得る。提供される方法の態様では、フィーダー細胞は、決して除去されず、照射の結果として、ＮＫ細胞は、フィーダー細胞に対して直接的に細胞傷害となり、フィーダー細胞は、培養中に死滅することになる。
いくつかの実施形態では、濃縮され、選択され、かつ／又は単離されたＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の存在下で、１：１０超又は約１：１０超のＨＬＡ－Ｅフィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団対濃縮されたＮＫ細胞、例えば、１０：１又は約１０：１～１０：１又は約１０：１のそのようなフィーダー細胞対濃縮されたＮＫ細胞である、フィーダー細胞対濃縮されたＮＫ細胞の比で、インキュベート又は培養される。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の比は、１：１０若しくは約１：１０～１０：１若しくは約１０：１、１：１０若しくは約１：１０～５：１若しくは約５：１、１：１０若しくは約１：１０～２．５：１若しくは約２．５：１、１：１０若しくは約１：１０～１：１若しくは約１：１、１：１０若しくは約１：１０～１：２．５若しくは約１：２．５、１：１０若しくは約１：１０～１：５若しくは約１：５、１：５若しくは約１：５～１０：１若しくは約１０：１、１：５若しくは約１：５～５：１若しくは約５：１、１：５若しくは約１：５～２．５：１若しくは約２．５：１、１：５若しくは約１：５～１：１若しくは約１：１、１：５若しくは約１：５～１：２．５若しくは約１：２．５、１：２．５若しくは約１：２．５～１０：１若しくは約１０：１、１：２．５若しくは約１：２．５～５：１若しくは約５：１、１：２．５若しくは約１：２．５～２．５：１若しくは約２．５：１、１：２．５若しくは約１：２．５～１：１若しくは約１：１、１：１若しくは約１：１～１０：１若しくは約１０：１、１：１若しくは約１：１～５：１若しくは約５：１、１：１若しくは約１：１～３：１若しくは約３：１、１：１若しくは約１：１～２．５：１若しくは約２．５：１、２．５：１若しくは約２．５：１～１０：１若しくは約１０：１、２．５：１若しくは約２．５：１～５：１若しくは約５：１、又は５：１若しくは約５：１～１０：１若しくは約１０：１（各々両端含む）である、そのようなフィーダー細胞対濃縮されたＮＫ細胞の比である。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の比は、１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２．０：１、２．２５：１、２：５：１、２．７５：１、３．０：１、３．２５：１、３．５：１、３．７５：１、４．０：１、４．２５：１、４．５：１、４．７５：１、若しくは５：１、又は約１．２５：１、約１．５：１、約１．７５：１、約２．０：１、約２．２５：１、約２：５：１、約２．７５：１、約３．０：１、約３．２５：１、約３．５：１、約３．７５：１、約４．０：１、約４．２５：１、約４．５：１、約４．７５：１、若しくは約５：１、あるいは上記のいずれかの間の任意の値である、そのようなフィーダー細胞対濃縮されたＮＫ細胞の比である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の比は、５：１未満又は約５：１未満である、そのようなフィーダー細胞対濃縮された細胞の比である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の比は、１：１又は約～２．５：１又は約２．５：１（両端含む）の比である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の比は、２．５：１又は約２．５：１の比である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現フィーダー細胞（例えば、２２１．ＡＥＨ細胞）、例えば、その照射された集団の比は、２：１又は約２：１である。
いくつかの場合、出発ＮＫ細胞集団が拡大前に凍結保存されている場合、すなわち、凍結／解凍に供されている場合、新鮮なＮＫ細胞を使用する方法よりも低い２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比が用いられ得る。ここで、１：１の２２１．ＡＥＨ対凍結／解凍ＮＫ細胞の比は、２．５：１の２２１．ＡＥＨ対新鮮なＮＫ細胞の比を含有する培養において同等の拡大を結果的にもたらしたことが見出される。いくつかの態様では、より低い比は、より多くの細胞間接触を可能にする培養中のより多くのＮＫ細胞数を確保し、これは、初期成長及び拡大の促進における役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、サンプルからのＮＫ細胞の初期の濃縮された集団が凍結／解凍に供された場合、２：１～１：２又は約２：１～約１：２の２２１．ＡＥＨ対凍結／解凍ＮＫ細胞の比が使用される。特定の実施形態では、比は、１：１である。２．５：１の２２１．ＡＥＨ対凍結／解凍ＮＫ細胞などの、より高い比が使用され得るが、これは、所望の閾値密度又は数に到達するために、より長い培養、例えば、２１日又は約２１日を必要とし得ることが理解される。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、培養に非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を更に追加することによって拡大される。いくつかの態様では、非分裂フィーダー細胞は、Ｘ線照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。いくつかの態様では、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ線照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防止するために、約１０００～１００００ｒａｄ、例えば、１０００～５０００ｒａｄの範囲のガンマ線で照射される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防止するために、約１０Ｇｙ～１００Ｇｙ、例えば、１０～５０Ｇｙの範囲のガンマ線で照射される。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部分の間、照射されたフィーダー細胞は、非分裂（例えば、照射された）ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞と同時に培養培地中に存在する。いくつかの態様では、非分裂（例えば、照射された）ＰＢＭＣフィーダー細胞、ＨＬＡ－Ｅ発現フィーダー細胞、及び濃縮されたＮＫ細胞は、インキュベーションの開始の日などの同日に、例えば、同時又はほぼ同時又はほとんど同時に培養に追加される。
いくつかの実施形態では、インキュベーション又は培養は、フィーダー細胞としての照射されたＰＢＭＣの存在下で更に実施される。いくつかの実施形態では、照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞は、濃縮されたＮＫ細胞が単離又は選択された同じ対象に対して自己由来であるか、又はそれに由来する。特定の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞を濃縮するために使用されるのと同じ生体サンプル、例えば、全血又は白血球アフェレーシス若しくはアフェレーシス産物から得られる。一旦得られると、ＰＢＭＣの一部分は、上記に説明されるＮＫ細胞の濃縮の前に照射のために保存される。
いくつかの実施形態では、照射されたＰＢＭＣは、フィーダー細胞として存在し、そのようなフィーダー細胞対濃縮されたＮＫ細胞の比は、１：１０若しくは約１：１０～１０：１若しくは約１０：１、１：１０若しくは約１：１０～５：１若しくは約５：１、１：１０若しくは約１：１０～２．５：１若しくは約２．５：１、１：１０若しくは約１：１０～１：１若しくは約１：１、１：１０若しくは約１：１０～１：２．５若しくは約１：２．５、１：１０若しくは約１：１０～１：５若しくは約１：５、１：５若しくは約１：５～１０：１若しくは約１０：１、１：５若しくは約１：５～５：１若しくは約５：１、１：５若しくは約１：５～２．５：１若しくは約２．５：１、１：５若しくは約１：５～１：１若しくは約１：１、１：５若しくは約１：５～１：２．５若しくは約１：２．５、１：２．５若しくは約１：２．５～１０：１若しくは約１０：１、１：２．５若しくは約１：２．５～５：１若しくは約５：１、１：２．５若しくは約１：２．５～２．５：１若しくは約２．５：１、１：２．５若しくは約１：２．５～１：１若しくは約１：１、１：１若しくは約１：１～１０：１若しくは約１０：１、１：１若しくは約１：１～５：１若しくは約５：１、１：１若しくは約１：１～２．５：１若しくは約２．５：１、２．５：１若しくは約２．５：１～１０：１若しくは約１０：１、２．５：１若しくは約２．５：１～５：１若しくは約５：１、又は５：１若しくは約５：１～１０：１若しくは約１０：１である。
いくつかの実施形態では、照射されたＰＢＭＣは、フィーダー細胞として存在し、そのようなフィーダー細胞対濃縮されたＮＫ細胞の比は、１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２．０：１、２．２５：１、２：５：１、２．７５：１、３．０：１、３．２５：１、３．５：１、３．７５：１、４．０：１、４．２５：１、４．５：１、４．７５：１、若しくは５：１、又は約１．２５：１、約１．５：１、約１．７５：１、約２．０：１、約２．２５：１、約２：５：１、約２．７５：１、約３．０：１、約３．２５：１、約３．５：１、約３．７５：１、約４．０：１、約４．２５：１、約４．５：１、約４．７５：１、若しくは約５：１、あるいは上記のいずれかの間の任意の値である。いくつかの実施形態では、照射されたＰＢＭＣは、５：１又は約５：１であるそのようなフィーダー細胞対濃縮された細胞の比で存在する。
特定の実施形態では、インキュベーション若しくは培養の少なくとも一部分の間、照射されたＰＢＭＣのＴ細胞などの１つ以上の細胞若しくは細胞型が活性化され、かつ／又はインキュベーション若しくは培養が、ＰＢＭＣフィーダー細胞の１つ以上のＴ細胞の活性化を刺激することができる少なくとも１つの刺激剤の存在下で実施される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、ＴＣＲ複合体のメンバーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの刺激剤は、ＣＤ３、任意選択的に、ＣＤ３イプシロンに特異的に結合する。いくつかの態様では、少なくとも１つの刺激剤は、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントである。例示的な抗ＣＤ３抗体としては、マウス抗ヒトＣＤ３（ＯＫＴ３）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含むインキュベーションの少なくとも一部分の間に存在する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、照射されたＰＢＭＣと同時又はほぼ同時に培養又はインキュベーションに追加される。例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、インキュベーション又は培養の開始時又はほぼ開始時に追加される。特定の態様では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、培養培地を交換又は洗浄することなどによる、培養又はインキュベーションの過程で、除去されるか、又はその濃度が低減され得る。特定の実施形態では、交換又は洗浄後、方法は、培養培地に抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントを追加して戻すか、又は補充することを含まない。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントは、培養又はインキュベーションの少なくとも一部分の間に追加されるか、又は存在し、濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ若しくは約１０ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ若しくは約５μｇ／ｍＬ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ若しくは約１０ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬ若しくは約２μｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ若しくは約１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ若しくは約１μｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ若しくは約１０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ若しくは約１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ若しくは約１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約５０ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ若しくは約５μｇ／ｍＬ、例えば、５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約５０ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬ若しくは約２μｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約５０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ若しくは約１μｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ若しくは約５μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬ若しくは約２μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ若しくは約１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ若しくは約５μｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬ若しくは約２μｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ若しくは約１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ若しくは約１μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ若しくは約５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ若しくは約１μｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬ若しくは約２μｇ／ｍＬ、又は２μｇ／ｍＬ若しくは約２μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ若しくは約５μｇ／ｍＬ（各々両端含む）である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、若しくは１００ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ、あるいは上記のうちのいずれかの間の任意の値である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体又は抗原結合フラグメントの濃度は、５０ｎｇ／ｍＬ又は約５０ｎｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態は、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）分子の抗原結合部分又はフラグメント、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。抗体という用語は、無傷のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のみならず、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などの、そのフラグメントを包含する。典型的には、「抗原結合フラグメント」は、関心対象の抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有する。これに関して、抗原結合フラグメントは、概して、可変重鎖（variable heavy chain、ＶＨ）及び可変軽鎖（variable light chain、ＶＬ）を含有する抗体に対する６つのＣＤＲ（重鎖及び軽鎖の各々の「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」）、又は単一可変ドメインを含有する抗体に対する３つのＣＤＲなどの、抗体を結合する抗体からのＶＨ及びＶＬ配列の１、２、３、４、５、又は全６つのＣＤＲを含み得る。
「抗体フラグメント」は、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部分を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性抗体、直鎖状抗体、可変重鎖（ＶＨ）領域、ｓｃＦｖ及び単一ドメインＶＨ単一抗体などの一本鎖抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖなどの、可変重鎖領域及び／又は可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメントである。
いくつかの実施形態では、インキュベーション又は培養は、選択及び／又は単離されたＮＫ細胞などのそのような濃縮されたＮＫ細胞の存在下で、０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個、又は少なくとも０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．１×１０６個若しくは約０．１×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．２×１０６個若しくは約０．２×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．５×１０６個若しくは約０．５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、又は１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬである濃度で開始される。提供される方法の実施形態では、インキュベーション又は培養は、選択及び／又は単離されたＮＫ細胞などの、そのような濃縮されたＮＫ細胞の存在下で、０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、例えば、０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個若しくは約０．７５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．５×１０６個若しくは約０．５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．２０×１０６個若しくは約０．２０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．０５×１０６個若しくは約０．０５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．１×１０６個若しくは約０．１×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．１×１０６個若しくは約０．１×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．１×１０６個若しくは約０．１×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個若しくは約０．７５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．１×１０６個若しくは約０．１×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．５×１０６個若しくは約０．５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．１×１０６個若しくは約０．１×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．２０×１０６個若しくは約０．２０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．２０×１０６個若しくは約０．２０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．２０×１０６個若しくは約０．２０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個若しくは約０．７５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．２０×１０６個若しくは約０．２０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．５×１０６個若しくは約０．５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．５×１０６個若しくは約０．５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．５×１０６個若しくは約０．５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個若しくは約０．７５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ、０．７５×１０６個若しくは約０．７５×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ～１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞／ｍＬ（各々両端含む）である濃度で開始される。いくつかの実施形態では、インキュベーション又は培養は、選択及び／又は単離されたＮＫ細胞などの、そのような濃縮されたＮＫ細胞の存在下で、０．２×１０６個又は約０．２×１０６個の濃度されたＮＫ細胞／ｍＬである濃度で開始される。
任意のそのような実施形態の一部では、インキュベーション又は培養の開始時に追加されるか、又は存在する、上記に説明されるようにＰＢＭＣから選択又は単離されたものなどの、濃縮されたＮＫ細胞の量は、少なくとも１×１０５個又は少なくとも約１×１０５個の細胞、少なくとも約２×１０５個又は少なくとも約２×１０５個の細胞、少なくとも３×１０５個又は少なくとも約３×１０５個の細胞、少なくとも４×１０５個又は少なくとも約４×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個又は少なくとも約５×１０５個の細胞、少なくとも６×１０５個又は少なくとも約６×１０５個の細胞、少なくとも７×１０５個又は少なくとも約７×１０５個の細胞、少なくとも８×１０５個又は少なくとも約８×１０５個の細胞、少なくとも９×１０５個又は少なくとも約９×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個又は少なくとも約１×１０６個の細胞であるか、又はそれを超える。特定の実施形態では、上記に説明されたようにＰＢＭＣから選択又は単離されたものなどの、濃縮されたＮＫ細胞の量は、少なくとも１×１０６個、又は少なくとも約１×１０６個、又は１×１０６個、又は約１×１０６個の細胞である。
いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、少なくとも２．０×１０６個若しくは少なくとも約２．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも３．０×１０６個若しくは少なくとも約３．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも４．０×１０６個若しくは少なくとも約４．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも５．０×１０６個若しくは少なくとも約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも６．０×１０６個若しくは少なくとも約６．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも７．０×１０６個若しくは少なくとも約７．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも８．０×１０６個若しくは少なくとも約８．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも９．０×１０６個若しくは少なくとも約９．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも１．０×１０７個若しくは少なくとも約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも５．０×１０７個若しくは少なくとも約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも１．０×１０８個若しくは少なくとも約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、少なくとも５．０×１０８個若しくは少なくとも約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、又は少なくとも１．０×１０９個若しくは少なくとも約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、少なくとも２．０×１０５個又は少なくとも約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、少なくとも１．０×１０６個又は少なくとも約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、少なくとも１．０×１０７個又は少なくとも約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、２．０×１０５個若しくは約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０６個若しくは約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０６個若しくは約５．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０７個若しくは約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、５．０×１０７個若しくは約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞、１．０×１０８個若しくは約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞、又は５．０×１０８個若しくは約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個若しくは約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、２．０×１０５個又は約２．０×１０５個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０７個又は約５．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、１．０×１０６個又は約１．０×１０６個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０８個又は約１．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、１．０×１０７個又は約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～５．０×１０８個又は約５．０×１０８個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団は、１．０×１０７個又は約１．０×１０７個の濃縮されたＮＫ細胞～１．０×１０９個又は約１．０×１０９個の濃縮されたＮＫ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団中のｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージは、２０％若しくは約２０％～９０％若しくは約９０％、２０％若しくは約２０％～８０％若しくは約８０％、２０％若しくは約２０％～７０％若しくは約７０％、２０％若しくは約２０％～６０％若しくは約６０％、２０％若しくは約２０％～５０％若しくは約５０％、２０％若しくは約２０％～４０％若しくは約４０％、２０％若しくは約２０％～３０％若しくは約３０％、３０％若しくは約３０％～９０％若しくは約９０％、３０％若しくは約３０％～８０％若しくは約８０％、３０％若しくは約３０％～７０％若しくは約７０％、３０％若しくは約３０％～６０％若しくは約６０％、３０％若しくは約３０％～５０％若しくは約５０％、３０％若しくは約３０％～４０％若しくは約４０％、４０％若しくは約４０％～９０％若しくは約９０％、４０％若しくは約４０％～８０％若しくは約８０％、４０％若しくは約４０％～７０％若しくは約７０％、４０％若しくは約４０％～６０％若しくは約６０％、４０％若しくは約４０％～５０％若しくは約５０％、５０％若しくは約５０％～９０％若しくは約９０％、５０％若しくは約５０％～８０％若しくは約８０％、５０％若しくは約５０％～７０％若しくは約７０％、５０％若しくは約５０％～６０％若しくは約６０％、６０％若しくは約６０％～９０％若しくは約９０％、６０％若しくは約６０％～８０％若しくは約８０％、６０％若しくは約６０％～７０％若しくは約７０％、７０％若しくは約７０％～９０％若しくは約９０％、７０％若しくは約７０％～８０％若しくは約８０％、又は８０％若しくは約８０％～９０％若しくは約９０％である。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団中のｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージは、２０％又は約２０％～９０％又は約９０％である。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団中のｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージは、４０％又は約４０％～９０％又は約９０％である。いくつかの実施形態では、濃縮されたＮＫ細胞の集団中のｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージは、６０％又は約６０％～９０％又は約９０％である。
これらの実施形態の一部では、ＮＫ細胞は、成長因子とともに培養され得る。いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの成長因子は、ＳＣＦ、ＧＳＫ３ｉ、ＦＬＴ３、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１からなる群から選択される成長因子を含む。いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの成長因子は、ＩＬ－２又はＩＬ－７、及びＩＬ－１５である。いくつかの実施形態によると、少なくとも１つの成長因子は、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、又はＩＬ－７、及びＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、成長因子は、組換えＩＬ－２、組換えＩＬ－７、組換えＩＬ－２１、又は組換えＩＬ－１５などの組換えサイトカインである。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１つ以上の組換えサイトカインの存在下で培養される。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＳＣＦ、ＧＳＫ３ｉ、ＦＬＴ３、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、又はそれらの組み合わせのうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、又はそれらの組み合わせのうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインのうちの少なくとも１つは、ＩＬ－２１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、若しくはＩＬ－２７、又はそれらの組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインのうちの少なくとも１つは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、少なくともＩＬ－２及びＩＬ－２１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２１及びＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、Ｉｌ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカインは、ＩＬ－２及びＩＬ－１５である。
特定の実施形態では、提供される方法は、組換えＩＬ－２の存在下における濃縮されたＮＫ細胞及びフィーダー細胞のインキュベーション又は培養を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される、組換えＩＬ－２は、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、例えば、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬ若しくは５００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、又は２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ（各々両端含む）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される、ＩＬ－２の濃度は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１２５ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、又は上記のうちのいずれかの間の任意の値である。特定の実施形態では、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２の濃度は、１００ＩＵ／ｍＬ又は約１００ＩＵ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２の濃度は、５００ＩＵ／ｍＬ又は約５００ＩＵ／ｍＬである。
特定の実施形態では、提供される方法は、組換えＩＬ－２１の存在下における濃縮されたＮＫ細胞及びフィーダー細胞のインキュベーション又は培養を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される、組換えＩＬ－２１は、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、例えば、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～約５００ＩＵ／ｍＬ若しくは５００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、又は２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ（各々両端含む）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される、ＩＬ－２１の濃度は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１２５ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、又は上記のうちのいずれかの間の任意の値である。特定の実施形態では、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２１の濃度は、１００ＩＵ／ｍＬ又は約１００ＩＵ／ｍＬである。
特定の実施形態では、提供される方法は、組換えＩＬ－２１の存在下における濃縮されたＮＫ細胞及びフィーダー細胞のインキュベーション又は培養を含む。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）である。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）である。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２１の濃度は、２５ｎｇ／ｍＬ又は約２５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１５の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１５の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１５の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態では、方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下における培養を含む。提供される方法の実施形態では、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えサイトカインの濃度は、５０ＩＵ／ｍＬ又は約５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ又は約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、例えば、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ又は５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１ｎｇ／ｍＬ又は約１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬ、及び１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１、例えば、２５ｎｇ／ｍＬ又は約２５ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１が、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加されるなど、培養の少なくとも一部分の間に追加される。特定の実施形態では、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１が、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加されるなど、培養の少なくとも一部分の間に追加される。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、組換えＩＬ－２１の存在下における濃縮されたＮＫ細胞及びフィーダー細胞のインキュベーション又は培養を含み、組換えＩＬ－２１は、抗ＩＬ－２１抗体との複合体として追加される。いくつかの実施形態では、培養前に、抗ＩＬ－２１抗体が組換えＩＬ－２１と接触され、それによって、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体を形成し、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体が培養培地に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２１と抗ＩＬ－２１抗体とを接触させて、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体を形成させることは、複合体の形成に好適な温度及び時間を含む条件下で実施される。いくつかの実施形態では、培養は、３７℃±２で３０分間実施される。
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体は、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ、又は４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で追加される。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体は、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ又は約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で追加される。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体は、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で追加される。
特定の実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体との複合体を形成するために使用される組換えＩＬ－２１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）である。特定の実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体との複合体を形成するために使用される組換えＩＬ－２１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）である。特定の実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体との複合体を形成するために使用される組換えＩＬ－２１の濃度は、２５ｎｇ／ｍＬ又は約２５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１２の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１２の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１２の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１８の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１８の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－１８の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２７の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２７の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分の間、例えば、培養の開始時、及び任意選択的に、培養中に１回以上追加される組換えＩＬ－２７の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、方法は、培養培地を交換することを含み、いくつかの態様では、細胞を洗浄することを含む。例えば、培養又はインキュベーションの少なくとも一部分の間、培養培地は、毎日、１日置き、３日毎、又は週１回など、断続的に交換又は洗浄され得る。特定の実施形態では、培養培地は、培養の開始後の３日～７日以内又は約３日～７日以内、例えば、３日目、４日目、５日目、６日目、若しくは７日目、又は約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、若しくは約７日目に開始する交換又は洗浄を行われる。特定の実施形態では、培養培地は、５日目の開始時又はほぼ開始時に交換又は洗浄される。例えば、培地は、５日目及びその後２～３日毎に交換される。
培養培地が除去又は洗浄されると、それが補充される。いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、上記に説明されたもののいずれかなどの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の成長因子又はサイトカイン、例えば、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、及び／又はＩＬ－２１を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。
特定の実施形態では、培養は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの少なくとも１つの存在下で実施され、培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１のうちの少なくとも１つを含むように補充される。いくつかの実施形態では、培養は、ＩＬ－２及びＩＬ－２１の存在下で実施され、培養培地は、ＩＬ－２及びＩＬ－２１を含むように補充される。いくつかの実施形態では、培養は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で実施され、培養培地は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５を含むように補充される。いくつかの実施形態では、培養は、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの少なくとも１つの存在下で実施され、培養培地は、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を含むように補充される。いくつかの実施形態では、培養は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で実施され、培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１を含むように補充される。いくつかの実施形態は、限定されるものではないが、組換えＩＬ－１８、組換えＩＬ－７、及び／又は組換えＩＬ－１２を含む、１つ以上のサイトカインは、ＮＫ細胞の拡大に利用され得る。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、組換えＩＬ－２などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２などの成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－２などの、成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２などの、成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－２などの、成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、組換えＩＬ－２を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－２は、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、例えば、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ、１ＩＵ／ｍＬ若しくは約１ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ若しくは約１００ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ、又は２５０ＩＵ／ｍＬ若しくは約２５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ若しくは約５００ＩＵ／ｍＬ（各々両端含む）の濃度で培養又はインキュベーションに追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１２５ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、若しくは約５０ＩＵ／ｍＬ、約６０ＩＵ／ｍＬ、約７０ＩＵ／ｍＬ、約８０ＩＵ／ｍＬ、約９０ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１２５ＩＵ／ｍＬ、約１５０ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、又は上記のうちのいずれかの間の任意の値である濃度で培養又はインキュベーションに追加される。特定の実施形態では、組換えＩＬ－２の濃度は、１００ＩＵ／ｍＬであるか、又は約１００ＩＵ／ｍＬである。特定の実施形態では、組換えＩＬ－２の濃度は、５００ＩＵ／ｍＬであるか、又は約５００ＩＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、組換えＩＬ－２１などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２１などの成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－２１などの、成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２１などの、成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－２１などの、成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、組換えＩＬ－２１を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－２１は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）の濃度で培養又はインキュベーションに追加される。特定の実施形態では、組換えＩＬ－２１は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）の濃度で培養又はインキュベーションに追加される。組換えＩＬ－２１は、２５ｎｇ／ｍＬ又は約２５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、抗ＩＬ－２１抗体などの、抗体との複合体として追加される、組換えＩＬ－２１などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１抗体複合体などの複合体は、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１抗体複合体などの、複合体は、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１抗体複合体などの、複合体は、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１抗体複合体などの、複合体を培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１抗体複合体などの、複合体を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、抗ＩＬ－２１抗体が組換えＩＬ－２１と接触され、それによって、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体を形成し、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体が培養培地に追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－２１と抗ＩＬ－２１抗体とを接触させて、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体を形成させることは、複合体の形成に好適な温度及び時間を含む条件下で実施される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、培養は、３７℃±２で３０分間実施される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、抗ＩＬ－２１抗体は、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ若しくは約１００ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ若しくは約２００ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬ～４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ、又は４００ｎｇ／ｍＬ若しくは約４００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ若しくは約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で追加される。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体は、１００ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ又は約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で追加される。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体は、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、抗ＩＬ－２１抗体との複合体を形成するために使用される組換えＩＬ－２１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約６０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ～約７０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ～約８０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ～約９０ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）である。特定の実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体との複合体を形成するために使用される組換えＩＬ－２１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ（両端含む）である。特定の実施形態では、抗ＩＬ－２１抗体との複合体を形成するために使用される組換えＩＬ－２１の濃度は、２５ｎｇ／ｍＬ又は約２５ｎｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、組換えＩＬ－１５などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－１５などの成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－１５などの、成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－１５などの、成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－１５などの、成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、組換えＩＬ－１５を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１５は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１５は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１５は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。特定の実施形態では、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１が培養又はインキュベーションに追加される。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、組換えＩＬ－１２などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－１２などの成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－１２などの、成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－１２などの、成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－１２などの、成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、組換えＩＬ－１２を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１２は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１２は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１２は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、組換えＩＬ－１８などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－１８などの成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－１８などの、成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－１８などの、成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－１８などの、成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、組換えＩＬ－１８を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１８は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１８は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－１８は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。
いくつかの実施形態では、補充された培養培地は、組換えＩＬ－２７などの、１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２７などの成長因子又はサイトカインは、インキュベーション又は培養中に断続的に追加される。いくつかのそのような態様では、組換えＩＬ－２７などの、成長因子又はサイトカインは、培養又はインキュベーションの開始時又はほぼ開始時に追加され、次いで、培養培地が交換又は洗浄されるたびなど、培養又はインキュベーション中に断続的に追加される。いくつかの実施形態では、組換えＩＬ－２７などの、成長因子又はサイトカインは、０日目（インキュベーションの開始）に始まる培養又はインキュベーションに追加され、培養培地の交換又は洗浄のたびに、組換えＩＬ－２７などの、成長因子又はサイトカインを培養又はインキュベーションに補充するために更に追加される。いくつかの実施形態では、方法は、組換えＩＬ－２７を、インキュベーションの開始時（０日目）に、並びにインキュベーションの持続期間中の培養培地の各洗浄又は交換時に２日又は３日毎、例えば、培養又はインキュベーションの５日目、７日目、９日目、１１日目、及び１４日目又はおよそ５日目、およそ７日目、およそ９日目、およそ１１日目、及びおよそ１４日目に追加することを含む。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－２７は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ～約４０ｎｇ／ｍＬ、又は約４０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－２７は、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。そのような実施形態のうちのいずれかでは、組換えＩＬ－２７は、１０ｎｇ／ｍＬ又は約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養又はインキュベーションに追加される。
提供される方法の実施形態では、培養又はインキュベートすることは、ＮＫ細胞の維持に必要又は有用である化学的及び物理的条件（例えば、温度、ガス）を提供することを含む。ＮＫ細胞の増殖又は拡大を支持し得る化学的条件の例としては、限定されるものではないが、成長（すなわち、培養）培地中に典型的に提供される緩衝液、栄養素、血清、ビタミン、及び抗生物質が挙げられる。一実施形態では、ＮＫ培養培地は、１０％ＦＣＳを含むＭＥＭα、又は５％ヒト血清／ＬｉｆｏｒＣｅｌｌ（登録商標）ＦＢＳ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含むＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ）を含む。本発明による使用に好適な他の培地としては、限定されるものではないが、Ｇｌａｓｃｏｗ培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆ．）、ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ．）、又はＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ．）が挙げられる。培養培地の多くは、ビタミンサプリメント、例えば、ＭＥＭα（８．１９μＭニコチンアミド）、ＲＰＭＩ（８．１９μＭニコチンアミド）、ＤＭＥＭ（３２．７８μＭニコチンアミド）、及びＧｌａｓｃｏｗ培地（１６．３９μＭニコチンアミド）として、ニコチンアミドを含有することに留意されたい。
いくつかの実施形態では、細胞がヒト対象に導入（又は再導入）される用途などのために、培養は、リンパ球培養のためのＡＩＭ Ｖ（商標）無血清培地、ＭＡＲＲＯＷＭＡＸ（商標）骨髄培地、又は無血清幹細胞増殖培地（serum-free stem cell growth medium、ＳＣＧＭ）（例えば、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ（登録商標）ＧＭＰ ＳＣＧＭ）などの、無血清製剤を使用して実施される。そのような培地製剤及び補充物は、商業的供給源から入手可能である。培養は、最適な生存能力、増殖、機能性、及び／又は生存を促進するために、アミノ酸、抗生物質、及び／又は説明されるような他の成長因子サイトカインを補充され得る。いくつかの実施形態では、無血清培地はまた、低パーセンテージのヒト血清、例えば、０．５％～１０％ヒト血清、例えば、５％又は約５％のヒト血清で補充され得る。そのような実施形態では、ヒト血清は、ヒトＡＢ血漿由来のヒト血清（ヒトＡＢ血清）又は自己血清であり得る。
いくつかの実施形態では、フィーダー細胞、及び任意選択的に、サイトカイン（例えば、組換えＩＬ－２又はＩＬ－２１）による培養は、ヒトＮＫ細胞の成長又は拡大に好適な温度、例えば、少なくとも約２５℃、一般に少なくとも約３０℃、及び一般に３７℃又は約３７℃を含む条件下で実施される。いくつかの実施形態では、培養は、３７℃±２で５％のＣＯ２で実施される。
提供される方法の実施形態では、培養は、ＧＭＰ条件下で実施されるインキュベーションを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、閉鎖システムであり、いくつかの態様では、閉鎖自動化システムであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の組換えサイトカイン又は成長因子を含有する培養培地は、無血清培地である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、閉鎖自動化システムで、無血清培地を用いて実施される。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の拡大は、細胞拡大に好適な培養容器中で実施される。いくつかの実施形態では、培養容器は、Ｇ－Ｒｅｘシステム（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ１０、Ｇ－Ｒｅｘ１０Ｍ、Ｇ－Ｒｅｘ１００Ｍ／１００Ｍ－ＣＳ、又はＧ－Ｒｅｘ５００Ｍ／５００Ｍ－ＣＳ）などの、ガス透過性培養容器である。いくつかの実施形態では、培養容器は、閉鎖システムにおける細胞の拡大に好適なマイクロプレート、フラスコ、バッグ、又は他の培養容器である。いくつかの実施形態では、拡大は、バイオリアクター内で実施され得る。いくつかの実施形態では、拡大は、細胞拡大システムを使用して、バイオリアクター（例えば、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に関連するものなどの、ガス透過性バッグへの細胞の移送によって実施される。一実施形態では、細胞拡大システムは、約５０ｍＬ、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌ、又は上記のうちのいずれかの間の任意の値である体積を有するバッグ、例えば、ガス透過性細胞バッグなどの培養容器を含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、自動化又は半自動化される。いくつかの態様では、拡大培養は、静的条件下で実施される。いくつかの実施形態では、拡大培養は、揺動条件下で実施される。培地は、ボーラスで追加され得るか、又は灌流スケジュールで追加され得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、０．０１Ｌ／分、０．０５Ｌ／分、０．１Ｌ／分、０．２Ｌ／分、０．３Ｌ／分、０．４Ｌ／分、０．５Ｌ／分、１．０Ｌ／分、１．５Ｌ／分、若しくは２．０Ｌ／分、又は約０．０１Ｌ／分、約０．０５Ｌ／分、約０．１Ｌ／分、約０．２Ｌ／分、約０．３Ｌ／分、約０．４Ｌ／分、約０．５Ｌ／分、約１．０Ｌ／分、約１．５Ｌ／分、若しくは約２．０Ｌ／分、又は少なくとも０．０１Ｌ／分、少なくとも０．０５Ｌ／分、少なくとも０．１Ｌ／分、少なくとも０．２Ｌ／分、少なくとも０．３Ｌ／分、少なくとも０．４Ｌ／分、少なくとも０．５Ｌ／分、少なくとも１．０Ｌ／分、少なくとも１．５Ｌ／分、若しくは少なくとも２．０Ｌ／分、又は２．０Ｌ／分超の定常空気流で、３７℃又はその付近の温度、及び５％又はその付近のＣＯ２レベルを維持する。ある特定の実施形態では、培養の少なくとも一部分は、２９０ｍｌ／日、５８０ｍｌ／日、及び／又は１１６０ｍｌ／日の速度などの灌流を用いて実施される。
いくつかの態様では、細胞は、灌流が可能である自動化閉鎖拡大システムにおいて拡大される。灌流は、最適な成長速度が達成されることを確保するために細胞に培地を連続的に追加し得る。
拡大方法は、閉鎖自動化システム及び無血清培地の使用を含む、ＧＭＰ条件下で実施され得る。いくつかの実施形態では、方法の工程のうちのいずれか１つ以上は、閉鎖システムにおいて、又はＧＭＰ条件下で実施され得る。ある特定の実施形態では、全てのプロセス操作は、ＧＭＰスイートにおいて実施される。いくつかの実施形態では、閉鎖システムは、細胞療法を製造、生成、又は生産するための方法の他の処理工程のうちの１つ以上を実施するために使用される。いくつかの実施形態では、処理工程、例えば、単離、選択、及び／又は濃縮、処理、細胞の拡大に関連するインキュベーションを含む培養工程、並びに製剤化工程のうちの１つ以上又は全ては、統合若しくは自己完結型システムにおけるシステム、デバイス、若しくは装置を使用して、及び／又は自動化若しくはプログラム可能様式で実施される。いくつかの態様では、システム又は装置は、システム又は装置と通信するコンピュータ及び／又はコンピュータプログラムを含み、これは、ユーザが、処理、単離、操作、及び製剤化工程の様々な態様をプログラムし、制御し、その転帰を評価し、及び／又は調整することを可能にする。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、培養は、方法が、少なくとも２．５０×１０８個又は少なくとも約２．５０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞の拡大を達成する時点まで実施される。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、培養は、方法が、少なくとも５．０×１０８個又は少なくとも約５．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞の拡大を達成する時点まで実施される。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、培養は、方法が、少なくとも１．０×１０９個又は少なくとも約１．０×１０９個のｇ－ＮＫ細胞の拡大を達成するまで実施される。提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、培養は、方法が、少なくとも５．０×１０９個又は少なくとも約５．０×１０９個のｇ－ＮＫ細胞の拡大を達成する時点まで実施される。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、培養は、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、若しくは２５日間、又は約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、若しくは約２５日間、又は少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、少なくとも２３日間、少なくとも２４日間、若しくは少なくとも２５日間、又は少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、若しくは少なくとも約２５日間、実施される。いくつかの実施形態では、培養は、１４日間若しくは約１４日間、又は少なくとも１４日間若しくは約１４日間、実施される。いくつかの実施形態では、培養は、２１日間若しくは約２１日間、又は少なくとも２１日間若しくは約２１日間、実施される。
提供される実施形態のうちのいずれかの一部では、提供される方法のうちのいずれかによる、培養又はインキュベーションは、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、若しくは２５日間、又は約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、若しくは約２５日間、又は少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、少なくとも２３日間、少なくとも２４日間、若しくは少なくとも２５日間、又は少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、若しくは少なくとも約２５日間、実施される。いくつかの実施形態では、培養は、１４日間若しくは約１４日間、又は少なくとも１４日間若しくは約１４日間、実施される。いくつかの実施形態では、培養は、２１日間若しくは約２１日間、又は少なくとも２１日間若しくは約２１日間、実施される。ある特定の実施形態では、培養開始時の濃縮されたＮＫ細胞が、以前に凍結又は凍結保存された後に解凍されている場合、典型的には、培養のより長い持続期間が必要である。培養開始時の細胞の状態、培養開始時若しくは培養中の細胞の健康若しくは生存率、及び／又は、例えば、治療目的で対象に投与される細胞の用量などの、細胞の所望の用途に応じた培養終了時の閾値細胞の所望の数などの因子に応じて、細胞を培養する最適な日数を経験的に決定することは、当業者のレベルの範囲内である。
培養の終了時に、細胞が回収される。細胞の収集又は回収は、培養終了後の培養容器からの細胞の遠心分離によって達成され得る。例えば、細胞は、約１４日間の培養後に遠心分離によって回収される。細胞の回収後、細胞が洗浄される。細胞のサンプルは、機能又は表現型試験のために収集され得る。機能又は表現型試験に使用されない任意の他の細胞は、別々に製剤化され得る。いくつかの場合、細胞は、細胞の凍結保存のために凍結保護剤とともに製剤化される。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、単離、選択、及び／又は濃縮の前又は後のいずれかに、細胞を凍結する、例えば、凍結保存するための工程を含む。いくつかの実施形態では、提供される方法は、インキュベーション及び／又は培養の前又は後のいずれかに、細胞を凍結する、例えば、凍結保存するための工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、凍結保護剤の存在下で細胞を凍結保存し、それによって、凍結保存された組成物を生産することを含む。いくつかの態様では、方法は、インキュベートする前及び／又は対象に投与する前に、凍結保護剤を低減又は除去する条件下で凍結保存された組成物を洗浄することを含む。いくつかの態様では、様々な既知の凍結溶液及びパラメータのうちのいずれかが使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、最終濃度が１２．５％、１２．０％、１１．５％、１１．０％、１０．５％、１０．０％、９．５％、９．０％、８．５％、８．０％、７．５％、７．０％、６．５％、６．０％、５．５％、若しくは５．０％、又は約１２．５％、約１２．０％、約１１．５％、約１１．０％、約１０．５％、約１０．０％、約９．５％、約９．０％、約８．５％、約８．０％、約７．５％、約７．０％、約６．５％、約６．０％、約５．５％、若しくは約５．０％のＤＭＳＯ、あるいは１％～１５％、６％～１２％、５％～１０％、又は６％～８％のＤＭＳＯを含む培地及び／又は溶液中で、凍結、例えば、低温凍結又は凍結保存される。特定の実施形態では、細胞は、最終濃度が５．０％、４．５％、４．０％、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．２５％、１．０％、０．７５％、０．５％、若しくは０．２５％、又は約５．０％、約４．５％、約４．０％、約３．５％、約３．０％、約２．５％、約２．０％、約１．５％、約１．２５％、約１．０％、約０．７５％、約０．５％、若しくは約０．２５％のＨＳＡ、あるいは０．１％～－５％、０．２５％～４％、０．５％～２％、又は１％～２％のＨＳＡを含む培地及び／又は溶液中で凍結、例えば、低温凍結又は凍結保存される。一例は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、又は他の好適な細胞凍結培地を使用することを伴う。これは、次いで、培地で１：１に希釈され、そのため、ＤＭＳＯ及びＨＳＡの最終濃度は、それぞれ、１０％及び４％である。次いで、細胞は、一般に、毎分１°又は約１°の速度で－８０℃又は約－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵される。いくつかの実施形態では、細胞は、凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地中で凍結される。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、ＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％又は約５％～１０％又は約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％又は約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、６％又は約６％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、７％又は約７％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、８％又は約８％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、９％又は約９％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、１０％又は約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、市販の凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０又はＣＳ５）を含有する。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地である。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ５は、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの、１つ以上の追加の賦形剤を含有する。
いくつかの実施形態では、細胞は、５×１０６個～１×１０８個の細胞／ｍＬの密度で凍結保存される。例えば、細胞は、５×１０６個若しくは約５×１０６個の細胞／ｍＬ、１０×１０６個若しくは約１０×１０６個の細胞／ｍＬ、１５×１０６個若しくは約１５×１０６個の細胞／ｍＬ、２０×１０６個若しくは約２０×１０６個の細胞／ｍＬ、２５×１０６個若しくは約２５×１０６個の細胞／ｍＬ、３０×１０６個若しくは約３０×１０６個の細胞／ｍＬ、４０×１０６個若しくは約４０×１０６個の細胞／ｍＬ、５０×１０６個若しくは約５０×１０６個の細胞／ｍＬ、６０×１０６個若しくは約６０×１０６個の細胞／ｍＬ、７０×１０６個若しくは約７０×１０６個の細胞／ｍＬ、８０×１０６個若しくは約８０×１０６個の細胞／ｍＬ、又は９０×１０６個若しくは約９０×１０６個の細胞／ｍＬ、あるいは上記のうちのいずれかの間の任意の値の密度で凍結保存される。細胞は、凍結保存容器に好適な任意の体積で凍結保存され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、バイアル内で凍結保存される。凍結保存培地の体積は、１ｍＬ又は約１ｍＬ～５０ｍＬ又は約５０ｍＬ、例えば、１ｍＬ又は約１ｍＬ～５ｍＬ又は約５ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、バッグ内で凍結保存される。凍結保存培地の体積は、１０ｍＬ又は約１０ｍＬ～５００ｍＬ又は約５００ｍＬ、例えば、１００ｍＬ又は約１００ｍＬ～２００ｍＬ又は約２００ｍＬであり得る。回収及び拡大された細胞は、－８０℃～－１９６℃の温度などの低温環境で凍結保存され得る。提供される方法のうちのいずれかの一部では、方法は、培養の開始時と比較して、培養の終了時に増加した数のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞を産生する。例えば、培養開始時と比較した培養終了時のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞の増加は、１００倍超若しくは約１００倍超、２００倍超若しくは約２００倍超、３００倍超若しくは約３００倍超、４００倍超若しくは約４００倍超、５００倍超若しくは約５００倍超、６００倍超若しくは約６００倍超、７００倍超若しくは約７００倍超、８００倍超又は若しくは約８００倍超であり得る。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１０００倍超又は約１０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２０００倍超又は約２０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５００倍超又は約２５００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３０００倍超又は約３０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、５０００倍超又は約５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１００００倍超又は約１００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１５０００倍超又は約１５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２００００倍超又は約２００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５０００倍超又は約２５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３００００倍超又は約３００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３５０００倍超又は約３５０００倍超である。いくつかの実施形態では、提供される方法のうちのいずれかによる培養又はインキュベーションは、方法が、少なくとも２．５０×１０８個若しくは少なくとも約２．５０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも３．０×１０８個若しくは少なくとも約３．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも４．０×１０８個若しくは少なくとも約４．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも５．０×１０８個若しくは少なくとも約５．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも６．０×１０８個若しくは少なくとも約６．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも７．０×１０８個若しくは少なくとも約７．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも８．０×１０８個若しくは少なくとも約８．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも９．０×１０８個若しくは少なくとも約９．０×１０８個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも１．０×１０９個若しくは少なくとも約１．０×１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも１．５×１０９個若しくは少なくとも約１．５×１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも２．０×１０９個若しくは少なくとも約２．０×１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも３．０×１０９個若しくは少なくとも約３．０×１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも４．０×１０９個若しくは少なくとも約４．０×１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも５．０×１０９個若しくは少なくとも約５．０×１０９個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも１．０×１０１０個若しくは少なくとも約１．０×１０１０個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも１．５×１０１０個若しくは少なくとも約１．５×１０１０個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも２．０×１０１０個若しくは少なくとも約２．０×１０１０個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、少なくとも２．５×１０１０個若しくは少なくとも約２．５×１０１０個のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ細胞、又はそれを超える拡大を達成する時点まで実施される。
提供される方法のうちのいずれかの一部では、方法は、培養の開始時と比較して、培養の終了時に増加した数のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞を産生する。例えば、培養開始時と比較した培養終了時のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞の増加は、１００倍超若しくは約１００倍超、２００倍超若しくは約２００倍超、３００倍超若しくは約３００倍超、４００倍超若しくは約４００倍超、５００倍超若しくは約５００倍超、６００倍超若しくは約６００倍超、７００倍超若しくは約７００倍超、８００倍超又は若しくは約８００倍超であり得る。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１０００倍超又は約１０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２０００倍超又は約２０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３０００倍超又は約３０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５００倍超又は約２５００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、５０００倍超又は約５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１００００倍超又は約１００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１５０００倍超又は約１５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２００００倍超又は約２００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５０００倍超又は約２５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３００００倍超又は約３００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３５０００倍超又は約３５０００倍超である。いくつかの実施形態では、提供される方法のうちのいずれかによる培養又はインキュベーションは、方法が、少なくとも２．５０×１０８個若しくは少なくとも約２．５０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも３．０×１０８個若しくは少なくとも約３．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも４．０×１０８個若しくは少なくとも約４．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも５．０×１０８個若しくは少なくとも約５．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも６．０×１０８個若しくは少なくとも約６．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも７．０×１０８個若しくは少なくとも約７．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも８．０×１０８個若しくは少なくとも約８．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも９．０×１０８個若しくは少なくとも約９．０×１０８個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．０×１０９個若しくは少なくとも約１．０×１０９個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．５×１０９個若しくは少なくとも約１．５×１０９個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも２．０×１０９個若しくは少なくとも約２．０×１０９個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも３．０×１０９個若しくは少なくとも約３．０×１０９個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも４．０×１０９個若しくは少なくとも約４．０×１０９個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも５．０×１０９個若しくは少なくとも約５．０×１０９個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．０×１０１０個若しくは少なくとも約１．０×１０１０個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．５×１０１０個若しくは少なくとも約１．５×１０１０個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも２．０×１０１０個若しくは少なくとも約２．０×１０１０個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも２．５×１０１０個若しくは少なくとも約２．５×１０１０個のＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、又はそれを超える拡大を達成する時点まで実施される。
提供される方法のうちのいずれかの一部では、方法は、培養の開始時と比較して、培養の終了時に増加した数のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞を産生する。例えば、培養開始時と比較した培養終了時のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞の増加は、１００倍超若しくは約１００倍超、２００倍超若しくは約２００倍超、３００倍超若しくは約３００倍超、４００倍超若しくは約４００倍超、５００倍超若しくは約５００倍超、６００倍超若しくは約６００倍超、７００倍超若しくは約７００倍超、８００倍超又は若しくは約８００倍超であり得る。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１０００倍超又は約１０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２０００倍超又は約２０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５００倍超又は約２５００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３０００倍超又は約３０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、５０００倍超又は約５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１００００倍超又は約１００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１５０００倍超又は約１５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２００００倍超又は約２００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５０００倍超又は約２５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３００００倍超又は約３００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３５０００倍超又は約３５０００倍超である。いくつかの実施形態では、提供される方法のうちのいずれかによる培養又はインキュベーションは、方法が、少なくとも２．５０×１０８個若しくは少なくとも約２．５０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも３．０×１０８個若しくは少なくとも約３．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも４．０×１０８個若しくは少なくとも約４．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも５．０×１０８個若しくは少なくとも約５．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも６．０×１０８個若しくは少なくとも約６．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも７．０×１０８個若しくは少なくとも約７．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも８．０×１０８個若しくは少なくとも約８．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも９．０×１０８個若しくは少なくとも約９．０×１０８個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．０×１０９個若しくは少なくとも約１．０×１０９個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．５×１０９個若しくは少なくとも約１．５×１０９個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも２．０×１０９個若しくは少なくとも約２．０×１０９個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも３．０×１０９個若しくは少なくとも約３．０×１０９個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも４．０×１０９個若しくは少なくとも約４．０×１０９個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも５．０×１０９個若しくは少なくとも約５．０×１０９個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．０×１０１０個若しくは少なくとも約１．０×１０１０個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも１．５×１０１０個若しくは少なくとも約１．５×１０１０個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも２．０×１０１０個若しくは少なくとも約２．０×１０１０個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、少なくとも２．５×１０１０個若しくは少なくとも約２．５×１０１０個のＮＫＧ２ＣｐｏｓＮＫＧ２Ａｎｅｇ細胞、又はそれを超える拡大を達成する時点まで実施される。
提供される方法のうちのいずれかの一部では、方法は、培養の開始時と比較して、培養の終了時に増加した数のｇ－ＮＫ細胞を産生する。例えば、培養開始時と比較した培養終了時のｇ－ＮＫ細胞の増加は、１００倍超若しくは約１００倍超、２００倍超若しくは約２００倍超、３００倍超若しくは約３００倍超、４００倍超若しくは約４００倍超、５００倍超若しくは約５００倍超、６００倍超若しくは約６００倍超、７００倍超若しくは約７００倍超、８００倍超又は若しくは約８００倍超であり得る。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１０００倍超又は約１０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２０００倍超又は約２０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５００倍超又は約２５００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３０００倍超又は約３０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、５０００倍超又は約５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１００００倍超又は約１００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、１５０００倍超又は約１５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２００００倍超又は約２００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、２５０００倍超又は約２５０００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３００００倍超又は約３００００倍超である。任意の実施形態のうちのいくつかでは、増加は、３５０００倍超又は約３５０００倍超である。いくつかの実施形態では、提供される方法のうちのいずれかによる培養又はインキュベーションは、方法が、少なくとも２．５０×１０８個若しくは少なくとも約２．５０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも３．０×１０８個若しくは少なくとも約３．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも４．０×１０８個若しくは少なくとも約４．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも５．０×１０８個若しくは少なくとも約５．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも６．０×１０８個若しくは少なくとも約６．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも７．０×１０８個若しくは少なくとも約７．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも８．０×１０８個若しくは少なくとも約８．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも９．０×１０８個若しくは少なくとも約９．０×１０８個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも１．０×１０９個若しくは少なくとも約１．０×１０９個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも１．５×１０９個若しくは少なくとも約１．５×１０９個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも２．０×１０９個若しくは少なくとも約２．０×１０９個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも３．０×１０９個若しくは少なくとも約３．０×１０９個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも４．０×１０９個若しくは少なくとも約４．０×１０９個のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも５．０×１０９個以上若しくは少なくとも約５．０×１０９個以上のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも１．０×１０１０個以上若しくは少なくとも約１．０×１０１０個以上のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも１．５×１０１０個以上若しくは少なくとも約１．５×１０１０個以上のｇ－ＮＫ細胞、少なくとも２．０×１０１０個以上若しくは少なくとも約２．０×１０１０個以上のｇ－ＮＫ細胞、又は少なくとも２．５×１０１０個以上若しくは少なくとも約２．５×１０１０個以上のｇ－ＮＫ細胞の拡大を達成する時点まで実施される。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、ｇ－ＮＫ細胞の優先的な拡大を結果的にもたらす。いくつかの態様では、ｇ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を他のリンパ球又は免疫細胞から区別し、ｇ－ＮＫ細胞を従来のＮＫ細胞から区別する１つ以上の様々なマーカーの表面発現の存在、非存在、又はレベルによって同定される。実施形態では、表面発現は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、マーカーへの抗体の結合を検出することによって決定され得る。同様の方法が、細胞内マーカーの発現を評価するために実施され得るが、そのような方法は、典型的には、フローサイトメトリーによって細胞内タンパク質を検出するための染色前の固定及び透過処理のための方法を含む。いくつかの実施形態では、固定は、ホルムアルデヒド（例えば、０．０１％）を使用して達成され、その後、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ－５０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、又はＬｅｕｃｏｐｅｒｍなどの洗剤（例えば、０．１％～１％の洗剤、例えば、０．５％又は約０．５％）を使用して膜の破壊に続く。
抗体及び他の結合実体が、ｇ－ＮＫ細胞を同定、検出、濃縮、及び／又は単離するためのマーカータンパク質の発現レベルを検出するために使用され得る。好適な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）、単鎖抗体、及び他の形態の特異的結合分子が挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ＮＫ細胞サブセット）は、細胞内マーカー又は表面マーカーであり得る特定のマーカーの細胞上又は細胞内に検出可能に存在する場合、特定のマーカーについて陽性（ｐｏｓ）である。実施形態では、表面発現は、染色が、別途同一の条件下でアイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルで、及び／又はマーカーに対して陽性であることが知られている細胞と実質的に同様のレベルで、若しくはいくつかの場合、それよりも高いレベルで、及び／又はマーカーに対して陰性であることが知られている細胞のレベルよりも高いレベルで検出可能である場合、陽性である。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ＮＫ細胞サブセット）は、細胞内マーカー又は表面マーカーであり得る特定のマーカーの細胞上又は細胞内における検出可能な存在が存在しない場合、特定のマーカーについて陰性（ｎｅｇ）である。実施形態では、表面発現は、染色が、別途同一の条件下でアイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルで、及び／又はマーカーに対して陽性であることが知られている細胞よりも実質的に低いレベルで、及び／又はマーカーに対して陰性であることが知られている細胞と実質的に同様のレベルで検出可能ではない場合、陰性である。
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ＮＫ細胞サブセット）は、マーカーについて陽性であることが知られている細胞と比較して、特定のマーカーの細胞上又は細胞内における検出可能な存在のレベルがより低い場合、特定のマーカーについて低い（ｌｏ又はｍｉｎ）。実施形態では、表面発現は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、マーカーへの抗体の結合を検出することによって決定され得、染色がマーカーに対して陽性であることが知られている細胞よりも低いレベルである場合、使用される方法に応じて、表面又は細胞内のいずれかの発現が低い。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の表現型を有する細胞（例えば、ＣＤ４５ｐｏｓ、ＣＤ３ｎｅｇ、及び／又はＣＤ５６ｐｏｓ）であり、ｇ－ＮＫ細胞サブセットを同定するか、又はそれと関連付けられる１つ以上のマーカーを発現する。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、公開された米国特許出願公開第２０１３／０２９５０４４号又はＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９０：１４０２－１４０６に説明されるように同定される。
いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、実質的にＦｃＲγを発現しないが、ナチュラルキラー細胞の少なくとも１つのマーカーを発現する細胞である。ＦｃＲγ鎖（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、高親和性免疫グロブリンガンマＦｃ受容体Ｉとも呼ばれる）についてのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいてアクセッション番号ＮＰ－００４０９７．１（ＧＩ：４７５８３４４）として入手可能であり、配列番号１として以下に再現される。
ＭＩＰＡＶＶＬＬＬＬＬＬＶＥＱＡＡＡＬＧＥＰＱＬＣＹＩＬＤＡＩＬＦＬＹＧＩＶＬＴ ＬＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫ ＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱ（配列番号１）
ＭＩＰＡＶＶＬＬＬＬＬＬＶＥＱＡＡＡＬＧＥＰＱＬＣＹＩＬＤＡＩＬＦＬＹＧＩＶＬＴ ＬＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫ ＳＤＧＶＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬＫＨＥＫＰＰＱ（配列番号１）
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞のｇ－ＮＫ細胞サブセットは、ＦｃＲγがＮＫ細胞の集団又はＮＫ細胞の亜集団によって発現されるかどうかを観察することによって検出され得る。いくつかの場合、ｇ－ＮＫ細胞は、ＦｃＲγを発現しない細胞として同定される。ＦｃＲγタンパク質は、細胞内タンパク質である。したがって、いくつかの態様では、ＦｃＲγの存在又は非存在は、例えば、細胞内タンパク質が検出されることを可能にするための固定及び透過処理によって、細胞の処置後に検出され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞の固定前などの、細胞内検出の前に１つ以上の表面マーカー（ＣＤ４５、ＣＤ３、及び／又はＣＤ５６）について更に評価される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＦｃＲγｎｅｇである細胞として同定、検出、濃縮、及び／又は単離される。
いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の５０％超又は約５０％超は、ＦｃＲγｎｅｇである。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の６０％超又は約６０％超は、ＦｃＲγｎｅｇである。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超は、ＦｃＲγｎｅｇである。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の８０％超又は約８０％超は、ＦｃＲγｎｅｇである。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の９０％超又は約９０％超は、ＦｃＲγｎｅｇである。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の９５％超又は約９５％超は、ＦｃＲγｎｅｇである。例えば、本明細書における方法は、一般に、高純度、例えば、７０～９０％のｇ－ＮＫ細胞産物を結果的にもたらす。
いくつかの実施形態では、例えば、サンプルの細胞が細胞選別又は機能アッセイに供される場合など、細胞内染色を用いずにｇ－ＮＫ細胞の発現を検出することが有用であり得る。ＦｃＲγの細胞内染色を可能にするための処置、例えば、固定及び透過処理は、実質的に純粋な細胞の集団の同定を確認するために使用され得るが、一方で、多くの場合、ｇ－ＮＫ細胞を同定、検出、又は単離するときに、細胞を傷付けずに検出され得る細胞表面マーカーが用いられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞のサブセット中のＦｃＲγの欠如と相関する代理マーカープロファイルを使用して同定される。いくつかの実施形態では、代理マーカープロファイルは、ＦｃＲγなどの細胞内タンパク質の存在又は非存在が細胞の特定の用途に応じて評価することが困難又は不可能であるときに特に有用である。
細胞表面マーカーの特定の組み合わせが、ＦｃＲγｇ－ＮＫ細胞表現型、すなわち、ＦｃＲγの細胞内発現を欠くか又はそれを欠損する細胞と相関し、それによって、細胞を傷付けない様式でｇ－ＮＫ細胞を同定又は検出するための代理マーカープロファイルを提供することが本明細書で見出される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇ－ＮＫ細胞の代理マーカープロファイルは、１つ以上のマーカーＣＤ１６（ＣＤ１６ｐｏｓ）、ＮＫＧ２Ｃ（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）、若しくはＣＤ５７（ＣＤ５７ｐｏｓ）の陽性表面発現に基づく、かつ／又は１つ以上のマーカーＣＤ７（ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ）、ＣＤ１６１（ＣＤ１６１ｎｅｇ）、及び／若しくはＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）の低い若しくは陰性表面発現に基づく。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３、及び／又はＣＤ５６などの、ＮＫ細胞の１つ以上の表面マーカーについて更に評価される。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、代理マーカープロファイルＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを用いて同定、検出、濃縮、及び／又は単離され得る。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、代理マーカープロファイルＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを用いて同定、検出、濃縮、及び／又は単離される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ及び／又はＮＫＧ２Ａｎｅｇであるｇ－ＮＫ細胞は、同定、検出、濃縮、及び／又は単離される。
いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の３０％超若しくは約３０％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の５０％超若しくは約５０％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の３５％超若しくは約３５％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の６０％超若しくは約６０％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の４０％超若しくは約４０％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の７０％超若しくは約７０％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の４５％超若しくは約４５％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の５０％超若しくは約５０％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の８５％超若しくは約８５％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の５５％超若しくは約５５％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のＮＫ細胞の６０％超若しくは約６０％超が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性であり、かつ／又は拡大された集団中のＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性若しくは低い。
いくつかの実施形態では、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超がパーフォリンに対して陽性であり、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の７５％超又は約７５％超がパーフォリンに対して陽性であり、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の７５％超又は約７５％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の８０％超又は約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の８０％超又は約８０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の８５％超又は約８５％超がパーフォリンに対して陽性であり、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の８５％超又は約８５％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の９０％超又は約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の９０％超又は約９０％超がグランザイムＢに対して陽性である。いくつかの実施形態では、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の９５％超又は約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、拡大された集団におけるｇ－ＮＫ細胞の９５％超又は約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である。
提供される方法によって拡大された細胞は、限定されるものではないが、細胞傷害活性、脱顆粒、サイトカインを産生又は分泌する能力、及び１つ以上の細胞内又は表面表現型マーカーの発現を含む、いくつかの機能的又は表現型活性のうちのいずれかについて評価され得る。そのような活性を評価する方法は公知であり、本明細書及び実施例に例示されている。
いくつかの実施形態では、標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）細胞傷害活性は、機能性の尺度として使用され得る。ＡＤＣＣ細胞傷害アッセイについて、拡大からの細胞が、標的細胞上の標的抗原に特異的な抗体の存在下又は非存在下で適切な標的細胞と共培養され得る。例えば、抗骨髄腫細胞傷害のために、いくつかの多発性骨髄腫（ＭＭ）標的細胞が使用され得（例えば、ＡＭ０１、ＫＭＳ１１、ＫＭＳ１８、ＫＭＳ３４、ＬＰ１、又はＭＭ．１Ｓ）のうちのいずれかが使用され得、アッセイは、抗ＣＤ３８（例えば、ダラツムマブ）又は抗ＣＤ３１９抗体（例えば、エロツズマブ）を用いて実施され得る。細胞死滅は、任意の数の方法によって決定され得る。例えば、細胞がヨウ化プロピジウム（Propidium iodide、ＰＩ）で染色され得、ＮＫ細胞、生存標的細胞、及び死滅標的細胞の数が、フローサイトメトリーなどによって解明され得る。
いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の１０％超又は約１０％超が、腫瘍細胞に対する脱顆粒が可能である。脱顆粒は、ＣＤ１０７Ａの発現を評価することによって測定され得る。例えば、いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の２０％超又は約２０％超が、腫瘍細胞に対する脱顆粒が可能である。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の３０％超又は約３０％超が、腫瘍細胞に対する脱顆粒が可能である。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の４０％超又は約４０％超が、腫瘍細胞に対する脱顆粒が可能である。いくつかの実施形態では、脱顆粒能は、腫瘍細胞に対する抗体の非存在下で測定される。
いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の１０％超又は約１０％超が、腫瘍細胞に対する、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファなどの、エフェクターサイトカインを産生することができる。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の２０％超又は約２０％超が、腫瘍細胞に対する、エフェクターサイトカイン、例えば、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができる。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の３０％超又は約３０％超が、腫瘍細胞に対する、エフェクターサイトカイン、例えば、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができる。いくつかの実施形態では、拡大された集団中のｇ－ＮＫ細胞の４０％超又は約４０％超が、腫瘍細胞に対する、エフェクターサイトカイン、例えば、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができる。いくつかの実施形態では、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生する能力は、腫瘍細胞に対する抗体の非存在下で測定される。
ｇ－ＮＫ細胞の代理マーカープロファイルを用いることによって、細胞集団を含有するサンプル中のｇ－ＮＫ細胞を同定又は検出するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞のサンプルを、１つ以上のマーカーＣＤ１６、ＣＤ５７、ＣＤ７、ＣＤ１６１、ＮＫＧ２Ｃ、及び／又はＮＫＧ２Ａに特異的である抗体又は抗原結合性フラグメントなどの、結合分子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞のサンプルを、１つ以上のマーカーＣＤ４５、ＣＤ３、及び／又はＣＤ５６に特異的である抗体又は抗原結合性フラグメントなどの、結合分子と接触させることを更に含む。方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の結合分子がサンプルと同時に接触させられ得る。方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の結合分子がサンプルと順次接触させられ得る。いくつかの実施形態では、接触に続いて、方法は、１つ以上の結合分子に結合された細胞を保持する、及び／又は未結合の結合分子をサンプルから分離する条件下における１つ以上の洗浄を含み得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の結合分子、例えば、抗体の各々は、マーカーに対して陽性又は陰性の細胞の検出のために、標識に直接的又は間接的に付着され得る。例えば、結合分子、例えば、抗体は、標識にコンジュゲート、結合、又は連結され得る。標識は、当業者に周知である。本明細書で企図される標識としては、限定されるものではないが、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子（例えば、コロイド金粒子）、銀粒子、強い光散乱特性を有する粒子、磁性粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁性ビーズなどの磁性ビーズ粒子）、ポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（商標）タグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグなど）、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）又はホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）などの酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、発光性化合物（例えば、化学発光基質）、オリゴヌクレオチド、特異的結合対のメンバー（例えば、リガンド及びその受容体）、並びに結合分子、例えば、抗体を、当該抗体に直接的又は間接的に付着したときに、可視化又は検出するために使用される当技術分野で周知の他の標識が挙げられる。
フローサイトメトリーによるなどの、親和性に基づく方法、例えば、表面マーカーの文脈で、例えば、免疫親和性ベースの方法による検出などの、表面マーカー又はタンパク質の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、標識は、フルオロフォアであり、ｇ－ＮＫ細胞の検出又は同定のための方法は、フローサイトメトリーによる。いくつかの実施形態では、異なる標識が、マルチカラーフローサイトメトリーによって異なるマーカーの各々について使用される。
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ７、及びＣＤ１６１に特異的な結合分子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＣＤ１６ｐｏｓ／ＣＤ５７ｐｏｓ／ＣＤ７ｄｉｍ／ｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを有する細胞として同定又は検出される。
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ａ、及びＣＤ１６１に特異的な結合分子と接触させることを含む。いくつかのそのような実施形態では、ｇ－ＮＫ細胞は、ｇ－ＮＫ細胞代理マーカープロファイルＣＤ４５ｐｏｓ／ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５６ｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ／ＣＤ１６１ｎｅｇを有する細胞として同定又は検出される。
いくつかの実施形態では、提供される方法はまた、提供される方法のうちのいずれかによって優先的に拡大されたｇ－ＮＫ細胞などのｇ－ＮＫを単離又は濃縮することを含み得る。いくつかのそのような実施形態では、説明されるパネル又はマーカーの組み合わせのうちのいずれかを使用して決定されるような、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、若しくは約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、又はそれを超えるｇ－ＮＫ細胞を含有する細胞集団などの、ｇ－ＮＫ細胞の実質的に純粋な集団が得られ得る。抗体及び他の結合分子は、ｇ－ＮＫ細胞の単離又は濃縮における使用のために、マーカータンパク質の発現レベルの存在又は非存在を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、単離又は濃縮は、蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sorting、ＦＡＣＳ）によって実施される。そのような方法の例では、ｇ－ＮＫ細胞は、複数の細胞表面マーカーについて細胞を染色するための上記に説明される方法を使用してフローサイトメトリーによって同定又は検出され、染色された細胞は、ｇ－ＮＫ細胞と関連付けられたマーカーについて陽性又は陰性である細胞の収集のために流体流内で運ばれる。
ＩＶ．キット及び製品
ｇ－ＮＫ細胞などの特定のサブセットについて濃縮されたＮＫ細胞を含有する、提供される組成物を含む製品及びキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、提供される方法のうちのいずれかによって産生される。いくつかの実施形態では、キットは、提供される組成物のうちのいずれかと、単剤療法として組成物を投与するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物のうちのいずれか及び追加の薬剤を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、追加の薬剤は、完全長抗体である。例示的な抗体は、説明される任意のものを含んだ。
ｇ－ＮＫ細胞などの特定のサブセットについて濃縮されたＮＫ細胞を含有する、提供される組成物を含む製品及びキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、提供される方法のうちのいずれかによって産生される。いくつかの実施形態では、キットは、提供される組成物のうちのいずれかと、単剤療法として組成物を投与するための説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物のうちのいずれか及び追加の薬剤を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、追加の薬剤は、完全長抗体である。例示的な抗体は、説明される任意のものを含んだ。
キットは、任意選択的に、使用のための説明書、デバイス、及び追加の試薬（例えば、組成物の希釈及び／又は凍結乾燥されたタンパク質の再構成のための滅菌水又は生理食塩水溶液）などの１つ以上の構成要素、並びに方法の実施のためのチューブ、容器、及びシリンジなどの構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、サンプルの収集、サンプルの調製及び処理のための試薬、並びに／又はサンプル中の１つ以上の表面マーカーの量を定量化するための試薬、例えば、限定されるものではないが、抗体などの検出試薬、緩衝液、酵素染色のための基質、クロマゲン、又はスライド、容器、マイクロタイタープレートなどの他の材料と、任意選択的に、方法を実施するための説明書と、を更に含有し得る。当業者は、提供される方法によって使用され得る多くの他の可能な容器及びプレート、並びに試薬を認識することになる。
いくつかの実施形態では、キットは、細胞、抗体若しくは試薬、又はそれらの組成物、あるいは１つ以上の他の構成要素を包装するための包装材料を含む製品として提供され得る。例えば、キットは、容器、ボトル、チューブ、バイアル、及びキットの構成要素を分離又は編成するのに好適な任意の包装材料を含有し得る。１つ以上の容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器は、方法で使用するための細胞又は抗体又は他の試薬を含む組成物を保持する。本明細書における製品又はキットは、別々の容器内又は同じ容器内に細胞、抗体、又は試薬を含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物を保持する１つ以上の容器は、単回使用バイアル又は複数回使用バイアルであり得、いくつかの場合、組成物の反復使用を可能にし得る。いくつかの実施形態では、製品又はキットは、好適な希釈剤を含む第２の容器を更に含み得る。製品又はキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、治療剤、及び／又は使用のための説明書を含む添付文書を含む、商業的、治療的、及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、任意選択的に、説明書を含み得る。説明書は、典型的には、細胞組成物、試薬、及び／又は抗体、並びに任意選択的に、キットに含まれる他の構成要素と、そのようなものを使用するための方法とを説明する具体的な表現を含む。いくつかの実施形態では、説明書は、提供される実施形態のうちのいずれかによるなどの、疾患又は状態を治療するために対象への投与のための細胞組成物及び抗体を使用するための方法を示す。いくつかの実施形態では、説明書は、標識又は添付文書として提供され、これは、容器上にあるか、又は容器に付随する。いくつかの実施形態では、説明書は、組成物の再構成及び／又は使用のための指示を示し得る。
Ｖ．例示的な実施形態
提供される実施形態の中には以下のものがある。
１．多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法。
２．方法が、多発性骨髄腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法である、実施形態１に記載の方法。
３．方法が、多発性骨髄腫抗原に対抗する抗体を対象に投与することを更に含む、実施形態１に記載の方法。
４．多発性骨髄腫抗原が、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、及びＢＣＭＡからなる群から選択される抗原を含む、実施形態３に記載の方法。
５．抗体が、完全長抗体である、実施形態３又は４に記載の方法。
６．抗体が、抗ＳＬＡＭＦ７抗体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
７．抗体が、抗ＢＣＭＡ抗体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
８．抗体が、抗ＣＤ３８抗体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
９．抗体が、二重特異性抗体である、実施形態３に記載の方法。
１０．二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＢＣＭＡ、ＳＬＡＭＦ７、及びＣＤ３８からなる群から選択される第２の多発性骨髄腫抗原に対抗する、実施形態９に記載の方法。
１１．二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ３８に対抗する、実施形態９又は１０に記載の方法。
１２．抗体が、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、週１回、又は週２回投与される、実施形態３～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている、実施形態８に記載の方法。
１４．多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の前投与を受けている、方法。
１５．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され、１４日周期が、１～３回繰り返される、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与される、実施形態１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブである、実施形態８及び１３～１６のいずれかに記載の方法。
１８．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
１９．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
２０．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
２１．抗ＣＤ３８抗体が、静脈内投与される、実施形態８及び１３～２０のいずれかに記載の方法。
２２．抗ＣＤ３８抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される、実施形態８及び１３～２１のいずれかに記載の方法。
２３．抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）の各用量が、８ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇ～約３２ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に、１６ｍｇ／ｋｇ又は約１６ｍｇ／ｋｇである量で投与される、請求項８及び１３～２２のいずれかに記載の方法。
２４．抗ＣＤ３８抗体が、皮下投与される、実施形態８及び１３～２０のいずれかに記載の方法。
２５．抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ３８抗体組成物で投与され、任意選択的に、抗ＣＤ３８抗体組成物が、ダラツムマブ及び組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）を含む、実施形態８、１３～２０、及び２４のいずれかに記載の方法。
２６．抗ＣＤ３８抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される、実施形態２５に記載の方法。
２７．抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む、実施形態２５又は２６に記載の方法。
２８．抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、約１８００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、約３０，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む、実施形態２４～２８のいずれかに記載の方法。
２９．方法が、抗ＣＤ３８抗体、任意選択的に、抗ＣＤ３８抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ３８抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与される、実施形態８及び１３～２８のいずれかに記載の方法。
３０．多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫である、実施形態１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．ｇ－ＮＫ細胞が、ＣＤ３８の低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＣＤ３８に対して陽性である、実施形態１～３０のいずれかに記載の方法。
３２．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＣＤ３８発現を低減又は排除するように操作されていない、実施形態１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈し、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈する、実施形態１～３２のいずれかに記載の方法。
３４．リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法。
３５．方法が、リンパ腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法である、実施形態３４に記載の方法。
３６．方法が、リンパ腫抗原に対抗する抗体を対象に投与することを更に含む、実施形態３４に記載の方法。
３７．リンパ腫抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される抗原を含む、実施形態３６に記載の方法。
３８．抗体が、完全長抗体である、実施形態３６又は３７に記載の方法。
３９．抗体が、抗ＣＤ１９抗体である、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．抗体が、抗ＣＤ３０抗体である、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４１．抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４２．抗体が、二重特異性抗体である、実施形態３６に記載の方法。
４３．二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される第２の抗原に対抗する、実施形態４２に記載の方法。
４４．二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ２０に対抗する、実施形態４３に記載の方法。
４５．抗体が、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、週１回、又は週２回投与される、実施形態３６～４５に記載の方法。
４６．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている、実施形態４１に記載の方法。
４７．リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の前投与を受けている、方法。
４８．リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、実施形態３４～４７のいずれかに記載の方法。
４９．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され、１４日周期が、１～３回繰り返される、実施形態３４～４８のいずれかに記載の方法。
５０．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与される、実施形態３４～４９のいずれかに記載の方法。
５１．抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、実施形態４１及び４５～５０のいずれかに記載の方法。
５２．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始される、実施形態４１及び４５～５１のいずれかに記載の方法。
５３．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始される、実施形態４１及び４５～５２のいずれかに記載の方法。
５４．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始される、実施形態４１及び４５～５３のいずれかに記載の方法。
５５．抗ＣＤ２０抗体が、静脈内投与される、実施形態４１及び４５～５４のいずれかに記載の方法。
５６．抗ＣＤ２０抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、４回又は８回の用量で投与される、実施形態４１及び４５～５５のいずれかに記載の方法。
５７．抗ＣＤ２０抗体の各用量が、２５０ｍｇ／ｍ２又は約２５０ｍｇ／ｍ２～５００ｍｇ／ｍ２、任意選択的に、３７５ｍｇ／ｍ２又は約３７５ｍｇ／ｍ２である量で投与される、実施形態４１及び４５～５６のいずれかに記載の方法。
５８．抗ＣＤ２０抗体が、皮下投与される、実施形態４１及び４５～５４のいずれかに記載の方法。
５９．抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ２０抗体組成物で投与され、任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体組成物が、リツキシマブ及びヒト組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０を含む、実施形態４１、４５～５４、及び５８のいずれかに記載の方法。
６０．抗ＣＤ２０抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、４回若しくは８回の用量で、又は任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体の静脈内の週１回の用量に続いて、３回若しくは７回の用量で、投与される、実施形態５９に記載の方法。
６１．抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６２．抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２３，４００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、実施形態５９～６１のいずれかに記載の方法。
６３．抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１６００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２６，８００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、実施形態５９～６１のいずれかに記載の方法。
６４．方法が、抗ＣＤ２０抗体、任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与される、実施形態４１及び４５～６３のいずれかに記載の方法。
６５．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、細胞の６０％超若しくは約６０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の７０％超若しくは約７０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の８０％超若しくは約８０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の９０％超若しくは約９０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、又は細胞の９５％超若しくは約９５％超がｇ－ＮＫ細胞である、実施形態１～６４のいずれかに記載の方法。
６６．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％が、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγｎｅｇ）ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、パーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、グランザイムＢに対して陽性である、実施形態１～６４のいずれかに記載の方法。
６７．（ｉ）ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、（ｉｉ）ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、又は（ｉｉｉ）ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である、実施形態６５又は６６に記載の方法。
６８．
パーフォリンに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのパーフォリンを発現する、及び／又は。
グランザイムＢに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのグランザイムＢを発現する、実施形態６６又は６７に記載の方法。
６９．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、腫瘍標的細胞に対する脱顆粒が可能であり、任意選択的に、脱顆粒が、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、実施形態１～６８のいずれかに記載の方法。
７０．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、脱顆粒を呈する、実施形態１～６９のいずれかに記載の方法。
７１．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、腫瘍標的細胞に対するインターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができ、任意選択的に、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファが、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、実施形態１～７０のいずれかに記載の方法。
７２．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する、実施形態１～７１のいずれかに記載の方法。
７３．エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－アルファである、実施形態７２に記載の方法。
７４．エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファである、実施形態７２又は７３に記載の方法。
７５．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、照射されたＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞とともに培養されたＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞のエクスビボ拡大によって産生されたものであり、ＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞が、ドナー対象由来の生体サンプルから濃縮される、実施形態１～７４のいずれかに記載の方法。
７６．ドナー対象が、ＣＭＶ－血清陽性である、実施形態７５に記載の方法。
７７．ドナー対象が、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型を有し、任意選択的に、生体サンプルが、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来する、実施形態７５又は７６に記載の方法。
７８．ドナー対象由来の末梢血サンプル中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも２０％又は約２０％が、ＮＫＧ２Ｃ（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）に対して陽性であり、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７０％が、ＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）に対して陰性又は低い、実施形態７５～７７のいずれかに記載の方法。
７９．照射されたフィーダー細胞が、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩを欠損している、実施形態７５～７７のいずれかに記載の方法。
８０．照射されたフィーダー細胞が、２２１．ＡＥＨ細胞である、実施形態７８又は７９に記載の方法。
８１．培養が、２つ以上の組換えサイトカインの存在下で実施され、少なくとも１つの組換えサイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）－２であり、少なくとも１つの組換えサイトカインが、ＩＬ－２１である、実施形態７９又は８０に記載の方法。
８２．組換えサイトカインが、ＩＬ－２１及びＩＬ－２である、実施形態８１に記載の方法。
８３．組換えサイトカインが、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５である、請求項８１に記載の方法。
８４．組成物中のｇ－ＮＫ細胞が、同じ生体サンプルから拡大された単一のドナー対象に由来する、実施形態１～８３のいずれかに記載の方法。
８５．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地中で製剤化され、任意選択的に、凍結保護剤が、ＤＭＳＯであり、凍結保存培地が、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、実施形態１～８４のいずれかに記載の方法。
８６．ｇ－ＮＫ細胞が、抗原受容体で操作されておらず、任意選択的に、抗原受容体が、キメラ抗原受容体である、実施形態１～８５のいずれかに記載の方法。
８７．ｇ－ＮＫ細胞が、分泌性サイトカインで、任意選択的に、ＩＬ－１５受容体融合物（ＩＬ－１５ＲＦ）などのサイトカイン受容体融合タンパク質で、操作されていない、実施形態１～８６のいずれかに記載の方法。
８８．方法が、ＮＫ細胞の生存又は拡大を支持するための対象への外因性サイトカイン投与を含まず、外因性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１のうちの１つ以上である、実施形態１～８７のいずれかに記載の方法。
８９．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１×１０８個又は約１×１０８個の細胞～５０×１０９個又は約５０×１０９個の細胞である、実施形態１～８８のいずれかに記載の方法。
９０．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０８個の細胞であるか、又は約５×１０８個の細胞である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９１．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０９個の細胞であるか、又は約５×１０９個の細胞である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９２．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１０×１０９個の細胞であるか、又は約１０×１０９個の細胞である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９３．ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与前に、対象が、リンパ球除去療法を受けている、実施形態１～９２のいずれかに記載の方法。
９４．リンパ球除去療法が、フルダラビン及び／又はシクロホスファミドを含む、実施形態９３に記載の方法。
９５．リンパ球除去が、２～４日間、毎日、２０～４０ｍｇ／ｍ２若しくは約２０～４０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３０ｍｇ／ｍ２若しくは約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン、及び／又は２～４日間、毎日、２００～４００ｍｇ／ｍ２若しくは約２００～４００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３００ｍｇ／ｍ２若しくは約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドの投与を含む、実施形態９３又は９４に記載の方法。
９６．リンパ球除去療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む、実施形態９４又は９５に記載の方法。
９７．リンパ球除去療法が、毎日、３０ｍｇ／ｍ２又は約３０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のフルダラビンと、毎日、３００ｍｇ／ｍ２又は約３００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のシクロホスファミドとの各々２～４日間、任意選択的に、３日間の投与を含む、実施形態１～９６のいずれかに記載の方法。
９８．ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、リンパ球除去療法の開始後の２週間以内又は２週間若しくは約２週間で開始される、実施形態１～９７のいずれかに記載の方法。
９９．ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、リンパ球除去療法の開始後の７日以内又は７日若しくは約７日で開始される、実施形態１～９７のいずれかに記載の方法。
１００．個体がヒトである、実施形態１～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．組成物中のＮＫ細胞が、個体に対して同種異系である、実施形態１～１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．外因性サイトカインサポートを投与して、対象におけるインビボのｇ－ＮＫ細胞の拡大又は持続を容易にすることを更に含み、任意選択的に、外因性サイトカインが、ＩＬ－１５であるか、又はＩＬ－１５を含む、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方法。
提供される実施形態の中には以下のものがある。
１．多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法。
２．方法が、多発性骨髄腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法である、実施形態１に記載の方法。
３．方法が、多発性骨髄腫抗原に対抗する抗体を対象に投与することを更に含む、実施形態１に記載の方法。
４．多発性骨髄腫抗原が、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、及びＢＣＭＡからなる群から選択される抗原を含む、実施形態３に記載の方法。
５．抗体が、完全長抗体である、実施形態３又は４に記載の方法。
６．抗体が、抗ＳＬＡＭＦ７抗体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
７．抗体が、抗ＢＣＭＡ抗体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
８．抗体が、抗ＣＤ３８抗体である、実施形態３～５のいずれか１つに記載の方法。
９．抗体が、二重特異性抗体である、実施形態３に記載の方法。
１０．二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＢＣＭＡ、ＳＬＡＭＦ７、及びＣＤ３８からなる群から選択される第２の多発性骨髄腫抗原に対抗する、実施形態９に記載の方法。
１１．二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ３８に対抗する、実施形態９又は１０に記載の方法。
１２．抗体が、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、週１回、又は週２回投与される、実施形態３～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている、実施形態８に記載の方法。
１４．多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の前投与を受けている、方法。
１５．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され、１４日周期が、１～３回繰り返される、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与される、実施形態１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブである、実施形態８及び１３～１６のいずれかに記載の方法。
１８．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
１９．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
２０．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法。
２１．抗ＣＤ３８抗体が、静脈内投与される、実施形態８及び１３～２０のいずれかに記載の方法。
２２．抗ＣＤ３８抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される、実施形態８及び１３～２１のいずれかに記載の方法。
２３．抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）の各用量が、８ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇ～約３２ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に、１６ｍｇ／ｋｇ又は約１６ｍｇ／ｋｇである量で投与される、請求項８及び１３～２２のいずれかに記載の方法。
２４．抗ＣＤ３８抗体が、皮下投与される、実施形態８及び１３～２０のいずれかに記載の方法。
２５．抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ３８抗体組成物で投与され、任意選択的に、抗ＣＤ３８抗体組成物が、ダラツムマブ及び組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）を含む、実施形態８、１３～２０、及び２４のいずれかに記載の方法。
２６．抗ＣＤ３８抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される、実施形態２５に記載の方法。
２７．抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む、実施形態２５又は２６に記載の方法。
２８．抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、約１８００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、約３０，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む、実施形態２４～２８のいずれかに記載の方法。
２９．方法が、抗ＣＤ３８抗体、任意選択的に、抗ＣＤ３８抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ３８抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与される、実施形態８及び１３～２８のいずれかに記載の方法。
３０．多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫である、実施形態１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．ｇ－ＮＫ細胞が、ＣＤ３８の低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＣＤ３８に対して陽性である、実施形態１～３０のいずれかに記載の方法。
３２．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＣＤ３８発現を低減又は排除するように操作されていない、実施形態１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈し、任意選択的に、ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈する、実施形態１～３２のいずれかに記載の方法。
３４．リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法。
３５．方法が、リンパ腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法である、実施形態３４に記載の方法。
３６．方法が、リンパ腫抗原に対抗する抗体を対象に投与することを更に含む、実施形態３４に記載の方法。
３７．リンパ腫抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される抗原を含む、実施形態３６に記載の方法。
３８．抗体が、完全長抗体である、実施形態３６又は３７に記載の方法。
３９．抗体が、抗ＣＤ１９抗体である、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．抗体が、抗ＣＤ３０抗体である、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４１．抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４２．抗体が、二重特異性抗体である、実施形態３６に記載の方法。
４３．二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される第２の抗原に対抗する、実施形態４２に記載の方法。
４４．二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ２０に対抗する、実施形態４３に記載の方法。
４５．抗体が、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、週１回、又は週２回投与される、実施形態３６～４５に記載の方法。
４６．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ある用量のｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に対象に投与されている、実施形態４１に記載の方法。
４７．リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され、対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の前投与を受けている、方法。
４８．リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、実施形態３４～４７のいずれかに記載の方法。
４９．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され、１４日周期が、１～３回繰り返される、実施形態３４～４８のいずれかに記載の方法。
５０．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与される、実施形態３４～４９のいずれかに記載の方法。
５１．抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、実施形態４１及び４５～５０のいずれかに記載の方法。
５２．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始される、実施形態４１及び４５～５１のいずれかに記載の方法。
５３．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始される、実施形態４１及び４５～５２のいずれかに記載の方法。
５４．少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の投与が、ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始される、実施形態４１及び４５～５３のいずれかに記載の方法。
５５．抗ＣＤ２０抗体が、静脈内投与される、実施形態４１及び４５～５４のいずれかに記載の方法。
５６．抗ＣＤ２０抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、４回又は８回の用量で投与される、実施形態４１及び４５～５５のいずれかに記載の方法。
５７．抗ＣＤ２０抗体の各用量が、２５０ｍｇ／ｍ２又は約２５０ｍｇ／ｍ２～５００ｍｇ／ｍ２、任意選択的に、３７５ｍｇ／ｍ２又は約３７５ｍｇ／ｍ２である量で投与される、実施形態４１及び４５～５６のいずれかに記載の方法。
５８．抗ＣＤ２０抗体が、皮下投与される、実施形態４１及び４５～５４のいずれかに記載の方法。
５９．抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ２０抗体組成物で投与され、任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体組成物が、リツキシマブ及びヒト組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０を含む、実施形態４１、４５～５４、及び５８のいずれかに記載の方法。
６０．抗ＣＤ２０抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、４回若しくは８回の用量で、又は任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体の静脈内の週１回の用量に続いて、３回若しくは７回の用量で、投与される、実施形態５９に記載の方法。
６１．抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６２．抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２３，４００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、実施形態５９～６１のいずれかに記載の方法。
６３．抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１６００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２６，８００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、実施形態５９～６１のいずれかに記載の方法。
６４．方法が、抗ＣＤ２０抗体、任意選択的に、抗ＣＤ２０抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む組成物の投与前に投与される、実施形態４１及び４５～６３のいずれかに記載の方法。
６５．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、細胞の６０％超若しくは約６０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の７０％超若しくは約７０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の８０％超若しくは約８０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、細胞の９０％超若しくは約９０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、又は細胞の９５％超若しくは約９５％超がｇ－ＮＫ細胞である、実施形態１～６４のいずれかに記載の方法。
６６．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％が、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγｎｅｇ）ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、パーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、グランザイムＢに対して陽性である、実施形態１～６４のいずれかに記載の方法。
６７．（ｉ）ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、（ｉｉ）ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、又は（ｉｉｉ）ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である、実施形態６５又は６６に記載の方法。
６８．
パーフォリンに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのパーフォリンを発現する、及び／又は。
グランザイムＢに対して陽性である細胞のうち、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのグランザイムＢを発現する、実施形態６６又は６７に記載の方法。
６９．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、腫瘍標的細胞に対する脱顆粒が可能であり、任意選択的に、脱顆粒が、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、実施形態１～６８のいずれかに記載の方法。
７０．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、脱顆粒を呈する、実施形態１～６９のいずれかに記載の方法。
７１．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、腫瘍標的細胞に対するインターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができ、任意選択的に、インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファが、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、実施形態１～７０のいずれかに記載の方法。
７２．ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する、実施形態１～７１のいずれかに記載の方法。
７３．エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－アルファである、実施形態７２に記載の方法。
７４．エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファである、実施形態７２又は７３に記載の方法。
７５．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、照射されたＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞とともに培養されたＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞のエクスビボ拡大によって産生されたものであり、ＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞が、ドナー対象由来の生体サンプルから濃縮される、実施形態１～７４のいずれかに記載の方法。
７６．ドナー対象が、ＣＭＶ－血清陽性である、実施形態７５に記載の方法。
７７．ドナー対象が、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型を有し、任意選択的に、生体サンプルが、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来する、実施形態７５又は７６に記載の方法。
７８．ドナー対象由来の末梢血サンプル中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも２０％又は約２０％が、ＮＫＧ２Ｃ（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）に対して陽性であり、末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７０％が、ＮＫＧ２Ａ（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）に対して陰性又は低い、実施形態７５～７７のいずれかに記載の方法。
７９．照射されたフィーダー細胞が、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩを欠損している、実施形態７５～７７のいずれかに記載の方法。
８０．照射されたフィーダー細胞が、２２１．ＡＥＨ細胞である、実施形態７８又は７９に記載の方法。
８１．培養が、２つ以上の組換えサイトカインの存在下で実施され、少なくとも１つの組換えサイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）－２であり、少なくとも１つの組換えサイトカインが、ＩＬ－２１である、実施形態７９又は８０に記載の方法。
８２．組換えサイトカインが、ＩＬ－２１及びＩＬ－２である、実施形態８１に記載の方法。
８３．組換えサイトカインが、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５である、請求項８１に記載の方法。
８４．組成物中のｇ－ＮＫ細胞が、同じ生体サンプルから拡大された単一のドナー対象に由来する、実施形態１～８３のいずれかに記載の方法。
８５．ｇ－ＮＫ細胞組成物が、凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地中で製剤化され、任意選択的に、凍結保護剤が、ＤＭＳＯであり、凍結保存培地が、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、実施形態１～８４のいずれかに記載の方法。
８６．ｇ－ＮＫ細胞が、抗原受容体で操作されておらず、任意選択的に、抗原受容体が、キメラ抗原受容体である、実施形態１～８５のいずれかに記載の方法。
８７．ｇ－ＮＫ細胞が、分泌性サイトカインで、任意選択的に、ＩＬ－１５受容体融合物（ＩＬ－１５ＲＦ）などのサイトカイン受容体融合タンパク質で、操作されていない、実施形態１～８６のいずれかに記載の方法。
８８．方法が、ＮＫ細胞の生存又は拡大を支持するための対象への外因性サイトカイン投与を含まず、外因性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１のうちの１つ以上である、実施形態１～８７のいずれかに記載の方法。
８９．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１×１０８個又は約１×１０８個の細胞～５０×１０９個又は約５０×１０９個の細胞である、実施形態１～８８のいずれかに記載の方法。
９０．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０８個の細胞であるか、又は約５×１０８個の細胞である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９１．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の５×１０９個の細胞であるか、又は約５×１０９個の細胞である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９２．ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、ｇ－ＮＫ細胞組成物の１０×１０９個の細胞であるか、又は約１０×１０９個の細胞である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９３．ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与前に、対象が、リンパ球除去療法を受けている、実施形態１～９２のいずれかに記載の方法。
９４．リンパ球除去療法が、フルダラビン及び／又はシクロホスファミドを含む、実施形態９３に記載の方法。
９５．リンパ球除去が、２～４日間、毎日、２０～４０ｍｇ／ｍ２若しくは約２０～４０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３０ｍｇ／ｍ２若しくは約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン、及び／又は２～４日間、毎日、２００～４００ｍｇ／ｍ２若しくは約２００～４００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）、任意選択的に、３００ｍｇ／ｍ２若しくは約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドの投与を含む、実施形態９３又は９４に記載の方法。
９６．リンパ球除去療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む、実施形態９４又は９５に記載の方法。
９７．リンパ球除去療法が、毎日、３０ｍｇ／ｍ２又は約３０ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のフルダラビンと、毎日、３００ｍｇ／ｍ２又は約３００ｍｇ／ｍ２（対象の体表面積）のシクロホスファミドとの各々２～４日間、任意選択的に、３日間の投与を含む、実施形態１～９６のいずれかに記載の方法。
９８．ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、リンパ球除去療法の開始後の２週間以内又は２週間若しくは約２週間で開始される、実施形態１～９７のいずれかに記載の方法。
９９．ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、リンパ球除去療法の開始後の７日以内又は７日若しくは約７日で開始される、実施形態１～９７のいずれかに記載の方法。
１００．個体がヒトである、実施形態１～９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．組成物中のＮＫ細胞が、個体に対して同種異系である、実施形態１～１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．外因性サイトカインサポートを投与して、対象におけるインビボのｇ－ＮＫ細胞の拡大又は持続を容易にすることを更に含み、任意選択的に、外因性サイトカインが、ＩＬ－１５であるか、又はＩＬ－１５を含む、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方法。
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、例示の目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
以下の実施例は、例示の目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１：異なるサイトカインの存在下におけるｇ－ＮＫ細胞の拡大
ＣＭＶ－血清陽性ドナーからの５０ｍＬの新鮮な全血（それぞれ、５６．２４％及び１１．６８％のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ及びＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞パーセンテージ）をＡＣＤバキュテイナチューブ内に収集し、ＰＢＳで１：１に希釈した。ＰＢＭＣを、製造者の説明書に従ってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣ含有バフィーコートを回収した後、ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄し、計数した。細胞計数後、磁気ビーズ分離を行って、ｇ－ＮＫ細胞の頻度を増加させた。磁気ビーズ分離は、ＣＤ５７ｐｏｓＮＫ細胞を単離するために、ＣＤ３枯渇、及びそれに続くＣＤ５７濃縮であった。
ＣＭＶ－血清陽性ドナーからの５０ｍＬの新鮮な全血（それぞれ、５６．２４％及び１１．６８％のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ及びＮＫＧ２ＡｎｅｇＮＫ細胞パーセンテージ）をＡＣＤバキュテイナチューブ内に収集し、ＰＢＳで１：１に希釈した。ＰＢＭＣを、製造者の説明書に従ってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣ含有バフィーコートを回収した後、ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄し、計数した。細胞計数後、磁気ビーズ分離を行って、ｇ－ＮＫ細胞の頻度を増加させた。磁気ビーズ分離は、ＣＤ５７ｐｏｓＮＫ細胞を単離するために、ＣＤ３枯渇、及びそれに続くＣＤ５７濃縮であった。
トランスジェニックリンパ腫細胞株２２１．ＡＥＨ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６０：４９５１－４９６０）及びトランスジェニック白血病細胞株Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ（Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９（９）：４０１０－４０１７）を、ＮＫ細胞拡大のためのフィーダー細胞として調製した。フィーダー細胞を新鮮な培養物（すなわち、凍結保存されていないストック）から採取し、使用前に照射した。２２１．ＡＥＨ及びＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞を５×１０５個の細胞／ｍＬの播種密度、及び２×１０５個の細胞／ｍＬの継代培養密度で拡大した。２２１．ＡＥＨフィーダー細胞を増殖させるために使用された培地は、１０％ＦＢＳ及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＲＰＭＩ－１６４０であった。Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬフィーダー細胞を増殖させるために使用された培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０であった。
凍結保存されていないＮＫ細胞を４つの異なる条件下で拡大させた：５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いた２：１のＡＥＨ対ＮＫ細胞比、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いた２：１のＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ対ＮＫ細胞比、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いた１：１：１のＡＥＨ対Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ対ＮＫ細胞比、並びに５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を用いた２：１のＡＥＨ対ＮＫ細胞比。全ての拡大を、５％ヒトＡＢ血清及びそれぞれのサイトカインを補充したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧＭＰ ＳＣＧＭ培地中で実施した。共培養細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で２１日間培養した。培地を交換又は補充するたびに（５、７、１０、１３、１６、１９、及び２１日目）細胞を計数し、ｇ－ＮＫのパーセンテージを０日目、１３日目、及び２１日目にフローサイトメトリーによって評価した。
図１Ａ～図１Ｂに示されるように、拡大培地へのＩＬ－２１の追加は、ｇ－ＮＫ細胞拡大の顕著な増加につながった。総ｇ－ＮＫ細胞数は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞について最も高かった（図１Ａ）。２１日目までのｇ－ＮＫ細胞の拡大倍数もまた、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞について最も高かった（図１Ｂ）。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在がｇ－ＮＫ細胞拡大を改善することを示す。
実施例２：異なるサイトカインの存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞の細胞エフェクター機能
この研究では、ＮＫ細胞エフェクター機能を、実施例１に説明されるように、ＩＬ－２１の存在下を含む、異なるフィーダー細胞及びサイトカインの存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞で測定した。アッセイを、標的細胞株ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓを０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて以下に説明されるように実施した。
この研究では、ＮＫ細胞エフェクター機能を、実施例１に説明されるように、ＩＬ－２１の存在下を含む、異なるフィーダー細胞及びサイトカインの存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞で測定した。アッセイを、標的細胞株ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓを０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて以下に説明されるように実施した。
Ａ．細胞媒介性細胞傷害
拡大されたＮＫ細胞の解凍時、１０４個のＮＫ細胞を、１：１のＮＫ細胞対ＭＭ細胞比で、１μｇ／ｍＬのダラツムマブ（抗ＣＤ３８）又は１μｇ／ｍＬのエロツズマブ（抗ＣＤ３１９）の存在下で、ＭＭ標的細胞と共培養した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃における４時間のインキュベート後、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３及びＣＤ５６抗体で染色して、ＮＫ細胞の数を定量化した。最後の洗浄後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を追加し、４色フローサイトメトリーを使用して、ＮＫ細胞、生存標的細胞、及び死滅標的細胞の数を解明した（Ｂｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８５：２３９－２５１）。
拡大されたＮＫ細胞の解凍時、１０４個のＮＫ細胞を、１：１のＮＫ細胞対ＭＭ細胞比で、１μｇ／ｍＬのダラツムマブ（抗ＣＤ３８）又は１μｇ／ｍＬのエロツズマブ（抗ＣＤ３１９）の存在下で、ＭＭ標的細胞と共培養した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃における４時間のインキュベート後、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３及びＣＤ５６抗体で染色して、ＮＫ細胞の数を定量化した。最後の洗浄後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を追加し、４色フローサイトメトリーを使用して、ＮＫ細胞、生存標的細胞、及び死滅標的細胞の数を解明した（Ｂｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８５：２３９－２５１）。
図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で２１日間拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図２Ａ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図２Ｂ）に対する細胞媒介性細胞傷害が大きかった。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい細胞媒介性細胞傷害が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する細胞媒介性細胞傷害を増強したことを示す。
Ｂ．脱顆粒
拡大されたＮＫ細胞の解凍時、２．０×１０５個のＮＫ細胞を、１：１のＮＫ細胞対ＭＭ細胞比で、１μｇ／ｍＬのダラツムマブ又は１μｇ／ｍＬのエロツズマブの存在下で、ＭＭ標的細胞と共培養した。脱顆粒アッセイについて、２μＬのＶｉｏＧｒｅｅｎコンジュゲート抗ＣＤ１０７ ａを、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃における１時間インキュベートにわたって共培養に追加して、その後、モネンシンを含有する４μＬのＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐを追加した。サイトカイン発現アッセイについて、ブレフェルジンＡを含有する６μＬのＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐを代わりに追加した。次いで、細胞を、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃における追加の５時間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、洗浄し、０．５μＬの抗ＣＤ４５抗体、０．５μＬの抗ＣＤ３抗体、及び１μＬの抗ＣＤ５６抗体（全ての抗体をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した）で染色した。次いで、細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＩｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して固定及び透過処理した。次いで、細胞を、表Ｅ１に説明されるように、１μＬの抗ＦｃＲγ、２μＬの抗パーフォリン、２μＬの抗グランザイムＢ、２μＬのインターフェロン－ガンマ、及び２μＬのＴＮＦ－アルファ抗体で染色した。最後の洗浄後、細胞を８色フローサイトメトリーを使用して解明した。
拡大されたＮＫ細胞の解凍時、２．０×１０５個のＮＫ細胞を、１：１のＮＫ細胞対ＭＭ細胞比で、１μｇ／ｍＬのダラツムマブ又は１μｇ／ｍＬのエロツズマブの存在下で、ＭＭ標的細胞と共培養した。脱顆粒アッセイについて、２μＬのＶｉｏＧｒｅｅｎコンジュゲート抗ＣＤ１０７ ａを、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃における１時間インキュベートにわたって共培養に追加して、その後、モネンシンを含有する４μＬのＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐを追加した。サイトカイン発現アッセイについて、ブレフェルジンＡを含有する６μＬのＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐを代わりに追加した。次いで、細胞を、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃における追加の５時間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、洗浄し、０．５μＬの抗ＣＤ４５抗体、０．５μＬの抗ＣＤ３抗体、及び１μＬの抗ＣＤ５６抗体（全ての抗体をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した）で染色した。次いで、細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＩｎｓｉｄｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して固定及び透過処理した。次いで、細胞を、表Ｅ１に説明されるように、１μＬの抗ＦｃＲγ、２μＬの抗パーフォリン、２μＬの抗グランザイムＢ、２μＬのインターフェロン－ガンマ、及び２μＬのＴＮＦ－アルファ抗体で染色した。最後の洗浄後、細胞を８色フローサイトメトリーを使用して解明した。
（表Ｅ１）機能アッセイのための抗体パネル
図３Ａ～図３Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図３Ａ及び図３Ｂ）並びに２１日後（図３Ｃ及び図３Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図３Ａ及び図３Ｃ）並びにＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図３Ｂ及び図３Ｄ）に対してより脱顆粒した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい脱顆粒が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する脱顆粒を増強したことを示す。
Ｃ．パーフォリン及びグランザイムＢの発現
図４Ａ～図４Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図４Ａ及び図４Ｂ）並びに２１日後（図４Ｃ及び図４Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、パーフォリン陽性細胞（図４Ａ及び図４Ｃ）並びに全パーフォリン発現（ＭＦＩ）（図４Ｂ及び図４Ｄ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くの細胞溶解タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、拡大の１３日後及び２１日後の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、グランザイムＢ陽性細胞（図４Ａ及び図４Ｃ）並びに全グランザイムＢ発現（ＭＦＩ）（図４Ｂ及び図４Ｄ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムＢを発現した。
図４Ａ～図４Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図４Ａ及び図４Ｂ）並びに２１日後（図４Ｃ及び図４Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、パーフォリン陽性細胞（図４Ａ及び図４Ｃ）並びに全パーフォリン発現（ＭＦＩ）（図４Ｂ及び図４Ｄ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くの細胞溶解タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、拡大の１３日後及び２１日後の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、グランザイムＢ陽性細胞（図４Ａ及び図４Ｃ）並びに全グランザイムＢ発現（ＭＦＩ）（図４Ｂ及び図４Ｄ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムＢを発現した。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、パーフォリン及びグランザイムＢの発現を増強したことを示す。
Ｄ．インターフェロン－γ発現
図５Ａ～図５Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図５Ａ及び図５Ｂ）並びに２１日後（図５Ｃ及び図５Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図５Ａ及び図５Ｃ）並びにＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図５Ｂ及び図５Ｄ）に対してより多くのインターフェロン－γを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいインターフェロン－γ発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図５Ａ～図５Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図５Ａ及び図５Ｂ）並びに２１日後（図５Ｃ及び図５Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図５Ａ及び図５Ｃ）並びにＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図５Ｂ及び図５Ｄ）に対してより多くのインターフェロン－γを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいインターフェロン－γ発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するインターフェロン－γ発現を増強したことを示す。
Ｅ．ＴＮＦ－α発現
図６Ａ～図６Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図６Ａ及び図６Ｂ）並びに２１日後（図６Ｃ及び図６Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図６Ａ及び図６Ｃ）並びにＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図６Ｂ及び図６Ｄ）に対してより多くのＴＮＦ－αを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいＴＮＦ－α発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図６Ａ～図６Ｄに示されるように、拡大の１３日後（図６Ａ及び図６Ｂ）並びに２１日後（図６Ｃ及び図６Ｄ）の両方で、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図６Ａ及び図６Ｃ）並びにＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図６Ｂ及び図６Ｄ）に対してより多くのＴＮＦ－αを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいＴＮＦ－α発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＴＮＦ－α発現を増強したことを示す。
実施例３：追加のサイトカインの存在下におけるｇ－ＮＫ細胞の拡大
別の研究では、サイトカイン混合物及び濃度の様々な組み合わせの存在下で拡大されたＮＫ細胞の拡大速度を比較した。実施例１及び上記に説明されたものと同じドナーからＮＫ細胞を回収した。ＮＫ細胞を、２×１０５個の細胞／ｍＬの密度及び継代培養密度の両方で播種し、それらを、２：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で、照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と共培養した。ＮＫ細胞拡大について、サイトカインを以下の濃度で追加した：１００ＩＵ／ｍＬ（低ＩＬ－２）若しくは５００ＩＵ／ｍＬ（ＩＬ－２）のＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８、及び／又は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２７。全ての拡大を、５％ヒトＡＢ血清及びそれぞれのサイトカインを補充したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧＭＰ ＳＣＧＭ培地中で実施した。
別の研究では、サイトカイン混合物及び濃度の様々な組み合わせの存在下で拡大されたＮＫ細胞の拡大速度を比較した。実施例１及び上記に説明されたものと同じドナーからＮＫ細胞を回収した。ＮＫ細胞を、２×１０５個の細胞／ｍＬの密度及び継代培養密度の両方で播種し、それらを、２：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で、照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と共培養した。ＮＫ細胞拡大について、サイトカインを以下の濃度で追加した：１００ＩＵ／ｍＬ（低ＩＬ－２）若しくは５００ＩＵ／ｍＬ（ＩＬ－２）のＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８、及び／又は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２７。全ての拡大を、５％ヒトＡＢ血清及びそれぞれのサイトカインを補充したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧＭＰ ＳＣＧＭ培地中で実施した。
図７に示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞は、単独で、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８、並びにＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２７の存在下で拡大されたＮＫ細胞よりも高いｇ－ＮＫ細胞拡大速度を有していた。最も高いｇ－ＮＫ細胞拡大速度につながるサイトカインの組み合わせは、ＩＬ－１５の存在下又は非存在下のいずれかにおいて、ＩＬ－２及びＩＬ－２１であった。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在が、他のサイトカイン混合物よりもｇ－ＮＫ細胞拡大速度を改善することを示す。
実施例４：追加のサイトカインの存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞の細胞エフェクター機能
ＮＫ細胞エフェクター機能を、実施例３に説明されるように、ＩＬ－２１の存在下を含む、サイトカインの存在下で１５日間拡大されたｇ－ＮＫ細胞で測定した。０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で標的細胞株ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓを使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて、実施例２に説明されるようにアッセイを実施した。
ＮＫ細胞エフェクター機能を、実施例３に説明されるように、ＩＬ－２１の存在下を含む、サイトカインの存在下で１５日間拡大されたｇ－ＮＫ細胞で測定した。０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で標的細胞株ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓを使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて、実施例２に説明されるようにアッセイを実施した。
Ａ．細胞媒介性細胞傷害
図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ａ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｂ）に対する細胞媒介性細胞傷害が大きかった。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい細胞媒介性細胞傷害が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ａ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｂ）に対する細胞媒介性細胞傷害が大きかった。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい細胞媒介性細胞傷害が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する細胞媒介性細胞傷害を増強したことを示す。
Ｂ．脱顆粒
図８Ｃ及び図８Ｄに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ｃ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｄ）に対してより脱顆粒した。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい脱顆粒を、抗体の非存在下を含む、全ての条件下で観察した。
図８Ｃ及び図８Ｄに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ｃ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｄ）に対してより脱顆粒した。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい脱顆粒を、抗体の非存在下を含む、全ての条件下で観察した。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する脱顆粒を増強したことを示す。
Ｃ．パーフォリン及びグランザイムＢの発現
図８Ｅ及び図８Ｆに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、パーフォリン陽性細胞（図８Ｅ）及び全パーフォリン発現（ＭＦＩ）（図８Ｆ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くの細胞溶解タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、グランザイムＢ陽性細胞（図８Ｅ）及び全グランザイムＢ発現（ＭＦＩ）（図８Ｆ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムＢを発現した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７の追加は、ｇ－ＮＫ細胞によるグランザイムＢ発現を増強した。
図８Ｅ及び図８Ｆに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、パーフォリン陽性細胞（図８Ｅ）及び全パーフォリン発現（ＭＦＩ）（図８Ｆ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くの細胞溶解タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、グランザイムＢ陽性細胞（図８Ｅ）及び全グランザイムＢ発現（ＭＦＩ）（図８Ｆ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムＢを発現した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７の追加は、ｇ－ＮＫ細胞によるグランザイムＢ発現を増強した。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、パーフォリン及びグランザイムＢの発現を増強したことを示す。
Ｄ．インターフェロン－γ発現
図８Ｇ及び図８Ｈに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ｇ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｈ）に対してより多くのインターフェロン－γを発現した。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいインターフェロン－γ発現を、抗体の非存在下を含む、全ての条件下で観察した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１の追加は、抗体の非存在下を含む、全ての条件下でｇ－ＮＫ細胞によるインターフェロン－γ発現を増強した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７の追加は、抗体の非存在下を含む、全ての条件下でｇ－ＮＫ細胞によるインターフェロン－γ発現を増強した。
図８Ｇ及び図８Ｈに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ｇ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｈ）に対してより多くのインターフェロン－γを発現した。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいインターフェロン－γ発現を、抗体の非存在下を含む、全ての条件下で観察した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１の追加は、抗体の非存在下を含む、全ての条件下でｇ－ＮＫ細胞によるインターフェロン－γ発現を増強した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７の追加は、抗体の非存在下を含む、全ての条件下でｇ－ＮＫ細胞によるインターフェロン－γ発現を増強した。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するインターフェロン－γ発現を増強したことを示す。
Ｅ．ＴＮＦ－α発現
図８Ｉ及び図８Ｊに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ｉ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｊ）に対してより多くのＴＮＦ－αを発現した。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいＴＮＦ－α発現を、抗体の非存在下を含む、全ての条件下で観察した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７の追加は、抗体の非存在下を含む、全ての条件下でｇ－ＮＫ細胞による抗体誘発ＴＮＦ－α発現を増強した。
図８Ｉ及び図８Ｊに示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図８Ｉ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図８Ｊ）に対してより多くのＴＮＦ－αを発現した。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいＴＮＦ－α発現を、抗体の非存在下を含む、全ての条件下で観察した。拡大培地へのＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２７の追加は、抗体の非存在下を含む、全ての条件下でｇ－ＮＫ細胞による抗体誘発ＴＮＦ－α発現を増強した。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＴＮＦ－α発現を増強したことを示す。
実施例５：ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞の拡大及び細胞エフェクター機能
この研究では、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞の拡大速度及びＮＫ細胞エフェクター機能を、ＩＬ－２１の非存在下で拡大されたＮＫ細胞のものと比較した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の説明書に従って、ＣＭＶ陽性ヒトドナー由来の全血から、又は比較のためにＣＭＶ－血清陰性ドナーから、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度遠心分離によって単離した。ドナーは、ＣＭＶ－血清陽性（ｎ＝８）及びＣＭＶ血清陰性（ｎ＝６）であった（年齢３７．８±１０．６歳、８人の男性及び６人の女性）。
この研究では、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞の拡大速度及びＮＫ細胞エフェクター機能を、ＩＬ－２１の非存在下で拡大されたＮＫ細胞のものと比較した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者の説明書に従って、ＣＭＶ陽性ヒトドナー由来の全血から、又は比較のためにＣＭＶ－血清陰性ドナーから、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）密度遠心分離によって単離した。ドナーは、ＣＭＶ－血清陽性（ｎ＝８）及びＣＭＶ血清陰性（ｎ＝６）であった（年齢３７．８±１０．６歳、８人の男性及び６人の女性）。
ＰＢＭＣをバフィーコートから回収し、洗浄し、フローサイトメトリーによって生存ＣＤ４５ｐｏｓ細胞について評価した。Ｔ細胞を除去するためのＣＤ３ｐｏｓ細胞の枯渇（ＣＤ３枯渇、ＣＤ３ｎｅｇ）、又はＣＤ５７ｐｏｓＮＫ細胞を濃縮するためのＣＤ３枯渇、それに続くＣＤ５７についての陽性選択（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓ）のいずれかによって、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ（商標）マイクロビーズを使用する免疫親和性ベースの磁気ビーズ分離によって、ＮＫ細胞を濃縮した。拡大前にＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞について最初に濃縮する後者の方法を、ｇ－ＮＫ細胞を拡大させるためのその後の実験において使用した。更なる比較として、ＮＫ細胞を、ＣＤ３枯渇によって濃縮し、その後、ＣＤ１６（濃縮ＣＤ１６ｐｏｓＮＫ細胞及び単球（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓ）に対する陽性選択に続けた。ＮＫ細胞を、２×１０５個の細胞／ｍＬの密度及び２×１０５個の細胞／ｍＬの継代培養密度で播種した。ＮＫ細胞を、２：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比でガンマ線照射された（１００ Ｇｙ）２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と共培養し、ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－２１（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下、又はＩＬ－２単独（５００ＩＵ／ｍＬ）で拡大した。実施例６に更に説明されるように、ＮＫ細胞の濃縮前にＰＢＭＣが凍結保存されていた場合、１：１の照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞対ＮＫ細胞の比を使用した。全ての拡大を、５％ヒトＡＢ血清及びそれぞれのサイトカインを補充したＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧＭＰ ＳＣＧＭ培地中で実施した。ＮＫ細胞を２週間拡大させ、培地を２～５日毎に交換した。拡大されたＮＫ細胞を、機能アッセイにおいて後で使用するために、９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを使用して凍結保存した。
拡大及び細胞エフェクター機能を、拡大の１４日後に評価した。０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で標的細胞株ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓを使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて、実施例２に説明されるようにアッセイを実施した。
後続の実施例に説明されるいくつかの研究では、ｇ－ＮＫ細胞の表現型及び機能的活性をｃＮＫ細胞と比較した。ＣＭＶ－血清陰性ドナーからのｃＮＫ細胞の不十分な収量及び上記に説明される方法を使用したＣＭＶ－血清陽性ドナーからのｇ－ＮＫ細胞の優先的な拡大（以下のセクションＡに説明される結果）に起因して、代替的な方法を使用して、インビトロ機能研究及びインビボ研究のためにｃＮＫ細胞を拡大させた。この拡大方法は、Ｋ６５２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬフィーダー細胞及び５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を使用して、２週間にわたってｃＮＫ細胞を１８０±８９倍（ｎ＝５のＣＭＶｎｅｇ）に拡大させた（Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８（９）：４０１０－４０１７）。５人のＣＭＶｎｅｇドナー（年齢３８．９±９．８歳、３人の男性及び２人の女性）におけるｇ－ＮＫ細胞の割合は、拡大前に１．５±０．５％であり、拡大後に１．６±０．４％であった。
Ａ．ｇ－ＮＫ細胞の拡大速度
培地交換時に細胞を計数し、０日目及び１４日目にフローサイトメトリーによってｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージを評価した。図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、拡大前にＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞について最初に濃縮され、次いで、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞は、同様の条件であるがＩＬ－２１を含まない条件よりも高いｇ－ＮＫ細胞拡大速度を有した。ＦｃＲγの細胞内染色及びフローサイトメトリーを使用して測定された場合、ｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージ（図９Ａ）及び計数（図９Ｂ）の両方を測定したときに、より高いｇ－ＮＫ細胞拡大速度が観察された。
培地交換時に細胞を計数し、０日目及び１４日目にフローサイトメトリーによってｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージを評価した。図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、拡大前にＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞について最初に濃縮され、次いで、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞は、同様の条件であるがＩＬ－２１を含まない条件よりも高いｇ－ＮＫ細胞拡大速度を有した。ＦｃＲγの細胞内染色及びフローサイトメトリーを使用して測定された場合、ｇ－ＮＫ細胞のパーセンテージ（図９Ａ）及び計数（図９Ｂ）の両方を測定したときに、より高いｇ－ＮＫ細胞拡大速度が観察された。
拡大前に、ＣＭＶ血清陽性ドナーにおけるｇ－ＮＫ細胞の割合は、３０．８±３．１％（総ＮＫ細胞の％）であったが、ＣＭＶ血清陰性ドナーにおけるｇ－ＮＫ細胞の割合は、わずか１．８±０．３％（総ＮＫ細胞の％）であった。ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞についての最初の濃縮後の拡大に続いて、ｇ－ＮＫ細胞の割合は、ＣＭＶ－血清陽性ドナーについて８４．０±１．４％に増加したが、ＣＭＶ血清陰性ドナーについては変化しなかった（１．５±０．４％）（図９Ｃ）。ＣＭＶ血清陽性及び血清陰性ドナーにおけるｇ－ＮＫ細胞の割合を図示する代表的なフローサイトメトリードットプロット及びヒストグラムが図９Ｅ及び図９Ｆに示される。ｇ－ＮＫサブセット内のＮＫＧ２Ｃｐｏｓ／ＮＫＧ２Ａｎｅｇ ＮＫ細胞のパーセンテージは、１．７～５１％（２６．８±１３．９％）の範囲であった。したがって、ｇ－ＮＫとＮＫＧ２Ｃｐｏｓ／ＮＫＧ２ＣｎｅｇＮＫ細胞との間には表現型の重複が存在するが、それらは同一ではない。
ｇ－ＮＫ細胞の代表的な拡大が図９Ｄに示され、拡大方法が、検出可能なｇ－ＮＫ集団を有するＣＭＶ－血清陽性ドナー由来のｇ－ＮＫ細胞の割合を増加させ、全ＮＫ細胞数が少なくとも４００倍増加したことが示される。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在がｇ－ＮＫ細胞拡大を改善することを示す。
Ｂ．細胞媒介性細胞傷害
図９Ｇ及び図９Ｈに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｇ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｈ）に対する細胞媒介性細胞傷害が大きかった。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい細胞媒介性細胞傷害が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図９Ｇ及び図９Ｈに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｇ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｈ）に対する細胞媒介性細胞傷害が大きかった。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい細胞媒介性細胞傷害が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する細胞媒介性細胞傷害を増強したことを示す。
Ｃ．脱顆粒
図９Ｉ及び図９Ｊに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｉ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｊ）に対してより脱顆粒した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい脱顆粒が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図９Ｉ及び図９Ｊに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｉ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｊ）に対してより脱顆粒した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きい脱顆粒が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する脱顆粒を増強したことを示す。
Ｄ．パーフォリン及びグランザイムＢの発現
図９Ｋ及び図９Ｌに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、パーフォリン陽性細胞のパーセンテージではなく（図９Ｋ）、総パーフォリン発現（図９Ｌ）によって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くの細胞溶解タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、グランザイムＢ陽性細胞（図９Ｋ）及び全グランザイムＢ発現（ＧＭＦＩ）（図９Ｌ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムＢを発現した。
図９Ｋ及び図９Ｌに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、パーフォリン陽性細胞のパーセンテージではなく（図９Ｋ）、総パーフォリン発現（図９Ｌ）によって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くの細胞溶解タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、グランザイムＢ陽性細胞（図９Ｋ）及び全グランザイムＢ発現（ＧＭＦＩ）（図９Ｌ）の両方のパーセンテージによって測定される際、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムＢを発現した。
パーフォリン（図９Ｍ、左）及びグランザイムＢ（図９Ｍ、右）のベースライン発現もまた、ｃＮＫ細胞よりも、拡大されたｇ－ＮＫ細胞において有意に高かった（ｎ＝５）。ＮＫ及びｃＮＫ細胞についてのパーフォリン及びグランザイムＢの発現の代表的なヒストグラムが図９Ｎに示される。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するパーフォリン及びグランザイムＢの発現を増強したことを示す。
Ｅ．インターフェロン－γ発現
図９Ｏ及び図９Ｐに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｏ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｐ）に対するより多くのインターフェロン－γを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいインターフェロン－γ発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図９Ｏ及び図９Ｐに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｏ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｐ）に対するより多くのインターフェロン－γを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいインターフェロン－γ発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するインターフェロン－γ発現を増強したことを示す。
Ｆ．ＴＮＦ－α発現
図９Ｑ及び図９Ｒに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｑ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｒ）に対するより多くのＴＮＦ－αを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいＴＮＦ－α発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図９Ｑ及び図９Ｒに示されるように、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図９Ｑ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図９Ｒ）に対するより多くのＴＮＦ－αを発現した。ＩＬ－２１拡大されたｇ－ＮＫ細胞についてのより大きいＴＮＦ－α発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞が、ＩＬ－２１を伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対するＴＮＦ－α発現を増強したことを示す。
Ｇ．ｇ－ＮＫドナー間のエフェクター機能の比較
ｇ－ＮＫ細胞及びｃＮＫ細胞を説明されるように拡大させ、エフェクター活性を異なるドナー間で比較した。０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で標的細胞株及びＭＭ．１Ｓを使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて、実施例２に説明されるようにアッセイを実施した。共培養後、細胞を固定し、透過処理し、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）及びＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦα）に対する細胞内サイトカイン染色によって分析した。図９Ｓ（ＩＦＮγ）及び図９Ｔ（ＴＮＦα）に図示される結果は、ｇ－ＮＫドナー間のドナー変動性が低いことを示し、ｍＡｂ依存性ＩＦＮγ及びＴＮＦα応答に対する標準誤差が５未満である。他のエフェクター機能についても同様の結果が見られた。結果は、全てのｇ－ＮＫドナーのエフェクター機能が、試験された全てのｃＮＫドナーよりも優れていたことを示した。
ｇ－ＮＫ細胞及びｃＮＫ細胞を説明されるように拡大させ、エフェクター活性を異なるドナー間で比較した。０．５：１のＮＫ対ＭＭ細胞比で標的細胞株及びＭＭ．１Ｓを使用し、抗体ダラツムマブ及びエロツズマブを用いて、実施例２に説明されるようにアッセイを実施した。共培養後、細胞を固定し、透過処理し、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）及びＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦα）に対する細胞内サイトカイン染色によって分析した。図９Ｓ（ＩＦＮγ）及び図９Ｔ（ＴＮＦα）に図示される結果は、ｇ－ＮＫドナー間のドナー変動性が低いことを示し、ｍＡｂ依存性ＩＦＮγ及びＴＮＦα応答に対する標準誤差が５未満である。他のエフェクター機能についても同様の結果が見られた。結果は、全てのｇ－ＮＫドナーのエフェクター機能が、試験された全てのｃＮＫドナーよりも優れていたことを示した。
実施例６：ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体の存在下におけるｇ－ＮＫ細胞の拡大
凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、磁気選別を介してＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＮＫ細胞について濃縮した。これらのＮＫ細胞の拡大前に、ＩＬ－２１と抗ＩＬ－２１抗体とを組み合わせることによって、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体を形成した。ＩＬ－２１及び抗ＩＬ－２１抗体を、それぞれ、２５ｎｇ／ｍＬ及び２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で３０分間共培養した。次いで、複合体を、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とともに、ＮＫ細胞拡大培地に追加した。ＮＫ細胞を、照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と、１：１のＮＫ対２２１．ＡＥＨフィーダー細胞比で共培養した。比較のために、ＮＫ細胞もまた、それぞれ、５００ＩＵ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大させた。
凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、磁気選別を介してＣＤ３ｎｅｇＣＤ５７ｐｏｓＮＫ細胞について濃縮した。これらのＮＫ細胞の拡大前に、ＩＬ－２１と抗ＩＬ－２１抗体とを組み合わせることによって、ＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体を形成した。ＩＬ－２１及び抗ＩＬ－２１抗体を、それぞれ、２５ｎｇ／ｍＬ及び２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、３７℃で３０分間共培養した。次いで、複合体を、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５とともに、ＮＫ細胞拡大培地に追加した。ＮＫ細胞を、照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と、１：１のＮＫ対２２１．ＡＥＨフィーダー細胞比で共培養した。比較のために、ＮＫ細胞もまた、それぞれ、５００ＩＵ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大させた。
図１０に示されるように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１／抗ＩＬ－２１複合体の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞よりも高い拡大速度を有した。
実施例７：凍結保存後のｇ－ＮＫ細胞エフェクター機能の維持
予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞のＮＫ細胞エフェクター機能を、新たに濃縮された（すなわち、凍結保存されていない）ｇ－ＮＫ細胞のものと比較した（ｎ＝４）。ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ濃縮されたＮＫ細胞を、照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と２：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１の存在下で共培養した。拡大後、ＮＫ細胞を新鮮な状態で機能的に評価するか、又は１０％ＤＭＳＯを含む９０％ＦＢＳ中、凍結保存培地１．８ｍｌ当たり２０００万個の細胞の濃度で凍結保存した。ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓ細胞株に対するＮＫセルエフェクター機能を、抗体を伴わずに、１μｇ／ｍＬダラツムマブ又は１μｇ／ｍＬエロツズマブの存在下で評価した。
予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞のＮＫ細胞エフェクター機能を、新たに濃縮された（すなわち、凍結保存されていない）ｇ－ＮＫ細胞のものと比較した（ｎ＝４）。ＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ濃縮されたＮＫ細胞を、照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞と２：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で、５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５、及び２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１の存在下で共培養した。拡大後、ＮＫ細胞を新鮮な状態で機能的に評価するか、又は１０％ＤＭＳＯを含む９０％ＦＢＳ中、凍結保存培地１．８ｍｌ当たり２０００万個の細胞の濃度で凍結保存した。ＬＰ１及びＭＭ．１Ｓ細胞株に対するＮＫセルエフェクター機能を、抗体を伴わずに、１μｇ／ｍＬダラツムマブ又は１μｇ／ｍＬエロツズマブの存在下で評価した。
Ａ．脱顆粒
図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図１１Ａ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図１１Ｂ）に対して、新鮮なｇ－ＮＫ細胞の脱顆粒レベルに匹敵する脱顆粒レベルを有した。同等の脱顆粒が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図１１Ａ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図１１Ｂ）に対して、新鮮なｇ－ＮＫ細胞の脱顆粒レベルに匹敵する脱顆粒レベルを有した。同等の脱顆粒が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、多発性骨髄腫標的細胞に応答したｇ－ＮＫ細胞脱顆粒が、凍結保存後に維持されることを示す。
Ｂ．パーフォリン及びグランザイムＢの発現
図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、新鮮なｇ－ＮＫ細胞のものに匹敵するパーフォリン（図１１Ｃ）及びグランザイムＢ発現（図１１Ｄ）を有した。まとめると、これらの結果は、ｇ－ＮＫ細胞パーフォリン及びグランザイムＢの発現が、凍結保存後に維持されることを示す。
図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、新鮮なｇ－ＮＫ細胞のものに匹敵するパーフォリン（図１１Ｃ）及びグランザイムＢ発現（図１１Ｄ）を有した。まとめると、これらの結果は、ｇ－ＮＫ細胞パーフォリン及びグランザイムＢの発現が、凍結保存後に維持されることを示す。
Ｃ．インターフェロン－γ発現
図１１Ｅ及び図１１Ｆに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図１１Ｅ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図１１Ｆ）に対して、新鮮なｇ－ＮＫ細胞のインターフェロン－γ発現レベルに匹敵するインターフェロン－γ発現レベルを有した。同等のインターフェロン－γ発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図１１Ｅ及び図１１Ｆに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図１１Ｅ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図１１Ｆ）に対して、新鮮なｇ－ＮＫ細胞のインターフェロン－γ発現レベルに匹敵するインターフェロン－γ発現レベルを有した。同等のインターフェロン－γ発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、多発性骨髄腫標的細胞に応答したｇ－ＮＫ細胞のインターフェロン－γ発現が、凍結保存後に維持されることを示す。
Ｄ．ＴＮＦ－α発現
図１１Ｇ及び図１１Ｈに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図１１Ｇ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図１１Ｈ）に対して、新鮮なｇ－ＮＫ細胞のＴＮＦ－α発現レベルと比較して、低下したＴＮＦ－α発現レベルを有した。低下したＴＮＦ－α発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
図１１Ｇ及び図１１Ｈに示されるように、予め凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞は、ＣＤ３８ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＬＰ１（図１１Ｇ）及びＳＬＡＭＦ７ｈｉｇｈＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓ（図１１Ｈ）に対して、新鮮なｇ－ＮＫ細胞のＴＮＦ－α発現レベルと比較して、低下したＴＮＦ－α発現レベルを有した。低下したＴＮＦ－α発現が、抗体の非存在下、及びダラツムマブ又はエロツズマブのいずれかの存在下で観察された。
まとめると、これらの結果は、多発性骨髄腫標的細胞に応答したｇ－ＮＫ細胞のＴＮＦ－α発現が、凍結保存後に減少することを示す。
実施例８：ｃＮＫ細胞と比較したインビボにおけるｇ－ＮＫ細胞の持続性の評価
実施例５に説明されるように実質的に拡大されたＮＫ細胞をマウスに注射し、生体サンプルをフローサイトメトリーを使用する分析に供して、それらの持続性を評価した。
実施例５に説明されるように実質的に拡大されたＮＫ細胞をマウスに注射し、生体サンプルをフローサイトメトリーを使用する分析に供して、それらの持続性を評価した。
実施例５に説明されるように、ｇ－ＮＫ細胞を、凍結保存されたＰＢＭＣからのＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞について最初に濃縮した後に拡大させ、続いて、ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－２１（２５ｎｇ／ｍＬ）の刺激性サイトカインの存在下で、１：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞を用いて拡大させた。ＣＭＶ－血清陰性ドナーからのｃＮＫ細胞の不順分な収量に起因して、実施例５に説明される代替的な方法を使用して、ｃＮＫ細胞を拡大させた。トランスジェニック白血病細胞株Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ及びＩＬ－２を使用して、ｃＮＫ細胞を２週間拡大させた。全ての細胞を、凍結保存されたＰＢＭＣ及び凍結保存されたフィーダー細胞から拡大させた。凍結保存された細胞のための凍結培地は、ＣＳ－１０（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌ、ＷＡ、ＵＳＡ）であった。凍結保存された細胞産物を、マウスに投与する前に湯浴中で急速に解凍した（３７℃）。
単回用量の１×１０７個の拡大されたＮＫ細胞（新鮮なｇ－ＮＫ、凍結保存されたｇ－ＮＫ、又は凍結保存されたｃＮＫ細胞）を、尾静脈を介して雌ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋＤｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに静脈内注射した（ｎ＝９、３／群）。ＮＫ細胞支持を提供するために、約２μｇ／マウスのヒト組換えＩＬ－１５を、３日毎にＩ．Ｐ．経路を介して投与した（表２を参照されたい）。注入後６、１６、２６、及び３１日目に収集した血液を、フローサイトメトリーによって即時に分析した。マウスを３１日目に屠殺し、骨髄及び脾臓を即時フローサイトメトリー分析のために回収した。
（表２）持続性研究設計
図１２Ａ～図１２Ｃは、末梢血（図１２Ａ）、脾臓（図１２Ｂ）、及び骨髄（図１２Ｃ）におけるｃＮＫ細胞に対する、新鮮な及び凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞の増強された持続性を示す。凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞の持続性は、複数の時点で末梢血において（ｐ＜０．００１）（図１２Ａ）、並びに３１日目の屠殺時に脾臓（ｐ＜０．００１）（図１２Ｂ）及び骨髄（ｐ＜０．０５）（図１２Ｃ）において、凍結保存されたｃＮＫ細胞で見られたものよりも＞９０％高かった（ｐ＜０．００１）。図１２Ａはまた、新鮮な及び凍結保存されたｇ－ＮＫ細胞のレベルが、試験の少なくとも２６日目まで同等のレベルで持続したことを示す。
結果は、ｇ－ＮＫ細胞が有意に改善された持続性を呈するという観察と一致する。これらの結果は、ｍＡｂ ＡＤＣＣを増強するための実行可能な既製の細胞療法としての新鮮な又は凍結保存されたｇ－ＮＫの有用性を実証する。
実施例９：ｇ－ＮＫ細胞上のＣＤ３８及びＳＬＡＭＦ７の評価並びにｇ－ＮＫ細胞のフラトリサイド活性
本実施例は、部分的に、標的表面マーカーの欠如に起因する抗体からのｇ－ＮＫ細胞の保護を実証する。
本実施例は、部分的に、標的表面マーカーの欠如に起因する抗体からのｇ－ＮＫ細胞の保護を実証する。
ｇ－ＮＫ細胞を、特定の例外を除いて実施例５に説明される方法によって実質的に拡大させた。１）２２．ＡＥＨ標的細胞対ＮＫ細胞の比は、２．５：１（実施例５における２：１の比と比較して）であり、２）ＮＫ細胞は、より低いレベルのＩＬ－２（実施例５における５００ＩＵ／ｍｌと比較して１００ＩＵ／ｍｌ）に曝露され、３）拡大中にＩＬ－２１は存在しなかった。およそ２．０×１０５個のＮＫ細胞及び／又はＭＭ．１Ｓ若しくはＲａｊｉ細胞をフローチューブ内に分注し、表Ｅ３に説明されるように、２μＬの７－ＡＡＤ生存色素、並びに２μＬの抗ＣＤ４５、２μＬの抗ＣＤ２０、２μＬの抗ＣＤ３８、２μＬの抗ＣＤ３、１０μＬの抗ＳＬＡＭＦ７、及び２μＬの抗ＣＤ５６抗体で染色した。４℃で１０分間のインキュベート後、細胞を洗浄し、抗ＦｃｅＲＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞内染色を実施した。染色プロセスの完了後、ｇ－ＮＫ、ｃＮＫ、及びＭＭ．１Ｓ又はＲａｊｉ細胞を発現するＣＤ２０、ＣＤ３８、及びＳＬＡＭＦ７のパーセンテージを、８色フローサイトメトリー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０）によって評価した。
（表Ｅ３）ＮＫ、ＭＭ、及びＲａｊｉ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ３８、及びＳＬＡＭＦ７発現を決定するためのフローサイトメトリーパネル
＊ＦｃＲｇは細胞内エピトープである。
ｇ－ＮＫ、ｃＮＫ、及びＭＭ．１Ｓ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ３８、及びＳＬＡＭＦ７の発現が図１３Ａ～図１３Ｄに提示される。ｇ－ＮＫ及びｃＮＫの両方は、Ｒａｊｉリンパ腫細胞上で高度に発現されたＣＤ２０の発現を欠いていた（図１３Ａ）。ｇ－ＮＫによるＣＤ３８の発現は、ｃＮＫ及びＭＭ．１Ｓ細胞よりもはるかに少なかった（図１３Ｂ参照、両方についてｐ＜０．００１）。ＳＬＡＭＦ７の発現は、ｇ－ＮＫとｃＮＫとの間で異ならなかったが（ｐ＝０．９）、ｇ－ＮＫ及びｃＮＫの両方が、ＭＭ．１Ｓ細胞よりもはるかに低いＳＬＡＭＦ７の発現を呈した（図１３Ｃ参照、両方についてｐ＜０．００１）。拡大されたｃＮＫと比較したとき、拡大されたｇ－ＮＫにおいてもＣＤ３８ｐｏｓＮＫ細胞の低減されたパーセンテージが見られた（図１３Ｄ参照、ｐ＜０．００１）。更に、ＣＤ３８発現の強度（ＭＦＩ）は、ＣＤ３８ｐｏｓ ｃＮＫ及びＭＭ１／Ｓ細胞に対して、ＣＤ３８ｐｏｓ ｇ－ＮＫ細胞上で低減された（図１３Ｅ、ｐ＜０．００１）。ｃＮＫ及びＭＭ．１Ｓ細胞に対するｇ－ＮＫ細胞の低減されたＣＤ３８発現を図示する代表的なヒストグラムが、図１３Ｆに示される。
ｇ－ＮＫによるＣＤ２０、ＣＤ３８、又はＳＬＡＭＦ７発現の欠如は、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）、又はエロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）によるｍＡｂ誘発フラトリサイドからの保護をもたらした。全体として、このデータは、特にダラツムマブなどの治療用抗体の存在下にあるとき、ｃＮＫと比較してｇ－ＮＫがどのように持続性の利点を有するかを更に例示している。
同様の結果が、ＩＬ－２１の存在下で実施例５に説明される拡大方法によって観察され、これは、ＩＬ－２１を伴うか又は伴わずに拡大されたｇ－ＮＫ細胞間でＣＤ３８又はＳＬＡＭＦ７発現に差がないことを示す。更なる評価では、拡大されたｇ－ＮＫ細胞のフラトリサイド速度を、拡大されたｃＮＫ細胞のものと比較した。図１３Ｂ及び図１３Ｄ～図１３Ｆに示されるように、ＣＤ３８発現は、ｃＮＫ細胞よりもｇ－ＮＫ細胞上で顕著に低く、図１３Ｃに示されるように、同等に低いレベルのＳＬＡＭＦ７がｇ－ＮＫ及びｃＮＫ細胞上に存在した。これらの結果は、ＮＫ細胞がｍＡｂ標的を発現する場合、ＡＤＣＣ活性が、腫瘍に加えて、フラトリサイドによるＮＫ細胞の排除につながり得るため、これらの標的に対するｇ－ＮＫ細胞によるフラトリサイド効果の欠如の潜在性を示す。ｃＮＫ細胞が高レベルのＣＤ３８を発現するという発見は、患者におけるダラツムマブ治療後に＞９０％のＣＤ３８ｈｉｇｈＮＫ細胞が急速に枯渇することを示唆する以前の結果と一致している（Ｃａｓｎｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ，１（２３）：２１０５－２１１４）。
実質的に実施例５に説明される方法を使用して、６人の固有のドナーを使用して、拡大されたｇ－ＮＫ（６ＣＭＶ＋、３Ｍ、３Ｆ、３９±７歳）を生成し、８人の固有のドナーを使用して、ｃＮＫ（８ＣＭＶ－、４Ｍ、４Ｆ、３８±９歳）を拡大させた。ｇ－ＮＫの割合は、ｇ－ＮＫドナーについては８５±４％であり、ｃＮＫドナーについては２±１％であった。
フラトリサイドを評価するために、約１×１０４個の拡大されたＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ又はｃＮＫ）を、１μｇ／ｍＬのダラツムマブ（抗ＣＤ３８）の存在下で培養した。５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で４時間のインキュベート後、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５６抗体で染色して、ＮＫ細胞の数を定量化した。最後の洗浄後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を追加し、３色フローサイトメトリーを使用して、生存及び死滅ＮＫ標的細胞の数を解明した（Ｂｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８５：２３９－２５１）。図１３Ｇに示されるように、ｇ－ＮＫ細胞は、ｃＮＫよりも１３倍低いフラトリサイドを有する。エロツズマブを用いて実施された同様の実験は、エロツズマブで処置されたｇ－ＮＫ又はｃＮＫについては、フラトリサイドが検出されなかったことを示した。
ＩＬ－２１の非存在下で拡大されたｇ－ＮＫ細胞の結果と合わせて、これらの結果は、ｇ－ＮＫ細胞が、フラトリサイド関連枯渇に罹患することなく、ＭＭにおいて増強されたｍＡｂ抗腫瘍活性を付与する能力と一致する。
実施例１０：多発性骨髄腫の播種性同所性異種移植片ＭＭ．１Ｓモデルにおけるインビボ有効性
ダラツムマブと組み合わせたＮＫ細胞（拡大されたｇ－ＮＫ細胞又はｃＮＫ細胞）のインビボ有効性を、多発性骨髄腫のマウスモデルにおける腫瘍阻害及び生存を測定することによって評価した。実施例５に説明されるように、ｇ－ＮＫ細胞を、凍結保存されたＰＢＭＣからのＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞について最初に濃縮した後に拡大させ、続いて、ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－２１（２５ｎｇ／ｍＬ）の刺激性サイトカインの存在下で、１：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞を用いて拡大させた。ＣＭＶ－血清陰性ドナーからのｃＮＫ細胞の不順分な収量に起因して、実施例５に説明される代替的な方法を使用して、ｃＮＫ細胞を拡大させた。トランスジェニック白血病細胞株Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ及びＩＬ－２を使用して、ｃＮＫ細胞を２週間拡大させた。全ての細胞を、凍結保存されたＰＢＭＣ及び凍結保存されたフィーダー細胞から拡大させた。
ダラツムマブと組み合わせたＮＫ細胞（拡大されたｇ－ＮＫ細胞又はｃＮＫ細胞）のインビボ有効性を、多発性骨髄腫のマウスモデルにおける腫瘍阻害及び生存を測定することによって評価した。実施例５に説明されるように、ｇ－ＮＫ細胞を、凍結保存されたＰＢＭＣからのＣＤ３ｎｅｇ／ＣＤ５７ｐｏｓ細胞について最初に濃縮した後に拡大させ、続いて、ＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－２１（２５ｎｇ／ｍＬ）の刺激性サイトカインの存在下で、１：１の２２１．ＡＥＨ対ＮＫ細胞比で照射された２２１．ＡＥＨフィーダー細胞を用いて拡大させた。ＣＭＶ－血清陰性ドナーからのｃＮＫ細胞の不順分な収量に起因して、実施例５に説明される代替的な方法を使用して、ｃＮＫ細胞を拡大させた。トランスジェニック白血病細胞株Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ及びＩＬ－２を使用して、ｃＮＫ細胞を２週間拡大させた。全ての細胞を、凍結保存されたＰＢＭＣ及び凍結保存されたフィーダー細胞から拡大させた。
およそ５×１０５個のルシフェラーゼ標識ＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞を、雌ＮＳＧマウスの尾静脈に静脈内注射し、１４日間成長させた。モノクローナル抗体ダラツムマブを、週１回、５週間の持続期間にわたって、６．０×１０６個の拡大されたｇ－ＮＫ又はｃＮＫ細胞の静脈内投与と組み合わせてＩ．Ｐ．経路を介して投与した。腫瘍投与の２週間後に開始して、２μｇ／マウスヒト組換えＩＬ－１５を、Ｉ．Ｐ．経路を介して３日毎に投与して、ＮＫ細胞支持を提供した。表４は、研究において治療されたマウスの群を要約する。
生物発光イメージング（Bioluminescence imaging、ＢＬＩ）を週２回実施して、腫瘍量を監視した。マウスを不快感及び忍容性の徴候について毎日チェックし、腫瘍接種の１週間後に開始して週２回体重を測定した。マウスを、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンの皮下注射の１５分後にイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、マウス全体の全光束（光子／秒）を定量化した。腫瘍保有マウスを、後肢麻痺、グルーミング、及び／又は無気力などの症状のある骨髄腫の発症時に屠殺した。屠殺までの時間を、生存の代用として使用した。全ての生存マウスを、組織収集のために最初のＮＫ細胞投与の４３日後に屠殺した。研究の完了時に、フローサイトメトリーを使用して、生体サンプル由来のｇ－ＮＫ、ｃＮＫ、及びＭＭ．１Ｓ（ＣＤ１３８ｐｏｓ／ＣＤ４５ｎｅｇ）細胞を定量化して、腫瘍量及びＮＫ細胞生存を決定した。
（表Ｅ４）ＭＭ有効性研究設計
ｇ－ＮＫ及びダラツムマブの同時投与は、ｃＮＫ及びダラツムマブによる治療と比較して、有意な腫瘍阻害及び増強された生存率を結果的にもたらした。図１４Ａに示されるように、ｇ－ＮＫ細胞＋ダラツムマブは、５週間の治療後のＢＬＩイメージングによって証明された７匹のマウスのうちの５匹において骨髄腫腫瘍量を排除した。定量的ＢＬＩ分析は、ｇ－ＮＫ＋ダラツムマブが持続的及び統計的に有意な腫瘍退縮を誘発したことを示した（図１４Ｂ）。カプラン－マイヤー生存分析は、ｇ－ＮＫ＋ダラツムマブ治療されたマウスの全生存確率が、ビヒクル又はｃＮＫ及びダラツムマブで治療されたマウスよりも有意に良好であったことを示した（ｐ＜０．０００１）（図１４Ｃ）。ｇ－ＮＫ細胞を投与された全てのマウスは、研究の終了時に体重減少又は毒性が観察されず、活力があったが、一方で、全ての対照マウス又はｃＮＫ細胞及びダラツムマブで治療されたマウスは、重度の体重減少を有し、研究の終了前に骨髄腫で死亡した（図１４Ｄ）。興味深いことに、ｇ－ＮＫ細胞で治療されたマウスのうちの１匹は、マウスのうちの１匹の麻酔誘発窒息に起因して、腫瘍接種後２１日目まで投与されず、このマウスは、ｇ－ＮＫマウスの最高ピークＢＬＩを有していたにもかかわらず、研究の終了時に検出可能な腫瘍ＢＬＩを有していなかった（図１４Ａ、＃として標識されたマウス）。ｇ－ＮＫ細胞を投与された７匹のマウスのうち、２匹のみが最小検出可能量の残存腫瘍ＢＬＩを有していた。
骨髄のフローサイトメトリー分析は、検出可能な腫瘍ＢＬＩを有していない５匹のｇ－ＮＫ治療されたマウスが、実際に腫瘍がなかった（骨髄中にＣＤ１３８ｐｏｓ細胞がない）ことを確認した。全ての７匹のｇ－ＮＫ治療されたマウスについての平均腫瘍量は、ｃＮＫ及びダラツムマブで治療されたマウスと比較して９９％を超えて低減した（ｐ＜０．００１、図１４Ｅ）。骨髄中の腫瘍量及び持続性ＮＫ細胞を図示する代表的なフローサイトメトリードットプロットが、図１４Ｆに示される。研究の過程にわたって撮影されたＢＬＩイメージングの全てが図１４Ｇに示される。Ｘ線画像を屠殺前のマウスの全てからを取得し、対照マウス又はｃＮＫ細胞及びダラツムマブで治療されたマウスが、後肢骨の骨折及び奇形を有したが、一方で、ｇ－ＮＫ細胞及びダラツムマブで治療されたマウスのうちの１匹が、任意の骨変形を有したことが決定された（図１４Ｈ）。
血液、脾臓、及び骨髄中のＮＫ細胞の分析は、ｃＮＫ細胞と比較して、ダラツムマブ治療されたマウスにおけるｇ－ＮＫ細胞の持続性の大幅な増加を実証した（図１５Ａ～図１５Ｃ）。注目すべきことに、ｇ－ＮＫ細胞数は、ｃＮＫ細胞よりも、血液中で＞９０％高く（図１５Ａ）、脾臓中で＞９５％高く（図１５Ｂ）、骨髄中で＞９９％高かった（図１５Ｃ）。
まとめると、結果は、インビボにおけるｍＡｂ効果を増強することに関して、ｃＮＫ細胞と比較した場合を含む、ｇ－ＮＫ細胞の優位性を更に支持し、ダラツムマブと組み合わせて投与されたｇ－ＮＫ細胞がＭＭを潜在的に治癒し得ることを示唆している。更に、結果は、増強された生存及びフラトリサイドに対する耐性が、優れた抗腫瘍効果及びｇ－ＮＫ細胞の持続性を結果的にもたらすことを支持する。
実施例１１：リンパ腫の播種性同所性異種移植片Ｒａｊｉモデルにおけるインビボ有効性
リツキシマブと組み合わせたＮＫ細胞（拡大されたｇ－ＮＫ細胞又はｃＮＫ細胞）のインビボ有効性を、リンパ腫のマウスモデルにおける腫瘍阻害及び生存を測定することによって評価した。
リツキシマブと組み合わせたＮＫ細胞（拡大されたｇ－ＮＫ細胞又はｃＮＫ細胞）のインビボ有効性を、リンパ腫のマウスモデルにおける腫瘍阻害及び生存を測定することによって評価した。
ｇ－ＮＫ細胞の拡大後、およそ５×１０５個のルシフェラーゼ標識Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞を、雌ＮＳＧマウスの尾静脈に静脈内注射し、２日間成長させた。モノクローナル抗体リツキシマブ（抗ＣＤ２０）を、腫瘍接種の２週間後に開始して、毎週、１５×１０６個の拡大されたｇ－ＮＫ又はｃＮＫ細胞の静脈内投与と組み合わせて、２００μｇ／マウスでＩ．Ｐ．経路を介して投与した。腫瘍接種の２日後に開始して、ＩＬ－１５を３日毎に投与して、ＮＫ細胞支持を提供した。表５は、研究において治療されたマウスの群を要約する。
（表Ｅ５）リンパ腫有効性研究設計
生物発光イメージング（ＢＬＩ）を週１回実施して、腫瘍接種の１週間後から開始して腫瘍量を監視した。マウスを不快感及び忍容性の徴候について毎日チェックし、腫瘍接種の１週間後に開始して週２回体重を測定した。マウスを、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンの皮下注射の１５分後にイメージングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、マウス全体の全光束（光子／秒）を定量化した。腫瘍保有マウスを、症候のあるリンパ腫の発症時に屠殺した。屠殺までの時間を、生存の代用として使用した。研究の完了時に、フローサイトメトリーを使用して、ｇ－ＮＫ、ｃＮＫ、及びＲａｊｉを定量化した。
ｇ－ＮＫ及びリツキシマブの同時投与は、ｃＮＫ及びリツキシマブによる治療と比較して、有意な腫瘍阻害及び増強された生存率を結果的にもたらした。図１６Ａに示されるように、拡大されたｇ－ＮＫ細胞は、インビボでリツキシマブと組み合わせたとき、顕著に増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。定性的ＢＬＩ分析（光子／秒）は、ｇ－ＮＫ細胞＋リツキシマブが、ｃＮＫ細胞を伴うリツキシマブ又は治療なしと比較して、Ｒａｊｉリンパ腫細胞の存在の統計的に有意な減少を結果的にもたらしたことを示す。カプラン－マイヤー生存分析は、ｇ－ＮＫ＋ダラツムマブ治療されたマウスの全生存確率が、リツキシマブ及びｃＮＫ細胞又は治療なしのマウスよりも有意に良好であったことを示した（図１６Ｂ）。
ｇ－ＮＫ細胞を投与された全てのマウスは、研究の終了時に体重減少又は毒性が観察されず、活力があったが、一方で、いかなる治療も受けなかった全てのマウスは、研究の終了前にリンパ腫で死亡した（図１６Ｂ及び図１６Ｃ）。リツキシマブ及びｃＮＫ細胞を受けたマウスは、ｇ－ＮＫ細胞＋リツキシマブを受けたマウスと比較して有意な体重減少を示した（図１６Ｃ）。
まとめると、結果は、インビボにおけるｍＡｂ効果を増強することに関して、ｃＮＫ細胞と比較した場合を含む、ｇ－ＮＫ細胞の優位性を更に支持し、リツキシマブと組み合わせて投与されたｇ－ＮＫ細胞がリンパ腫を潜在的に治癒し得ることを示唆している。
本発明は、例えば、本発明の様々な態様を例示するために提供される特定の開示された実施形態に範囲が限定されることを意図していない。説明される組成物及び方法に対する様々な修正は、本明細書の説明及び教示から明らかになる。そのような変形例は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱せずに実施され得、本開示の範囲内に収まることが意図される。
Claims (102)
- 多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法。
- 前記多発性骨髄腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法である、請求項１に記載の方法。
- 多発性骨髄腫抗原に対抗する抗体を前記対象に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記多発性骨髄腫抗原が、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、及びＢＣＭＡからなる群から選択される抗原を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記抗体が、完全長抗体である、請求項３又は４に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ＳＬＡＭＦ７抗体である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ＢＣＭＡ抗体である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ＣＤ３８抗体である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項３に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＢＣＭＡ、ＳＬＡＭＦ７、及びＣＤ３８からなる群から選択される第２の多発性骨髄腫抗原に対抗する、請求項９に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ３８に対抗する、請求項９又は１０に記載の方法。
- 前記抗体が、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、週１回、又は週２回投与される、請求項３～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体が、ある用量の前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に前記対象に投与されている、請求項８に記載の方法。
- 多発性骨髄腫を治療する方法であって、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され、前記対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３８抗体の前投与を受けている、方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され、前記１４日周期が、１～３回繰り返される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブである、請求項８及び１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１回の用量の前記抗ＣＤ３８抗体の投与が、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１回の用量の前記抗ＣＤ３８抗体の投与が、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１回の用量の前記抗ＣＤ３８抗体の投与が、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体が、静脈内投与される、請求項８及び１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される、請求項８及び１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）の各用量が、８ｍｇ／ｋｇ又は約８ｍｇ／ｋｇ～約３２ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に、１６ｍｇ／ｋｇ又は約１６ｍｇ／ｋｇである量で投与される、請求項８及び１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体が、皮下投与される、請求項８及び１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ３８抗体組成物で投与され、任意選択的に、前記抗ＣＤ３８抗体組成物が、ダラツムマブ及び組換えヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）を含む、請求項８、１３～２０、及び２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、１回又は２回の２８日周期にわたって投与される、請求項２５に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
- 抗ＣＤ３８抗体組成物の各用量が、約１８００ｍｇの抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）と、約３０，０００Ｕのヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ－ｆｉｈｊ）と、を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記抗ＣＤ３８抗体、任意選択的に、前記抗ＣＤ３８抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、前記ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の前記抗ＣＤ３８抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む前記組成物の投与前に投与される、請求項８及び１３～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多発性骨髄腫が、再発性／難治性多発性骨髄腫である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞が、ＣＤ３８の低い発現を有するか、又は発現を有しておらず、任意選択的に、前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の２５％未満が、表面ＣＤ３８に対して陽性である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞が、ＣＤ３８発現を低減又は排除するように操作されていない、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、最小限の抗ＣＤ３８誘発フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）を呈し、任意選択的に、前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％未満が、抗ＣＤ３８誘発フラトリサイドを呈する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
- リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与される、方法。
- 前記リンパ腫を治療するための外因性抗体の併用投与を伴わない単剤療法である、請求項３４に記載の方法。
- リンパ腫抗原に対抗する抗体を前記対象に投与することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記リンパ腫抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される抗原を含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記抗体が、完全長抗体である、請求項３６又は３７に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ＣＤ１９抗体である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ＣＤ３０抗体である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項３６に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、ＣＤ１６、並びにＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３０からなる群から選択される第２の抗原に対抗する、請求項４２に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、ＣＤ１６及びＣＤ２０に対抗する、請求項４３に記載の方法。
- 前記抗体が、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、週１回、又は週２回投与される、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体が、ある用量の前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前に前記対象に投与されている、請求項４１に記載の方法。
- リンパ腫を治療する方法であって、リンパ腫を有する対象に、ＦｃＲγ鎖の発現が欠損しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ｇ－ＮＫ細胞）の組成物を投与することを含み、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物が、週１回、所定の回数の用量で投与され、前記対象が、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ２０抗体の前投与を受けている、方法。
- 前記リンパ腫が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、１４日周期に２回の用量として投与され、前記１４日周期が、１～３回繰り返される、請求項３４～４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、合計６回の用量として投与される、請求項３４～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、請求項４１及び４５～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１回の用量の前記抗ＣＤ２０抗体の投与が、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の１か月以内に開始される、請求項４１及び４５～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１回の用量の前記抗ＣＤ２０抗体の投与が、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の３週間以内に開始される、請求項４１及び４５～５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１回の用量の前記抗ＣＤ２０抗体の投与が、前記ｇ－ＮＫ細胞の組成物の投与前の２週間以内に開始される、請求項４１及び４５～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体が、静脈内投与される、請求項４１及び４５～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体が、週１回の用量として、任意選択的に、４回又は８回の用量で投与される、請求項４１及び４５～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体の各用量が、２５０ｍｇ／ｍ２又は約２５０ｍｇ／ｍ２～５００ｍｇ／ｍ２、任意選択的に、３７５ｍｇ／ｍ２又は約３７５ｍｇ／ｍ２である量で投与される、請求項４１及び４５～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体が、皮下投与される、請求項４１及び４５～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が、ヒアルロニダーゼを含む抗ＣＤ２０抗体組成物で投与され、任意選択的に、前記抗ＣＤ２０抗体組成物が、リツキシマブ及びヒト組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０を含む、請求項４１、４５～５４、及び５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体組成物が、週１回の用量として、任意選択的に、４回若しくは８回の用量で、又は任意選択的に、前記抗ＣＤ２０抗体の静脈内の週１回の用量に続いて、３回若しくは７回の用量で、投与される、請求項５９に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、１２００ｍｇ又は約１２００ｍｇ～約２４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、１５，０００ユニット（Ｕ）又は約１５，０００Ｕ～約４５，０００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、請求項５９又は６０に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１４００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２３，４００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ２０抗体組成物の各用量が、約１６００ｍｇの抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）と、約２６，８００Ｕのヒアルロニダーゼと、を含む、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記抗ＣＤ２０抗体、任意選択的に、前記抗ＣＤ２０抗体組成物を、週１回、合計８回の用量で投与することと、前記ｇ－ＮＫ細胞組成物を、週１回、合計６回の用量で投与することと、を含み、１回用量又は２回用量の前記抗ＣＤ２０抗体が、ｇ－ＮＫ細胞を含む前記組成物の投与前に投与される、請求項４１及び４５～６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、前記細胞の６０％超若しくは約６０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、前記細胞の７０％超若しくは約７０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、前記細胞の８０％超若しくは約８０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、前記細胞の９０％超若しくは約９０％超がｇ－ＮＫ細胞であるか、又は前記細胞の９５％超若しくは約９５％超がｇ－ＮＫ細胞である、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の少なくとも５０％又は約５０％が、ＦｃＲγ欠損（ＦｃＲγｎｅｇ）ＮＫ細胞（ｇ－ＮＫ）であり、前記ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、パーフォリンに対して陽性であり、前記ｇ－ＮＫ細胞の７０％超又は約７０％超が、グランザイムＢに対して陽性である、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
- （ｉ）前記ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がパーフォリンに対して陽性であり、前記ｇ－ＮＫ細胞の８０％超若しくは約８０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、
（ｉｉ）前記ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がパーフォリンに対して陽性であり、前記ｇ－ＮＫ細胞の９０％超若しくは約９０％超がグランザイムＢに対して陽性であるか、又は
（ｉｉｉ）前記ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がパーフォリンに対して陽性であり、前記ｇ－ＮＫ細胞の９５％超若しくは約９５％超がグランザイムＢに対して陽性である、
請求項６５又は６６に記載の方法。 - パーフォリンに対して陽性である前記細胞のうち、前記細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのパーフォリンを発現する、及び／又は
グランザイムＢに対して陽性である前記細胞のうち、前記細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された際、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づいて、ＦｃＲγｐｏｓである細胞によって発現されるグランザイムＢの平均レベルの少なくとも２倍又は約２倍である平均レベルのグランザイムＢを発現する、請求項６６又は６７に記載の方法。 - 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、腫瘍標的細胞に対する脱顆粒が可能であり、任意選択的に、前記脱顆粒が、前記腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、任意選択的にＣＤ１０７ａ発現によって測定される際、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び前記標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、脱顆粒を呈する、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞の１０％超が、腫瘍標的細胞に対するインターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファを産生することができ、任意選択的に、前記インターフェロン－ガンマ又はＴＮＦ－アルファが、前記腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物中の細胞のうち、１５％超若しくは約１５％超、２０％超若しくは約２０％超、３０％超若しくは約３０％超、４０％超若しくは約４０％超、又は５０％超若しくは約５０％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）及び前記標的抗原に対抗する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する、請求項１～７１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ又はＴＮＦ－アルファである、請求項７２に記載の方法。
- 前記エフェクターサイトカインが、ＩＦＮ－ガンマ及びＴＮＦ－アルファである、請求項７２又は７３に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、照射されたＨＬＡ－Ｅ＋フィーダー細胞とともに培養されたＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞のエクスビボ拡大によって産生されたものであり、前記ＣＤ３－／ＣＤ５７＋細胞が、ドナー対象由来の生体サンプルから濃縮される、請求項１～７４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー対象が、ＣＭＶ－血清陽性である、請求項７５に記載の方法。
- 前記ドナー対象が、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型を有し、任意選択的に、前記生体サンプルが、ＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖ ＮＫ細胞遺伝子型又はＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｆ ＮＫ細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来する、請求項７５又は７６に記載の方法。
- 前記ドナー対象由来の末梢血サンプル中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも２０％又は約２０％が、ＮＫＧ２Ｃに対して陽性（ＮＫＧ２Ｃｐｏｓ）であり、前記末梢血サンプル中のＮＫ細胞の少なくとも７０％が、ＮＫＧ２Ａに対して陰性であるか又は低い（ＮＫＧ２Ａｎｅｇ）、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記照射されたフィーダー細胞が、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩを欠損している、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記照射されたフィーダー細胞が、２２１．ＡＥＨ細胞である、請求項７５～７９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養が、２つ以上の組換えサイトカインの存在下で実施され、少なくとも１つの組換えサイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）－２であり、少なくとも１つの組換えサイトカインが、ＩＬ－２１である、請求項７５～８０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えサイトカインが、ＩＬ－２１及びＩＬ－２である、請求項８１に記載の方法。
- 前記組換えサイトカインが、ＩＬ－２１、ＩＬ－２、及びＩＬ－１５である、請求項８１に記載の方法。
- 前記組成物中の前記ｇ－ＮＫ細胞が、同じ生体サンプルから拡大された単一のドナー対象に由来する、請求項１～８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞組成物が、凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地中で製剤化され、任意選択的に、前記凍結保護剤が、ＤＭＳＯであり、前記凍結保存培地が、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、請求項１～８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞が、抗原受容体で操作されておらず、任意選択的に、前記抗原受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｇ－ＮＫ細胞が、分泌性サイトカインで、任意選択的に、ＩＬ－１５受容体融合物（ＩＬ－１５ＲＦ）などのサイトカイン受容体融合タンパク質で、操作されていない、請求項１～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、ＮＫ細胞の生存又は拡大を支持するための前記対象への外因性サイトカイン投与を含まず、前記外因性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１のうちの１つ以上である、請求項１～８７のいずれか一項に記載の方法。
- ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、１×１０８個又は約１×１０８個の細胞～５０×１０９個又は約５０×１０９個の細胞の前記ｇ－ＮＫ細胞組成物である、請求項１～８８のいずれか一項に記載の方法。
- ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、５×１０８個の細胞又は約５×１０８個の細胞の前記ｇ－ＮＫ細胞組成物である、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。
- ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、５×１０９個の細胞又は約５×１０９個の細胞の前記ｇ－ＮＫ細胞組成物である、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。
- ｇ－ＮＫ細胞の各用量が、１０×１０９個の細胞又は約１０×１０９個の細胞の前記ｇ－ＮＫ細胞組成物である、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用量のｇ－ＮＫ細胞の前記投与前に、前記対象が、リンパ球除去療法を受けている、請求項１～９２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンパ球除去療法が、フルダラビン及び／又はシクロホスファミドを含む、請求項９３に記載の方法。
- 前記リンパ球除去が、２～４日間、毎日、２０～４０ｍｇ／ｍ２対象体表面積若しくは約２０～４０ｍｇ／ｍ２対象体表面積、任意選択的に、３０ｍｇ／ｍ２対象体表面積若しくは約３０ｍｇ／ｍ２対象体表面積のフルダラビン、及び／又は２～４日間、毎日、２００～４００ｍｇ／ｍ２対象体表面積若しくは約２００～４００ｍｇ／ｍ２対象体表面積、任意選択的に、３００ｍｇ／ｍ２若しくは約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドの投与を含む、請求項９３又は９４に記載の方法。
- 前記リンパ球除去療法が、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む、請求項９４又は９５に記載の方法。
- 前記リンパ球除去療法が、毎日、３０ｍｇ／ｍ２対象体表面積又は約３０ｍｇ／ｍ２対象体表面積のフルダラビン、及び、毎日、３００ｍｇ／ｍ２対象体表面積又は約３００ｍｇ／ｍ２対象体表面積のシクロホスファミドの、各々２～４日間、任意選択的に、３日間の投与を含む、請求項１～９６のいずれか一項に記載の方法。
- ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、前記リンパ球除去療法の開始後の２週間以内又は２週間若しくは約２週間で開始される、請求項１～９７のいずれか一項に記載の方法。
- ある用量のｇ－ＮＫ細胞の投与が、前記リンパ球除去療法の開始後の７日以内又は７日若しくは約７日で開始される、請求項１～９７のいずれか一項に記載の方法。
- 個体が、ヒトである、請求項１～９９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物中の前記ＮＫ細胞が、個体に対して同種異系である、請求項１～１００のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象におけるインビボの前記ｇ－ＮＫ細胞の拡大又は持続を容易にするために外因性サイトカインサポートを投与することを更に含み、任意選択的に、前記外因性サイトカインが、ＩＬ－１５であるか、又はＩＬ－１５を含む、請求項１～１０１のいずれか一項に記載の方法。
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